專利名稱：嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
W002]本申請(qǐng)描述了用于工業(yè)過程，如淀粉的液化的α-淀粉酶變體。α -淀粉 酶具有增加的比活性，允許最大粘度在液化過程中更快速地降低。
背景技術(shù)：
對(duì)于使用淀粉作為起始材料的許多工業(yè)過程，期望具有這樣的淀粉分解 酶，其在高溫下起作用以快速降解淀粉，釋放更小的糖類，導(dǎo)致粘度降低。粘度降低得越 多，該酶更容易進(jìn)一步切割淀粉，并且需要用于混合反應(yīng)的機(jī)械力更少。許多酶用于淀 粉液化，包括分別來自地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenformis)或嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophilus)的α -淀 粉酶AmyL和AmyS，其非常適合于在高溫下 液化淀粉。
一般地，必須向液化過程中加入足夠量的酶，以提供目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，即必須有 足夠的酶活性(或催化活性)以在預(yù)選時(shí)間里液化淀粉底物?？蓽y定每單位酶的酶活性， 并稱為比活性。因此，必須以更高的量使用具有更低比活性的酶，以在給定過程中提供想要 量的酶活性。通常有利地是，能夠制備高比活性的酶制劑，允許使用更少的量產(chǎn)生想要的效 果。例如，這可通過純化酶粗制劑來實(shí)現(xiàn)。然而，即使純酶在特定測定條件下對(duì)給定的底物 也有最大的比活性。
存在適合于在高溫下液化淀粉的改良α _淀粉酶的需要。發(fā)明概述
本文提供用于淀粉降解工業(yè)過程的α-淀粉酶變體。變體淀粉酶基于來 自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生物的野生型α-淀粉酶，尤其是 AmyS α-淀粉酶的多肽序列。
變體淀粉酶是有用的，因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)于其來源親本淀粉酶具有提高的比活 性，由此在淀粉水解應(yīng)用中提供提高的性能。變體淀粉酶尤其用于淀粉降解過程，如用于乙 醇生產(chǎn)過程和織物及其他針織材料(woven material)脫漿過程的液化。酶是相對(duì)熱穩(wěn)定 的，并且在一般用于淀粉降解的條件下具有良好活性。變體淀粉酶的特征是它們?cè)诟邷匾?化過程中降低淀粉漿液初始粘度方面共有改良性質(zhì)。而且，因?yàn)樽凅w淀粉酶可以更少的量 單獨(dú)使用或與其他酶混合使用，它們還為最終用戶和生產(chǎn)商提供了經(jīng)濟(jì)利益。
本發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案包括分離的變體α -淀粉酶、包含這些酶 的組合物、和使用所述酶或組合物的方法，以及編碼所述變體酶的核酸、表達(dá)載體、和表達(dá) 所述α-淀粉酶變體的宿主細(xì)胞。
一方面，提供來自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體α-淀粉酶。該變體在成熟蛋白質(zhì)181和/或182位上發(fā)生了改變。具體而言，改變野生型序列，使得181位、182位或這兩個(gè)位置上天然發(fā)生的氨基酸被野生型該位置上不存在的不同氨基酸殘基取 代。優(yōu)選地，181位的野生型氨基酸殘基取代為Ala、Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，和/或182 位的野生型氨基酸殘基取代為Ala、Ser或Pro。
另一方面，提供包含一種或多種具有α _淀粉酶活性的變體α -淀粉酶的 組合物。該組合物可進(jìn)一步包含一種或多種其他的酶，如具有用于液化復(fù)合糖類(包括直 鏈淀粉和支鏈淀粉)，例如淀粉的活性的酶。在一個(gè)實(shí)例中，提供包含本文描述或示例的一 種或多種變體α-淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物。
還提供編碼變體α -淀粉酶，如具有氨基酸序列SEQ ID NO :1_17的那些 變體α-淀粉酶的多核苷酸。特定多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:2、3、4、5、10、 15、17或19的多肽。還提供包含多核苷酸的載體、包含多核苷酸或載體中一種的細(xì)菌細(xì)胞 和宿主細(xì)胞，和用于表達(dá)編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。
還提供制備和使用淀粉酶變體和組合物的方法。一方面，提供產(chǎn)生包 含來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的野生型α-淀粉酶的至少一個(gè)變體的組合物的方法。該方 法包括利用宿主細(xì)胞用于發(fā)酵過程，其中表達(dá)所述至少一個(gè)變體α-淀粉酶。如上，所 述變體在成熟蛋白質(zhì)的181位或182位上包含取代。宿主細(xì)胞優(yōu)選為芽孢桿菌屬物種， 如地衣芽孢桿菌(B. lichenformis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophiIus)。該方法使得必須進(jìn)行最后一步，即至少部分純化所述至少一個(gè) 變體α-淀粉酶的最后一步，由此導(dǎo)致包括至少一個(gè)變體α-淀粉酶的組合物的產(chǎn)生。W013]提供使用如本文提供的淀粉酶變體液化淀粉漿液的方法。所述方法包括制 備包含淀粉的漿液，將漿液加熱至液化可接受的溫度，向漿液中加入如本文描述的包含至 少一種變體的組合物，并將漿液與組合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí)間。
進(jìn)一步提供處理針織材料的方法，所述針織材料前面已經(jīng)與包含淀粉或淀 粉衍生物的涂層(coating)接觸過。所述方法包括使針織材料與包含如上文提供的α-淀 粉酶變體的液體在足以從所述針織材料中基本上去除涂層的條件下接觸一段時(shí)間。
本發(fā)明還提供酶混合物。酶混合物包含至少第一種和第二種α-淀粉酶。 第一種α-淀粉酶具有催化活性，當(dāng)其用于液化過程時(shí)，產(chǎn)生比第二種α-淀粉酶提供的終 粘度低的終粘度。當(dāng)每一種酶單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程時(shí)，第一種α-淀粉酶的活性產(chǎn)生最 大粘度，其高于第二種α-淀粉酶活性產(chǎn)生的最大粘度。酶混合物提供全部或組合催化活 性，當(dāng)其用于液化過程時(shí)產(chǎn)生與相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用第一種α-淀粉酶得到的終粘度 大致相同的終粘度，和顯著低于相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用第二種α “淀粉酶得到的最大粘 度的最大粘度。
還提供使用酶混合物液化淀粉漿液的方法。該方法包括制備包含淀粉的漿 液，將漿液加熱至液化可接受的溫度，向漿液中加入如上提供的酶混合物(例如，包含第一 種和第二種α“淀粉酶)，并將漿液與酶混合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí) 間。優(yōu)選地，該方法提供大約與在相當(dāng)(comparable)液化過程中單獨(dú)使用第一種α _淀粉 酶獲得的終粘度一樣低的終粘度，和比在相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用第二種α “淀粉酶獲得 的最大粘度低的最大粘度。
還提供使用本文公開的淀粉酶變體、組合物和/或酶混合物產(chǎn)生乙醇的方法。
提供制備變體淀粉酶的方法，和使用α _淀粉酶變體以及包含該用于液化 的變體的組合物和混合物，以及加工針織材料以去除涂層的方法。W019]還提供用于促進(jìn)淀粉漿液液化的試劑盒。所述試劑盒包括以下中的至少一 種如上文提供的變體α -淀粉酶，如上文提供的包含淀粉酶變體的組合物，如上文提供的食品級(jí)凍干組合物，或 如上文提供的酶混合物；和用于在淀粉漿液液化中使用試劑盒的說明書。
下文闡明了本發(fā)明組合物和方法的特定方面和實(shí)施方案
一方面，提供基于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的親本α-淀粉酶的變體α-淀 粉酶，其中所述變體與親本α _淀粉酶相比在181位氨基酸、或182位氨基酸或這兩個(gè)位置 的氨基酸上包含取代，其中變體181位上的氨基酸殘基選自Pr0、Ala、Leu、CyS、ASp和Glu， 變體182位上的氨基酸殘基選自Pro、Ala和Ser。
在一些實(shí)施方案中，變體α-淀粉酶具有選自SEQ ID NO :3(I181P)、SEQ ID NO :2(I181A)、SEQ ID NO :10 (I181L)、SEQ ID NO :4 (I181C)、SEQ ID NO :5 (I181D)、SEQ ID NO :6(I181E)和SEQ ID NO :15(I181Y)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，變體α-淀 粉酶具有選自 SEQ ID NO :18(G182P)、SEQ ID NO :16(G182A)和 SEQ ID NO :17(G182S)的
氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，親本α -淀粉酶具有與SEQ ID NO=I的氨基酸序列具 有至少85%同一性的氨基酸序列。在特定實(shí)施方案中，親本α-淀粉酶具有SEQ ID NO=I 的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，變體α-淀粉酶在特定測定條件下相比于野生型 α _淀粉酶具有增加的比活性。在一些實(shí)施方案中，所述變體在約50-90°C之間具有增加的 比活性。在特定實(shí)施方案中，所述變體α-淀粉酶在約65_85°C之間具有增加的比活性。
另一方面，提供包含變體α -淀粉酶的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述組 合物包含至少一種其他的酶。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種其他的酶具有用于液化包 含直鏈淀粉和支鏈淀粉的復(fù)合糖類的活性。在特定實(shí)施方案中，所述至少一種其他的酶是 其他的α-淀粉酶。
在一些實(shí)施方案中，液化過程中的組合物相比于在沒有變體α-淀粉酶的 情況下用其他的酶液化的相當(dāng)?shù)矸蹪{液的最大粘度，其降低了淀粉漿液的最大粘度。
在一些實(shí)施方案中，配制用于食品或食品加工的組合物。相關(guān)實(shí)施方案是 包含變體α-淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物。
另一方面，提供了編碼變體α -淀粉酶的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，優(yōu) 化多核苷酸的密碼子使用以用于在微生物或植物中表達(dá)所述變體α-淀粉酶。
在一些實(shí)施方案中，提供包含編碼變體α-淀粉酶的多核苷酸的表達(dá)載 體。在相關(guān)實(shí)施方案中，提供包含所述表達(dá)載體的細(xì)菌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，提供包含 編碼變體α-淀粉酶的多核苷酸的宿主細(xì)胞。多核苷酸可位于表達(dá)載體中。宿主細(xì)胞可以 是地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。宿主細(xì)胞或者可以是植物，并且植物可用于乙醇生產(chǎn)。
另一方面，提供液化淀粉漿液的方法，其包括制備包含淀粉的漿液；將漿液加熱至淀粉液化可接受的溫度；向漿液中加入項(xiàng)9 的組合物；并將漿液與組合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí)間。
在該方法的一些實(shí)施方案中，溫度從約50°C到約95°C。在該方法的一些實(shí) 施方案中，漿液包含約15-40%基于干重的淀粉。
在該方法的一些實(shí)施方案中，液化是發(fā)酵過程的一部分。在該方法的一些 實(shí)施方案中，發(fā)酵用于產(chǎn)生食品產(chǎn)品、食物添加劑、燃料、或燃料添加劑。在該方法的一些實(shí) 施方案中，所述燃料或燃料添加劑是醇。在特定實(shí)施方案中，所述醇是乙醇。
在該方法的一些實(shí)施方案中，溫育步驟產(chǎn)生相對(duì)于親本α _淀粉酶液化的 相當(dāng)漿液的最大粘度降低至少25%的最大粘度。
另一方面，提供處理之前已經(jīng)與包含淀粉或淀粉衍生物的涂層接觸過的針 織材料的方法，所述方法包括使所述針織材料與包含變體α“淀粉酶的溶液在足以從該針 織材料中基本上去除涂層的情況下接觸一段時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，所述針織材料是織 物(fabric)。在一些實(shí)施方案中，在比周圍大氣壓高的壓力下進(jìn)行接觸步驟。
另一方面，提供用于液化淀粉漿液的酶混合物。所述混合物包含至少第一種和第二種α -淀粉酶，所述第一種α -淀粉酶具有催化活性，當(dāng)其用于液化過程中時(shí)，產(chǎn)生比每一種酶 單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程中時(shí)，所述第二種α “淀粉酶的相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的終粘度低的終 粘度，但比其產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度，其中當(dāng)用于相當(dāng)液化過程中時(shí)，酶混合物提供這樣的催化活性，其產(chǎn)生與單獨(dú) 使用所述第一種α-淀粉酶得到的大致相同的終粘度，和顯著低于單獨(dú)使用所述第二種 α“淀粉酶得到的最大粘度的最大粘度；其中相當(dāng)液化過程包含溫度、ρΗ、鈣離子濃度和底物濃度的特定條件。
在相關(guān)方面，提供液化淀粉漿液的方法，其包括制備包含淀粉的漿液，將漿 液加熱至液化可接受的溫度，向漿液中加入包含所述第一種和第二種α “淀粉酶的酶混合 物，并將漿液與酶混合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí)間。在一些實(shí)施方案中， 終粘度大約與相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用所述第一種α-淀粉酶獲得的終粘度一樣低，并且 最大粘度低于相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用所述第二種α-淀粉酶獲得的最大粘度。在一些 實(shí)施方案中，與每一種酶單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程時(shí)分別加入的第一種和第二種α“淀粉酶 的相應(yīng)量相比，加入的酶混合物的量導(dǎo)致加入更少的第一種和第二種α“淀粉酶中的每一 種。在一些實(shí)施方案中，第一種和第二種α-淀粉酶中每一種的量約為單獨(dú)使用每一種時(shí) 加入的相應(yīng)量的一半。
另一方面，提供產(chǎn)生乙醇的方法，其包括利用以下中的一種或多種種來液化淀粉漿液 (a)基于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的親本α _淀粉酶的變體α _淀粉酶，其中所述變 體與親本α -淀粉酶相比在181位氨基酸、或182位氨基酸或這兩個(gè)位置的氨基酸上包含 取代，其中變體181位上的氨基酸殘基選自Pr0、Ala、Leu、CyS、ASp和Glu，變體182位上的 氨基酸殘基選自Pro、Ala和Ser，
(b)包含(a)的變體α -淀粉酶的組合物，(c)包含(a)的變體α -淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物，或(d)包含(a)的變體α -淀粉酶和第二種淀粉酶的酶混合物，變體α _淀粉酶具有 催化活性，當(dāng)其用于液化過程中時(shí)產(chǎn)生比變體α-淀粉酶和第二種淀粉酶中的每一種酶單 獨(dú)用于相當(dāng)液化過程中時(shí)所述第二種α“淀粉酶的相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的終粘度低的終粘 度，但比其產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度；發(fā)酵漿液中的至少一部分糖以產(chǎn)生乙醇；并至少部分純化所得乙醇。
在一些實(shí)施方案中，向液化的淀粉漿液中加入一種或多種其他酶的任選步 驟進(jìn)一步完成發(fā)酵步驟中的乙醇生產(chǎn)。
在另一方面，提供用于促進(jìn)淀粉漿液液化的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種(a)基于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的親本α _淀粉酶的變體α _淀粉酶，其中所述變 體與親本α -淀粉酶相比在氨基酸181位氨基酸、或182位氨基酸或這兩個(gè)位置的氨基酸 上包含取代，其中變體181位上的氨基酸殘基選自Pr0、Ala、Leu、CyS、ASp和Glu，變體182 位上的氨基酸殘基選自Pro、Ala和Ser，(b)包含(a)的變體α -淀粉酶的組合物，(c)包含(a)的變體α -淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物，或(d)包含(a)的變體α _淀粉酶和第二種淀粉酶的酶混合物，變體α -淀粉酶具有 催化活性，當(dāng)其用于液化過程中時(shí)產(chǎn)生比變體α-淀粉酶和第二種淀粉酶中的每一種酶單 獨(dú)用于相當(dāng)液化過程中時(shí)所述第二種α“淀粉酶的相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的終粘度低的終粘 度，但比其產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度；和用于液化淀粉漿液的試劑盒中的說明書。
本發(fā)明組合物和方法的這些方面和其他方面在以下描述和附圖中變得顯 而易見。附圖簡述


圖1顯示AmyS α -淀粉酶181位上的變體熱穩(wěn)定性篩選的結(jié)果。
圖2顯示使用淀粉酶SPEZYME ETHYL的淀粉水解反應(yīng)(液化)的結(jié)果。 圖A 在65°C溫育5分鐘后取出的樣品的HPLC色譜圖。圖B、C、D 溫度從65°C驟增到85°C 后分別5分鐘、15分鐘和30分鐘取出的樣品的HPLC色譜圖。
圖3顯示使用淀粉酶SPEZYME i XTRA的淀粉水解反應(yīng)的結(jié)果。圖A 在 65°C溫育5分鐘后取出的樣品的HPLC色譜圖。圖B、C、D 溫度從65°C開始驟增到85°C后 分別5分鐘、15分鐘和30分鐘取出的樣品的HPLC色譜圖。
圖4顯示使用變體α -淀粉酶AmyS I181P(SEQ ID NO 3)的淀粉水解反 應(yīng)的結(jié)果。圖A 在65°C溫育5分鐘后取出的樣品的HPLC色譜圖。圖B、C、D 溫度從65°C 開始驟增到85°C后分別5分鐘、15分鐘和30分鐘取出的樣品的HPLC色譜圖。
圖5顯示圖2、3和4的圖B的并列比較。
圖6顯示液化過程中粘度計(jì)中變體α -淀粉酶與SPEZYME XTRA的比較。
圖7A-B顯示使用粘度測定法，使用市售酶、變體或兩者的混合物進(jìn)行的淀 粉液化的比較。
圖8顯示本申請(qǐng)中使用的序列列表。序列簡述
SEQ ID NO :1是親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO :2是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代Ι181Α。
SEQ ID NO :3是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代Ι181Ρ。
SEQ ID NO :4是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181C。
SEQ ID NO :5是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181D。
SEQ ID NO 6是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代Ι181Ε。
SEQ ID NO :7是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181F。
SEQ ID NO :8是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181G。
SEQ ID NO :9是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代Ι181Η。
SEQ ID NO 10是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181L。
SEQ ID NO=Il是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181R。
SEQ ID NO 12是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代1181S。
SEQ ID NO 13是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代Ι181Τ。
SEQ ID NO 14是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代I181V。
SEQ ID NO 15是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代Ι181Υ。
SEQ ID NO 16是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代G182A。
SEQ ID NO 17是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代G182S。
SEQ ID NO 18是基于親本/野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體 α -淀粉酶的氨基酸序列，所述變體具有取代G182P。發(fā)明詳述
描述了提供優(yōu)于目前可得α-淀粉酶的某些優(yōu)勢(shì)和優(yōu)點(diǎn)的α -淀粉酶(α-淀粉酶)。變體α-淀粉酶顯示相對(duì)良好的熱穩(wěn)定性和寬泛的溫度最適條件，允許它 們用于高溫淀粉液化，例如用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，如醇，尤其是乙醇。此外，變體α-淀粉酶具 有提高的比活性(即，每單位酶的活性)；因此，可使用更少的酶達(dá)到親本/野生型淀粉酶 產(chǎn)生的相同結(jié)果。
淀粉酶變體可用于液化過程和其他淀粉降解過程，如脫漿針織材料。變體 淀粉酶也可彼此結(jié)合使用，和或與一種或多種其他酶結(jié)合，例如以混合物使用。優(yōu)選地，其 他酶在如用于變體α-淀粉酶的那些相同或類似反應(yīng)條件下是有活性的。酶混合物的使用 為最終用戶提供了更多的靈活性，并為最終用戶和生產(chǎn)商提供某些經(jīng)濟(jì)和加工優(yōu)勢(shì)。
在如液化應(yīng)用中提供比活性提高以及性能改變的變體酶的發(fā)現(xiàn)為生產(chǎn)商 和最終用戶提供了生產(chǎn)和使用淀粉酶的選項(xiàng)?？蛇x擇加工條件，如ΡΗ、溫度、離子強(qiáng)度和輔 助因子的存在，以支持混合物中存在的變體α-淀粉酶和一種或多種其他酶的活性。這些 加工條件可促進(jìn)使用連續(xù)或半連續(xù)方法，而不是昂貴且耗時(shí)的分批法。Α.定義和縮寫
根據(jù)該詳細(xì)描述，應(yīng)用以下縮寫和定義。單數(shù)形式“一個(gè)”、“該”和“所述” 包括復(fù)數(shù)，除非上下文另有明確說明。因此，例如，所稱“酶”包括多種這樣的酶，所稱“制 齊U”包括一種或多種制劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。
數(shù)值或范圍方面的術(shù)語“大約”表示數(shù)值可以比所述值高10%或低10%。 在其他實(shí)施方案中，“大約”表示數(shù)值可以比所述值高5 %或低5 %。
除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常理解的相同意思。定義以下術(shù)語用于說明1.定義
“淀粉酶”表示其中能夠催化淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉等降解的酶。一 般地，將α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 1 ;a-D_(l — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定義為內(nèi)作用酶 (endo-acting enzyme)，其切割含有三個(gè)或更多a-D-(l —4)連接葡萄糖單位的多糖中 的α-D-(1 — 4)0-糖苷鍵。α-淀粉酶釋放α-構(gòu)型的還原基團(tuán)。它們以隨機(jī)方式在淀 粉、糖原和相關(guān)多糖和寡糖上起作用。相反，外作用(exo-acting)淀粉酶從非還原末端連 續(xù)切割底物分子。葡聚糖1，4-α-麥芽糖水解酶(麥芽α-淀粉酶；EC 3. 2. 1. 133)產(chǎn)生 終產(chǎn)物α "麥芽糖，而β _淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)產(chǎn)生β -麥芽糖。β -淀粉酶、α -葡糖 苷酶(EC 3.2. 1.20 ； α-D-葡糖苷葡糖苷酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1. 3 ； α-D-(1 — 4)-葡 聚糖葡糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可從其各自底物產(chǎn)生特定長度的低聚麥芽糖 (malto-oligosaccharide)。葡糖淀粉酶從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原末端釋放葡 糖殘基。葡糖淀粉酶也催化α _1，6和α _1，3鍵的水解，盡管速率比催化α _1，4鍵低得多。
“ α -淀粉酶變體”、“ α -淀粉酶變體多肽”和“變體淀粉酶”或“變體酶” 表示具有從野生型α-淀粉酶的氨基酸序列修飾的氨基酸序列的α-淀粉酶蛋白質(zhì)。如 本文所用，“親本酶”、“親本序列”、“親本多肽”、“野生型α-淀粉酶蛋白質(zhì)”和“親本多肽” 表示α-淀粉酶變體多肽所基于的酶和多肽，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)或地芽孢桿菌 屬(Geobacillus)物種α-淀粉酶。本文優(yōu)選為野生型或親本酶的是來自嗜熱脂肪地芽孢 桿菌的那些酶。編碼親本多肽的核酸序列此處稱為“親本核酸”。野生型α-淀粉酶是天 然發(fā)生的?！唉?淀粉酶變體”在成熟蛋白質(zhì)(即沒有信號(hào)序列，或翻譯后去除的其他天然或人工序列的活性分子)的氨基酸殘基上不同于野生型α-淀粉酶。α-淀粉酶變體可以 是“嵌合的”或可以是“嵌合分子”，例如含有來自多于一個(gè)多肽的序列的融合蛋白。例如， α_淀粉酶蛋白可包含與另一 α-淀粉酶的信號(hào)肽連接的成熟α-淀粉酶蛋白。α _淀粉 酶變體在這個(gè)意義上也可以是嵌合的其含有來自融合一個(gè)或更多其他分子的一個(gè)或更多 部分、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的一個(gè)分子的部分、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，只要在所得分子中存在α-淀粉酶 的催化活性。如本文所用，嵌合分子不是天然發(fā)生的。本文優(yōu)選酶變體，其中一個(gè)或兩個(gè)氨 基酸殘基(181位或182位，或這兩者)取代成不在參照位置上天然發(fā)生的氨基酸殘基。
酶的“活性”表示催化活性，并包括酶活性的任何可接受量度，如活性等級(jí)、 活性量、或比活性。“比活性”是每單位酶的活性量度。因此，可通過酶的單位重量或單位體 積表示比活性。另外，比活性可包括酶純度的量度。其他情況下比活性自身將提供純度指 示，例如其中活性標(biāo)準(zhǔn)已知，或可用于比較。
如本文所用“變體”指多肽或核酸。術(shù)語“變體”有時(shí)候可與術(shù)語“突變 體”同義使用。相對(duì)于親本多肽或核酸，變體多肽或核酸在氨基酸或核苷酸序列中一個(gè)或 更多位置上包括插入、取代、缺失、易位、截短和/或倒轉(zhuǎn)。變體核酸可包括與能夠與本文所 示的核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列。例如，變體序列與在嚴(yán)格條件，例如50°C和0. 2X SSCdX SSC = 0. 15M NaCl, 0. 015M檸檬酸鈉，pH 7. 0)下能夠與本文所示的核苷酸序列雜 交的序列互補(bǔ)。具體而言，術(shù)語變體包括在高度嚴(yán)格條件下，例如65°C和0. IX SSC下能夠 與本文所示的核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，變體與本文明確提 供的序列具有至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或甚至 99%相同。
如本文所用，術(shù)語“表達(dá)”指在基因或人工序列的核酸序列基礎(chǔ)上產(chǎn)生多肽 的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯?！氨磉_(dá)產(chǎn)物” 一般指體內(nèi)或體外翻譯的蛋白質(zhì)。類似地， 如果基因表達(dá)了，那么在細(xì)胞，如包含基因的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生了基因產(chǎn)物(一般是蛋白質(zhì)， 但有時(shí)候也會(huì)是RNA)。
如本文所用，“微生物”包括任何細(xì)菌、酵母或真菌物種。
“分離的”蛋白質(zhì)或核酸序列表示所述序列至少基本上沒有該序列天然結(jié) 合的并見于自然界的至少一種其他組分。在核酸序列的實(shí)例中，分離的表示從基因組序列 中分離出來的。
“純化的”表示材料處于相對(duì)純的狀態(tài)，例如至少約90%純，至少約95% 純，或至少約98%純。“部分純化的”包括更低程度的純度，只要所述蛋白質(zhì)或核酸是如本 文所用術(shù)語“分離的”。
“熱穩(wěn)定的”表示酶暴露在升高溫度后保留可測定活性。通過半衰期(tl/2) 測定酶，如α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的一種量度，其中一半的酶活性到達(dá)半衰期時(shí)喪失。在確定 條件下通過測定剩余的淀粉酶活性計(jì)算半衰期值。在一些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定性的其他量 度可能更重要或更實(shí)用，并可測定并表述為例如特定暴露時(shí)間和目標(biāo)溫度后保留的百分比 活性。一般地，酶暴露在目標(biāo)溫度期望時(shí)間后，在標(biāo)準(zhǔn)測定條件(包括溫度)下測定酶。熱 穩(wěn)定的酶也可以是熱活性酶，即當(dāng)在高溫下測定時(shí)它們可顯示活性。如本文所用，熱穩(wěn)定酶 可對(duì)熱變性具有抵抗力，并在高溫下有活性。
“pH范圍”表示從酸性條件到堿性條件下酶顯示催化活性的能力。使用 α -淀粉酶的常見過程可包括橫跨5或更高pH單位的pH條件。如本文所用，“pH穩(wěn)定的”涉及酶在寬PH范圍，例如1、2、3、4、5或甚至更高pH單位內(nèi)保留可測定活性的能力。除了 PH穩(wěn)定性，本文描述的變體α -淀粉酶也可提供pH最佳值，其中在溫度、時(shí)間、底物濃度和 鈣離子濃度保持恒定的條件下，活性在某一 PH或pH范圍內(nèi)最大。
如本文所用，在本文中“氨基酸序列”有時(shí)候與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋 白質(zhì)”同義使用。一些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義；一些情況下，術(shù)語“氨 基酸序列”與術(shù)語“酶”同義。在上下文清晰可見的其他情況下，“氨基酸序列”指氨基酸側(cè) 鏈或多肽主鏈中“殘基”的實(shí)際序列(“一級(jí)序列”)。例如，本文提供的序列表提供了幾個(gè) 多肽或多肽結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
如本文所用，“核苷酸序列，，或“核酸序列，，指寡核苷酸序列或多核苷酸序 列(“多核苷酸”)及其變體、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因組、合成或重 組來源，并可以是雙鏈或單鏈，無論代表正義鏈還是反義鏈。如本文所用，術(shù)語“核苷酸序 列”包括基因組DNA、cDNA、合成DNA和RNA。對(duì)于多肽，在討論多核苷酸主鏈的核苷酸或堿 基的實(shí)際序列，即一級(jí)序列時(shí)也使用術(shù)語“核苷酸序列”。
“同源物”表示與目標(biāo)氨基酸序列和目標(biāo)核苷酸序列具有一定程度同一性 或“同源性”的實(shí)體。通常，同源物包含與目標(biāo)氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)殘基。同源物還 保留了 α-淀粉酶活性，盡管所述同源物具有與目標(biāo)蛋白質(zhì)不同的酶促性質(zhì)?！巴葱蛄小卑?括多核苷酸或多肽，其與另一序列具有某一百分比的同一性，例如80%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性。
例如當(dāng)在比對(duì)中比較兩條多肽序列時(shí)，“百分比同一性”表示目標(biāo)序列或蛋 白質(zhì)中給定百分比的堿基或氨基酸殘基與參考序列或蛋白質(zhì)中存在的堿基或殘基完全相 同。氨基酸可以相似，但不相同，其中目標(biāo)序列中的氨基酸相對(duì)于參考序列中的氨基酸被取 代、缺失或插入。對(duì)于蛋白質(zhì)，優(yōu)選在翻譯后修飾方面相似狀態(tài)中的序列之間測定百分比序 列同一性。通常，目標(biāo)蛋白質(zhì)的“成熟序列”(即，加工去除信號(hào)序列后保留的序列)與參考 蛋白質(zhì)的成熟序列進(jìn)行比較。在其他情況下，目標(biāo)多肽序列的前體序列與參考序列的前體 進(jìn)行比較。
如本文所用，如果變體多肽包括與親本多肽相同或基本相同的氨基酸序 列，除了特定取代、缺失、插入、化學(xué)修飾等，變體多肽“基于”或“來自”親本(或野生型)參 考多肽?！盎鞠嗤北硎境颂囟ㄈ〈⑷笔?、插入、化學(xué)修飾等，變體的氨基酸序列不包括 其他顯著改變親本多肽性質(zhì)的取代、缺失、插入、化學(xué)修飾等。
如本文所用，“雜交”包括核酸鏈與互補(bǔ)鏈通過堿基配對(duì)進(jìn)行連接的過程， 以及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增過程。編碼變體α-淀粉酶的核酸可以以 單鏈或雙鏈DNA或RNA、RNA/DNA異源雙鏈體，或RNA/DNA共聚物存在。如本文所用，“共聚 物”指包含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的單條核酸鏈。對(duì)特定生物“優(yōu)化” α-淀粉酶編 碼核酸，以通過定制核酸來包含在該生物翻譯天然蛋白質(zhì)中優(yōu)先利用的那些密碼子來增強(qiáng) 表達(dá)。W089]如本文所用，通過化學(xué)或酶促合成產(chǎn)生“合成的”化合物。合成化合物包括， 但不限于編碼α -淀粉酶變體的核酸，優(yōu)選由所選宿主生物為了表達(dá)選擇的最佳密碼子使 用制成。也可使用體外技術(shù)，如體外轉(zhuǎn)錄或翻譯，或PCR等制備合成的多肽或核酸。
如本文所用，“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括細(xì)胞，包括細(xì)菌和真菌細(xì)胞，其已經(jīng)通過使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化通常通過將一個(gè)或更多核苷酸序列插入細(xì)胞中發(fā)生。插入 的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列，即待轉(zhuǎn)化細(xì)胞中非天然存在的序列，如編碼變體、融 合蛋白或嵌合多肽的核酸。
如本文所用，“有效連接的”表示所述組分處于允許它們以其預(yù)期方式起作 用的關(guān)系中。例如，調(diào)節(jié)序列可以以這樣的方式“有效連接”編碼序列在與調(diào)節(jié)序列相容 的條件下完成編碼序列的表達(dá)。
如本文所用，“生物活性的”指序列與天然發(fā)生的序列具有相似的結(jié)構(gòu)、 調(diào)節(jié)或生物化學(xué)功能，盡管不必是相同程度。例如，生物活性的α-淀粉酶是具有可測定 α-淀粉酶活性的多肽。
如本文所用，“淀粉”指包含植物多糖糖類的任何材料。淀粉一般包含 具有化學(xué)式(C6HltlO5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任何整數(shù)。術(shù)語“顆粒淀粉 (granular starch) ”指生的，即未烹飪過的，例如未膠凝化的淀粉。
如本文所用，術(shù)語“糖化”指淀粉到葡萄糖的酶促轉(zhuǎn)化。
術(shù)語“液化”指淀粉轉(zhuǎn)化中的階段，其中將膠凝淀粉水解，給出低分子量的 可溶性糊精。術(shù)語“聚合程度”(DP)指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單位的數(shù)量。DPl的實(shí)例 是單糖葡萄糖和果糖。DP2的實(shí)例是二糖麥芽糖和蔗糖。為此，本文的“相當(dāng)液化過程”是 在相當(dāng)條件，優(yōu)選溫度、PH、底物濃度、鈣離子濃度等標(biāo)準(zhǔn)化的條件下進(jìn)行的那些過程。優(yōu)選 相當(dāng)液化過程在等量蛋白質(zhì)或等量活性單位基礎(chǔ)上相當(dāng)，然而在一些實(shí)施方案中，任一蛋 白質(zhì)或活性單位或這兩者在相當(dāng)液化過程中可發(fā)生變化。技術(shù)人員將理解液化過程“相當(dāng)” 的基礎(chǔ)。
在液化過程中，淀粉漿液粘度頻繁地用作淀粉向更小的DP單位轉(zhuǎn)化的量 度。本文有時(shí)候使用表述“初始粘度”。技術(shù)人員將理解這是專業(yè)術(shù)語，并且期望的并不是 真實(shí)的初始粘度，而是例如在底物膠凝化點(diǎn)周圍發(fā)生的最大粘度。使用初始粘度來與液化 過程結(jié)束時(shí)底物，例如淀粉漿液的粘度(“終粘度”)區(qū)分開。因此，如從液化過程的隨時(shí)間 的粘度變化圖(raph of the viscosity over the time-course)上顯而易見，初始或最大 粘度不是立即出現(xiàn)的，而是在某一段時(shí)間，例如低于總時(shí)間50%后，并更優(yōu)選在液化總時(shí)間 約第一個(gè)1/3或甚至1/4或1/5內(nèi)出現(xiàn)。例如，在本文示例的液化中，最大粘度通常在第一 個(gè)10分鐘內(nèi)出現(xiàn)，在該時(shí)間后加入酶，粘度開始降低。隨著淀粉顆粒在膠凝化過程中打開， 顆粒內(nèi)部更易接近酶活性，并且更容易切割，導(dǎo)致粘度的降低。
如本文所用，術(shù)語“干固體含量”(ds)指在干重基礎(chǔ)上漿液中固體的總量。 干固體含量和干重基礎(chǔ)一般表述為目標(biāo)材料的重量占總干材料重量的百分比。術(shù)語“漿液” 指在液體，通常是水或類似溶劑中含有不可溶固體的混合物。淀粉或面粉經(jīng)常懸浮于水溶 液中以形成漿液用于檢測淀粉酶，或用于液化過程。
術(shù)語“葡萄糖當(dāng)量”或“DE”定義為還原糖占總糖類部分的百分比。術(shù)語 “聚合程度”或“DP”指淀粉酶降解淀粉的產(chǎn)物大小。DP越高，糖類就越復(fù)雜。α-淀粉酶優(yōu) 選產(chǎn)生低DPjB DP2的產(chǎn)物。
“混合物”或“酶混合物”指包含兩種或更多酶的混合物的組合物，由此提 供組合的催化活性，其限定混合物中存在的每一種酶的活性。酶混合物不需要等量的兩種 或更多酶中的每一種，但需要酶混合物可在等量蛋白質(zhì)，或等量活性基礎(chǔ)上配制。組合的催化活性可以僅是累加的或平均的，或可以是拮抗的或協(xié)同的。本文使用的優(yōu)選混合物提供 至少一種累加催化活性，更優(yōu)選提供協(xié)同催化效果。
為此，“相當(dāng)液化過程”表示在可控和特定條件(例如溫度、pH、鈣離子濃 度和底物濃度方面)下使用不同或“對(duì)照”淀粉酶進(jìn)行的類似過程，并且其可與目標(biāo)液化過
程相當(dāng)
如本文所用，一個(gè)“α淀粉酶單位(AAU) ”是在特定條件下每分鐘水解 IOmg淀粉需要的細(xì)菌α淀粉酶活性。
“SPEZYME XTRA” 是 Genencor，International 生產(chǎn)的市售酶制劑，其 包括作為活性成分的C末端截短(即C末端29個(gè)殘基)的或嗜熱脂肪地芽孢桿菌野生型 α -淀粉酶的變體。比活性通常是14，000AAU/g。
“SPEZYME FRED” 是 Genencor International, Inc.生產(chǎn)的市售酶制 齊U，其包括作為活性成分的地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) α-淀粉酶的改造變體，其具 有取代 Μ15Τ、Η133Υ、N188S 和 A209V。比活性最小值是 17，400AAU/g。
“SPEZYME ETHYL” 是 Genencor International 生產(chǎn)的市售酶制劑，其 包括作為活性成分的或嗜熱脂肪地芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，其具有RG缺失(即，R179 和G180)。加工淀粉酶多肽以去除C末端29個(gè)殘基。比活性是6，700-7，300AAU/g。2.縮寫
應(yīng)用以下縮寫，除非另有說明AAUα淀粉酶單位ATCC 美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心cDNA互補(bǔ) DNACFU菌落形成單位DE葡萄糖當(dāng)量DEAE二乙氨基乙醇DNA脫氧核糖核酸DNS3，5-二硝基水楊酸DP或DPn 聚合程度(η亞基)ds干固體EC酶分類酶學(xué)委員會(huì)FDA食品藥品管理局FAO聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織GLP最佳實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范GMP優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)HPLC 高效液相層析HPAEC-PAD具有脈沖電流計(jì)檢測的高效液相陰離子交換色譜HS高糖(DPn，其中 η > 3)JECFA FW0/WH0食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)kb千堿基LAT地衣芽孢桿菌α-淀粉酶
LU液化單位MALDI-T0F襯質(zhì)輔助激光解吸與電離飛行時(shí)間質(zhì)譜學(xué)mRNA 信使核糖核酸mL毫升mt公噸(1000kg)N正常M摩爾nC納庫倫PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PEG聚乙二醇ppm百萬分之一RO反滲透RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SKBU/g ds每克干固體的α-淀粉酶單位。測定條件下一個(gè)α -淀粉酶單位每小時(shí)糊精化(dextrinize) 1. Og極限糊精底物。IX SSC 0. 15M NaCl，0. 015M 檸檬酸鈉，pH 7.0WHO世界衛(wèi)生組織w/v重量/體積w/w重量/重量μ g微克μ L微升B.變體α-淀粉酶
在幾個(gè)方面的第一個(gè)方面，提供來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的α-淀粉酶 的變體。變體基于對(duì)成熟蛋白質(zhì)181位或182位上野生型淀粉酶序列的修飾，其中取代了 181位和182位，或這兩個(gè)位置上的野生型氨基酸。181位上野生型氨基酸的取代包括Ala、 Cys、Asp、Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸的取代包括Ala、Ser或Pro。在一個(gè)實(shí)施 方案中，變體淀粉酶在特定測定條件下相比于野生型α-淀粉酶具有增加的比活性。在多 個(gè)實(shí)施方案中，變體的比活性具有約10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、100%或更高的 提高。其他情況下，變體淀粉酶相對(duì)于野生型具有2倍、3倍、4倍或更高的比活性。這進(jìn)一 步提供了其他的優(yōu)勢(shì)，允許在給定應(yīng)用中使用更少的酶，并將生產(chǎn)能力的問題降至最小。優(yōu) 選地，變體在約50-90°C之間具有增加的比活性。在其他實(shí)施方案中，變體在約65-85°C之 間具有增加的比活性。
在一些實(shí)施方案中，變體α-淀粉酶具有SEQ ID NO :2、3、4、5、6、10或
15的氨基酸序列。這些序列在野生型氨基酸序列181位上包含單個(gè)突變或變異。在一些實(shí)施方案中，野生型/親本序列是AmyS的序列，其中突變或變異位于1181位上。一般地， "X1POSX2”形式的命名表示變體在“P0S”位上含有變異的氨基酸序列，其中野生型氨基酸殘 基，X1取代為不同的氨基酸殘基X2，其中X1和X2是氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母密碼，并且“P0S”是 野生型成熟序列的一級(jí)氨基酸序列內(nèi)的任何位置。因此，1181上的變體是淀粉酶序列，其中在野生型序列181位上具有異亮氨酸的野生型序列取代為另一氨基酸。目前優(yōu)選I181P、 I181A和I181L變體。在其他實(shí)施方案中，包括I181C、I181D、I181E和I181Y的變體是重 要的。還包括變體I181F、I181G、I181H和I181V。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體具有SEQ ID NO :2、3或10的序列。野生型/ 親本序列是AmyS的序列時(shí)，這些突變或變異分別對(duì)應(yīng)于I181I、I181A和I181L。在一個(gè)實(shí) 施方案中，當(dāng)用于液化過程時(shí)，相對(duì)于用相應(yīng)野生型α “淀粉酶液化的相當(dāng)?shù)矸蹪{液的最 大粘度，淀粉酶活性降低了淀粉漿液的最大粘度。
在一些實(shí)施方案中，變體α-淀粉酶具有SEQ ID NO 16、17或18的氨基 酸序列。這些序列在野生型氨基酸序列182位上包含單個(gè)突變或變異。在一些實(shí)施方案中， 野生型/親本序列是AmyS的序列，其中突變或變異位于G182位上。目前優(yōu)選G182A、G181S 和G182P變體。
變體沒有其他已知α - 淀粉酶(例如在Van Der Laan和Aehle的美國 專利號(hào) 6，939，703 和 Svendsen 等的 6，143，708 ^BlSgard -Frantzen 等的 5，830，837 中
公開的那些α-淀粉酶)的序列。類似地，本文描述的變體淀粉酶不包括其他已知序列，例 如Sajedi等在J. Biochem. Mol. Biol. 40 :315_324 (2006)中公開的序列也特異地排除在外。 也明確European Molecular Biology Laboratories (EMBL) gJc National Center for Biotechnology Information(NCBI)的公共數(shù)據(jù)庫中在本公開內(nèi)容提交日期之前超過一年 提供的α-淀粉酶序列作為本發(fā)明α-淀粉酶變體的序列?？墒褂酶綆l件從本發(fā)明組合 物和方法中單獨(dú)排除任何這種已知的序列。
本發(fā)明組合物和方法包括的變體α _淀粉酶具有α -淀粉酶的基本催化 活性，其允許它們攻擊(即，水解)底物如直鏈淀粉和/或支鏈淀粉的α-1，4鍵，將其轉(zhuǎn)化 成更低DP的糊精。在這樣的過程中，α-淀粉酶降低了粘度，并增加了葡萄糖當(dāng)量(DE)，使 得它們液化并糊精化通常處于漿液中的淀粉。α _淀粉酶也用于其他淀粉降解過程，例如脫 漿針織材料和清洗過程，其中必須去除不想要的淀粉。
本發(fā)明α -淀粉酶變體的特征是它們相對(duì)于其來源的野生型/親本淀粉 酶顯示提高的性能特征。在其他實(shí)施方案中，變體相對(duì)于其他α-淀粉酶，如AmyL或AmyS 具有提高的性能。在一些實(shí)施方案中，變體淀粉酶顯示優(yōu)于用于同一目的的常規(guī)市售酶制 劑的提高的應(yīng)用性能。
提高的性能特征包括提高的穩(wěn)定性、ρΗ范圍、氧化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。具 體而言，α -淀粉酶變體在高溫(例如70-90°C )下提供更好的穩(wěn)定性，和/或在高溫提供 增加的比活性。本文提供的熱穩(wěn)定變體淀粉酶有利地用于高溫液化，以及使用或需要升高 溫度的其他過程(如烹飪、烘烤等)。
本發(fā)明變體的另一性能特征是它們降低淀粉漿液的最大粘度。這通過需 要更少能量用于混合并允許淀粉更快向更低DP產(chǎn)物轉(zhuǎn)化對(duì)液化過程有利。C.包含變體α -淀粉酶的組合物
還提供多種組合物，其包含具有α -淀粉酶催化活性的一種或多種α -淀 粉酶突變體。組合物包括例如含有變體α-淀粉酶的酶濃縮物、酶混合物、純化的酶、部分 純化的酶產(chǎn)品、食品添加劑和清洗產(chǎn)品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包括如本文描述或示例的變體淀粉酶。這種組合物具有多種用途。組合物還可提供多于一種的淀粉酶變體，或其他淀粉酶，或其組合。可 高度純化或僅部分純化組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物在活性單位方面進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?？?以多種物理形式，包括多種濃度和純度的液體、凝膠、團(tuán)塊(cake)、半固體或固體提供組合 物。組合適合任何物理形式，只要在最終組合物中保留可測定活性。因此，可方便地凍干、 濃縮、冷凍、噴霧干燥或以多種已知或重要方式加工組合物?？梢砸詷?biāo)準(zhǔn)尺寸提供組合物， 用于某些商業(yè)應(yīng)用，或進(jìn)行常規(guī)包裝，或在以任何類型的散裝容器(bulk container)提供。
組合物和酶混合物可進(jìn)一步包含和用于與一種或多種其他多肽組合。優(yōu) 選地，所述一種或多種其他的多肽包含至少一種酶。因此，任何已知的酶可與組合物或酶混 合物，當(dāng)然還可以與α-淀粉酶本身一起使用?？上虮疚墓_的組合物、酶混合物或α-淀 粉酶中加入任何多種其他的酶，以提供技術(shù)人員期望的其他功用或便利。在多個(gè)實(shí)施方案 中，其他的酶可包含一種或多種細(xì)菌α-淀粉酶或β-淀粉酶，例如ΒΒΑ，真菌α-淀粉酶， 例如CLARASE L，或葡糖淀粉酶、異淀粉酶、異構(gòu)酶、蛋白酶，如真菌和細(xì)菌蛋白酶、纖維素 酶、lignase、半纖維素酶、脂肪酶、磷脂酶和cutinase。本文包括使用包含如本文公開的一 種或多種α-淀粉酶變體彼此一起，或與任何一種或多種前述淀粉酶的組合。如上 文公布， 真菌蛋白酶包括例如從曲霉屬物種(Aspergillus spp.)，如黑曲霉(A. niger)、泡盛曲霉 (A.awamori)、米曲霉(A. oryzae)；毛霉屬物種(Mucor spp.)，例如，米黑毛霉(M. miehei)； 根霉屬(Rhizopus spp.)等獲得的任何蛋白質(zhì)降解酶活性。β _淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)是外 作用麥芽糖(maltogenic)淀粉酶，其催化1，4_ α -糖苷鍵水解成支鏈淀粉和相關(guān)的葡萄糖 聚合物，由此釋放麥芽糖。已經(jīng)從多種植物和微生物中分離了 淀粉酶。參閱Fogart等 PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第 15 卷，112-115 頁(1979)。這些 β -淀粉酶在 40°C到65°C的范圍內(nèi)具有最佳溫度，在約4. 5到約7. O的范圍內(nèi)具有最佳pH。涵蓋的β -淀 粉酶包括但不限于來自大麥的β -淀粉酶SPEZYME BBA 1500、SPEZYME DBA、OPTIMALT ME.0PTIMALT BBA(Genencor International, Inc.)；和 N0V0ZYM WBA(Novozymes A/S)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物或酶混合物包含用于液化包含直鏈淀粉和支 鏈淀粉的復(fù)合糖類的一種或多種其他酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其他的酶是α-淀粉酶。 任何已知的α-淀粉酶可與淀粉酶、組合物或酶混合物，包括細(xì)菌α-淀粉酶，例如來自芽 孢桿菌的α “淀粉酶，如AmyL-、AmyS-, AmyQ-或AmyM-類型的淀粉酶、真菌淀粉酶，或植物 或動(dòng)物淀粉酶組合使用。當(dāng)用于液化過程時(shí)，相對(duì)于用單個(gè)酶，尤其是野生型酶液化的相當(dāng) 淀粉漿液的最大粘度，這種組合物或混合物優(yōu)選降低淀粉漿液的最大粘度。在一個(gè)實(shí)施方 案中，包含兩種或更多酶的組合物或混合物將淀粉漿液的最大粘度降到至少任何兩種或更 多酶單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的粘度，并產(chǎn)生與任何兩種或更多酶單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的終粘度至少一 樣低的淀粉漿液的終粘度。
制備或配制一個(gè)實(shí)施方案中的組合物，用作食品添加劑或適合于食品加 工的加工助劑。還提供包含如本文公開的α-淀粉酶變體的食品級(jí)凍干組合物。當(dāng)制備或 配制用作食品添加劑或用于食品加工時(shí)，組合物必須滿足或超過某些調(diào)控需要。這些需要 作為技術(shù)人員在制備組合物中的指導(dǎo)。因此，技術(shù)人員將理解盡管調(diào)控需要在多個(gè)國家可 能不同，但一般地，組合物的重金屬含量非常低，并且鉛和砷也低。尤其是，總重金屬含量優(yōu) 選不超過約40ppm，更優(yōu)選低于約30ppm。組合物的鉛含量不超過約10pm，更優(yōu)選低于約5 或3ppm。組合物的砷含量低于約3ppm。當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測時(shí)，組合物對(duì)真菌毒素和抗菌內(nèi)容也是陰性的。組合物在其微生物內(nèi)容方面也是干凈的，當(dāng)旨在用作食品添加劑或食品加 工助劑時(shí)，其優(yōu)選在GMP或GLP標(biāo)準(zhǔn)下以最小量微生物內(nèi)容產(chǎn)生。具體而言，總活菌數(shù)不超 過每克組合物約5x104CFU。組合物優(yōu)選具有不超過每克組合物約40CFU的大腸芽孢桿菌計(jì) 數(shù)。更優(yōu)選地，大腸芽孢桿菌的計(jì)數(shù)不超過每克約30CFU。此外，如標(biāo)準(zhǔn)微生物方法測定，組 合物沒有可檢測的沙門氏菌(Salmonella)或志賀氏菌(Shigella)。當(dāng)在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生 變體淀粉酶時(shí)，組合物具有低于每克ICFU宿主生物。
另外，組合物在毒性等方面具有令人滿意的安全標(biāo)準(zhǔn)。在一個(gè)實(shí)施方案 中，組合物在合適的體外測定中沒有顯示出潛在的毒性。組合物在動(dòng)物急性和/或亞慢性 劑量研究中也沒有顯示出毒性效應(yīng)。
為了食品添加劑或食品加工助劑的目的，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)如許多商業(yè)使 用的食品酶。因此，在生產(chǎn)過程中使用GMP，滿足例如FDA或國際權(quán)利機(jī)構(gòu)，例如Food Chemicals Codex (第4版，1996)，F(xiàn)W0/WH0食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)在 Compendium of Food AdditivesSpecifications，第 1 卷，附件 1 附 錄9 (2001)(和更早期相 關(guān)附錄)中確定的食品酶的需要和技術(shù)要求。例如，使用如補(bǔ)料分批發(fā)酵，例如，例如生物 體中的深層補(bǔ)料分批發(fā)酵(submerged fed-batch fermentation)的方法生產(chǎn)包含α-淀 粉酶變體的組合物，所述submerged補(bǔ)料分批發(fā)酵一般認(rèn)為是安全的，或用于該目的，例如 生產(chǎn)食品級(jí)酶制劑的歷史悠久。
為了本文的一些目的，合適的宿主生物包括來自芽孢桿菌屬的革蘭氏陽 性菌，包括例如嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短芽孢桿菌(B. brevis) 和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)。包括凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽孢 桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、蘇云金芽孢桿 菌(B. thuringiensis)和嗜堿芽孢桿菌(B. alkalophilus)的其他芽孢桿菌也是重要的。 可用于生產(chǎn)本文描述的一些組合物的其他革蘭氏陽性菌包括變鉛青鏈霉菌(Str印tomyces lividans)和鼠灰鏈霉菌(S.murinus)。包括大腸芽孢桿菌(Escherichia coli)或假單胞 菌屬(Pseudomonas)物種的革蘭氏陰性菌也可用于生產(chǎn)本文提供的某些組合物。
本文還提供包含α _淀粉酶變體的組合物，所述α -淀粉酶變體用于促進(jìn) 從多種非淀粉(因此非底物)材料如織品(textile)、紙、玻璃、塑料、金屬、帆布、瓷器等中 去除酶的底物(例如淀粉)。因?yàn)樵谙礈旎蚯逑催^程中頻繁地去除此類材料，一個(gè)實(shí)施方案 中的組合物包括一種或多種肥皂、去污劑、清洗劑、氧化劑或螯合劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，組 合物用作洗衣清潔劑，在另一實(shí)施方案中其用作餐具去污劑。為本文描述的這些目的以及 其他目的，組合物可配制成凝膠。多種此類凝膠為本領(lǐng)域已知，并且除了提供對(duì)消費(fèi)者或使 用者有吸引力并且便利的使用形式外，還提供某些優(yōu)勢(shì)，例如酶在待去除底物上的工作接 觸時(shí)間和條件。標(biāo)準(zhǔn)清洗劑，以及去污劑、肥皂、氧化劑和/或螯合劑的包含物(inclusion) 需要α “淀粉酶活性不僅在最終使用中發(fā)現(xiàn)的條件下穩(wěn)定，在產(chǎn)品自身中發(fā)現(xiàn)的更集中或 極端條件也下穩(wěn)定。D.變體α -淀粉酶的表征
可通過本領(lǐng)域已知的多種方法和技術(shù)表征本文提供的酶，如α-淀粉酶 變體。核酸和一級(jí)多肽序列是比較并分析本文提供的淀粉酶的重要手段。三維結(jié)構(gòu)模型和 /或物理結(jié)晶也是重要的。比活性的測定經(jīng)常用于表征酶?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測定，或通過在測定淀粉酶的已知技術(shù)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)新測定法來評(píng)估在底物、溫度、pH、 鈣離子濃度和其他因素多種條件下的酶活性。測定酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，包括動(dòng)力學(xué)常數(shù)如特 定條件下的Vmax或Km也用于表征本文提供的變體淀粉酶。如用于測定實(shí)現(xiàn)最大活性的最佳 鈣離子濃度，并實(shí)現(xiàn)在存儲(chǔ)α-淀粉酶變體過程中最大穩(wěn)定性的條件的方法，用于測定穩(wěn) 定性或測定法的最佳PH的方法為本領(lǐng)域所知。
應(yīng)用表征包括在模擬加工條件下產(chǎn)生的結(jié)果方面表征酶活性。桌面 (bench-top)液化方法等可用于在更接近實(shí)際使用條件的條件下測定或評(píng)估變體的性能。 粘度測定研究可幫助表征淀粉酶在所述方法中達(dá)到的最大粘度，或淀粉酶變體降解或處理 的淀粉漿液的終粘度方面的催化活性。在許多重要實(shí)施方案中，與野生型淀粉酶、對(duì)照淀粉 酶，或用于相似條件的市售淀粉酶進(jìn)行比較。與其他淀粉酶變體的比較也用于評(píng)估特定酶 的相對(duì)值或功效。
表征宿主細(xì)胞中變體淀粉酶的表達(dá)例如在測定制備淀粉酶變體的方法的 商業(yè)潛能中是個(gè)重要特征。為了提高宿主細(xì)胞中變體α-淀粉酶的表達(dá)，可測定表達(dá)的蛋 白質(zhì)、相應(yīng)的mRNA，或酶活性。合適的測定包括Northern和Southern印跡、RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄 酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和使用適當(dāng)標(biāo)記的雜交探針的原位雜交。特定宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的淀粉 酶的表達(dá)量、表達(dá)速率或最大回收率的測定均是與變體淀粉酶表達(dá)相關(guān)的重要特征實(shí)例。
本文描述的α -淀粉酶變體在給定溫度下相對(duì)于AmyS或AmyL酶也顯 示延長的半衰期。在多個(gè)實(shí)施方案中，半衰期尤其是在約55°C到約95°C或更高，尤其在約 75°C、80°C、85°C或更高的升高溫度下可以增加 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%、100%、200% 或更高。
在一些實(shí)施方案中，α-淀粉酶變體相對(duì)于變體來源的野生型序列其比 活性提高了。約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或甚至更
高的比活性提高可在變體淀粉酶中產(chǎn)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的α -淀粉酶變體與親本序列，如AmyS酶具 有相同的PH穩(wěn)定性。在另一方面，變體淀粉酶顯示對(duì)pH變化的更大范圍的穩(wěn)定性，或?qū)H 最佳值或穩(wěn)定范圍轉(zhuǎn)換到為了酶最終商業(yè)目的的期望范圍。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，變體 淀粉酶可在約PH 4.5到約？!1 10. 5降解淀粉。α-淀粉酶變體在相同條件下相對(duì)于AmyS 具有更長的半衰期或更高的活性(取決于測定)。α -淀粉酶變體在相同pH條件下也具有 約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200% 或更長的半衰期。在另 一實(shí)施方案中，α -淀粉酶在相同pH條件下與野生型序列或親本序列，例如AmyS相比具有 更高的比活性。本文提供的α-淀粉酶變體可具有上文列出的期望特征的任何組合。Ε.編碼變體α -淀粉酶的多核苷酸
在其多個(gè)方面的另一方面，提供編碼如本文所述嗜熱脂肪芽孢桿菌 α-淀粉酶變體的多核苷酸。因?yàn)樵谧匀唤缰形窗l(fā)現(xiàn)所編碼的多肽，所以必須通過手工制 備，例如合成或例如通過定點(diǎn)突變和篩選方法產(chǎn)生多肽。具體而言，多核苷酸編碼多肽，其 包含野生型淀粉酶序列，除了在成熟蛋白質(zhì)181或182位上的取代，其中181和182位或這 兩個(gè)位置上的野生型氨基酸發(fā)生了取代。181位上野生型氨基酸的取代包括Ala、CyS、ASp、 Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸的取代包括Ala、Ser或Pro。
在多個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼I181P、I181A和I181L變體多肽。在其他實(shí)施方案中，多核苷酸編碼包括I181C、I181D、I181E和I181Y，或甚至，I181G、I181H和 118IV的變體。
在多個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2_18，優(yōu)選SEQ ID NO: 2-6、10、15和17-19，一些情況下SEQ ID NO :2、3、10、16和18的氨基酸序列的多肽。在特 定實(shí)施方案中，編碼的變體多肽具有SEQ ID NO :2或3的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸是基因組DNA，而在另一實(shí)施方案中，多核 苷酸是cDNA。由于遺傳密碼的簡并，具有根據(jù)本公開內(nèi)容提供的多個(gè)多核苷酸，其編碼同一 多肽。多核苷酸也包括編碼如本文提供的淀粉酶變體的mRNA。
在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過改變多核苷酸的組成來滿足優(yōu)先用 于宿主細(xì)胞中的那些密碼子來優(yōu)化編碼α “淀粉酶變體多肽的多核苷酸，用于變體多肽在 來自微生物或植物的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。用于優(yōu)化密碼子使用的技術(shù)為本領(lǐng)域已知并且 多種生物的密碼子使用表可在標(biāo)準(zhǔn)資源如生物技術(shù)的文本或?qū)嶋H手冊(cè)中得到。
還提供包含編碼變體淀粉酶的多核苷酸的載體。本文包括使用用于維持 多核苷酸、產(chǎn)生多核苷酸量、操作多核苷酸序列或在體外或宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸的任 何載體。在標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)手冊(cè)和文本，例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)中提供合適載體的實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的載體用于在宿主細(xì)胞，尤其在微生物細(xì)胞，如 細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞中表達(dá)編碼的多肽。可調(diào)整表達(dá)載體用于瞬時(shí)表達(dá)變體α-淀粉酶， 例如以證實(shí)放大之前的催化和其他性質(zhì)。長期使用并大規(guī)模生產(chǎn)的表達(dá)載體例如通過整 合到宿主染色體內(nèi)，或通過穩(wěn)定摻入到自我復(fù)制多核苷酸序列中得以優(yōu)選調(diào)整用于穩(wěn)定表 達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包含與α-淀粉酶變體的編碼序列有效連接的調(diào)節(jié)序列的表 達(dá)載體將載體、DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。
還提供微生物細(xì)胞，包括酵母、真菌或細(xì)菌細(xì)胞，其包含含有編碼變體 α -淀粉酶的多核苷酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼多 肽的表達(dá)載體。在另一實(shí)施方案中，提供包含植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞。用于在多種宿主 細(xì)胞中表達(dá)的載體為本領(lǐng)域已知并含有所需調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子等，以促進(jìn)編碼多肽的表 達(dá)。用于芽孢桿菌中的示例性啟動(dòng)子包括來自AmyL、AmyQ、AmyM或AmyS中的淀粉酶基因的 啟動(dòng)子，以及來自枯草芽孢桿菌中xylA和xylB基因的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載 體含有一個(gè)或更多或者是組成型的或者是誘導(dǎo)型的強(qiáng)啟動(dòng)子，用于表達(dá)或過表達(dá)編碼的多 肽。在另一實(shí)施方案中，多核苷酸包括用于翻譯后修飾肽，如將表達(dá)多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，或 轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)室內(nèi)以促進(jìn)從宿主細(xì)胞中產(chǎn)生、分離或純化多肽的序列。例如，多 核苷酸可包括一個(gè)或更多序列，以便最初產(chǎn)生其一端附著異源多肽(如來自地衣芽孢桿菌 的信號(hào)肽)以促進(jìn)表達(dá)蛋白質(zhì)從細(xì)菌宿主細(xì)胞中分泌的變體淀粉酶。多核苷酸也可包括這 樣的序列，其使得最初產(chǎn)生具有“純化序列”，即促進(jìn)表達(dá)蛋白質(zhì)純化的序列的變體淀粉酶， 其中在純化過程中切割所述“純化序列”。
宿主細(xì)胞是植物時(shí)，預(yù)期在一個(gè)實(shí)施方案中植物是用于淀粉生產(chǎn)的農(nóng)作 物?？稍谥参镏羞^度生產(chǎn)淀粉酶變體。可用儲(chǔ)存淀粉的植物部分，例如種子過度生產(chǎn)并區(qū) 室化所述淀粉酶變體。因此，可收獲植物，分離淀粉，并且α-淀粉酶變體可與淀粉一起純化。該實(shí)施方案在植物待用于醇發(fā)酵，尤其例如用于燃料乙醇發(fā)酵時(shí)特別有用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞來自生產(chǎn)食品加工助劑或食品添加劑可接受的生物。目前，優(yōu)選來自芽孢桿菌，尤其是地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢 桿菌的宿主細(xì)胞。用于細(xì)菌細(xì)胞的合適質(zhì)粒(包括用于在芽孢桿菌中自我復(fù)制的載體)為 本領(lǐng)域已知。F.制備和使用變體α-淀粉酶的方法
根據(jù)本文公開內(nèi)容另一方面提供的是產(chǎn)生嗜熱脂肪芽孢桿菌α _淀粉酶 變體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的方法產(chǎn)生了包含如上文所述至少一種野生型嗜熱 脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的組合物。變體淀粉酶具有可測定的α-淀粉酶活性。該方法包 括利用本文提供的宿主細(xì)胞用于發(fā)酵過程，其中表達(dá)至少一種變體淀粉酶。表達(dá)后，表達(dá)的 變體淀粉酶分子至少是部分純化的，由此產(chǎn)生包含變體α-淀粉酶的組合物。在一個(gè)實(shí)施 方案中，表達(dá)變體在成熟野生型蛋白質(zhì)181位或182位上包含變體，其中181位和182位上 的野生型氨基酸發(fā)生取代，181位上野生型氨基酸殘基的取代分別包括Ala、CyS、ASp、Glu、 Leu或Pro，182位上野生型氨基酸殘基的取代分別包括Ala、Ser或Pro。在一個(gè)實(shí)施方案 中，變體在特定測定條件下與對(duì)應(yīng)的野生型α-淀粉酶相比具有提高的或增加的比活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞來自芽孢桿菌屬物種。發(fā)酵方法可以是任何 類型的，盡管補(bǔ)料分批發(fā)酵過程，如深層補(bǔ)料分批發(fā)酵在本文中是重要的。
提供的方法進(jìn)一步包括在某些實(shí)施方案中進(jìn)一步純化變體淀粉酶，以制 備純化的組合物的步驟，所述純化的組合物在體外測定中不顯示任何潛在的毒性；在動(dòng)物 急性和亞慢性劑量研究中也不顯示任何毒性效應(yīng)。這種組合物用作食品加工助劑，或在一 些情況下用作直接的食品添加劑。
該方法產(chǎn)生純化的或部分純化的組合物，其包含不超過40ppm的總重金 屬，不超過5ppm的砷、不超過IOppm的鉛、不超過5xl04的總活生物(CFU/g)、不超過30大 腸桿菌(CFU/g)，并通標(biāo)準(zhǔn)測試沒有可檢測的沙門氏菌、真菌毒素或抗菌活性。
在多個(gè)實(shí)施方案中，該方法還用于制備部分純化或純化的組合物，其包含 多于一種α-淀粉酶活性，并且在一些實(shí)施方案中還包含至少一種其他酶活性。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述純化或部分純化的組合物包含用于液化過程的至少一種其他酶活性。當(dāng)用 于液化過程時(shí)，純化或部分純化的組合物降低了淀粉漿液相對(duì)于用單個(gè)酶液化的相當(dāng)?shù)矸?漿液的最大粘度的最大粘度。
還提供使用包含α -淀粉酶變體的組合物的方法。尤其提供液化復(fù)合糖 類，如淀粉漿液的方法。該方法包括制備包含復(fù)合糖類的漿液，將漿液加熱至液化可接受的 溫度，向漿液中加入包含如本文提供的至少一個(gè)α “淀粉酶變體的組合物，并將漿液與組 合物在足以液化復(fù)合糖類的溫度下溫育一段時(shí)間。在優(yōu)選實(shí)施方案中，復(fù)合糖類是淀粉。如 本文所用，“液化”不表示切割每一可得到的底物鍵，而表示至少部分水解復(fù)合糖類，如終粘 度的可測定降低、漿液DE增加、低DP片段/產(chǎn)物釋放，或還原基團(tuán)、糊精或α -麥芽糖單位 增加的另一量度所證明的。
在所要求保護(hù)的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，底物，即復(fù)合糖類是淀粉、淀粉 酶或支鏈淀粉。液化方法的溫度可從室溫變化到超過100°c，但更優(yōu)選從約50°C到約90°C。 液化可限定隨著時(shí)間的復(fù)雜溫度曲線，例如反應(yīng)在低溫下開始，并通過本領(lǐng)域已知的方法升高到期望的最終溫度。也可以在一定時(shí)間，或在達(dá)到粘度、DE值或液化另一量度方面的 期望終點(diǎn)后降低溫度。技術(shù)人員因此將理解所述方法不需要限特定溫度持續(xù)特定時(shí)間，只 要淀粉酶活性可以在所提供的溫度和條件下起作用。除了抑制劑等的存在或缺失外，影響 活性的其他條件包括PH和鈣離子濃度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，漿液包含基于干重約20_40%的淀粉，而在另一實(shí)施 方案中，漿液包含約30到約36或37. 5%的淀粉。但從經(jīng)濟(jì)考慮上進(jìn)行限制，可使用更少量 的淀粉。最大粘度和相關(guān)因素，如混合所需的能量輸入可限制待用于漿液中的淀粉的最大 量。技術(shù)人員將理解在制備淀粉漿液中進(jìn)行的實(shí)際考慮。
在一個(gè)實(shí)施方案中，液化是發(fā)酵的一部分。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本文公開的 淀粉酶變體，包括具有SEQ ID NO :2或3氨基酸序列的那些淀粉酶變體的性質(zhì)在淀粉發(fā)酵 過程中非常有用，因?yàn)橄鄬?duì)于用變體來源野生型酶處理或用目前市售酶制劑處理的相當(dāng)漿 液(的最大粘度)的最大粘度，它們可大大降低淀粉漿液的最大粘度。在一些實(shí)施方案中， 發(fā)酵用于產(chǎn)生食品產(chǎn)品、食品添加劑、燃料或燃料添加劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵用于產(chǎn) 生燃料或燃料添加劑，其為醇，優(yōu)選乙醇或另一低級(jí)醇。
技術(shù)人員將理解，粘度降低得越多，淀粉液化得越徹底，糊精產(chǎn)生得越多 (或所得液化淀粉的DE越高)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，最大粘度相對(duì)于變體來源野生型 酶液化的或用目前市售酶制劑處理的相當(dāng)漿液的最大粘度降低了至少10、20、25、30、40或 甚至50%或更高。
本文提供清洗表面以去除不想要的或非期望淀粉殘余的方法。該方法包 括這樣的步驟，其提供具有待去除淀粉殘余的表面，使表面與包含一個(gè)或更多變體α-淀 粉酶的組合物在足夠溫度以及允許導(dǎo)致淀粉殘余去除的條件下接觸一段時(shí)間。該表面可以 在任何材料上；例如，其可以在盤子、平板、玻璃等上面，或其可以在服裝(clothing)或織 物上面。其例如也可以是柜臺(tái)面或工作臺(tái)面，或必須定期或規(guī)律地清洗的任何類型的市售 容器。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于方法中的組合物包含至少一種其他酶，例如一種 或多種蛋白酶、脂肪酶、其他的淀粉酶，或其組合。在另一實(shí)施方案中，在接觸步驟前完成沖 洗或批量去除殘余的步驟。該步驟從清洗過程中去除了大量淀粉，以使得酶能夠在殘留且 更難以去除的底物上作用。可在任何溫度，但優(yōu)選在接觸步驟達(dá)到至少50-90°C的溫度下進(jìn) 行清洗方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在去除殘余后對(duì)表面消毒，或蒸氣處理表面的 步驟。在幾個(gè)實(shí)施方案中，該組合物還包含至少一種去污劑、氧化劑、螯合劑或其組合。
本文還提供使用本文所述α _淀粉酶變體處理針織材料的方法。用淀粉 酶處理處理針織材料，如織物的方法為本領(lǐng)域所知。所提供的方法可提高針織材料，如織品 或織物的質(zhì)感和/或外觀。該方法包括使針織材料與包含α-淀粉酶變體的液體或包含變 體的組合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，針織材料是織物或織品。在另一實(shí)施方案中，在壓力 下用液體處理針織材料。液體一般是水溶液。
該方法通常在編織過程，例如編織織物或織品過程中或之后應(yīng)用?；蛘?， 在脫漿階段，或在進(jìn)一步加工針織材料的一個(gè)或更多其他步驟中使用該方法。因?yàn)樵诰幙?過程中，材料(例如線)暴露在巨大機(jī)械牽拉下，所以該方法是有用的。在編織過程之前，特 別是在市售織布機(jī)上，待編織的材料經(jīng)常涂層包含淀粉或淀粉衍生物的“涂料(sizing) ”，以增加其牽引力并防止斷裂。本文提供的變體淀粉酶可在編織過程中或之后應(yīng)用，以去除 該涂料淀粉或淀粉衍生物。
本文提供的α-淀粉酶變體可單獨(dú)使用或與其他脫漿化學(xué)試劑，如去污 劑和/或脫漿酶一起使用，以脫漿針織材料，如織物，包括棉花和含棉花的織物。
本文公開的α -淀粉酶變體在酶促修整方法(finishing method)中也有 應(yīng)用。已經(jīng)開發(fā)該方法用于服裝，例如在制造厚牛仔褲中。淀粉酶的作用是為織物提供柔 軟度，并使得棉花更易于隨后的酶促修整步驟(例如以實(shí)現(xiàn)石洗效果)。G.酶混合物和試劑盒，以及使用所述酶混合物和試劑盒的方法
本文還提供包含至少第一種和第二種α-淀粉酶的酶混合物。當(dāng)每一 種淀粉酶單獨(dú)用于相當(dāng)?shù)囊夯^程時(shí)，第一種α-淀粉酶具有催化活性，其產(chǎn)生比第二種 α-淀粉酶產(chǎn)生的終粘度低的終粘度。然而，第一種淀粉酶的催化活性產(chǎn)生比第二種α -淀 粉酶相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度。令人驚奇的是，酶混合物提供組合催化 活性，當(dāng)其用于液化過程時(shí)，產(chǎn)生與第一種α-淀粉酶單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程時(shí)獲得的終 粘度大致相同的終濃度。混合物還提供最大粘度，其顯著低于第二種α-淀粉酶單獨(dú)用于 相當(dāng)液化過程時(shí)獲得的最大粘度。如本文所用，“相當(dāng)液化過程”包括溫度、ΡΗ、鈣離子濃度 和底物濃度的特定條件。
如上包含α -淀粉酶的組合物，酶混合物可進(jìn)一步包含或與一種或多種 其他的多肽，如至少一種酶組合使用。技術(shù)人員將理解任何已知的酶可與本文公開的酶混 合物一起使用?？上蛎富旌衔镏屑尤肴魏味喾N其他的酶，以如技術(shù)人員所期望的提高功效 或便利。其他的酶可包含具有淀粉或糖類修飾活性的酶，包括脫支酶、麥芽糖酶等。例如，本 文可使用一種或多種細(xì)菌α -或β -淀粉酶，例如ΒΒΑ，真菌α -淀粉酶，例如Clarase L， 或葡糖淀粉酶、異淀粉酶或異構(gòu)酶。預(yù)期用于本文的其他酶包括蛋白酶，如真菌和細(xì)菌蛋白 酶、纖維素酶、lignase、半纖維素酶和cutinase，以及脂肪酶，和/或磷脂酶。本文明確期 望使用包含本文公開的一種或多種其他α "淀粉酶變體，或彼此在一起，或與任何一種或 多種上述淀粉酶活性組合的其他淀粉酶活性。如上公開，真菌蛋白酶包括，例如從曲霉屬物 種，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉屬物種，例如，米黑毛霉；根霉屬等獲得的任何蛋白 質(zhì)降解酶活性。β _淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)是外作用麥芽糖淀粉酶，其催化1，4-α -糖苷鍵水 解成支鏈淀粉和相關(guān)葡萄糖聚合物，由此釋放麥芽糖。已經(jīng)從多種植物和微生物中分離了 β -淀粉酶。參閱 Fogarty 等，PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第 15卷，第 112-115 頁(1979)。這些β-淀粉酶在40°C到65°C范圍內(nèi)具有最佳溫度，在約4. 5到約7.0范圍 內(nèi)具有最佳PH。期望的β-淀粉酶包括，但不限于來自大麥的β -淀粉酶SPEZYME BBA 1500、SPEZYME DBA、0ptimalt ME、0ptimalt BBA(Genencor International, Inc.)；禾口 Novozym WBA(Novozymes A/S)。多個(gè)種類或活性的其他酶的實(shí)例已經(jīng)商品化并為本領(lǐng)域 所知，且適合于用于本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)特定配制為食品加工助劑或食品添加劑 的其他酶與本文公開的酶混合物或其他組合物組合使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶混合物包含用于液化淀粉或包含直鏈淀粉和/ 或支鏈淀粉的其他復(fù)合糖類的一種或多種其他酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其他的酶是 α-淀粉酶。任何已知的α-淀粉酶可與淀粉酶、組合物或本文提供的酶混合物，包括細(xì) 菌α-淀粉酶，例如來自任何芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)的α -淀粉酶，如AmyL-、AmyS-.AmyQ-或AmyM-類型的淀粉酶、真菌淀粉酶，或植物或動(dòng)物淀粉酶組合使用。當(dāng)用于 液化過程時(shí)，相對(duì)于用單個(gè)酶，尤其是野生型酶液化的相當(dāng)?shù)矸蹪{液的最大粘度，這種混合 物或組合物優(yōu)選降低淀粉漿液的最大粘度。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含兩種或更多酶的酶混 合物將淀粉漿液的最大粘度降到至少任何兩種或更多酶單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的粘度，并還導(dǎo)致 淀粉漿液的終粘度與任何兩種或更多酶單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的終粘度至少一樣低。
還提供液化淀粉漿液的方法，其包括制備包含淀粉的漿液，將漿液加熱 至液化可接受的溫度，向漿液中加入包含如本文所述第一種和第二種α “淀粉酶的上述酶 混合物，并將漿液與酶混合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí)間。漿液的終粘度 大約與相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用第一種α “淀粉酶獲得的終粘度一樣低，并且漿液的最大 粘度比在相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用第二種α-淀粉酶獲得的最大粘度低。在一個(gè)實(shí)施方 案中，和分別加入第一種和第二種α-淀粉酶單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程時(shí)的相應(yīng)量相比，力口 入的酶混合物的量導(dǎo)致加入更少的每一種第一種和第二種α-淀粉酶。第一種和第二種 α-淀粉酶每一種的量分別是每一種單獨(dú)使用時(shí)加入相應(yīng)量的大約一半。
還提供包含變體淀粉酶的藥盒(即試劑盒)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用 于促進(jìn)淀粉漿液液化的試劑盒。所述試劑盒包括至少一種本文所述變體α-淀粉酶、本文 所述包含變體淀粉酶的組合物、本文所述食品級(jí)凍干組合物，或本文所述酶混合物；和用于 在淀粉漿液液化過程中使用試劑盒的說明書。
還提供試劑盒，其用于實(shí)踐前述從表面清洗淀粉殘余的方法，并用于處理 針織材料以去除包含淀粉或淀粉衍生物的涂層。試劑盒包括至少一種本文所述的α-淀粉 酶變體，或本文所述一種組合物或酶混合物，以及用于實(shí)踐相應(yīng)方法的說明書。
還提供使用本文公開的α -淀粉酶、組合物或酶混合物生產(chǎn)乙醇的方法。 該方法包括用以下中的一種或多種種液化淀粉漿液(a)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的變體 α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶至少181位和182位或這兩個(gè)位置上的氨基酸相對(duì)于來 自嗜熱脂肪芽孢桿菌的野生型α “淀粉酶發(fā)生取代，181位上的野生型氨基酸殘基取代分 別包括Ala、Cys, Asp、Glu、Leu或Pro，182位上野生型氨基酸殘基取代分別包括Ala、Ser 或Pro ； (b)包含所述α -淀粉酶的組合物；(c)包含所述淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物；或 (d)包含所述淀粉酶和第二種淀粉酶的酶混合物，所述α-淀粉酶具有催化活性，當(dāng)其用于 液化過程時(shí)產(chǎn)生比每一種淀粉酶單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程時(shí)第二種α-淀粉酶的相應(yīng)催化 活性產(chǎn)生的終粘度低的終粘度，但比其最大粘度高的最大粘度。加入酶后，用能夠生產(chǎn)乙醇 的一種或多種生物在適合在發(fā)酵中產(chǎn)生乙醇的條件下發(fā)酵所得液化淀粉漿液一段時(shí)間。技 術(shù)人員將理解任何多種生物可用于通過發(fā)酵此類液化糖類來產(chǎn)生乙醇。優(yōu)選地，例如通過 本領(lǐng)域已知的任何多種方法，如通過蒸餾和濃縮至少部分純化所得乙醇。
技術(shù)人員將理解選來發(fā)酵的特定生物可提供更高的產(chǎn)量或更有效地發(fā)酵 糖類，如果漿液進(jìn)一步例如酶促加工或轉(zhuǎn)化成甚至更小的DP聚合物——例如單糖，如葡萄 糖，或葡萄糖和果糖的組合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括向液化淀粉漿液中加 入一種或多種其他的酶以在發(fā)酵步驟中進(jìn)一步完成乙醇生產(chǎn)的任選步驟。此類酶包括淀粉 酶，例如麥芽糖淀粉酶或糖酵解淀粉酶(glucolytic amylase)、異構(gòu)酶或甚至蛋白酶或脂 肪酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，充分純化乙醇以用作食品或飲料、食品添加劑，或燃料或燃料添 加劑。
上文引用的所有參考文獻(xiàn)為了所有目的以其整體引入作為參考。提供下 文提供的操作實(shí)例以進(jìn)一步描述并闡明α-淀粉酶變體的某些方面，并因此不應(yīng)理解為限 制。
實(shí)施例實(shí)施例1 基于嗜熱脂肪地芽孢桿菌α -淀粉酶序列的α _淀粉酶變體的熱穩(wěn)定 性
篩選在181位具有取代的AmyS α -淀粉酶變體文庫相對(duì)于兩種對(duì)照即親 本α -淀粉酶AmyS (來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌)和市售酶制劑SPEZYME ETHYL (Genencor International, Palo Alto，CA ；如上描述)的熱穩(wěn)定性。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成文庫。包括 I181K、I181N、I181Q和I181W在內(nèi)的某些變體不呈現(xiàn)在文庫中。制備并篩選文庫中每一變 體的熱穩(wěn)定性。在純化的或平板樣品上進(jìn)行蛋白質(zhì)測定。在所有測定中，將等量的α-淀 粉酶蛋白質(zhì)加入反應(yīng)中。
使用ρΗ 5. 6的蘋果酸緩沖液將平板或純化的變體稀釋至蛋白質(zhì)濃度約 為20ppm。在相同的緩沖液中懸浮由15%的玉米淀粉組成的底物。將反應(yīng)管中400μ1的 淀粉懸浮液平衡至70°C 2. 5分鐘。隨后將7 μ L稀釋的酶加入至平衡后的淀粉懸浮液中使 蛋白質(zhì)終濃度約為0. 35ppm。隨后將反應(yīng)混合物放在預(yù)熱到85°C的振蕩加熱器中并在300 轉(zhuǎn)/分鐘下進(jìn)行混合。
在預(yù)設(shè)的溫育時(shí)間(20分鐘)時(shí)，通過加入50 μ L 125mMNa0H來終止反 應(yīng)。隨后旋轉(zhuǎn)反應(yīng)管并且用IOmM NaOH將上清液稀釋10倍，用于HPAEC-PAD進(jìn)行DP譜分 析。計(jì)算每種檢測酶的活性，在未進(jìn)行85°C熱攻擊的酶的活性基礎(chǔ)上計(jì)算每種酶剩余的百 分比活性。結(jié)果
以上測定結(jié)果顯示于圖1中。柱高代表85°C溫育20分鐘后的剩余百分 比活性(Y軸)。每個(gè)柱都用一個(gè)字母表示，該字母對(duì)應(yīng)用于取代AmyS α -淀粉酶的181位 天然存在的異亮氨酸的氨基酸殘基的單字母縮寫。在不存在值(即，柱高為零)的地方，未 檢測對(duì)應(yīng)于該取代的變體。標(biāo)注為“Ζ”的柱代表野生型AmyS α-淀粉酶。標(biāo)注為“$ ”的柱 代表使用市售酶制劑SPEZYME ETHYL (Genencor International)的對(duì)比對(duì)照。
相對(duì)于野生型AmyS，許多變體顯示出了提高的熱穩(wěn)定性。在這些變體中， I181P、I181A和I181L在熱攻擊后保留了最高的活性。I181P和I181A的誤差棒表明差異 是顯著的。如熱激發(fā)后保留活性所示，包括I181C、I181D、I181E和I181Y在內(nèi)的其他變體 平均都顯示出至少在數(shù)字上增加的熱穩(wěn)定性?？紤]到誤差棒的重疊，變體I181F、I181G、 I181H和I181V看起來均具有與野生型/親本酶相當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定性。實(shí)施例2 變體相對(duì)于市售酶制劑的活性譜
比較了兩種市售酶與在初期篩選中顯示最高熱穩(wěn)定性的變體的活性譜。 先測定純化的樣品及來自平板的樣品的蛋白質(zhì)濃度并且所有淀粉酶以相同的蛋白質(zhì)濃度 進(jìn)行檢測。
使用ρΗ 5. 6的蘋果酸緩沖液將平板或純化的α -淀粉酶變體稀釋至蛋白 質(zhì)濃度約為20ppm。底物由相同緩沖液中的15%玉米淀粉組成。將反應(yīng)管中400μ1的淀粉懸浮液底物平衡至65°C 2. 5分鐘。將稀釋的酶(10 μ L)加入到平衡后的淀粉懸浮液中至 蛋白質(zhì)終濃度約為lppm。將反應(yīng)混合物溫育5分鐘，隨后放置在預(yù)熱至85°C的振蕩加熱器 中并在300轉(zhuǎn)/分鐘下進(jìn)行混合。在預(yù)設(shè)的時(shí)間間隔處，用50 μ L 125mM的NaOH對(duì)反應(yīng)進(jìn) 行淬滅。隨后旋轉(zhuǎn)反應(yīng)管并用IOmM NaOH將上清液稀釋10倍，以用于通過HPAEC-PAD來進(jìn) 行DP譜分析，這是支鏈淀粉的鏈長度分析的常用技術(shù)。
在65°C放置5分鐘后取初始樣品。在溫度從65V驟增至85°C后，在5分 鐘、15分鐘和30分鐘時(shí)取下一步的樣品。整合從DP2至HPLC運(yùn)行結(jié)束的總面積，并使所述 面積除以總蛋白質(zhì)和反應(yīng)時(shí)間。對(duì)于高溫溫育，5分鐘的反應(yīng)提供了酶如何快速開始破壞底 物的指示；15分鐘的反應(yīng)提供了酶的熱活性的指示，并且30分鐘提供了酶的熱穩(wěn)定性的指
7J\ ο結(jié)果
結(jié)果顯示于圖2、圖3和圖4中。每一色譜中的Y軸表示通過脈沖電流檢 測(PAD)的分析物定量檢測，以納庫侖(nC)表示。X軸表示從柱子上的洗脫時(shí)間。
圖 2 顯示了市售酶制劑 SPEZYME ETHYL (Genencor International)的 結(jié)果。如從圖A-D中可見，如從溫育5分鐘至15分鐘至30分鐘的更快洗脫峰的增加所示， 在30分鐘的時(shí)間過程中酶活性持續(xù)從漿液中釋放出更低的DP片段。30分鐘的樣品(圖D) 在DP2片段上較圖C(15分鐘)顯示出16%的增加，所述圖C(15分鐘)在DP2碎片上較圖 B(5分鐘)顯示出33%的增加。圖B在DP2碎片上較圖A(僅65°C溫育)顯示出34%的增 加。
圖 3 顯示 了另一種市售酶制劑 SPEZYME XTRA (Genencor International ；上文描述)的結(jié)果。該酶最初反應(yīng)更迅速；然而，它的熱穩(wěn)定性看起來較 低，因?yàn)楦虳P片段釋放的增長速率持續(xù)下降(例如圖D相對(duì)于圖C)。30分鐘樣品(圖 D)在釋放的DP2片段上較15分鐘樣品(圖C)顯示出2%的增加，所述15分鐘樣品較圖B 中顯示的5分鐘樣品顯示出26%的增加。圖B在釋放的DP2片段上較在65°C溫育了 5分 鐘的樣品顯示出40%的增加。
圖4顯示了 AmyS變體I181P的結(jié)果。該變體酶活性提供了更低DP片段 的更快初始釋放，說明該變體具有非常迅速的起始活性。與初始樣品(65°C 5分鐘)相比， 在85°C 5分鐘后(圖B)存在45%的增加。15分鐘后(圖C)，在DP2片段的釋放上存在進(jìn) 一步6%的增加。從圖C至圖D(30分鐘)，在DP2片段的釋放上存在進(jìn)一步7%的增加。還 不清楚從圖B至圖C至圖D的增加下降是熱失活的結(jié)果，還是由于其他因素例如底物的實(shí) 際早期切割(并因此而損失)、或可能是由于例如產(chǎn)物抑制的其他因素所導(dǎo)致的底物切割 上的降低的結(jié)果。淀粉降解的初始速率對(duì)市售產(chǎn)品而言是非常重要的因素，而AmyS I181P 變體顯示出了高的初始降解率。
圖5顯示了圖2、圖3和圖4每幅圖的圖B中顯示的信息的并列比對(duì)。該 時(shí)間點(diǎn)代表了溫度從65°C驟增到85°C后的5分鐘的溫育，并且提供了對(duì)酶能力有用評(píng)估。
如圖2、圖3和圖4中，Y軸提供了使用脈沖安培檢測的以納庫侖(nC)表 示的檢測定量結(jié)果，且X軸代表以分鐘計(jì)的洗脫時(shí)間。變體具有不同的活性譜并且一般在 降解底物釋放更低DP產(chǎn)物，例如DP2片段方面優(yōu)于市售酶。實(shí)施例3 =AmyS變體與市售酶制劑的粘度測定法比較
本實(shí)施例顯示該AmyS變體與包括市售制劑在內(nèi)的其他α -淀粉酶相比表現(xiàn)出改變的性能。這些改變的性能一般包括改變的熱穩(wěn)定性、改變的水解率和改變的比活 性。在淀粉漿液的水解過程中(例如液化)觀察到的其他改變的性能，包括改變的最大粘 度和/或改變的終粘度。
純化了四個(gè)α-淀粉酶變體并表征了總蛋白質(zhì)和比活性，隨后如通過粘 度測定法(HAAKE Viscotester 550儀器)監(jiān)測來檢測了它們?cè)跐{液中水解/切割玉米淀粉 的能力。每日生產(chǎn)一批具有30%玉米粉干固體的底物漿液。使用硫酸調(diào)節(jié)ρΗ為5.8。稱 取50g漿液(15g干固體)并在攪拌下預(yù)溫育10分鐘至70°C。除非另行說明，酶均單獨(dú)加 入到各反應(yīng)中。檢測的酶和使用的量如下變體AmySI181P 變體(SEQ ID NO 3) :44μ g,AmySI181A 變體(SEQ ID NO 2) :44μ g,AmySG182A 變體(SEQ ID NO: 16) 27. 5μ g,AmySG182S 變體(SEQ ID NO 17) :27· 5 μ g,AmySG182P 變體(SEQ ID NO : 17) :27. 5 μ g, 687. 5 μ g (結(jié)果未顯示)·市售制劑SPEZYME XTRA(第l批)27·5μg，SPEZYME XTRA (第 2 批)27· 5 μ g，
加入α-淀粉酶后，伴隨75轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，溫度從70°C驟增至85°C。達(dá) 到85°C后保持漿液和酶混合物的溫度恒定。在整個(gè)溫育過程中及隨后的30分鐘內(nèi)監(jiān)測粘 度，以μ Nm指示。結(jié)果
結(jié)果顯示于圖6中。Y軸顯示了以μ Nm計(jì)的相對(duì)粘度，而X軸顯示以分 鐘計(jì)的時(shí)間。最大粘度在約10分鐘處可獲得并隨使用的酶而有所改變。所有樣品的粘度 在后期階段隨淀粉膠凝化增加。
與市售酶SPEZYME XTRA相比，變體Ι181Ρ和Ι181Α產(chǎn)生大大降低的最大 粘度。1181變體還較市售酶制劑產(chǎn)生了更高的終粘度。使用兩批單獨(dú)的SPEZYME XTRA， 一批是新鮮制備以確保所觀察到的差異不是由于例如貯藏過程中諸如活性喪失等任何混 雜因素而導(dǎo)致。兩批均產(chǎn)生了相似的結(jié)果。因此，變體的催化活性導(dǎo)致了較市售酶的催化活 性產(chǎn)生的最大粘度更低的最大粘度，而較市售酶的催化活性產(chǎn)生的終粘度更高的終粘度。
G182變體未能與1181變體或標(biāo)準(zhǔn)α -淀粉酶SPEZYME XTRA表現(xiàn)地一 樣好。盡管G182P變體必須以更高劑量來使用，但G182A和G182P變體均用于應(yīng)用。在檢 測中，使用687. 5 μ g (約50AAU/g)的劑量(結(jié)果未顯示)。
一般地，1181變體在降低最大粘度方面比G182變體或SPEZYME XTRA 表現(xiàn)得更好，然而，SPEZYME XTRA比任一變體類型產(chǎn)生更低的終粘度。實(shí)施例4 使用AmyS變體的酶混合物
除了比較本發(fā)明α-淀粉酶變體與市售酶制劑外，還制備并檢測了兩種 市售酶，或α-淀粉酶和市售酶的組合物(即混合物)。此類組合的表現(xiàn)優(yōu)于包括兩種市售 酶的混合物在內(nèi)的任何其他酶制劑。
制備用于取樣的淀粉漿液和酶反應(yīng)物，并如上文實(shí)施例3中詳細(xì)描述的 進(jìn)行。檢測以下酶活性或活性組合圖 7ASPEZYME FRED,以 390 μ g 使用，SPEZYME XTRA,以 30 μ g 使用，SPEZYME FRED 和 SPEZYME XTRA 的混合物，分別使用 195 μ g 和 15 μ g。圖 7BSPEZYME FRED，以 390 μ g 使用， AmyS 118IP 變體(SEQ ID NO :3)，以 88 μ g 使用，SPEZYME FRED 和 AmyS 1181 變體的混合物，分別使用 195 μ g 和 44 μ g。結(jié)果
結(jié)果顯示于圖7A和圖7B中。如圖7A中顯示的，市售酶制劑SPEZYME XTRA和SPEZYME FRED (Genencor，International ；如上描述)均產(chǎn)生低的終粘度，并且 SPEZYME FRED活性比SPEZYME XTRA提供更低的終粘度。然而，SPEZYME FRED的最 大粘度明顯高于SPEZYME XTRA的最大粘度。此外，SPEZYME FRED以高于SPEZYME XTRA濃度10倍的量使用。有趣的是，包含有SPEZYME FRED和SPEZYME XTRA的酶混合 物僅以每種單獨(dú)使用時(shí)濃度的一半來使用，并產(chǎn)生了與SPEZYME FRED提供的最大粘度一 樣低的最大粘度。此外，該最大粘度降低到SPEZYME XTRA活性提供的最大粘度。因此， 該混合物提供兩種酶活性的優(yōu)點(diǎn)，并且沒有任一種酶的缺點(diǎn)；然而，無協(xié)同作用并且?guī)缀鯖] 有或無累加作用是明顯的。SPEZYME FRED和SPEZYME XTRA的最大粘度仍比期望的高， 并且顯著高于某些α-淀粉酶變體所觀察到的。
圖7Β顯示了用118IP變體和SPEZYME FRED進(jìn)行相當(dāng)漿液消化物的粘度 數(shù)據(jù)。使用變體所獲得的最大粘度顯著低于市售淀粉酶制劑的最大粘度。然而，終粘度顯著 高于SPEZYME FRED或SPEZYME XTRA (未顯示，見圖7Α)的終粘度。此外，含SPEZYME FRED和AmyS變體I181P的酶混合物提供兩種酶的優(yōu)點(diǎn)，即比SPEZYME FRED更低的最大 粘度和比變體淀粉酶更低的終粘度。此外，SPEZYME f FRED和1181淀粉酶變體的組合混 合物提供比任何一種酶單獨(dú)提供的更低的最大粘度以及與SPEZYME, FRED提供的終粘度 一樣低的終粘度。因此，該混合物產(chǎn)生了與更低的終濃度組合的更低的最大粘度，并在組合 使用時(shí)在兩種酶之間顯示出了協(xié)同作用。因此，本發(fā)明α-淀粉酶變體特別用于與其他淀 粉酶組合。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，α-淀粉酶變體以及制備和使用這 些淀粉酶變體的方法是可以改變或修飾的，而不背離本公開內(nèi)容的范圍或精神。因此，此類 改變和修飾包括在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。盡管本申請(qǐng)已經(jīng)被分為幾部分來幫助讀者， 但某一部分中的描述是可以用于其他部分中的。因此不應(yīng)該將標(biāo)題理解為限制。
權(quán)利要求
基于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的親本α 淀粉酶的變體α 淀粉酶，其中所述變體與親本α 淀粉酶相比，在181位氨基酸、或182位氨基酸或這兩個(gè)位置的氨基酸上包含取代，其中變體181位上的氨基酸殘基選自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp和Glu，變體182位上的氨基酸殘基選自Pro、Ala和Ser。
2.權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶，其具有選自SEQID NO :3 (Ι181Ρ)、SEQ ID NO: 2(I181A)、SEQ ID NO :10 (I181L)、SEQ ID NO :4 (I181C)、SEQ ID NO :5 (I181D)、SEQ ID NO: 6(I181E)和 SEQ ID NO :15(I181Y)的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶，其具有選自SEQID NO 18 (G182P)、SEQ ID NO 16(G182A)和 SEQ ID NO :17(G182S)的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶，其中所述親本α -淀粉酶具有與SEQID NO 1的氨 基酸序列至少85%相同的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶，其中所述親本α-淀粉酶具有SEQIDNO :1的氨基 酸序列。
6.權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶，其在特定測定條件下，相比于野生型α-淀粉酶具有 增加的比活性。
7.權(quán)利要求6的變體α-淀粉酶，其中所述變體在約50-90°C之間具有增加的比活性。
8.權(quán)利要求7的變體α-淀粉酶，其中所述變體在約65_85°C之間具有增加的比活性。
9.組合物，其包含權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶。
10.權(quán)利要求9的組合物，其還包含至少一種其他的酶。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述至少一種其他的酶具有用于液化復(fù)合糖類的活 性，所述復(fù)合糖類包含直鏈淀粉和支鏈淀粉。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述至少一種其他的酶是其他的α-淀粉酶。
13.權(quán)利要求10的組合物，其中在液化過程中，相對(duì)于在缺乏變體α-淀粉酶時(shí)用其他 酶液化的相當(dāng)?shù)矸蹪{液的最大粘度，所述組合物降低淀粉漿液的最大粘度。
14.權(quán)利要求11的組合物，其配制用于食品或食品加工。
15.食品級(jí)凍干組合物，其包含權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶。
16.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶。
17.權(quán)利要求16的多核苷酸，其中優(yōu)化密碼子使用以用于在微生物或植物中表達(dá)所述 變體α “淀粉酶。
18.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求16的多核苷酸。
19.細(xì)菌細(xì)胞，其包含權(quán)利要求18的表達(dá)載體。
20.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16的多核苷酸。
21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或嗜 熱脂肪芽孢桿菌。
22.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物并且所述植物用于乙醇生產(chǎn)。
23.液化淀粉漿液的方法，其包括制備包含淀粉的漿液；將所述漿液加熱至淀粉液化可接受的溫度；向所述漿液中加入權(quán)利要求9的組合物；并將所述漿液與所述組合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí)間。
24.權(quán)利要求23的方法，其中溫度從約50°C到約95°C。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述漿液包含約15-40%以干重計(jì)的淀粉。
26.權(quán)利要求23的方法，其中液化是發(fā)酵過程的部分。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述發(fā)酵用于產(chǎn)生食品產(chǎn)品、食品添加劑、燃料或燃料添 加劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述燃料或燃料添加劑是醇。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述醇是乙醇。
30.權(quán)利要求23的方法，其中與親本α-淀粉酶液化的相當(dāng)漿液的最大粘度相比，溫育 步驟產(chǎn)生降低最大粘度至少25%。
31.處理之前已經(jīng)與包含淀粉或淀粉衍生物的涂層接觸的針織材料的方法，所述方法 包括使所述針織材料與包含權(quán)利要求1的變體α-淀粉酶的溶液在足以從所述針織材料基 本上去除涂層的條件下接觸一段時(shí)間。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述針織材料是織物。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述接觸步驟在比周圍大氣壓高的壓力下進(jìn)行。
34.用于液化淀粉漿液的酶混合物，所述混合物包含至少第一種和第二種α-淀粉酶，所述第一種α-淀粉酶具有催化活性，當(dāng)其用于液化過程中時(shí)，產(chǎn)生比每一種酶單獨(dú) 用于相當(dāng)液化過程中時(shí)所述第二種α“淀粉酶的相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的終粘度低的終粘度， 但比其產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度，其中當(dāng)用于相當(dāng)液化過程中時(shí)，所述酶混合物提供這樣的催化活性，其產(chǎn)生與單獨(dú)使 用所述第一種α-淀粉酶得到的終粘度大致相同的終粘度，和顯著低于單獨(dú)使用所述第二 種α“淀粉酶得到的最大粘度的最大粘度；其中相當(dāng)液化過程包含溫度、ΡΗ、鈣離子濃度和底物濃度的特定條件。
35.液化淀粉漿液的方法，其包括制備包含淀粉的漿液，將漿液加熱至液化可接受的溫 度，向漿液中加入包含所述第一種和第二種α “淀粉酶的權(quán)利要求34的酶混合物，并將漿 液與所述酶混合物在足以液化淀粉漿液的溫度下溫育一段時(shí)間。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述終粘度大約與相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用所述第一 種α “淀粉酶獲得的終粘度一樣低，并且最大粘度比相當(dāng)液化過程中單獨(dú)使用所述第二種 α-淀粉酶獲得的最大粘度低。
37.權(quán)利要求34的方法，其中與每一種酶單獨(dú)用于相當(dāng)液化過程時(shí)分別加入的第一種 和第二種α-淀粉酶的相應(yīng)量相比，加入的酶混合物的量導(dǎo)致加入更少的第一種和第二種 α-淀粉酶中的每一種。
38.權(quán)利要求37的方法，其中第一種和第二種α-淀粉酶每一種的量分別約為單獨(dú)使 用每一種時(shí)加入的相應(yīng)量的一半。
39.生產(chǎn)乙醇的方法，其包括利用以下中的一個(gè)和多個(gè)來液化淀粉漿液(a)基于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的親本α -淀粉酶的變體α -淀粉酶，其中所述變體與親本α -淀粉酶相比在181位氨基酸、或182位氨基酸或這兩個(gè)位置的氨基酸上包含取代， 其中變體181位上的氨基酸殘基選自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp和Glu，變體182位上的氨基 酸殘基選自Pro、Ala和Ser, (b)包含(a)的變體α-淀粉酶的組合物，(c)包含(a)的變體α-淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物，或(d)包含(a)的變體α-淀粉酶和第二種淀粉酶的酶混合物，變體α _淀粉酶具有催化 活性，當(dāng)其用于液化過程中時(shí)，產(chǎn)生比變體α-淀粉酶和第二種淀粉酶每一種酶單獨(dú)用于 相當(dāng)液化過程中時(shí)所述第二種α-淀粉酶的相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的終粘度低的終粘度，但比 其產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度；發(fā)酵漿液中的至少一部分糖以生產(chǎn)乙醇；并至少部分純化所得乙醇。
40.權(quán)利要求39的方法，其包括向液化的淀粉漿液中加入一種或多種其他酶的任選步 驟，以進(jìn)一步完成發(fā)酵步驟中的乙醇生產(chǎn)。
41.促進(jìn)淀粉漿液液化的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種(a)基于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的親本α-淀粉酶的變體α -淀粉酶，其中所述變體與 親本α _淀粉酶相比在181位氨基酸、或182位氨基酸或這兩個(gè)位置的氨基酸上包含取代， 其中變體181位上的氨基酸殘基選自Pro、Ala、Leu、Cys、Asp和Glu，變體182位上的氨基 酸殘基選自Pro、Ala和Ser,(b)包含(a)的變體α-淀粉酶的組合物，(c)包含(a)的變體α-淀粉酶的食品級(jí)凍干組合物，或(d)包含(a)的變體α-淀粉酶和第二種淀粉酶的酶混合物，所述變體α -淀粉酶具有 催化活性，當(dāng)其用于液化過程中時(shí)，產(chǎn)生比變體α -淀粉酶和第二種淀粉酶每一種酶單獨(dú) 用于相當(dāng)液化過程中時(shí)所述第二種α“淀粉酶的相應(yīng)催化活性產(chǎn)生的終粘度低的終粘度， 但比其產(chǎn)生的最大粘度高的最大粘度；和用于液化淀粉漿液的試劑盒中的說明書。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了在181位或/和182位上有突變，具有改變的淀粉水解譜的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體。該變體具有提高的熱穩(wěn)定性和增加的比活性，導(dǎo)致在淀粉液化過程中降低的最大粘度和改變的終粘度。該淀粉酶變體用于例如液化和其他淀粉降解過程。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101939421SQ200980104115
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者A·肖, M·J·佩珀森, S·W·拉默 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國公司