專利名稱：一株誘變得到的高產(chǎn)穩(wěn)定產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一株誘變得到的高產(chǎn)穩(wěn)定產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌及應(yīng)用。具體來說，是涉及 一株可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) YB-3，于2009年4月17日保藏于中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072 ，電話(027) 68754052，傳真(027) 68754833， E-mail: cctcc@whu.edu.cn，其保藏號(hào)為CCTCC NO: M209075,及其誘變選育方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
凝乳酶〔EC4.4. 1.4)屬于酸性蛋白酶，又稱天冬氨酸蛋白酶，是生產(chǎn)干酪不可缺少的制 劑，其產(chǎn)值占整個(gè)酶制劑總產(chǎn)值的15.5%。目前該酶的主要來源是未斷奶小牛胃粘膜、部分 植物組織和微生物。
凝乳酶的傳統(tǒng)來源是哺乳期小牛的皺胃，動(dòng)物凝乳酶以其凝乳活力與蛋白水解能力的高 比值而成為制作奶酪的首選酶。但是動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢且價(jià)格昂貴，容易增加企業(yè)生產(chǎn)成本，并 且從動(dòng)物中提取酶液程序和工藝較復(fù)雜。木瓜、無(wú)花果、菠蘿、南瓜、合歡樹、銀杏等植物 中都含有能使乳凝固的蛋白酶。植物來源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因 此很多植物性凝乳酶沒有得到大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。微生物凝乳酶來源廣泛，目前發(fā)現(xiàn)有40余 種微生物可生產(chǎn)一定量的凝乳酶。例如，芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、總狀毛霉( Mucor-racelnosus)、孚L白耙霉(Irpex-lacteus)、 易脆毛霉(Mucor fragilis)、米黑毛霉 (Mucor-michei)、寄生內(nèi)座殼菌(Endothia parasitisa)等。微生物生長(zhǎng)快，繁殖周期短， 生長(zhǎng)和產(chǎn)酶過程容易控制，且微生物所產(chǎn)的凝乳酶是一種胞外酶，提取方便，成本低。
枯草芽孢桿菌作為微生物源生產(chǎn)凝乳酶的為數(shù)不多的細(xì)菌，與霉菌比較具有許多優(yōu)勢(shì) 生長(zhǎng)速率快，發(fā)酵產(chǎn)酶周期在l-3天之間。而霉菌的發(fā)酵周期為7天；好氧生長(zhǎng)，抗剪切
力能力較強(qiáng)，可通過提高攪拌轉(zhuǎn)速來加快菌體生長(zhǎng)。霉菌生長(zhǎng)產(chǎn)生大量菌絲體，容易受到剪 切損傷，影響產(chǎn)酶。但到目前為止，其產(chǎn)生的凝乳酶活性和霉菌相比，還有一定差距。而且 枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的凝乳酶存在蛋白水解活性高的缺陷，影響奶酪的風(fēng)味和口感。
本發(fā)明采用紫外或者化學(xué)誘變的方法，并采用合適的誘變模型可以篩選出穩(wěn)定的高產(chǎn)的 菌株，篩選出的菌株在快速生長(zhǎng)的同時(shí)，也能產(chǎn)生大量的凝乳酶，并且具有比較低的蛋白水解活性，來彌補(bǔ)上述缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過對(duì)枯草芽孢桿菌野生菌株的誘變，得到具有高產(chǎn)凝乳酶能力的突 變株，并且該突變株所產(chǎn)的凝乳酶具有添加量低、催化位點(diǎn)專一、蛋白水解能力低、快 速凝固等特點(diǎn)。
本發(fā)明的目的在于提供一株通過紫外誘變得到的具有高產(chǎn)凝乳酶能力的細(xì)菌-枯草芽孢 桿菌的突變株-枯草芽孢桿菌YB-3，使其能經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)出在牛奶等原料乳中添加量低，催化 位點(diǎn)專一，蛋白水解能力低，具有凝固作用的凝乳酶。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明提供的可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌的誘變選育方法，其誘變步驟如下
(1) 菌種保藏。
出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌QL-2， CCTCC NO: M208023 (于2008年2月1日保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072 ，電話(027) 68754052，傳 真(027) 68754833， E-mail: cctcc@whu.edu.cn)分別保藏于含有30%甘油的改良NA液體 培養(yǎng)基，分別置于-2(TC和-8(TC低溫冰箱，半年接種復(fù)壯一次。
所述培養(yǎng)基組成(g/L):蛋白胨5，牛肉膏3，葡萄糖IO，酵母浸膏l(xiāng)， pH=7.0。于121 。C滅菌20分鐘。
(2) 出發(fā)菌株的培養(yǎng)
以枯草芽孢桿菌QL-2為出發(fā)菌株；將出發(fā)菌株接種于滅菌的改良NA液體培養(yǎng)基上28 3(TC復(fù)壯培養(yǎng)2-3代；再將培養(yǎng)穩(wěn)定的菌株接種于滅菌液體酪蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)2代，使其達(dá) 到正常的生長(zhǎng)周期，即得到出發(fā)菌株，備用；
所述酪蛋白培養(yǎng)基組成為(g/L):干酪素IO，牛肉膏3， NaH2P04 12H205， NaCl 5， pH=7. 0。于12rC滅菌20分鐘。
(3) 出發(fā)菌株單孢子懸液的制備
將步驟(2)中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的出發(fā)菌株菌液5ml于5000r/min離心10min;去上清，加滅 菌的生理鹽水3 5ml，輕微震蕩洗滌菌體后，5000r/min離心10min，此步驟重復(fù)操作2 3次 ;去上清后，用斡旋器打散菌體，制備成菌懸液。用顯微計(jì)數(shù)法，調(diào)整細(xì)胞濃度為l(^/ml。
(4) 菌體的紫外誘變和中間培養(yǎng)
將制備好單孢子懸液吸取3ml移入4)6cm的無(wú)菌平皿，使液層厚度在O. 3 0. 5cm;進(jìn)行紫外誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為25W，照射時(shí)間為O. 5 3min，照射距離10 30cm ;照射后吸取lml至用于中間培養(yǎng)的改良NA液體培養(yǎng)基和酪蛋白液體培養(yǎng)基中，27 35'C培 養(yǎng)4 8h。采取十倍稀釋法稀釋經(jīng)過中間培養(yǎng)的誘變菌體，取上述104 106三個(gè)稀釋度的菌 液O. 25ml分別涂布于酪蛋白水解平板和脫脂牛奶平板上，27 35。C培養(yǎng)2 3天，進(jìn)行初篩， 挑取5個(gè)菌落生長(zhǎng)速度較快，酪蛋白平板凝乳圈較大的單菌落，每個(gè)三個(gè)平行進(jìn)行搖瓶發(fā)酵 復(fù)篩，用IDF的相對(duì)牛奶凝結(jié)活力實(shí)驗(yàn)(REMCAT)測(cè)定凝乳酶活力。選擇凝乳酶產(chǎn)量高，并 且可以穩(wěn)定傳代3代以上的菌株，重復(fù)上述步驟進(jìn)行紫外誘變及篩選，剔除菌種退化，生長(zhǎng)速 度下降，蛋白酶活力過高或產(chǎn)酶性能下降的菌株，保留生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)凝乳酶性能優(yōu)良、穩(wěn) 定遺傳的菌株、凝乳酶產(chǎn)量較高的枯草芽孢桿菌YB-3。
所述的用于中間培養(yǎng)的酪蛋白培養(yǎng)基按以下比例配制干酪素10g，牛肉膏3g， NaH2P04 12H20 5g， NaCl 5g， CaCl2 lg， pH=7.0。于121。C滅菌20分鐘。
所述的凝乳酶測(cè)定方法參照IDF的方法157A: 1997。
所述的蛋白酶測(cè)定方法參照改良的Lorry法。
(5)枯草芽孢桿菌YB-3的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
將YB-3接種到滅菌液體培養(yǎng)基上，27 32。C搖瓶培養(yǎng)48h，取24h及48h發(fā)酵液，離心除 去菌體，測(cè)定發(fā)酵液中凝乳酶的活力和蛋白酶活力。搖瓶培養(yǎng)48h轉(zhuǎn)接到滅菌液體培養(yǎng)基中 ，27 32。C搖瓶培養(yǎng)48h，測(cè)定酶活，重復(fù)此步驟10次以上。
所述的傳代培養(yǎng)基為酪蛋白培養(yǎng)基按以下比例配制干酪素10g，牛肉膏3g， NaH2P04* 12H20 5g， NaCl 5g， pH=7. 0。間歇式滅菌。
所述的間歇式滅菌為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基特有滅菌方式。步驟如下
分裝培養(yǎng)基后，12rC滅菌20min。
待經(jīng)過初次滅菌的培養(yǎng)基冷卻后，置于恒溫?fù)u床30。C震蕩培養(yǎng)8h。 震蕩培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)基于12rC再次滅菌20min，冷卻后4'C低溫保存。 本發(fā)明提供的可高產(chǎn)凝乳酶的誘變選育方法，還包括將可得到高產(chǎn)菌株-枯草芽孢桿菌
YB-3保存在液體培養(yǎng)基上，分別于-2(TC和-8(TC保藏，每半年轉(zhuǎn)接一次。轉(zhuǎn)接用于該菌株的
正常傳代，以防止菌株退化。
所述液體培養(yǎng)基按以下比例配制蛋白胨5，牛肉膏3，葡萄糖IO，酵母浸膏l(xiāng)， pH=7.0
。于121。C滅菌20分鐘。
該可穩(wěn)定高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌可用于液體發(fā)酵制備凝乳酶粗酶液，這些凝乳酶粗
酶液可用制備奶酪和干酪素，縮短牛奶凝固時(shí)間。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌及其制備方法優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 誘變方法不復(fù)雜，操作方便，誘變提高活力達(dá)170%;
(2) 用該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶過程比傳統(tǒng)的霉菌相比，縮短生產(chǎn)周期達(dá)80%，降低發(fā)酵成本，使 凝乳酶在曲拉大量?jī)?yōu)質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用成為可能；
(3) 誘變育種的高產(chǎn)菌株可用于制備微生物食品用添加劑；
(4) 誘變育種的高產(chǎn)菌株可用于制備微生物工業(yè)用添加劑；
(5) 菌株穩(wěn)定性良好，經(jīng)過多次發(fā)酵生產(chǎn)，可保證其生產(chǎn)性能不發(fā)生較大程度的下降。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、誘變育種發(fā)明的可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌YB-3
按照本發(fā)明提供誘變選育方法，誘變選育可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌，其步驟如下
(1) 出發(fā)菌株的培養(yǎng)
以本實(shí)驗(yàn)室篩選出的菌株枯草芽孢桿菌QL-2作為出發(fā)菌株；
將出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌QL-2接種于滅菌的改良NA液體培養(yǎng)基上，3(TC復(fù)壯培養(yǎng)2代； 再將該穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌株接種于滅菌液體酪蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)2代，使其達(dá)到正常的生長(zhǎng)周期 ，即得到出發(fā)菌株，備用
所述酪蛋白培養(yǎng)基組成為(g/L):干酪素IO，牛肉膏3， NaH2P04 12H205， NaCl 5， pH=7. 0。于12rC滅菌20分鐘。
(2) 出發(fā)菌株單孢子懸液的制備
取步驟(1)中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌QL-2的菌液5ml， 5000r/min離心 10min;傾去上清，加滅菌的生理鹽水3ml，輕微震蕩洗滌菌體后，5000r/min離心10min，此 步驟重復(fù)操作2次；去上清后，用斡旋器打散菌體，制備成菌懸液。用顯微計(jì)數(shù)法，調(diào)整細(xì) 胞濃度為l()7/ml。
(3) 菌體的紫外誘變和中間培養(yǎng)
將制備好的單孢子懸液吸取3ml移入4)6cm的無(wú)菌平皿中，液層厚度達(dá)到O. 4cm左右；進(jìn) 行紫外誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為25W，照射時(shí)間為120s，照射距離25cm;在避光 情況下，吸取經(jīng)紫外燈照射的菌液lml，加入改良NA液體培養(yǎng)基進(jìn)行中間培養(yǎng)，28'C搖瓶培 養(yǎng)8h。取出經(jīng)過中間培養(yǎng)的菌液，采取十倍稀釋的方法稀釋菌液，吸取上述104 106三個(gè)稀 釋度的菌液0.25ml，分別涂布于酪蛋白水解平板，28'C培養(yǎng)2天。進(jìn)行初篩，挑取4個(gè)菌落生 長(zhǎng)速度較快，酪蛋白平板凝乳圈較大的單菌落，接種于酪蛋白液體培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩:采用IDF的相對(duì)牛奶凝結(jié)活力實(shí)驗(yàn)(REMCAT)測(cè)定凝乳酶活力。選擇凝乳酶產(chǎn)量高，并且 可以穩(wěn)定傳代3代以上的菌株，重復(fù)上述步驟進(jìn)行紫外誘變及篩選，剔除菌種退化，生長(zhǎng)速度 下降，蛋白酶活力過高或產(chǎn)酶性能下降的菌株，保留生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)凝乳酶性能優(yōu)良、穩(wěn)定 遺傳的菌株、凝乳酶產(chǎn)量較高的枯草芽孢桿菌YB-3。
所述的用于中間培養(yǎng)的酪蛋白培養(yǎng)基按以下比例配制干酪素10g，牛肉膏3g， NaH2P04 12H20 5g， NaCl 5g， CaCl2 lg， pH=7.0。于121。C滅菌20分鐘。
所述的凝乳酶測(cè)定方法參照IDF的方法157A: 1997。
所述的蛋白酶測(cè)定方法參照改良的Lorry法。
凝乳酶高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌YB-3的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
將凝乳酶高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌YB-3接種到滅菌液體培養(yǎng)基上，28。C搖瓶培養(yǎng)48h，取 24h及48h發(fā)酵液，離心除去菌體，測(cè)定發(fā)酵液中凝乳酶的活力和蛋白酶活力。搖瓶培養(yǎng)48h 轉(zhuǎn)接到滅菌液體培養(yǎng)基中，28'C搖瓶培養(yǎng)48h，測(cè)定酶活，重復(fù)此步驟10次。此時(shí)，出發(fā)菌 株與誘變菌株(第十代)的凝乳酶活性及蛋白酶活力如表l所示
表l、出發(fā)菌株與誘變菌株(第十代)的凝乳酶活性及蛋白酶活力的比較
菌株編號(hào)凝乳酶活力(u/ml)蛋白酶活力(u/ml)凝乳酶活力/蛋白酶活力
QL-216. 712. 21. 37
YB-3218. 226. 38. 30
與出發(fā)菌株相比，誘變得到的枯草芽孢桿菌YB-3凝乳酶活'性提高了1306%，凝乳酶活力
與蛋白酶活力比值提高了605%。
所述的傳代培養(yǎng)基為酪蛋白培養(yǎng)基按以下比例配制干酪素10g，牛肉膏3g， NaH2P04* 12H20 5g， NaCl 5g， pH=7. 0。間歇式滅菌。
所述的間歇式滅菌為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基特有滅菌方式。步驟如下
分裝培養(yǎng)基后，12rC滅菌20min。
待經(jīng)過初次滅菌的培養(yǎng)基冷卻后，置于恒溫?fù)u床30。C震蕩培養(yǎng)8h。 震蕩培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)基于12rC再次滅菌20min，冷卻后4'C低溫保存。
實(shí)施例3、可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌YB-3的發(fā)酵產(chǎn)酶
將枯草芽孢桿菌YB-3接種于滅菌的改良NA液體培養(yǎng)基上3(TC復(fù)壯培養(yǎng)3代；再將該穩(wěn)定 生長(zhǎng)的菌株接種于滅菌液體酪蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代，使其達(dá)到正常的生長(zhǎng)周期，備用。
所述酪蛋白培養(yǎng)基組成為(g/L):干酪素10，牛肉膏3， NaH2P04 12H20 5， NaCl 5，pH=7. 0。于12rC滅菌20分鐘。 種子培養(yǎng)
將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枯草芽孢桿菌YB-3菌液接種到滅菌的種子培養(yǎng)基，于30。C ， 200rpm震蕩培養(yǎng)36h，備用。
所述的種子培養(yǎng)基組成為(g/L):乳清粉20，麩皮30， NaH2P04 12H20 5， NaCl
5，CaCl2l， pH=7.0。除乳清粉外配成溶液，于12rC滅菌20分鐘；乳清粉單獨(dú)配成溶液 ，于108。C滅菌20分鐘，冷卻后混勻后即可使用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
為容量為20L的機(jī)械攪拌液體發(fā)酵罐配制發(fā)酵培養(yǎng)基投入2L麩皮水解液，160g乳清粉 ，40g NaH2P04 12H20 ， 40g NaCl禾口8g CaCl2 ，補(bǔ)7K至8L， pH自然。
所述麩皮水解液制備方法為準(zhǔn)確稱量麩皮240g，加入2.5L蒸餾水，加熱煮沸30min， 冷卻后8層紗布過濾殘?jiān)玫郊s2L濾液，備用。
滅菌
在壓力和溫度分別為O. 05MPa、 108'C條件下，對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌
處理，處理時(shí)間為30min。
接種培養(yǎng)
當(dāng)罐溫降至3(TC時(shí)，將預(yù)先經(jīng)二級(jí)培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枯草芽孢桿菌YB-3菌株的細(xì)菌 種子接入上述發(fā)酵罐中，接種量為100ml，在罐壓、通氣量、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和罐溫分別為O. 04 MPa、 600L/h、 150rpm和30。C的條件下，對(duì)該菌株連續(xù)發(fā)酵48h。
收獲凝乳酶粗酶液
經(jīng)上步處理后，上述變異菌株大量繁殖，從發(fā)酵罐中收獲發(fā)酵液，6000rpm離心15min除 去菌體，即得凝乳酶粗酶液，4"C保藏，用于酶的純化處理。同時(shí)取出過濾粗酶液，測(cè)定凝 乳酶活力和蛋白水解活力，分別達(dá)到58u/ml和10u/ml。
實(shí)施例4、發(fā)酵的凝乳酶粗酶液的應(yīng)用
調(diào)整粗酶液pH至6，于4(TC保溫15min，按l: IO的比例加入至含有O. 01mol/LCaCl2的脫 脂乳液中，4(TC保溫處理20min。脫脂乳液凝固成塊后，7(TC使酶失活，凝固后牛奶用于切 割成奶酪；或者經(jīng)過高溫蒸干水分處理，制備干酪素，凝乳效果較原菌株有了很大的改善。
牛奶脫脂步驟如下將鮮奶有小火煮沸后，離開火源，待其冷卻后將表面結(jié)成的一層奶 油皮用玻璃棒挑去，然后再煮開、冷卻、去皮，這樣反復(fù)幾次，直到不在結(jié)皮為止。
權(quán)利要求
1.一株能產(chǎn)生凝乳酶的細(xì)菌，其特征在于，該細(xì)菌是一株枯草芽孢桿菌的突變株，能夠利用麩皮發(fā)酵高產(chǎn)凝乳酶，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NOM209075。
2.一種利用權(quán)利要求l所述細(xì)菌生產(chǎn)凝乳酶的方法，其特征在于，以 麩皮及乳清粉為主要底物，添加磷酸氫二鉀及氯化鈣和水，調(diào)節(jié)pH為7.5左右，接種權(quán)力要 求l所述的枯草芽孢桿菌變異株，采用液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶。
3. 一種權(quán)利要求l所述的可高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌變異株的用途 ，通過權(quán)利要求2液體發(fā)酵制備的凝乳酶粗酶液用于牛奶制備奶酪和干酪素，縮短牛奶凝固 時(shí)間。
全文摘要
一株誘變得到的高產(chǎn)穩(wěn)定產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌及應(yīng)用。發(fā)明所用出發(fā)菌株是本實(shí)驗(yàn)室篩選所得的用于發(fā)酵產(chǎn)生干酪等產(chǎn)品的枯草芽孢桿菌，于2008年2月保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏名為枯草芽孢桿菌QL-2(Bacillus subtilis QL2)，保藏號(hào)M208023。其誘變選育步驟包括以保存于CCTCC、菌種保藏號(hào)M208023的枯草芽孢桿菌QL-2作為出發(fā)菌株，依次于復(fù)壯培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到出發(fā)菌株懸液；將菌懸液用渦旋裝置制成單孢子懸液后；再將此單孢子懸液進(jìn)行多次紫外誘變和培養(yǎng)，最后得到可穩(wěn)定高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌YB-3(Bacillus subtilis YB-3，CCTCC NOM209075)。該可穩(wěn)定高產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌可用于液體發(fā)酵制備凝乳酶粗酶液，這些凝乳酶粗酶液可用制備奶酪和干酪素，縮短牛奶凝固時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101665779SQ20091030223
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者劉河濤, 洋 李, 李紅玉 申請(qǐng)人:李紅玉;蘭州大學(xué)