專利名稱：穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及其制造法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。更詳細(xì)為涉及具有優(yōu)良的氧化穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性等 的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是催化存在于肽鏈內(nèi)的谷氨酰胺殘基的Y-羧基酰胺基的酰基轉(zhuǎn) 移反應(yīng)的酶，蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基氨基作為酰基受體起作用時(shí)，在蛋白質(zhì)分子的分 子內(nèi)或者分子間形成ε-(Y-Gin)-Lys交聯(lián)鍵。所以，如果利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用就能 進(jìn)行蛋白質(zhì)或肽的改性，因此，使用了源自鏈霉菌屬微生物酶的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(參照專利 文獻(xiàn)1)被使用于粘結(jié)肉、香腸、豆腐、面包、面類的制造中。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是以發(fā)酵過程中經(jīng)Pro體轉(zhuǎn)換為成熟型的半胱氨酸為活性中心殘 基的硫醇酶，所以穩(wěn)定性差，為抑制制造工序中或者制品的保存中發(fā)生失活而需要添加穩(wěn) 定劑。作為用于改善轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶保存中的穩(wěn)定性的方法，已提出添加有機(jī)酸、無機(jī)酸、 多酚、硫醇、糖醇等的技術(shù)(專利文獻(xiàn)1)。另外，還開發(fā)出添加蛋白質(zhì)(小麥蛋白質(zhì)、大豆蛋 白質(zhì)等)、蛋白質(zhì)部分水解物而提高穩(wěn)定性的方法(專利文獻(xiàn)2)。而且，也開發(fā)了利用海藻 糖進(jìn)行穩(wěn)定化的技術(shù)(專利文獻(xiàn)3)。專利文獻(xiàn)1 特開平4-207194號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 專利第3651003號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 特開2004-305010號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
到目前為止雖然已提出各種穩(wěn)定化技術(shù)，但對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行穩(wěn)定化的需求仍 然很高。如上所述，在食品領(lǐng)域中廣泛利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。所以，為了避免意外事態(tài)，要求 盡量不添加多余成分。在以上的背景下，本發(fā)明以提供具有優(yōu)良的穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、其制造法、及 其用途為課題。本發(fā)明人等鑒于以上的課題進(jìn)行了銳意的研究。其結(jié)果，確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn) 菌的培養(yǎng)液中存在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中間體，并成功地對(duì)其進(jìn)行了回收。繼續(xù)探討的結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 回收的中間體是Pro序列肽與成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(成熟型TGase)相結(jié)合的物質(zhì)。另一 方面，對(duì)中間體的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性以及保 存穩(wěn)定性均超出成熟型TGase。本發(fā)明是基于以上的認(rèn)識(shí)下完成的，其內(nèi)容如下。[1] 一種穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的Pro序列肽與成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰 胺酶結(jié)合了的結(jié)構(gòu)構(gòu)成。[2]根據(jù)[1]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為源自微生物。
[3]根據(jù)[2]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，微生物為鏈霉菌(str印tomyces)屬微 生物。[4]根據(jù)[2]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，微生物為茂原鏈霉菌(Str印tomyces mobaraensis)0[5]根據(jù)[1]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有序列號(hào)6所示 的氨基酸序列。[6]根據(jù)[1]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，Pro序列肽為源自微生物。[7]根據(jù)[6]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，微生物為鏈霉菌屬微生物。[8]根據(jù)[6]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，微生物為茂原鏈霉菌。[9]根據(jù)[1]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，Pro序列肽具有以下⑴ ⑶中的任 一序列(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列號(hào) 1)；(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列號(hào) 2)；(3) DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS (序列號(hào) 3)。[10]根據(jù)[1] [9]中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，與未結(jié)合轉(zhuǎn)谷氨酰胺 酶的Pro序列肽的成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶相比，選自pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性以及 保存穩(wěn)定性中的一個(gè)以上的穩(wěn)定性高。[11] 一種酶制劑，含有[1] [10]中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。[12] 一種穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，包含在產(chǎn)生轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的條件下培養(yǎng)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)生能力的微生物的步 驟；從培養(yǎng)液分離、回收結(jié)合了 Pro序列肽的成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的步驟。[13]根據(jù)[12]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，微生物為鏈霉菌屬微生物。[14]根據(jù)[12]所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，微生物為茂原鏈霉菌。


圖1為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的pH穩(wěn)定性的對(duì)比。橫 軸為PH、縱軸為殘存活性(％)。圖2為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的溫度穩(wěn)定性的對(duì)比。 橫軸為處理時(shí)間(分)、縱軸為殘存活性(％ )。圖3為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的氧化穩(wěn)定性的對(duì)比。 橫軸為過氧化氫濃度(％ )、縱軸為殘存活性(％ )。圖4為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的保存穩(wěn)定性的對(duì)比。 橫軸為保存期間(月)、縱軸為殘存活性(％ )。圖5為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的溫度穩(wěn)定性的對(duì)比。 橫軸為處理時(shí)間(分)、縱軸為殘存活性(％ )。圖6為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的氧化穩(wěn)定性的對(duì)比。 橫軸為過氧化氫濃度(％ )、縱軸為殘存活性(％ )。圖7為穩(wěn)定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的溫度穩(wěn)定性的對(duì)比。
4橫軸為處理時(shí)間(分)、縱軸為殘存活性(％ )。
具體實(shí)施例方式(穩(wěn)定型 TGase)本發(fā)明的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(穩(wěn)定型TGase)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的Pro序列肽 與成熟型TGase結(jié)合了的結(jié)構(gòu)。即，必須的構(gòu)成要素為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的Pro序列肽和成熟型 TGase,以這些要素相結(jié)合為特征。由于該特征，本發(fā)明的穩(wěn)定型TGase呈高于成熟型TGase 的穩(wěn)定性。本說明書中用語“穩(wěn)定性”是作為包括了 PH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、保 存穩(wěn)定性的表述而被使用。所以，本發(fā)明的穩(wěn)定型TGase是其選自pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、 氧化穩(wěn)定性以及保存穩(wěn)定性中的一個(gè)以上的穩(wěn)定性優(yōu)于成熟型TGase。優(yōu)選方式的穩(wěn)定型 TGase的pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、以及保存穩(wěn)定性均優(yōu)于成熟型TGase。然而，屬于分泌型蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，作為連接有信號(hào)序列(Pre序列)以及 Pro序列的PrePro型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被翻譯之后，信號(hào)序列被切斷轉(zhuǎn)換為Pro型轉(zhuǎn)谷氨酰胺 酶，接著Pro序列被切斷，變?yōu)槌墒煨娃D(zhuǎn)谷氨酰胺酶(成熟型TGase)。如后述的實(shí)施例所示， 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了在該一系列的過程中存在結(jié)構(gòu)為被切斷的Pro序列肽結(jié)合于成熟型轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶的中間體，并且明確了其具有優(yōu)良的穩(wěn)定性。本發(fā)明的穩(wěn)定型TGase典型的是 作為在上述的過程中生成的中間體而獲得，但只要是具有Pro序列肽結(jié)合于成熟型TGase 的結(jié)構(gòu)、且穩(wěn)定性高于成熟型TGase就對(duì)其制造法(獲取法)沒有特別的限定。所以，即使 分別準(zhǔn)備Pro序列肽和成熟型TGase，使兩者結(jié)合的所得物，只要能確認(rèn)穩(wěn)定性的提高也屬 于本發(fā)明的穩(wěn)定型TGase。本說明書中“Pro序列肽”是指構(gòu)成Pro序列(即，存在于Pre序列和成熟型蛋白 質(zhì)序列之間的序列)的肽的一部分或全部。以下作為Pro序列肽的例子示出了 3種肽。Pro序列肽的例1 由 DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列號(hào) 1)序列構(gòu)成的肽Pro序列肽的例2 由 DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS (序列號(hào) 2)序列構(gòu)成的肽Pro序列肽的例3 由 DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS (序列號(hào) 3)序列構(gòu)成的肽對(duì)Pro序列肽的來源(起源)沒有特別的限定。優(yōu)選的是Pro序列肽為源自微生 物?！霸醋晕⑸颬ro序列肽”除了鏈霉菌屬等的微生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(例如參照特 開昭64-27471號(hào)公報(bào))的Pro序列肽之外，還包括由該P(yáng)ro序列肽(即，微生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶的Pro序列的一部分或全長)同源的氨基酸序列構(gòu)成的肽。在序列號(hào)4(茂原 鏈霉菌)、序列號(hào)5 (肉桂色鏈霉菌(Str印tomyces cinnamoneus))中表示微生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶的Pro序列全長氨基酸序列的例子。對(duì)于本發(fā)明的穩(wěn)定型TGase構(gòu)成要素之一的成熟型TGase的來源(起源)也沒 有特別限定。例如，可以使用鏈霉菌屬等的微生物產(chǎn)生的成熟型TGase(例如參照特開昭 64-27471號(hào)公報(bào))、哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的成熟型TGase (例如參照特公平1-50382號(hào)公報(bào))、利用 重組DNA技術(shù)所得的重組(Recombinant)成熟型TGase (例如特開平5-199883號(hào)公報(bào)、特開 2004-97099號(hào)公報(bào))等。優(yōu)選成熟型TGase是源自微生物?！霸醋晕⑸锏某墒煨蚑Gase”除了鏈霉菌屬等的微生物產(chǎn)生的天然型成熟型TGase (例如參照特開昭64-27471號(hào)公報(bào)) 之外還包含對(duì)導(dǎo)入了微生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)而得到的重組成 熟型TGase。序列號(hào)6 (茂原鏈霉菌)、序列號(hào)7 (肉桂色鏈霉菌)表示源自微生物的成熟型 TGase的氨基酸序列的例子。作為Pro序列肽和/或成熟型TGase的來源的微生物優(yōu)選為屬于鏈霉 菌(Sti^ptomyces)屬的微生物。作為屬于鏈霉菌屬的微生物可舉出茂原鏈霉菌 (Streptomyces mobaraensis)(舊茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)) No. 140226 株(特開 2005-73628 號(hào)公報(bào))、淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae) No. 466 (參照專利第2849773號(hào)說明書、專利文獻(xiàn)1)、鏈霉菌(Streptomyces sp. )No. 83 (參 照專利第2849773號(hào)說明書、專利文獻(xiàn)1)等。另外，還可以使用通過紫外線照射、NTG(N-me thyl-N’-nitrosoguanidine)等的一般法提高了生產(chǎn)率、或減少了蛋白酶、淀粉酶等的雜蛋 白的生成、或抑制或缺失抗生素等生理活性物質(zhì)的突變株，而且可以使用基因重組菌等。利用重組DNA技術(shù)時(shí)(即，使用基因重組菌時(shí))，可以得到Pro序列肽的來源和成 熟型TGase的來源不同的穩(wěn)定型TGase。但是優(yōu)選Pro序列肽的來源和成熟型TGase的來 源相同。這種方式的穩(wěn)定型TGase，典型的是通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌(自身具有生產(chǎn) 性的菌或?qū)肓宿D(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的重組菌)而以中間體獲得。下面，對(duì)該方式的穩(wěn)定型 TGase的制造法的一例進(jìn)行說明。(穩(wěn)定型TGase的制造法)首先，準(zhǔn)備具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)生能力的鏈霉菌屬微生物(例如茂原鏈霉菌 No. 140226株)，在產(chǎn)生轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。只要能產(chǎn)生轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶就對(duì)培 養(yǎng)條件沒有特別限定。培養(yǎng)條件的具體例示于后述的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要 適當(dāng)?shù)馗淖兣囵B(yǎng)條件。培養(yǎng)基中可以使用淀粉、蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖等的碳源，胨、肉提取物、酵母提 取物、玉米漿、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨等的氮源，磷酸一鉀、磷酸二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、炭酸 鈣等的微量金屬鹽等通常使用的培養(yǎng)基原料。另外，為了抑制發(fā)泡可根據(jù)需要進(jìn)行消泡劑 的添加。培養(yǎng)溫度通常為25°C 35°C。另外，使用各種發(fā)酵容器進(jìn)行培養(yǎng)即可，通常進(jìn)行2 天 6天的通氣攪拌?？筛鶕?jù)所使用菌株的種類、發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行，可不必依照該條件。例 如，對(duì)培養(yǎng)基原料進(jìn)行送料(”一于)V )，或者含高濃度的培養(yǎng)基原料時(shí)，通常培養(yǎng)時(shí) 間會(huì)變得更長。另外，可根據(jù)需要進(jìn)行培養(yǎng)基的PH控制。通過過濾或者離心分離，從培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵混合物去除菌體等。作為過濾優(yōu)選 添加硅藻土的加壓過濾，并且優(yōu)選在室溫以下的條件下實(shí)施。根據(jù)需要冷卻所得濾液，即轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶粗酶液。其中，如Eur，· J，Biochem.，257，570-576 (1998)所記載，已知轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶是作為前體而被生產(chǎn)，為了變換成穩(wěn)定型TGase而可以向發(fā)酵混合物添加蛋白酶或 肽酶等的酶，進(jìn)行一定時(shí)間的處理。另外，已知轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的一部分也以不具有酶活性的 氧化型存在，所以優(yōu)選添加半胱氨酸、谷胱甘肽、或者含這些的物質(zhì)，使其變換為活性型。其 中，這些活化操作并非限定于純化工序的階段進(jìn)行，但優(yōu)選在純化的早期階段進(jìn)行。根據(jù)需要濃縮粗酶液。對(duì)濃縮方法沒有特別限定，優(yōu)選利用能夠同時(shí)進(jìn)行濃縮和 純化的超濾。通?？蓪饪s進(jìn)行至10倍 100倍左右。其中，只要能濃縮到可以進(jìn)行接下 來的工序的濃度就對(duì)濃縮的程度沒有特別要求。其中，作為超濾膜，考慮到TGase的分子量(約38000)，優(yōu)選使用具有其以下的膜，例如使用具有分子量13000的平均孔徑的旭化成工 業(yè)制ACP-13000等。不過，即使使用具有分子量50000的孔徑的膜也基本不會(huì)漏掉酶，所以 能夠通過根據(jù)需要選擇膜而提高純化度。脫鹽濃縮中有時(shí)生成沉淀，但可以通過添加適當(dāng) 的緩沖液或者鹽類溶液等而使其溶解。另外，對(duì)濃縮時(shí)的溫度沒有特別的限定，優(yōu)選10°C 30°C。雖然溫度越高越能有效地實(shí)施濃縮，但其反面是有可能發(fā)生失活。濃縮液中含有目標(biāo)穩(wěn)定型TGase(結(jié)合了 Pro序列肽的成熟型TGase)和成熟型 TGase0所以從濃縮液回收目標(biāo)穩(wěn)定型TGase。下面，對(duì)穩(wěn)定型TGase的回收法的一例進(jìn)行 說明。首先，為了去除雜蛋白質(zhì)等，通過使用了乙醇、聚乙二醇等的前處理而將濃縮液部分 純化。將經(jīng)該前處理回收的沉淀溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液之后，提供于透析。透析后，添加硫酸 銨、氯化鈉等的鹽類進(jìn)行鹽析。由此沉淀成熟型TGase?；厥丈锨逯螅名}析、柱層析、 離心分離等分離、純化上清中的穩(wěn)定型TGase。根據(jù)需要進(jìn)行脫鹽、濃縮等。(含有穩(wěn)定型TGase的酶制劑)可以使用穩(wěn)定型TGase構(gòu)成酶制劑。本發(fā)明的酶制劑的形狀沒有特別的限定，例 如為粉末狀、顆粒狀、液體狀、膠囊狀等。本發(fā)明的酶制劑含有穩(wěn)定型TGase作為必須的有 效成分。其他的成分為任意。作為本發(fā)明的酶制劑可以含有的成分可例示食品用賦形劑、 各種蛋白質(zhì)、各種蛋白質(zhì)的分解物、各種提取物類、各種鹽類、各種抗氧化劑、半胱氨酸、谷 胱甘肽、谷氨酸鈉、肌苷酸鈉、鳥苷酸鈉、貝殼煅燒鈣、二氧化硅。其中，食品用賦形劑的例子 有糊精、支化糊精、環(huán)糊精、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、多糖 類、淀粉(馬鈴薯淀粉、玉米淀粉)、難消化性糊精、橡膠類、乳化劑(蔗糖脂肪酸酯、卵磷脂 等)、膠質(zhì)、油脂。蛋白質(zhì)的例子為大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)、玉米蛋白質(zhì)、乳蛋白質(zhì)、動(dòng)物來 源蛋白質(zhì)等。提取物類的例子有肉提取物、植物提取物、酵母提取物等。鹽類的例子有氯化 鹽、磷酸鹽、聚磷酸鹽、焦磷酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、碳酸鹽等?？寡趸瘎┑睦訛長-抗壞 血酸鹽、亞硫酸氫鈉等。實(shí)施例1.穩(wěn)定型TGase的純化使用含2%的可溶性淀粉、5%的蔗糖、2%的聚胨、0. 2%的酵母提取物、0. 的硫 酸鎂、0.2%的磷酸二鉀、0. 05%的Adecanol的培養(yǎng)基，將作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌的茂原 鏈霉菌(Sti^ptomycesmobaraensis)No. 140226 ^ (參照特開 2OO5-73628 號(hào)公報(bào))在 30°C 下進(jìn)行2天的振蕩培養(yǎng)，得到了 4000mL的粗酶液。其中，只要不是特別說明，％是指重量％ (以下的各實(shí)施例中亦然)。接著，以超濾膜(旭化成社制ACP1010)將粗酶液脫鹽、濃縮，得到200mL的濃縮 液。向濃縮液以最終成為1/10濃度的方式添加、混合McIlvaine緩沖液(pH6. 0)之后，以 冷乙醇50%進(jìn)行了分餾。將回收的沉淀溶解于含0. IM氯化鈉的1/10濃度的Mcllvaine緩 沖液(pH6.0)之后，提供于透析。接著，以達(dá)到飽和濃度的方式向透析液添加氯化鈉，在低 溫下靜置3天后，回收了上清。沉淀為成熟型TGase (M-TGase)的結(jié)晶，經(jīng)利用飽和食鹽溶液 的重結(jié)晶化而獲得M-TGase純化酶。M-TGase純化酶的比活性(u/Abs280nm)為19. 1。其 中，序列號(hào)6表示M-TGase的氨基酸序列。另一方面，以達(dá)到飽和濃度的方式向回收的上清添加硫酸銨，回收了沉淀。將回收 的沉淀溶解于20mM的磷酸緩沖液(KPB ；pH7. 2)中之后，以該緩沖液進(jìn)行了透析。接著，以
7成為1. 7M的方式向透析液添加硫酸銨，提供于以含1. 7M硫酸銨的20mM磷酸緩沖液(KPB ； pH7. 2)進(jìn)行了平衡化的Phenyl-S印harose 6Fast Flow0以硫酸銨濃度1. 7M進(jìn)行洗凈后， 以硫酸銨濃度1. OM進(jìn)行了洗脫。本洗脫餾分中洗脫出了目標(biāo)穩(wěn)定型TGase (P-TGase)。如此 得到的P-TGase的比活性(u/Abs280nm)為7.9。對(duì)添加了 SDS (十二烷基硫酸鈉)的情況 和未添加的情況的凝膠過濾(S印hacryl S-100)洗脫圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果判明了 P-TGase 具有在成熟型TGase上結(jié)合有Pro序列肽的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性的測定是根據(jù)特開昭64-27471號(hào)公報(bào)所記載的方法進(jìn)行 的。S卩，以芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羥基胺為底物在不存在Ca2+下進(jìn)行反應(yīng)，將生成的 異羥肟酸在三氯乙酸共存條件下形成鐵配合物，測定525nm的吸收，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出異羥 肟酸的量，計(jì)算轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。下面，詳細(xì)說明測定法。首先，準(zhǔn)備以下的試劑A以及 B0試劑A 0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液(ρΗ6. 0)、0. IM羥基胺、0. OlM還原型谷胱甘肽、
0. 03M芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸試劑B :3N 鹽酸、12%三氯乙酸、5% FeCl3 ·6Η20(溶解于 0. 1N-HC1)的 1 1 1 的混合液向酶液0. 05mL添加0. 5mL的試劑A混合后，37°C下反應(yīng)10分鐘。添加試劑B停 止反應(yīng)并形成Fe配合物之后測定525nm的吸光度。作為對(duì)照，使用預(yù)先熱失活的酶液同樣 進(jìn)行反應(yīng)而測定其吸光度，求出與酶液的吸光度差。另行代替酶液使用L-谷氨酸-γ-單 異羥肟酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由上述吸光度差求出所生成的異羥肟酸的量。以1分鐘生成1 μ 摩爾的異羥肟酸的酶活性作為1單位。只要沒有特別說明，以下的各試驗(yàn)中也通過該測定 法測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性。2. Pro序列肽的純化向1.中得到的P-TGase溶液1. 8mL添加、溶解5. Omg的碳酸鈉之后，混合10% (w/ ν)的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液0. 2mL，37°C下處理30分鐘。將2. OmL的處理液提供于以 含0. 1 % SDS的20mM KPB (pH7. 2)進(jìn)行平衡化的S印hacryl S-100 (柱體積160mL)。監(jiān)測吸 光度280nm，回收流動(dòng)相量123mL附近觀察到的峰。使用Amicon Ultra(Ultracel_5K)，在 4°C的條件下對(duì)回收的溶液進(jìn)行了離心濃縮。得到的濃縮液(樣品)提供于N末端氨基酸 測序以及質(zhì)量分析。從N末端氨基酸分析的結(jié)果明確了肽的N末端為DNGAGEETKS。另一方 面，質(zhì)量分析的結(jié)果觀測到了 m/z (1)3623. 938、(2)3640.903、(3)3710. 780、(4)3727.845、 (5) 3813. 735的5個(gè)峰。認(rèn)為(1)和(3)分別為(2)和(4)的脫酰胺體。從N末端氨基酸 測序的結(jié)果和質(zhì)量分析的結(jié)果，將其他的3峰的氨基酸序列鑒定為，(l)DNGAGEETKSYAETYR LTADDVANINALNESAPAA(序列號(hào) 1)、(2) DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS (序列號(hào) 2)、(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列號(hào) 3)。而且，這些序列相當(dāng)于 Pro 序列全長(序列號(hào)4)的一部分。3. P-TGase的穩(wěn)定性試驗(yàn)1對(duì)比了 P-TGase和Μ-TGase的pH穩(wěn)定性。pH2 4時(shí)使用檸檬酸-鹽酸緩沖液、 pH4 11時(shí)使用伯瑞坦-羅比森(Britton-Robinson)緩沖液調(diào)制各酶稀釋液，進(jìn)行50°C、1 小時(shí)的處理之后，測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。其結(jié)果，相對(duì)于P-TGase在pH4時(shí)也具有93% 的殘存活性，同條件下的M-TGase的殘存活性為2% (圖1)。這樣，P-TGase在酸性區(qū)域中顯示出高穩(wěn)定性。另一方面，也對(duì)比了 P-TGase和Μ-TGase的溫度穩(wěn)定性。用0. 2MTRIS-鹽酸緩沖 液(pH6.0)調(diào)制了各酶稀釋液，各溫度下熱處理之后，測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。其結(jié)果， 50°C下處理80分鐘時(shí)的殘存活性是相對(duì)于M-Tgase為33%，P-Tgase為64% (圖2)。這 樣，P-TGase顯示出高于Μ-TGase的熱穩(wěn)定性。4. P-TGase的穩(wěn)定性試驗(yàn)2為了評(píng)價(jià)溶液中的對(duì)氧化的穩(wěn)定性(氧化失活的難度)，實(shí)施了抑制試驗(yàn)(對(duì)過氧 化氫)。將過氧化氫水(試劑、30% (w/v))以適宜的0.2M TRIS-鹽酸緩沖液(pH6. 0)稀 釋后添加到酶溶液，37°C下處理30分鐘之后，測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。處理濃度0. 03% (w/v)時(shí)的殘存活性是相對(duì)于M-TGase為3%, P-TGase % 54% (圖3)。這樣，P-TGase在 溶液中顯示出高氧化穩(wěn)定性。5. P-TGase的穩(wěn)定性試驗(yàn)3評(píng)價(jià)了粉末狀態(tài)下的穩(wěn)定性。通過凍結(jié)干燥分別對(duì)P-TGase和M-TGase進(jìn)行了 粉末化。對(duì)M-TGase粉末混合糊精，以使每重量當(dāng)中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性與P-TGase粉末 相同。保存溫度為44°C。2個(gè)月后的殘存活性是相對(duì)于M-TGase為79% ,P-TGase為85% (圖4)。這樣，在粉末狀態(tài)時(shí)P-TGase顯示出高穩(wěn)定性。6. P-TGase的純化(淡紫灰鏈霉菌No. 466)使用含2%的可溶性淀粉、5 %的蔗糖、2 %的聚胨、0. 2 %的酵母提取物、0. 1 %的 硫酸鎂、0.2%的磷酸二鉀、0. 05%的Adecanol的培養(yǎng)基，將作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌的 淡紫灰鏈霉菌(Sti^ptomyceslavendulae)No. 466(參照專利第2849773號(hào)公報(bào)、特開平 4-207194號(hào)公報(bào))，在30°C下進(jìn)行3天的振蕩培養(yǎng)，得到了粗酶液1500mL。接著，利用超濾膜(旭化成社制ACP1010)濃縮粗酶液，得到了 300mL的濃縮液。 以80%飽和濃度硫酸銨鹽析濃縮液，回收了沉淀。將回收的沉淀溶解于20mM的磷酸緩沖液 (KPB ;pH7. 2)，并且在相同的緩沖液中進(jìn)行了透析。從透析樣品去除不溶物，同樣將上清提 供于以20mM磷酸緩沖液(KPB ;pH7. 2)進(jìn)行平衡化的Blue-S印harose 6Fast Flow。回收 以該緩沖液進(jìn)行洗凈的餾分，用含1. 7M硫酸銨的20mM磷酸緩沖液(KPB ；pH6. 8)進(jìn)行了透 析。將透析樣品提供于同樣以含1. 7M硫酸銨的20mM磷酸緩沖液(KPB ；pH6. 8)進(jìn)行了平衡 化的 Phenyl-Sepharose 6Fast Flow.以同樣的緩沖液洗凈后，以硫酸銨濃度1. 7M OM的線性梯度進(jìn)行洗 脫，結(jié)果在洗脫液硫酸銨濃度1. OM附近洗脫出了 P-TGase。并且，在洗脫液硫酸銨濃度0. 8M 附近洗脫出了 M-TGase。7. P-TGase (淡紫灰鏈霉菌No. 466)的穩(wěn)定性試驗(yàn)1還對(duì)P-TGase和Μ-TGase的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行了對(duì)比。用0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液 (pH6. 0)調(diào)制各酶稀釋液，各溫度下熱處理之后，測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。其結(jié)果，50°C下 處理20分時(shí)的殘存活性是相對(duì)于M-TGase為12% ,P-TGase為29% (圖5)。這樣，源自淡 紫灰鏈霉菌No. 466株的P-TGase顯示出高于源自同株M-TGase的熱穩(wěn)定性。8. P-TGase (淡紫灰鏈霉菌No. 466)的穩(wěn)定性試驗(yàn)2為評(píng)價(jià)溶液中的對(duì)氧化的穩(wěn)定性(氧化失活難度)，實(shí)施了抑制試驗(yàn)(對(duì)過氧化 氫)。將過氧化氫水(試劑、30% (w/v))以適宜的0.2M TRIS-鹽酸緩沖液(pH6. 0)稀釋后向酶溶液添加，37°C下處理15分鐘之后，測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。處理濃度0.006% (w/ ν)時(shí)的殘存活性是相對(duì)于M-TGase為35%,P-TGase為62% (圖6)。這樣，源自淡紫灰鏈 霉菌No. 466株的P-TGase在溶液中顯示出高氧化穩(wěn)定性。9. Pro型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的調(diào)制使用含2%的可溶性淀粉、5%的蔗糖、2%的聚胨、0.2%的酵母提取物、0. 的 硫酸鎂、0.2%的磷酸二鉀、0. 05%的Adecanol的培養(yǎng)基，將作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌的茂 原鏈霉菌(Sti^ptomycesmobaraensis)No. 140226 株(特開 2005-73628)，在 30°C 下進(jìn)行 了 2天的振蕩培養(yǎng)，得到了粗酶液1500mL。將粗酶液利用超濾膜(旭化成社制ACP1010) 進(jìn)行濃縮，獲得了 150mL的濃縮液。將濃縮液以基于文獻(xiàn)信息(Eur. J. Biochem. 257， 570-576(1998))的方法進(jìn)行純化，得到了 Pro型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。10. P-TGase的調(diào)制(利用蛋白酶處理的由Pro型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的轉(zhuǎn)變)將Pro型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液用含150mM氯化鈉的50mM Hepes緩沖液(pH7. 4)進(jìn) 行透析而得到了透析樣品(Abs. 280nm = 1. 8)。向透析樣品以處理液終濃度成為0. 08u/mL 的方式添加Dispase II (ROCHE制)之后，30°C下進(jìn)行60分鐘的處理調(diào)制了 P-TGase。反應(yīng) 的停止是通過用含5mM EDTA的0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液(pH6. 0)稀釋到下述“11. ”的使用 濃度為止而進(jìn)行的。另一方面，下述“11. ”中使用的M-TGase也是使用了與P-TGase同樣 地進(jìn)行了 DispaseII處理的樣品。11. P-TGase (蛋白酶處理品)的穩(wěn)定性試驗(yàn)還對(duì)P-TGase和Μ-TGase的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行了對(duì)比。用0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液 (pH6. 0)調(diào)制了各酶稀釋液，各溫度下熱處理之后，測定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。其結(jié)果，50°C 下處理60分鐘時(shí)的殘存活性是相對(duì)于M-TGase為41%，P-TGase為76% (圖7)。這樣，通 過蛋白酶處理得到的P-TGase也顯示出高于M-TGase的熱穩(wěn)定性。由此，認(rèn)為經(jīng)蛋白酶處 理而得到的上述“10. ”的P-TGase與上述“1. ”的P-TGase屬于相同的物質(zhì)。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶相比，在pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn) 定性等方面優(yōu)異。本發(fā)明的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的用途例子為粘結(jié)肉、香腸、豆腐、面包、面 類的制造。本發(fā)明并不受上述的發(fā)明的實(shí)施方式以及實(shí)施例的說明的任何限定。不脫離要求 保護(hù)的范圍所記載的、本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易想到的范圍中的各種各樣的變形方式也包 括在本發(fā)明中。本說明書中所示的論文、公開專利公報(bào)、以及專利公報(bào)等的內(nèi)容是通過援用而引 用了其全部內(nèi)容。
權(quán)利要求
一種穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的Pro序列肽與成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶結(jié)合了的結(jié)構(gòu)構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為源自微 生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，微生物為鏈霉菌屬微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，微生物為茂原鏈霉菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有序列 號(hào)6所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，Pro序列肽為源自微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，微生物為鏈霉菌屬微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，微生物為茂原鏈霉菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中Pro序列肽具有以下的(1) (3) 中的任一個(gè)序列(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列號(hào)1)；(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列號(hào)2)；(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列號(hào)3)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中，與未結(jié)合轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶的Pro序列肽的成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶相比，選自pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性 和保存穩(wěn)定性中的一個(gè)以上的穩(wěn)定性高。
11.一種酶制劑，含有權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
12.一種穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，包含在產(chǎn)生轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的條件下，培養(yǎng)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)生能力的微生物的步驟； 從培養(yǎng)液分離、回收結(jié)合了 Pro序列肽的成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，其中，微生物為鏈霉菌屬 微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，其中，微生物為茂原鏈霉菌。
全文摘要
本發(fā)明以提供具有優(yōu)良的穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及其制造法為課題。提供一種穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的Pro序列肽與成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶結(jié)合了的結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。還提供一種穩(wěn)定型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制造法，其包含在產(chǎn)生轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的條件下培養(yǎng)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)生能力的微生物的步驟；從培養(yǎng)液分離、回收結(jié)合了Pro序列肽的成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的步驟。
文檔編號(hào)C12N9/10GK101945995SQ20098010464
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月13日
發(fā)明者岡田正通, 天野仁, 山口莊太郎, 黑野良明 申請(qǐng)人:天野酶株式會(huì)社