專利名稱：一種檢測精子dna碎片的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于體外檢測的方法及裝置，尤其是一種適用于檢測精子DNA碎片的方法及 裝置。
背景技術：
目前，精液分析是不育癥檢査中不可缺少的一項，主要包括精子密度、精子活動力和精 子形態(tài)學檢査等，然而這些檢査不能全面評估男性生育力，而且有部分男性不育患者的精液 檢査是正常的，因此，需要進一步研究新的不育評估指標。隨著分子生物學技術的發(fā)展，精 子DNA檢測方法逐漸成熟完善，尤其是對精子DNA碎片化問題的研究越來越多，精子DNA碎片 化程度可作為不育、反復流產(chǎn)以及胚胎異常病因?qū)W診斷的一種可靠的精子質(zhì)量評價指標。精 子DNA碎片化的發(fā)生機制可能與精子發(fā)生過程中的異常染色質(zhì)包裝、氧壓脅迫或凋亡異常有 關。遺傳物質(zhì)完整性對于成功妊娠和子代的健康是至關重要的，DNA碎片程度反映精子遺傳 物質(zhì)的完整性，精子DNA發(fā)生碎片化對生育將會產(chǎn)生負面影響，造成不育和反復流產(chǎn)。
目前，精子DNA碎片的主要檢測方法有精子染色質(zhì)結構分析、彗星實驗、末端轉(zhuǎn)移酶介 導的dUTP末端標記法和精子染色質(zhì)擴散實驗。但這些方法大多存在以下單方面或多方面的 問題①需要昂貴的檢測儀器；②操作較為復雜；③檢測方案(方法和試劑)不夠完善，④ 檢測成本昂貴難以臨床推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種操作簡單、結果易于判定且易于臨床推廣應用的檢 測精子DNA碎片的方法，同時本發(fā)明還提供一種利用上述方法檢測精子DNA碎片的裝置。
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種檢測精子DNA碎片的方法，其特征在于，包括如下步
驟
1) 調(diào)整精子濃度；
2) 將低熔點凝膠完全融化后，置于高于低熔點凝膠熔點的溫度條件下平衡待用；
3) 將所述步驟l)得到的精子與步驟2)得到的凝膠按適當比例混合；
4) 吸取步驟3)得到的懸液至包被有高熔點凝膠的固相上，加蓋蓋片后置2 8。C使其凝固，以制備穩(wěn)定的不易脫落的凝膠-精子反應相；
5) 移去蓋片，在低于低熔點凝膠熔點的溫度條件下，將包被固相水平浸入變性液中反 應；目的在于使精子雙鏈DNA變性為單鏈DNA，其中，必須保證反應溫度低于低熔點凝膠的熔 點，以免造成凝膠反應相表面的低熔點凝膠熔化(即若低熔點凝膠的熔點為3(TC，則反應 溫度不得大于或等于3(TC)，為了保證反應的重復性， 一般容易接受的反應溫度為18-28。C
6) 將包被固相移入溶解液中，在低于低熔點凝膠熔點的溫度條件下反應；目的在于部 分溶解精子頭部蛋白質(zhì)，以利暴露和擴散變性后的單鍵DNA，優(yōu)選地，反應時間5-40分鐘， 可獲得精子頭部蛋白溶解充分、精子結構清晰的最佳效果，反應的溫度條件與步驟5)中變 性反應的溫度要求相同；
7) 洗滌包被固相，去除殘存的溶解液以達到終止反應的目的；
8) 以從低至高的乙醇濃度順序進行連續(xù)脫水，空氣中干燥，以利穩(wěn)定精子形態(tài)和便于 顯微鏡下清楚地觀察結構；
9) 進行染色處理；
10) 顯微鏡下計數(shù)精子DNA碎片的發(fā)生率。
作為優(yōu)選方案，所述步驟5)中的變性液是冰乙酸、乙酸、鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸中 的一種或幾種的混合，pHO. 1-4.0，酸濃度為0.02-0.2摩爾/升；所述變性反應時間為3-30 分鐘，所述低于低熔點凝膠熔點的優(yōu)選溫度范圍是18-28'C ;
所述步驟6)中的溶解液pH值為7. 0-9.0，其組分包括巰基試劑的濃度含量為 0.01-2.8摩爾/升、離子去垢劑的重量含量為O. 05-1.5%，非離子去垢劑的體積含量為 0. 01-3. 5%;溶解反應時間為5-40分鐘，所述低于低熔點凝膠熔點的優(yōu)選溫度范圍是18-28'C
所述包被固相為包被液在載片或容器的固相表面形成的包被干燥物，所述包被液含Tris 或磷酸鹽緩沖液及高熔點凝膠，該凝膠的熔點為40-10(TC，包被液的pH值為7. 0-9.0。
所述步驟3)中的適當比例是使得包埋于低熔點凝膠中的精子按平均3-25萬個精子/ 18-24X 18-24mm的蓋片面積比覆蓋；
所述低熔點凝膠固封于帶蓋的密封管內(nèi)，其熔點為25-6(TC，低熔點凝膠水溶液的pH值 為7. 0-9. 0;
所述步驟9)中染色液選用熒光染色液，并配有熒光封固液，該封固液采用對苯二氨重 量含量為O. 05-0. 5%和甘油體積含量為5-50%的磷酸鹽緩沖液，其pH為7. 5-9. 0，該封固液中還含有適量的抑制細胞生長的防腐劑。
在所述步驟l)之前以上泳法或密度梯度法收集高活力精子；所述步驟9)之后以洗滌液 或流水洗滌包被固相。
上述檢測方法的設計原理由于凝膠具有分子篩性質(zhì)的網(wǎng)狀結構(既可以保證反應試劑 自由滲入凝膠相與精子反應，又可使凝膠相內(nèi)變性后的精子DNA向四周擴散)，將待測精子 分布于凝膠相中，通過酸變性使精子頭部完整的雙鏈DNA變性為單鏈DNA，如果精子DNA不完 整(即存在DNA碎片)則在特定時間內(nèi)不能變性為單鍵DNA或變性為單鍵DNA的數(shù)量很少；再 經(jīng)溶解液去除精子頭部部分蛋白質(zhì)，以利暴露和擴散變性后的單鍵DNA;最后通過脫水染色 后，從形態(tài)上判斷精子是否存在DNA碎片如果精子以頭部為中心向外擴散的"光暈"較厚 ，則表明精子DNA結構完整；反之若無"光暈"或光暈較少(單側光暈的厚度小于精子頭部 最小直徑的1/3)，則表明精子DNA結構不完整，即存在DNA碎片。
為解決技術問題，本發(fā)明還提供一種檢測精子DNA碎片的裝置，其特征在于，它包括
(1) 包被固相在載片或容器上包被有高熔點凝膠的固相；
(2) 固封于密封管內(nèi)的凝膠；
(3) 變性液用來使精子變性以產(chǎn)生單鏈DNA的無機酸水溶液；
(4) 溶解液用來溶解去除精子核蛋白的含巰基試劑的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；
(5) 用來指示反應后精子DNA碎片化狀況的染色液。
所述(1)中包被固相為高熔點凝膠在載片或容器等固相表面上的包被干燥物，用于在 室溫條件下保持反應環(huán)境的穩(wěn)定性；所述包被用固相包括玻璃或塑料等材質(zhì)的載片或容器等 ;所述包被液中Tris的重量含量為O. 12-0.48%、凝膠的重量含量為O. 1-5. 0%，所述凝膠的熔 點為40-10(TC 。高熔點凝膠包被的固相可以避免在常溫條件下保存或運輸時不會發(fā)生凝膠熔 化脫落(部分地區(qū)室外溫度可能高過4(TC)，因此高熔點凝膠熔點必須大于可能出現(xiàn)的貯存 與運輸溫度。所述高熔點凝膠可以是聚丙烯酰胺凝膠或聚乙烯醇型凝膠或瓊脂或瓊脂糖或瓊 脂糖衍生物或葡聚糖凝膠或葡聚糖衍生物凝膠等，而且凝膠的含量還可以為其他值。上述步 驟中使用的Tris還可以用別的緩沖物質(zhì)替換，比如磷酸鹽緩沖液；而且Tris的含量還可以 為其他值，只要能夠保證包被液的pH值為7. 0-9.0，且不影響在載片上形成包被干燥物即可
優(yōu)選地，該裝置還包括用于提取高活力精子和調(diào)整精子濃度的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液可以 是1000ml蒸餾7K中含有NaCl 2. 77-11. 08g、 KC1 0. 17-0. 70g、 CaCl2 2H20 0. 12-0. 50g 、 KH2P04 0.08-Q.32g、 MgS04 7H20 0.14-0.58 g、酚紅O. 5-3mg、 NaHC03 1. 0-4. 2g、葡萄糖0. 5-2. 0g、焦丙酮酸鈉15-60mgBSA 1. 7-7. 0g青霉素50000-200000單位、硫酸鏈霉素
50-500mg，加入乳酸鈉糖漿(600g/L) 1.8-7.4ml;所述培養(yǎng)液中的NaCl重量含量為
0. 28-1. 11%、 KCl的重量含量為O. 02-0. 07%、 CaCl2 21120的重量含量為0. 01-0. 05%、 KH2P04
的重量含量為O. 01-0. 03%、 MgS04 7H20的重量含量為0. 01-0. 06%、酚紅的重量含量為
0. 0005-0. 003%。、 NaHCO;j的重量含量為O. 10-0. 42%、葡萄糖的重量含量為O. 05-0. 20%、焦丙
酮酸鈉的重量含量為O. 015-0. 060%。、青霉素的含量為5000-20000單位％、硫酸鏈霉素的重量
含量為O. 05-0. 50%。、乳酸鈉糖漿(600g/L)的體積含量為O. 18-0. 74%;所述培養(yǎng)液還可以用
其他類型的培養(yǎng)液替換，如HTF、 FIO、 Earle培養(yǎng)液等。
上述(2)中密封管內(nèi)的凝膠為低熔點凝膠水溶液保存于4'C的凝固態(tài)，因此該裝置于4 "C冰箱內(nèi)保存。該低熔點凝膠的熔點為25-6(TC，低熔點凝膠水溶液的pH值為7. 0-9.0。低熔 點凝膠是用于制備精子-凝膠相，即將精子包埋于凝膠相中。其實此過程也可以采用高熔點 凝膠，之所以采用低熔點凝膠主要是出于使用方便、檢測準確的目的。在制備精子-凝膠相 之前，必須預先將待用凝膠熔化。若采用高熔點凝膠則需要將加熱的溫度調(diào)至很高(大于熔 點)，完全熔化需要的時間可能會較長；過快地升溫或過高的溫度可能破壞凝膠使其發(fā)生碳 化；凝膠熔化后不可馬上將精子加入其中，因為過高的溫度可人為破壞精子形態(tài)及DNA，造 成檢測結果不準確，因此必須等到凝膠溫度下降至不破壞精子結構方可使用，這個最適溫度 為37'C左右。若采用高熔點凝膠則從高溫降至熔點以上可能需要較長時間，通常高熔點凝膠 熔點遠高于37'C，因此還可能破壞精子形態(tài)及DNA。顯然使用高熔點凝膠從準備到應用所需 的時間會較長，而且臨床實驗室通常不具備也不歡迎較高的控溫程序，較高的溫度也會增加 操作的不安全因素。相反，采用低熔點凝膠則可以大大減少從制備到應用的時間，熔化條件 溫和、操作更安全更易獲得實驗室操作者的親睞；更重要的是，相對于高熔點凝膠，在制備 凝膠-精子相時，低熔點凝膠由于具有低熔點優(yōu)勢，可避免由于凝膠過熱造成人為破壞精子 形態(tài)及DNA。
所述密封管選擇帶蓋的，如離心管(印pendrof管)，該密封管用于為精子提供反應環(huán) 境并利于與包被固相粘合，由于低熔點凝膠是裝在密封管中的，即使是在保存或運輸過程中 溫度超出其熔點也不會對結果檢測造成影響。密封管中的液體成份可以是100ml蒸餾水中含 有Tris 0. 24g、凝膠O. 1-5. 0g;所述密封管中的液體成份中Tris的重量含量可以為 0.12-0.48%、凝膠的重量含量為O. 1-5.0%，凝膠的熔點為25-6(TC;所述凝膠是聚丙烯酰胺 凝膠、聚乙烯醇型凝膠、瓊脂、瓊脂糖、瓊脂糖衍生物、葡聚糖凝膠、葡聚糖衍生物凝膠等 ，而且凝膠的含量還可以為其他值；所述Tris還可以用別的緩沖物質(zhì)替換，而且Tris的含量還可以為其他值，只要能夠保證密封管中液體的PH值為7. 0-9. O且不破壞精子的結構和影響 檢測結果。
所述變性液用于使精子變性以產(chǎn)生單鏈DNA;所述變性液可以是1000ml蒸餾水中含有冰 乙酸0.02-0.2摩爾；所述冰乙酸也可用乙酸、鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸等中的一種或幾種的 混合予以代替；所述1000ml變性液中酸濃度為0.02-0.2摩爾；所述變性液pH值為O. 1-4.0。
所述溶解液用于溶解去除核蛋白，該溶解液可以是1000ml蒸餾水中含有Tris 2. 4-9. 8g 、巰基試劑0.01-2.8摩爾、離子去垢劑0.5-15.4g、非離子去垢劑O. 1-35ml;所述巰基試劑 是半胱氨酸、二硫赤蘚糖醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、2，3-二巰基丙醇等中的 一種或幾種的混合，溶解液中巰基試劑的濃度含量為0.01-2.8摩爾/升；所述離子去垢劑是 3-[(3-膽烷酰胺丙基)-二甲銨]-l-丙磺酸鹽、3-[(3-膽烷酰胺丙基)-二甲銨]-2-羥-l-丙磺 酸鹽、十二烷基肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基溴化銨、 Zwittergent等中的一種或幾種的混合，溶解液中離子去垢劑的重量含量為O. 05-1. 5%;所述 非離子去垢劑是Tween-20、 Tween-60、 Tween-80、 Brij35、 Brij 56、 Brij58、 Triton X-100、 Triton X-114、 Nonidet P40等中的一種或幾種的混合，溶解液中非離子去垢劑的體 積含量為O. 01-3. 5%;所述Tris還可以用別的緩沖物質(zhì)替換，而且Tris的含量還可以為其他 值，只要能夠保證密封管中液體的pH值為7. 0-9. 0，且不破壞精子的結構和影響檢測結果即可
所述染色液用于指示反應后精子DNA碎片化狀況，該染色液又分為細胞染色液與熒光染 色液兩種；所述細胞染色液包括瑞氏、姬-瑞氏、巴氏、改良巴氏、Diff-Quik等細胞染色方 法，該細胞染色液可從市場購買商品化試劑；所述熒光染色液包括DAPI (4' ，6-聯(lián)脒-2-苯 基吲哚)、赫斯特33258、溴化乙啶、碘化丙啶等，該熒光染色液中熒光染料的重量含量為 1-5ug/ml。熒光染色液中含有Tris 1. 2-4. 8g、 NaCl 0. 4-1. 6g、 BSA 0. 1-0. 5g、 NaN3 0. 01-0. 05g，溶于100毫升蒸餾水中，加入DAPI 0. 1-0. 5mg， pH 7.0-7.8，置4。C保存。
優(yōu)選選用熒光染色液，此時該裝置中還應配有熒光封固液，其用于延長熒光標記物在熒 光照射下的淬滅時間，該封固液在本發(fā)明中采用含對苯二氨和甘油的磷酸鹽緩沖液，所述封 固液是100ml PBS中含有Na2HPO4 12H20 0.4—0.8g、 KH2P040. 02—0. 10g、 NaN3 0. 01—0. 5g、 苯二氨0.05-0.5g，甘油5-50ml;所述封固液中NaN3的重量含量為0. 01-0. 5%、對苯二氨的重 量含量為O. 05-0. 5%、甘油的體積含量為5-50%;所述NaN3還可以用其他的防腐劑替換，而且 防腐劑的含量還可以為其他值，只要能抑制細胞生長且對檢測無影響；所述PBS還可以用別 的緩沖物質(zhì)替換，而且PBS的含量還可以為其他值，只要能夠保證洗滌液的pH值為7. 5-9.0，含量的多少基本不會加速熒光素在熒光照射下的淬滅時間。 本發(fā)明的有益效果在于
1、 精子經(jīng)變性、溶解、染色等步驟之后，從形態(tài)上可直觀判斷DNA碎片化的狀況，方法 學特異、易于判定；
2、 由于采用了優(yōu)化檢測方案，減少了操作步驟與操作時間，大大提高了檢測效率；
3、 由于采用了優(yōu)化檢測方案，減化了試劑結構，較大程度地降低了檢測成本；
4、 由于操作簡單、采用即用型試劑且性能穩(wěn)定、無需特殊檢測儀器，便于臨床常規(guī)應 用與推廣。
5、 進一步地，由于將檢測方法的各環(huán)節(jié)進行了最優(yōu)化設計，包括標本與凝膠的適配比
、變性液濃度與反應時間的合理搭配、溶解液各組份濃度與反應時間和作用效果的匹配，并 消除了精液中脫落細胞等非精子物質(zhì)對檢測結果的影響。從而保證了該檢測方法的可靠性， 且檢測結果特異，重復性好。其中，消除了精液中脫落細胞等非精子物質(zhì)對檢測結果的影響 具體分析如下正常情況下，精液中脫落細胞等非精子物質(zhì)在形態(tài)學上與精子有很大差異， 因此借助形態(tài)學特征可以很容易地將這些非精子特質(zhì)區(qū)分開。但是，在檢測過程中，由于經(jīng) 歷了酸變性和溶解反應過程，精子以及精液中脫落細胞等非精子物質(zhì)很容易失去形態(tài)學上的 識別特征(均僅為圓形核，有或無光暈)，難以辨別哪是精子哪是非精子。本發(fā)明的突出特 點是，通過變性液、變性時間、溶解液、溶解液反應時間的合理搭配，在達到反應完成后仍 能保持精子尾部結構完整性的效果，最終通過精子尾部特征輕松實現(xiàn)與非精子物質(zhì)的區(qū)別。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述。
本發(fā)明的精子DNA碎片檢測裝置(即試劑盒)，包括包被有高熔點凝膠的載片，封裝有 低熔點凝膠水溶液的密封管，變性液，溶解液，培養(yǎng)液，熒光染色液和封固液。各試劑的制 備如下
Al、包被載片的制備
1) 稱取Tris (三羥甲基氨基甲烷)2.4g置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解；用 lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7. 4，加蒸餾水至1000ml，制成Tris緩沖液。
2) 稱取高熔點凝膠瓊脂糖lg置燒杯，加上述Tris緩沖液100ml，混合。
3) 將步驟2)得到的懸液置于10(TC水浴中完全融化。
4) 趁熱將步驟3)得到的溶液置于載片表面，烤干，即在載片上形成了高熔點凝膠的包被干燥物。
A2、包被載片的制備
1) 稱取Trisl.2g置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解；用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0， 加蒸餾水至1000ml，制成Tris緩沖液。
2) 稱取高熔點凝膠聚丙烯酰胺凝膠0.2g置燒杯，加上述Tris緩沖液100ml，混合。
3) 將步驟2)得到的懸液置于10(TC水浴中完全融化。
4) 趁熱將步驟3)得到的溶液置于載片表面，烤干，即在載片上形成了高熔點凝膠的包 被干燥物。
A3、包被載片的制備
1) 稱取Tris4.8g置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解；用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0， 加蒸餾水至1000ml，制成Tris緩沖液。
2) 稱取高熔點凝膠瓊脂3g置燒杯，加上述Tris緩沖液100ml，混合。
3) 將步驟2)得到的懸液置于10(TC水浴中完全融化。
4) 趁熱將步驟3)得到的溶液置于載片表面，烤干，即在載片上形成了高熔點凝膠的包 被干燥物。
Bl、低熔點凝膠水溶液的制備
5) 稱取低熔點凝膠瓊脂糖lg置燒杯，加步驟l)得到的Tris緩沖液100ml，混合。
6) 將步驟5)溶液分裝于印pendrof管，每管140ul， 4"C保存。 B2、低熔點凝膠水溶液的制備
5) 稱取低熔點凝膠瓊脂0.3g置燒杯，加步驟l)得到的Tris緩沖液100ml，混合。
6) 將步驟5)溶液分裝于印pendrof管，每管140ul， 4"C保存。 B3、低熔點凝膠水溶液的制備
5) 稱取低熔點凝膠葡聚糖凝膠4.0g置燒杯，加步驟l)得到的Tris緩沖液100ml，混合
6) 將步驟5)溶液分裝于印pendrof管，每管140ul， 4"C保存。 C、變性液的制備
7) 量取冰乙酸O. l摩爾至量筒，加蒸餾水至1000ml，攪拌溶解。 或者量取冰乙酸0.02-0.2摩爾至量筒，加蒸餾水至1000ml，攪拌溶解保存。 Dl、溶解液的制備
8) 稱取Tris 4.9g、十二烷基肌氨酸鈉10g、谷胱甘肽30. 7g、吐溫-20 1. 5ml置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解。
9)用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7. 4，加蒸餾水至1000ml。 D2、溶解液的制備
8) 稱取Tris 2.4g、溴化十六烷基吡啶l. 0g、半胱氨酸45g、吐溫-60 25ml置燒杯，加 蒸餾水至900ml，攪拌溶解。
9) 用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，加蒸餾水至1000ml。 D3、溶解液的制備
8) 稱取Tris 9.8g、 3-[ (3-膽烷酰胺丙基)-二甲銨]-1-丙磺酸鹽5. 0g、 2-巰基乙醇 20ul、 Brij 56 10ml置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解。
9) 用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至8. 0，加蒸餾水至1000ml。
E、 培養(yǎng)液的制備
10) 稱取NaCl 5.54g、 KC1 0. 35g、 CaCl2 2H20 0. 25g 、 KH2P04 0.16 g、 MgS04 7H20 0.29g、酚紅lmg置燒杯，加蒸餾水至1000ml，攪拌溶解。
11) 稱取NaHCO;j 0. 21g、葡萄糖O. 10g、焦丙酮酸鈉3mg、 BSA 0. 35g、青霉素10000單位 、硫酸鏈霉素10mg，加入乳酸鈉糖漿(600g/L) 0. 37ml、加入上述IO)配制的溶液100ml，攪 拌溶解，4'C保存。
F、 熒光染色液的制備
12) 稱取Tris 2.4g、 NaCl 0. 8g、 BSA 0. 2g、 NaN3 0. 02g溶于80毫升蒸餾水中，攪拌溶解。
13) 用lmol/L HCl調(diào)pH至7. 5，用蒸餾水定容至100毫升；或者用lmol/L HCl調(diào)pH至 7.0-7.8，用蒸餾水定容至100毫升。
14) 在上述溶液中加入DAPI 0.2mg，攪拌溶解，置4。C保存；或者加入DAPI 0. 1-0. 5mg ，攪拌溶解，置4'C保存；
G、 封固液的制備
15) 稱取Na2HP04' 12H20 0.6 g、 KH2P040. 05 g、 NaN3 0. 02g、對苯二氨O(jiān). 25g置燒杯， 加蒸餾水至90ml，攪拌溶解。
16) 加入甘油25ml。
17) 調(diào)pH至8.0，加蒸餾水至100ml， 4。C保存。 采用上述試劑，檢測精子DNA碎片，具體步驟如下 一、樣本準備直接檢測或者待檢精子經(jīng)上泳法或密度梯度法收集高活力精子后再行檢測。
二、 試劑準備
將上述裝置內(nèi)的培養(yǎng)液、包被載片、變性液、溶解液和染色液等試劑置室溫平衡。將低 熔點凝膠密封管置于90-10(TC熱水浴中5分鐘，直至完全溶解后置37。C平衡待用。
三、 操作步驟
1、 以培養(yǎng)液調(diào)整精子濃度至5-10X10Vml;
2、 將60ul精子加入裝有140ul已溶解低熔點凝膠的密封管內(nèi)(37°C)，混勻；
3、 吸取步驟2懸液20ul至包被有高熔點凝膠的載片上；
4、 立即蓋上蓋片(18-24X18-24mm)，置2-8。C不少于5分鐘，使其凝固；
5、 小心移去蓋片，于室溫避光條件下，將載片立即水平浸泡于變性液中反應6-12分鐘
6、 將載片移入溶解液，室溫浸泡10-40分鐘；
7、 將載片移入大量蒸餾水中，室溫浸泡5分鐘；
8、 分別以70%， 90%和100%乙醇進行連續(xù)脫水，每次2分鐘，空氣中干燥；
9、 載片熒光染料進行染色；
10、 在熒光顯微鏡下計數(shù)500個精子DNA碎片發(fā)生率。精子DNA碎片判定標準精子頭部 僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈，單側光暈的厚度小于精子頭部最小直徑的1/3。
其中，精子DNA碎片反生率二存在DNA碎片精子數(shù)+被觀察精子總數(shù)X 100% 例如計數(shù)精子500個，其中存在DNA碎片精子數(shù)75個；則精子DNA碎片反生率二75 + 500 XI00%= 15%。
本發(fā)明不限于以上實施方式，只要是說明書中提及的方案均是可以實施的。
權利要求
1.一種檢測精子DNA碎片的方法，其特征在于，包括如下步驟1)調(diào)整精子濃度；2)將低熔點凝膠完全融化后，置于高于低熔點凝膠熔點的溫度條件下平衡待用；3)將所述步驟1)得到的精子與所述步驟2)得到的凝膠按適當比例混合；4)吸取步驟3)得到的懸液至包被有高熔點凝膠的固相上，加蓋蓋片后置2-8℃使其凝固；5)移去蓋片，在低于低熔點凝膠熔點的溫度條件下，將包被固相水平浸入變性液中反應；6)將包被固相移入溶解液中，在低于低熔點凝膠熔點的溫度條件下反應；7)洗滌包被固相；8)用從低至高的乙醇濃度順序進行連續(xù)脫水，空氣中干燥；9)用染色液進行處理；10)顯微鏡下計數(shù)精子DNA碎片的發(fā)生率。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測精子DNA碎片的方法，其特征在于，所述步驟5)中的變性液是冰乙酸、乙酸、鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸中的一種或幾種的 混合，pHO. 1-4.0，酸濃度為0.02-0.2摩爾/升；所述變性反應時間為3-30分鐘，所述低于 低熔點凝膠熔點的優(yōu)選溫度范圍是l8-28°C ;所述步驟6)中的溶解液pH值為7. 0-9.0，其組分包括巰基試劑的濃度含量為 0.01-2.8摩爾/升、離子去垢劑的重量含量為O. 05-1.5%，非離子去垢劑的體積含量為 0. 01-3. 5%;溶解反應時間為5-40分鐘，所述低于低熔點凝膠熔點的優(yōu)選溫度范圍是18-28'C
3.根據(jù)權利要求1所述的檢測精子DNA碎片的方法，其特征在于，所述包被固相為包被液在載片或容器的固相表面形成的包被干燥物，所述包被液含 Tris或磷酸鹽緩沖液及高熔點凝膠，該凝膠的熔點為40-10(TC，包被液的pH值為7. 0-9. 0。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測精子DNA碎片的方法，其特征在于，所述步驟3)中的適當比例是使得包埋于低熔點凝膠中的精子按平均3-25萬個精子/ 18-24X 18-24mm的蓋片面積比覆蓋；所述低熔點凝膠固封于帶蓋的密封管內(nèi)，其熔點為25-6(TC，低熔點凝膠水溶液的pH值 為7. 0-9. 0;所述步驟9)中染色液選用熒光染色液，并配有熒光封固液，該封固液采用對苯二氨重 量含量為O. 05-0. 5%和甘油體積含量為5-50%的磷酸鹽緩沖液，其pH為7. 5-9. 0，該封固液中 還含有適量的抑制細胞生長的防腐劑。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測精子DNA碎片的方法，其特征在于，在所述步驟l)之前以上 泳法或密度梯度法收集高活力精子；所述步驟9)之后以洗滌液或流水洗滌包被固相。
6.一種檢測精子DNA碎片的裝置，其特征在于，它包括(1) 包被固相在載片或容器上包被有高熔點凝膠的固相；(2) 固封于密封管內(nèi)的凝膠；(3) 變性液用來使精子變性以產(chǎn)生單鏈DNA的酸性水溶液；(4) 溶解液用來溶解去除精子核蛋白的含巰基試劑的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；(5) 用來指示反應后精子DNA碎片化狀況的染色液。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測精子DNA碎片的裝置，其特征在于還包括用于提取高活力 精子和調(diào)整精子濃度的培養(yǎng)液。
8.根據(jù)權利要求6所述的檢測精子DNA碎片的裝置，其特征在于所述包被固相用的包被液中含Tris或磷酸鹽緩沖液，包被液的pH值為7. 0-9.0，高熔點 凝膠的熔點為40-100。C;所述密封管是帶蓋的，其內(nèi)的凝膠為低熔點凝膠，其熔點為25-6(TC，低熔點凝膠水溶 液的pH值為7.0-9.0;所述凝膠是聚丙烯酰胺凝膠或聚乙烯醇型凝膠或瓊脂或瓊脂糖或瓊脂糖衍生物或葡聚 糖凝膠或葡聚糖衍生物凝膠。
9.根據(jù)權利要求6所述的檢測精子DNA碎片的裝置，其特征在于所述酸性水溶液是冰乙酸、乙酸、鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸中的一種或幾種的混合， 其中，pH 0.1-4.0，酸濃度為O. 02-0. 2摩爾/升；所述溶解液pH值為7. 0-9.0，其組分包括巰基試劑的濃度含量為0.01-2.8摩爾/升、 離子去垢劑的重量含量為O. 05-1. 5%，非離子去垢劑的體積含量為O. 01-3. 5%。
10.根據(jù)權利要求9所述的檢測精子DNA碎片的裝置，其特征在于所述巰基試劑是半胱氨酸、二硫赤蘚糖醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、 2， 3-二巰基丙醇中的一種或幾種的混合；所述離子去垢劑是3-[(3-膽烷酰胺丙基)-二甲銨]-l-丙磺酸鹽、3-[(3-膽烷酰胺丙基 )-二甲銨]-2-羥-1-丙磺酸鹽、十二烷基肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基吡啶、 十六烷基三甲基溴化銨、Zwittergent中的一種或幾種的混合；所述非離子去垢劑是Tween-20、 Tween-60、 Tween-80、 Brij35、 Brij 56、 Brij58、 Triton X-100、 Triton X-114、 Nonidet P40中的一種或幾種的混合；所述染色液選用熒光染色液，并配有熒光封固液，該封固液采用對苯二氨重量含量為 0. 05-0. 5%和甘油體積含量為5-50%的磷酸鹽緩沖液，其pH為7. 5-9. 0，該封固液中還含有適 量的抑制細胞生長的防腐劑。
全文摘要
一種檢測精子DNA碎片的方法1)調(diào)整精子濃度；2)將低熔點凝膠完全融化，平衡待用；3)將精子與該凝膠按適當比例混合；4)吸取得到的懸液至包被有高熔點凝膠的固相上，加蓋蓋片后置2～8℃使其凝固；5)移去蓋片，在低于低熔點凝膠熔點的溫度條件下，將包被固相水平浸入變性液中反應；6)將包被固相移入溶解液中，在低于低熔點凝膠熔點的溫度條件下反應；7)洗滌包被固相；8)用從低至高的乙醇濃度順序連續(xù)脫水，空氣中干燥；9)染色；10)顯微鏡下計數(shù)精子DNA碎片的發(fā)生率。一種檢測精子DNA碎片的裝置，包括包被固相、低熔點凝膠水溶液、變性液、溶解液和洗滌液。本發(fā)明突出的技術效果結果易于判定，操作簡單，易于臨床推廣應用。
文檔編號C12M1/34GK101525670SQ200910301318
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月2日 優(yōu)先權日2009年3月23日
發(fā)明者瑜 劉 申請人:瑜 劉