專利名稱：作為免疫刺激劑/佐劑的式(I)(N_uG_lX_mG_nN_v)_a的核酸及其衍生物的制作方法
作為免疫刺激劑/佐劑的式(I) (NuGlXmGnNv)a的核酸及其衍
生物本發(fā)明涉及作為免疫刺激劑/佐劑的通式(I) =(NuG1XmGnNv)a的核酸及其衍生物并 且涉及包含其的組合物，所述組合物任選地還包含另外的佐劑。本發(fā)明另外涉及藥物組合 物或疫苗，每一種包含上述式(I)的核酸和/或其衍生物作為免疫刺激劑，和任選地包括至 少一種另外的藥用活性成分，例如，抗原試劑。本發(fā)明同樣涉及藥物組合物或疫苗用于治療 癌癥疾病，感染性疾病，變應(yīng)性疾病和自體免疫疾病等的應(yīng)用。同樣地，本發(fā)明包括式(I) (NuG1XmGnNv)a的核酸和/或其衍生物用于制備治療所述疾病的藥物組合物的應(yīng)用。在常規(guī)和遺傳疫苗中，頻繁出現(xiàn)這樣的問題，即在被治療或接種的生物體中僅發(fā) 生較少并因此頻繁的不充分的免疫應(yīng)答。為此原因，經(jīng)常將所謂的佐劑加入疫苗或藥用活 性成分中，即將能夠以靶向方式增加和/或影響免疫應(yīng)答的物質(zhì)或組合物，加入例如抗原 中。例如，已知一些可注射的醫(yī)用活性成分的有效性可以通過組合活性成分以及能夠影響 活性成分釋放到宿主細(xì)胞系統(tǒng)中以及任選地其吸收到宿主細(xì)胞中的佐劑組合而明顯提高。 以該方式，可以獲得這樣的作用，其與以常規(guī)間隔周期性地施用許多小劑量相當(dāng)。術(shù)語“佐 劑”在該背景下一般指充當(dāng)免疫原和/或其它藥用活性化合物的載體或輔助物質(zhì)的化合物 或組合物。典型地，術(shù)語“佐劑”以廣義解釋并且指廣譜物質(zhì)或stratagerm，其能夠增加結(jié) 合到目的佐劑或與目的佐劑共同施用的抗原的免疫原性。佐劑可以進(jìn)一步分為，而不限于， 免疫強(qiáng)化劑，抗原遞送系統(tǒng)或甚至其組合。已經(jīng)將許多化合物和組合物提議作為本領(lǐng)域的佐劑，例如弗氏佐劑，金屬氧化物 (氫氧化鋁等)，明礬，無機(jī)螯合物或其鹽，各種石蠟樣油，合成樹脂，藻酸鹽，類黏蛋白，多 糖化合物，酪蛋白酸鹽，以及分離自血液和/或血凝塊的化合物，如例如纖維蛋白衍生物 等。然而，在大多數(shù)情況下，所述佐劑產(chǎn)生不理想的副作用，例如皮膚刺激和在施用位點的 炎癥。在某些病例中還觀察到毒性副作用，特別是組織壞死。不幸的是，在大多數(shù)情形中， 這些已知的佐劑僅帶來對細(xì)胞免疫應(yīng)答的不充分的刺激，因為僅B細(xì)胞被激活。分離自動物的化合物，如例如明膠通常不適合作為用于免疫刺激目的的佐劑。盡 管所述化合物通常不顯示對于目的宿主生物或宿主細(xì)胞的負(fù)面作用，它們典型地以太快的 速度從注射位點遷移到宿主生物或到宿主細(xì)胞中，從而幾乎不能獲得通常對于佐劑是理想 的性質(zhì)，如，例如，任選地與佐劑等一起注射的活性成分的延遲的釋放。在某些情形中，所述 快速分布可以被單寧或其它(無機(jī))化合物抵消。然而尚不能充分解釋所述另外的化合物 的代謝和它們在體內(nèi)的所在。因此，還是在該情形中，假定這些化合物在碎片中聚集并因此 明顯地干擾過濾機(jī)制，例如腎細(xì)胞，肝細(xì)胞和/或脾細(xì)胞是合理的。此外，明膠的當(dāng)腸胃外 施用時溶脹的性質(zhì)可在體內(nèi)條件下導(dǎo)致令人不愉快的副作用，如，例如，特別是在施用位點 的溶脹，并且導(dǎo)致疾病的感覺。在分離自血液和/或血凝塊的化合物的情形中，如例如，纖維蛋白衍生物等，已經(jīng) 典型地證實了免疫刺激作用。然而，大多數(shù)這些化合物，當(dāng)作為佐劑施用時，不適合用于該 目的，因為它們對免疫系統(tǒng)具有副作用(這與需要的免疫原性質(zhì)平行發(fā)生)。例如，許多這 樣的化合物被分類為變應(yīng)原性的，并且在某些情形中，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過需要的程度。因此，出于上述原因，這些化合物同樣地不適合作為佐劑來用于免疫刺激。因此，本發(fā)明的第一個目的是提供免疫刺激劑，其作用為佐劑并刺激先天免疫系 統(tǒng)，優(yōu)選地，如果與其它生物活性化合物組合施用，特別是如果與免疫調(diào)節(jié)化合物組合施 用，更優(yōu)選地與特異性刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的化合物，如抗原組合施用。在該背景下，已知還可以通過直接使用引發(fā)非特異性(即，先天)免疫應(yīng)答的核 酸，例如用細(xì)菌CpG-DNA序列(其不僅用作遺傳信息)來產(chǎn)生(非特異性)免疫刺激作 用。例如，已知DNA在非特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用。例如，已知細(xì)菌DNA作為 “危險”信號來警告免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞并促進(jìn)保護(hù)性的Thl極化T細(xì)胞免疫 應(yīng)答。免疫刺激作用似乎由未甲基化的CG (核酸)基序的存在導(dǎo)致，并且因此像這樣這樣 的CpG-DNA被提議作為免疫刺激劑(見例如US 5，663，153)。CpG-DNA直接導(dǎo)致先天免疫 系統(tǒng)的成員的激活，產(chǎn)生了共刺激分子和促炎性細(xì)胞因子的上調(diào)。還可以通過DNA寡核苷 酸來實現(xiàn)DNA的免疫刺激性質(zhì)，所述DNA寡核苷酸通過硫代磷酸酯修飾而被穩(wěn)定(見例如 US 6，239，116)。所述免疫刺激DNA還可以與另外的免疫刺激化合物組合。例如，US專利 6，406，705公開這樣的免疫刺激組合物，其包含CpG寡脫氧核糖核苷酸和非核酸化合物的 協(xié)同組合以發(fā)揮對于先天免疫系統(tǒng)的刺激作用。然而，有一些觀點認(rèn)為使用DNA來刺激非特異性免疫應(yīng)答是不太有利的。DNA在 體內(nèi)僅僅相對緩慢地分解，從而當(dāng)使用免疫刺激(外源)DNA時，可能發(fā)生抗-DNA抗體 的形成，這已經(jīng)在鼠的動物模型中得到證實(Gilkeson等，J.Clin. Invest.(臨床研究雜 志)1995，95 :1398-1402)。因此，(外源)DNA在生物體中的持久性可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的過 度激活，這已知在鼠中會導(dǎo)致脾腫大(Montheith等，Anticancer Drug Res(抗癌藥物研 究)· 1997,12(5) :421-432)。此外，(外源)DNA可以與宿主基因組相互作用并且導(dǎo)致突變， 特別是通過整合到宿主基因組中來進(jìn)行。例如，將引入的(外源)DNA摻入完整的基因中可 以發(fā)生，其代表了可能阻礙或甚至完全消除內(nèi)源基因功能的突變。作為所述整合事件的結(jié) 果，可以摧毀對于細(xì)胞至關(guān)重要的酶系統(tǒng)。然而，還存在這樣的風(fēng)險，即這樣改變的細(xì)胞將 轉(zhuǎn)化為退化態(tài)。這樣的轉(zhuǎn)化可以發(fā)生，例如如果通過(外源)DNA的整合，改變了對于細(xì)胞 生長的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵的基因。因此，在迄今已知的方法中，當(dāng)使用(外源)DNA作為免疫刺激 劑時，不能排除形成癌癥的可能風(fēng)險。因此，通常使用特異性RNA分子作為激發(fā)先天免疫系統(tǒng)的(非特異性)應(yīng)答的 化合物是更加有利的。在這種背景下，作為免疫系統(tǒng)的部分的先天免疫系統(tǒng)在大多數(shù)生 物中是占優(yōu)勢的宿主防御系統(tǒng)，并且包括屏障如體液和化學(xué)屏障，例如炎癥，補(bǔ)體系統(tǒng)，和 細(xì)胞屏障。另外，先天免疫系統(tǒng)基于少量受體，即模式識別受體或病原體相關(guān)分子模式受 體(PAMP-受體)，如Toll樣受體(TLR)家族的成員(見例如Trinchieri和Sher, Nature reviews, Immunology (自然綜述，免疫學(xué))，卷7，2007年3月)。所述TLRs是識別細(xì)胞外環(huán)境 或內(nèi)體腔的配體的跨膜蛋白。在配體結(jié)合后，它們通過細(xì)胞質(zhì)銜接頭蛋白轉(zhuǎn)換信號，所述細(xì) 胞質(zhì)銜接頭蛋白導(dǎo)致宿主-防御反應(yīng)的引發(fā)，并伴隨著抗菌肽，促炎性趨化因子和細(xì)胞因 子，抗病毒細(xì)胞因子等的產(chǎn)生(見例如Meylan，E.，J. Tschopp，等(2006). "Intracellular pattern recognition receptors in the host response (在宿主反應(yīng)中的細(xì)胞內(nèi)模式識 別受體).” Nature (自然)442 (7098) 39-44)。到目前為止，已經(jīng)在人中鑒定了 Toll-樣受體(TLRs)的至少10個成員并且在小鼠中鑒定了 13個成員，其部分地關(guān)于它們的作用模式而被鑒定。在人中，那些Toll樣受 體(TLRs)包括TLR1-TLR2 (已知配體三?；?，TLR1-TLR6 (已知配體二?；?， TLR2(已知配體肽聚糖)，TLR3(已知配體dsRNA)，TLR4(已知配體革蘭氏陰性細(xì)菌的 LPS(脂多糖)))，TLR5(已知配體細(xì)菌鞭毛蛋白)，TLR7/8(已知配體咪唑并喹啉，鳥苷 (鳥嘌呤)類似物和ssRNA)，TLR9(已知配體細(xì)菌，病毒和原生動物的CpG DNA,以及瘧原 蟲色素(malaria pigment hemozoin)(血紅蛋白消化的產(chǎn)物)和TLRlO。在識別微生物病 原體后，這些TLRs典型地引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，其導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子(例如TNF-α， IL-6，IL-I-β和IL-12)，I型干擾素(IFN-β和多種IFN-α )和趨化因子的誘導(dǎo)(Kawai， Τ.和 S. Akira(2006). “ TLR signalling(TLR信號傳導(dǎo))· “ Cell Death Differ (細(xì)胞、死 亡與分化)13 (5) :816-25)。在該背景下，RNAs出于幾種原因是有利的。例如，如目前已知和上述的，SSRNA能 夠結(jié)合于TLR-7/-8受體并且dsRNA能夠結(jié)合于TLR受體由此揮發(fā)免疫刺激作用。此外，作 為免疫刺激劑的RNA典型地具有明顯比DNA更短的體內(nèi)半衰期，由此避免了 DNA的上述缺 陷。然而，已知作為免疫刺激劑的那些特異性RNA分子在本領(lǐng)域中的應(yīng)用也具有一些局限 性。例如，在本領(lǐng)域中迄今公開的特異性RNA序列僅顯示有限的體內(nèi)免疫刺激能力。這可 能需要增加量的RNA用于免疫刺激，其不管由于待施用的RNA的增加的量造成的增加的費 用，包括前文通常所述的常見的不需要的副作用的風(fēng)險，例如在施用部位的刺激和炎癥，即 使對于有限的時間范圍內(nèi)可能是這樣的。此外。當(dāng)施用大量的免疫刺激劑時，不能排除毒 性副作用。另外的限制是通過已知的免疫刺激RNA分子對I型干擾素(例如IFN α和IFN β ) 的較低誘導(dǎo)，所述免疫刺激RNA分子是淋巴細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的抗病毒和 抗增殖活性以及細(xì)胞溶解活性的重要誘導(dǎo)物。已知的免疫刺激dsRNA分子例如是聚A:U和聚I:C。然而，這些免疫刺激dsRNA 分子的不利之處在于它們未明確的長度，其可能導(dǎo)致不可預(yù)期的分子結(jié)構(gòu)并由此導(dǎo)致聚集 物。所述聚集物還可能導(dǎo)致不理想的副作用如血管的阻塞或在注射位點的過度免疫刺激。 另外，所述不可預(yù)期的分子結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了在日常實驗室和生產(chǎn)程序上的問題，因為由于可 變的產(chǎn)物參數(shù)，可能不能進(jìn)行足夠的質(zhì)量控制。在此，優(yōu)選地將顯示限定的長度和結(jié)構(gòu)并且 適合作為佐劑的限定的核酸分子用于藥物應(yīng)用。盡管到目前為止用RNA取得了成功，仍舊存在對于可通過它們本身產(chǎn)生患者的先 天免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答的改進(jìn)的免疫刺激劑的持續(xù)需要以及相當(dāng)?shù)呐d趣。因此，本發(fā)明的 第二個目的是提供通過激活患者的先天免疫系統(tǒng)來產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答的免疫刺激劑。本發(fā)明的兩個目的都通過提供下面通式(I)的核酸分子而得以解決。這些創(chuàng)造性 的核酸分子激活先天免疫系統(tǒng)，因此激發(fā)非特異性免疫應(yīng)答。作為佐劑(例如，作為疫苗的 成分)，它們可以另外支持特異性激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的第二化合物的免疫刺激活性。本發(fā)明提供式(I)的核酸(分子)(NuG1XmGnNv)a,其中G是鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)或鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的類 似物，優(yōu)選地鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；
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X 是鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷 (胞嘧啶)，或這些核苷酸(核苷)的類似物，優(yōu)選地尿苷(尿嘧啶)或其類似物；N是具有長度為約4-50，優(yōu)選地約4-40，更優(yōu)選地約4-30或約4-20個核酸的核 酸序列，每個N獨立地選自鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧 啶)，胞苷(胞嘧啶)或這些核苷酸(核苷)的類似物；a是1-20，優(yōu)選地1_15，最優(yōu)選地1_10的整數(shù)；1 是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，G是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當(dāng)1 > 1時，這些核苷酸(核苷)的至少50%是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；m是整數(shù)并且至少是3 ；其中當(dāng)m = 3時，X是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，并且當(dāng)m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的類似物；η是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時，G是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當(dāng)η > 1時，這些核苷酸(核苷)的至少50%是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；u, ν可以彼此獨立地是0-50的整數(shù)，優(yōu)選地，其中當(dāng)u = 0時，ν彡1，或當(dāng) ν = 0 時，u 彡 1 ；其中根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子具有至少50個核苷酸的長度，優(yōu)選地至少 100個核苷酸的長度，更優(yōu)選地至少150個核苷酸的長度，甚至更優(yōu)選地至少200個核苷酸 的長度和最優(yōu)選地至少250個核苷酸的長度。根據(jù)本發(fā)明的式(I)的分子(NuG1XmGnNv)a典型地是核酸，其可以任何DNA或RNA的 形式存在，所述DNA或RNA優(yōu)選地，但是不限于，是環(huán)狀或線性DNA或RNA，單鏈或雙鏈DNA 或RNA (由于兩條單鏈DNA或RNA的非共價締合，其也可以被視為一條DNA或RNA)或部分 雙鏈DNA或RNA(其典型地由更長和至少一個更短的單鏈DNA或RNA分子或由至少兩個長 度大約相同的單鏈DNA或RNA-分子形成，其中一個或多個單鏈DNA或RNA分子部分與一個 或多個其它單鏈DNA或RNA分子互補(bǔ)，并因此在該區(qū)域中形成雙鏈RNA)，例如(部分地)單 鏈DNA或RNA，其與(部分)雙鏈DNA或RNA的區(qū)域混合。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的式(I)的 核酸分子可以以單鏈或雙鏈DNA或RNA的形式，更優(yōu)選地部分雙鏈DNA或RNA的形式存在。 還優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子以單鏈核酸和雙鏈DNA或RNA的混合物的形 式存在。如果根據(jù)本發(fā)明的式(I)的本發(fā)明的核酸(NuG1XmGnNv)a是部分雙鏈核酸分子，這 是特別有利的，因為所述根據(jù)式(I)(或如下文定義的式(Ia)，(II) (IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb))的(部分雙鏈)本發(fā)明核酸分子可以通過定向單鏈RNA的PAMP-(病原體相關(guān) 分子模式)受體(TLR-7和TLR-8)，以及雙鏈RNA的PAMP-受體(TLR-3，RIG-I和MDA-5)而 正向刺激待治療的患者中的先天免疫應(yīng)答。受體TLR-3，TLR-7和TLR-8位于內(nèi)體中并且由 被內(nèi)體攝取的RNA激活。與此相反，RIG-I和MDA-5是細(xì)胞質(zhì)受體，其由RNA激活，被直接攝 取到細(xì)胞質(zhì)中或已經(jīng)從內(nèi)體中釋放(內(nèi)體的釋放或內(nèi)體的逃逸)。因此式(I)的任何部分 雙鏈的本發(fā)明核酸(NuG1XmGnNv)a (或根據(jù)式(I)(和如下文定義的(Ia)，(II) (IIa)，(lib),(IIIa)和(IIIb)的(部分雙鏈)的本發(fā)明的核酸分子)能夠激活免疫刺激的不同信號級 聯(lián)并因此導(dǎo)致先天免疫應(yīng)答或顯著增強(qiáng)這樣的應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的式⑴的結(jié)構(gòu)(NuG1XmGnNv)a包括元件6#扎作為核心結(jié)構(gòu)，以及另外 的邊界元件Nu和/或Nv，其中完整的元件NuG1XmGnNv可以重復(fù)出現(xiàn)，即至少一次，如通過整 數(shù)a所確定的。在該背景下，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的式(I)的分子，即具有如 上定義的結(jié)構(gòu)(NuG1XmGnNv)a，導(dǎo)致當(dāng)與施用像這樣的核心結(jié)構(gòu)G1XmGn比較時患者中增加的先 天免疫應(yīng)答，其特別由IFNa釋放的增加而指示。此外，當(dāng)其邊界是如在式(I)中定義的重 復(fù)元件Nu和/或Nv時，包含上述核心結(jié)構(gòu)G1XmGn的分子可以在細(xì)菌生物中以明顯更好的產(chǎn) 率擴(kuò)增。當(dāng)通過使用體外轉(zhuǎn)錄方法來取代本領(lǐng)域已知的固相合成方法(其典型地受限于核 酸的具體大小)而制備根據(jù)如上定義的式(I)的結(jié)構(gòu)(NuG1XmGnNv)a的分子時，這種分子設(shè)計 是特別有利的。根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核心結(jié)構(gòu)G1XmGn在下文中更精確地定義在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中的G是核苷酸或脫氧核苷酸或包括核苷，其 中所述核苷酸(核苷)是鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)或其類似物，更優(yōu)選地鳥苷(鳥 嘌呤)或其類似物。在該情形中，鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸(核苷)類似 物如天然存在的核苷酸(核苷)鳥苷(鳥嘌呤)和尿苷(尿嘧啶)的非天然存在的變體定 義。因此，鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)類似物典型地是具有非天然存在的官能團(tuán)或 成分的化學(xué)衍生的核苷酸(核苷)，所述官能團(tuán)或成分被優(yōu)選地加入，被修飾，或從天然存 在的鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸中去除，或其取代天然存在的鳥苷(鳥嘌呤) 或尿苷(尿嘧啶)核苷酸的天然存在的官能團(tuán)或成分。因此，天然存在的鳥苷(鳥嘌呤)或 尿苷(尿嘧啶)核苷酸的每個官能團(tuán)或成分可以被修飾或從其中去除，即堿基成分，糖(核 糖)成分，任何天然存在的功能側(cè)基和/或形成寡核苷酸主鏈的磷酸酯成分。磷酸酯部分 可以由例如氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，肽核苷酸，甲基膦酸酯等取代，然而，在本發(fā)明的背景 中，天然存在的磷酸二酯主鏈仍舊是優(yōu)選的。另外，糖(核糖)成分選自脫氧核糖，特別地 所述核酸是如上定義的RNA，其中糖(核糖)成分選自脫氧核糖。因此，鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的類似物，包括但不限于，已經(jīng)通過乙酰 化，甲基化，羥基化等化學(xué)改變的任何天然存在或非天然存在的鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿 嘧啶)，包括例如1-甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，2-甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，2，2- 二甲基-鳥苷 (鳥嘌呤)，7-甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，二氫-尿苷(尿嘧啶)，4-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-羧 甲基氨基甲基-2-硫代_尿苷(尿嘧啶)，5-(羧基-羥甲基)-尿苷(尿嘧啶)，5-氟-尿 苷(尿嘧啶)，5-溴-尿苷(尿嘧啶)，5-羧甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5-甲基-2-硫 代-尿苷(尿嘧啶)，N-尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸甲酯，5-甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧 啶)，5_甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5'-甲氧基羰基甲基-尿苷(尿嘧 啶)，5_甲氧基-尿苷(尿嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸甲酯，尿苷(尿嘧啶)-5_氧 乙酸(ν)。所述類似物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如從美國專利4，373，071，US 4，401，796，US4, 415，732，US 4，458，066，US 4，500，707，US 4，668，777，US 4，973，679， US5, 047, 524,US 5，132，418，US 5，153，319，US 5，262，530 和 5，700，642 中已知，將其全部 公開內(nèi)容通過引用結(jié)合在本文中。在如上述的類似物的情形中，根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選那些 類似物，其增加根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子的免疫原性和/或不干擾已經(jīng)被引入的另
14外的修飾。至少一種鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)或其類似物可以存在于核心結(jié)構(gòu)元 件G1和/或Gn中，任選地，核心結(jié)構(gòu)元件G1和/或Gn中的核苷酸的至少10 %，20 %，30 %， 40%,50%,60%,70%,80% 90%或甚至100%是天然存在的鳥苷(鳥嘌呤)，天然存在的 尿苷(尿嘧啶)，和/或其類似物，和/或顯示如本文定義的其類似物的性質(zhì)。優(yōu)選地，所 述核心結(jié)構(gòu)元件G1和/或Gn包含天然存在的鳥苷(鳥嘌呤)和/或天然存在的尿苷(尿 嘧啶)的至少一種類似物。最優(yōu)選地，這些核心結(jié)構(gòu)元件G1和/或6 的所有的核苷酸(核 苷)是類似物，其可以-最優(yōu)選地-是關(guān)于相同類型的核苷酸(例如，將所有的鳥苷(鳥嘌 呤)核苷酸提供為ι-甲基-鳥苷(鳥嘌呤))的相同類似物，或它們可以是獨特的(例如 至少兩個不同的鳥嘌呤類似物取代天然存在的鳥嘌呤核苷酸)。在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中的核心結(jié)構(gòu)元件6(61和/或6 )的核苷酸 (核苷)的數(shù)目由1和η確定。1和η，彼此獨立地分別是整數(shù)1-100，1-90，1-80,1-70,1-60, 優(yōu)選地1-50，更優(yōu)選地1-40，和甚至更優(yōu)選地1-30，其中該范圍的下限可以是1，但是備選 地也可以是 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26， 27，28，29，30，或甚至更多。優(yōu)選地，對于每個整數(shù)，當(dāng)1和/或η = 1時，G是鳥苷(鳥嘌 呤)或其類似物，并且當(dāng)1或η > 1時，核心結(jié)構(gòu)元件G (G1和/或Gn)的至少50%，更優(yōu)選 地至少50%，60%，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸(核苷)是鳥苷(鳥嘌呤)或 其類似物。例如，但不限于，當(dāng)1或η = 4時，&和/或6 可以是例如，⑶⑶，GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG 或 GGGG，等.；當(dāng) 1 或 η = 5 時，G1 禾口 / 或 Gn 可以是例 如，GG⑶U，GGUGU，⑶GGU，UGGGU，UG⑶G，UGUGG，UUGGG，⑶⑶G，GGGGU，GG⑶G，GGUGG，⑶GGG， UGGGG，或GGGGG，等；等。在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中，直接鄰近于Xm的核心結(jié)構(gòu) 元件G1和/或Gn的核苷酸(核苷)優(yōu)選地不是尿苷(尿嘧啶)或其類似物。更優(yōu)選地，在 根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中，直接鄰近于XmW核心結(jié)構(gòu)元件&和/或6 的核苷酸 (核苷)是至少一個(鳥嘌呤)或其類似物，更優(yōu)選地至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13， 14，15，16，17，18，19或甚至20或更多鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物的片段。另外，在根據(jù)本 發(fā)明的式(I)的核酸分子中的直接鄰近于N，例如Nu，和/或Nv(或如下文定義的Nwl或Nw2) 的核心結(jié)構(gòu)元件G1和/或Gn的核苷酸優(yōu)選地不是尿苷(尿嘧啶)或其類似物。更優(yōu)選地， 在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中直接鄰近于N，例如Nu，和/或Nv(或如下文定義的Nwl 或Nw2)的核心結(jié)構(gòu)元件G1和/或Gn的核苷酸優(yōu)選地是至少一個鳥苷(鳥嘌呤)或其類似 物，更優(yōu)選地至少 2，3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或甚至 20 個或更多 個鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物的片段。在本申請中，術(shù)語“同一性”意為序列相對于參照序列進(jìn)行比較，并且百分比同一 性通過比較它們而確定。例如為了確定兩個核酸序列的百分比同一性，所述序列可以首先 相對于彼此排列(排比)從而可以進(jìn)行序列的隨后的比較。為此目的，例如，可以將缺口引 入第一核酸序列的序列中并且所述核苷酸可以與第二核酸序列的相應(yīng)位置比較。當(dāng)在第一 核酸序列中的位置被與第二序列中的位置相同的核苷酸占據(jù)時，那么兩個序列在該位置是 相同的。兩個序列之間的百分比同一性是相同位置的數(shù)目除以序列的函數(shù)。如果，例如，關(guān) 于與具有限定長度的參照核酸比較的特定核酸而設(shè)定具體的序列同一性，那么相對于參照 核酸相對地指出該百分比同一性。因此，例如從與具有100個核苷酸的長度的參照核酸序 列具有50%序列同一性的核酸序列起始，核酸序列可以代表具有50個核苷酸的長度的核
15酸序列，其與具有長度為50個核苷酸的參照核酸序列的部分完全相同。然而，其還可以代 表具有50%同一性的具有長度為100個核苷酸的核酸序列，即在該情形中，在其完整長度 上與參照核酸序列50%相同的核酸。備選地，該核酸序列可以是具有長度為200核苷酸的 核酸序列，其在具有100個核苷酸長度的核酸序列部分中，與具有長度為100個核苷酸的參 照核酸序列完全相同。其它核酸序列自然同等滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。確定兩個序列的百分比同一性可以通過數(shù)學(xué)算法來進(jìn)行?？梢杂糜诒容^兩個序列 的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選但非限制性的實例是Karlin等(1993)，PNAS USA, 90 :5873_5877的算 法。將所述算法整合到NBLAST程序中，使用所述程序可鑒定與本發(fā)明的序列具有需要的同 一性的序列。為了獲得上述缺口排比(gapped alignment)，可以使用“缺口 BLAST”程序， 如在 Altschul 等(1997)，Nucleics Acids Res (核酸研究)，25 :3389_3402 中所述。當(dāng)使 用BLAST和缺口 BLAST程序時，可以使用特定程序(例如NBLAST)的默認(rèn)值參數(shù)。還可以使 用版本 9 的來自〃 Genetic Computing Group (基因計算組)〃的 GAP(global alignment progranK缺口排比程序))進(jìn)一步排比序列，其中使用默認(rèn)值(BL0SUM62)矩陣(-4-+11)， 其具有-12的缺口開放罰分(對于缺口的第一個0)和-4的缺口延伸罰分(對于缺口中的 每個另外的連續(xù)的0)。在排比后，通過將對應(yīng)的數(shù)目表示為要求保護(hù)的序列的核酸的百分 比來計算百分比同一性。還可以使用適合的程序，來將用于確定兩個核酸序列的百分比同 一性的所述方法相應(yīng)地應(yīng)用于氨基酸序列。同樣優(yōu)選地，對于式(I)，當(dāng)1或n> 1時，核心結(jié)構(gòu)元件61和/或6 的至少60%， 70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸(核苷)是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，如上定義。 在核心結(jié)構(gòu)元件61和/或6 中的剩余到100%的核苷酸(核苷)(當(dāng)鳥苷(鳥嘌呤)組成 少于100%的這些核苷酸(核苷)時)，可以是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，如前文定義。在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中的X，特別是Xm，也是核心結(jié)構(gòu)元件并且是核 苷酸或脫氧核苷酸或包括核苷，其中所述核苷酸(核苷)典型地選自鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷 (尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或其類似物，優(yōu)選地尿苷(尿 嘧啶)或其類似物。在該情形中，核苷酸(核苷)類似物如天然存在的核苷酸(核苷)的非 天然存在的變體定義。因此，類似物是用非天然存在的官能團(tuán)化學(xué)衍生的核苷酸(核苷)， 其優(yōu)選地加入或從天然存在的核苷酸(核苷)中去除或其取代核苷酸(核苷)的天然存在 的官能團(tuán)。因此，可以對天然存在的核苷酸的每種成分進(jìn)行修飾，即堿基成分，糖(核糖或 脫氧核糖)成分和/或形成寡核苷酸主鏈的磷酸酯成分。磷酸酯成分可以被例如，氨基磷 酸酯，硫代磷酸酯，肽核苷酸，甲基膦酸酯等取代，然而其中天然存在的磷酸二酯主鏈仍舊 是優(yōu)選的。如果本發(fā)明的核酸包含至少一種類似物，優(yōu)選地至少10%，更優(yōu)選地至少20%， 更優(yōu)選地至少30 %，更優(yōu)選地至少50 %，更優(yōu)選地至少70 %和甚至更優(yōu)選地至少90 %的所 有“X”核苷酸可以顯示如本文定義的類似物的性質(zhì)。取代在核心結(jié)構(gòu)元件"Xm”中的特定核 苷酸類型的類似物可以是相同的，例如在核心結(jié)構(gòu)元件“Xm”中存在的所有胞苷(胞嘧啶) 核苷酸(核苷)由特定胞苷(胞嘧啶)類似物(例如2-硫代-胞苷(胞嘧啶))形成，或 它們對于特定核苷酸(核苷)可以是獨特的，例如至少兩個獨特的胞苷(胞嘧啶)類似物 被包含在核心結(jié)構(gòu)元件"Xm”中。鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧 啶)的類似物包括，但不限于，任何天然存在或非天然存在的鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)或胞苷(胞嘧啶)，其已經(jīng)通過化學(xué)方式，例如通過 乙?；?，甲基化，羥基化等改變，包括1-甲基_腺苷(腺嘌呤)，2-甲基-腺苷(腺嘌呤)， 2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺苷(腺嘌呤)，N6-甲基-腺苷(腺嘌呤)，N6-異戊烯基-腺 苷(腺嘌呤)，2-硫代-胞苷(胞嘧啶)，3_甲基-胞苷(胞嘧啶)，4_乙酰基-胞苷(胞 嘧啶)，2，6- 二甲基氨基嘌呤，1-甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，2-甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，2，2- 二 甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，7-甲基-鳥苷(鳥嘌呤)，肌苷，1-甲基-肌苷，二氫-尿苷(尿嘧 啶)，4-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-(羧基羥 甲基)_尿苷(尿嘧啶)，5_氟-尿苷(尿嘧啶)，5_溴-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲 基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，N-尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸甲酯， 5-甲基氨基甲基_尿苷(尿嘧啶)，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5 ‘-甲 氧基羰基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲氧基-尿苷(尿嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸甲 酯，尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸(v) ,queosine, β _D_甘露糖基-queosine，wybutoxosine，和 肌苷。所述類似物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如從US 4, 373, 071,US 4，401，796， US 4，415，732，US 4，458，066，US 4，500，707，US 4，668，777，US4, 973，679，US 5,047,524， US 5，132，418，US 5，153，319，US 5，262，530 和 US5, 700，642 中已知。在如上述的類似物 的情形中，根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選那些核苷酸(核苷)類似物，其增加根據(jù)本發(fā)明的式(I)的 核酸分子的免疫原性和/或不干擾已經(jīng)被引入的另外的修飾。在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中的核心結(jié)構(gòu)元件X的數(shù)目由m確定。m是整 數(shù)并且典型地是至少 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，20-30，30-40， 40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200，或甚至更多，其中當(dāng) m = 3 時，X是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，并且當(dāng)m > 3時，至少3或更多個直接連續(xù)的尿苷 (尿嘧啶)或其類似物在上述式(I)的元件X中存在。這樣的至少3個或更多個直接連續(xù) 的尿苷(尿嘧啶)的序列在本申請中被稱為“單調(diào)的尿苷(尿嘧啶)序列”。單調(diào)的尿苷 (尿嘧啶)序列典型地具有至少 3，4，5，6，7，8，9 或 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20, 20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200 個如上定義的 尿苷(尿嘧啶)或任選地尿苷(尿嘧啶)的類似物的長度。所述單調(diào)的尿苷(尿嘧啶)序 列在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子的核心結(jié)構(gòu)元件X中出現(xiàn)至少一次。因此，對于具有至 少3個或更多個尿苷(尿嘧啶)或其類似物的1，2，3，4，5或更多個單調(diào)的尿苷(尿嘧啶) 序列，這是可以發(fā)生的，所述單調(diào)的尿苷(尿嘧啶)序列可以在核心結(jié)構(gòu)元件X中被至少一 個，優(yōu)選地2，3，4，5或更多個鳥苷(鳥嘌呤)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞 嘧啶)或其類似物中斷。例如，當(dāng)m=3時，Xm是UUU。當(dāng)m = 4時，Xm可以是，例如，但沒 有任何限制，UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU，⑶UU或CUUU，等。當(dāng)η = 10時，Xm可以是，例 如，但沒有任何限制，UUUAAUUUUC, UUUU⑶UUUA，UUU⑶UU⑶U，UUGUUUU⑶U，UUUUUUUUUU，等。 鄰近根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子的G1或Gn的Xm的核苷酸優(yōu)選地包含尿苷(尿嘧啶) 或其類似物。當(dāng)m > 3時，典型地Xm的至少50 %，優(yōu)選地至少60 %，70 %，80 %，90 %或甚 至100%的核苷酸是如上定義的尿苷(尿嘧啶)或其類似物。Xm的剩余到100%的核苷酸 (其中在序列Xm中存在少于100%的尿苷(尿嘧啶))是如上定義的鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷 (尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或其類似物。上述本發(fā)明的根據(jù)式(I)的核酸包含邊界元件N。邊界元件N典型地是具有長度為約4-50，優(yōu)選地約4-40，更優(yōu)選地約4-30個核苷酸(核苷)，甚至更優(yōu)選地約4_20個核 苷酸(核苷)的核酸序列，其中這些范圍的下限備選地也可以是5，6，7，8，9，10，或更多。優(yōu) 選地，每個N的核苷酸(核苷)獨立地選自鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌 呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)和/或其類似物。換言之，在根據(jù)本發(fā)明的式(I) 的核酸分子中的邊界元件N可以是這樣的序列，其可以由本領(lǐng)域可知的任何(隨機(jī))序列 組成，每個N獨立地選自鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧 啶)，胞苷(胞嘧啶)和/或這些核苷酸的類似物，或選自這些核苷酸(核苷)的均聚物，在 每種情形中，假定所述序列具有約4-50，優(yōu)選地約4-40，更優(yōu)選地約4-30長度核苷酸(核 苷)和甚至更優(yōu)選地約4-30或4-20長度的根據(jù)上述的定義的核苷酸(核苷)。根據(jù)具體實施方案，N可以是在上述定義中的核酸序列，其中所述序列典型地在直 接相鄰的位置包含不超過2個相同的如上定義的核苷酸(核苷)，即，所述序列典型地不包 含超過兩個相同的選自腺苷(腺嘌呤)，胞苷(胞嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)和/或鳥苷(鳥嘌 呤)，和/或其類似物的核苷酸(核苷)的片段(即，“aa”，“CC”，“UU”，“gg”和/或其類似物 的片段)，更優(yōu)選地不包含這樣的片段，即在直接相鄰的位置不包含相同的如上定義的核苷 酸(核苷)。另外或備選地，N可以是在上述定義中的核酸序列，其中所述序列典型地包含優(yōu) 選地約0-50 %，5-45 %，或10-40 %，更優(yōu)選地約15-35 %，甚至更優(yōu)選地約20-30 %，和最優(yōu) 選地約25 %的腺苷(腺嘌呤)或其類似物的含量；優(yōu)選地約0-50 %，5-45 %，或10-40 %，更 優(yōu)選地約15-35%，甚至更優(yōu)選地約20-30%，和最優(yōu)選地約25%的尿苷(尿嘧啶)或其類 似物的含量；優(yōu)選地約0-50%，5-45%，或10-40%，更優(yōu)選地約15-35%，甚至更優(yōu)選地約 20-30 %，和最優(yōu)選地約25 %的胞苷(胞嘧啶)或其類似物含量；優(yōu)選地約0-50 %，5-45 %， 或10-40%，更優(yōu)選地約15-35%，甚至更優(yōu)選地約20-30%，和最優(yōu)選地約25%的鳥苷(鳥 嘌呤)或其類似物的含量。最優(yōu)選地，N可以是在上述定義中的核酸序列，其中所述序列典 型地包含含量各為約25%的腺苷(腺嘌呤)，鳥苷(鳥嘌呤)，胞苷(胞嘧啶)和尿苷(尿 啼唆)。所述 N 的序列的實例包括例如 agcu, ague, augc, acgu, gcua, gcau, gacu, guca, cuag, caug, cagu, cgau, uagc, uacg, ucga, ucag, agcugcua, gcaucaug, caguucga，·。在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中的邊界元件N的數(shù)目，S卩，其重復(fù)，由整數(shù)u 和/或ν確定。因此，在根據(jù)本發(fā)明的式(I)的核酸分子中的N可以作為(重復(fù))邊界元 件Nu和/或Nv存在，其中u和/或ν可以彼此獨立地選自0或1到100的整數(shù)，更優(yōu)選地 選自0或1-50的整數(shù)，甚至更優(yōu)選地選自0或1-40的整數(shù)，和最優(yōu)選地選自0或1-30的 整數(shù)，例如 0 或 1-5，10，20，25，或 30 ；選自 5-10，10-15，15-20，20-25 或 25-30。更優(yōu)選地， 在式⑴中可以存在至少一個(重復(fù)的)邊界元件凡和/或隊，即11或￥不是0，更優(yōu)選地 存在兩個(重復(fù)的)邊界元件化和/或隊，甚至更優(yōu)選地在上述定義中。另外，核心結(jié)構(gòu)元件和邊界元件與元件NuG1XmGnNv的組合可以作為根據(jù)如上定義 的本發(fā)明的式⑴的分子的重復(fù)元件，(NuG1XmGnNv)a存在，其中根據(jù)式⑴的組合元件， (NuG1XmGnNv) a的重復(fù)的數(shù)目由整數(shù)a確定。優(yōu)選地，a是來自約1_100，1-50,1-20的整數(shù)，更 優(yōu)選地是約1-15的整數(shù)，最優(yōu)選地是約1-10的整數(shù)。在該情形中，重復(fù)元件NuG1XmGnNv可 以是彼此相同或彼此不同的。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，如上定義的本發(fā)明的式(I)的核酸分子(NuG1XmGnNv)a 包括核心結(jié)構(gòu)G1XmGn，優(yōu)選地選自下列SEQ ID NOs :1_80序列的至少一個
-GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 1)；-GGGG⑶UUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 2)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 3)；-⑶⑶⑶⑶⑶⑶UUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU(SEQID NO 4)；-GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUG(iUUG(;UUG(;UU(SEQ ID NO 5)；-GGGGGGGG⑶UUGGGGGGGG(SEQ ID NO 6)；-GGGGGGGGUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 7)；-GGGGGG⑶UUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 8)；-GGGGGG⑶UUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 9)；-GGGGGGUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 10)；-GGGGGGUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 11)；-GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 12)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 13)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 14)；-GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 15)；-GGGGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 16)；-GGUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 17)；-⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO 18)；-GGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO 19)；-GGGGGGGG⑶UUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO 20)；-GGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 21)；-GGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 22)；-GGGGGG⑶UUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 23)；-GGGGGG⑶UUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 24)；-GGGGGG⑶UUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 25)；-GGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 26)；-GGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 27)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 28)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 29)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 30)；-GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 31)；-GGGGGGGGGG⑶UUGGGGGGGGGG(SEQ ID NO 32)；-GGGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGGG(SEQ ID NO 33)；-GGGGGGGG⑶UUUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO 34)；-GGGGGGGG⑶UUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 35)；-GGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 36)；-GGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 37)；-GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 38)；-GGGGGG⑶UUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 39)；
19
-GGGGGG⑶UUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 40)
-GGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 41)
-GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 42)
-GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 43)
-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 44)
-⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO 45)；
-GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 46)；
-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ IDNO 47)；
-GGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGSEQID NO 48)；
-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 49)；
-GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 50)；
-GGGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 51)；
-GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 52)；
-GGGGGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 53)；
-GGUUUGG(SEQ ID NO 54)；
-GGUUUUGG(SEQ ID NO 55)；
-GGUUUUUGG(SEQ ID NO 56)；
-GGUUUUUUGG(SEQ ID NO 57)；
-GGUUUUUUUGG(SEQ ID NO 58)；
-GGUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 59)；
-GGUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 60)；
-GGUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 61)；
-GGUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 62)；
-GGUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 63)；
-GGUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 64)；
-GGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 65)；
-GGUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 66)；
-GG⑶UUGGG(SEQ ID NO 67)；
-GG⑶UUUGGG(SEQ ID NO 68)；
-GG⑶UUUUGGG(SEQ ID NO 69)；
-GG⑶UUUUUGGG(SEQ ID NO 70)；
-GG⑶UUUUUUGGG(SEQ ID NO 71)；
-GG⑶UUUUUUUGGG(SEQ ID NO 72)；
-GG⑶UUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 73)；
-GG⑶UUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 74)；
-GG⑶UUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 75)；
-GG⑶UUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 76)；
-GG⑶UUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 77)；
-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUGG⑶UUUUUUUUUUUUUUGG⑶UUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO
2078)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 79)；-GG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGGG (SEQ ID NO 80)；根據(jù)另一個特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明待解決的問題可以通過根據(jù)式(Ia)的 備選的核酸分子而解決，(NuC1XmCnNv)a其中C是胞苷(胞嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)或胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的類 似物，優(yōu)選地胞苷(胞嘧啶)或其類似物；X 是鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷 (胞嘧啶)或上述核苷酸(核苷)的類似物，優(yōu)選地尿苷(尿嘧啶)或其類似物；N 分別是這樣的核酸序列，其彼此獨立地具有約4-50，優(yōu)選地約4-40，更優(yōu)選地 約4-30或4-20個核酸的長度，每個N獨立地選自鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷 (腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或這些核苷酸(核苷)的類似物；a是1-20的整數(shù)，優(yōu)選地1_15的整數(shù)，最優(yōu)選地1_10的整數(shù)；1 是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，C是胞苷(胞嘧啶)或其類似物，當(dāng)1 > 1時，這些核苷酸(核苷)的至少50%是胞苷(胞嘧啶)或其類似物；m是整數(shù)并且至少是3;其中，當(dāng)m = 3時，X是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，當(dāng)m > 3，存在至少3個連續(xù)尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的類似物；η是1-40的整數(shù)，其中，當(dāng)η = 1時，C是胞苷(胞嘧啶)或其類似物，當(dāng)η > 1時，這些核苷酸(核苷)的至少50%是胞苷(胞嘧啶)或其類似物。u, ν可以彼此獨立地是0-50的整數(shù)，優(yōu)選地其中當(dāng)u = 0，ν彡1，或當(dāng) ν = 0，u 彡 1 時；其中根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子具有至少50個核苷酸的長度，優(yōu)選地至少 100個核苷酸的長度，更優(yōu)選地至少150個核苷酸的長度，甚至更優(yōu)選地至少200個核苷酸 的長度和最優(yōu)選地至少250個核苷酸的長度。對于式(Ia)，任何上述關(guān)于元件N(即Nu和Nv)和X (Xm)，特別是關(guān)于如上定義的 核心結(jié)構(gòu)，以及關(guān)于整數(shù)a，l，m，n，U*V所給出的定義類似地相應(yīng)應(yīng)用于式(Ia)的元件， 其中在式(Ia)中，核心結(jié)構(gòu)由C1XmCn所限定。邊界元件Nu和Nv的定義與上述關(guān)于Nu和Nv 的定義相同。更具體地，在根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中的C是核苷酸或脫氧核苷酸或包 括核苷，其中所述核苷酸(核苷)典型地是胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)或其類似物。 在該情形中，胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸類似物如天然存在的胞苷(胞嘧啶) 或尿苷(尿嘧啶)核苷酸的非天然存在的變體所定義。因此，胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿 嘧啶)類似物是用非天然存在的官能團(tuán)化學(xué)衍生的核苷酸(核苷)，所述官能團(tuán)被優(yōu)選地加
21入，或從天然存在的胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸(核苷)中去除或其取代胞 苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸(核苷)的天然存在的官能團(tuán)。因此，天然存在的 胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸的每種成分可以被修飾，即堿基成分，糖(核糖成 分)和/或形成寡核苷酸主鏈的磷酸酯成分。磷酸酯部分可以被例如氨基磷酸酯，硫代磷 酸酯，肽核苷酸，甲基膦酸酯等取代，其中仍舊優(yōu)選天然存在的磷酸二酯主鏈。因此，胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的類似物包括，但不限于，任何天然存在或 非天然存在的胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)，其已經(jīng)通過化學(xué)方式，例如通過乙?；?，甲 基化，羥基化等改變，包括，例如，2-硫代-胞苷(胞嘧啶)，3-甲基-胞苷(胞嘧啶)，4-乙 酰基-胞苷(胞嘧啶)，二氫-尿苷(尿嘧啶)，4_硫代-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲 基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-(羧基-羥甲基)-尿苷(尿嘧啶)，5_氟-尿苷(尿嘧啶)， 5_溴-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲基-2-硫代-尿苷(尿 嘧啶)，N-尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯，5-甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5-甲氧基氨 基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5'-甲氧基羰基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲氧基-尿 苷(尿嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸甲酯，尿苷(尿嘧啶)-5_氧乙酸(ν)。所述類似 物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如從US 4，373，071，US 4，401，796，US 4，415，732， US 4，458，066，US 4，500，707，US 4，668，777，US 4，973，679，US 5，047，524，US5, 132，418， US 5, 153, 319,US 5，262，530和US 5，700，642中了解，將其全部公開內(nèi)容通過引用結(jié)合在 本文中。在如上述的核苷酸(核苷)類似物的情形中，根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選那些類似物，其 增加根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子的免疫原性和/或不干擾已經(jīng)被引入的另外的修飾。 至少一種胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)或其類似物可以存在于核心結(jié)構(gòu)元件C1和/ 或(；中，任選地，核心結(jié)構(gòu)元件C1和/或(；中的核苷酸(核苷)的至少10%，20%，30%， 40%,50%,60%,70%,80%90%或甚至100%是天然存在的胞苷(胞嘧啶)，天然存在的尿 苷(尿嘧啶)，和/或其類似物，和/或顯示如本文定義的其類似物的性質(zhì)。優(yōu)選地，所述核 心結(jié)構(gòu)元件&和/或(；包含天然存在的胞苷(胞嘧啶)和/或天然存在的尿苷(尿嘧啶) 的至少一種類似物。最優(yōu)選地，這些核心結(jié)構(gòu)元件C1和/或Cn的所有的核苷酸(核苷)是 類似物，其可以-最優(yōu)選地-是關(guān)于相同類型的核苷酸(核苷)(例如，將所有的胞苷(胞 嘧啶)核苷酸提供為2-硫代-胞苷(胞嘧啶))的相同類似物，或它們可以是獨特的(例 如至少兩個不同的胞苷(胞嘧啶)類似物取代天然存在的胞苷(胞嘧啶)核苷酸)。在根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中的核心結(jié)構(gòu)元件CK1和/或Cn)的核苷酸 (核苷)的數(shù)目由1和η確定。1和η，彼此獨立地分別是1-90，1-80,1-70,1-60,優(yōu)選地 1-50，更優(yōu)選地1-40，和甚至更優(yōu)選地1-30的整數(shù)，其中該范圍的下限可以是1，但是備選 地也可以是 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26， 27，28，29，30，或甚至更多。優(yōu)選地，對于每個整數(shù)，當(dāng)1和/或η = 1時，C是胞苷(胞嘧 啶)或其類似物，并且當(dāng)1或η > 1時，核心結(jié)構(gòu)元件CK1和/或Cn)的至少50%，更優(yōu)選 地至少50%，60%，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸(核苷)是胞苷(胞嘧啶)或 其類似物。例如，但不限于，當(dāng)1或η = 4時，C1和/或Cn可以是例如，⑶⑶，CCUU, UCUC， UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC 或 CCCC，等.；當(dāng) 1 或 η = 5 時，C1 禾口 / 或 Cn 可以是例 如，CCCUU，CCUCU，CUCCU，UCCCU，UCCUC，UCUCC，UUCCC，CUCUC，CCCCU，CCCUC，CCUCC，CUCCC， UCCCC， CCCCC，等；等。在根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中，直接鄰近于Xm的核心結(jié)構(gòu)元件C1和/或Cn的核苷酸(核苷)優(yōu)選地不是尿苷(尿嘧啶)或其類似物。更優(yōu)選地，在 根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中，直接鄰近于XmW核心結(jié)構(gòu)元件C1*/或Cn的核苷酸 (核苷)是至少一個胞苷(胞嘧啶)或其類似物，更優(yōu)選地至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19或甚至20或更多胞苷(胞嘧啶)或其類似物的片段。另外，在 根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中的直接鄰近于N，例如Nu，和/或隊(或如下文定義的 Nwl或Nw2)的核心結(jié)構(gòu)元件C1和/或Cn的核苷酸(核苷)優(yōu)選地不是尿苷(尿嘧啶)或 其類似物。更優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中直接鄰近于N，例如Nu，和/或 Nv(或如下文定義的Nwl或Nw2)的核心結(jié)構(gòu)元件C1和/或Cn的核苷酸(核苷)是至少一個 胞苷(胞嘧啶)或其類似物，更優(yōu)選地至少2，3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19或甚至20個或更多個胞苷(胞嘧啶)或其類似物的片段。同樣優(yōu)選地，對于式(Ia)， 當(dāng)1或n> 1時，核心結(jié)構(gòu)元件C1和/或(；的至少60%，70%，80%，90%或甚至100%的 核苷酸是胞苷(胞嘧啶)或其類似物，如上定義。在核心結(jié)構(gòu)元件(^和/或(；中的剩余到 100%的核苷酸(核苷)(當(dāng)胞苷(胞嘧啶)組成少于100%的這些核苷酸(核苷)時)，可 以是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，如前文定義。X，特別是Xm，作為在本發(fā)明的根據(jù)式(Ia)的核酸分子中的另外的核心結(jié)構(gòu)元件， 優(yōu)選地如關(guān)于式(I)所定義。在根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子中的核心結(jié)構(gòu)元件X的數(shù) 目由m確定。m是整數(shù)并且典型地是至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18， 19，20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200，或甚至 更多，其中當(dāng)m = 3時，X是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，并且當(dāng)m > 3時，至少3或更多個 直接連續(xù)的尿苷(尿嘧啶)或其類似物在上述式(Ia)的元件X中存在。這樣的至少3個或 更多個直接連續(xù)的尿苷(尿嘧啶)的序列在本申請中被稱為“單調(diào)的尿苷(尿嘧啶)序列”。 單調(diào)的尿苷(尿嘧啶)序列典型地具有至少3,4, 5,6, 7，8，9或10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19，20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200 個如 上定義的尿苷(尿嘧啶)或任選地尿苷(尿嘧啶)的類似物的長度。所述單調(diào)的尿苷(尿 嘧啶)序列在根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子的核心結(jié)構(gòu)元件X中出現(xiàn)至少一次。因此， 對于具有至少3個或更多個尿苷(尿嘧啶)或其類似物的1，2，3，4，5或更多個單調(diào)的尿 苷(尿嘧啶)序列，這是可以發(fā)生的，所述單調(diào)的尿苷(尿嘧啶)序列可以在核心結(jié)構(gòu)元 件X中被至少一個，優(yōu)選地2，3，4，5或更多個鳥苷(鳥嘌呤)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺 嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或其類似物中斷。例如，當(dāng)m= 3時，Xm是UUU。當(dāng)m = 4時，Xm可 以是，例如，但沒有任何限制，UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU，GUUU或CUUU，等。當(dāng)η = 10 時，Xm可以是，例如，但沒有任何限制，UUUAAUUUUC, UUUU⑶UUUA，UUU⑶UU⑶U，UUGUUUU⑶U， UUUUUUUUUU，等。鄰近根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子的C1或Cn的Xm的核苷酸(核苷) 優(yōu)選地包含尿苷(尿嘧啶)或其類似物。當(dāng)m>3時，典型地Xm的至少50%，優(yōu)選地至少 60%，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸是如上定義的尿苷(尿嘧啶)或其類似物。Xm 剩余到100%的核苷酸(核苷)(其中在序列Xm中存在少于100%的尿苷(尿嘧啶))是如 上定義的鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧 啶)或其類似物。同樣地，上述本發(fā)明的根據(jù)式(Ia)的核酸包含邊界元件N，特別是凡和/或Nv，其 中邊界元件N，特別是Nu和/或Nv，以及整數(shù)χ和y如上定義。
元件^(^,{-,可以作為根據(jù)如上定義的本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子的重復(fù)元 件，(NuC1XmCnNv)a存在，其中根據(jù)式(Ia)的元件，(NuG1XmGnNv)a的重復(fù)的數(shù)目由整數(shù)a確定。 優(yōu)選地，a是來自約1-100，1-50，1-20的整數(shù)，更優(yōu)選地是約1_15的整數(shù)，最優(yōu)選地是約 1-10的整數(shù)。在該情形中，重復(fù)元件NuC1XmCnNv可以是彼此相同或彼此不同的。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，如上定義的本發(fā)明的式(Ia)的核酸分子(NuC1XmCnNv)a 包括核心結(jié)構(gòu)C1XmCn，優(yōu)選地選自下列SEQ ID NOs :81_83的序列的至少一個-CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC(SEQ ID NO: 81)-CCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCC(SEQ ID NO 82)-CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC(SEQ ID NO 83)本發(fā)明根據(jù)式(I)(或(Ia))的核酸分子，特別是其每個單重復(fù)元件NuG1XmGnNv(或 NuC1XmCnNv),可以是通常如關(guān)于式⑴所定義的單鏈，雙鏈或部分雙鏈。如果本發(fā)明的根據(jù)式(I)(或(Ia))的核酸分子是單鏈核酸分子，所述序列典型地 在其整個長度上是單鏈的。同樣地，如果本發(fā)明的根據(jù)式(I)(或(Ia))的核酸分子是雙鏈核酸分子，所述序 列在其整個長度上典型地是雙鏈的。如果本發(fā)明的根據(jù)式(I)(或(Ia))的核酸分子是部分雙鏈核酸分子，那么式(I) (或(Ia))的核酸分子的核酸序列在核心結(jié)構(gòu)G1XmGn(或C1XmCn)之外的區(qū)域內(nèi)可以是單鏈 的，并且在所述核心結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)是雙鏈的，所述核心結(jié)構(gòu)GJmGj或C1XmCn)優(yōu)選地選自上述 定義的SEQ ID NOs 1-83序列的至少一個。甚至更優(yōu)選地，式(I)(或(Ia))的核心結(jié)構(gòu) G1XmGn(或C1XmCn)在核心結(jié)構(gòu)的所述區(qū)域內(nèi)可以是雙鏈的，其中最優(yōu)選地在整個尿苷(尿嘧 啶)片段或至少其60%，70%，80%，90%，95%，98%或99%存在尿苷(尿嘧啶)片段。備選地或另外地，如果本發(fā)明的根據(jù)式(I)或(Ia)的核酸分子是部分雙鏈核酸分 子，根據(jù)如上定義的式(I)或(Ia)的本發(fā)明的核酸分子的其它部分(非核心結(jié)構(gòu)G1XmGn)可 以是雙鏈的。例如，式(I)或(Ia)的核酸分子的核酸序列在核心結(jié)構(gòu)G1XmGn(或C1XmCn)之 外的區(qū)域(例如在邊界元件凡和/或隊中)可以是雙鏈的，并且在所述核心結(jié)構(gòu)的區(qū)域中 是單鏈的，所述核心結(jié)構(gòu)G1XmGn(或C1XmCn)優(yōu)選地選自上述SEQ ID NOs :1_83的限定序列 的至少一個。例如，邊界元件隊和/或隊的至少一個可以是雙鏈的，而式(I)或(Ia)的其 它元件，例如核心結(jié)構(gòu)G1XmGn和/或其它元件可以仍然為單鏈的。備選地或另外地，本發(fā)明的根據(jù)式⑴的核酸分子可以選自優(yōu)選地以約 1 10-10 1的比率，更優(yōu)選地以1:3-3:1的比率存在的根據(jù)式(I)或(Ia)的單鏈 核酸分子和根據(jù)式(I)(或(Ia))的(部分)雙鏈核酸分子的混合物。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的根據(jù)式(I)的核酸分子可以選自例如下列序 列的任一個來自SEQ ID NO :84 UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGGUGCGUUCCUA GAAGUACACG或來自SEQ ID NO :85 UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG
CUUAUUCG⑶GAAACGCCAGAAUGCUAAAUUCCAAUAACUCUUCCCAAAACGCGUACGGCCGAAGACGCGCGCUUAUCUUGUGUACGUUCUCGCACAUGGAAGAAUCAGCGGGCAUG⑶GGUAGGGCAAUAGGGGAGCUGGGUAGCAGCGAAAAAGGGCCCCUGCGCAC⑶AGCUUCGCU⑶UC⑶CUGAAACAACCCGGCAUCC⑶UGUAGCG
AUCCC ⑶ UAUCA ⑶⑶ UAUUCUUGUGCGCACUAAGAUUCAUGGUGUAGUCGACAAUAACAGCGUCUUGGCAGAUUCUG⑶CACGUGCCCUAUGCCCGGGCUU⑶GCCUCUCAGGUGCACAGCGAUACUUAAAGCCUUCAAGGUACUCGACGUGGGUACCGAUUC⑶GACACUUCCUAAGAUUAUUCCACU ⑶⑶ UAGCCCCGCACCGCCGACCUAAACUGGUCCAAUGUAUACGCAUUCGCUGAGCGGAUCGAUAAUAAAAGCUUGAAUU或來自SEQ ID NO 117 (R821 (N40U20N40) 2)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUG⑶CACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACC⑶C
UCAAGGUCCAA⑶UAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUU⑶GCGGUACG⑶UAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUC或來自SEQ ID NO 118 (Seq. R722 (N40U20N40) 5)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUG⑶CACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACC⑶CUCAAGGUCCAA⑶UAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUU⑶GCGGUACG⑶UAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAU
GAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUA⑶CAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACA⑶UACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGU⑶CACUGCUCUCGAG⑶CUCACGAGAGCGCUCGAUACA⑶CCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU⑶GCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAG⑶CUGCUCUA或來自SEQ ID NO 119 (R723 (N40U20N40) 10)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUG⑶CACCUGUAC
AACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACC⑶CUCAAGGUCCAA⑶UAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUU⑶GCGGUACG⑶UAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAU
GAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUA⑶CAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACA⑶UACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGU⑶CACUGCUCUCGAG⑶CUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU⑶GCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAG⑶CUGCUCUAGAACGAACUGACCUGACGCCUGAACUUAUGAGCGUGCGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCUCCCAACAAAUGUCGAUCAAUAGCUGGGCU⑶UGGAGACGC⑶CAGCAAAUGCCGUGGCUCCAUAGGACGUGUAGACUUCUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCCGGGACCACAAAUAAUAUUCUUGCUUG⑶UGGGCGCAAGGGCCCCGUAUCAG⑶CAUAAACGGGUACAU⑶UGCACAGGCUCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCGCUGA⑶UAUUCCG⑶CUCAAAAGACGGCAGAC⑶CAGUCGACAACACGGUCUAAAGCA⑶GCUACAAUCUGCCGUGUUCGUGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU⑶GAACCUACACGGCGUGCACUGUAGUUCGCAAUUCAUAGGGUACCGGCUCAGA⑶UAUGCCUUGGUUGAAAACUGCCCAGCAUACUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCAUAUUCCCAUGCUAAGCAAGGGAUGCCGCGAGUCAU⑶UAAGCUUGAAUU根據(jù)另外的特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的根據(jù)式(Ia)的核酸分子可以選自例 如下列序列中的任一個UAGCGAAGCU CUUGGACCUA CC UUUUU UUUUU UUUUU CCCUGCGUUCCUA GAAGUACACG(SEQ ID NO 86)或UAGCGAAGCU CUUGGACCUA CC UUUUU UUUUU UUUUU CCCUGCGUUCCUA GAAGUACACGAUCGCUUCGA GAACCUGGAU GG AAAAA AAAAA AAAAA GGGACGCAAGGAU CUUCAUGUGC(SEQ ID NO 87)根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的根據(jù)如上定義的式(I)(或(Ia))的核酸分子 可以用聚(X)序列(修飾元件)修飾。本發(fā)明的核酸分子可以包含例如根據(jù)式(II)的核 酸分子聚⑴s (NuG1XmGnNv) a 聚⑴ t，其中根據(jù)本發(fā)明的式(II)的核酸分子同樣具有至少50個核苷酸的長度，優(yōu)選地 至少100個核苷酸的長度，更優(yōu)選地至少150個核苷酸的長度，甚至更優(yōu)選地至少200個核 苷酸和最優(yōu)選地至少250個核苷酸的長度。
在根據(jù)本發(fā)明的式(II)的核酸分子中，元件G，X和N，特別是核心結(jié)構(gòu)G1XmGn，和 元件凡和隊，以及整數(shù)a，l，m，n，U*V如上關(guān)于式(I)定義。在本發(fā)明的情形中，根據(jù)式 (II)的本發(fā)明的核酸分子的修飾元件聚(X)，特別是聚(X)s和/或聚(X)tW型地是單鏈， 雙鏈或部分雙鏈核酸序列，例如通常如上定義的DNA或RNA序列。優(yōu)選地修飾元件聚(X)， 特別是聚(《3和/或聚(X)t，是核酸的同聚片段，其中X可以是任何核苷酸或脫氧核苷酸或 包含這樣的核苷，其如上關(guān)于本發(fā)明的根據(jù)式(I)或(Ia)的核酸分子定義。優(yōu)選地，X可 以獨立地關(guān)于聚(X)，特別是聚(X)s和/或聚(X)t的每個，選自核苷酸或脫氧核苷酸或包 括核苷，其中所述核苷酸(核苷)選自鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)， 胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)，肌苷或這些核苷酸的類似物，例如選自胞苷(胞嘧啶) (聚(C))的單鏈片段，鳥苷(鳥嘌呤)(聚(G))的單鏈片段，腺苷(腺嘌呤)(聚(A))的單 鏈片段，尿苷(尿嘧啶)(聚(U))的單鏈片段，肌苷(聚(I))的單鏈片段等，或選自肌苷和 胞苷(胞嘧啶)(聚(I:C))的同聚雙鏈片段，腺苷(腺嘌呤)和尿苷(尿嘧啶)(聚(A:U)) 的同聚雙鏈片段等，其中所述同聚序列，特別是聚(I:C)和/或聚(A:U)可以通過其鏈的 任一條(例如使用聚-C，聚-I，聚-A或聚-U序列)偶聯(lián)于根據(jù)式(II)的核酸分子的序列 (NuG1XmGnNv)P本發(fā)明的式(II)的核酸分子的修飾元件聚(X)，特別是聚(《3和/或聚(X) t的長度由整數(shù)s和/或t確定，其中s和/或t，彼此獨立地可以是約5-100的整數(shù)，優(yōu)選 地約5-70，更優(yōu)選地約5-50，甚至更優(yōu)選地約5-30和最優(yōu)選地約5_20的整數(shù)。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，根據(jù)如上定義的式(II)的核酸分子，可以具體的包含 例如根據(jù)式(IIa)的核酸分子，聚(X)(NuG1XmGnNv)a,或根據(jù)式(IIb)的核酸分子，聚⑴(NuG1XmGnNv)a 聚(X)，其中，根據(jù)本發(fā)明的式(IIa)或(IIb)的這些核酸分子的任一個同樣地具有至少 50個核苷酸的長度，優(yōu)選地至少100個核苷酸，更優(yōu)選地至少150個核苷酸，甚至更優(yōu)選地 至少200個核苷酸和最優(yōu)選地至少250個核苷酸的長度。類似地，所有其它定義如上述式 (II)或⑴所述。同樣地，所述式(II)，(Ha)和(IIb)可以基于根據(jù)式(Ib)的式定義， 即引入核心結(jié)構(gòu)C1XmCntl更優(yōu)選地，在本發(fā)明的根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸分子可以選自 如上定義的聚(X)，更優(yōu)選地選自聚(I:c)和/或選自聚(A:U)。這些修飾元件聚(X)，特 別是聚(I:C)和/或聚(A:U)，可以通過其任一條鏈，例如使用聚-C，聚-G，聚-1，聚-A或 聚-U序列偶聯(lián)于根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)的序列。類似地，如上關(guān)于式(I)或(Ia)定義，本發(fā)明的根據(jù)式(II), (IIa)和/或(IIb) 任一的核酸分子可以是如上定義的單鏈，雙鏈或部分雙鏈核酸分子。如果本發(fā)明的根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸分子是單鏈核酸分子， 所述序列典型地在其整個長度上是單鏈的。同樣地，如果本發(fā)明的根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸分子是雙鏈核 酸分子，所述序列在其整個長度上典型地是雙鏈的如果本發(fā)明的根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸分子是部分雙鏈核酸 分子，那么式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸分子的核酸序列在核心結(jié)構(gòu)G1XmGn之外
28的區(qū)域內(nèi)可以是單鏈的，并且在所述核心結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)是雙鏈的，所述核心結(jié)構(gòu)G1XmGn優(yōu)選地 選自上述定義的SEQ ID NOs 1-80或SEQID NOs :81_83序列的至少一個。甚至更優(yōu)選地， 式(I)(或(Ia))的核心結(jié)構(gòu)G1XmGn(或C1XmCn)在核心結(jié)構(gòu)的所述區(qū)域內(nèi)可以是雙鏈的，其 中最優(yōu)選地在整個尿苷(尿嘧啶)片段或至少其60%，70%，80%，90%，95%，98%或99% 中存在尿苷(尿嘧啶)片段。備選地或另外地，如果本發(fā)明的根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸分子 是部分雙鏈核酸分子，根據(jù)如上定義的式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的本發(fā)明的核酸分 子的其它部分(非核心結(jié)構(gòu)G1XmGn)可以是雙鏈的。例如，式(II)，(IIa)和/或(IIb)的 核酸分子的核酸序列在核心結(jié)構(gòu)G1XmGn之外的區(qū)域(例如在邊界元件Nu和/或Nv中，和/ 或在修飾元件聚(X)，例如聚(X)s和或聚(X)t(如例如聚(IC)或聚(A:U)序列中))可以 是雙鏈的，并且例如在所述核心結(jié)構(gòu)的區(qū)域中是單鏈的，所述核心結(jié)構(gòu)G1XmGn優(yōu)選地選自上 述SEQID NOs 1-83的限定序列的至少一個。例如，邊界元件Nv和/或Nv的至少一個和/ 或修飾元件聚(X)，例如聚(X)s和或聚(X)t中的至少一個可以是雙鏈的，而式(II)，(Ha) 和/或(IIb)的其它元件，例如核心結(jié)構(gòu)G1XmGn和/或其它元件可以仍然為單鏈的。備選地或另外地，根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的單鏈核酸分子，和 根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的(部分)雙鏈核酸分子的混合物，優(yōu)選地以約 1 10-10 1的比率，更優(yōu)選地以1 3-3 1的比率存在。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的根據(jù)式(II)，(IIa)和/或(IIb)任一的核酸 分子可以選自例如下列序列的任一個-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO 88)-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO 89)IIIIIIIIII IIIIIIIIII-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO 90)AAAAA AAAAA AAAAA-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO 91)GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG CC AAAAA AAAAA AAAAA CCC-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUUGGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG(SEQ ID NO 92)-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUAGAAGUACACGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGG CC AAAAA AAAAA AAAAA CCC ACGCAAGGAUCUUCAUGUGCUAGCGAAGCU CUUGGACCUA (SEQ ID NO 93)AUCGCUUCGA GAACCUGGAU-CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUAGAAGUACACGCC AAAAA AAAAA AAAAA CCC ACGCAAGGAU CUUCAUGUGCUAGCGAAGCU CUUGGACCUA (SEQ ID NO 94)
29
AUCGCUUCGA GAACCUGGAU根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的根據(jù)如上定義的式(I)(或(Ia))的核酸分 子可以通過插入莖或莖環(huán)來進(jìn)行修飾，例如得到根據(jù)式(IIIa)的核酸分子，(Nu-IG1XmGn-ZNv)a,或根據(jù)式(IIIb)的核酸分子，(NuG1XmGnNv)a-INwl 莖2\2，其中根據(jù)本發(fā)明的式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子具有至少100個核苷酸， 更優(yōu)選地至少150個核苷酸，甚至更優(yōu)選地至少200個核苷酸和最優(yōu)選地至少250個核苷 酸的長度。同樣地，所述式(IIIa)和(IIIb)可以基于根據(jù)式(Ib)的式定義，即引入核心 結(jié)構(gòu) C1XmCn0特別地，本發(fā)明的式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸代表如上定義的式(I)的變體。 在根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)的任一個的核酸中，接近核心結(jié)構(gòu)G1XmGn的邊界元件N，即 凡和/或隊，由至少一個莖或莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步擴(kuò)充，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選地由單一莖環(huán)元件莖 1和莖2組成。在本發(fā)明的根據(jù)如上定義的式(IIIa)和/或(IIIb)的任一個的核酸中， 元件G，X和N，特別地，核心結(jié)構(gòu)G1XmGn，和整數(shù)a，1，m，n，u和ν如上定義。更優(yōu)選地整數(shù) a= I0任選地u和/或ν可以是0。另外地，鄰近于莖環(huán)元件莖1和莖2的元件Nwl和Nw2 代表另外的邊界元件，其如上述關(guān)于邊界元件Nu和/或Nv所定義。特別地，邊界元件N通 常如上述關(guān)于式(I)中的N所述，并且整數(shù)wl和w2彼此獨立地選擇并且如上述在式(I) 中的整數(shù)u和/或ν所定義。在該背景下，莖或莖環(huán)結(jié)構(gòu)是在單鏈DNA或更常見地在RNA中存在的分子內(nèi)堿基 配對。該結(jié)構(gòu)還已知為發(fā)夾或發(fā)夾環(huán)。當(dāng)相同分子的兩個區(qū)域，例如莖環(huán)元件莖1和莖2， 通常地核酸序列的回文序列元件彼此形成堿基對時，發(fā)生這樣的現(xiàn)象，導(dǎo)致形成(雙螺旋， 其終止于)未配對的環(huán)。未配對的環(huán)由此典型地代表核酸區(qū)域，其顯示與莖1或莖2的序 列沒有同源性，或幾乎沒有同源性，并且因此不能夠與這些莖環(huán)元件的任一個堿基配對。得 到的巨頭噬菌體形狀結(jié)構(gòu)是許多RNA次級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵構(gòu)件。莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的形成因此取決于 得到的螺旋和環(huán)區(qū)域的穩(wěn)定性，其中第一先決條件典型地是本身可以折疊回以形成配對的 雙螺旋的存在。配對的莖環(huán)元件的穩(wěn)定性由長度，其包含的錯配或凸出部分的數(shù)目(少量 的錯配典型地是可忍受的，尤其在長螺旋中)，以及配對區(qū)域的堿基組成確定。例如，在鳥苷 (鳥嘌呤)和胞苷(胞嘧啶)之間的配對在這樣的序列中可以是更優(yōu)選的，因為它們具有 三個氫鍵并且與僅具有兩個氫鍵的腺苷(腺嘌呤)_尿苷(尿嘧啶)配對相比更穩(wěn)定。在 RNA中，特征是兩個氫鍵的鳥苷(鳥嘌呤)-尿苷(尿嘧啶)配對因此可以是有利的。環(huán)的 穩(wěn)定性還影響莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。少于三個堿基長度的"環(huán)"(即，僅不包含莖環(huán)元件莖 1和莖2的環(huán))在空間排列上是較不優(yōu)選的。然而，還可以包含這樣的莖，即在莖1和莖2 之間不顯示(限定的)環(huán)，而僅顯示未配對的區(qū)域的形成。在本發(fā)明的背景中，任選的環(huán)的 長度傾向于是約4-100個堿基，更優(yōu)選地4-50個堿基或甚至4-30個堿基或甚至4_20個堿 基的長度。因此，在根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)任一個的核酸分子的情形中，莖環(huán)元件莖1 和莖2典型地代表一個莖或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的部分，其中所述莖或莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以由莖環(huán)元件莖1 和莖2形成，并且環(huán)可以由位于這些莖環(huán)元件之間的序列形成。所述莖或莖環(huán)可以在堿基配對區(qū)域中具有螺旋形式。每個莖環(huán)元件莖1和莖2優(yōu)選地是如上定義的核酸，更優(yōu)選地 是RNA，并且最優(yōu)選地是單鏈RNA，其中如上關(guān)于核心結(jié)構(gòu)元件X定義的核苷酸(核苷)或 類似物的任一種可以用作莖1和/或莖2的核苷酸(核苷)。另外地，莖環(huán)元件莖1表示莖 環(huán)元件莖2的回文序列。因此，兩個序列優(yōu)選地能夠與彼此堿基配對，并因此在一起形成莖 或莖環(huán)的基礎(chǔ)。 因此，莖環(huán)元件莖1或莖2可以成對地選自任何核酸序列，條件是莖環(huán)元件莖1或 莖2是彼此回文的，即一個序列等價于回讀的其它(互補(bǔ)序列)或當(dāng)回讀時，顯示該序列與 其它序列至少90%，更優(yōu)選地至少95%，和最優(yōu)選地至少99%的同源性。所述回文序列莖 1和莖2分別可以由具有約5-50，更優(yōu)選地約5-40和最優(yōu)選地約5-30個核酸的長度的核 酸序列形成，所述核酸選自腺苷(腺嘌呤)，鳥苷(鳥嘌呤)，胞苷(胞嘧啶)，尿苷(尿嘧 啶)，胸苷(胸腺嘧啶)，或其如本文定義的類似物。a)對于莖1
UAGCGAAGCUCUUGGACCUA(SEQ ID NO95)
對于莖2
UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA(SEQ ID NO96)
b)對于莖1
UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA(SEQ ID NO96)
對于莖2
UAGCGAAGCUCUUGGACCUA(SEQ ID NO95)
c)對于莖1
GCCGCGGGCCG(SEQ ID NO 97)
對于莖2
CGGCCCGCGGC(SEQ ID NO 98)
d)對于莖1
CGGCCCGCGGC(SEQ ID NO 98)
對于莖2
GCCGCGGGCCG(SEQ ID NO 97)
e)對于莖1
GACACGGUGC(SEQ ID NO 99)
對于莖2
GCACCGUGCA(SEQ ID NO: 100)
f)對于莖1
GCACCGUGCA(SEQ ID NO: 100)
對于莖2
GACACGGUGC(SEQ ID NO 99)
g)對于莖1
ACCUAGGU(SEQ ID NO 101)
對于莖2
ACCUAGGU(SEQ ID NO 101)
h)對于莖 1:UGGAUCCA(SEQ ID NO: 102)對于莖2 UGGAUCCA (SEQ ID NO: 102)i)對于莖 1 CCUGC(SEQ ID NO: 103)對于莖2 GCAGG(SEQ ID NO: 104)j)對于莖 1 GCAGG(SEQ ID NO: 105)對于莖2:CCUGC (SEQ ID N0:106)等。根據(jù)一個第一備選方案，所述核心結(jié)構(gòu)G1XmGn可以位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)，S卩，所述核心 結(jié)構(gòu)G1XmGn可以位于莖環(huán)元件莖1和莖2之間，由此優(yōu)選地形成環(huán)。這樣的核酸分子與式 (IIIa)類似，其具有如上定義的組成(Nu-IG1XmGn莖2N上。當(dāng)u和/或v = 0，且a=l 時，式(IIIa)可以形成特定的核酸分子“莖IG1XmGn莖2 “，其也可以結(jié)合在本發(fā)明中。根據(jù)另一個備選方案，所述核心結(jié)構(gòu)G1XmGn可以位于所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的外部，其中同 樣地，莖環(huán)元件莖1和莖2可以彼此通過一定序列(優(yōu)選地，邊界元件N，例如Nwl或Nw2)分 離，其接著可以在莖環(huán)元件莖1和莖2的堿基配對后形成環(huán)結(jié)構(gòu)。另外，鄰近于核心結(jié)構(gòu) G1XmGn的莖環(huán)元件1和/或1，可以通過其它的邊界元件，例如Nwl或Nw2與核心結(jié)構(gòu)G1XmGn分 離。根據(jù)本發(fā)明，這樣的核酸與式(IIIb)類似，其具有如上定義的組成(NuG1XmGnNv)a-INwl 莖 2Nw2。本發(fā)明的根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子可以是單鏈的，或部分雙鏈的。如果本發(fā)明的根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子是單鏈核酸分子，那么所 述序列典型地在其整個長度上是單鏈的。如果本發(fā)明的根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子是部分雙鏈核酸分子，那 么式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子優(yōu)選地在莖環(huán)元件莖1和莖2的區(qū)域中并且在由核 心結(jié)構(gòu)G1XmGn或任何其它元件(例如Nwl或Nw2)形成的區(qū)域中可以是單鏈的。那么位于莖 環(huán)元件莖1和莖2外部和在由核心結(jié)構(gòu)G1XmGn或由任何其它元件(例如Nwl或Nw2)形成的 環(huán)的區(qū)域中的元件，可以彼此獨立地是單鏈或雙鏈。備選地或另外地，優(yōu)選地以約1 10-10 1的比率，更優(yōu)選地以1 3_3 1的 比率存在的根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)的單鏈或部分雙鏈核酸分子，和根據(jù)式(IIIa)或 (IIIb)的(部分)雙鏈核酸分子的混合物。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的根據(jù)式(IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子可 以選自例如下列序列的任一個-UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA (SEQ ID NO 107) -UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUAGAAGUACACG GCCGCGGGCCG UGCGUUCCUA GAAGUACACG CGGCCCGCGGCUGCGUUCCUA GAAGUACACG(SEQ ID NO
32108)(莖1和莖2以下劃線表示，核心結(jié)構(gòu)G1XmGn以粗體表示)如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb) 的核酸分子可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行制備，所述方法包括合成方法如例如固相 合成，以及體外方法如體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。優(yōu)選地，體外轉(zhuǎn)錄用于本發(fā)明的核酸分子的制備。發(fā) 明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與通過合成方法制備的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)， (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子比較時，當(dāng)通過基于其5’ -磷酸酯的體外轉(zhuǎn)錄制備時， 如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸 分子顯示甚至更好的對先天免疫系統(tǒng)的刺激。所述對先天免疫系統(tǒng)的刺激，有利于(但不 限于此)對受體RIG-I的激活。因此如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)， (lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子是特別優(yōu)選的，當(dāng)通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備時。將如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或 (IIIb)的核酸分子典型地作為“穩(wěn)定的寡核苷酸”提供，即作為對體內(nèi)降解(例如通過核 酸外切酶或核酸內(nèi)切酶)具有抗性的寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸提供。這樣的穩(wěn) 定可以例如通過如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/ 或(IIIb)的核酸分子的修飾的磷酸酯主鏈來實現(xiàn)的。優(yōu)選用于該情形的核苷酸包含硫代 硫酸酯_修飾的磷酸酯主鏈，優(yōu)選地至少一個包含在磷酸酯主鏈中被硫原子取代的磷酸酯 氧。其它穩(wěn)定的寡核苷酸包括非離子類似物，如例如，烷基膦酸酯和芳基膦酸酯，其中帶電 的膦酸酯氧被烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)，或磷酸二酯和烷基磷酸三酯取代，其中帶電的氧殘基 以烷基化形式存在。然而，天然存在的磷酸二酯主鏈仍舊是優(yōu)選的。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb) 的核酸分子可以同樣地被穩(wěn)定。如上提及的，任何核酸，例如DNA或RNA，可以原則上用于 如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸 分子。然而，從安全性觀點，優(yōu)選RNA用于這樣的核酸分子的應(yīng)用。具體地，RNA不涉及被 穩(wěn)定地整合到轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組中的風(fēng)險。此外，RNA明顯更容易地在體內(nèi)降解。同樣地， 迄今尚未檢測到抗-RNA的抗體，這可能是由于與DNA相比，RNA在體內(nèi)相對較短的半衰期。 與DNA相比，RNA相對在溶液中更不穩(wěn)定，這特別是由于RNA降解酶，所謂的RNA酶(核糖核 酸酶)造成的。甚至最少量的核糖核酸酶污染也足以在溶液中完全降解RNA。這樣的RNA 酶污染通?？梢詢H通過特殊的處理，具體地用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理來去除。因此，在 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中對mRNA的天然降解是受到非常精細(xì)調(diào)節(jié)的。在現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于此已經(jīng)了 解許多機(jī)制。因此，末端結(jié)構(gòu)典型地對于體內(nèi)mRNA是至關(guān)重要的。在天然存在的mRNAs的 5'末端，通常存在所謂的“帽結(jié)構(gòu)”(修飾的鳥苷(鳥嘌呤)核苷酸)并且在3'端存在多 到200腺苷(腺嘌呤)核苷酸(所謂的聚A尾)的序列。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb) 任一的核酸分子，特別是如果作為(m)RNA提供，可以因此通過加入所謂的"5'帽“結(jié) 構(gòu)來對抗RNA酶的降解而得以穩(wěn)定。在這方面，特別優(yōu)選m7G(5' )ppp(5' (A, G(5') PPP (5' )A或G(5' )PPP(5' )G作為5'帽"結(jié)構(gòu)。然而，這樣的修飾僅是如果修飾，例 如脂質(zhì)修飾尚未被引入如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa) 和/或(IIIb)任一的核酸分子的5'端或如果所述修飾不干擾如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式
33(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的(未修飾的或化學(xué)修飾的)核 酸分子的免疫原性，才會被引入。備選地，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/ 或(IIIb)任一的核酸分子的3'端，特別如果作為RNA提供，可以被至少50個腺苷核糖核 苷酸，優(yōu)選地至少70個腺苷核糖核苷酸，更優(yōu)選地至少100個腺苷核糖核苷酸，特別優(yōu)選 地至少200個腺苷(腺嘌呤)核糖核苷酸(所謂的"聚A尾")的序列修飾。特別地，尤 其是如果RNA以(m)RNA的形式存在，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)， (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以在3'末端，包含典型地約10-200個腺 苷核苷酸，優(yōu)選地約10-100個腺苷核苷酸，更優(yōu)選地約20-100個腺苷核苷酸或甚至更優(yōu)選 地約40-80個腺苷核苷酸的聚腺苷酸尾。此外，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子的3'端，特別地如果作為RNA提供，可以被至少50個胞苷核糖核 苷酸，優(yōu)選地至少70胞苷核糖核苷酸，更優(yōu)選地至少100個胞苷核糖核苷酸，特別優(yōu)選地至 少200個胞苷核糖核苷酸的序列(所謂的"聚-C尾")修飾。特別地，尤其是如果RNA以 (m) RNA的形式存在，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和 /或(IIIb)任一的核酸分子可以在3'末端包含典型地約10-200個胞苷核苷酸，優(yōu)選地約 10-100個胞苷核苷酸，更優(yōu)選地約20-70個胞苷核苷酸或甚至更優(yōu)選地約20-60個或甚至 10-40個胞苷核苷酸的聚-C尾。類似地，在該情形中，這樣的(“聚腺苷酸”和/或“聚-C尾” _)修飾僅在如果修 飾，例如脂質(zhì)修飾尚未被引入如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'端或如果所述修飾不干擾如上定義的根據(jù)本 發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的(未修飾的或化學(xué) 修飾的)核酸分子的免疫原性時，才會被引入。上述修飾，即將"5'帽〃結(jié)構(gòu)或"聚腺苷酸"和/或“聚-C尾”插入3'端，防止 了如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一 的核酸分子的體內(nèi)過早降解，并且因此在體內(nèi)穩(wěn)定如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，
(II)，(IIa)，(lib),(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子。根據(jù)特定的實施方案，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib)， (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以包含脂質(zhì)修飾。所述根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)-修飾 的核酸分子典型地包含如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa) 和/或(IIIb)任一的核酸分子，至少一種與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子共價連接的接頭，和至 少一種與各個接頭共價連接的脂質(zhì)。備選地，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)_修飾的核酸分子包含(至 少一種)如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb) 任一的核酸分子和至少一種與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子共價連接(無接頭)的(雙官能)脂 質(zhì)。根據(jù)第三個備選方案，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)_修飾的核酸分子包含如上定義的根據(jù)本發(fā) 明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，至少一種與 根據(jù)本發(fā)明的核酸分子共價連接的接頭，和至少一種與各個接頭共價連接的脂質(zhì)，以及至 少一種與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子共價連接(無接頭)的(雙官能)脂質(zhì)。在根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)_修飾的核酸分子中包含的脂質(zhì)典型地是優(yōu)選地其本身具有生物活性的脂質(zhì)或親脂殘基。所述脂質(zhì)優(yōu)選地包括天然物質(zhì)或化合物，如例如維生素，例 如α -生育酚(維生素Ε)，包括RRR- α -生育酚(以前的D- α -生育酚)，L- α -生育酚， 外消旋物D，L- α -生育酚，維生素E琥珀酸酯(VES)，或維生素A及其衍生物，例如視黃酸， 視黃醇，維生素D及其衍生物，例如維生素D及其麥角固醇前體，維生素E及其衍生物，維生 素K及其衍生物，例如維生素K和相關(guān)的醌或植醇化合物，或類固醇，如膽汁酸，例如膽酸， 脫氧膽酸，去氫膽酸，可的松(cortisone)，地高辛(digoxygenin)，睪酮(testosterone), 膽固醇或硫代膽固醇。在本發(fā)明范圍內(nèi)的另外的脂質(zhì)或親脂殘基包括，但不限于，聚亞烷 基二醇(Oberhauser 等，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1992，20，533)，脂族基團(tuán)如，例如， C1-C20-烷，C1-C2tl-烯或C1-C2tl-鏈烷醇化合物，等，如，例如，十二烷二醇，十六醇或i^一烷基 殘基(Saison-Behmoaras 等，EMBO J，1991，10，111 ；Kabanov 等，F(xiàn)EBS Lett. (FEBS 通訊)， 1990，259，327 ；Svinarchuk 等，Biochimie, 1993，75，49)，磷脂如，例如，磷脂酰甘油，二酰 基磷脂酰甘油，磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷 脂酰乙醇胺，雙_十六烷基_外消旋_甘油，鞘脂，腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷酯，或1，2- 二 -0-十六 烷基-外消旋_甘油-3-H-磷酸三乙銨(Manoharan等，Tetrahedron Lett.(四面體通訊)， 1995, 36, 3651 ；Shea 等，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1990,18, 3777)，多胺或聚(亞燒 基)二醇，如例如，聚乙二醇(PEG) (Manoharan 等，Nucleosides & Nucleotides (核苷 & 核苷酸)，1995，14，969)，六甘醇(HEG)，棕櫚酸甘油酯或棕櫚基殘基(Mishra等，Biochim. Biophys. Acta (生物化學(xué)生物物理學(xué)報)，1995，1264，229)，十八胺或己基氨基-羰基-氧 基膽固醇?xì)埢?Crooke 等，J. Pharmacol. Exp. Ther.，1996，277，923)，以及蠟，萜，脂族烴， 飽和的和單或多不飽和脂肪酸殘基等。在脂質(zhì)和如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和 /或(IIIb)任一的核酸分子之間的連接原則上可以發(fā)生在本發(fā)明核酸的任何核苷酸、任 何核苷酸的堿基或糖成分上，發(fā)生在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'和/或5'端，和/或在磷酸酯主鏈上。 根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在其3'和/或5'端的末端脂質(zhì)修飾。與序 列內(nèi)的修飾相比，末端修飾具有許多優(yōu)勢。另一方面，在序列內(nèi)的修飾可以影響雜交行為， 其可以在空間需求的殘基方面具有不利的作用。在其它方面，在僅在末端修飾的脂質(zhì)-修 飾的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的合成制備中，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的合成可以用可大量獲得的商購單體 進(jìn)行，并且可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的合成方案。根據(jù)第一個優(yōu)選的實施方案，在根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和所用的至少一種脂質(zhì)之 間的連接通過接頭(與如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa) 和/或(IIIb)任一的核酸分子的共價連接)實現(xiàn)。在本發(fā)明范圍內(nèi)的接頭典型地具有至 少兩個，和任選地3，4，5，6，7，8，9，10，10-20，20-30或更多個反應(yīng)基，所述反應(yīng)基選自例如 羥基、氨基、烷氧基等。一個反應(yīng)基優(yōu)選地用于結(jié)合上述如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)， (Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，例如RNA寡核苷酸。該 反應(yīng)基可以以保護(hù)的形式存在，例如作為DMT基團(tuán)(二甲氧基三苯甲基氯)，作為Fmoc基 團(tuán)，作為MMT(單甲氧基三苯甲基)基團(tuán)，作為TFA(三氟乙酸)基團(tuán)，等。此外，硫基團(tuán)可 以通過二硫化物進(jìn)行保護(hù)，所述二硫化物例如烷基硫醇，如例如，3-硫代丙醇，或通過激活
35成分如2-硫代吡啶保護(hù)。一個或多個另外的反應(yīng)基根據(jù)本發(fā)明用于一個或多個脂質(zhì)的共 價結(jié)合。因此，根據(jù)第一個實施方案，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)， (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以通過共價結(jié)合的接頭優(yōu)選地結(jié)合至少一 種脂質(zhì)，例如每個如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/ 或(IIIb)任一的核酸分子結(jié)合1，2，3，4，5，5-10，10-20，20-30或更多脂質(zhì)(s)，特別地優(yōu) 選地至少3-8或更多個脂質(zhì)。由此，結(jié)合的脂質(zhì)可以彼此獨立地在如上定義的根據(jù)本發(fā)明 的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的不同位置結(jié) 合，或它們以在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子的一個或多個位置的復(fù)合物的形式存在。接頭的另外的反應(yīng)基可 以用于直接或間接(可裂解的)結(jié)合載體物質(zhì)，例如固相。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的接頭，例如是 乙二醇，甘油和甘油衍生物，2-氨基丁基-1，3-丙二醇和2-氨基丁基-1，3-丙二醇衍生物 /骨架，吡咯烷接頭或包含吡咯烷的有機(jī)分子(具體地用于在3'端的修飾)等。甘油或甘 油衍生物(C3錨)或2-氨基丁基-1，3-丙二醇衍生物/骨架(C7錨)是根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu) 選使用的接頭。當(dāng)脂質(zhì)修飾可以通過醚鍵引入時，作為接頭的甘油衍生物((3錨)是特別 優(yōu)選的。如果脂質(zhì)修飾通過酰胺或氨基甲酸酯鍵弓I入，例如優(yōu)選2-氨基丁基-1，3-丙二醇 骨架((7錨)。在該情形中，在接頭和如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)， (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子之間形成的鍵的性質(zhì)優(yōu)選地是這樣的從而使 其與amidite化學(xué)的條件和化學(xué)品是相容的，即，其優(yōu)選地不是酸不穩(wěn)定的也不是堿不穩(wěn) 定的。特別優(yōu)選容易通過合成獲得的堿并且其不通過核酸合成工藝的氨性裂解方法被水 解。適合的鍵原則上是所有相應(yīng)的適合的鍵，優(yōu)選地酯鍵，酰胺鍵，氨基甲酸酯鍵和醚鍵。除 了原材料的良好可及性(很少的合成步驟)之外，特別優(yōu)選醚鍵，這是因為其針對酶促水解 的相對較高的生物學(xué)穩(wěn)定性。 根據(jù)第二個優(yōu)選的實施方案，(至少一種)如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)， (II), (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子直接與如上所述的至少一種(雙 官能)脂質(zhì)直接連接，即不使用如上所述的接頭。在該情形中，根據(jù)本發(fā)明使用的(雙官 能)脂質(zhì)優(yōu)選地包含至少兩個反應(yīng)基或任選地3，4，5，6，7，8，9，10或更多個反應(yīng)基，第一反 應(yīng)基用于直接或間接結(jié)合本文所述的載體物質(zhì)并且至少一種另外的反應(yīng)基用于結(jié)合如上 定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸 分子。根據(jù)第二個實施方案，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以優(yōu)選地結(jié)合至少一種脂質(zhì)(直接地而無需接 頭)，例如每個如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子結(jié)合1,2,3,4,5, 5-10,10-20，20-30或更多脂質(zhì)，特別優(yōu)選地至少 3-8或更多個脂質(zhì)。結(jié)合的脂質(zhì)可以彼此獨立地在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II), (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的不同位置結(jié)合，或它們可以以 復(fù)合物的形式存在于如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)任一的核酸分子的一個或多個位置上。備選地，至少一種如上定義的根據(jù)本發(fā) 明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，例如，任選 地如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一 的3，4，5，6，7，8，9，10，10-20，20-30或更多個核酸通過其反應(yīng)基根據(jù)第二個實施方案結(jié)合
36于如上所述的脂質(zhì)?？梢杂糜谠摰诙€實施方案的脂質(zhì)特別優(yōu)選地包括那些(雙官能)脂 質(zhì)，其容許偶聯(lián)(優(yōu)選地，在其末端或任選地分子內(nèi)地)，如例如聚乙二醇(PEG)及其衍生 物，六乙二醇(HEG)及其衍生物，烷二醇，氨基烷，硫代烷醇等。在(雙官能)脂質(zhì)和上述如 上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分 子之間的鍵的性質(zhì)優(yōu)選地如第一個優(yōu)選實施方案所述。根據(jù)第三個實施方案，在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子和至少一種如上所述的脂質(zhì)之間的連接可 以通過兩種上述實施方案同時發(fā)生。例如，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以在核酸的一個位置與至少一種 脂質(zhì)通過接頭連接(類似于第一個實施方案)和在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)， (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的不同位置直接與至少一種脂 質(zhì)不使用接頭連接(類似于第二個實施方案)。例如，在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)， (Ia) ,(II), (IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'端，至少一種如上所 述的脂質(zhì)可以與核酸通過接頭共價連接，并且在根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的5'端，如上所述 的脂質(zhì)可以與核酸不經(jīng)過接頭共價連接。備選地，在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)， (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的5‘端，至少一種如上所述 的脂質(zhì)可以與核酸分子通過接頭共價連接，并且在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)， (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'端，如上所述的脂質(zhì)可以 與核酸分子，不經(jīng)過接頭而共價連接。同樣地，共價連接可以不僅在如上定義的根據(jù)本發(fā)明 的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的末端發(fā)生，還 可以在分子內(nèi)發(fā)生，如上所述，例如在3'端和分子內(nèi)，在5'端和分子內(nèi)，在3'和5'端和 分子內(nèi)，僅分子內(nèi)等。脂質(zhì)-修飾的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa) 和/或(IIIb)任一的核酸分子可以優(yōu)選地通過各種方法獲得。脂質(zhì)修飾可以原則上-如 上定義-被引入如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子的任何位置，例如在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3‘和/或5'端或在磷酸酯主鏈 上，和/或在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子的任何核苷酸的任何堿基或糖上。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在如上定義的 根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸的3' 和/或5'端的末端脂質(zhì)修飾。通過所述末端化學(xué)修飾的方式，可以根據(jù)本發(fā)明獲得大量 的不同衍生的核酸。用于制備如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的所述脂質(zhì)-修飾的核酸優(yōu)選地基于脂質(zhì)修飾的位置選擇。如果，脂質(zhì)修飾例如發(fā)生在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)， (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'端，那么脂質(zhì)修飾典型地在制備如上定 義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分 子之前或之后進(jìn)行。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)的核酸分子的制備可以通過直接合成核酸或任選地通過加入快速合成的核酸 或來自分離自其它來源的樣品的核酸來進(jìn) 。
根據(jù)第一個備選方案，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib)， (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子在引入脂質(zhì)前直接合成，其典型地通過現(xiàn)有技術(shù)合成核酸 已知的方法進(jìn)行。為此目的，起始核苷酸(核苷)優(yōu)選地結(jié)合于固相，例如通過偶聯(lián)分子，例 如琥珀酰殘基，例如通過amidite化學(xué)方法合成了如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子。接著，優(yōu)選地通過所述接頭 的第一反應(yīng)基，將前文所述的接頭與如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'端結(jié)合。接著，可以將如前文所述的脂 質(zhì)與接頭通過接頭的第二反應(yīng)基共價連接。備選地，接頭可以在其結(jié)合于如上定義的根據(jù) 本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3' 端之前，與脂質(zhì)共價連接。在該情形中，僅接頭的第一反應(yīng)基與如上定義的根據(jù)本發(fā)明的 式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3'端的結(jié)合 是必需的。在合成如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/ 或(IIIb)任一的核酸分子后，或在脂質(zhì)的結(jié)合后，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以從固相分離，并且被去保 護(hù)。如果合成已經(jīng)在溶液中進(jìn)行，用于去除未反應(yīng)的反應(yīng)物以及溶劑和不合需要的次級產(chǎn) 物的洗滌和純化步驟可以在合成脂質(zhì)_修飾的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子進(jìn)行(并且任選地， 在從載體物質(zhì)分離之前進(jìn)行)。根據(jù)另一個備選方案，如上定義的3'-脂質(zhì)-修飾的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的 式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子在將脂質(zhì)引入接 頭的反應(yīng)基后或結(jié)合于接頭的反應(yīng)基后，作為快速合成的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)， (Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子合成。為此目的，例如， 如上所述的接頭的第一反應(yīng)基可以與如前所述的脂質(zhì)反應(yīng)。接著，優(yōu)選地在第二個步驟中， 給所述接頭的第二反應(yīng)基提供酸穩(wěn)定性的保護(hù)基，例如DMT，F(xiàn)moc，等，從而容許隨后將如上 定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸 分子結(jié)合于該反應(yīng)基。接著，所述接頭可以直接或間接通過接頭的第三反應(yīng)基結(jié)合于固相。 間接結(jié)合是可能的，例如通過(偶聯(lián))分子，其可以共價結(jié)合于接頭和固相。所述(偶聯(lián)) 分子例如是如前文所述的琥珀酰殘基等。接著通常發(fā)生在接頭的第三反應(yīng)基的保護(hù)基的去 除和在目前可及的反應(yīng)基結(jié)合或合成如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)， (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子。最后，脂質(zhì)-修飾的根據(jù)本發(fā)明的核酸分 子典型地從載體物質(zhì)上裂解下來(并且在核酸上的保護(hù)基任選地被去除)。然而，其它的脂 質(zhì)也可以任選地偶聯(lián)于偶聯(lián)的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任 一的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，其優(yōu)選地根據(jù)前述的一個步驟進(jìn)行。根據(jù)該前述備選方案的變體，如上所述的接頭可以直接或間接地通過第一反應(yīng)基 連接于固相。接著，將酸穩(wěn)定的保護(hù)基首先結(jié)合于接頭的第二反應(yīng)基。在將保護(hù)基結(jié)合于 第二反應(yīng)基后，如上所述的脂質(zhì)可以首先結(jié)合于所述接頭的第三反應(yīng)基。接著，同樣地優(yōu)選 地進(jìn)行在接頭的第三反應(yīng)基的保護(hù)基的去除，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)， (IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子在目前可及的反應(yīng)基的結(jié)合或合成， 以及脂質(zhì)_修飾的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子從所述載體物質(zhì)的裂解(并且任選地，在所述核 酸去除保護(hù)基)。
根據(jù)如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子的3'-脂質(zhì)修飾的特別優(yōu)選的實施方案，所述脂質(zhì)_修飾的根據(jù) 本發(fā)明的核酸分子可以通過具有三個基于甘油基本物質(zhì)(C3錨)的反應(yīng)基(三官能錨定化 合物)和具有單官能脂質(zhì)的接頭合成，所述脂質(zhì)如例如，棕櫚基殘基，膽固醇或生育酚。作 為合成接頭的起始物質(zhì)，可以使用例如α，異亞丙基-甘油(包含縮酮保護(hù)基的甘油)， 其優(yōu)選地首先用氫氧化鈉轉(zhuǎn)化為醇化物并且與十六烷基溴和脂質(zhì)在威廉遜合成法中反應(yīng) 以形成相應(yīng)的醚。備選地，醚鍵可以在第一個步驟中通過不同的方法連接，例如通過形成 α，β-異亞丙基-甘油的甲苯磺酸酯，并且使甲苯磺酸酯與脂質(zhì)的反應(yīng)基(例如酸性質(zhì) 子)反應(yīng)，以形成相應(yīng)的醚。在第二個階段中，可以用酸(例如乙酸、稀釋的鹽酸等)去除 縮酮保護(hù)基，接著可以選擇性地通過二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)來保護(hù)二醇的伯羥基。 在最后的階段中，優(yōu)選地進(jìn)行在前一個步驟中獲得的產(chǎn)物與琥珀酸酐的反應(yīng)從而形成琥珀 酸酯，其中用DMAP作為催化劑。所述接頭特別適合于例如結(jié)合作為脂質(zhì)的棕櫚基殘基或生 育酚。根據(jù)另一個備選方案，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib)， (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的3' _脂質(zhì)修飾使用(雙官能)脂質(zhì)，如，例如，聚 乙二醇(PEG)或六乙二醇(HEG)，而不使用如上所述的接頭來實現(xiàn)。所述雙官能脂質(zhì)典型 地具有如上所述的兩個官能團(tuán)，其中雙官能脂質(zhì)的一端可以優(yōu)選地通過偶聯(lián)分子，例如如 本文所述的堿不穩(wěn)定的琥珀?；^等而結(jié)合于載體物質(zhì)，并且如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式
(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以在雙官能脂質(zhì)的 其它端合成(E. Bayer, Μ. Maier，K. Bleicher, H. -J. Gaus Ζ. Naturforsch. 50b (1995) 671)。 通過分別省略如前文使用的第三次官能化和接頭，簡化了這樣的脂質(zhì)_修飾的根據(jù)本發(fā)明 的核酸分子的合成。對于制備，根據(jù)本發(fā)明使用的雙官能脂質(zhì)，例如聚乙二醇典型地首先用 保護(hù)基(例如DMT)單取代。在第二個階段，通常用琥珀酸酐，用DMAP催化，進(jìn)行在反應(yīng)基 保護(hù)的脂質(zhì)的酯化，從而形成琥珀酸酯。隨后，在第三個階段中，在如上定義的根據(jù)本發(fā)明 的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的合成根據(jù)如 前所述的方法發(fā)生在第四個步驟中后，所述雙官能脂質(zhì)與載體物質(zhì)偶聯(lián)并進(jìn)行去保護(hù)。接 著任選地進(jìn)行合成的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib)，(IIIa)和 /或(IIIb)任一的核酸分子的去保護(hù)和脂質(zhì)-修飾的核酸從載體物質(zhì)上的裂解。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)， (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的脂質(zhì)修飾發(fā)生在核酸的5'端。由此，脂 質(zhì)修飾典型地在提供或在合成如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子后進(jìn)行。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia),
(II),(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的提供可以如上定義，通過如上 定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia) ,(II), (IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分 子的直接合成或通過加入快速合成的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)， (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子來進(jìn)行。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)， (Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的合成優(yōu)選地類似于上述 方法，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的核酸合成的方法，更優(yōu)選地根據(jù)亞磷酰胺方法發(fā)生。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，在用于合成核酸的亞磷酰胺方法后，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的脂質(zhì) 修飾通過特定修飾的亞磷酰胺發(fā)生在根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的5'端?？赏ㄟ^合成相當(dāng)簡 單的獲得的這些amidites作為最后的單體常規(guī)偶聯(lián)于商購的或快速合成的核酸。這些反 應(yīng)由相當(dāng)快速的反應(yīng)動力學(xué)和非常高的偶聯(lián)收率區(qū)分。修飾的amidites的合成優(yōu)選地通 過亞磷酰胺，例如β-氰基乙基-單氯亞磷酰胺(磷酸單-(2-氰基乙酯)_ 二異丙基-酰 胺氯)與如上定義的脂質(zhì)的醇(溶解在適合的溶劑中，例如在無水二氯甲烷中)，例如生育 酚、膽固醇、十六烷醇、DMT-PEG等的脂質(zhì)醇反應(yīng)而進(jìn)行。同樣優(yōu)選地，將DIPEA作為酸性受 體加入反應(yīng)溶液中。用于合成5'-脂質(zhì)-修飾的根據(jù)本發(fā)明的核酸的這些亞磷酰胺對于水解具有相 對的抗性，并且可以(在合成前)通過硅膠的方式通過色譜法純化。為此目的，將少量的弱 堿，如例如三乙胺，典型地加入洗脫液中從而避免amidite的分解。該堿從產(chǎn)物中再次徹底 去除從而避免較差的偶聯(lián)產(chǎn)率是重要的。例如，這可以這樣進(jìn)行，例如通過在真空中的簡單 干燥，但是優(yōu)選地通過使用戊烷將亞磷酰胺從叔丁基甲醚中沉淀出來而純化。如果所用的 脂質(zhì)_修飾的amidites具有非常高的粘性，例如以粘性油的形式存在，還可以進(jìn)行(快速) 柱色譜法，其使用三乙胺作為堿進(jìn)行分配成為可能。然而，這樣的純化典型地不在PEG-修 飾的amidites的情形中進(jìn)行，因為它們包含酸不穩(wěn)定的DMT保護(hù)基。對于脂質(zhì)-修飾的亞磷酰胺與如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (Ha), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子的5'端的偶聯(lián)反應(yīng)，優(yōu)選地使用那些溶 劑，其中所用的amidites是充分可溶的。例如，由于根據(jù)本發(fā)明使用的amidites的高親油 性，它們在乙腈中的溶解性可以受到限制。除了典型使用的作為溶劑的乙腈之外，優(yōu)選地將 氯化烴的溶液用于偶聯(lián)反應(yīng)，例如在(無水)二氯甲烷中的0. IM溶液。然而，二氯甲烷的 應(yīng)用需要合成循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)方案的一些變化。例如，為了避免amidite沉淀在自動合成裝置 的管道中以及在載體物質(zhì)上，在實際偶聯(lián)步驟和吹干之前和之后，將與amidite接觸的所 有閥門和管道用(無水)二氯甲烷沖洗。當(dāng)使用脂質(zhì)-修飾的amidites時，典型地獲得高偶聯(lián)收率，其與常規(guī)用于現(xiàn)有技 術(shù)中的amidites的偶聯(lián)產(chǎn)率相當(dāng)。脂質(zhì)_修飾的amidites的反應(yīng)動力學(xué)通常更緩慢地進(jìn) 行。為此原因，與標(biāo)準(zhǔn)方案比較時，當(dāng)使用脂質(zhì)-修飾的amidites時，偶聯(lián)時間優(yōu)選地(明 顯地)被增長。所述偶聯(lián)時間可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。因為，可以省略在偶聯(lián) 后的加帽步驟，如果需要同樣可以用相同的脂質(zhì)_修飾的amidite進(jìn)行的另外的合成循環(huán) 從而增加反應(yīng)的總收率。在該情形中，通常不進(jìn)行去三苯甲基化步驟，例如在DMT-修飾的 脂質(zhì)如DMT-PEG的情形中。在根據(jù)本發(fā)明的5'-脂質(zhì)-修飾的核酸分子的合成中，可以將亞磷酸三酯通過 硫化劑進(jìn)行氧化，通過所述亞磷酸三酯脂質(zhì)結(jié)合于如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)， (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子。為此目的，優(yōu)選地，使用硫化 劑，其盡可能徹底地實現(xiàn)磷酸三酯的氧化。另外，硫化反應(yīng)，例如出于空間原因，可以進(jìn)行 地這樣不徹底，以至于在MON的氨性裂解和去保護(hù)后獲得僅少量的產(chǎn)物或根本沒有獲得產(chǎn) 物。這種現(xiàn)象取決于修飾的類型，所用的硫化劑和硫化條件。因此，優(yōu)選地用碘進(jìn)行氧化。 結(jié)果，盡管引入了磷酸二酯鍵，由于脂質(zhì)殘基的接近，不預(yù)期鍵作為底物被核酸酶識別。在脂質(zhì)修飾中，包含在如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子中的接頭或(雙官能)脂質(zhì)或任選地如上定義的根 據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子本身 可以如前文所述，直接地或間接地偶聯(lián)于載體物質(zhì)。直接偶聯(lián)優(yōu)選地直接地與載體物質(zhì)進(jìn) 行，而間接偶聯(lián)于載體物質(zhì)典型地通過另外的(偶聯(lián))分子進(jìn)行。通過偶聯(lián)于載體物質(zhì)形 成的結(jié)合優(yōu)選地顯示與接頭或雙官能脂質(zhì)的(可裂解)共價結(jié)合和/或與固相的(可裂 解)共價結(jié)合。適合作為(偶聯(lián))分子的化合物例如是二羧酸，例如琥珀酰殘基(=琥珀 酰錨)，草酰殘基(=草酰錨)等。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的接頭，(雙官能)脂質(zhì)或任選地核酸，例如氨基烷基殘 基(例如，氨基丙基或氨基己基殘基)，攜帶游離的氨基官能團(tuán)，所述接頭，(雙官能)脂質(zhì) 或任選地核酸可以通過苯鄰二甲酰亞胺接頭結(jié)合于載體物質(zhì)。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的 式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的包含巰基的接頭，(雙官能)脂 質(zhì)或任選地核酸可以以二硫化物的形式結(jié)合于載體物質(zhì)。在本發(fā)明的該情形中的適合的 載體物質(zhì)特別是固相如CPG, Tentagel ，氨基-官能化的PS-PEG(Tentagel S NH2)，等， 優(yōu)選地Tentagel 或氨基-官能化的PS-PEG (Tentagel S NH2)。根據(jù)特定的實施方案， 對于偶聯(lián)于載體物質(zhì)，可以將例如根據(jù)本發(fā)明使用的所述接頭或雙官能脂質(zhì)的琥珀酸酯， 與氨基-官能化的PS-PEG(Tentagel S NH2)進(jìn)行偶聯(lián)，其中優(yōu)選地用TBTU/NMM(1H-苯并 三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基尿鐺四氟硼酸酯/N-甲基嗎啉)作為偶聯(lián)劑。在常規(guī)使用 的Iymol等級的PS-PEG載體物質(zhì)的情形中，用50-100ymol/g的負(fù)荷典型地獲得最佳的 結(jié)果(E. Bayer, K. Bleicher,M. Maier Ζ. Naturforsch. 50b (1995) 1096)。然而，如果在根據(jù) 本發(fā)明的大規(guī)模等級上合成核苷酸，載體物質(zhì)的負(fù)荷優(yōu)選地是盡可能高的(> 100ymol)o 根據(jù)本發(fā)明，這樣的方法同樣導(dǎo)致良好的偶聯(lián)收率(M.Gerster，Μ. Maier，N. Clausen, J. Schewitz，E. Bayer Ζ. Naturforsch. 52b (1997) 110)。例如，可以使用載體物質(zhì)如，例如具 有多到138 μ mol/g或任選地更高負(fù)荷的樹脂，其獲得了良好的合成收率。因為用上述接頭 或雙官能脂質(zhì)獲得的偶聯(lián)收率是約100%，可以通過這些化合物的化學(xué)計量相對精確地調(diào) 整所述載體物質(zhì)的負(fù)荷。所述負(fù)荷優(yōu)選地通過裂解的DMT保護(hù)基的分光光度法量化來監(jiān)測 (見實驗部分)。仍舊存在于載體物質(zhì)上的殘余的氨基官能團(tuán)可以用乙酸酐進(jìn)行加帽。這種 加帽在通常情形下，在加載載體物質(zhì)后進(jìn)行，但是也可以直接地在核酸合成中發(fā)生，例如在 DNA合成儀中發(fā)生。對于在衍生化的PS-PEG載體物質(zhì)上的脂質(zhì)-修飾的核酸的合成，優(yōu)選 地使用特別關(guān)于Tentagel 開發(fā)的合成循環(huán)，其考慮了所述物質(zhì)的特征性性質(zhì)(E. Bayer, Μ. Maier, K.Bleicher, H. -J. Gaus Ζ. Naturforsch. 50b(1995) 671, Ε. Bayer, K. Bleicher, Μ. Maier Ζ. Naturforsch. 50b (1995) 1096.)。與標(biāo)準(zhǔn)方案相當(dāng)?shù)膬?yōu)選的變化包括·在偶聯(lián)、加帽和氧化步驟中的反應(yīng)時間增長；·去三苯甲基化步驟數(shù)量增加；·在每個步驟后的洗滌步驟加長；·在氧化步驟后使用包含抗壞血酸的洗滌溶液(0. IM 二噁烷/水=9 1)，(其 通常在amidite方法中是必需的(用于亞磷酸三酯的氧化))，以去除痕量的碘。應(yīng)該注意，修飾的性質(zhì)可以對合成循環(huán)的每個步驟具有影響。例如，在PEG15tltl-衍 生的載體物質(zhì)的情形中，觀察到相當(dāng)緩慢的反應(yīng)動力學(xué)，這需要再次加長去三苯甲基化步 驟，以及另外延長偶聯(lián)時間。所述變化和改進(jìn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的正常能力范圍內(nèi)，并且
41可以在本發(fā)明公開內(nèi)容中的任何時間進(jìn)行。使用這些這樣改進(jìn)的反應(yīng)循環(huán)，可以合成脂 質(zhì)-修飾的磷酸二酯和硫代磷酸酯。在根據(jù)本發(fā)明使用的接頭或雙官能脂質(zhì)上的amidites 的偶聯(lián)收率沒有被脂質(zhì)殘基損害，而是對應(yīng)于常規(guī)值(97-99%)。當(dāng)使用所述3'修飾時， 仍舊保留5'衍生化和引入另外的修飾(例如堿、糖或磷酸酯主鏈)的可能性。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/ 或(IIIb) 任一的核酸分子，如化學(xué)未修飾的核酸或(化學(xué))修飾的核酸，例如脂質(zhì)修飾的如上定義的 根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(Ila)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，可 以同樣地通過使如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(Ila), (lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的核酸分子與，例如但不限于陽離子聚合物，陽離子肽或多肽，優(yōu)選地與聚陽離 子聚合物如聚賴氨酸或聚精氨酸，或備選地與陽離子脂質(zhì)或lipofectants，與組蛋白，核仁 蛋白，魚精蛋白，寡核苷酸轉(zhuǎn)染(oligofectamine)，精胺或亞精胺，和陽離子多糖，特別是脫 乙酰殼多糖，TDM, MDP，胞壁酰二肽，泊洛沙姆，和/或其衍生物之一等形成復(fù)合物而得以穩(wěn) 定。組蛋白和魚精蛋白是天然包裝DNA的陽離子蛋白質(zhì)。因此，它們在體內(nèi)負(fù)責(zé)未翻譯的 DNA和某些病毒的DNA的縮合。作為可以用于本發(fā)明與如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)， (Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子形成復(fù)合物的組蛋白，可 以更特別提及組蛋白Hl，H2a，H3和H4。然而，魚精蛋白(魚精蛋白Pl或P2)或魚精蛋白 的陽離子部分序列是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的情形中，化合物可以有利地由從魚精蛋白Pl 或P2衍生的肽序列，更精確地對應(yīng)于(陽離子)序列(SRSRYYRQRQRSRRRRRR(SEQ ID NO: 109)或RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(SEQ ID NO 110)的肽序列表示。適合于與如上定義的根 據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的根據(jù)本發(fā)明的 核酸分子形成復(fù)合物的其它化合物可以選自如本文所述的佐劑化合物，但不限于此。在該情形中，“形成復(fù)合物”應(yīng)該意味著如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II), (Ila), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子與如上定義的穩(wěn)定化合物，例如 陽離子聚合物，陽離子肽或多肽，等，通過在核酸和穩(wěn)定化合物之間形成非共價復(fù)合物而結(jié) 合。在本文中，“非共價”意味著核酸和穩(wěn)定化合物之間的可逆締合通過這些分子的非共價 相互作用而形成，其中所述分子通過一些類型的電子相互作用，而非共價鍵，例如通過范德 瓦爾斯-鍵締合，所述范德瓦爾斯-鍵即由兩種分子的非特異性吸引力導(dǎo)致的弱靜電吸引。 如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的 核酸分子和穩(wěn)定化合物之間的締合與該復(fù)合物的解離平衡。不限于任何理論，預(yù)期所述平 衡在細(xì)胞內(nèi)向解離的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(Ila), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)任一的核酸分子和穩(wěn)定化合物偏向。根據(jù)一個實施方案，如果不和任何其它藥用活性成分一起施用，如上定義的根據(jù) 本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子可以是 免疫刺激劑，或如果和藥用活性成分一起施用，其可以用作佐劑，，例如作為包含藥用活性 成分和佐劑組分的組合物(例如包含特異性抗原和作為佐劑的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的 (I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的疫苗組合物)。如上定義的作為"免疫刺激劑"的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa), (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子優(yōu)選地能夠促發(fā)非抗原特異性免疫反應(yīng)(如 先天免疫系統(tǒng)提供)，優(yōu)選以免疫刺激的方式進(jìn)行。免疫反應(yīng)可以以多種方式發(fā)生。對于合
42適的免疫應(yīng)答的一個重要因素是不同T細(xì)胞亞群的刺激。T淋巴細(xì)胞典型地分化成兩種亞 群，T-輔助I(Thl)細(xì)胞和T-輔助2(Th2)細(xì)胞，免疫系統(tǒng)使用所述T-輔助I(Thl)細(xì)胞和 T-輔助2(Th2)細(xì)胞能夠破壞細(xì)胞內(nèi)(Thl)和細(xì)胞外(Th2)病原體(例如抗原)。兩種Th 細(xì)胞群區(qū)別在于由它們產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白(細(xì)胞因子)的模式。因而，Thl細(xì)胞通過巨噬細(xì)胞 和細(xì)胞毒性T-細(xì)胞的激活幫助細(xì)胞免疫應(yīng)答。相反，Th2細(xì)胞，通過刺激B-細(xì)胞轉(zhuǎn)變成漿 細(xì)胞和通過抗體(例如針對抗原)的形成來促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。所以Thl/Th2比率在免疫 應(yīng)答中非常重要。在本發(fā)明的背景中，優(yōu)選地將免疫應(yīng)答的Thl/Th2比率用免疫刺激劑來 替代，即針對細(xì)胞反應(yīng)的方向上如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)， (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，也就是說Thl應(yīng)答，并且主要的細(xì)胞免疫應(yīng)答由此 誘導(dǎo)。如上定義，本發(fā)明的核酸其自身產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答，這使得該核酸象這樣(不用 添加其它藥用活性成分)被用作免疫刺激劑。如果與其它藥用活性成分一起施用，優(yōu)選特 異性免疫刺激組分，本發(fā)明的核酸充當(dāng)佐劑，其支持由其它藥用活性成分誘發(fā)的特異性免 疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含至少一種創(chuàng)造性的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式 (I)，(Ia), (II), (IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子和任選地(相容的) 藥用載體和/或其它輔助物質(zhì)和添加劑和/或佐劑(本發(fā)明組合物的第一種實施方案)。另 外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含至少一種如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，例如一種，兩種，三種，四種，六種，七 種，或其更多核酸分子，藥用活性成分和任選地藥用載體和/或其它輔助物質(zhì)和添加劑和/ 或佐劑(本發(fā)明組合物的第二種實施方案)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物典型地包含安全和有效量的至少一種如上定義的根據(jù) 本發(fā)明的式(I)，(Ia) ,(II), (IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，或一種， 兩種，三種，四種，六種，七種，或其更多核酸分子。本文所用的"安全和有效量"意指在組 合物中如上定義的根據(jù)本發(fā)明式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任 一的每一種或全部核酸的量，其足以顯著誘導(dǎo)待治療疾病的陽性改善，所述疾病例如腫瘤， 自體免疫疾病，變應(yīng)性疾病或感染性疾病，等等。同時，不過，"安全和有效量"是足夠小以 避免嚴(yán)重的副作用，也就是說允許介于益處和危險之間的敏感關(guān)系。這些限制的確定一般 存在于敏感醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)。關(guān)于如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)， (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，“安全和有效量"的表達(dá)方式優(yōu)選地意指 適合刺激免疫系統(tǒng)的量，這種刺激是以不獲得過量或有害的免疫反應(yīng)的方式進(jìn)行的，但也 優(yōu)選沒有低于可測量水平的這種免疫反應(yīng)。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)， (IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的"安全和有效量"，將根據(jù)待治療 的特定疾病有所變化，也取決于待治療患者的年齡和身體狀況，病癥的嚴(yán)重性，治療的持續(xù) 時間，伴隨性治療的性質(zhì)，所用的特定藥用載體，和類似的因素，在相關(guān)醫(yī)生的知識和經(jīng)驗 范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)本發(fā)明用于人，并且也可以用于獸醫(yī)療目的。根據(jù)第一個實施方案，上述如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)， (lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，其自身可以是免疫刺激劑(不用添加任何其 它藥用活性成分)。如果如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa) 和/或(IIIb)任一的核酸分子包含脂質(zhì)修飾的話，這特別適用。脂質(zhì)可以進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明的核酸的免疫刺激特性或者可以良好地形成治療活性的分子，如，例如，維生素，或類固 醇，如上所述，例如α -生育酚(維生素Ε)，D- α -生育酚，L- α -生育酚，D，L- α -生育酚， 維生素E琥珀酸酯(VES)，維生素A及其衍生物，維生素D及其衍生物，維生素K及其衍生
物，等等。根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方案的藥物組合物可以包含(除了如上定義的根據(jù)本 發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的至少一 種之外)至少一種另外的藥用活性成分。在此背景中藥用活性成分是具有針對特定適應(yīng) 癥的治療作用的化合物，所述適應(yīng)癥優(yōu)選地是癌癥疾病，自體免疫疾病，變應(yīng)性或感染性疾 病。所述化合物包括，但不限于，肽，蛋白質(zhì)，核酸，(治療活性的)低分子量有機(jī)或無機(jī)化 合物(小于5000的分子量，優(yōu)選地小于1000)，糖，抗原或抗體，現(xiàn)有技術(shù)中已知的治療劑， 抗原性細(xì)胞，抗原性細(xì)胞片段，細(xì)胞級分；經(jīng)修飾的，減毒的或失活的(例如通過化學(xué)手段 或通過刺激)病原體(病毒，細(xì)菌等)等。根據(jù)(根據(jù)本發(fā)明的組合物)第二個實施方案的第一種備選，包含在藥物組合物 中的藥用活性成分是免疫調(diào)節(jié)組分，優(yōu)選是免疫刺激性組分。最優(yōu)選地所述藥用活性成分 是抗原或免疫原。“抗原"和"免疫原"應(yīng)理解為是任何能夠帶來抗體形成和/或細(xì)胞免 疫應(yīng)答的激活的任何結(jié)構(gòu)，所述免疫應(yīng)答即特異性(并且不是輔助)免疫應(yīng)答。所以，根據(jù) 本發(fā)明，術(shù)語"抗原"和"免疫原"被同義使用?？乖膶嵗请模嚯?，即蛋白質(zhì)，細(xì)胞， 細(xì)胞提取物，多糖，多糖綴合物，脂質(zhì)，糖脂和碳水化合物。作為抗原，可以考慮例如，腫瘤抗 原，動物，草藥，病毒，細(xì)菌，真菌和原生動物抗原，自身免疫抗原或變應(yīng)原。優(yōu)選腫瘤細(xì)胞的 表面抗原和病毒，細(xì)菌，真菌和原生動物病原體的表面抗原，特別是分泌型形式的。當(dāng)然，所 述抗原可以存在于，例如根據(jù)本發(fā)明的疫苗中，還可以作為偶聯(lián)到合適載體上的半抗原。還 可以使用其它抗原性組分，例如失活的或減毒的病原體(如上所述)。抗原性(多)肽包括所有已知的抗原性肽，例如腫瘤抗原，等。腫瘤抗原的具 體實例特別是腫瘤特異性表面抗原(TSSAs)，例如5T4，707-AP，9D7，AFP，AlbZIP HPGl, α-5-β-1-整聯(lián)蛋白，α-5-β-6-整聯(lián)蛋白，α-輔肌動蛋白-4/m，α -甲基?；?輔酶A 消旋酶，ART-4，ARTCl/m, B7H4, BAGE-I，BCL-2, bcr/abl, β -連環(huán)蛋白 /m，BING-4，BRCAl/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29，CA 19-9，CA72-4，CA125，鈣網(wǎng)織蛋白，CAMEL，CASP-8/m，組織 蛋白酶 B，組織蛋白酶 L，CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m，毛狀蛋白(coactosin)-樣 蛋白，collage XXIII，C0X-2，CT-9/BRD6，Cten，細(xì)胞周期蛋白 Bi，細(xì)胞周期蛋白 Dl,cyp-B, CYPBl，DAM-10, DAM-6，DEK-CAN，EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3,ETV6-AML1,EZH2,FGF-5,FN,Frau-1，G250，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5， GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8，GDEP，GnT-V，gplOO, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, h印sin( —禾中 絲氨酸蛋白酶)，Her2/neu，HERV-K-MEL, HLA_A*0201-R17I，HLA-All/m，HLA_A2/m，HNE,同 源框 NKX3. 1，HOM-TES-14/SCP-l, H0M-TES-85，HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE，IGF-1R，IL-13Ra2, IL-2R，IL-5，未成熟層粘連蛋白受體，激肽釋放酶-2，激肽釋放 酶-4， Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-Al, LDLR-FUT, MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-Al2, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-Cl, MAGE-C2,
44MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-Fl, MAGE-Hl, MAGEL2，乳腺 珠蛋白(mammaglobin)A，MART-1/me 1 an-A，MART-2, MART-2/m，基質(zhì)蛋白 22，MC1R, M-CSF, MEl/m，間皮素(mesothelin)，MG50/PXDN, MMPl 1, MN/CA IX-抗原，MRP-3，MUC-I, MUC-2， MUM-l/m, MUM-2/m, MUM-3/m, I類肌球蛋白/m，NA88-A, N-乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶-V， Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, ΝΜΡ22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-I, NY-ESO-B, OAl, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, 0S-9，0S_9/m，鮭魚降鈣素注射劑，骨橋蛋白，pl5，pl90 較小 bcr-abl，p53，p53/m, PAGE-4，PAI-1，PAI-2，PART-I, PATE, PDEF，Pim-I-激酶，Pin-l,Pml/ PARa，POTE, PRAME, PRDX5/m，前列腺癌相關(guān)抗原(prostein)，蛋白酶-3，PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RUl，RU2, S—100，SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Spl7, SSX-I, SSX-2/H0M-MEL-40, SSX-4，STAMP-1, STEAP，存 活素，存活素-2B，SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF β，TGF β RII， TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-I, TRP_2/6b，TRP/INT2, TRP-p8,酪氨酸酶，UPA，VEGF, VEGFR-2/FLK-1，和WTl。任何類別的腫瘤抗原都適于本發(fā)明的目的，例如已知涉及新血管生 成，涉及影響細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)等的腫瘤抗原。腫瘤抗原可以在藥物組合物中作為蛋白質(zhì)或 肽抗原或作為編碼腫瘤抗原或其表位的mRNA或DNA而被提供，優(yōu)選以上腫瘤抗原。通過第二個實施方案(關(guān)于包含本發(fā)明的核酸(作為佐劑)和另外的藥用活性成 分的根據(jù)本發(fā)明的組合物)的第二個備選，所述藥用活性成分是抗體。在該情形中，可以使 用任何在治療上適合的抗體。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選針對在癌癥疾病或感染性疾病中發(fā)揮重 要作用的抗原，蛋白質(zhì)或核酸的抗體，例如細(xì)胞表面蛋白，腫瘤抑制基因或其抑制劑，生長 因子和延長因子，凋亡相關(guān)蛋白，腫瘤抗原，或如前文所述抗原，等等。根據(jù)第二個實施方案的第三個備選，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中包含的藥用活性 成分是核酸。這種核酸可以是單鏈或雙鏈并且可以是同型或異型雙鏈體的形式并且還是線 狀或環(huán)狀形式。作為藥用活性成分包含在藥物組合物中的核酸在其長度方面并不限制并且 可以包含任何天然存在的核酸序列或其互補(bǔ)體或其片段。同樣地，在該情形中所用的核酸 可以是部分或完全合成的性質(zhì)。例如，該核酸可以包括編碼(治療上相關(guān)的)蛋白和/或 能夠帶來免疫反應(yīng)的核酸，例如抗原或編碼抗原的核酸。在此抗原優(yōu)選如前文所述的抗原。優(yōu)選地作為藥用活性成分包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的核酸是mRNA。可以 將這種mRNA以其裸露形式加入到根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中，或以穩(wěn)定化的形式存在，這 種形式減弱或甚至阻止核酸在體內(nèi)降解，例如，通過核酸外切酶和/或核酸內(nèi)切酶阻止。例如，作為藥用活性成分包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的mRNA可以通過以 上定義的5'帽加以穩(wěn)定化，備選地或另外地通過3'端的聚腺苷酸尾和/或聚C尾加以 穩(wěn)定化，其至少是50個核苷酸，優(yōu)選地至少70個核苷酸，更優(yōu)選地至少100個核苷酸，特 別地優(yōu)選地至少200個核苷酸。正如已經(jīng)提到的，末端結(jié)構(gòu)在體內(nèi)非常重要。通過這些結(jié) 構(gòu)RNA被識別為mRNA并且降解得以被調(diào)節(jié)。此外，然而，存在穩(wěn)定RNA或使RNA去穩(wěn)定的 另外的方法。這些方法中的許多仍舊是未知的，但是在RNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用通常 因此是決定性的。例如最近已經(jīng)描述了 “mRNA監(jiān)督系統(tǒng)”(Hellerin和Parker，Ann. Rev. Genet. 1999，33 :229_260)，其中不完全或無義mRNA由細(xì)胞溶質(zhì)中的特定反饋蛋白相互作 用識別，并且易于降解，這些方法的大部分由核酸外切酶進(jìn)行。包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中，作為藥用活性成分的mRNA的穩(wěn)定可以同樣地通過使mRNA與陽離子化合物，特別的聚陽離子化合物，例如，(聚)陽離子肽或蛋白締合 或復(fù)合，或?qū)⑵浣Y(jié)合于所述聚陽離子化合物來進(jìn)行。具體地，將魚精蛋白，核仁蛋白，精胺 或亞精胺用作聚陽離子(核酸結(jié)合)蛋白是特別有效的。另外，其它陽離子肽或蛋白質(zhì)，如 聚-L-賴氨酸或組蛋白同樣是可以的。在EP-A-1083232中描述了用于穩(wěn)定mRNA的這種方 法，將其公開內(nèi)容全文結(jié)合在本發(fā)明中作為參考?？梢杂糜诜€(wěn)定作為藥用活性成分存在的 mRNA的另外的優(yōu)選的陽離子物質(zhì)包括本文關(guān)于佐劑公開的陽離子化合物，其適合于本發(fā)明 核酸的貯存和遞送，例如陽離子多糖，例如脫乙酰殼多糖，1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一亞甲 基聚甲溴化物，聚乙烯亞胺(PEI)或聚-L-賴氨酸(PLL)，等。除了以佐劑形式存在的脂 質(zhì)-修飾的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子在提 高細(xì)胞滲透性方面的作用(這已經(jīng)是有利的)之外，mRNA與陽離子化合物，例如陽離子蛋 白質(zhì)或陽離子脂質(zhì)，例如作為基于脂質(zhì)的復(fù)合劑的寡核苷酸轉(zhuǎn)染優(yōu)選地增加作為藥用活性 成分存在的mRNA向待治療的細(xì)胞或向待治療的生物中的轉(zhuǎn)移。關(guān)于本發(fā)明核酸分子通過 復(fù)合的穩(wěn)定作用也參見本文的披露內(nèi)容，所述復(fù)合作用也帶來mRNA的穩(wěn)定等。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中將mRNA作為藥用活性成分加以穩(wěn)定的其它方法是 通過除去或改變所謂的去穩(wěn)定序列元件(DSEs)進(jìn)行mRNA的序列的靶向改變。信號蛋白能 夠結(jié)合到這些去穩(wěn)定序列元件(DSEs)上，其特別存在于真核mRNA中，并調(diào)節(jié)體內(nèi)mRNA的 酶降解。所以，為了進(jìn)一步穩(wěn)定作為藥用活性成分存在的mRNA，優(yōu)選與野生型mRNA的相應(yīng) 區(qū)域相比進(jìn)行一個或多個變化，從而不存在去穩(wěn)定序列元件。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明同樣優(yōu)選從 mRNA上消除DSEs，所述DSEs任選地存在于非翻譯區(qū)(3 ‘-和/或5 ‘ -UTR)。以上DSEs 的實例是富含AU序列(“AURES “)，其存在于多種不穩(wěn)定mRNAs的3 ‘ -UTR部分(Caput 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)1986,83 1670-1674)。所以用作藥 用活性成分的mRNA優(yōu)選地是與野生型mRNA相比經(jīng)修飾的，所述修飾是以這樣的方式進(jìn)行 的，即它不包含任何這種去穩(wěn)定序列。對于被可能的核酸內(nèi)切酶識別的那些序列基序也是 正確的，所述基序例如序列GAACAAG，其包含在編碼運鐵蛋白受體的基因的3 ‘ -UTR片段中 (Binder等，EMBO J. 1994，13 =1969-1980) 0還優(yōu)選從脂質(zhì)修飾的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子中 消除這樣的序列基序。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中作為藥用活性成分的mRNA可以進(jìn)一步加以修飾， 例如為了進(jìn)行所需的有效翻譯，其方式是核糖體有效結(jié)合到核糖體結(jié)合位點(Kozak序列 GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO 111)，AUG形成起始密碼子)。已經(jīng)注意到在此背景下提高這一 位置周圍的A/U含量允許核糖體更有效地結(jié)合到mRNA上。另外，有可能將一個或多個所謂的IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點)(序列)引入到 用作藥用活性成分的mRNA中。因而IRES可以充當(dāng)唯一的核糖體結(jié)合位點，但是它還可以 作用來提供編碼多種肽或多肽的mRNA，所述肽或多肽由核糖體彼此獨立翻譯(“多順反子 mRNA")。根據(jù)本發(fā)明可以使用的IRES序列的實例是來自小RNA病毒(例如FMDV)，瘟疫 病毒(CFFV)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)，腦心肌炎病毒(ECMV)，口蹄疫病毒(FMDV)，丙型肝炎病 毒(HCV)，常規(guī)豬霍亂病毒(CSFV)，豬白血病病毒(MLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻 痹病毒(CrPV)的序列。同樣地在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中任選地用作藥用活性成分的mRNA可以在其 5'-和/或3'-非翻譯區(qū)中包含穩(wěn)定序列，所述穩(wěn)定序列能夠提高mRNA在細(xì)胞溶質(zhì)中的
46半衰期。這些穩(wěn)定序列可以顯示與存在于病毒、細(xì)菌和真核生物中的天然存在序列100% 的序列同源性，但是它們還可以是部分或全部合成性質(zhì)的。作為可以用在本發(fā)明中的穩(wěn)定 序列的實例可以提及β-珠蛋白基因的非翻譯序列(UTR)，例如人(Homo sapiens)或非 洲爪蛙(Xenopus laevis)的序列。穩(wěn)定序列的另一個實例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A) PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO :112)，其包含在編碼α -珠蛋白，α-(I)-膠原，15-脂肪加氧酶或 酪氨酸“羥化酶的非常穩(wěn)定的mRNA的3' -UTR中(見Holclik等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997,94:2410-2414)。當(dāng)然，這種穩(wěn)定序列可以個別使用或結(jié)合另一種使用以及結(jié)合 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它穩(wěn)定序列使用。 為了進(jìn)一步增強(qiáng)最終所需的翻譯，作為藥用活性成分使用的mRNA與相應(yīng)野生型 mRNA相比能夠顯示下列修飾，該修飾可以作為備選物存在或彼此結(jié)合存在。一方面，編碼肽 或多肽的修飾的mRNA區(qū)域的G/C含量可以比編碼肽或多肽的野生型mRNA的編碼區(qū)的G/C 含量更高，與野生型相比氨基酸序列編碼未修飾。這種修飾是基于這種事實，即對于mRNA 的有效翻譯來說，mRNA的這種穩(wěn)定性是關(guān)鍵的。各種核苷酸的組分和序列由此發(fā)揮很大作 用。特別地，具有增加的G(鳥苷(鳥嘌呤))/C(胞苷(胞嘧啶))含量的序列比具有增加的 A(腺苷(腺嘌呤))/U(尿苷(尿嘧啶))含量的序列更加穩(wěn)定。所以，根據(jù)本發(fā)明，盡管保 留翻譯的氨基酸序列，但密碼子與野生型mRNA相比是變化的，所述變化是以它們包含更多 G/C核苷酸的方式進(jìn)行的。因為幾種密碼子編碼相同的氨基酸(遺傳密碼子的簡并性)可 以確定有益于穩(wěn)定性的密碼子(選擇性密碼子的用法)。取決于mRNA所編碼的氨基酸，與 野生型序列相比mRNA序列修飾的不同可能性是可以的。對于由只包含G或C核苷酸的密 碼子所編碼的氨基酸的情形，沒有密碼子的修飾是必需的。因此，Pro (CCC或CCG) ,Arg(CGC 或CGG)，Al a (GCC或GCG)和Gly (GGC或GGG)的密碼子并不需要任何變化，因為并不存在A 或U。在下列情形中，通過取代編碼相同氨基酸但不包含A和/或U的不同密碼子來改變包 含A和/或U核苷酸的密碼子。實例是Pro的密碼子可以由CCU或CCA改變至CCC或CCG ； Arg的密碼子可以由CGU或CGA或AGA或AGG改變?yōu)镃GC或CGG ；Ala的密碼子可以由GCU 或GCA改變至GCC或GCG ；Gly的密碼子可以由GGU或GGA改變至GGC或GGG。在其它情形 中，盡管A和U核苷酸不能從密碼子中消除，但有可能通過使用包含較少A和/或U核苷酸 的密碼子來減少A和U含量。例如Phe的密碼子可以由UUU改變至UUC ；Leu的密碼子可以 由UUA，CUU或CUA改變至CUC或CUG ；Ser的密碼子可以由UCU或UCA或AGU改變至UCC， UCG或AGC ；Tyr的密碼子可以由UAU改變至UAC ；終止密碼子UAA可以改變至UAG或UGA ； Cys的密碼子可以由UGU改變至UGC ；His的密碼子可以由CAU改變至CAC ；Gln的密碼子可 以由CAA改變至CAG ； IIe的密碼子可以由AUU或AUA改變至AUC ；Thr的密碼子可以由A⑶ 或ACA改變至ACC或ACG ；Asn的密碼子可以由AAU改變至AAC ；Lys的密碼子可以由AAA改 變至AAG ；Val的密碼子可以由GUU或GUA改變至⑶C或GUG ；Asp的密碼子可以由GAU改變 至GAC ；Glu的密碼子可以由GAA改變至GAG。另一方面，對于Met (AUG)和Trp (UGG)的密 碼子的情形，沒有序列修飾的可能性。以上列出的取代當(dāng)然可能個別使用，但也可以進(jìn)行所 有可能的組合來與原始序列相比提高修飾mRNA的G/C含量。因而，例如，所有存在于原始 (野生型)序列中的Thr的密碼子都可以改變至ACC(或ACG)。不過，優(yōu)選地，使用以上取 代可能性的組合，例如在原始序列中編碼Thr的所有密碼子取代為ACC(或ACG)和原始編 碼Ser的所有密碼子都取代為UCC(或UCG或AGC)；在原始序列中編碼Ile的所有密碼子取代為AUC和原始編碼Lys的所有密碼子都取代為AAG和原始編碼Tyr的所有密碼子都取代 為UAC ；在原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC(或GUG)和原始編碼Glu的所有 密碼子都取代為GAG和原始編碼Ala的所有密碼子都取代為GCC (或GCG)和原始編碼Arg 的所有密碼子都取代為CGC (或CGG)；在原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或 GUG)和原始編碼Glu的所有密碼子都取代為GAG和原始編碼Ala的所有密碼子都取代為 GCC (或GCG)和原始編碼Gly的所有密碼子都取代為GGC (或GGG)和原始編碼Asn的所有 密碼子都取代為AAC ；在原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和原始編 碼Phe的所有密碼子都取代為UUC和原始編碼Cys的所有密碼子都取代為UGC和原始編碼 Leu的所有密碼子都取代為CUG (或CUC)和原始編碼Gln的所有密碼子都取代為CAG和原 始編碼Pro的所有密碼子都取代為CCC(或CCG)；等。與編碼相應(yīng)肽或多肽的野生型mRNA 的編碼區(qū)的G/C含量相比，優(yōu)選地編碼肽或多肽的mRNA的區(qū)域(或任選地存在的每一個其 它片段)的G/C含量提高了至少7%個點，更優(yōu)選地提高了至少15%個點，特別地優(yōu)選地提 高了至少20%個點，并且優(yōu)選地至少50%，更優(yōu)選地至少70%和最優(yōu)選地至少90%。在此 背景下特別優(yōu)選與野生型序列相比將如此修飾的mRNA的G/C含量提高至最大可能的程度。在藥物組合物中用作藥用活性成分的mRNA的另外優(yōu)選的修飾基于這樣的發(fā)現(xiàn)， 即翻譯效率也通過tRNAs在細(xì)胞中存在的不同頻率來確定。因此，如果所謂的“稀有”密碼 子以增加的數(shù)量存在于RNA序列中，那么在其中存在編碼相對“頻繁的” tRNAs的密碼子的 情形中，相應(yīng)的mRNA顯著更差地進(jìn)行翻譯。因此，根據(jù)本發(fā)明，與野生型mRNA的相應(yīng)區(qū)域 比較，用作藥用活性成分的mRNA中的編碼區(qū)以這樣的方式進(jìn)行修飾，即在所述細(xì)胞中編碼 相對稀有tRNA的野生型序列的至少一種密碼子由在細(xì)胞中編碼相對頻繁的tRNA的密碼子 取代，其攜帶與相對稀有的tRNA相同的氨基酸。通過這種修飾，所述RNA序列被這樣修飾 以致于將密碼子引入，對此其可獲得頻繁存在的tRNAs。在細(xì)胞中相對頻繁地存在的并且通 過比較是相對稀有的tRNAs是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的；見例如Akashi，Curr. Opin. Genet. Dev. 2001,11(6) :660_666。通過這種修飾，可以根據(jù)本發(fā)明用編碼細(xì)胞中相對頻繁的tRNA 的密碼子取代細(xì)胞中編碼相對稀有的tRNA的野生型序列的所有密碼子，其攜帶與相對稀 有的tRNA相同的氨基酸。特別優(yōu)選將如上所述的mRNA中的增加的，特別是最大的連續(xù)G/ C含量與“頻繁的”密碼子組合，而不會改變由mRNA的編碼區(qū)編碼的抗原肽或多肽(一種或 多種)的氨基酸序列。如上列出可以由G/C富集的/優(yōu)化的mRNA編碼的優(yōu)選抗原。根據(jù)第二個實施方案(對于本發(fā)明的組合物)的第四個備選，包含在根據(jù)本發(fā)明 的藥物組合物中作為藥用活性成分的核酸是dsRNA，優(yōu)選地siRNA。關(guān)于RNA干擾現(xiàn)象， dsRNA，或siRNA特別令人感興趣。在免疫學(xué)研究過程中，RNA干擾的現(xiàn)象引起了關(guān)注。近 年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了基于RNA的防御機(jī)制，其存在于真菌王國和植物和動物王國中，并且作 為“基因組的免疫系統(tǒng)”起作用。在可以將所述方法的潛在機(jī)制鑒定為相同的之前，所述 系統(tǒng)最初在各個物種中彼此獨立地描述，首先在秀麗線蟲(C.elegans)中描述在植物中 的RNA介導(dǎo)的病毒抗性，在植物中的PTGS (翻譯后基因沉默)，和在真核生物中的RNA干 擾相應(yīng)地基于共同的程序。RNA干擾(RNAi)的體外技術(shù)基于雙鏈RNA分子(dsRNA)，其 引發(fā)序列特異性的對基因表達(dá)的抑制(Zamore (2001) Nat. Struct. Biol.(自然結(jié)構(gòu)生物 學(xué))9 746-750 ；Sharp (2001)Genes Dev.(基因遞送)5 485-490 =Hannon(2002)Nature (自 然)41 :244-251)。在用長dsRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞中，蛋白激酶R和RnaseL的激活導(dǎo)致非特異性的作用，如例如干擾素反應(yīng)(Stark等(1998)Annu. Rev. Biochem.(生物化學(xué)年 if)67:227-264;He*Katze(2002)Viral Immunol.(病毒免疫學(xué))15 :95_119)。當(dāng)使用更 短的，例如21-23 mer的所謂siRNA(小干擾RNA)，可以避免這些非特異性的作用，因為短于 30bp 的 siRNA 不能引發(fā)非特異性作用(Elbashir 等(2001)Nature (自然)411 :494_498)。 最近，已將 dsRNA 分子體內(nèi)應(yīng)用(McCaffrey 等(2002)，Nature (自然)418:38-39 ；Xia 等 (2002) ,Nature Biotech.(自然生物技術(shù))20 :1006_1010 ；BrummeIkamp 等(2002)，Cancer Cell (癌癥細(xì)胞)2 :243-247)。因此，最終在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中用作藥用活性成分的雙鏈RNA(dsRNA) 優(yōu)選地包含具有一般結(jié)構(gòu)5' -(N17^29)-3'的序列，其中N是任何堿基并且代表核苷酸。一 般結(jié)構(gòu)由具有核糖核苷酸組成的大分子的雙鏈RNA，包含戊糖(核糖或脫氧核糖)的核糖核 苷酸，有機(jī)堿和磷酸酯(鹽)組成。在本文的RNA中的有機(jī)堿包含嘌呤堿腺苷(腺嘌呤)(A) 和鳥苷(鳥嘌呤)(G)和嘧啶堿胞苷(胞嘧啶)(C)和尿苷(尿嘧啶)(U)。在根據(jù)本發(fā)明的藥 物組合物中最終用作藥用活性成分的dsRNA包含具有定向結(jié)構(gòu)的這樣的核苷酸或核苷酸 類似物。用作根據(jù)本發(fā)明的藥用活性成分的dsRNAs優(yōu)選地具有一般結(jié)構(gòu)5' -(N19^25)-3'， 更優(yōu)選地5' -(N19^24)-3'，更優(yōu)選地5' -(N21^23)-3'，其中N是任何堿基。優(yōu)選地至少 90%，更優(yōu)選地95%和尤其優(yōu)選地100%的用作藥用活性成分的dsRNA核苷酸與前文所述 的(治療相關(guān))蛋白或抗原(作為藥用活性成分)的(m)RNA序列的部分互補(bǔ)。90%互補(bǔ) 意為對于例如長度為20個核苷酸的根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA，其包含不超過2個這樣的核 苷酸，所述核苷酸與(m)RNA的相應(yīng)部分沒有相應(yīng)的互補(bǔ)性。然而，任選地用于根據(jù)本發(fā)明 的藥物組合物的雙鏈RNA的序列，優(yōu)選地在其一般結(jié)構(gòu)中完全互補(bǔ)于如前所述的作為藥用 活性成分的蛋白或抗原的(m)RNA的部分。原則上，存在于(m)RNA編碼區(qū)中所有的長度為17-29，優(yōu)選地19-25個堿基對部分 可以作為dsRNA的靶序列，所述dsRNA最終將用作根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的藥用活性 成分。同樣地，還可以將用作藥用活性成分的dsRNAs針對前文所述的(治療相關(guān))蛋白或 抗原(作為藥用活性成分)的核苷酸序列，其不位于(m)RNA的編碼區(qū)內(nèi)，特別是在5'非編 碼區(qū)內(nèi)，例如因此針對具有調(diào)節(jié)功能的(m)RNA的非編碼區(qū)。因此，用作前文所述的蛋白或 抗原的藥用活性成分的dsRNA的靶序列可以位于(m)RNA的翻譯區(qū)和非翻譯區(qū)和/或在控 制元件的區(qū)域中。用作根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的藥用活性成分的dsRNA的靶序列也可 以位于非翻譯序列和翻譯序列的重疊區(qū)域中；特別地，所述靶序列可以包含位于(m)RNA的 編碼區(qū)的起始三聯(lián)體上游的至少一種核苷酸。修飾的核苷酸可以優(yōu)選地存在于最終用作根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的藥用活 性成分的dsRNA中。表述“修飾的核苷酸”根據(jù)本發(fā)明意為目的核苷酸已經(jīng)經(jīng)過化學(xué)修飾。 通過表述“化學(xué)修飾”，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解與天然存在的核苷酸相比，通過取代、添加或去 除一個或多個原子或原子基團(tuán)，修飾的核苷酸已經(jīng)被改變。在根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA中 的至少一種修飾的核苷酸一方面是為了穩(wěn)定性，而另一方面是為了防止解離。優(yōu)選地，已經(jīng) 修飾在根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA中的2-10個，和更優(yōu)選地2-5個核苷酸。有利地，在雙鏈 結(jié)構(gòu)中的dsRNA的核苷酸的至少一個2'-羥基基團(tuán)已經(jīng)被化學(xué)基團(tuán)(優(yōu)選2'-氨基或 2' _甲基)所取代。在所述雙鏈結(jié)構(gòu)的至少一條鏈中的至少一個核苷酸也可以是具有糖 環(huán)的所謂的“鎖定核苷酸”，所述糖環(huán)已經(jīng)經(jīng)過化學(xué)修飾，優(yōu)選地通過2' -0,4' -C-亞甲基
49橋進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA的一些核苷酸有利的是鎖定的核苷酸。而且，通過修飾 根據(jù)本發(fā)明的dsRNA的主鏈，可以防止其過早的降解。在該情形下，特別優(yōu)選已經(jīng)以硫代硫 酸酯，2' -0-甲基-RNA，LNA, LNA/DNA gapmers等形式進(jìn)行修飾并因此具有更長的體內(nèi)半 衰期的dsRNA。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中用作藥用活性成分的雙鏈RNA(dsRNA)的末端可以 優(yōu)選地進(jìn)行修飾從而消除細(xì)胞中的降解或解離成單鏈，特別是為了避免由核酸酶造成的過 早降解。特別當(dāng)使用其低濃度或短鏈長度時，發(fā)生dsRNA各個鏈的正常情況不合乎需要的 解離。為了特別有效的抑制解離，由根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸對所實 現(xiàn)的內(nèi)聚力可以由至少一個，優(yōu)選地超過一個化學(xué)鍵增加。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中 用作藥用活性成分的dsRNA(其解離已經(jīng)被減少)具有針對在細(xì)胞或在生物(體內(nèi))或離 體中的酶促和化學(xué)降解的更高的穩(wěn)定性并因此具有更長的半衰期。防止根據(jù)本發(fā)明使用的 dsRNA在細(xì)胞中過早解離的另外的可能性存在于在所述鏈的每一端形成發(fā)夾環(huán)。在特定實 施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中所用的dsRNA因此具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)從而減緩解離動 力學(xué)。在這樣的結(jié)構(gòu)中，環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選地在5'和/或3'端形成。所述環(huán)結(jié)構(gòu)不具有氫橋接， 并典型地因此在核苷酸堿基之間不存在互補(bǔ)性。典型地，這樣的環(huán)具有至少5個，優(yōu)選地至 少7個核苷酸的環(huán)，并且以該方式連接根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA的兩條互補(bǔ)的個體鏈。為 了防止鏈的解離，根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA的兩條鏈的核苷酸可以同樣優(yōu)選地這樣修飾從 而獲得氫橋鍵的加強(qiáng)，例如通過任選地修飾的核苷酸增加在堿基之間的氫橋鍵合能力。作 為結(jié)果，增加了在所述鏈之間的相互作用的穩(wěn)定性，并且dsRNA被保護(hù)免于RNA酶的攻擊。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中用作藥用活性成分的 dsRNA針對如前文所述的蛋白或抗原的(m)RNA。所用的dsRNA由此優(yōu)選地抑制細(xì)胞中的上 述蛋白或抗原的翻譯達(dá)至少50 %，更優(yōu)選地60 %，更優(yōu)選地70 %和最優(yōu)選地至少90 %的程 度，即所述細(xì)胞優(yōu)選地包含不超過天然存在的(沒有用根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA處理)的 上述蛋白或抗原的細(xì)胞濃度的一半。在加入根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA分子后，對細(xì)胞中這 些蛋白或抗原的翻譯的抑制是基于由所述分子造成的RNA干擾的現(xiàn)象。根據(jù)本發(fā)明使用的 dsRNA是這樣的siRNA，其引發(fā)RNA干擾的現(xiàn)象，并且可以結(jié)合上述蛋白或抗原的(m)RNA。 測量或顯示細(xì)胞中由根據(jù)本發(fā)明使用的dsRNA引發(fā)的翻譯抑制可以通過RNA印跡、定量實 時PCR或在蛋白水平，用針對上述蛋白或抗原的特異性抗體進(jìn)行。最終在根據(jù)本發(fā)明的藥 物組合物中用作藥用活性成分的dsRNA，和相應(yīng)的siRNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方法進(jìn)行制備。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物(根據(jù)第一或第二個實施方案)典型地包含(相容性 的)藥用載體。用于本文時，表述“(相容的)藥用載體”優(yōu)選地包括所述組合物的液體或 非液體基礎(chǔ)。用于本文時，術(shù)語“相容的”意為藥物組合物的成分能夠與藥用活性成分，與 象這樣作為免疫刺激劑或作為佐劑的本發(fā)明的核酸，和與一種另外的成分以這樣的方式混 合，即不存在這樣的相互作用，所述相互作用會在正常使用條件下，減少組合物的藥物有效 性。當(dāng)然，藥用載體必需具有足夠高的純度和足夠低的毒性從而使它們適合施用于待治療 的人。如果所述組合物以液體形式提供，所述藥用載體將典型地包含一種或多種(相 容)藥用液體載體。所述組合物可以包含例如無熱原的水；等滲鹽水或緩沖(水性)溶
50液，例如磷酸鹽，檸檬酸鹽等緩沖溶液，植物油，如例如，花生油，棉子油，芝麻油，橄欖油，玉 米油和來自梧桐科植物(theobroma)的油；多元醇如，例如聚丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露 醇和聚乙二醇；海藻酸等作為(相容性)藥用液體載體。特別地，對于本發(fā)明的藥物組合 物的注射，可以使用緩沖液，優(yōu)選水性緩沖液，所述緩沖液包含鈉鹽，優(yōu)選地至少50mM的鈉 鹽，鈣鹽，優(yōu)選地至少0，OlmM鈣鹽，和任選地鉀鹽，優(yōu)選地至少3mM鉀鹽。根據(jù)優(yōu)選的實施 方案，所述鈉鹽，鈣鹽和任選地，鉀鹽可以以它們的鹵化物(例如氯化物，碘化物或溴化物) 的形式存在，以它們的氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽或硫酸鹽等形式存在。不限于此，鈉鹽的 實例包括例如NaCl，NaI，NaBr，Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4,任選的鉀鹽的實例包括例如KCl，KI， KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4,并且鈣鹽的實例包括例如 CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca (OH) 2。 另外，前述陽離子的有機(jī)陰離子可以包含在緩沖液中。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，適合用于如 上定義的注射目的的緩沖液可以包含選自氯化鈉(NaCl)，氯化鈣(CaCl2)和任選地氯化鉀 (KCl)的鹽，其中除了氯化物之外，可以存在另外的陰離子。典型地，在注射緩沖液中的鹽 以至少50mM氯化鈉(NaCl)，至少3mM氯化鉀(KCl)和至少0，OlmM氯化鈣(CaCl2)的濃度 存在。所述注射緩沖液可以是參照具體參照介質(zhì)高滲、等滲或低滲的，即參照特定的參照介 質(zhì)所述緩沖液可以具有更高，相同或更低的鹽含量，其中優(yōu)選地，可以使用前述鹽的所述濃 度，所述濃度不會由于滲透性或其它濃度作用導(dǎo)致對細(xì)胞的損傷。參照介質(zhì)在“體內(nèi)”方法 中，例如是存在的液體如血液，淋巴，細(xì)胞溶質(zhì)液體，或其它體液，或例如這樣的液體，其可 以在“體外”方法中，用作參照介質(zhì)，如常規(guī)緩沖液或液體。所述常見的緩沖液或液體是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。特別優(yōu)選將林格氏_乳酸溶液作為液體基礎(chǔ)。如果所述組合物以固體形式提供，所述藥用載體典型地包含一種或多種(相容) 藥用固體載體。所述組合物還可以包含例如一種或多種相容的固體或液體填充劑或稀釋劑 作為(相容的)藥用固體載體，或還可以使用包封化合物，其適合于施用于人。所述(相容) 藥用固體載體的一些實例例如是糖，如例如，乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如例如，玉米淀粉或 馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，如例如，羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素，醋酸纖維素；粉末 狀的黃蓍樹膠；麥芽；明膠；牛油；固體助流劑，如，例如，硬脂酸，硬脂酸鎂；硫酸鈣，等。對(相容性)藥用載體的選擇主要由施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方式確定。 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物例如以系統(tǒng)內(nèi)的方式進(jìn)行。用于施用的路徑包括，例如口服、皮 下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、肺內(nèi)、腹膜 內(nèi)、心內(nèi)、動脈內(nèi)和舌下局部和/或鼻內(nèi)途徑。待用的藥物組合物的適合的量可以通過用動 物模型進(jìn)行的常規(guī)實驗確定。所述模型包括，但不限于，兔、羊、小鼠、大鼠、狗和非人靈長 類動物模型。用于注射的優(yōu)選單位劑型包括無菌水溶液，生理鹽水或其混合物。應(yīng)該將所 述溶液的PH調(diào)節(jié)為約7. 4。用于注射的適合的載體包括水凝膠、用于控制和延遲釋放的裝 置、聚乳酸和膠原蛋白基質(zhì)。用于局部應(yīng)用的適合的藥用載體包括那些，其適合用于洗劑、 膏劑、凝膠等。如果化合物將通過口服施用，片劑、膠囊等是優(yōu)選的單位劑型?？梢杂糜诳?服施用的制備單位劑型的藥用載體是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。對其的選擇將取決于次要考慮， 如味道、費用和貯存性，這對于本發(fā)明的目的不是關(guān)鍵的，并且這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言 沒有難度。為了進(jìn)一步增加免疫原性，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以另外包含一種或多種輔 助物質(zhì)。如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子和任選地另外包含在如上所述的藥物組合物(和最后，藥用活性成分)中 的輔助物質(zhì)的協(xié)同作用優(yōu)選地這樣獲得。取決于各種類型的輔助物質(zhì)，在這方面可以考慮 各種機(jī)制。例如，容許樹突細(xì)胞(DCs)成熟的化合物，例如，脂多糖、TNF-α或CD40配體，形 成第一類適合的輔助物質(zhì)。一般地，可以使用以“危險信號”(LPS，GP96，等)或細(xì)胞因子，如 GM-CFS的方式影響免疫系統(tǒng)的任何試劑作為輔助物質(zhì)，其使根據(jù)本發(fā)明的免疫刺激佐劑產(chǎn) 生的免疫應(yīng)答以靶向方式得以增強(qiáng)和/或被影響。特別優(yōu)選的輔助物質(zhì)是細(xì)胞因子，如單 核因子，淋巴因子，白介素或趨化因子，其促進(jìn)免疫應(yīng)答，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5， IL-6, IL-7, IL-8, IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19， IL-20, IL-21, IL-22, IL-23， IL-24， IL-25， IL-26， IL-27， IL-28， IL-29， IL-30， IL-31， IL-32, IL-33, INF- α，IFN- β，INF- γ，GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT- β 或 TNF- α，生長因子， 如 hGH?？梢园诟鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物中的另外的添加劑是乳化劑，如，例如，吐溫 ；濕潤劑，如，例如，十二烷基硫酸鈉；著色劑；賦味劑，藥物載體；片劑形成劑；穩(wěn)定劑；抗 氧化劑；防腐劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物(第一(無藥用活性成分)和第二(用藥用活性成分) 實施方案)還可以另外包含佐劑。因此，作為免疫刺激劑或作為佐劑(對于本發(fā)明藥物組 合物的第二個實施方案)的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，可以與另外的免疫刺激劑/佐劑組合。在本發(fā)明 范圍內(nèi)，用于這些目的的適合對于試劑/佐劑特別是那些化合物，其增強(qiáng)(通過一種或多種 機(jī)制)根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的(修 飾的或未修飾的)核酸分子的生物學(xué)一種或多種性質(zhì)，也就是說，特別是有利于根據(jù)本發(fā) 明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子的免疫刺激 作用的物質(zhì)。可以根據(jù)本發(fā)明使用的試劑/佐劑的實例包括，但不限于如上所述的穩(wěn)定的 陽離子肽或多肽，其包括魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，和陽離子多糖，特別是脫乙酰 殼多糖，TDM, MDP，胞壁酰二肽，泊洛沙姆，明礬溶液，氫氧化鋁，ADJUMER (聚磷腈)；磷酸 鋁凝膠；來自海藻的葡聚糖；algammulin ；氫氧化鋁凝膠(明礬)；高蛋白吸附性氫氧化鋁 凝膠；低粘性氫氧化鋁凝膠；AF或SPT (角鯊?fù)榈娜闋钜?5% )，吐溫80 (0. 2% )，泊洛沙姆 L121(1.25% )，磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4) ；AVRIDINE (丙二胺)；BAY R1005 ((N-(2-脫 氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二烷酰-酰胺氫化乙酸鹽 (hydroacetate) ；CALCITRI0L (1_，25- 二甲基羥基-維生素 D3)；磷酸鈣凝膠；CAPTM(磷 酸鈣納米顆粒)；霍亂全毒素，霍亂_毒素-Al-蛋白-A-D-片段融合蛋白，霍亂毒素的B亞 基；CRL 1005(嵌段共聚物P1205)；包含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體；DDA (二甲基二(十八烷基)溴 化銨)；DHEA(脫氫表雄酮)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿)；DMPG( 二肉豆蔻酰磷脂酰甘 油)；DOC/明礬復(fù)合物(脫氧膽酸鈉鹽)；弗氏完全佐劑；弗氏不完全佐劑；Y菊粉；Gerbu 佐劑((i) N-乙?；咸前坊?(Pl-4) -N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)， ) 二甲基二(十八烷基)氯化銨(DDA)，iii)鋅-L-脯氨酸鹽復(fù)合物(ZnPro-8)的混合 物)；GM-CSF) ；GMDP (N-乙?；咸前坊?(bl_4) -N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨 酰胺)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1Η-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)；ImmTherTM(N-乙酰 基葡糖胺基-N-乙?；邗?L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二棕櫚酸酯)；DRVs (制備自脫水-再水合的囊泡的免疫脂質(zhì)體)；Y-干擾素；白介素；白介素-2;白介素-7;白介 M-12 ；ISCOMStmC 免疫刺激復(fù)合物")；ISC0PREP 7.0.3. ；脂質(zhì)體；L0X0RIBINE (7-烯 丙基-8-氧代鳥苷(鳥嘌呤))；LT 口服佐劑(大腸桿菌(E.coli)不穩(wěn)定的腸毒素-原毒 素)；任何組合物的微球體和微粒；MF59 ;(角鯊烯-水乳狀液)；MONTANIDE ISA 51 (純 化的不完全弗氏佐劑)；M0NTANIDE ISA 720 (可代謝的油性佐劑)；MPL (3-Q-脫酰 基-4'-單磷酰基脂質(zhì)A) ；MTP-PE和MTP-PE脂質(zhì)體((N-乙酰基-L-丙氨酰-D-異谷 氨?；?L-丙氨酸_2-(1，2- 二棕櫚酰-sn-甘油_3-(羥基磷酰氧基))乙基酰胺，單鈉 鹽)；MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3) ；MURAPALMITINE 和 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-異GIn-sn-甘油二棕櫚酰)；NAGO (神經(jīng)氨酸酶-半乳糖氧化酶)；任 何組合物的納米球體或納米顆粒；NISVs (非離子表面活性劑囊泡)；PLEURAN (i3 -葡聚 糖)；PLGA，PGA和PLA(乳酸和羥基乙酸的均聚物和共聚物；微球體/納米球體)；泊洛沙 姆L121 ;PMMA(聚甲基甲基丙烯酸酯)；P0DDS (類蛋白微球體)；聚乙烯氨基甲酸酯衍 生物；聚-rA:聚_rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸復(fù)合物)；聚山梨酸酯80(吐溫80)；蛋白脂 質(zhì)卷(cochleates) (Avanti Polar Lipids, Inc.，Alabaster, AL) ；STIMUL0N (QS_21)； QuiI-A(QuiI-A皂苷)；S-28463 (4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑并[4， 5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1 ("興泰克(Syntex)佐劑制劑")；仙臺脂蛋白體和包含仙臺 的脂質(zhì)基質(zhì)；司盤_85(三油酸山梨坦)；Specol (Marcol 52，司盤85和吐溫85的乳狀液)； 角鯊烯或 Robane (2,6,10，15，19，23-六甲基二十四烷和 2,6,10，15，19，23-六甲基-2，6， 10，14，18，22-二十四碳己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸鹽酸鹽)；Theramid (N-乙 酰基葡糖胺基-N-乙?；邗?L-Ala-D-異Glu-L-Ala- 二棕櫚氧基丙酰胺)；蘇氨酰 (Theronyl) -MDP (Termurtide 或[thr 1] -MDP ；N-乙?；邗?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰 胺)；Ty顆粒(Ty-VLPs或病毒樣顆粒)；Walter-Reed脂質(zhì)體(包含吸附在氫氧化鋁上的脂 質(zhì)A的脂質(zhì)體)等。脂肽，如Pam3Cys，同樣特別適合與本發(fā)明如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式 (I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子組合，其以免疫刺激佐劑 的形式存在(見 Deres 等，Nature (自然)1989，342 :561_564)。如上定義的佐劑可以歸為數(shù)類，包括適合于貯庫和遞送，用于共刺激的佐劑，適合 作為拮抗劑的佐劑等。優(yōu)選的適合貯存和遞送的佐劑可以包括例如，鋁鹽，如Adju-phos，鋁 膠，吸附氫氧化鋁凝膠，等；乳狀液，如 CFA，SAF, IFA, MF59，Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin,等；共聚物，如Optivax(CRL1005), L121，泊洛沙姆4010)，等；脂質(zhì)體，如 Stealth，等，脂質(zhì)卷(cochleates)，如BI0RAL，等；植物衍生的佐劑，如QS21，Quil A， Iscomatrix, ISC0M，等；適合于共刺激的優(yōu)選的佐劑可以包括例如番茄素，生物聚合物， 如PLG, PMM，菊粉，等；微生物衍生的佐劑，如羅莫肽，DETOX, MPL, CWS，甘露糖，CPG7909， ISS-1018, IC31，咪唑并喹啉，聚肌胞，Ribi529，IMOxine, IRIVs，VLPs，霍亂毒素，熱不穩(wěn)定 的毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI錨，LNFPIII/LewisX，抗菌肽，UC-I V150, RSV融合蛋白， cdiGMP,等；適合作為拮抗劑的優(yōu)選佐劑可以例如包括CGRP神經(jīng)肽等。適合貯庫和遞送的特別優(yōu)選的佐劑是陽離子或聚陽離子化合物，包括魚精蛋白， 核仁蛋白，精胺或亞精胺，或其它陽離子肽或蛋白質(zhì)，如聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸， 堿性多肽，細(xì)胞滲透肽(CPPs)，包括HIV結(jié)合肽，Tat, HIV-I Tat (HIV)，Tat衍生的肽，穿 膜肽(Penetratin)，VP22衍生的或類似的肽，HSV VP22(單純皰疹)，MAP，KALA或蛋白
53轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，一種或 多種MPG-肽，Pep-1, L-寡聚體，一種或多種降鈣素肽，觸角足衍生肽(特別地來自果蠅 (Drosophila)觸角足)，pAntp，plsl，F(xiàn)GF，乳鐵蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24， SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-衍生的肽，SAP,魚精蛋白，精胺，亞精胺，或組蛋白。另外地，優(yōu)選 的陽離子或聚陽離子蛋白質(zhì)或肽可以是選自具有下列總式的下列蛋白或肽=(Arg)1 ； (Lys) m; (His)n; (Orn)。；(Xaa)x，其中 l+m+η+ο+χ = 8-15，并且 1，m，η 或0 彼此獨立地可以是選 自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14 或 15 的任何數(shù)字，條件是 Arg，Lys, His 和 Orn 的總含量代表寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是選自除Arg，Lys, His或Orn 之外的天然(=天然存在)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是選自0，1，2，3或 4的任何數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過寡肽的所有氨基酸的50%。在該情形中特別優(yōu) 選的寡精氨酸例如是 Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, 等?？梢杂米髯魟┑牧硗獾膬?yōu)選的陽離子或聚陽離子化合物可以包括陽離子多糖，例如脫 乙酰殼多糖，1，5_ 二甲基-1，5-二氮i^一亞甲基聚甲溴化物，陽離子聚合物，例如聚乙烯 亞胺(PEI)，陽離子脂質(zhì)，包括DOTMA :[1_ (2，3-二油酰氧基(sioleyloxy)丙基)]_N，N， N-三甲基氯化銨，DMRIE，二-C14-脒，DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇-胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS 二(十八烷基)氨基甘氨 酰(glicyl)精胺，DIMRI 二肉豆蔻酸-氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨，DOTAP 二油酰氧 基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14:0，0-二(十四烷酰)-Ν_(α-三甲基氨溶乙酰基)二 乙醇胺氯化物，CLIPl 外消旋-[(2，3_ 二(十八烷基)氧基丙基)(2-羥基乙基)]-二甲 基氯化銨，11 6:外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲 基銨，CLIP9 外消旋-[2(2，3_ 二(十六烷基)氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基]-三甲 基銨，寡核苷酸轉(zhuǎn)染(oligofetamine)，或陽離子或聚陽離子聚合物，包括修飾的聚氨基酸， 包括β-氨基酸-聚合物或逆聚酰胺，修飾的聚乙烯，如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化 吡啶鐺))等，修飾的丙烯酸酯，包括pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，修飾 的酰胺胺包括PAMAM(聚(酰胺胺))等，修飾的聚β氨基酯(PBAE)，如二胺端修飾的1， 4 丁二醇二丙烯酸酯_共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，樹狀聚體，如聚丙基胺樹狀聚體或基 于ρΑΜΑΜ的樹狀聚體，多種聚亞胺，如PEI 聚(乙烯亞胺)，聚(丙烯亞胺)，聚烯丙基胺， 基于糖主鏈的聚合物，如基于環(huán)糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，脫乙酰殼多糖等，，基 于硅烷主鏈的聚合物，如PM0XA-PDMS共聚物等，由一個或多個陽離子嵌段(包含如上所述 的選擇的陽離子聚合物)和一個或多個親水性或疏水性嵌段(例如聚乙烯乙二醇)的組合 組成的嵌段聚合物等。本發(fā)明如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子與陽離子或聚陽離子化合物的締合或復(fù)合優(yōu)選地給 核酸提供佐劑性質(zhì)并將穩(wěn)定作用通過復(fù)合賦予核酸。用于穩(wěn)定本發(fā)明核酸的方法通常描述 在EP-A-1083232中，將所述公開內(nèi)容的全部通過引用結(jié)合在本文中。特別地，優(yōu)選的陽離 子或聚陽離子化合物是選自由下列各項組成的組的化合物如上定義的魚精蛋白，核仁蛋 白，精胺，亞精胺，寡精氨酸，如 Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9，R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y (RKH) 2R，等。 可以具有共刺激作用的佐劑包括式(IV) =G1XmGn的核酸，其中G是鳥苷(鳥嘌 呤)，尿苷(尿嘧啶)或鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)的類似物；X是鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或上述核苷酸的類似物； 1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，G是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50% 的核苷酸是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；m是整數(shù)并且至少是3 ；其中當(dāng)m= 3時，X是尿苷 (尿嘧啶)或其類似物，當(dāng)m > 3時，至少3個連續(xù)的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的 類似物存在；η是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時，G是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當(dāng)η > 1 時，至少50%的核苷酸是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；或式(V) =C1XfflCn的核酸，其中C是胞苷(胞嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)或胞苷(胞嘧 啶)或尿苷(尿嘧啶)的類似物；X是鳥苷(鳥嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸 苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或上述核苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1 時，C是胞苷(胞嘧啶)或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核苷酸是核苷或其類似物；m 是整數(shù)并且至少是3 ；其中當(dāng)m = 3時，X是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，當(dāng)m > 3時，至少 3個連續(xù)的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的類似物存在；11是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時，C是胞苷(胞嘧啶)或其類似物，當(dāng)η > 1時，至少50%的核苷酸是胞苷(胞嘧啶)或 其類似物。已知由于其與 Toll 樣受體TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9， TLR10，TLR11，TLR12或TLR13的結(jié)合親和性(作為配體)而具有免疫刺激性的任何化合物 可以適當(dāng)?shù)赜米髁硗獾某煞謴亩M(jìn)一步刺激由本發(fā)明的藥物組合物中的本發(fā)明的核酸誘 導(dǎo)的免疫應(yīng)答。可以加入本發(fā)明的藥物組合物中的另一類化合物是CpG核酸，特別是CpG-RNA或 CpG-DNA。CpG-RNA 或 CpG-DNA 可以是單鏈 CpG-DNA (ss CpG-DNA)，雙鏈 CpG-DNA (dsDNA)，單 鏈 CpG-RNA (ss CpG-RNA)或雙鏈 CpG-RNA (ds CpG-RNA)。所述 CpG 核酸優(yōu)選地以 CpG-RNA 形式，更優(yōu)選地以單鏈CpG-RNA(ss CpG-RNA)的形式存在。所述CpG核酸優(yōu)選地包含至少 一個或多個(促有絲分裂)的胞苷(胞嘧啶)/鳥嘌呤二核苷酸序列(s) (CpG基序)。根據(jù) 第一個優(yōu)選的備選，包含在這些序列中的至少一種CpG基序，即CpG基序的C (胞苷(胞嘧 啶))和G(鳥嘌呤)是未甲基化的。任選地包含在這些序列中的所有其它胞苷(胞嘧啶) 或鳥嘌呤可以是甲基化或未甲基化的。然而，根據(jù)另外的優(yōu)選備選，CpG基序的C(胞苷(胞 嘧啶))和G(鳥嘌呤)也可以以甲基化形式存在。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，還可以將根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物作為疫苗提供。根 據(jù)本發(fā)明的疫苗典型地包含(對應(yīng)于)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的所述疫苗 的組成特征在于結(jié)合到疫苗組合物中的藥用活性成分的具體種類。典型地，藥用活性化合 物是免疫刺激性物質(zhì)，其激發(fā)針對某些抗原的特異性(適應(yīng)性)免疫應(yīng)答。激發(fā)的特異性 (適應(yīng)性)免疫應(yīng)答使受試者開發(fā)針對例如具體病原體或具體腫瘤的免疫應(yīng)答(通過主動 或被動模式激發(fā))。本發(fā)明的藥物組合物，和具體地本發(fā)明的疫苗具體地特征在于施用其的方式。典 型地，本發(fā)明的藥物組合物，特別是疫苗，優(yōu)選系統(tǒng)地進(jìn)行施用。用于施用所述本發(fā)明的藥 物組合物/疫苗的路徑典型地包括口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘 內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、肺內(nèi)、腹膜內(nèi)、心內(nèi)、動脈內(nèi)和舌下局部和/或鼻內(nèi)途 徑。備選地，本發(fā)明的疫苗或藥物組合物可以通過皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)途徑進(jìn)行施用。因此，優(yōu) 選地將組合物/疫苗以如上通常關(guān)于藥物組合物定義的液體或固體形式進(jìn)行配制。另外的輔助物質(zhì)(如上定義)可以進(jìn)一步增加特別是疫苗的免疫原性，其可以優(yōu)選地結(jié)合在根據(jù) 本發(fā)明的疫苗中。有利地，選擇如前文定義的一種或多種所述輔助物質(zhì)，這取決于在根據(jù)本 發(fā)明的疫苗中的藥用活性成分的免疫原性和其它性質(zhì)。 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選目的，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，特別優(yōu)選的本發(fā)明的 疫苗，用于通過如下實施例的方式治療提及的適應(yīng)癥。用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，特別優(yōu) 選地用本發(fā)明的疫苗，可以治療在治療情形中的與例如與各種病理學(xué)上缺乏的免疫應(yīng)答相 關(guān)或需要免疫應(yīng)答，優(yōu)選地增加的免疫應(yīng)答的疾病或病癥，例如腫瘤特異性或病原體特異 性疾病，感染性疾病，等或可以通過將(過量)免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)門Hl主導(dǎo)的免疫應(yīng)答和/或 通過使遭受過量免疫應(yīng)答折磨的患者脫敏的疾病，如例如在變應(yīng)性或自體免疫疾病中。由 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物產(chǎn)生這樣的免疫應(yīng)答，或已經(jīng)存在但任選地不充分的免疫應(yīng)答的 增加明顯基于其引發(fā)非抗原-特異性免疫反應(yīng)的能力。對于適合的免疫應(yīng)答的重要因素 是對不同T細(xì)胞亞群的刺激。T-淋巴細(xì)胞典型地分化為兩個亞群，T-輔助1 (Thl)細(xì)胞和 T-輔助2(Th2)細(xì)胞，使用所述細(xì)胞免疫系統(tǒng)能夠破壞細(xì)胞內(nèi)(Thl)和細(xì)胞外(Th2)病原 體(例如抗原)。兩個Th細(xì)胞群在由它們產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白(細(xì)胞因子)的模式上不同。因 此，Thl細(xì)胞通過激活巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T-細(xì)胞來輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答。在另一方面，Th2 細(xì)胞通過刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞和通過形成抗體(例如針對抗原)促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。 因此，Thl/Th2比率在免疫應(yīng)答中是非常重要的。關(guān)于本發(fā)明，免疫應(yīng)答的Thl/Th2比率優(yōu) 選地由根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物以朝向細(xì)胞應(yīng)答的方向替換，所述藥物組合物包含至少一 種如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一 的核酸分子，例如其1種，2種，3種，4種，6種，7種或更多的核酸，即由此誘導(dǎo)Thl應(yīng)答和 主要地細(xì)胞免疫應(yīng)答。僅通過這種替換和優(yōu)先，或甚至排他的發(fā)生THl免疫應(yīng)答，有效治療 上述適應(yīng)癥是可以的。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物或根據(jù)本發(fā)明的疫苗用于引發(fā)腫 瘤特異性或病原體特異性免疫應(yīng)答。所述藥物組合物或根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以特別優(yōu)選 地用于增加抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的免疫應(yīng)答。同樣地，特別優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組 合物或疫苗可以用于治療癌癥或腫瘤疾病，所述疾病優(yōu)選地選自結(jié)腸癌，黑素瘤，腎癌，淋 巴瘤，急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋 巴細(xì)胞白血病(CLL)，胃腸腫瘤，肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，甲狀腺腫瘤，乳癌，前列腺腫瘤，肝癌，各 種病毒誘導(dǎo)的腫瘤如，例如，乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的癌癥(例如宮頸癌)，腺癌，皰疹病毒誘導(dǎo) 的腫瘤(例如伯基特淋巴瘤，EBV-誘導(dǎo)的B-細(xì)胞淋巴瘤)，乙型肝炎病毒誘導(dǎo)的腫瘤(肝 細(xì)胞癌)，HTLV-I-和HTLV-2-誘導(dǎo)的淋巴瘤，聽神經(jīng)瘤/神經(jīng)鞘瘤，宮頸癌，肺癌，咽癌，肛 門癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，淋巴瘤，直腸癌，星形細(xì)胞瘤，腦腫瘤，胃癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，基底細(xì) 胞癌，腦轉(zhuǎn)移，髓母細(xì)胞瘤，陰道癌，胰腺癌，睪丸癌，黑素瘤，甲狀腺癌，膀胱癌，霍奇金綜合 征，腦膜瘤，Schneeberger病，支氣管癌，垂體腫瘤，蕈樣肉芽腫病，食管癌，乳腺癌，類癌， 神經(jīng)鞘瘤，spinaliomas，伯基特淋巴瘤，喉癌，腎癌，胸腺瘤，子宮體癌，骨癌，非霍奇金淋巴 瘤，尿道癌，CUP綜合征，頭/頸腫瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，外陰癌，小腸癌，結(jié)腸癌，食管癌，疣 累及，小腸腫瘤，顱咽管瘤，卵巢癌，軟組織腫瘤/肉瘤，卵巢癌，肝癌，胰腺癌，宮頸癌，子宮 內(nèi)膜癌，肝轉(zhuǎn)移，陰莖癌，舌癌，膽囊癌，白血病，漿細(xì)胞瘤，子宮癌，瞼腫瘤和前列腺癌等。如 果用在脂質(zhì)-修飾的核酸中或作為組合物中的藥用活性成分的脂質(zhì)是α-生育酚(維生 素Ε)，D- α -生育酚，L- α -生育酚，D, L-α-生育酚或維生素E琥珀酸酯VES)，這是特別優(yōu)選的。α -生育酚(維生素Ε)不是非常毒性的并且顯示有效的抗腫瘤活性(A. Bendich, L. J. Machlin Am. J. Clin. Nutr. 48(1988)612)，這使其似乎在癌癥治療中非常有前景。作 為抑制腫瘤細(xì)胞增殖或其細(xì)胞毒性活性的解釋，已知兩種機(jī)制在一方面，維生素E是有效 的抗氧化劑和良好的原子團(tuán)受體(C. Borek Ann. NY Acad. Sci. 570 (1990) 417)；另一方面， 其通過刺激免疫應(yīng)答，能夠防止腫瘤生長(G. Shklar，J. Schwartz, D. P. Trickier, S. Reid J. Oral Pathol. Med. 19(1990)60)。在最近的工作中，已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞(口腔鱗 狀細(xì)胞癌)的腫瘤抑制基因P53的表達(dá)與用維生素E琥珀酸酯(VES)進(jìn)行的治療之間的關(guān) 聯(lián)(J· Schwartz，G· Shklar，D· Trickier Oral Oncol. Europ. J. Cancer 29B (1993) 313)。由 此可以觀察到對作用為腫瘤抑制子的野生型P53的生產(chǎn)的刺激，和發(fā)展致癌活性的突變的 P53的減少。有趣的是，VES對這些腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性在兩個方面是劑量依賴性的以 生理劑量(0. 001-50 μ mol/1)，觀察到增加的細(xì)胞生長；以藥理學(xué)劑量(100-154 μ mol/1)， 抑制了細(xì)胞生長。這已經(jīng)顯示在細(xì)胞培養(yǎng)物中(T.M.A.Elattar，A. S. Virji Anticancer Res (抗癌研究).19(1999)365)。還可以通過用VES治療來誘導(dǎo)各種乳腺癌細(xì)胞系中的凋 t (W. Yu, K. Israel, Q. Y. Liao, C. Μ. Aldaz, B. G. Sanders, K. Kline Cancer Res( fg^ff 究).59(1999)953)。誘導(dǎo)的凋亡通過Fas配體和Fas受體之間的相互作用起始。這是被 特別強(qiáng)調(diào)的，因為迄今尚不可以在相應(yīng)的細(xì)胞系中觀察到這樣的機(jī)制。存在維生素E的各 種異構(gòu)體，其在芳香環(huán)的甲基的數(shù)量和位置上不同。在所述的工作中，使用天然存在的維生 素Ε，α-生育酚的生物學(xué)最具活性的形式。這又發(fā)生在各種立體異構(gòu)體中，因為所述分子 包含三種光學(xué)活性中心。維生素E的天然形式是RRR- α -生育酚(以前的D- α -生育酚)， 而目前主要使用外消旋物(D，L-α-生育酚)。作為脂質(zhì)的維生素E的所有上述形式同樣 地被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 同樣特別優(yōu)選地，至少一種如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)， (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子，或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于治療 感染性疾病。沒有任何限制，所述感染性疾病優(yōu)選地選自流感，瘧疾，SARS，黃熱病， AIDS,萊姆疏螺旋體病，利什曼病，炭疽，腦膜炎，病毒傳染性疾病如AIDS，尖銳濕疣，空 心疣(hollow warts)，登革熱，三日熱，埃博拉病毒，感冒，早夏腦膜腦炎(early summer meningoencephalitis) (FSME)，流行性感冒，帶狀皰疹，肝炎，I型單純皰疹，II型單純皰 疹，帶狀皰疹，流感，日本腦炎，拉沙熱，馬爾堡病毒，麻疹，口蹄疫，單核細(xì)胞增多癥，流行性 腮腺炎，諾瓦克病毒感染，傳染性單核細(xì)胞增多癥，天花，脊髓灰質(zhì)炎(兒童跛行)，假格魯 布，傳染性紅斑，狂犬病，疣，西尼羅熱，水痘，巨細(xì)胞癥病毒(CMV)，選自細(xì)菌感染性疾病，如 流產(chǎn)(前列腺炎癥)，炭疽，闌尾炎，疏螺旋體病，肉毒中毒，彎曲菌屬(Camphylobacter)， 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)(尿道炎癥，結(jié)膜炎)，霍亂，白喉，杜諾凡菌病，會 厭炎，斑疹傷寒，氣性壞疽，淋病，兔熱病，幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)，百日咳，腹 股溝淋巴肉芽腫，骨髓炎，軍團(tuán)病，麻風(fēng)病，利斯特菌病，肺炎，腦膜炎，細(xì)菌性腦膜炎，炭疽， 中耳炎，人支原體，新生兒膿毒癥(絨毛膜羊膜炎)，壞疽性口炎，副傷寒(paratyphus)]^ 疫，萊特爾綜合征，洛磯山斑疹熱，副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphus)，傷寒沙門氏 菌(Salmonella typhus)，猩紅熱，梅毒，破傷風(fēng)，淋病(tripper)，恙蟲病，結(jié)核病，斑疹傷 寒，鞘炎(陰道炎)，軟下疳，和選自由寄生蟲、原生動物或真菌引起的感染性疾病，如阿米 巴病，血吸蟲病，美洲錐蟲病，足癬，酵母菌斑，疥瘡，瘧疾，盤尾絲蟲病(河盲)，或真菌病，弓形體病，滴蟲病，錐蟲病(昏睡病)，內(nèi)臟利什曼病，尿布/尿布皮炎，血吸蟲病，魚肉中毒 (雪卡毒素)，念珠菌病，皮膚利什曼病，蘭氏鞭毛蟲病(賈第蟲病)，或昏睡病，或選自由棘 球絳蟲、闊節(jié)裂頭絳蟲、狐絳蟲、犬絳蟲、虱、牛肉絳蟲、豬肉絳蟲和微小絳蟲引起的感染性疾病。因此，如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或 (IIIb)任一的本發(fā)明至少一種核酸，或本發(fā)明的藥物組合物可以用于制備藥物，所述藥物 用于治療變應(yīng)性疾病或病癥。變應(yīng)性是一種涉及某些外源抗原或變應(yīng)原的異常、需要的的 免疫學(xué)超敏反應(yīng)。變應(yīng)性在正常情況下導(dǎo)致針對這些抗原或變應(yīng)原的局部或系統(tǒng)炎性反 應(yīng)，并在體內(nèi)導(dǎo)致針對這些變應(yīng)原的免疫性。在此背景下的變應(yīng)原包括例如草、花粉、霉菌、 藥物或許多環(huán)境觸發(fā)物等。不限于理論，設(shè)想一些不同的疾病機(jī)制涉及變應(yīng)性的發(fā)展。根 據(jù)P. gell和R. Coombs的分類方案，術(shù)語“變應(yīng)性”限于I型超敏反應(yīng)，其由經(jīng)典IgE機(jī)制 所導(dǎo)致。I型超敏反應(yīng)特征在于由IgE過量激活肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞，導(dǎo)致系統(tǒng)炎性反應(yīng)， 所述炎性反應(yīng)可以導(dǎo)致良性癥狀如鼻漏(runny nose)，到威脅生命的過敏性休克和死亡。 熟知的變應(yīng)性類型包括，但不限于，變應(yīng)性哮喘(導(dǎo)致鼻粘膜的腫脹)，變應(yīng)性結(jié)膜炎(導(dǎo) 致結(jié)膜的發(fā)紅和發(fā)癢)，變應(yīng)性鼻炎("花粉熱")，過敏反應(yīng)，血管性水腫(angiodema)，特 異性皮炎(濕疹)，蕁麻疹(假膜性喉頭炎)，嗜酸粒細(xì)胞增多，對于昆蟲叮咬的呼吸系統(tǒng)變 應(yīng)性，皮膚變應(yīng)性(導(dǎo)致并包括各種皮疹，如濕疹，假膜性喉頭炎(蕁麻疹)，和(接觸性) 皮炎)，食物變應(yīng)性，和對于藥物的變應(yīng)性。關(guān)于本發(fā)明，提供例如本發(fā)明的藥物組合物或 疫苗，所述藥物組合物或疫苗包含作為蛋白，編碼該蛋白變應(yīng)原的mRNA(或DNA)的變應(yīng)原 (例如，來自貓變應(yīng)原，粉塵變應(yīng)原，螨蟲變應(yīng)原，植物抗原(例如樺抗原)等)，以及如上定 義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分 子。本發(fā)明的藥物組合物可以將(過量的)免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)向更強(qiáng)的THl應(yīng)答，由此抑制或減 弱不需要的IgE應(yīng)答。同樣地，至少一種如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的本發(fā)明核酸或本發(fā)明的藥物活性組合物可以用于制備藥物，所 述藥物用于治療自體免疫疾病。根據(jù)每種疾病主要的臨床-病理學(xué)特征，可以將自體免疫 疾病在廣泛意義上分成系統(tǒng)和器官特異性或局部的自體免疫疾病。自體免疫疾病可以分為 系統(tǒng)綜合征的種類，包括SLE，斯耶格倫綜合征，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多肌炎或可以是 內(nèi)分泌性的局部綜合征(I型DM，橋本甲狀腺炎，艾迪生病等)，皮膚性的局部綜合征(尋常 型天皰瘡)，血液性的局部綜合征(自身免疫溶血性貧血)，神經(jīng)性局部綜合征(多發(fā)性硬 化)或可以實際上包括體組織的任何局限腫塊。待治療的自體免疫疾病可以選自由下列各 項組成的組1型自體免疫疾病或II型自體免疫疾病或III型自體免疫疾病或IV型自體免 疫疾病，如，例如，多發(fā)性硬化(MS)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，I型糖尿病(糖尿病)，系統(tǒng) 性紅斑狼瘡(SLE)，慢性多關(guān)節(jié)炎，巴塞多氏病，慢性肝炎的自體免疫形式，潰瘍性結(jié)腸炎，I 型變應(yīng)性疾病，II型變應(yīng)性疾病，III型變應(yīng)性疾病，IV型變應(yīng)性疾病，纖維肌痛，脫發(fā)，別 赫捷列夫氏病，克羅恩氏病，重癥肌無力，神經(jīng)性皮炎，風(fēng)濕性多肌痛，進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病 (PSS)，銀屑病，萊特爾綜合征，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，脈管炎，等，或II型糖尿病。盡管尚 未闡釋為什么免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)針對自體抗原的免疫反應(yīng)的精確模式，存在關(guān)于該病因?qū)W的數(shù) 種發(fā)現(xiàn)。因此，自體反應(yīng)可以是由于T-細(xì)胞旁路引起的。正常的免疫系統(tǒng)需要由T-細(xì)胞
58激活B-細(xì)胞，之后前者可以大量產(chǎn)生抗體。在少數(shù)情況下，對T細(xì)胞的需要可以被繞過，如 由產(chǎn)生超抗原的生物的感染，其能夠通過以非特異性方式直接結(jié)合T-細(xì)胞受體的一個亞 基而起始對B-細(xì)胞，或甚至T細(xì)胞的多克隆激活。另一種解釋從分子擬態(tài)推導(dǎo)出自體免疫 疾病。外源抗原可以與某些宿主抗原享有結(jié)構(gòu)類似性；因此，針對該抗原(其模擬自體抗 原)產(chǎn)生的任何抗體可以在理論上結(jié)合宿主抗原并且放大免疫應(yīng)答。在組Αβ-溶血性鏈 球菌(streptococci)中觀察到分子擬態(tài)的最引人注目的形式，其與人心肌共享抗原，并且 是風(fēng)濕熱的心臟表現(xiàn)的原因。因此，本發(fā)明可以提供包含自體抗原(如蛋白，編碼自體抗原 蛋白的mRNA或DNA)和典型地允許免疫系統(tǒng)脫敏的本發(fā)明的核酸的藥物組合物。本發(fā)明涉及將至少一種本發(fā)明的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子用于制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物或 根據(jù)本發(fā)明的疫苗的應(yīng)用，所述藥物組合物或疫苗用于治療前文所述的適應(yīng)癥，例如用于 治療提及的腫瘤，自體免疫疾病，變應(yīng)性和感染性疾病。備選地，本發(fā)明包括至少一種如上 定義的根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸 分子用于治療如前文所述的腫瘤或感染性疾病的(治療)應(yīng)用。同樣地，本發(fā)明包括試劑盒，例如多部件試劑盒，(每個部件)包含至少一種根據(jù) 本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子和/或 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，和/或根據(jù)本發(fā)明的疫苗以及，任選地用于利用關(guān)于至少一種 根據(jù)本發(fā)明的式⑴，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸分子和 /或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，和/或根據(jù)本發(fā)明的疫苗的施用和劑量的信息的技術(shù)說明 書。治療選自由癌癥疾病，感染性疾病，自體免疫疾病和變應(yīng)性的組的疾病或病癥的 方法，其通過給需要其的患者施用藥用有效量的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子進(jìn)行。M下圖意欲進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。它們并不意欲限制本發(fā)明的主題。

圖1 顯示根據(jù)式(I)的DOTAP配制的RNA的TNF α誘導(dǎo)能力。將PBMCs以2*105/ 孔Λ00 μ 1的培養(yǎng)基的密度接種并用以DOTAP (12 μ g/ml)配制的RNA (4 μ g/ml)刺激20小 時。接著用無細(xì)胞的上清液進(jìn)行TNFa-ELISA。如可以在圖1中觀察到的，TNF α的分泌 顯著地由本發(fā)明的根據(jù)式(I)的核酸誘導(dǎo)，特別由如上定義的根據(jù)式(I)的本發(fā)明核酸根 據(jù) SEQ ID NOs 114-119 的 mRNA 序列顯著誘導(dǎo)，即根據(jù) SEQ ID NOs 114-119 (SEQ ID NO: 114 (R820/(N100) 2)，SEQ ID NO 115 (R719/(N100) 5), SEQ ID NO 116 (R720/(N100) 10), SEQ ID NO :117(R821/(N40T20N40)2), SEQ ID NO 118 (R722/ (N40T20N40) 5),禾口 SEQ ID NO: 119 (R723/ (N40T20N40) 10))的 mRNA 序列和對照 G2U20G20 (G⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG)，Seq. U21 :UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU (磷酸二酯)和聚(U) (Sigma，800-1000kDa)。圖2 顯示根據(jù)式(I)的DOTAP配制的RNA的IFN α誘導(dǎo)能力。將PBMCs以2*105/ 孔ΛΟΟμΙ的培養(yǎng)基的密度接種并用以DOTAP(UygAil)配制的RNA (2 μ g/ml)刺激20 小時。接著用無細(xì)胞的上清液進(jìn)行IFNa-ELISA。如可以在圖2中觀察到的，IFNa的分 泌顯著地由本發(fā)明的根據(jù)式(I)的核酸誘導(dǎo)，特別由如上定義的根據(jù)式(I)的本發(fā)明核酸 根據(jù) SEQ ID NOs 114-119 的 mRNA 序列顯著誘導(dǎo)，S卩，根據(jù) SEQ ID NOs 114-119 (SEQ ID NO 114 (R820/(NlOO)2), SEQ ID NO 115 (R719/(N100) 5), SEQ ID NO 116 (R720/(N100) 10),
59SEQ ID NO :117(R821/(N40T20N40)2) ,SEQ ID NO 118 (R722/(N40T20N40)5) JPSEQ ID NO: 119 (R723/ (N40T20N40) 10))的 mRNA 序列和對照 G2U20G20 (G⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG)，Seq. U21 :UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU (磷酸二酯)和聚(U) (Sigma，800-1000kDa)。實施例下面的實施例意欲進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。它們并不意欲限制本發(fā)明的主題。L 合成根據(jù)本發(fā)明的式(I), (la), (II), (IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)任 一的示例件核酸RNA寡核苷酸，作為根據(jù)本發(fā)明的通式(I), (Ia)，(II)，(IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)的核酸的實例通過亞磷酰胺化學(xué)的方式通過自動固相合成(包括根據(jù)SEQ ID NOs :84-85(式(I)),SEQ ID NOs :86_87(式(Ia) )，SEQ ID NOs :88_94(式(II)，(IIa)和 (lib)) JPSEQ ID NOs 107-108 (式(IIIa)和(IIIb))的序列)制備。在每種情形中，將核 苷酸的RNA-特異性2 ‘-羥基用TBDMS保護(hù)基保護(hù)。在硫代磷酸酯的合成中，使用Beaucage 試劑進(jìn)行氧化。用甲胺進(jìn)行載體物質(zhì)和堿不穩(wěn)定的保護(hù)基的裂解，并且用三乙胺氟化氫進(jìn) 行TBDMS保護(hù)基的裂解。將粗制產(chǎn)物通過離子對色譜法，通過離子交換色譜法或通過兩種方法的組合，通 過HPLC進(jìn)行純化，脫鹽和干燥。通過質(zhì)譜法檢查產(chǎn)物的純度和正確的堿基組成。根據(jù)備選方法，通過基于攜帶本發(fā)明的序列的DNA載體或寡核苷酸序列的體外翻 譯制備上述序列。2.根據(jù)本發(fā)明的式(I), (la), (II), (IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)仵一的 示例性核酸的體外免疫刺激a)對于刺激小鼠BDMCs (骨髓來源的樹突細(xì)胞)，將3 μ 1的oligofectamine與 30 μ 1的無FCS IMDM培養(yǎng)基(BioWhittaker，批號.BE12-722F)混合，并在室溫溫育5分 鐘。將6 μ g的RNA形式的根據(jù)SEQ ID NOs :84_94和107-108的核酸(每種類型的核酸 形成單一實驗)，分別與60 μ 1的無FCS-IMDM混合，并與oligofectamine/IMDM混合，在室 溫溫育20分鐘。接著，將33 μ 1的這種混合物置于96孔微量培養(yǎng)板的孔中培養(yǎng)過夜，在所 述微量培養(yǎng)板的每個孔中，在200 μ 1的無FCS IMDM培養(yǎng)基中包含200，000小鼠BDMCs。4 小時后，加入100 μ 1包含20% FCS的IMDM，并且在16小時的共溫育后，去除上清液，并且 通過細(xì)胞因子ELISA測試白介素-6(IL-6)和白介素-12 (IL-12)。使用與魚精蛋白復(fù)合的 β-半乳糖苷酶(IacZ)的免疫刺激的未加帽野生型mRNA，以類似于上述序列的方式進(jìn)行比 較測試。以RNA 形式存在的根據(jù)本發(fā)明式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和 / 或(IHb)的核酸，特別是根據(jù)SEQ ID NOs :84_94和107-108的本發(fā)明的序列具有刺激 先天免疫應(yīng)答的良好的免疫刺激性質(zhì)。(b)通過菲可密度梯度和在X-VIV0-15培養(yǎng)基 (BioWhittaker，批號BE04-418Q)中在存在10 μ g/ml的以RNA形式存在的根據(jù)本發(fā)明的 式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸，特別是 SEQ ID NOs 84-94和107-108的根據(jù)本發(fā)明的序列(每種類型的核酸形成單一實驗)情況下，培養(yǎng)過夜 來獲得人PBMCs，所述培養(yǎng)基包含谷氨酰胺和青霉素。對于朿Ij 激，將 3μ 1 的 oligofectamine 與 30 μ 1 的 X-VIV0-15 培養(yǎng)基 (BioWhittaker,批號BE04-418Q)混合，并將其在室溫溫育5分鐘。將6 μ g的以RNA形式存在的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia)，(II)，(IIa)，(lib)，(IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸，特 別是根據(jù)本發(fā)明SEQ ID NOs :84-94和107-108的序列(對每種類型的核酸進(jìn)行一個實驗) 分別與 60 μ 1 X-VIV0-15 培養(yǎng)基(Bioffhittaker, catalogue no. BE04-418Q)混合，并且與 oligofectamine/X-VIVO培養(yǎng)基混合，在室溫溫育20分鐘。接著，將33 μ 1的這種混合物置 于96孔微量培養(yǎng)板的每個孔中進(jìn)行培養(yǎng)過夜，在所述每個孔中，在200 μ 1的X-VIV0-15培 養(yǎng)基(BioWhittaker，catalogue no. BE04-418Q)中包含 200，000 PBMCs0 在共培育 16 小時 后，去除上清液并通過細(xì)胞因子-ELISA的方式測試白介素-6(IL-6)和白介素-12 (IL-12) 禾口 TNF α。用免疫刺激性寡 RNA40(5' -GCCCGUCUGUU ⑶⑶ GACUC-3 ‘，SEQ ID N0:113)，以 類似于根據(jù)本發(fā)明序列(見上)的方式進(jìn)行比較測試?？梢燥@示以RNA形式存在的本發(fā)明的核酸，特別是具有如上定義的根據(jù)本發(fā)明的 式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的本發(fā)明序列的本發(fā)明核酸 具有良好的免疫刺激性質(zhì)。3.用根據(jù)本發(fā)明的式(I), (Ta), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)仵一 的示例件核酸講行的體內(nèi)免疫刺激_用作佐劑將BALB/c小鼠(每組5只)用β -半乳糖苷酶蛋白和用佐劑(如本文定義)在 第0天和第10天進(jìn)行注射。將小鼠在第20天處死，并通過ELISA，將血清用于針對β-半 乳糖苷酶蛋白的抗體測試，并以類似于上述體外培養(yǎng)的方式確定IL-6，IL-12和TNF- α值。4.用以式(I), (Ta), (II)，(IIa), (lib), (IIIa)和 /或(IIIb)仵一的核酸分子
劍月白嚇_散入_a)為了確定以佐劑形式存在的如上定義的根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)， (IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)任一的核酸的免疫原活性，特別地包含根據(jù)SEQ ID NOs 84-94和107-108序列的核酸的免疫原活性(每種類型的核酸再次形成單一實驗)與 人細(xì)胞共溫育。為此目的，將人PBMC細(xì)胞，例如，在X-VIV0-15培養(yǎng)基(BioWhittaker，批號 BE04-418Q)中共溫育16小時，將所述培養(yǎng)基用2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker)，10U/ml 青霉素(BioWhittaker)和10 μ g/ml鏈霉素，用編碼β -半乳糖苷酶的RNA (mRNA)，和任選 地用10 μ g/ml魚精蛋白富集。去除上清液，并通過ELISA的方式分析IL-6和TNF α的釋 放。b)在另外的實驗中，在用根據(jù)本發(fā)明的式(I)，(Ia), (II)，(IIa)，(lib), (IIIa) 和/或(IIIb)任一的本發(fā)明核酸(SEQ ID NOs :84_94和107-108，每種類型的核酸在單一 實驗中進(jìn)行，見上)和根據(jù)本發(fā)明使用的佐劑刺激后確定人PBMC細(xì)胞釋放的TNF-α。為此目的，將人PBMC細(xì)胞與10 μ g/ml的所述本發(fā)明核酸在X-VIV015培養(yǎng)基 (Bioffhittaker)中共溫育16小時，所述培養(yǎng)基用2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker)，10U/ ml青霉素(BioWhittaker)和10 μ g/ml鏈霉素富集。去除上清液，并通過ELISA的方式進(jìn) 行分析。5.在人 PBMCs 中分泌 TNF α 禾口 IFN- α對于該實驗，用DOTAP(Roche)配制如上定義的數(shù)種根據(jù)式(I)的本發(fā)明核酸，即 根據(jù) SEQ ID NOs 114-119 的 mRNA 序列。在所述實驗中使用的本發(fā)明的核酸序列是SEQ ID NO 114 (R820/(NlOO)2)；
61
SEQID NOSEQID NOSEQID NOSEQID NOSEQID NO
115(R719/(NlOO)5)；
116(R720/(NlOO)10)； 117(R821/(N40T20N40)2)； 118(R722/(N40T20N40)5)；禾口 :119(R723/(N40T20N40)10).接著，將人PBMCs用濃度為8 μ g/ml和12 μ g/ml DOTAP的配制的RNA刺激20小 時。接著，使用匹配_配對的ELISA研究上清液的TNFa和IFN_a分泌。對于所述實驗，通過菲可密度梯度和在X-VIV0-15培養(yǎng)基(BioWhittaker，批號 BE04-418Q)中在存在2或4 μ g/ml的上述核酸的情況下培養(yǎng)20小時來獲得人PBMCs分別 用于IFNa和TNFa刺激，所述培養(yǎng)基包含1 %谷氨酰胺和1 %青霉素。對于配制和刺激， 將3或6 μ g在HBS緩沖液中的RNA轉(zhuǎn)移到在HBS緩沖液中包含18 μ g N- [1- (2，3- 二甲基 油酰氧基)丙基]-N，N，N三甲基甲基硫酸銨(DOTAP) (Roche Diagnostics，批號11811 177 001)的瓶中，并通過輕柔吹吸混合物數(shù)次來仔細(xì)混合。將轉(zhuǎn)染的混合物在15-25°c溫育15 分鐘。接著，將1體積的DOTAP/核酸混合物用7. 3體積的X-Vivo培養(yǎng)基輕輕稀釋。接著， 將100 μ 1的這種混合物在96孔微量培養(yǎng)板的孔中培養(yǎng)過夜，所述培養(yǎng)板的每孔在100 μ 1 的 X-VIV0-15 培養(yǎng)基(BioWhittaker, catalogue no. BE04-418Q)中包含 2*105 PBMCs0 在 共溫育20小時后，去除上清液，并通過細(xì)胞因子-ELISA的方式測試IFNα和TNFa。用免 疫刺激寡G2U2tlG2 (硫代硫酸酯-修飾的)，聚(U) (Sigma, Taufkirchen,德國)和寡U21 (磷 酸二酯)，以類似于根據(jù)本發(fā)明的序列(見上)的方式進(jìn)行比較測試。將結(jié)果顯示在圖1和2中。圖1顯示DOTAP配制的RNAs的TNF α誘導(dǎo)能力。將 PBMCs以2*IO5/孔/200 μ 1培養(yǎng)基的密度接種，并用以DOTAP (12 μ g/ml)配制的RNA (4 μ g/ ml)刺激20小時。接著用無細(xì)胞的上清液進(jìn)行TNF α -ELISA。圖2顯示DOTAP配制的RNAs 的IFN α誘導(dǎo)能力。將PBMCs以2*105/孔/200 μ 1培養(yǎng)基的密度接種，并用以DOTAP (12 μ g/ ml)配制的RNA(2 μ g/ml)刺激20小時。接著，用無細(xì)胞的上清液進(jìn)行IFNa -ELISA。如可以在圖1和圖2中觀察到的，TNFa和IFNa的分泌由根據(jù)式(I)的本 發(fā)明的核酸，特別由如上定義的根據(jù)式(I)的根據(jù)SEQ ID NOs :114-119本發(fā)明核酸 的 mRNA 序列顯著誘導(dǎo)，S卩，根據(jù) SEQ ID NOs 114-119 (SEQ ID NO 114 (R820/(N100)2), SEQ ID NO 115 (R719/(N100) 5)，SEQ ID NO 116 (R720/(N100) 10), SEQ ID NO :117(R821/ (N40T20N40)2)，SEQ ID NO 118 (R722/ (N40T20N40) 5),禾口 SEQ ID NO :119(R723/ (N40T20N40) 10))的mRNA序列對比對照序列G2U2tlG2 (硫代硫酸酯修飾的)，聚(U) (Sigma, Taufkirchen, Germany)和寡 U21 (磷酸二酯)。本發(fā)明的益處根據(jù)本發(fā)明的通式⑴，(Ia), (II), (IIa)，(IIb)，(IIIa)和/或(IIIb)的核酸 可以用作象這樣的免疫刺激劑，其刺激待治療的患者的先天免疫系統(tǒng)。這種免疫刺激性質(zhì) 可以通過加入本領(lǐng)域已知的其它化合物來主動刺激針對本發(fā)明核酸的先天免疫應(yīng)答(例 如通過脂質(zhì)修飾或通過加入另外的佐劑)從而充分地增強(qiáng)。如上定義的本發(fā)明核酸，特別 是包含結(jié)構(gòu)(NuG1XmGnNv)a,或其衍生物的根據(jù)式⑴的那些，顯示在細(xì)菌(例如大腸桿菌) 中明顯更好的擴(kuò)增。如果本發(fā)明式⑴的核酸(NvG1XmGnNu)a，或其衍生物，是部分雙鏈核酸 分子或單鏈和雙鏈核酸分子的混合物，這是另外特別有利的，因為根據(jù)式(1)(或式(Ia)，
62(II) (IIa), (lib), (IIIa)和/或(IIIb))的(部分雙鏈)本發(fā)明的核酸分子可以通過定向 關(guān)于單鏈RNA的PAMP-(病原體相關(guān)分子模式模式)受體(TLR-7和TLR-8)以及關(guān)于雙鏈 RNA的PAMP-受體(TLR-3，RIG-I和MDA-5)來正向刺激待治療的患者中的先天免疫應(yīng)答。 受體TLR-3，TLR-7和TLR-8位于內(nèi)體內(nèi)，并且被由內(nèi)體攝取的RNA激活。與此相反，RIG-I 和MDA-5是細(xì)胞質(zhì)受體，其由直接被攝取到細(xì)胞質(zhì)中或已經(jīng)由內(nèi)體釋放(內(nèi)體釋放或內(nèi)體 逃逸)的RNA激活。因此，式⑴的部分雙鏈本發(fā)明的核酸(NuG1XmGnNv)a(或其衍生物，例如 如上定義的根據(jù)式(Ia)，(II) (IIa)，(lib), (IIIa)和(IIIb)的(部分雙鏈)本發(fā)明核酸 分子)能夠激活不同的免疫刺激信號級聯(lián)并由此導(dǎo)致增加的先天免疫應(yīng)答或顯著增強(qiáng)這 樣的反應(yīng)。本發(fā)明的另外的益處是優(yōu)選用于刺激先天免疫系統(tǒng)的抗病毒細(xì)胞因子IFNa的 高度誘導(dǎo)。對通常公認(rèn)的免疫刺激核酸(例如聚A:U和聚I:C)的一般估計不足的限制是 它們未明確的結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致調(diào)節(jié)受限。
權(quán)利要求
式(I)的核酸分子(NuGlXmGnNv)a，其中G 是鳥苷，尿苷或鳥苷或尿苷的類似物；X 是鳥苷，尿苷，腺苷，胸苷，胞苷，或這些核苷酸的類似物；N 是具有長度為約4 50，優(yōu)選地約4 40，更優(yōu)選地約4 30或約4 20個核酸的核酸序列，每個N獨立地選自鳥苷，尿苷，腺苷，胸苷，胞苷或這些核苷酸的類似物；a 是1 20，優(yōu)選地1 15，最優(yōu)選地1 10的整數(shù)；l 是1 40的整數(shù)，其中當(dāng)l＝1時，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)l＞1時，這些核苷酸的至少50％是鳥苷或其類似物；m 是整數(shù)并且至少是3；其中當(dāng)m＝3時，X是尿苷或其類似物，并且當(dāng)m＞3時，存在至少3個連續(xù)的尿苷或尿苷的類似物；n 是1 40的整數(shù)，其中當(dāng)n＝1時，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)n＞1時，這些核苷酸的至少50％是鳥苷或其類似物；u，v 可以彼此獨立地是0 50的整數(shù)，優(yōu)選地，其中當(dāng)u＝0時，v≥1，或當(dāng)v＝0時，u≥1；其中式(I)的核酸分子具有至少50個核苷酸的長度，優(yōu)選地至少100個核苷酸的長度，更優(yōu)選地至少150個核苷酸的長度，甚至更優(yōu)選地至少200個核苷酸的長度和最優(yōu)選地至少250個核苷酸的長度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其特征在于，所述式(I)的核酸分子包含核心結(jié)構(gòu)G1XmGn， 其選自根據(jù)SEQ ID NOs 1-80任一個的至少一種序列-GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 1)；-GGGG⑶UUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 2)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 3)；-⑶⑶⑶⑶⑶⑶UUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 4)；-GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUG(iUUG(;UUG(;UU(SEQ ID NO 5)；-GGGGGGGGGUUUGGGGGGGG(SEQIDNO6)；-GGGGGGGCiUUUUGGGGGGGG (SEQIDNO7)；-GGGGGGGUUUUUUGGGGGGG(SEQIDNO8)；-GGGGGGGUUUUUUUGGGGGG(SEQIDNO9)；-GGGGG⑶UUUUUUUGGGGGG(SEQIDNO10)-GGGGG⑶UUUUUUUUGGGGG(SEQIDNO11)-GGGGG⑶UUUUUUUUUGGGG(SEQIDNO12)-GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG(SEQIDNO13)-GGGGGUUUUUUUUUUUUGGG(SEQIDNO14) 2-GGG⑶UUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 15)；-GGG⑶UUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 16)；-G⑶UUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 17)；-GUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO 18)；-GGGGGGGGG⑶UUGGGGGGGGG(SEQ ID NO 19)；-GGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO 20)；-GGGGGGG⑶UUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 21)；-GGGGGGG⑶UUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 22)；-GGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 23)；-GGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 24)；-GGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 25)；-GGGGG⑶UUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 26)；-GGGGG⑶UUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 27)；-GGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 28)；-GGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 29)；-GGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 30)；-G⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 31)；-GGGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGG(SEQ ID NO 32)；-GGGGGGGGG⑶UUUGGGGGGGGGG(SEQ ID NO 33)；-GGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO 34)；-GGGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 35)；-GGGGGGG⑶UUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 36)；-GGGGGGG⑶UUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 37)；-GGGGGGG⑶UUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 38)；-GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 39)；-GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 40)；-GGGGG⑶UUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 41)；-GGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 42)；-GGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 43)；-GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 44)；-GUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO 45)；-G⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 46)；-GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 47)；-GGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 48)；-GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO 49)；-GGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 50)；-GGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 51)；-GGGGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO 52)；-GGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO 53)；-GGUUUGG(SEQ ID NO 54)； -GGUUUUGG(SEQ ID NO 55)； -GGUUUUUGG(SEQ ID NO 56)； -GGUUUUUUGG(SEQ ID NO 57)； -GGUUUUUUUGG(SEQ ID NO 58)； -GGUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 59)； -GGUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 60)； -GGUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 61)； -GGUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 62)； -GGUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 63)； -GGUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 64)； -GGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 65)； -GGUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 66)； -GG⑶UUGGG(SEQ ID NO 67)； -GG⑶UUUGGG(SEQ ID NO 68)； -GG⑶UUUUGGG(SEQ ID NO 69)； -GG⑶UUUUUGGG(SEQ ID NO 70)； -GG⑶UUUUUUGGG(SEQ ID NO 71)； -GG⑶UUUUUUUGGG(SEQ ID NO 72)； -GG⑶UUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 73)； -GG⑶UUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 74)； -GG⑶UUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 75)； -GG⑶UUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 76)； -GG⑶UUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 77)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUGG⑶UUUUUUUUUUUUUGGGU UUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO 78)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 79)；-GG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGGG (SEQ ID NO 80)；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸，其特征在于所述核酸包含具體的式(II) 聚(X) S(NuG1XmGnNv)a 聚(X)t,其中G，X，N，a, 1，m，n，u和ν如上關(guān)于式(I)定義；并且聚(X)是核酸的同聚片段，其中X可以是關(guān)于根據(jù)式(I)的核酸分子的X定義的任何 核酸；并且s，t 分別是彼此獨立地選自約5-100，優(yōu)選地約5-70，更優(yōu)選地約5-50，甚至更優(yōu)選 地約5-30和最優(yōu)選地約5-20的整數(shù)，其中所述式(II)的核酸分子具有至少50個核苷酸的長度，優(yōu)選地至少100個核苷酸， 更優(yōu)選地至少150個核苷酸，甚至更優(yōu)選地至少200個核苷酸和最優(yōu)選地至少250個核苷 酸的長度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸，其特征在于所述根據(jù)式(II)的核酸分子具體地是根據(jù)式(IIa)的核酸分子 聚⑴(NuG1XmGnNv)atl
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸，其特征在于所述根據(jù)式(II)的核酸分子具體地是根據(jù)式 (IIb)的核酸分子聚(X) (NuG1XmGnNv) 3聚(X)0
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項的核酸，其特征在于核酸聚(X)的同聚片段是單鏈，部分 雙鏈或雙鏈RNA序列。
7.權(quán)利要求3-6中任一項的核酸，其特征在于核酸聚(X)的同聚片段選自胞苷(聚 (C))，鳥苷(聚(G))，腺苷(聚(A))，尿苷(聚(U))，肌苷(聚(I))的單鏈片段，或選自肌 苷和胞苷(聚(I:C))，或腺苷和尿苷(聚(A:U))的同聚雙鏈片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項的核酸，其特征在于所述核酸包含具體的式(IIIa) (Nu-IG1XmGn-ZNv)a,或具體的式(IIIb) (NuG1XmGnNv)a-INwl 莖2\2， 其中每個G，X，N，a, 1，m，n，u和ν如上關(guān)于式(I)定義；并且 wl, w2是彼此獨立地如上關(guān)于式(I)的整數(shù)u，ν定義的整數(shù)；并且 莖1，莖2 是回文序列并形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述回文序列分別由具有約5-50，更優(yōu) 選地約5-40和最優(yōu)選地約5-30個核酸的核酸序列形成，所述核酸選自腺苷、鳥苷、胞苷、尿 苷、胸苷或其類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的核酸，其特征在于所述式(I)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的核酸分子以RNA或DNA的形式存在，是單鏈，雙鏈或部分雙鏈，和/ 或是線性或環(huán)狀的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的核酸，其特征在于所述式(I)，(II)，(IIa),(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的任一個的核酸以單鏈RNA，雙鏈RNA或部分雙鏈RNA，優(yōu)選地部分雙 鏈RNA的形式存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的核酸，其特征在于式(I)，(II)，(IIa)，(lib), (IIIa)和/或(IIIb)的任一個的核酸以RNA的形式存在，并且另外在5'末端具有"帽結(jié) 構(gòu)"和/或在3'末端具有聚A尾和/或在3'末端具有聚-C尾。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的核酸，其特征在于所述核酸通過體外翻譯制備。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的核酸，其用作藥物，特別用作免疫刺激劑。
14.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的核酸，藥用載體，和任選地另外 的輔助物質(zhì)，添加劑和/或佐劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其另外地包含至少一種藥用活性成分.
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其特征在于所述至少一種藥用活性成分選自由下 列各項組成的組肽，蛋白質(zhì)，核酸，具有低于5000的分子量的(治療活性的)低分子量有 機(jī)或無機(jī)化合物，糖，抗原，抗體，病原體，減毒的病原體，失活的病原體，(人)細(xì)胞，細(xì)胞片 段或級分和其它治療劑，其優(yōu)選地被改進(jìn)以顯示增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染性質(zhì)，包括通過與脂質(zhì)和/或 聚陽離子化合物絡(luò)合，所述聚陽離子化合物包含聚陽離子肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任一項的藥物組合物，其特征在于所述組合物包含至少一 種另外的佐劑，其是免疫刺激劑，選自由下列各項組成的組陽離子肽，包括多肽，所述多 肽包括魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，包括脫乙酰殼多糖的陽離子多糖，TDM, MDP，胞 壁酰二肽，泊洛沙姆，明礬溶液，氫氧化鋁，ADJUMER (聚磷腈)；磷酸鋁凝膠；來自海藻的 葡聚糖；algammulin ；氫氧化鋁凝膠(明礬)；高蛋白吸附性氫氧化鋁凝膠；低粘性氫氧化 鋁凝膠；AF或SPT(角鯊?fù)榈娜闋钜?5% )，吐溫80(0. 2% )，泊洛沙姆L121 (1. 25% )，磷 酸鹽緩沖鹽水，PH 7.4) ；AVRIDINE (丙二胺)；BAY R1005 ((N-(2-脫氧-2-L-亮氨酰氨 基-b-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二烷酰_酰胺氫化乙酸鹽；CALCITRI0Ltm(1-ci， 25-二甲基羥基-維生素D3)；磷酸鈣凝膠；CAPTM(磷酸鈣納米顆粒)；霍亂全毒素，霍 亂_毒素-Al-蛋白-A-D-片段融合蛋白，霍亂毒素的B亞基；CRL 1005(嵌段共聚物 P1205)；包含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體；DDA(二甲基二(十八烷基)溴化銨)；DHEA(脫氫表雄 酮)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿)；DMPG(二肉豆蔻酰磷脂酰甘油)；DOC/明礬復(fù)合物 (脫氧膽酸鈉鹽)；弗氏完全佐劑；弗氏不完全佐劑；Y菊粉；Gerbu佐劑((i)N-乙?；?糖胺基-(Pl-4)-N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，ii) 二甲基二(十八烷 基)氯化銨(DDA)，iii)鋅-L-脯氨酸鹽復(fù)合物(ZnPro-8)的混合物)；GM-CSF) ；GMDP (N-乙 ?；咸前坊?(bl-4)-N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺)；咪喹莫特(1-(2_甲 基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)；ImmTherTM(N-乙?；咸前坊?N-乙?；?壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二棕櫚酸酯)；DRVs (制備自脫水-再水合的囊泡的 免疫脂質(zhì)體)；Y _干擾素；白介素-1 β ；白介素_2 ；白介素-7 ；白介素-12 ；ISC0MS (" 免疫刺激復(fù)合物")；ISC0PREP 7.0.3. 脂質(zhì)體；L0X0RIBINE (7-烯丙基-8-氧代鳥 苷(鳥嘌呤))；LT 口服佐劑(大腸桿菌不穩(wěn)定的腸毒素_原毒素)；任何組合物的微球體 和微粒；MF59 ;(角鯊烯-水乳狀液)；M0NTANIDE ISA 51 (純化的不完全弗氏佐劑)； MONTANIDE ISA 720 (可代謝的油性佐劑)；MPL (3-Q-脫酰基-4'-單磷?；|(zhì)A)； MTP-PE和MTP-PE脂質(zhì)體((N-乙酰基-L-丙氨酰-D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2- (1，2- 二 棕櫚酰-sn-甘油-3-(羥基磷酰氧基))乙基酰胺，單鈉鹽)；MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Al B-D-Gln-OCH3) ；MURAPALMITINE 和 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-異 Gln-sn-甘 油二棕櫚酰)；NAGO(神經(jīng)氨酸酶-半乳糖氧化酶)；任何組合物的納米球體或納米顆粒； NISVs (非離子表面活性劑囊泡)；PLEURAN (i3 -葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA (乳酸和羥基乙 酸的均聚物和共聚物；微球體/納米球體)；泊洛沙姆L121 ;PMMA(聚甲基甲基丙烯酸酯)； P0DDS (類蛋白微球體)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；聚_rA:聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸 復(fù)合物)；聚山梨酸酯80 (吐溫80)；蛋白脂質(zhì)卷(Avanti Polar Lipids, Inc. ,Alabaster, AL) ；STIMUL0N (QS-21) ；Quil-A (Qui 1_A 皂苷)；S-28463 (4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧 基甲基-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1 (〃興泰克佐劑制劑")；仙臺脂蛋白 體和包含仙臺的脂質(zhì)基質(zhì)；司盤-85 (三油酸山梨坦)；Specol(Marcol 52，司盤85和吐溫 85的乳狀液)；角鯊烯或Robane (2，6，10，15，19，23-六甲基二十四烷和2，6，10，15，19， 23-六甲基_2，6，10，14，18，22_二十四碳己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸鹽酸鹽)； Theramid (N-乙?；咸前坊?N-乙?；邗?L-Ala-D-異Glu-L-Ala- 二棕櫚氧基丙 酰胺)；蘇氨酰-MDP (Termurtide 或[thr 1] -MDP ；N-乙?；邗?L-蘇氨酰-D-異谷 氨酰胺)；Ty顆粒(Ty-VLPs或病毒樣顆粒)；Walter-Reed脂質(zhì)體(包含吸附在氫氧化鋁上的脂質(zhì)A的脂質(zhì)體)和脂肽，包括Pam3Cys，特別是鋁鹽，如Adju-phos，鋁膠，吸附氫氧化鋁凝膠，等；乳狀液，如CFA，SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin，等；共聚物，如 Optivax (CRL1005)，L121, 泊洛沙姆4010)，等；脂質(zhì)體，如Stealth,等，脂質(zhì)卷，如BI0RAL,等；植物衍生的佐劑，如 QS21，Quil A，Iscomatrix, ISC0M，等；適合于共刺激的優(yōu)選的佐劑可以包括例如番茄素， 生物聚合物，如PLG，PMM,菊粉，等；微生物衍生的佐劑，如羅莫肽，DETOX, MPL, CffS,甘露糖， CPG7909, ISS-1018, IC31，咪唑并喹啉，聚肌胞，Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs，霍亂毒素， 熱不穩(wěn)定的毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI錨，LNFPIII/LewisX，抗菌肽，UC-1V150，RSV融合 蛋白，cdiGMP，等；適合作為拮抗劑的優(yōu)選的佐劑可以例如包括CGRP神經(jīng)肽，或選自適合用于庫和遞送的陽離子或聚陽離子化合物，包括魚精蛋白，核仁蛋白，精胺 或亞精胺，或其它陽離子肽或蛋白質(zhì)，包括聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸，堿性多肽，細(xì) 胞滲透肽(CPPs)，包括HIV結(jié)合肽，Tat, HIV-I Tat (HIV), Tat衍生的肽，穿膜肽，VP22衍 生的或類似的肽，HSV VP22(單純皰疹)，MAP，KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620，富含 脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，一種或多種MPG-肽，Pep-1, L-寡聚體，一 種或多種降鈣素肽，觸角足衍生肽(特別地來自果蠅觸角足)，pAntp，pIsl，F(xiàn)GF，乳鐵蛋白， Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，ρVEC, hCT-衍生的肽，SAP,魚精蛋白， 精胺，亞精胺，或組蛋白；另外地，優(yōu)選的陽離子或聚陽離子蛋白質(zhì)或肽可以是選自具有下 列總式的下列蛋白或肽(Arg)1 ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ； (Xaa)x，其中 l+m+η+ο+χ = 8-15, 并且1，111，11或0彼此獨立地可以是選自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15的任 何數(shù)字，條件是Arg，LyS，HiS和Orn的總含量代表寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa 可以是選自除Arg，Lys, His或Orn之外的天然(=天然存在)或非天然氨基酸的任何氨 基酸；并且χ可以是選自0，1，2，3或4的任何數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過寡肽的所有 氨基酸的50%，陽離子多糖，例如脫乙酰殼多糖，1，5_二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴 化物，陽離子聚合物，包括聚乙烯亞胺(PEI)，陽離子脂質(zhì)，包括DOTMA [1- (2，3- 二油酰氧 基丙基)]_N，N, N-三甲基氯化銨，DMRIE, 二 _C14_ 脒，DOTIM，SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇 _ 胺，DOSPA，DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS 二(十八烷 基)氨基甘氨酰精胺，DIMRI 二肉豆蔻酸-氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨，DOTAP 二油 酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14 :0，0- 二(十四烷酰)-N- ( α -三甲基氨溶乙酰基) 二乙醇胺氯化物，CLIPl 外消旋_[(2，3-二(十八烷基)氧基丙基)(2-羥基乙基)]-二 甲基氯化銨，11 6:外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三 甲基銨，0^9:外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基]-三 甲基銨，寡核苷酸轉(zhuǎn)染，或陽離子或聚陽離子聚合物，包括修飾的聚氨基酸，包括β _氨基 酸_聚合物或逆性聚酰胺，修飾的聚乙烯，包括PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))， 修飾的丙烯酸酯，包括pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，修飾的酰胺胺包括 pAMAM(聚(酰胺胺))，修飾的聚β氨基酯(PBAE)，包括二胺端修飾的1，4 丁二醇二丙烯酸 酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，樹狀聚體，包括聚丙基胺樹狀聚體或基于PAMAM的樹狀聚 體，(多種)聚亞胺，包括PEI 聚(乙烯亞胺)，聚(丙烯亞胺)，聚烯丙基胺，基于糖主鏈的 聚合物，包括基于環(huán)糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，脫乙酰殼多糖，基于硅烷主鏈的 聚合物，包括PM0XA-PDMS共聚物，由一個或多個陽離子嵌段(包含如上所述的選擇的陽離子聚合物)和一個或多個親水性或疏水性嵌段(例如聚乙烯乙二醇)的組合組成的嵌段聚 合物；或可以選自式(IV) =G1XmGn的核酸，其中G是鳥苷，尿苷或鳥苷或尿苷的類似物；X是 鳥苷，尿苷，腺苷，胸苷，胞苷或上述核苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，G 是鳥苷或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物；m是整數(shù)并且至少 是3 ；其中當(dāng)m = 3時，X是尿苷或其類似物，當(dāng)m > 3時，至少3個連續(xù)的尿苷或尿苷的類 似物存在；η是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)η > 1時，至少50% 的核苷酸是鳥苷或其類似物；或選自式(V) =C1XmCn的核酸，其中C是胞苷，尿苷或胞苷或尿苷的類似物；X是鳥苷， 尿苷，腺苷，胸苷，胞苷或上述核苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，C是胞苷 或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核苷酸是胞苷或其類似物；m是整數(shù)并且至少是3 ；其 中當(dāng)m = 3時，X是尿苷或其類似物，當(dāng)m > 3時，至少3個連續(xù)的尿苷或尿苷的類似物存 在；η是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時，C是胞苷或其類似物，當(dāng)η > 1時，至少50%的核苷 酸是胞苷或其類似物。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17中任一項的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物是疫苗。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的核酸用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療癌癥 疾病，自體免疫疾病，變應(yīng)性或感染性疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其特征在于所述癌癥疾病選自結(jié)腸癌，黑素瘤，腎癌，淋 巴瘤，急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋 巴細(xì)胞白血病(CLL)，胃腸腫瘤，肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，甲狀腺腫瘤，乳癌，前列腺腫瘤，肝癌，各 種病毒誘導(dǎo)的腫瘤如，例如，乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的癌癥(例如宮頸癌)，腺癌，皰疹病毒誘導(dǎo) 的腫瘤(例如伯基特淋巴瘤，EBV-誘導(dǎo)的B-細(xì)胞淋巴瘤)，乙型肝炎病毒誘導(dǎo)的腫瘤(肝 細(xì)胞癌)，HTLV-I-和HTLV-2-誘導(dǎo)的淋巴瘤，聽神經(jīng)瘤/神經(jīng)鞘瘤，宮頸癌，肺癌，咽癌，肛 門癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，淋巴瘤，直腸癌，星形細(xì)胞瘤，腦腫瘤，胃癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，基底細(xì) 胞癌，腦轉(zhuǎn)移，髓母細(xì)胞瘤瘤，陰道癌，胰腺癌，睪丸癌，黑素瘤，甲狀腺癌，膀胱癌，霍奇金綜 合征，腦膜瘤，Schneeberger病，支氣管癌，垂體腫瘤，蕈樣肉芽腫病，食管癌，乳腺癌，類癌， 神經(jīng)鞘瘤，spinaliomas，伯基特淋巴瘤，喉癌，腎癌，胸腺瘤，子宮體癌，骨癌，非霍奇金淋巴 瘤，尿道癌，CUP綜合征，頭/頸腫瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，外陰癌，小腸癌，結(jié)腸癌，食管癌，疣 累及，小腸腫瘤，顱咽管瘤，卵巢癌，軟組織腫瘤/肉瘤，卵巢癌，肝癌，胰腺癌，宮頸癌，子宮 內(nèi)膜癌，肝轉(zhuǎn)移，陰莖癌，舌癌，膽囊癌，白血病，漿細(xì)胞瘤，子宮癌，瞼腫瘤和前列腺癌。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其特征在于所述感染性疾病選自流感，瘧疾，SARS，黃熱 病，AIDS，萊姆疏螺旋體病，利什曼病，炭疽，腦膜炎，病毒傳染性疾病如AIDS，尖銳濕疣，空 心疣，登革熱，三日熱，埃博拉病毒，感冒，早夏腦膜腦炎(FSME)，流行性感冒，帶狀皰疹，肝 炎，I型單純皰疹，II型單純皰疹，帶狀皰疹，流感，日本腦炎，拉沙熱，馬爾堡病毒，麻疹，口 蹄疫，單核細(xì)胞增多癥，流行性腮腺炎，諾瓦克病毒感染，傳染性單核細(xì)胞增多癥，天花，脊 髓灰質(zhì)炎(兒童跛行)，假格魯布，傳染性紅斑，狂犬病，疣，西尼羅熱，水痘，巨細(xì)胞癥病毒 (CMV)，選自細(xì)菌感染性疾病，如流產(chǎn)(前列腺炎癥)，炭疽，闌尾炎，疏螺旋體病，肉毒中毒， 彎曲菌屬，沙眼衣原體(尿道炎癥，結(jié)膜炎)，霍亂，白喉，杜諾凡菌病，會厭炎，斑疹傷寒，氣 性壞疽，淋病，兔熱病，幽門螺桿菌，百日咳，腹股溝淋巴肉芽腫，骨髓炎，軍團(tuán)病，麻風(fēng)病，利斯特菌病，肺炎，腦膜炎，細(xì)菌性腦膜炎，炭疽，中耳炎，人支原體，新生兒膿毒癥(絨毛膜羊 膜炎)，壞疽性口炎，副傷寒，鼠疫，萊特爾綜合征，洛磯山斑疹熱，副傷寒沙門氏菌，傷寒沙 門氏菌，猩紅熱，梅毒，破傷風(fēng)，淋病，恙蟲病，結(jié)核病，斑疹傷寒，鞘炎(陰道炎)，軟下疳，和 選自由寄生蟲、原生動物或真菌引起的感染性疾病，如阿米巴病，血吸蟲病，美洲錐蟲病，足 癬，酵母菌斑，疥瘡，瘧疾，盤尾絲蟲病(河盲)，或真菌病，弓形體病，滴蟲病，錐蟲病(昏睡 病)，內(nèi)臟利什曼病，尿布/尿布皮炎，血吸蟲病，魚肉中毒(雪卡毒素)，念珠菌病，皮膚利 什曼病，蘭氏鞭毛蟲病(賈第蟲病)，或昏睡病，或選自由棘球絳蟲、闊節(jié)裂頭絳蟲、狐絳蟲、 犬絳蟲、虱、牛肉絳蟲、豬肉絳蟲和微小絳蟲引起的感染性疾病。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其特征在于自體免疫疾病選自由下列各項組成的組1 型自體免疫疾病或II型自體免疫疾病或III型自體免疫疾病或IV型自體免疫疾病，如， 例如，多發(fā)性硬化(MS)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，I型糖尿病(糖尿病)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE)，慢性多關(guān)節(jié)炎，巴塞多氏病，慢性肝炎的自體免疫形式，潰瘍性結(jié)腸炎，I型變應(yīng)性疾 病，II型變應(yīng)性疾病，III型變應(yīng)性疾病，IV型變應(yīng)性疾病，纖維肌痛，脫發(fā)，別赫捷列夫氏 病，克羅恩氏病，重癥肌無力，神經(jīng)性皮炎，風(fēng)濕性多肌痛，進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病(PSS)，銀屑 病，萊特爾綜合征，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，脈管炎，等，或II型糖尿病。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其特征在于所述變應(yīng)性選自由下列各項組成的組變應(yīng) 性哮喘(導(dǎo)致鼻粘膜的腫脹)，變應(yīng)性結(jié)膜炎(導(dǎo)致結(jié)膜的發(fā)紅和發(fā)癢)，變應(yīng)性鼻炎(“花 粉熱")，過敏反應(yīng)，血管性水腫，特異性皮炎(濕疹)，蕁麻疹(假膜性喉頭炎)，嗜酸粒細(xì) 胞增多，對于昆蟲叮咬的呼吸系統(tǒng)變應(yīng)性，皮膚變應(yīng)性(導(dǎo)致并包括各種皮疹，如濕疹，假 膜性喉頭炎(蕁麻疹)，和(接觸性)皮炎)，食物變應(yīng)性，和對于藥物的變應(yīng)性。
24.試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的核酸或根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一 項的藥物組合物，以及另外任選地包含用于利用關(guān)于所述核酸或所述藥物組合物的施用和 劑量的信息的技術(shù)說明書。
25.治療疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥選自由下列各項組成的組癌癥疾病，感 染性疾病，自體免疫疾病和變應(yīng)性，所述方法通過將藥用有效量的權(quán)利要求1-12中任一項 的核酸或權(quán)利要求14-18中任一項的藥物組合物施用于需要其的患者來進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為免疫刺激劑/佐劑的通式(I)的核酸(NuGlXmGnNv)a及其衍生物，以及包含其的組合物，所述組合物任選地包含另外的佐劑。本發(fā)明還涉及各自包含作為免疫刺激劑的上述式(I)的核酸和/或其衍生物，和任選地包含至少一種另外的藥用活性成分，例如抗原劑的藥物組合物或疫苗。本發(fā)明同樣涉及藥物組合物或疫苗用于治療癌癥疾病，感染性疾病，變應(yīng)性和自體免疫疾病等的應(yīng)用。同樣地，本發(fā)明包括通式(I)的核酸(NuGlXmGnNv)a和/或其衍生物用于制備藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療所述疾病。
文檔編號C12N15/117GK101932707SQ200980103728
公開日2010年12月29日 申請日期2009年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者托馬斯·克蘭普斯, 索渥克·福斯, 約亨·普羅布斯特, 英馬爾·霍伊爾 申請人:庫瑞瓦格有限責(zé)任公司