專利名稱：高純度膠原蛋白的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明有關于一種膠原蛋白制備方法。
背景技術：
膠原蛋白是一種纖維蛋白(fibrous protein)，其可在軟骨、筋腱、真皮組織以及 其它結締組織中發(fā)現(xiàn)。膠原蛋白已廣泛運用于工業(yè)以及醫(yī)藥。膠原蛋白一般藉由可將非膠原蛋白物質移除的反復酸溶或酵素處理，而由結締組 織純化出來。此種處理需重復數(shù)次以改善膠原蛋白的純度。重復處理不僅會拉長純化工藝， 更會導致膠原蛋白產率低。因而需要一種新穎的高純度膠原蛋白制備方法。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的特征為一種高純度膠原蛋白制備方法，其先由一結締組織(例如 真皮組織或筋腱)制造一膠原蛋白基質，然后再由基質萃取出膠原蛋白。詳細言之，此方法 包含下列步驟⑴提供一結締組織，其表面積為20平方毫米(mm2)至2平方公尺(m2)(例 如，25平方公厘至900平方公分)；(ii)以一第一酸液使該結締組織的體積至少膨脹百分 之五十(較佳為100%至500% )而形成一膨脹結締組織；(iii)清洗該膨脹結締組織以除 去非膠原蛋白物質藉此形成一膠原蛋白基質；以及(iv)利用一萃取液從該膠原蛋白基質 萃取出膠原蛋白，藉此制造一含有膠原蛋白的溶液。上述的膨脹步驟可藉由將結締組織浸泡于該第一酸液而達成。較佳地，上述的浸 泡步驟藉由同時將一液體噴射至結締組織或同時以一超音波處理結締組織而達成。上述的 結締組織源自真皮組織或筋腱。該第一酸液的PH值為1至6 (較佳為2至4)，且該第一酸 液實質上不包含鹽類，也就是說溶液中沒有鹽類成分，或者是鹽類濃度非常低，使得溶液的 離子強度不大于0. 005M。上述的酸液可由甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷 酸或其混合物來制備。較佳的是，上述酸液為0. 1-6M的醋酸溶液。在上述的膨脹步驟之后，將膨脹后的結締組織加以清洗以除去非膠原蛋白物質， 藉此制備出一膠原蛋白基質。上述的清洗步驟可藉由將該膨脹結締組織浸泡于一清洗液 而達成，該清洗液可以進一步包含清潔劑、蛋白水解酶或其混合物；在上述浸泡或清洗步驟 中，可將該膨脹結締組織以超音波處理或以液體噴射處理。然后將前述膠原蛋白基質浸于一萃取液中，藉此形成一含有膠原蛋白的溶液。該 萃取液可以是含有弱有機酸(例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其 混合物)的酸液，該酸液的PH值適于溶解膠原蛋白(較佳為小于4)。此外，該萃取液可以 是含有鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)的中性溶液(例如0. 05M的Tris緩沖溶液)，該鹽的濃 度適于溶解膠原蛋白(例如大于1M)。在一實施例中，膠原蛋白藉由下列步驟從該膠原蛋白 基質萃取出研磨該膠原蛋白基質而制得膠原蛋白粉末，以及將該膠原蛋白粉末與該萃取 液混合而制得該含有膠原蛋白的溶液。該研磨步驟以及該混合步驟可同時進行。
接著，可以習用方法將膠原蛋白由該含有膠原蛋白的溶液中沉淀。在一實施例中， 該膠原蛋白藉由透析法沉淀。在另一實施例中，將該含有膠原蛋白的溶液與一鹽以IM至4M 的濃度混合來使膠原蛋白沉淀；如此獲得的膠原蛋白較佳需進行脫鹽。在又一實施例中，將 該含有膠原蛋白的溶液的PH值調整至4. 5到8來使膠原蛋白沉淀。制得的膠原蛋白可加以冷凍干燥、空氣干燥或真空干燥而形成膠原蛋白粉末、膠 原蛋白海綿狀物(sponge)、膠原蛋白片狀物或膠原蛋白膜。制得的膠原蛋白粉末可分散 于一酸液中而形成一膠原蛋白分散溶液，制得的膠原蛋白粉末亦可以蛋白水解酶處理以 制造無端肽膠原蛋白(atelop印tide collagen)。蛋白水解酶的例子包含，但不限于，胃 蛋白酶(ρ印sin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰凝乳蛋 白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無花果蛋白酶(f icin)、木瓜蛋白酶 (papain)、勝月太酶(peptidase)、蛋白酶 A(proteinaseA)、蛋白酶〖(proteinase K)、胰蛋白 酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbialproteases)及其混合物。下文特舉本發(fā)明一些實施例作詳細說明如后。本發(fā)明的其他目的或特征將呈現(xiàn)于 后述實施例以及后附的申請專利范圍。
具體實施例方式膠原蛋白長約300奈米(nm)，直徑約1. 5奈米(nm)。大量的膠原蛋白分子形成膠 原蛋白纖維絲，而一束膠原蛋白纖維絲形成一膠原蛋白纖維。膠原蛋白分子之間以及膠原 蛋白分子內部存在著共價的交聯(lián)，藉此在結締組織內形成了纖維狀的網絡。在此所述為一種高純度膠原蛋白制備方法，其直接先由一結締組織制造一膠原蛋 白基質，然后再由該膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白。制備膠原蛋白基質起始材料(亦即結締組織)可取自于動物，例如牛、豬、馬、羊、雞、鴨、火雞、鵝、鯨 魚或者鯊魚等畜類或魚類。適用于本發(fā)明方法的結締組織包含，但不限于，真皮組織、皮下 組織、韌帶、筋腱、腱膜、軟骨以及骨頭組織。假如需要的話，可先用人工[例如藉由粗略的 切開(grossdissection)]或機械清理結締組織以除去不需要的材料，例如脂肪及脂質。在 一實施例中，真皮組織取自新鮮的動物皮，將動物皮除去脂質、以鹽水(saline)清洗皮數(shù) 次后，以一植皮刀(dermatome)除去動物皮的表面層即可獲得真皮組織。所得的真皮組織 可用磷酸鹽緩沖溶液進一步清洗。假如需要，結締組織可以先用一適合的有機溶劑或者是一有機溶劑與水的混合液 進行處理，使有機溶劑可以滲透入結締組織。有機溶劑包含，但不限于醇、酮、丙酮、乙腈、氯 仿、N，N- 二甲基甲酰胺、二甲亞砜或其混合物。當使用有機溶劑與水的混合液時，有機溶劑 與水的比例高于1 5(例如1 4、1 1或4 1)。當結締組織含有毛發(fā)或毛根時，可先以一微堿溶液或蛋白水解酶處理以除去毛 發(fā)或毛根，蛋白水解酶可為，例如分散酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶 (papain)、胃蛋白酶(ρ印sin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain), 無花果蛋白酶(ficin)或其混合物。接著，將上述任一結締組織浸泡于適量酸液中，經過適當?shù)臅r間后，使得結締組織 膨脹到所需的標準，亦即比原厚度至少增加50 %的厚度(較佳為原厚度的2-5倍)。上述的酸液可以一有機酸來制備，有機酸可為，例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、 磷酸或其混合物。在一實施例中，酸液可為濃度0. 1-6M(較佳為0. 1-2M或0. 5-1. 25M)的 醋酸。為了獲得較佳的膨脹效果，本發(fā)明所使用的酸液實質上不包含鹽類。在上述的膨脹步驟中，結締組織是懸浮于以上所述的酸液中。假如需要的話，可利 用一或數(shù)道液體來處理結締組織，促使酸液滲透入結締組織并縮短膨脹結締組織至所需標 準的時間。上述的液體可以由一容器的噴嘴或噴孔來噴出，上述的酸液及結締組織置放于 該容器內?；蛘?，或此外，可將超音波(由一超音波震動裝置產生)或高頻率水波(藉由一電 磁場產生)施加于浸泡于酸液中的結締組織，以促使酸液滲透入結締組織。使用一清洗液來清洗上述膨脹步驟所制備的膨脹結締組織，以實質上除去上述膨 脹結締組織中的非膠原蛋白物質，藉此以制備一膠原蛋白基質。所述的清洗液可含有清潔 劑、螯合劑、蛋白酶或其混合物。用以制備清洗液的范例清潔劑包含，但不限于十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulphate, SDS)、Tego化合物[例如介面活性劑Tween-80、非離子清潔劑TffR(Triton W. R. 1339)、對-異辛烷基聚氧-乙烯苯酚聚合物(p-isooctylpolyoxy-ethylene phenol polymer)與四丁酚醛(Triton A20)表面活性劑]、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、溴化十六燒基三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide)、二辛燒鈉磺基 琥珀酸酯(dioctyl sodium sulphosuccinate)、品名為「Emasol 4130J的聚氧基乙烯山梨 糖醇油酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monoleate)介面活性齊[J、品名為「Lubrol W」的 非離子介面活性劑、品名為「Nonidet P40」的非離子介面活性劑)。在一實施例中，使用一 含有SDS濃度0. 01 %至10%的清洗液，在4°C至45°C溫度下處理所述膨脹結締組織1小時 至150小時。所述清潔液所含的螯合劑包含，但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十 二燒基 _1，4，7，10，-四乙酸(1， 4,7, 10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, D0TA)>1,4,7,10-四 氮雜環(huán)十 二燒基_1，4，7，10，-四亞甲基磷酸[1，4，7，10-tetraazacyclododecane-l， 4,7,10-tetrakis (methylenephosphonic acid), D0TP]、環(huán)己二胺四醋酸(trans-1， 2-diaminocyclohexantetra-acetic acid, CDTA)、4,5_ 二 輕基苯-1,3- 二石黃酸(4,
5-dihydroxybenzene-l,3-disulphonicacid, Tiron)> 硫月尿(thiourea)>8- ψ 基
啉-5-石黃酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonic acid)、3,6_ 二石黃基 8_ 二輕基萘(3,
6-disulpho-l,8-dihydroxy-naphthalene)> EriochromeschwarzT[1-(1-徑基 ~2~ 蔡基 偶氮)-2-羥基-5-硝基-4-萘磺酸]{Eriochromeschwarz T [1- (l-hydroxy-2-naphth ylazo)-2-hydroxy-5__nitro-4-naphthalenesulphonic acid]}、紅紫酸 I安(ammonium purpurate)等。較佳的螯合劑為0. OlmM至IOOmM的EDTA?；蛘?，或此外，清洗液可包含一或多種蛋白水解酶，例如無花果蛋白酶(ficin)、 胃蛋白酶(P印Sin)、胰蛋白酶(trypsin)、分散酶(dispase)以及溶血素(hermolysin), 以除去連接于細胞外基質的蛋白質、其它非膠原蛋白的蛋白質與膠原蛋白分子的末端肽 (telopeptide)。在此技術領域中，有限度的酵素切割(亦即使非膠原蛋白的蛋白質降解但 仍保持膠原蛋白纖維的完整性))的條件是眾所皆知的。
在清洗步驟中，可將所述膨脹的結締組織浸泡于前面所提到酸液之中的任一種一 段適當?shù)臅r間。在一實施例中，將一或多道液體自一噴嘴或噴孔噴射至所述的結締組織，以 促進非膠原蛋白物質的移除。所述液體可為水、包含清潔劑的溶液或包含酵素的溶液。在 另一實施例中，使用超音波處理浸泡于清洗液中的膨脹結締組織，可改善清洗效率。習知用以將非膠原蛋白物質由結締組織移除的方法(例如美國專利第 7，498，412,5, 993，844以及5，374，539號)亦可用于本發(fā)明?？蓪⒁呀涍M行過上述清洗步驟的膠原蛋白基質在液態(tài)氮中冷凍干燥法進行保 存?；蛘撸z原蛋白基質可浸泡于一磷酸鹽緩沖溶液中并儲存于4°C的溫度環(huán)境。當有需 要時，可藉由一般的化學或物理方法使上述的膠原蛋白基質交聯(lián)化。用于使上述膠原蛋 白基質交聯(lián)化的交聯(lián)劑包含戊二醛(glutaraldehyde)、甲醛(formaldehyde)、碳二酰胺 (carbodiimide)或其它聚環(huán)氧樹脂化合物(poly印oxy compound)，例如乙二醇二縮水甘油 Bi (glycol diglycidyl ether)、聚醚多縮水甘油醚(polyol polyglycidylether)、二羧酸 二縮水甘油酉旨(dicarboxylic acid diglycidyl ester)。前述用以制備膠原蛋白基質的方法在至少兩個面向上不同于習知的方法。第一， 本發(fā)明的方法不需要嚴苛的物理或化學處理法(例如研磨、均質化或酸/堿降解)，這些方 法都會破壞結締組織中膠原蛋白纖維的網絡結構。第二，用以膨脹結締組織的酸液實質上 不包含鹽類，而一般習知方法是利用鹽類來穩(wěn)定膠原蛋白纖維。從膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白以前述方法制備的膠原蛋白基質可以被研磨，例如以震蕩、攪拌、均質化、絞碎、撕 裂、切割、磨碎、切或其混合方式。將膠原蛋白基質(完整的或研磨過的)浸于一萃取液中 一段適當期間，以允許溶解最大量的膠原蛋白。在一實施例中，將研磨過的膠原蛋白基質與 萃取液在溫和的機械動作(例如震蕩、攪動或攪拌)下混合以促進膠原蛋白溶解。該萃取液可以是一酸液或含有鹽的中性溶液，其pH值或鹽濃度適于溶解膠原蛋 白。適用于制備萃取液的酸包含，但不限于，甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、 磷酸或其混合物。當使用醋酸時，其濃度為0. 1_6M(較佳為0. 1-2M或0. 5-1. 25M)。例示的鹽 包含氯化鈉以及氯化鉀，其濃度為0. 1_2M(較佳為1M)。例示的中性溶液包含磷酸緩沖溶液 (PBS)以及Tris緩沖溶液。當使用pH值7-8的中性緩沖溶液，可加入一種或多種中性鹽(例 如IM氯化鉀或氯化鈉)以增加膠原蛋白在緩沖溶液中的溶解度。其它適用于制備萃取液 的緩沖溶液包含，但不限于，甘胺酸-HCl緩沖溶液(glycine-HCl buffer)、Clark and Lubs 緩沖溶液、檸檬酸-Na2HPO4 緩沖溶液(citric acid-Na2HP04 buffer), Britton-Robinson 緩沖溶液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(citric acid-sodium citrate buffer)、貝 他-貝他，-二甲基戊二酸-NaOH 緩沖溶液(beta :beta' -dimethylglutaricacid-NaOH buffer)、醋酸鈉-檸檬酸鈉緩沖溶液(sodium acetate-sodiumcitrate buffer)、琥珀 酸-NaOH 緩沖溶液(succinic acid-NaOH buffer)、二 甲胂酸-HCl 緩沖溶液(sodium cacodylate-HCl buffer)、馬來酸氧鈉-NaOH 緩沖溶液(sodium hydrogen maleate-NaOH buffer)、Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖溶液、碳酸鈉-5% CO2 緩沖溶液(sodium bicarbonate-5% CO2 buffer)、亞胺唑(咪唑)-HCl 緩沖溶液[imidazole (glyoxaline)-HCl buffer],2,4, 6-三甲基吡啶(可力丁)緩沖溶液[2，4，6-trimethylpyridine(collidine)buffer]、三 乙醇胺鹽酸鹽-NaOH 緩沖溶液(triethanolaminehydrochloride-NaOH buffer)、5，5- 二乙基巴比土酸鈉鹽緩沖溶液(sodium5，5' -diethyl barbiturate buffer)、二甲基亮 胺酰甘胺酸緩沖溶液(dimethylleucylglycine buffer)以及N-乙基嗎啉-HCl緩沖溶 液-(N-ethylmorpholine-HCl buffer)。萃取后，將不溶物移除(例如藉由離心或過濾)可得含有膠原蛋白的溶液。如有 必要，可以用相同的萃取液萃取不溶物一次或數(shù)次，上清液(soluble fraction)可以與該 含有膠原蛋白的溶液混合在一起。該含有膠原蛋白的溶液可以蛋白水解酶水解(digestion)處理以除去末端肽 (telop印tide)，藉此制造無端肽膠原蛋白(atelop印tidecollagen)。適用于此水解的蛋 白水解酶包含，但不限于，胃蛋白酶(P印sin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶 (chymopapain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無花果蛋白 酶(ficin)、木瓜蛋白酶(papain)、勝肽酶(ρ印tidase)、蛋白酶A (proteinaseA)、蛋白酶 K (proteinase K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbialproteases)及其混合 物。水解反應的條件視所使用的酶而定。例如，當使用胃蛋白酶時，反應混合物的PH值約 為2-5，酶濃度約為待處理膠原蛋白的0. 001-10wt%，待處理膠原蛋白約為0. 5g/l至IOg/ 1 (較佳為lg/Ι至5g/l)。膠原蛋白可由前述含有膠原蛋白的溶液中沉淀而進一步純化。此沉淀工藝可重復 直至達到所要的純度。在一實施例中，該膠原蛋白藉由透析法沉淀，其將前述含有膠原蛋白 的溶液以一透析管(截留分子量約為12，000至14，000)對著一緩沖溶液透析。在另一實施 例中，在該含有膠原蛋白的溶液中加入鹽(例如堿金屬鹵化物(例如氯化鈉))至IM至4M 的濃度來使膠原蛋白沉淀，然后離心收集膠原蛋白并以超過濾(ultrafiltration)、透析或 以稀釋酸液脫鹽。在又一實施例中，將該含有膠原蛋白的溶液的PH值調整至膠原蛋白不溶 的PH值來使膠原蛋白沉淀。參見W0/2004/096384。膠原蛋白的純化也可藉由前述方法的 組合而達成。沉淀的膠原蛋白可以使其重新懸浮(resuspended)并利用超過濾膜進行緩沖 液交換。以前述任一方法制得的膠原蛋白可在真空下冷凍干燥。此外，亦可以使膠原蛋白 重新懸浮于一適當溶液。相信在此技術領域中的熟悉技藝者基于前述的描述，都可將本發(fā)明充分的利用而 不需進一步的詳細描述。因此，下文所舉實施例僅僅只是作為范例，并非用以在任何方面限 制本發(fā)明。在此引用的所有文獻并入本案以為參照。實施例1 制備膠原蛋白基質自豬身上取得皮膚組織，除去脂質后，以鹽水清洗皮數(shù)次，以植皮刀(dermatome) 除去皮的表皮層以獲得一厚度為0.3毫米(mm)的真皮組織。進一步以磷酸鹽緩沖溶液清 洗所述的真皮組織。在清洗過后，將所有緩沖溶液殘余物自真皮組織的表面完全的除去。將真皮組織置入一裝有濃度0. 5M醋酸溶液的容器內，并在37°C定溫放置一天半 來使真皮組織膨脹至厚度為0. 45毫米。在定溫放置期間，容器是置于一震動器上，以使真 皮組織懸浮。接著將膨脹后的真皮組織浸泡于室溫下含有0. 5 %的SDS與0. 5mM的EDTA的溶液 中兩小時，以除去非膠原蛋白物質而產生一膠原蛋白基質。以一經過殺菌處理的磷酸鹽緩 沖溶液清洗上述的膠原蛋白基質，以除去殘余的SDS與EDTA。
實施例2 由膠原蛋白基質萃取膠原蛋白將以實施例1所述方法制備的膠原蛋白基質浸于0. 5M醋酸溶液12至M小時并 加以攪拌。將產生的混合物以2000rpm(700Xg)離心1小時后，收集上清液并儲存在4°C。將含有純化膠原蛋白的上清液以胃蛋白酶(0. 2mg/ml)處理M小時以制造無端肽 膠原蛋白。實施例3 以透析法純化膠原蛋白將膠原蛋白利用實施例2所述的步驟由膠原蛋白基質萃取出來并制備含有膠原 蛋白的溶液。將該溶液以一纖維素膜(MWC0 12-14，000)對著一 0.02M磷酸二氫鈉緩沖液 透析后，在SOOOxg離心1小時。收集團粒(pellet)，以冷MilliQ水沖洗數(shù)次，然后將團粒 重新懸浮在冷MilliQ水中。將懸浮液在8000xg離心1小時。將產生的膠原蛋白團粒重新懸浮在0. IM的醋酸中。實施例4 以鹽析法(salting-out)或改變pH來純化膠原蛋白將膠原蛋白利用實施例2所述的步驟由膠原蛋白基質萃取出來并制備含有膠原 蛋白的溶液。在該溶液中逐漸加入氯化鈉至最終濃度為2. 5M。收集沉淀的膠原蛋白并以蒸餾水 清洗后，將其重新懸浮在0. IM的醋酸中。此外，在該含有膠原蛋白的溶液中加入IM NaOH,將其pH值調整至7。將混合物置 于冷房中攪拌3小時讓膠原蛋白沉淀。之后，將混合物在4°C離心10分鐘后，將膠原蛋白團 粒重新懸浮在去離子水中。將懸浮液的PH值以0. IM鹽酸調整至低于3. 5用以讓膠原蛋白 溶解。其他實施例本發(fā)明所揭露的所有特征應可以任何結合方式實現(xiàn)。本發(fā)明所揭露的每一特征應 可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此，除非有明確的指定，否則所揭露的每一 個特征僅僅只是均等物或相似特征的一個種類的一實施例。由上述內容可知，任何在此技術領域中具有通常知識者，將可輕易從本發(fā)明的揭 露中了解到本發(fā)明的特征，在不偏離后附申請專利范圍所界定的本發(fā)明的精神與范圍下， 當可在此進行各種改變、取代以及修正。因此，其他實施例亦落于后附申請專利范圍內。
權利要求
1.一種膠原蛋白制備方法，其特征在于其包含提供一結締組織，其表面積為20平方毫米至2平方公尺；以一第一酸液使該結締組織的體積至少膨脹百分之五十而形成一膨脹結締組織，其中 該酸液實質上不包含鹽類且該酸液的酸堿值為1至6 ；清洗該膨脹結締組織以除去非膠原蛋白物質，藉此形成一膠原蛋白基質；以及利用一萃取液從該膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白，藉此制造一含有膠原蛋白的溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該萃取步驟包含研磨該 膠原蛋白基質而制得膠原蛋白粉末，以及將該膠原蛋白粉末與該萃取液混合而制得該含有 膠原蛋白的溶液。
3.根據(jù)權利要求2所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該研磨步驟以及該混合 步驟同時進行。
4.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其另包含，在該萃取步驟之 后，將膠原蛋白由該含有膠原蛋白的溶液中沉淀，以及干燥該膠原蛋白或將該膠原蛋白分散于一第二酸液中。
5.根據(jù)權利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中其中在該沉淀步驟中， 該膠原蛋白藉由透析法沉淀。
6.根據(jù)權利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該沉淀步驟包含將該含 有膠原蛋白的溶液與一鹽類以1. OM至4. OM的濃度混合，藉此將該膠原蛋白沉淀，并且該方 法另包含，在該沉淀步驟之后，將該膠原蛋白脫鹽。
7.根據(jù)權利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該沉淀步驟包含將該含 有膠原蛋白的溶液的PH值調整至4. 5至8，藉此將該膠原蛋白沉淀。
8.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其另包含，在該萃取步驟 之后，將該含有膠原蛋白的溶液與一含有蛋白水解酶的溶液混合以制造無端肽膠原蛋白 (atelopeptide collagen)。
9.根據(jù)權利要求8所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該蛋白水解酶選自胃 蛋白酶(ρ印sin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰凝乳蛋 白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無花果蛋白酶(ficin)、木瓜蛋白酶 (papain)、勝月太酶(peptidase)、蛋白酶A(proteinase Α)、蛋白酶〖(proteinase K)、胰蛋白 酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbial proteases)及其混合物所組成的群組。
10.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該萃取液包含由甲酸、 草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種酸。
11.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該萃取液包含一鹽類。
12.根據(jù)權利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該第二酸液包含由甲 酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種 酸。
13.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于膨脹步驟包含將該結締組 織浸泡于該第一酸液且同時以一液體噴射該結締組織。
14.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該 膨脹結締組織浸泡于一清洗液且同時以一液體噴射該結締組織。
15.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該膨脹步驟包含將該 結締組織浸泡于該第一酸液中，且同時以超音波處理該結締組織。
16.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該 膨脹結締組織浸泡于該清洗液中，且同時以超音波處理該膨脹結締組織。
17.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該結締組織源自于真 皮組織或筋腱。
18.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該結締組織的尺寸為 25平方毫米至900平方公分。
19.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該第一酸液包含由甲 酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種酸。
20.根據(jù)權利要求19所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該酸液的pH值為2至4。
21.根據(jù)權利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該酸液包含濃度0.1至 6M的醋酸。
全文摘要
一種膠原蛋白制備方法，其先制造一膠原蛋白基質，然后再由基質萃取出膠原蛋白。
文檔編號A23L1/0562GK102131403SQ200980101280
公開日2011年7月20日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權日2009年7月27日
發(fā)明者黃玲惠 申請人:惠合再生醫(yī)學生技股份有限公司, 成功大學