專利名稱：Tt1基因在提高植物耐鹽堿性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TTl基因在提高植物耐鹽堿性中的用途。
背景技術(shù)：
隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展和基因克隆技術(shù)的不斷完善，植物基因工程研究正 向縱深發(fā)展，抗性基因研究已由抗生物逆性(如抗病、抗蟲)向抗非生物逆性(如抗寒、抗 旱、抗鹽等)轉(zhuǎn)移。目前世界上有100多個(gè)國家存在不同類型鹽堿地10億hm2，約占全球可耕地面積 的10%。我國鹽堿地面積達(dá)9913萬hm2，主要分布在華北、西北和東北等干旱、半干旱地區(qū)。 我國東北西部松嫩平原有鹽堿地面積370余萬hm2，是世界上三大蘇打鹽堿地集中分布區(qū)之 一。同時(shí)，由于工業(yè)污染、不合理灌溉和化肥使用不當(dāng)?shù)仍?，次生鹽堿化土壤面積也在迅 速增加。鹽堿地影響植被生長，使農(nóng)作物減產(chǎn)或絕收，并間接造成生態(tài)環(huán)境惡化，且能腐蝕 損壞工程設(shè)施，所造成的損失每年達(dá)25. 11億元。因此，如何減輕土壤鹽堿化對作物的危害，充分利用有限的國土資源成為農(nóng)業(yè)可 持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題之一。除利用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)、生物等措施進(jìn)行綜合治理 外，應(yīng)用最新的分子生物學(xué)方法，通過基因工程提高作物耐性將是最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。鹽堿土是含過多的NaCl、Na2SO4, Na2CO3和NaHCO3等鹽類的土壤。鹽堿土對植物 的毒害主要包括鹽脅迫和高PH脅迫及這兩種因素相互作用產(chǎn)生的復(fù)合毒害。鹽堿脅迫對 植物造成的主要傷害表現(xiàn)在以下三個(gè)方面一是細(xì)胞質(zhì)中金屬離子(主要是Na)的大量積 累，它會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡并抑制細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝過程，使植物光合作用能力下降， 最終因碳饑餓而死亡；二是鹽堿土壤是一個(gè)高滲環(huán)境，它能阻止植物根系吸收水分，從而使 植物因“干旱”而死亡；三是鹽堿土壤PH值較高，這使得植物體與外界環(huán)境酸堿失衡，進(jìn)而 破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞內(nèi)溶物外滲而使植物死亡。因而，受鹽堿脅迫的植物一方面 要降低細(xì)胞質(zhì)中離子積累，另一方面還通過積累過程產(chǎn)生某些特殊的產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、氨基 酸、糖類等來增強(qiáng)細(xì)胞的滲透壓，阻止細(xì)胞失水，穩(wěn)定質(zhì)膜及酶類的結(jié)構(gòu)。由于鹽堿地廣泛存在，該領(lǐng)域的研究正在成為一個(gè)新的熱點(diǎn)。現(xiàn)在國內(nèi)的研究主 要集中在鹽堿地植物如何響應(yīng)PH脅迫，對生理表型和基因表達(dá)都僅是初步探索，主要的研 究對象是一些耐鹽堿植物，如星星草、羊草、向日葵、白刺等，但每種植物都有其特殊的代謝 過程，不具有普遍的指導(dǎo)意義。另外，由于這些植物的基因組信息尚不清楚，也會(huì)阻礙在分 子水平上研究植物響應(yīng)高PH脅迫的進(jìn)程。使用基因工程技術(shù)對植物進(jìn)行改良是近年來的熱點(diǎn)。使用基因工程技術(shù)以期提高 植物的耐鹽堿性，培育出耐鹽堿品系也是一個(gè)可行之道。但是，目前還鮮見有提高植物耐鹽 堿性的基因的報(bào)道。在申請人之前遞交的中國專利申請200810045667. 8中記載了分離自 油菜的新基因，命名為TT1。本領(lǐng)域需要開發(fā)出能夠提高植物耐鹽堿性的備選基因，以及運(yùn)用基因工程技術(shù)提 高植物的耐鹽堿性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物耐鹽堿性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新 的有效選擇。本發(fā)明解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了 TTl基因在提高植物耐鹽堿性中的 用途。其中，上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；或(2)在(1)中的核苷酸序列經(jīng)過取 代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所得的衍生序列，且該衍生序列與SEQ ID NO :1的序列編 碼功能相同的多肽。SEQ ID NO 1的核苷酸序列所編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明還提供了 TTl基因編碼的多肽在提高植物耐鹽堿性中的用途。上述TTl基 因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過 取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼 功能相同的多肽。也能提高植物耐鹽堿性。此外，本發(fā)明還提供了一種培育耐鹽堿植物的方法。該方法包括以下步驟(1)將上述TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成含SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因耐鹽堿植株及其后代，所 述后代包括植物種子及植物組織。本發(fā)明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，該 基因來源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方法，篩選到油菜中 的一個(gè)EST序列，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’RACE的方法獲得序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。然后根據(jù)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對PCR引物，即可 從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因可操作地插入到載體中獲得，上述載體可選 用本領(lǐng)域已知的各種載體，尤其是真核表達(dá)載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明用上 述重組載體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因耐鹽堿 植株及其后代，所述后代包括植物種子及植物組織。在本發(fā)明中，“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 核苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO :1所編碼的蛋白活性的多 肽的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相 同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO 1 同源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生序列”的含義還包括能 在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO :1中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%， 更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。且該核苷酸序列與與SEQ ID N0:1的序 列編碼功能相同的多肽，在本發(fā)明中的相同功能是指提高植物的耐鹽堿性。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO :2相同功能的蛋白的SEQ ID NO=I 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1 90個(gè)，較佳地1 60個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為 10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高植物的耐鹽堿性。本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域 已知的各種載體，尤其是真核表達(dá)載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明用上述重組載 體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因耐鹽堿性植株及 其后代，所述后代包括植物種子及植物組織。本發(fā)明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽 的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子控制序 列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位 置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTl基因在提高植物耐鹽堿性方面的用 途，在本發(fā)明的實(shí)施例中也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)入了 TTl基因的植物在鹽堿性環(huán)境下其種子 萌發(fā)率有了明顯提高，生長后的植株中的脯氨酸含量也有提高，證明了 TTl基因TTl基因能 有效的提高植物耐鹽堿性。本發(fā)明培育出耐鹽堿植物的方法也簡便而有效，為提高植物耐 鹽堿性提供了新的有效選擇，具有好的應(yīng)用前景。


圖1、瓊脂糖電泳檢測目的基因是否已轉(zhuǎn)入擬南芥，1 12道為轉(zhuǎn)基因擬南芥基因 組DNA，13道為含SEQ ID NO 1的過量表達(dá)重組質(zhì)粒DNA。圖2、不同濃度(mmol/DNaCl對非轉(zhuǎn)TTl基因擬南芥種子萌發(fā)率的影響。圖3、不同濃度(mmol/L) NaCl對TTl基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率的影響。圖4、不同處理組的脯氨酸含量(μ g/g)。其中RLD為野生型，OEa, OEb, OEc, OEd 為過表達(dá)TTl基因擬南芥株系，縱坐標(biāo)為脯氨酸含量(μ g/g)。圖5、不同處理組脯氨酸紅色甲苯溶液在比色杯中的顏色。其中RLD為野生型， OEa, OEb, OEc, OEd為過表達(dá)TTl基因擬南芥株系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件 的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中，所用載體PET28，pGEX-2T，pGEM_T購自于Qiagen 公司，菌株BL21購自于Qiagen公司，菌株EHA105、載體pBI121購自于Clontech公司。其 余化學(xué)試劑均為市售分析純。下述實(shí)施例中，“SEQ ID NO 1”單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解1其為“SEQ IDNO 1所示核苷酸序列”的簡稱，實(shí)施例一TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個(gè)EST序列(SEQ ID NO :3所示，編 碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5'RACE (見Takara 公司所公開的5’RACE方法資料)的方法獲得本發(fā)明所述提高植物和微生物耐熱性基因，其 核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物(SEQID NO 7) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95"C 30s (變性)3. 53"C 30s (復(fù)性)4. 72"C 50s (延伸)5. 2-4步驟循環(huán)30次6. 72 "C 5min (終延伸)7.4V 保存。對PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產(chǎn)物純化資料)，經(jīng)測序驗(yàn)證，得到 序列SEQ ID NO 1的基因片段。核苷酸序列SEQ ID NO 1的替換與缺失根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，設(shè)計(jì) 出上游引物(SEQ ID NO :9)5-ATGGCTGATGATTTCAGTTTATGTAC-3’ 和下游引物(SEQ ID NO: 10) 5_，TTGGGTTGGATATTGGCGGCGGCTG-3，，以連接有 SEQ ID NO 1 的載體 pET28 做模板，PCR 擴(kuò)增出SEQ ID N0:5序列(編碼的多肽序列為SEQ ID NO :6所示，是在SEQ ID NO :2序列 N端的第二個(gè)絲氨酸替換成丙氨酸以及第五位的亮氨酸替換成苯丙氨酸，并且C端缺失三 個(gè)氨基酸)，然后連接PGEM-T載體。設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整SEQ ID NO 5序列的引物上游引物(SEQID NO 11)5' -CCGGAA TTC ATG GCT GAT GAT TTC AG TTT ATG TAC-3，，下游引物(SEQID NO 12)5' -CCGGAGCTC TTG GGT TGG ATATTG GCG GCG GCT G-3'經(jīng)PCR從連接有SEQ ID NO 5的pGEM_T載體中擴(kuò)增SEQ ID NO 3的核苷酸序列。PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C 30s (變性)
3. 53"C 30s (復(fù)性)4. 72"C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環(huán)30次6. 72 "C 5min (終延伸)7. 4°C 保存。對PCR產(chǎn)物純化，然后用BamHl與Sacl酶切，膠回收，與pET28連接(連接位 點(diǎn)=BamHl與Sacl)，獲含SEQ ID NO 4的重組質(zhì)粒。將含SEQ ID NO 4的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上。經(jīng)測序驗(yàn)證，得到含SEQ ID NO 3的重組質(zhì)粒 的 E. colipET28 菌株。A、挑取含SEQ ID NO 1的過量表達(dá)重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含20mg/L Str, 50mg/ LKan,40mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖菌過夜后收集菌體，重懸于含0. 01%表面活 性劑silwet-77的MS液體培養(yǎng)基中至OD600 = 0. 4-0. 6，28°C搖菌l_2h，菌液待用。B、將培養(yǎng)60天的擬南芥已長出的花序剪掉，用含有SEQ ID NO :1的過量表達(dá)重組 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液浸泡花序2分鐘，之后暗培養(yǎng)48小時(shí)，暗培養(yǎng)后的擬南芥苗即可移入正 常光照環(huán)境生長，隨后長出的莢果即為轉(zhuǎn)TTl基因TO代種子。2、轉(zhuǎn)基因鑒定將收獲的種子栽種，長至50天后，取少許葉片進(jìn)行PCR檢測上游引物(SEQID NO 15) :5，ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3，下游引物(SEQID NO 16) :5，TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT 3，根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，PCR程序如下
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1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C 30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C 50s (延伸)5.2 4步驟循環(huán)37次6. 72 "C 5min (終延伸)7.4V 保存。然后瓊脂糖電泳檢測是否有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，若有則代表目的基因已轉(zhuǎn)入擬南芥。 檢測結(jié)果見圖1 1 12道為轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA，13道為含SEQ ID NO 1的過量表達(dá)重組質(zhì) 粒DNA，待檢測DNA的目的條帶與過量表達(dá)質(zhì)粒DNA的帶一致，說明為SEQ ID N0:1核苷酸 過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株并制得其種子。3、轉(zhuǎn)基因陽性植株成熟后，收集種子備用。同理，制得SEQ ID NO :3序列過表達(dá)的 擬南芥植株制備和種子備用。實(shí)施例三、不同濃度NaCl對擬南芥種子萌發(fā)率的影響鹽堿土的鹽類通常為NaCl、Na2S0、Na2C0和NaHC03等，鹽脅迫除了也能造成水勢降低外還有Na離子升高造成的離子脅迫，影響了植物對K離子和Ca離子等營養(yǎng)的吸收，從 而對植物造成傷害。因此，本實(shí)驗(yàn)采用NaCl模擬鹽脅迫條件。配制好的MS培養(yǎng)基(配方見表1，pH用KOH調(diào)至5. 8)在滅菌之前分別將NaCl 添加進(jìn)去，使得NaCl終濃度分別為0mmol/L(對照組)、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、 200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L，高壓蒸汽滅菌后分裝到培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基凝固后用2mL 無菌水懸浮種子轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基上，待種子均勻播種后除去多余無菌水，打開皿蓋，于無菌環(huán)境 中放置Ih至表面干燥，封口，然后放到培養(yǎng)室(22°C，光照強(qiáng)度6000 80001x，16h/8h光暗 周期，相對濕度70% )培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每天觀察萌發(fā)及其他表型，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)，取 其平均值。表IMS培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
TT1基因在提高植物耐鹽堿性中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸衍生所得 的核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高植物耐鹽堿性中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸衍生所得 的核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同的多肽。
5.一種培育耐鹽堿植物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因耐鹽堿植株及其后代，所述后 代包括植物種子及植物組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸衍生所得 的核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同的多肽。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TT1基因在提高植物耐鹽堿性中的用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物耐鹽堿性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了TT1基因在提高植物耐鹽堿性方面的用途，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入了TT1基因的植物在鹽堿性環(huán)境下其種子萌發(fā)率有了明顯提高，生長后的植株中的脯氨酸含量也有提高，證明了TT1基因TT1基因能有效的提高植物耐鹽堿性。本發(fā)明培育出耐鹽堿植物的方法也簡便而有效，為提高植物耐鹽堿性提供了新的有效選擇。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101962656SQ20091030472
公開日2011年2月2日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司