專(zhuān)利名稱(chēng)：由粗甘油制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明尤其(但非排他地)涉及一種使用粗甘油作為原料發(fā)酵酵母來(lái)制造營(yíng)養(yǎng) 性、治療性和/或感官性產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
粗甘油可作為肥皂和清潔劑生產(chǎn)、酒精飲料生產(chǎn)、脂肪酸制造和生物柴油生產(chǎn)等 工藝的副產(chǎn)物而大量獲得。生物柴油是一種來(lái)源于植物油或動(dòng)物脂肪的燃料，可用于柴油 機(jī)和加熱系統(tǒng)中。這種燃料是可再生而且無(wú)毒的，其使用可減少有害排放。因此，全世界涌 現(xiàn)了生物柴油的制造，使其成為昂貴而具污染性的石油基燃料的引人注目的替代品。2008 年，據(jù)美國(guó)國(guó)家生物柴油委員會(huì)(United States National Biodiesel Board)報(bào)導(dǎo)，單單 在美國(guó)，生物柴油制造就達(dá)到了每年22. 4億加侖(參看http //www, biodiesel. org/odf files/fuelfactsheets/production capacity, pdf)。隨著如此大量的生物柴油被制造出 來(lái)，過(guò)量的粗甘油超過(guò)了化妝品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品和藥品等傳統(tǒng)應(yīng)用對(duì)于甘油的需求。此外， 針對(duì)這類(lèi)用途精制粗甘油的過(guò)程昂貴而且耗能大，使得精制不可能是解決過(guò)量粗甘油的完 善方案。人們?cè)u(píng)估了多種方法來(lái)處理粗甘油過(guò)度供應(yīng)的問(wèn)題，包括使用粗甘油作為動(dòng)物飼 料(例如參看Cerrate等人(2006) Int. J. Poult. Sci. 5 :1001)，以及將粗甘油轉(zhuǎn)化成1， 3_丙二醇等產(chǎn)品(例如參看Asad-ur-Rehamn等人(2008) Journal ofChemical Technology & Biotechnology，83 (7) :1072)。然而，大規(guī)模實(shí)施這些方法的可行性被證實(shí)是難以實(shí)現(xiàn) 的，因此，仍然需要能夠?qū)⑦^(guò)量粗甘油轉(zhuǎn)化成高價(jià)值產(chǎn)品的可行方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用粗甘油制造具有高質(zhì)量和高價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性 產(chǎn)品的方法。根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施例，提供一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，其包 含(a)在包含作為至少一種碳源的粗甘油以及一種或多種氮源的培養(yǎng)基存在下，在 有氧條件下生長(zhǎng)非重組酵母，以產(chǎn)生酵母產(chǎn)品；其中培養(yǎng)基中的碳氮比小于90 1;和(b)加工酵母產(chǎn)品，獲得營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施例，提供一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，其包 含(a)在包含作為至少一種碳源的粗甘油以及一種或多種氮源的培養(yǎng)基存在下，在 有氧條件下生長(zhǎng)產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，以產(chǎn)生酵母產(chǎn)品；和(b)加工酵母產(chǎn)品，獲得營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明第三實(shí)施例，提供一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，其包 含
(a)在包含作為至少一種碳源的粗甘油、一種或多種氮源以及一種或多種選自由 硒、鉻、鉬、鍺、鋅、鐵、銅、鎂、錳、碘和其組合組成的群組的元素的培養(yǎng)基存在下，在有氧條 件下生長(zhǎng)非重組酵母，以產(chǎn)生礦化酵母產(chǎn)品；和(b)加工礦化酵母產(chǎn)品，獲得營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明第四實(shí)施例，提供一種適用于人類(lèi)和/或動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)性或感官性產(chǎn) 品，其是由本發(fā)明第一、第二或第三實(shí)施例中描述的方法制備而成。根據(jù)本發(fā)明第五實(shí)施例，提供一種適用于人類(lèi)和/或動(dòng)物的治療性產(chǎn)品，其是由 本發(fā)明第一、第二或第三實(shí)施例中描述的方法制備而成。
具體實(shí)施例方式除非文中另有需要，否則本說(shuō)明書(shū)通篇和以下權(quán)利要求書(shū)中，“包含”一詞應(yīng)理解 為暗含包括所述整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟在內(nèi)，但不排除任何其它整數(shù)或步驟，或 者任何其它組整數(shù)或步驟。本說(shuō)明書(shū)內(nèi)提到的文獻(xiàn)都是按引用全部并入本文中。本說(shuō)明書(shū)中提到的任何現(xiàn)有技術(shù)不是而且不應(yīng)視為承認(rèn)或以任何形式暗示，所述 現(xiàn)有技術(shù)形成澳大利亞普通常識(shí)的一部分。如上文所提到的，在一個(gè)寬泛實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通過(guò)在包括粗甘油的培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)酵母，來(lái)制備來(lái)源于酵母的營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方 法生長(zhǎng)的酵母是能夠使用粗甘油作為可同化碳源的非重組酵母生物體。術(shù)語(yǔ)“非重組酵母” 用于指尚未通過(guò)引入來(lái)自另一生物體的遺傳物質(zhì)或去除遺傳物質(zhì)而有意地改變基因組的 酵母生物體。因此，適于本發(fā)明的酵母生物體可以包括基因組隨機(jī)改變，但未通過(guò)例如(但 不限于)選擇育種和/或在選擇壓力下突變等基因工程改造技術(shù)來(lái)插入外來(lái)遺傳物質(zhì)的生 物體。此類(lèi)非重組酵母生物體包括(但不限于)產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、 彎假絲酵母(Candida curvata)、西班牙假絲酵母(Candida hispaniensis)、 Candidabentonensis> 馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、貝酵母 (Saccharomyces bayanus) >Μ^ (Saccharomyces cerevisiae) Κ胃^E^f。 ifcife 所述酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。根據(jù)本發(fā)明，也可能需要生長(zhǎng)兩種或兩種以上酵母生物體，以產(chǎn) 生復(fù)合的酵母生物質(zhì)。酵母生物體的其它實(shí)施例可包括(但不限于)屬于以下各屬的酵母種類(lèi) 或其菌株球擬酵母屬(Torulopsis)、紅酵母屬(Rhodotorula)、克魯維酵母菌屬 (Kluyveromyces)、德巴里酵母屬(Debaromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、地絲菌屬 (Geotrichum)、漢遜酵母屬(Hansenulae)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、毛孢子菌屬 (Trichosporon)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、耶羅威亞酵母屬(Yarrowia)、芽孢酵母屬 (Aciculoconidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Apiotrichum、被抱霉屬(Mortierella)、 小克銀漢霉屬(Cunninghamellae)、毛霉目(Mucorales)、毛霉屬(Mucor)、根霉屬 (Rhizopus)或擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，而且其是非重組的，并能夠使用粗甘油作為碳 源。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，上文所列的各酵母生物體可具有其它分類(lèi)。例如，產(chǎn)朊 假絲酵母也稱(chēng)為杰丁畢赤酵母(Pichia jadinii)。
術(shù)語(yǔ)“粗甘油”用于指由一種或多種工藝產(chǎn)生并且未經(jīng)蒸餾的甘油，所述一種或多 種工藝包括(但不限于)植物油或動(dòng)物脂肪制造生物柴油的酯基轉(zhuǎn)移；脂肪或油制造脂肪 酸的水解；和脂肪或油制造肥皂和清潔劑的皂化。由所述工藝獲得的粗甘油可具有多種雜
質(zhì)含量。例如，作為生物柴油工藝的副產(chǎn)物，以重量比(wt/wt)計(jì)，粗甘油可含有約15%至 約95%甘油，以及不同量的雜質(zhì)，包括(但不限于)脂肪酸和/或其鹽；短鏈烷基醇，例如甲 醇或乙醇；無(wú)機(jī)鹽；水，以及非甘油有機(jī)物質(zhì)(Matter OrganicNon-Glycerol, M0NG)，包括 單酸甘油酯和二酸甘油酯、二甘油、聚甘油醚、丙烯醛(例如高溫食用油是生物柴油原料的 情形)和生物柴油本身。由生物柴油制造獲得的粗甘油的PH值可在約2到12的范圍內(nèi)， 更通常為約4到10。粗甘油中PH值的變化、雜質(zhì)性質(zhì)和各雜質(zhì)的量受多種因素影響，包括 生物柴油原料(三酸甘油酯)的質(zhì)量與純度、酯基轉(zhuǎn)移工藝中使用的催化劑的量，和所使用 的加工技術(shù)。例如，以重量比計(jì)(wt/wt)，由生物柴油制造獲得的粗甘油可含有60%到85% 甘油，余量為脂肪酸或其鹽(5%到35% )、無(wú)機(jī)鹽(5%到20% )和MONG( < 10% )。優(yōu)選以重量比計(jì)，根據(jù)本發(fā)明使用的粗甘油含有約20%到約95%甘油。更優(yōu)選以 重量比計(jì)，粗甘油含有約40%到約90%甘油。最優(yōu)選以重量比計(jì)，粗甘油含有約80%到約 90%甘油。粗甘油中存在的雜質(zhì)，例如脂肪酸、甲醇、無(wú)機(jī)鹽和丙烯醛，可抑制某些微生物的 生長(zhǎng)。這些雜質(zhì)甚至還可能有毒，或僅僅限制可達(dá)到的細(xì)胞密度和/或工藝生產(chǎn)率。雜質(zhì) 還可能改變粗甘油的顏色、香味和味道，而這又會(huì)影響由本發(fā)明方法制備的酵母產(chǎn)品的顏 色、香味和味道。例如，由生物柴油制造獲得的粗甘油的顏色會(huì)呈深褐色，而取決于產(chǎn)品，這 種顏色可能是不被接受的。本發(fā)明的關(guān)鍵方面在于，所得來(lái)源于酵母的產(chǎn)品的顏色、香味和 味道具有市場(chǎng)上可接受的質(zhì)量，而且多種粗甘油的質(zhì)量始終如一。因此，在添加到培養(yǎng)基中 前，可能需要對(duì)粗甘油進(jìn)行處理，以便至少部分純化粗甘油，去除一種或多種雜質(zhì)?；蛘撸?以選擇不受雜質(zhì)抑制，而仍能夠提供例如用于營(yíng)養(yǎng)或藥用目的的高價(jià)值產(chǎn)品或提取物的非 重組微生物。為了實(shí)現(xiàn)粗甘油的部分純化，取決于粗甘油的純度和欲實(shí)現(xiàn)的所需純化，粗物質(zhì) 可經(jīng)歷一種或多種處理，包括(但不限于)酸化、吸收和過(guò)濾。例如，添加一種或多種無(wú)機(jī) 酸(例如磷酸、硫酸、鹽酸或硝酸)和/或一種或多種有機(jī)酸(例如乙酸、氯乙酸、甲烷磺酸 和其類(lèi)似物)降低PH值，可以將脂肪酸與粗甘油分離，從而通過(guò)傾析、離心或其它方式將其 去除。如果粗甘油經(jīng)歷酸化處理，則優(yōu)選使用磷酸。必要時(shí)，可以通過(guò)蒸餾或其它方法，去 除粗甘油內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)，例如甲醇。單酸甘油酯和二酸甘油酯可以例如通過(guò)皂化形成其 它甘油和脂肪酸鹽去除。其它可能的粗甘油處理方法包括(但不限于)通過(guò)離子交換法、 反滲透法、納濾法(nanofiltration)、超濾法和/或?yàn)V過(guò)吸附劑的方法去除無(wú)機(jī)或有機(jī)鹽。 例如，可通過(guò)使粗甘油經(jīng)歷活性炭和/或膨潤(rùn)土等吸附劑處理，來(lái)去除不利的顏色、味道和 香味。在使用一種以上純化方法的情況下，可以選擇任何次序，優(yōu)選能最有效實(shí)現(xiàn)所需 純化的次序。如果粗甘油確實(shí)經(jīng)歷了一個(gè)或多個(gè)部分純化步驟，則預(yù)期經(jīng)過(guò)處理的粗甘油 中甘油的含量(以重量百分比計(jì))將保持在20重量％到95重量％的近似范圍內(nèi)。有關(guān)粗 甘油的來(lái)源、質(zhì)量范圍和處理選擇的其它細(xì)節(jié)，可見(jiàn)于多個(gè)文獻(xiàn)中，包括Glycerine =A KeyCosmetic Ingredient, Eric Jungermannn &Norman 0· V. Sonntag 編輯，Marcel Dekker Incorporated, 1991，ISBN978-0824784652，其按引用并入本文中。但是取決于所得粗甘油 的質(zhì)量，可以省略部分純化的步驟。本發(fā)明的方法可包括以下步驟任選部分純化粗甘油，以去除或減少一種或多種 雜質(zhì)；將處理過(guò)的粗甘油供應(yīng)給有氧酵母發(fā)酵系統(tǒng)；在實(shí)質(zhì)上無(wú)菌的條件下，以分批、補(bǔ)料 分批、半連續(xù)、連續(xù)模式或其組合培養(yǎng)酵母；收集培養(yǎng)物和分離酵母；以及回收和進(jìn)一步加 工酵母發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選提供利用處理過(guò)的粗甘油，通過(guò)在實(shí)質(zhì)上無(wú)菌的連續(xù)有氧發(fā) 酵系統(tǒng)中生長(zhǎng)非重組酵母，來(lái)產(chǎn)生酵母和來(lái)源于酵母的產(chǎn)品的方法。根據(jù)本發(fā)明，在合成培養(yǎng)基內(nèi)處理過(guò)的或未經(jīng)過(guò)處理的粗甘油是可在所述合成培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母的一種可能的可同化碳源。可與未經(jīng)過(guò)處理或經(jīng)過(guò)處理的粗甘油一起包 括在培養(yǎng)基內(nèi)的其它可同化碳源包括(但不限于)葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麥芽糖、海藻 糖、蔗糖、纖維二糖、阿拉伯糖和/或半乳糖等糖，以及可發(fā)酵糖源，包括(但不限于)啤酒 廠糖殘余物、糖蜜、玉米漿、木材加工廢水和/或乳清。優(yōu)選使非重組酵母在包括經(jīng)過(guò)處理 或未經(jīng)過(guò)處理的粗甘油作為唯一可同化碳源的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。此類(lèi)酵母包括產(chǎn)朊假絲 酵母、橢圓釀酒酵母、貝酵母和/或馬克斯克魯維酵母的選定菌株。所述酵母可進(jìn)一步加工 來(lái)提供人類(lèi)食品級(jí)產(chǎn)品?？扇缢鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員所知，以一種操作模式(分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)、連續(xù)或 其組合)制備接種物或種子培養(yǎng)物，隨后用于裝入發(fā)酵罐中以便在相同或不同模式或其組 合下操作。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知各模式的細(xì)節(jié)，例如，可見(jiàn)于以下課本中fermentation and Biochemical Engineering Handbook Principles,Process Design and Equipment, 第 2 版，H C Vogel & C L Todaro 編輯，NoyesPublications (New Jersey) 1997, ISBN 0-8155-1407-7，其按引用并入本文中。為了獲得高生產(chǎn)率，優(yōu)選補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)操 作模式。最優(yōu)選在實(shí)質(zhì)上無(wú)菌的條件下，以連續(xù)模式操作發(fā)酵罐。在連續(xù)操作期間，稀釋率(D)是一個(gè)重要參數(shù)，因?yàn)樗前l(fā)酵罐體積中每小時(shí)的 發(fā)酵罐體積通過(guò)量，即，如果D是0. 1/小時(shí)，則2000升發(fā)酵罐中每小時(shí)更換200升。工業(yè) 發(fā)酵罐的最佳稀釋率是根據(jù)所需生產(chǎn)率、下游加工設(shè)備的能力和所需產(chǎn)品質(zhì)量的精確細(xì)節(jié) 確定。生物體的最大生長(zhǎng)速率代表著稀釋率的上限，以避免出現(xiàn)發(fā)酵罐中的細(xì)胞密度迅速 降低到零的“洗出(wash out)”效應(yīng)。稀釋率優(yōu)選為約0.05到約0.25/小時(shí)。如所屬領(lǐng)域 技術(shù)人員所了解的，稀釋率較高，可增加所產(chǎn)生的生物質(zhì)的核糖核酸含量，取決于應(yīng)用，這 可能是或可能不是所想要的。除稀釋率外，還優(yōu)選使用常規(guī)方式控制其它發(fā)酵條件，例如溶解氧濃度(通風(fēng))、 營(yíng)養(yǎng)物組成、PH值和溫度等，來(lái)提供最佳酵母產(chǎn)量。很明顯，為了達(dá)到并保持高發(fā)酵生產(chǎn)率， 所有營(yíng)養(yǎng)物都應(yīng)以足量或以足夠比率提供。具體地說(shuō)，需要將通風(fēng)或溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)保持在大于零的水平。 如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這可以通過(guò)向發(fā)酵罐中供應(yīng)大量空氣并同時(shí)利用高剪切混合機(jī) 實(shí)現(xiàn)?；蛘撸梢詫⒏缓醯目諝夤?yīng)到發(fā)酵罐中。穿過(guò)發(fā)酵罐的典型氣體通量在每分鐘 約0. 1到10個(gè)發(fā)酵罐體積(vvm)的范圍內(nèi)。保持DO大于零所需的精確氣體通量將取決于 培養(yǎng)細(xì)胞密度、其具體的氧攝取需求、稀釋率(適用時(shí))、操作壓力和發(fā)酵容器的物理參數(shù) 等因素。溶解氧的濃度優(yōu)選超過(guò)2%的空氣飽和度，更優(yōu)選超過(guò)5%的空氣飽和度。
發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度(無(wú)論是由未經(jīng)過(guò)處理還是經(jīng)過(guò)處理的粗甘油提供) 應(yīng)足以支持酵母進(jìn)一步生長(zhǎng)和生產(chǎn)率，同時(shí)又低于可能因滲透壓影響而抑制酵母生長(zhǎng)的限 度。培養(yǎng)基中甘油的濃度優(yōu)選為約0.1克/升到約500.0克/升。培養(yǎng)基中甘油的濃度更 優(yōu)選為約50. 0克/升到約200. 0克/升。培養(yǎng)基中甘油的濃度最優(yōu)選為約70. 0克/升到 約150. 0克/升。培養(yǎng)基中約70. 0克/升到約150. 0克/升的甘油濃度，會(huì)產(chǎn)生以干重計(jì) 在25. 0到90. 0克/升的近似范圍內(nèi)的細(xì)胞密度。如果培養(yǎng)基除甘油外，還含有其它可同 化碳源，則所有碳源的總濃度優(yōu)選為約0. 1克/升到約500. 0克/升。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員所了解，發(fā)酵罐中碳源的濃度可能不同于供應(yīng)到發(fā)酵罐中的碳源的濃度。培養(yǎng)基中還包括氮，而且一種或多種氮源可包括(但不限于)氨、其一種或多種無(wú) 機(jī)鹽、一種或多種有機(jī)銨鹽、酵母提取物、尿素、硝酸、一種或多種無(wú)機(jī)亞硝酸鹽和/或一種 或多種無(wú)機(jī)硝酸鹽。發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源優(yōu)選為氨水溶液或氨氣，或者一種或多種無(wú)機(jī)銨 鹽。發(fā)酵期間，也可以使用氨控制PH值。發(fā)酵培養(yǎng)基中碳與氮(C/N)的比率小于90 1。優(yōu)選C/N比小于或等于80 1。 更優(yōu)選C/N比小于或等于40 1，甚至更優(yōu)選小于或等于20 1。最優(yōu)選C/N比小于或等 于10 1。C/N比為10 1，會(huì)由甘油產(chǎn)生50%干生物質(zhì)的產(chǎn)率(以純的計(jì))。根據(jù)本發(fā) 明可以達(dá)到較高的生物質(zhì)產(chǎn)率，即使預(yù)計(jì)C/N比小于90 1可能會(huì)使更多的酵母暴露于未 經(jīng)過(guò)處理或經(jīng)過(guò)處理的粗甘油中可能具抑制作用的雜質(zhì)。在酵母生長(zhǎng)不受氧等其它生長(zhǎng)限制因素限制的情況下，碳氮比越低，則生長(zhǎng)受可 用碳量限制的可能性越大。根據(jù)本發(fā)明，酵母生長(zhǎng)可受一個(gè)以上因素限制，或受除可用碳外 的因素限制。在無(wú)其它生長(zhǎng)限制因素存在的情況下，C/N比為90 1或大于90 1，會(huì)使 酵母生長(zhǎng)受到可用氮量限制，而C/N比低于3 1，則會(huì)導(dǎo)致氮利用率低下。取決于酵母種類(lèi)或其菌株，培養(yǎng)基還可以含有一種或多種大量營(yíng)養(yǎng)物 (macro-nutrient)，例如礦物鹽或其元素；或微量營(yíng)養(yǎng)物(micro-nutrient)，例如維生素。 例如，產(chǎn)朊假絲酵母需要硫(S)、氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鎂(Mg)、鈉(Na)、鈣(Ca)、鋅(Zn)、 鐵(Fe)、錳(Mn)、鈷(Co)、銅(Cu)、鉬(Mo)和硼(B)等元素來(lái)支持生長(zhǎng)，但不需要維生素。 然而，如果酵母種類(lèi)或其菌株需要一種或多種維生素，例如硫胺素、煙酸、吡哆醇、生物素、 肌醇、泛酸等，則所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，維生素的供應(yīng)優(yōu)選獨(dú)立于其它進(jìn)料，而且還 應(yīng)根據(jù)特定酵母生物體提供必要的維生素量。培養(yǎng)基中元素的濃度由多種因素決定。濃度下限是由特定酵母菌株在特定生長(zhǎng)條 件下的需要決定。濃度上限是由特定元素開(kāi)始變得對(duì)特定酵母種類(lèi)的生長(zhǎng)有抑制作用或甚 至有毒的濃度決定。抑制作用/毒性可能專(zhuān)門(mén)針對(duì)某些元素(例如，低含量的重金屬是必不 可少的，但含量較高則有毒)，或所述影響可能是由高濃度引起的離子強(qiáng)度或滲透壓產(chǎn)生。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，可以將培養(yǎng)基中的各種組分(例如經(jīng)過(guò)處理或未 經(jīng)過(guò)處理的甘油、礦物鹽或其元素、氮源、水和任選使用的微量營(yíng)養(yǎng)物)分別引入發(fā)酵罐 中；以單一混合物形式引入，或者以?xún)煞N或兩種以上各含有兩種或兩種以上組分的個(gè)別混 合物形式引入。送入發(fā)酵罐中的組分混合物優(yōu)選以至少減少(如果不能消除的話(huà))沉淀作 用的方式制備。發(fā)酵罐的pH值應(yīng)保持在滿(mǎn)足酵母生長(zhǎng)的水平范圍內(nèi)，通常為pH 3. OilJpHS. 0o pH 值優(yōu)選應(yīng)保持在幾乎沒(méi)有其它微生物能良好生長(zhǎng)的水平，例如小于4. 5，以使污染的風(fēng)險(xiǎn)減
10到最小。PH值最優(yōu)選小于4.0。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，例如產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)的 PH值最優(yōu)選為3.6。也可以控制工藝溫度，而且其應(yīng)高到足以達(dá)到較快的生長(zhǎng)速率，但在酵母種類(lèi)或 菌株的耐受性所確定的上限內(nèi)。可能時(shí)，優(yōu)選較高的溫度。對(duì)于酵母生長(zhǎng)，溫度為約20. O0C 到約40.0°C。更優(yōu)選溫度為約25.0°C到約36.0°C。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，例如 產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)的溫度最優(yōu)選為35. 0°C。由甘油(無(wú)論是由未經(jīng)過(guò)處理還是經(jīng)過(guò)處理的粗甘油提供)得到的酵母生物質(zhì)的 產(chǎn)率將取決于酵母種類(lèi)或其菌株，以及其它可能的限制因素的存在與否。產(chǎn)率定義為每克 碳源(以干重計(jì))細(xì)胞的克數(shù)(以干重計(jì))。在無(wú)其它限制存在的情況下，在含有未經(jīng)過(guò)處 理或經(jīng)過(guò)處理的粗甘油的培養(yǎng)基存在下生長(zhǎng)的酵母的產(chǎn)率可為約25. 0%到約80. 0%。以 干重計(jì)，相應(yīng)細(xì)胞密度為約5. 0克/升到大于或等于150. 0克/升。以干重計(jì)，細(xì)胞密度優(yōu) 選為約20. 0克/升到大于或等于100. 0克/升。以干重計(jì)，細(xì)胞密度更優(yōu)選為約30. 0克/ 升到大于或等于80.0克/升。以干重計(jì)，細(xì)胞密度最優(yōu)選大于50.0克/升。為了使水的 使用減到最少以及幫助通過(guò)脫水回收產(chǎn)物，優(yōu)選較高的細(xì)胞密度。較高的細(xì)胞密度在理論上是可行的，但在連續(xù)操作模式中，DO的供應(yīng)會(huì)成為限速 因素，除非稀釋率極低。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，取決于所用粗甘油的純度，根據(jù)本發(fā)明在粗甘 油上以連續(xù)模式生長(zhǎng)的產(chǎn)朊假絲酵母的產(chǎn)率和細(xì)胞密度類(lèi)似于或者甚至高于利用純甘油 達(dá)到的產(chǎn)率和細(xì)胞密度。還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明方法可以使酵母生長(zhǎng)展現(xiàn)大于或等于0. 85克/ 升·小時(shí)的工藝生產(chǎn)率。優(yōu)選工藝生產(chǎn)率大于或等于1. 00克/升·小時(shí)，更優(yōu)選生產(chǎn)率大 于或等于2. 00克/升·小時(shí)，最優(yōu)選生產(chǎn)率大于或等于3. 00克/升·小時(shí)。通常，本發(fā)明產(chǎn)品是無(wú)毒的，因?yàn)槠浔徽J(rèn)為對(duì)預(yù)定的營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性使用 是安全的。由本發(fā)明方法制造的酵母產(chǎn)品可以是生物體本身、分泌的代謝物，或通過(guò)進(jìn)一步 加工所培養(yǎng)的酵母得到的產(chǎn)品。在酵母產(chǎn)品是酵母生物體本身的情況下，所述酵母可用于 人類(lèi)、動(dòng)物或二者，以達(dá)到營(yíng)養(yǎng)、治療或感官目的。進(jìn)一步加工可得到酵母自溶物和提取物 等產(chǎn)品，其例如可用作調(diào)味成分和增味劑。通過(guò)本發(fā)明方法可以獲得的其它產(chǎn)品包括核苷 酸，例如GMP和IMP，其可單獨(dú)或組合用作增味劑，而且還可以包括一種或多種酵母提取物。 由酵母得到的具有乳化、增稠、結(jié)合脂肪和蛋清代用等所需功能特性的蛋白質(zhì)部分也是本 發(fā)明的產(chǎn)品?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明方法制備的其它產(chǎn)品包括來(lái)源于酵母細(xì)胞壁的葡聚糖。 β -葡聚糖可具有有益的感官特性。根據(jù)本發(fā)明，感官性產(chǎn)品是一種經(jīng)過(guò)加工的酵母產(chǎn)品， 其可為終產(chǎn)品提供所需味道、顏色、氣味和/或感覺(jué)(包括口感)。例如，在食品制備的情況 下，適合的感官特性可包括白色或灰白色、可口的味道(例如肉味或咸味)和/或令人愉快 的氣味(例如非酵母樣香味)。根據(jù)本發(fā)明，具有免疫刺激性的葡聚糖也可例如用作治療性產(chǎn)品。治療性產(chǎn) 品定義為可改善、改良或治療有需要個(gè)體的疾病或病癥(例如，緩解疾病的一種或多種癥 狀，或者停滯、逆轉(zhuǎn)或另外減緩疾病一種或多種癥狀的進(jìn)展或其嚴(yán)重程度)的經(jīng)過(guò)加工的 酵母產(chǎn)品，或?qū)τ行枰獋€(gè)體具有預(yù)防作用(例如，在疾病或病狀的癥狀顯現(xiàn)之前，預(yù)防或延 緩疾病或其癥狀的發(fā)作，或另外減輕癥狀的范圍或嚴(yán)重程度)的經(jīng)過(guò)加工的酵母產(chǎn)品。治療性產(chǎn)品可投予植物(例如農(nóng)作物、觀賞植物)，或動(dòng)物(例如水生動(dòng)物個(gè)體，例
11如魚(yú)、蝦)，或哺乳動(dòng)物個(gè)體等個(gè)體。哺乳動(dòng)物個(gè)體可包括(但不限于)人類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、 家畜(包括(但不限于)奶牛、馬、綿羊、豬和山羊)、伴侶動(dòng)物(包括(但不限于)狗、貓、 兔、豚鼠)和圈養(yǎng)野生動(dòng)物。也涵蓋實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和倉(cāng)鼠。個(gè)體優(yōu) 選是哺乳動(dòng)物個(gè)體。實(shí)現(xiàn)治療作用的合適劑量和給藥方案可由主治醫(yī)師或獸醫(yī)決定，而且可以取決 于所治療的特定病狀、病狀的嚴(yán)重程度以及個(gè)體的一般年齡、健康和體重。對(duì)于某些應(yīng)用 (例如動(dòng)物飼料或水產(chǎn)養(yǎng)殖)，治療性產(chǎn)品的劑量也可由成本效益分析確定。治療性產(chǎn)品 可以單劑或一系列劑量投予。盡管可能單獨(dú)投予治療性產(chǎn)品，但其也可以呈與一種或多種 與組合物中其它成分相容而且對(duì)個(gè)體無(wú)害的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑的組合物形式， 優(yōu)選是藥物組合物(例如參看Remington' s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，1990，按引用并入本文中)。所述載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑包括所有常規(guī)溶 劑、分散介質(zhì)、填充劑、固體載劑、包衣、抗真菌劑和抗細(xì)菌劑、透皮劑、表面活性劑、等滲劑 和吸收劑等。應(yīng)了解，組合物還可以包括其它輔助性生理活性物質(zhì)。治療性產(chǎn)品或其組合物適宜經(jīng)口、直腸、鼻、局部(包括皮膚、口腔和舌下)、陰道 或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))投予。組合物適宜以單位劑型(包括膠囊、 藥袋、片劑、散劑、顆粒劑、錠劑、口嚼錠、軟錠、漱口液；于水性或非水性液體中的溶液、懸浮 液或糊漿；或水包油乳液或油包水乳液、洗液、凝膠、乳膏、油膏或泡沫劑)提供，并且可以 利用藥劑學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備。除治療性產(chǎn)品外，營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)品也可以由本發(fā)明方法獲得。根據(jù)本發(fā)明，營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn) 品是一種經(jīng)過(guò)加工的酵母產(chǎn)品，其可提供、補(bǔ)充或新補(bǔ)給活個(gè)體(例如哺乳動(dòng)物個(gè)體，包括 人類(lèi)和上述動(dòng)物；以及植物，包括農(nóng)作物和觀賞性植物；細(xì)菌和真菌)生長(zhǎng)、繁殖、改善或維 持健康和其它異養(yǎng)需求以及延遲、逆轉(zhuǎn)或防止過(guò)早老化或其癥狀所需的營(yíng)養(yǎng)物。營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn) 品還可用于完全或部分強(qiáng)化任何活個(gè)體的食品、飲料、水或營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充源(例如鹽磚)。例 如，本發(fā)明的經(jīng)過(guò)加工的酵母產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可以是蛋白質(zhì)和氨基酸含量、碳水化合物含 量(例如膳食纖維源)和/或維生素含量。根據(jù)本發(fā)明，營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)品可來(lái)源于礦化酵母。例如，礦化酵母可以是無(wú)法從傳統(tǒng)膳 食組合物中獲得足量的必需痕量礦物質(zhì)時(shí)，人類(lèi)食品或動(dòng)物飼料應(yīng)用中的重要補(bǔ)充。本發(fā) 明的礦化酵母產(chǎn)品是在有氧和實(shí)質(zhì)上無(wú)菌的條件下于水性培養(yǎng)中生長(zhǎng)。所述培養(yǎng)基包括 作為一種可能碳源的經(jīng)過(guò)處理或未經(jīng)過(guò)處理的粗甘油，以及一種或多種能被酵母吸收的元 素，由此以分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式或其組合產(chǎn)生礦化酵母。優(yōu)選以連續(xù)模式產(chǎn) 生礦化酵母產(chǎn)品。礦化酵母生長(zhǎng)的條件和參數(shù)的范圍，包括通風(fēng)、溫度、pH值、C/N比、營(yíng)養(yǎng)物組成和 甘油濃度，都與上述條件和參數(shù)類(lèi)似，只是培養(yǎng)基中一種或多種元素的量和/或存在可變 化。為了制造礦化酵母產(chǎn)物，可將一種或多種預(yù)期會(huì)被酵母吸收的元素足量添加到培養(yǎng)基 中。如果培養(yǎng)基中一種或多種其它元素與所需元素的吸收競(jìng)爭(zhēng)，則所需元素的添加還需要 減少這些元素。某些元素還可能抑制酵母生長(zhǎng)，而且進(jìn)行發(fā)酵工藝的方式應(yīng)使礦物質(zhì)對(duì)發(fā) 酵性能的不利影響減到最小，同時(shí)又使酵母中所需元素的并入產(chǎn)率和由粗甘油制造酵母生 物質(zhì)的產(chǎn)率最大化。適于此目的的方法包括(但不限于)提供缺乏可與所需元素(例如硒) 的吸收競(jìng)爭(zhēng)的元素(例如硫)的培養(yǎng)基，以及控制所需元素的供應(yīng)。制備缺乏硫的培養(yǎng)基
12的一種可能方法是將硝酸添加到礦物鹽中以平衡酸度，同時(shí)降低礦物鹽中硫酸的量。以此 方式，硝酸也充當(dāng)?shù)?。并入酵母中的?yōu)選元素是對(duì)例如人類(lèi)或動(dòng)物提供健康或營(yíng)養(yǎng)益處并且無(wú)機(jī)形式 不易被生物利用的元素，包括(但不限于)硒、鉻、鉬、鍺、鋅、鐵、銅、鎂、錳、碘和其組合。因 此，礦化酵母產(chǎn)品中含有的硒、鉻、鉬、鍺、鋅、鐵、銅、鎂、錳、碘和其組合等一種或多種元素 的含量增高。這些元素在自然界僅以痕量水平存在，而來(lái)源于礦化酵母的本發(fā)明產(chǎn)品含有 顯著增高的含量。取決于元素、酵母種類(lèi)或菌株以及酵母生長(zhǎng)的條件，以干重計(jì)，所述增高 的含量可在約百萬(wàn)分之一百到約百萬(wàn)分之五萬(wàn)(parts per million, ppm)各元素的范圍 內(nèi)。以干重計(jì)，優(yōu)選礦化酵母產(chǎn)品中所需元素應(yīng)實(shí)質(zhì)上呈有機(jī)形式(例如硒代甲硫氨酸)， 以使生物利用率最大。盡管礦化酵母產(chǎn)品可經(jīng)過(guò)處理而產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)品，但預(yù)期礦化酵母 產(chǎn)品經(jīng)過(guò)加工，也可以產(chǎn)生治療性產(chǎn)品或感官性產(chǎn)品。適于產(chǎn)生礦化酵母產(chǎn)品的酵母生物體是能夠使用未經(jīng)過(guò)處理或經(jīng)過(guò)處理的粗甘 油作為碳源并且吸收所需元素的任何非重組生物體。此類(lèi)酵母包括(但不限于)產(chǎn)朊假絲 酵母、彎假絲酵母、西班牙假絲酵母、Candida bentonensis、馬克斯克魯維酵母、貝酵母、橢 圓釀酒酵母或其組合。優(yōu)選酵母是產(chǎn)朊假絲酵母(杰丁畢赤酵母)。根據(jù)本發(fā)明，也可能需 要生長(zhǎng)兩種或兩種以上酵母生物體，以產(chǎn)生復(fù)合的礦化酵母生物質(zhì)。酵母生物體的其它實(shí) 施例可包括(但不限于)屬于以下各屬的酵母種類(lèi)或其菌株球擬酵母屬、紅酵母屬、克魯 維酵母菌屬、德巴里酵母屬、畢赤酵母屬、地絲菌屬、漢遜酵母屬、纖維單胞菌屬、毛孢子菌 屬、黃單胞菌屬、耶羅威亞酵母屬、芽孢酵母屬、隱球菌屬、Apiotrichum、被孢霉屬、小克銀 漢霉屬、毛霉目、毛霉屬、根霉屬或擔(dān)子菌綱，而且其是非重組的，并能夠使用粗甘油作為碳 源并吸收所供應(yīng)的所需礦物質(zhì)。本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品是通過(guò)加工礦化或非礦化酵母產(chǎn)品獲得。 可利用所屬領(lǐng)域中已知的任何方法，例如離心、過(guò)濾等，收集由發(fā)酵得到的酵母產(chǎn)品。例如， 可能有必要通過(guò)離心和/或過(guò)濾從上清液中分離出礦化或非礦化酵母產(chǎn)品。隨后，可利用 以下一種或多種工藝，包括(但不限于)洗滌、萃取、干燥(例如，使用轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)或噴霧 干燥機(jī))、自溶、分級(jí)分離或濃縮，進(jìn)一步加工所得酵母泥，由此產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官 性產(chǎn)品。還可以加工所得上清液，以從用過(guò)的培養(yǎng)基中分離出酵母代謝物，由此產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng) 性、治療性或感官性產(chǎn)品?；蛘?，可以有氧或無(wú)氧方式消化上清液，并將由此產(chǎn)生的水從所 得泥漿中分離出來(lái)，并且再循環(huán)到有氧發(fā)酵工藝中。酵母泥可經(jīng)歷均質(zhì)化，包括高壓均質(zhì)化、超聲波處理和/或其它溶解法(例如使用 清潔劑)，獲得蛋白質(zhì)/氨基酸和碳水化合物作為營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。由酵母泥 獲得的蛋白質(zhì)可任選進(jìn)一步衍生化，提供能用作營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的功能性蛋 白質(zhì)。任選衍生化的功能性蛋白質(zhì)可例如用作乳化劑、增稠劑、脂肪結(jié)合劑、蛋清代用品和 冰淇淋穩(wěn)定劑。功能性蛋白質(zhì)以及如核苷酸等其它產(chǎn)品的制備中酵母生物質(zhì)的使用例如描 述于:Use of Yeast Biomassin Food Production，CRC Press，A. Halasz & R Lasztity, 1991，第5章，第8章和附錄第291到第300頁(yè)，以及其中的參考文獻(xiàn)中，其按引用并入本文 中。還可以用蛋白酶等酶，酶促消化酵母泥，通過(guò)離心和/或過(guò)濾分離得到酵母提取 物和酵母細(xì)胞壁。酵母細(xì)胞壁部分可例如通過(guò)轉(zhuǎn)鼓式干燥或噴霧干燥進(jìn)行干燥，而且可以
13通過(guò)研磨和篩分等方法減小所得干物質(zhì)的粒度。干燥的酵母細(xì)胞壁以及酵母提取物都可用 作營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。例如，酵母細(xì)胞壁的干粉可用作復(fù)合多糖的來(lái)源，或用于 其它營(yíng)養(yǎng)或藥妝目的。例如，其還可以是具有免疫刺激特性的葡聚糖的來(lái)源。來(lái)自橢圓釀酒酵母的作為酵母提取過(guò)程的副產(chǎn)物產(chǎn)生并且隨后經(jīng)過(guò)干燥的酵母 細(xì)胞壁，可含有約30% β-葡聚糖、約30%甘露聚糖、約15%蛋白質(zhì)和約5%到10%脂質(zhì)， 以及其它組分，例如甘露糖蛋白和殼多糖。但是，各酵母細(xì)胞壁組分的含量可取決于酵母的 種類(lèi)或其菌株而變化。例如，由產(chǎn)朊假絲酵母，根據(jù)本發(fā)明制備和干燥的酵母細(xì)胞壁可含有 約10% β-葡聚糖和約40%蛋白質(zhì)?？梢愿鶕?jù)所屬領(lǐng)域中已知的方法，例如涉及水解和/或酶促降解橢圓釀酒酵母細(xì) 胞壁的方法，通過(guò)選擇性去除其它組分，來(lái)增大酵母細(xì)胞壁部分中葡聚糖的含量?？梢?通過(guò)化學(xué)和/或酶方法，包括(但不限于)用于去除脂質(zhì)的脂酶、用于去除蛋白質(zhì)和甘露糖 蛋白的蛋白酶和用于去除殼多糖的殼多糖酶，去除特定的非葡聚糖組分。葡聚糖 (去除或不去除酵母細(xì)胞壁中的其它非β-葡聚糖組分)可用作營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn) 品。酵母細(xì)胞壁中的其它組分也可以是本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。例如，甘露 聚糖可通過(guò)用熱水萃取，從酵母細(xì)胞部分中去除，隨后用作營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。現(xiàn)將參考以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，而且所述實(shí)施例只用于例示說(shuō) 明。實(shí)施例實(shí)施例1 處理粗甘油將由生物柴油制造得到的副產(chǎn)物粗甘油加溫到約25°C，以使所述物質(zhì)液化。粗甘 油的PH值為約10.0，并且甲醇含量小于(重量比)。將粗甘油(1000升)轉(zhuǎn)移到1300 升裝有頂置攪拌和加熱/冷卻夾套的不銹鋼罐中。加溫到60°C后，將85% (重量比)磷酸 溶液緩慢泵入經(jīng)過(guò)攪拌的混合物中，直到通過(guò)滴定確定達(dá)到終點(diǎn)PH 4.0。再添加水(250 升)，以保持形成的鹽在溶解狀態(tài)。隨后，使混合物靜置2小時(shí)，此后，分離出下層甘油水溶 液相(TCG)，并儲(chǔ)存供用于發(fā)酵階段。或者，可對(duì)混合物進(jìn)行離心，以獲得上層和下層相，隨 后分離。TCG相中甘油含量為約700克/升。進(jìn)一步使用前，將TCG稀釋到含500克/升甘 油的標(biāo)準(zhǔn)濃度。取出主要由游離脂肪酸組成的上層相，以供儲(chǔ)存、分析和處置。任選可通過(guò)用膨潤(rùn)土和/或活性炭處理，去除TCG的淺琥珀色到深褐色。將膨潤(rùn) 土和/或活性炭添加到TCG(25克/升)中，在環(huán)境溫度下攪拌，隨后通過(guò)離心去除。所得 TCG可以是無(wú)色的。通過(guò)HPLC，利用RI檢測(cè)來(lái)分析加工之前和之后各相的甘油含量，以確定產(chǎn)率。進(jìn)料量1000升，約50%到60% (重量比)甘油，即約含500到600公斤甘油產(chǎn)量約1000升，約50% (重量比)甘油，即約含500公斤甘油產(chǎn)率=TCG中得到的甘油占約95%到100%上層相中甘油的含量約小于(重量比)。實(shí)施例2 在實(shí)施例1經(jīng)過(guò)處理的粗甘油存在下，連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)朊假絲酵母以連續(xù)方式建立一個(gè)2L的實(shí)驗(yàn)室有氧發(fā)酵罐，帶有控制PH值及溫度和泡沫，以及 測(cè)量溶解氧(DO)、供應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基和收集培養(yǎng)物的設(shè)施。根據(jù)需要，向發(fā)酵罐中供應(yīng)氧，以 便在必要時(shí)防止連續(xù)培養(yǎng)的氧缺乏。
供應(yīng)到發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基包括以下三種組分(1)甘油濃度為約500克/升并且pH值為4. 0的實(shí)施例1的經(jīng)過(guò)處理的粗甘油 (作為唯一碳源)，其是以50毫升/小時(shí)的流量提供；(2)⑴礦物鹽濃縮物(含有 S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo 和 B)、(ii) 硫酸與(iii)磷酸的混合物，所述混合物的PH值為0.8，并且以110毫升/小時(shí)的流量提 供；和(3)水，以105毫升/小時(shí)的流量提供，其量足以稀釋甘油、礦物鹽濃縮物、硫酸和 磷酸達(dá)到下表1中所示的濃度。在供應(yīng)到發(fā)酵罐中之前，這三種組分各自分別經(jīng)由高壓釜 滅菌。獨(dú)立地調(diào)整三種組分供應(yīng)的組成和相對(duì)速率，以便控制發(fā)酵的稀釋率(生長(zhǎng)速 率)和發(fā)酵罐中的組成。優(yōu)選發(fā)酵罐中營(yíng)養(yǎng)物的濃度如表1中所示表1-舗■爭(zhēng)腿贈(zèng)籠白嫩帛
表1中所列濃度是在當(dāng)前所述條件下各組分的適宜濃度。然而，必要時(shí)，有可能通 過(guò)增加或降低特定元素的濃度，來(lái)改變表1中各元素的濃度。接種前，向發(fā)酵罐中部分裝入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并靜置過(guò)夜，以平衡DO和pH探針。必 要時(shí)，在發(fā)酵期間通過(guò)加熱以及向發(fā)酵罐中供應(yīng)28%氨水溶液，來(lái)將發(fā)酵罐中的溫度和pH 值調(diào)到設(shè)定點(diǎn)(35°C，pH 3. 6)，以便保持pH值。用150毫升在搖瓶中生長(zhǎng)過(guò)夜的處于指數(shù)生長(zhǎng)期的種子培養(yǎng)物(分批培養(yǎng))接種 發(fā)酵罐。種子培養(yǎng)的接種物量是發(fā)酵罐體積的7. 5% (體積比)。當(dāng)發(fā)酵罐中細(xì)胞的光學(xué) 密度大于等于10時(shí)，開(kāi)始連續(xù)發(fā)酵。使用28%氨水溶液控制pH值的一個(gè)結(jié)果是向發(fā)酵罐中供應(yīng)氮。礦物鹽濃縮物、硫 酸與磷酸的混合物經(jīng)過(guò)調(diào)配，以致保持恒定PH值所需的氨進(jìn)料也供應(yīng)適當(dāng)?shù)牡┖叩?白質(zhì)含量的細(xì)胞生物質(zhì)生長(zhǎng)之用。送入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的C/N比為5. 5 1。所述工藝產(chǎn)生0. 15/小時(shí)的稀釋率(生長(zhǎng)速率)和55. 4克/升的平均細(xì)胞密度 (以干重計(jì))。每100克含于培養(yǎng)基中的甘油的生物質(zhì)產(chǎn)率(以干重計(jì))為約70%，并且工 藝生產(chǎn)率為8. 3克/升·小時(shí)。使用溢流系統(tǒng)將發(fā)酵罐內(nèi)含物連續(xù)收集到20升大瓶(carboy)中，并在約4°C下儲(chǔ) 存收集到的肉湯(broth)。完成后，從系統(tǒng)采集20升肉湯，并離心，得到含約20%到25% (重量比)固體的酵母泥。最初根據(jù)酵母泥的顏色(淺褐色)、香味(芳香，非酵母樣氣味)和粗蛋白質(zhì)含量， 評(píng)估其質(zhì)量，所述粗蛋白質(zhì)含量通過(guò)凱氏分析法(Kjeldahl analysis)評(píng)估為約55% (重 量比；以干重計(jì))(NX6. 25)。實(shí)施例3 在實(shí)施例1經(jīng)過(guò)處理的粗甘油存在下，大規(guī)模連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)朊假絲酵母。以連續(xù)方式建立一個(gè)500升的實(shí)驗(yàn)室有氧發(fā)酵罐，帶有控制PH值及溫度和泡沫， 以及測(cè)量溶解氧(DO)、供應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基和收集培養(yǎng)物的設(shè)施。培養(yǎng)基中的組分包括實(shí)施例1的經(jīng)過(guò)處理的粗甘油(作為唯一碳源)、礦物鹽濃縮 物(含有S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo和B)、磷酸、硫酸和水。以5000升批料 預(yù)混合適量的所有這些組分，以達(dá)到下表2中所示的濃度。隨后，在90°C下，對(duì)合并的培養(yǎng) 基進(jìn)行60到90分鐘巴氏滅菌，然后送入發(fā)酵罐中。經(jīng)過(guò)巴氏滅菌的合并的培養(yǎng)基的pH值 為約1.8。就較大規(guī)模來(lái)說(shuō)，可將粗甘油、礦物鹽濃縮物和水等培養(yǎng)基組分連續(xù)送入混合機(jī) /滅菌器中，此后送入發(fā)酵罐中，以改進(jìn)能效并更好地控制無(wú)菌狀態(tài)。接種前，向發(fā)酵罐中部分裝入經(jīng)過(guò)巴氏滅菌的合并的培養(yǎng)基和無(wú)菌水(各100 升)，并靜置過(guò)夜，以平衡DO和pH探針。此初始培養(yǎng)基含有表2所示的營(yíng)養(yǎng)物的50%濃度。 必要時(shí)，通過(guò)加熱以及供應(yīng)氨氣，將發(fā)酵罐中的溫度和PH值調(diào)到設(shè)定點(diǎn)(35°C，pH 3. 6)，以 保持PH值。表2-發(fā)酵罐凈進(jìn)料中營(yíng)養(yǎng)物的濃度 用從2升連續(xù)發(fā)酵罐中收集的細(xì)胞密度為50克/升的20升種子培養(yǎng)物接種發(fā)酵 罐(例如實(shí)施例2中所述)。隨后，使220升合并的發(fā)酵物以分批模式有氧發(fā)酵8小時(shí)。必 要時(shí)，在發(fā)酵期間，向發(fā)酵罐中送入氨氣，以將PH值控制在3. 60到3. 65范圍內(nèi)。每分鐘供 應(yīng)1到2個(gè)發(fā)酵罐體積的空氣。此后，在補(bǔ)料分批模式下，以30升/小時(shí)的速率向發(fā)酵罐中再送入合并的經(jīng)過(guò)巴 氏滅菌的培養(yǎng)基，直到液體體積達(dá)到300升。由于通風(fēng)引起泡沫和氣體滯留，故發(fā)酵罐總體 積接近450升，盡管只存在300升液體。液體體積達(dá)到300升后，接著以與進(jìn)料相同的速率， 從發(fā)酵罐中取出物質(zhì)，以使發(fā)酵罐以連續(xù)模式操作。供應(yīng)給發(fā)酵罐的總體C/N比為9. 3 1。在約24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞密度達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度，而且在極少擾動(dòng)下，使發(fā)酵罐保持穩(wěn)態(tài) 至少3天。因此，流量為30升/小時(shí)時(shí)，稀釋率為0. 1/小時(shí)。將從發(fā)酵罐連續(xù)取出的所收集物質(zhì)迅速冷卻到約4°C，并在1000升收集罐中儲(chǔ)存 不到3天，隨后進(jìn)行離心、洗滌和下游加工。就較大規(guī)模來(lái)說(shuō)，可在收集時(shí)，通過(guò)連續(xù)離心來(lái) 自發(fā)酵罐肉湯的酵母，來(lái)更換酵母收集物的分批儲(chǔ)料。使用此系統(tǒng)達(dá)到的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞密度以干重計(jì)為38. 2克/升，而且生物質(zhì)產(chǎn)率為約 44%。工藝生產(chǎn)率為3. 82克/升·小時(shí)。最初根據(jù)酵母泥的顏色(淺褐色)、香味(芳香，非酵母樣氣味)和粗蛋白質(zhì)含 量，評(píng)估其質(zhì)量，所述粗蛋白質(zhì)含量通過(guò)凱氏分析法評(píng)估為約58% (重量比；以干重計(jì))轉(zhuǎn)鼓式干燥或轉(zhuǎn)化成酵母提取物，來(lái)進(jìn)一步加工所述物質(zhì)。在兩種情況下， 判斷產(chǎn)品具有優(yōu)良的感官質(zhì)量。實(shí)施例4 在經(jīng)過(guò)處理的粗甘油存在下，補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)朊假絲酵母通過(guò)高壓釜滅菌2升發(fā)酵罐，其裝備有再循環(huán)和通風(fēng)系統(tǒng)、泡沫控制系統(tǒng)、DO測(cè)量 系統(tǒng)以及PH和溫度監(jiān)測(cè)與控制系統(tǒng)。隨后，向發(fā)酵罐中裝入150毫升包括以下三種組分的 經(jīng)過(guò)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基(1)經(jīng)過(guò)處理的粗甘油(以與實(shí)施例1所述相同的方式處理)，甘油濃度為約500 克/升并且PH值為4.0;(2)⑴礦物鹽濃縮物(含有 S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo 和 B)、(ii) 硫酸與(iii)磷酸的混合物，而且所述混合物的PH值為0. 8 ；和(3)水，其量足以稀釋甘油以及礦物鹽濃縮物、硫酸和磷酸的混合物達(dá)到下表3中 所示的初始濃度。在供應(yīng)到發(fā)酵罐中之前，這三種組分各自分別經(jīng)由高壓釜滅菌。表3-i^mm^mmm^m 用150毫升活酵母培養(yǎng)物(通過(guò)用實(shí)質(zhì)上無(wú)菌洗滌新制酵母培養(yǎng)物的瓊脂斜面得 到的洗滌液(2毫升)接種含150毫升培養(yǎng)基的燒瓶來(lái)制備)接種發(fā)酵罐。再循環(huán)肉湯，通 風(fēng)并使其在35°C溫度和pH 3. 6下發(fā)酵。使用氨(28%水溶液)保持pH值。2小時(shí)后，再以27毫升/小時(shí)的總流量向批料中供應(yīng)培養(yǎng)基。所送入的此培養(yǎng)基 的組成與表3中相同。此流量每2小時(shí)增加一次，使得新流量等于調(diào)整時(shí)發(fā)酵罐累積體積 的0. 09倍。自接種起22小時(shí)后，發(fā)酵完成(S卩，容器裝滿(mǎn))。此時(shí)，測(cè)量細(xì)胞密度為75克/升 (以干重計(jì))，并且產(chǎn)率為約75%。工藝生產(chǎn)率為3. 4克/升·小時(shí)，并且供應(yīng)給發(fā)酵罐的 C/N*4.2 1。判斷酵母泥具有優(yōu)良的感官質(zhì)量。實(shí)施例5 由在經(jīng)過(guò)處理的耜甘油存在下牛長(zhǎng)的產(chǎn)朊假絲酵母制備酵母提取物和 酵母細(xì)胞壁本實(shí)施例說(shuō)明來(lái)源于在粗甘油上生長(zhǎng)的酵母的產(chǎn)品的制備，其中通過(guò)使用粗甘 油，所述制備得到良好產(chǎn)率，并且沒(méi)有不良的氣味或味道。向250毫升錐形燒瓶中裝入68. 0克(以濕重計(jì))由粗甘油得到的酵母泥(以與 實(shí)施例2所述類(lèi)似的方式獲得)，所述酵母泥以重量比計(jì)，含有約25%固體(即，17. 0克，以 干重計(jì))。隨后將水添加到酵母泥中，達(dá)到100毫升刻度線(xiàn)。密封錐形燒瓶，并用力振蕩混 合物，由此獲得均質(zhì)混合物。在此階段，反應(yīng)混合物的PH值介于4. 5與4. 6之間。使用1.3 毫升IN NaOH將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)到pH 8.5。接著于保持70°C的振蕩水浴中保持此反 應(yīng)混合物。向反應(yīng)混合物中添加0. 1重量％ (17mg/100ml)酶Protex 6L (從Genencor公 司得到)。在4、8、16、20、24、36和48小時(shí)時(shí)，對(duì)反應(yīng)混合物采樣。每次采樣期間，將10毫升 反應(yīng)混合物采入有刻度的玻璃離心管中。在5°C溫度下，以4000rpm離心樣品5分鐘。離心 結(jié)束時(shí)，將所得上清液全部轉(zhuǎn)移到有刻度的玻璃管中，并測(cè)量和記錄上清液體積(約6. 5毫 升)。將上清液(5毫升)轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱(chēng)重的表面皿上，并將表面皿放入105°C的烘箱中，保 持約24小時(shí)。由上清液的干重％和其體積，計(jì)算出產(chǎn)率％為57%，即9. 7g提取物(以干重 計(jì))。由經(jīng)過(guò)離心的反應(yīng)混合物得到的上清液保留為可溶性酵母提取物，并且殘余物主 要是由酵母細(xì)胞壁(其可經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工而獲得富含β-葡聚糖和甘露聚糖的部分)組 成。利用凱氏分析法(Buchi AG)，測(cè)量上清液酵母提取物中的含氮量，得到粗蛋白質(zhì) 的測(cè)量值(NX6. 25)。利用甲酸滴定法(Formol titration method ；Am J EnolVitic, 52, 4，400-401，按引用并入本文中)測(cè)量游離氨基氮的含量。由這兩個(gè)測(cè)量值，根據(jù)游離氨基 氮與總氮的比率，計(jì)算出水解程度，并且結(jié)果概述于下。使用市售酶檢測(cè)試劑盒(enzymatic test kit ；Megazymes Intl)，以分光光度法測(cè)量酵母提取物中谷氨酸鹽的濃度，并且結(jié)果 也概述于下。完成消化的時(shí)間約24小時(shí)產(chǎn)率57%，即由17克酵母泥(以干重計(jì))得到9. 7克提取物(以干重計(jì))上清液中酵母提取物的濃度約10%到13% (重量比；以干重計(jì))
酵母提取物中的含氮量％ 24小時(shí)結(jié)束時(shí)的FAN% 24小時(shí)結(jié)束時(shí)的DH% 谷氨酸鹽％ 感官分析約8. 5%到10.0% (重量比；以干重計(jì)) 約3. 5%到5.0% (重量比；以干重計(jì)) 約 45%到 55%
占酵母提取物約11%到12% (以干重計(jì)) 可口的咸味/肉味(2%溶液) 沒(méi)有檢測(cè)到痕量類(lèi)似于粗甘油的氣味或味道。 除上述實(shí)驗(yàn)外，還進(jìn)行了數(shù)個(gè)其它實(shí)驗(yàn)，其中嘗試測(cè)試不同的蛋白酶以?xún)?yōu)化這些 特定酶的反應(yīng)條件。改變了 PH值、培育溫度和反應(yīng)時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)。還對(duì)由下表4中概述 的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的所有酵母提取物進(jìn)行了感官分析。表4-DH倌、溫度和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
酶時(shí)間溫度pH產(chǎn)率％ (以干重計(jì))味道Protex6L24小時(shí)70 "C7. 551. 2肉味/咸味Protex6L24小時(shí)70 "C8. 048. 2肉味/咸味Protex6L24小時(shí)70 "C8. 557. 4肉味/咸味Protex6L24小時(shí)55 "C7. 541. 0苦味Protex6L24小時(shí)55 "C8. 043. 8苦味Protex6L24小時(shí)55 "C8. 538. 6苦味菠蘿蛋白 酶 (Bromelain )24小時(shí)70 "C7. 038. 2苦味菠蘿蛋白 酶24小時(shí)70 "C7. 540. 1苦味菠蘿蛋白 酶24小時(shí)70 "C8. 042. 1苦味菠蘿蛋白 酶24小時(shí)55 "C7. 042. 1苦味菠蘿蛋白 酶24小時(shí)55 "C7. 541. 2苦味
20 在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在70°C和pH 8. 5下，用PROTEX 6LTM消化來(lái)自TCG 的酵母細(xì)胞是制造酵母提取物的適當(dāng)條件，此舉得到57%產(chǎn)率以及引人注目的淺黃色和肉 味。實(shí)施例6 由在經(jīng)過(guò)處理的耜甘油存在下牛長(zhǎng)的產(chǎn)朊假絲酵母制備干酵母細(xì)胞壁根據(jù)實(shí)施例3中所述的方法，大規(guī)模制備產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞。隨后根據(jù)實(shí)施例5， 使用所得酵母泥制備酵母提取物。離心取出酵母提取物溶液后，將殘余物再懸浮于等體積 的水中，并且再離心。再重復(fù)此洗滌過(guò)程2次。接著，再懸浮所得殘余物(含有約20%干物 質(zhì))達(dá)到10% (重量比)固體的濃度，并送入蒸汽加熱的轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)中。干燥機(jī)中的進(jìn) 料速率為每分鐘約70到90毫升，并且有規(guī)律地進(jìn)行調(diào)整以配合干燥機(jī)的轉(zhuǎn)速，并防止轉(zhuǎn)鼓 上酵母泥的任何累積。接著，通過(guò)用研棒和研缽研磨，減小收集到的干燥固體的粒度，得到自由流動(dòng)的粉 末。根據(jù)Megazymes公司(愛(ài)爾蘭)提供的方法，發(fā)現(xiàn)此粉末含有93. 3%干物質(zhì)，經(jīng)過(guò)分 析，其中約10. 5%為β-葡聚糖(以干重計(jì))。^ΜΜΧ^由在經(jīng)過(guò)處理的粗甘油存在下生長(zhǎng)的產(chǎn)朊假絲酵母獲得的酵母細(xì)胞壁 制備β“葡聚糖已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁(由上述實(shí)施例5中所述的酵母提取方法作為副產(chǎn)物形成) 含有約10. 5% β -葡聚糖(以干重計(jì))。去除α -葡聚糖(通過(guò)用α -淀粉酶處理)和脂 質(zhì)(在回流下，用2-丙醇萃取2小時(shí))后，葡聚糖的含量增大到15%。還發(fā)現(xiàn)用熱檸 檬酸鈉緩沖液萃取(去除甘露糖蛋白組分)，能將殘余物中葡聚糖的含量增大到20%。 β -葡聚糖的含量是使用購(gòu)自Megazyme InternationalIreland公司的酶分析試劑盒測(cè)量 得到。
實(shí)施例8 制備由在經(jīng)過(guò)處理的粗甘油存在下生長(zhǎng)的產(chǎn)朊假絲酵母得到的礦化酵 母產(chǎn)品通過(guò)高壓釜滅菌2升發(fā)酵罐，其裝備有再循環(huán)和通風(fēng)系統(tǒng)、泡沫控制系統(tǒng)、pH和溫 度監(jiān)測(cè)與控制系統(tǒng)以及DO測(cè)量系統(tǒng)。向發(fā)酵罐中裝入1750毫升包括以下三種組分的無(wú)菌
發(fā)酵培養(yǎng)基1)根據(jù)實(shí)施例1方法制備250毫升經(jīng)過(guò)處理的粗甘油(作為唯一碳源)，并且其 含有650克/升甘油；2)0. 5 升⑴礦物鹽濃縮物(含有 S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo 和 B)、 ( )硝酸與(iii)磷酸的混合物；和3)1 升水發(fā)酵罐中營(yíng)養(yǎng)物的初始濃度如下表5中所示表5-發(fā)酵罐中營(yíng)養(yǎng)物的初始濃度
使用氨水溶液將pH值校正到3. 6，隨后用200毫升純種子培養(yǎng)物(通過(guò)在搖瓶中 過(guò)夜分批發(fā)酵來(lái)制備)接種內(nèi)含物。使系統(tǒng)在35°C下以分批模式發(fā)酵過(guò)夜，或直到在700納米下的光學(xué)密度達(dá)到10。 隨后，將系統(tǒng)轉(zhuǎn)換到連續(xù)模式，其中以26毫升/小時(shí)送入經(jīng)過(guò)處理的粗甘油(根據(jù)實(shí)施例 1制備，以重量/體積比計(jì)，為65% )。以69毫升/小時(shí)送入礦物鹽濃縮物、硝酸和磷酸的 混合物，并且以56毫升/小時(shí)供應(yīng)水，以便保持表6中所示的進(jìn)料組成。^ e- 'Mmm^m^mm^mm 加入控制pH值(氨水溶液)和泡沫(例如Dow-Corning公司的Antifoaml520US ) 的試劑后，稀釋率為0. 1/小時(shí)。
必要時(shí)，在發(fā)酵期間，通過(guò)自動(dòng)添加氨水溶液，將pH值保持在3. 6與3. 7之間。使 溫度升到35. 0°C，隨后必要時(shí)通過(guò)供應(yīng)冷卻水，保持此溫度。當(dāng)發(fā)酵罐中的細(xì)胞密度達(dá)到穩(wěn)態(tài)(或超過(guò)每升40克干生物質(zhì))時(shí)，利用改良的礦 物鹽混合物更換礦物鹽濃縮物、硝酸與磷酸的混合物，所述改良的礦物鹽混合物的組成與 表6中所示進(jìn)料組成一致，只是在進(jìn)料組合物中還存在0. 11克/升濃度的硒酸鈉。在發(fā)酵罐在送入改良的礦物鹽混合物的同時(shí)達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)平衡(在約24到48小 時(shí)內(nèi)發(fā)生)后，接著使用第二種改良的礦物鹽混合物，其中硒酸鈉的濃度有所增加，以致進(jìn) 料組合物中硒濃度為0. 22克/升。再次達(dá)到平衡期，此后使用第三種改良的礦物鹽混合物， 其中硒酸鈉的濃度有所增加，以致進(jìn)料組合物中硒濃度為0. 33克/升。以此方式增加發(fā)酵罐進(jìn)料(穩(wěn)態(tài))中硒的濃度。持續(xù)增加，直到由細(xì)胞密度降低 到小于30克/升(以干重計(jì))觀察到，硒含量開(kāi)始對(duì)酵母生長(zhǎng)有毒。這對(duì)應(yīng)于35%的由甘 油得到的生物質(zhì)的產(chǎn)率。在細(xì)胞密度降低到約30克/升時(shí)，停止發(fā)酵。停止發(fā)酵時(shí)，連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)率為3克/升·小時(shí)。供應(yīng)到發(fā)酵罐的進(jìn)料中的C/ N 比為 10. 6 1。收集發(fā)酵罐的溢出物，并在4°C下儲(chǔ)存。定期取出收集物，通過(guò)離心濃縮，并將所 得酵母泥轉(zhuǎn)鼓干燥，達(dá)到固體含量大于90% (重量比)。利用原子吸收光譜法(Atomic Absorption Spectroscopy)測(cè)量酵母的含硒量，并且結(jié)果概述于表7中。據(jù)判斷，干酵母的 感官特性是可接受的，而且不存在由粗甘油原料引起的污染。表7 礦化酵母產(chǎn)品的含硒量 應(yīng)了解，僅借助實(shí)施例描述了本發(fā)明，并且所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的揭示內(nèi) 容將顯而易見(jiàn)本發(fā)明的修改和/或變更，而這些修改和/或變更也認(rèn)為是在隨附權(quán)利要求 書(shū)所界定的本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。
2權(quán)利要求
一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，其包含(a)在包含作為至少一種碳源的粗甘油以及一種或多種氮源的培養(yǎng)基存在下，在有氧條件下生長(zhǎng)非重組酵母，以產(chǎn)生酵母產(chǎn)品；其中所述培養(yǎng)基中的碳氮比小于90∶1；和(b)加工所述酵母產(chǎn)品，獲得所述營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述粗甘油在添加到所述培養(yǎng)基中前，經(jīng)歷一種 或多種處理以去除一種或多種雜質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述粗甘油以重量比計(jì)，含有約15%到約 95%甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述粗甘油以重量比計(jì)，含有約20%到約95%甘油。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述粗甘油以重量比計(jì)，含有約40%到約90%甘油。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述粗甘油以重量比計(jì)，含有約80%到約90%甘油。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述粗甘油是唯一碳源。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述氮源是氨。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于 80 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于40 1。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于20 1。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于10 1。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是以連續(xù)模式生長(zhǎng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述連續(xù)模式是以約0.05/小時(shí)到約0. 25/小 時(shí)的稀釋率操作。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一權(quán)利要求所述的方法，其中溶解氧的濃度大于2%的 空氣飽和度。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溶解氧的濃度大于5%的空氣飽和度。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中甘油的濃度 為約0.1克/升到約500.0克/升。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中甘油的濃度為約50.0克/升到約 200. 0 克 / 升。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中甘油的濃度為約70.0克/升到約 150. 0 克 / 升。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是在pH3.0到 pH 8. 0下生長(zhǎng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述pH值為4.5或4. 5以下。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是在約20.0°C到 約40. 0°C溫度下生長(zhǎng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述溫度為約25.0°C到約36. 0°C。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是產(chǎn)朊假絲 酵母(Candida utilis)、彎假絲酵母(Candida curvata)、西班牙假絲酵母(Candida hispaniensis) > Candida bentonensis、馬克Jff克魯維_母(Kluyveromyces marxianus) > 貝酵母(Saccharomyces bayanus)、橢圓酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母生物質(zhì)的產(chǎn)率為 約 25. 0%到約 80. 0%o
26.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一權(quán)利要求所述的方法，其中以干重計(jì)，細(xì)胞密度為約 5. O克/升到大于或等于150. O克/升。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母的生長(zhǎng)展現(xiàn)大于 或等于0. 85克/升·小時(shí)的工藝生產(chǎn)率。
28.一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，其包含(a)在包含作為至少一種碳源的粗甘油以及一種或多種氮源的培養(yǎng)基存在下，在有氧 條件下生長(zhǎng)產(chǎn)朊假絲酵母，以產(chǎn)生酵母產(chǎn)品；和(b)加工所述酵母產(chǎn)品，獲得所述營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述粗甘油在添加到所述培養(yǎng)基中前，經(jīng)歷一 種或多種處理以去除一種或多種雜質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法，其中所述粗甘油以重量比計(jì)，含有約15%到約 95%甘油。
31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述粗甘油是唯一碳源。
32.根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述氮源是氨。
33.根據(jù)權(quán)利要求28至32中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中的碳氮比小 于 90 1。
34.根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一權(quán)利要求所述的方法，其中產(chǎn)朊假絲酵母是以連續(xù)模 式生長(zhǎng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述連續(xù)模式是以約0.05/小時(shí)到約0. 25/小 時(shí)的稀釋率操作。
36.根據(jù)權(quán)利要求28至35中任一權(quán)利要求所述的方法，其中溶解氧的濃度大于2%的 空氣飽和度。
37.根據(jù)權(quán)利要求28至36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中甘油的濃度 為約0.1克/升到約500.0克/升。
38.根據(jù)權(quán)利要求28至37中任一權(quán)利要求所述的方法，其中產(chǎn)朊假絲酵母是在pH 3. 6下生長(zhǎng)。
39.根據(jù)權(quán)利要求28至38中任一權(quán)利要求所述的方法，其中產(chǎn)朊假絲酵母是在 35. 0°C溫度下生長(zhǎng)。
40.根據(jù)權(quán)利要求28至39中任一權(quán)利要求所述的方法，其中酵母生物質(zhì)的產(chǎn)率為約 25. 0%到約80. 0%產(chǎn)率。
41.根據(jù)權(quán)利要求28至39中任一權(quán)利要求所述的方法，其中以干重計(jì)，細(xì)胞密度為約 5. 0克/升到大于或等于150. 0克/升。
42.根據(jù)權(quán)利要求28至39中任一權(quán)利要求所述的方法，其中產(chǎn)朊假絲酵母的生長(zhǎng)展現(xiàn) 大于或等于0. 85克/升·小時(shí)的工藝生產(chǎn)率。
43.一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，其包含(a)在包含作為至少一種碳源的粗甘油、一種或多種氮源以及一種或多種選自由硒、 鉻、鉬、鍺、鋅、鐵、銅、鎂、錳、碘和其組合組成的群組的元素的培養(yǎng)基存在下，在有氧條件下 生長(zhǎng)非重組酵母，以產(chǎn)生礦化酵母產(chǎn)品；和(b)加工所述礦化酵母產(chǎn)品，獲得所述營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中以干重計(jì)，所述礦化酵母產(chǎn)品含有約IOOppm到 約50000ppm各元素。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的方法，其中所述元素是硒。
46.根據(jù)權(quán)利要求43至45中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述粗甘油在添加到所述 培養(yǎng)基中前，經(jīng)歷一種或多種處理以去除一種或多種雜質(zhì)。
47.根據(jù)權(quán)利要求43至46中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述粗甘油以重量比計(jì)， 含有約15%到約95%甘油。
48.根據(jù)權(quán)利要求43至47中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述粗甘油是唯一碳源。
49.根據(jù)權(quán)利要求43至48中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述氮源是氨和硝酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求43至49中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中的碳氮比小 于 90 1。
51.根據(jù)權(quán)利要求43至50中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是以連續(xù)模式生長(zhǎng)。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述連續(xù)模式是以約0.05/小時(shí)到約0. 25/小 時(shí)的稀釋率操作。
53.根據(jù)權(quán)利要求43至52中任一權(quán)利要求所述的方法，其中溶解氧的濃度大于2%的 空氣飽和度。
54.根據(jù)權(quán)利要求43至53中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中甘油的濃度 為約0.1克/升到約500.0克/升。
55.根據(jù)權(quán)利要求43至54中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是在pH3. 0到 pH 8. 0下生長(zhǎng)。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述pH值為4.5或4. 5以下。
57.根據(jù)權(quán)利要求43至56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是在約20.0°C 到約40. 0°C溫度下生長(zhǎng)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述溫度為約25.0°C到約36. 0°C。
59.根據(jù)權(quán)利要求43至58中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酵母是產(chǎn)朊假絲酵 母、彎假絲酵母、西班牙假絲酵母、Candida bentonensis、馬克斯克魯維酵母、貝酵母、橢圓 釀酒酵母或其組合。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。
61.根據(jù)權(quán)利要求43至60中任一權(quán)利要求所述的方法，其中酵母生物質(zhì)的產(chǎn)率為約 25. 0%到約80. 0%產(chǎn)率。
62.根據(jù)權(quán)利要求43至60中任一權(quán)利要求所述的方法，其中以干重計(jì)，細(xì)胞密度為約5. 0克/升到大于或等于150. 0克/升。
63.根據(jù)權(quán)利要求43至60中任一權(quán)利要求所述的方法，其中產(chǎn)朊假絲酵母的生長(zhǎng)展現(xiàn) 大于或等于0. 85克/升·小時(shí)的工藝生產(chǎn)率。
64.一種由根據(jù)權(quán)利要求1至63中任一權(quán)利要求所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性或感官性產(chǎn) 品，其適用于人類(lèi)和/或動(dòng)物。
65.一種由根據(jù)權(quán)利要求1至63中任一權(quán)利要求所述的方法制備的治療性產(chǎn)品，其適 用于人類(lèi)和/或動(dòng)物。
66.根據(jù)權(quán)利要求64或65所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是酵母泥、酵母代謝物、碳水化合 物、蛋白質(zhì)、功能性蛋白質(zhì)、核苷酸、酵母自溶物、酵母提取物、酵母細(xì)胞壁、β-葡聚糖、甘露 聚糖或來(lái)源于礦化酵母產(chǎn)品的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品的方法，是通過(guò)在包括粗甘油作為一種可能碳源的培養(yǎng)基中，在有氧條件下生長(zhǎng)非重組酵母以產(chǎn)生酵母產(chǎn)品來(lái)完成的。所述酵母產(chǎn)品經(jīng)過(guò)加工，可獲得酵母泥、酵母代謝物、碳水化合物、蛋白質(zhì)、功能性蛋白質(zhì)、核苷酸、酵母自溶物、酵母提取物、酵母細(xì)胞壁、β葡聚糖、甘露聚糖或來(lái)源于礦化酵母產(chǎn)品的產(chǎn)品等營(yíng)養(yǎng)性、治療性或感官性產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N1/16GK101918535SQ200980102370
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者唐諾·芬萊·麥克連南, 大衛(wèi)·葛拉漢·麥克連南, 瑪莉·伊麗莎白·麥克連南, 羅賓·費(fèi)德豪斯 申請(qǐng)人:澳洲生質(zhì)處理有限公司