專利名稱：產(chǎn)生γ-氨基丁酸的方法
產(chǎn)生Y-氨基丁酸的方法本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)表達(dá)具有谷氨酸脫羧酶活性的酶的重組微生物發(fā)酵產(chǎn)生 Y-氨基丁酸(GABA)的新方法。本發(fā)明還涉及對(duì)應(yīng)的重組宿主、重組載體、適于制備此類宿 主的表達(dá)盒和核酸以及利用發(fā)酵產(chǎn)生獲得的GABA制備聚酰胺的方法。
背景技術(shù)：
GABA(CAS號(hào)56_12_2)是在原核和真核生物中普遍存在的重要非蛋白質(zhì)氨基酸。 其顯示不同的生物機(jī)能，例如交感神經(jīng)系統(tǒng)中代表性的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，并且其有效降低 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的血壓。該化合物由谷氨酸脫羧酶(GAD ；EC 4. 1. 1. 15)從谷氨酸合成。GABA用于不同技術(shù)領(lǐng)域。例如，富含GABA的食品可用作食物添加物和營(yíng)養(yǎng)劑來(lái)幫 助治療失眠、抑郁和自主神經(jīng)系統(tǒng)障礙、慢性酒精中毒相關(guān)癥狀以及激活免疫細(xì)胞。該化合 物還可用作生產(chǎn)聚酰胺和吡咯烷酮的原料。發(fā)酵產(chǎn)生該具有商業(yè)價(jià)值的化合物的合適方法尚未有記載。因此，本發(fā)明的目的是提供發(fā)酵產(chǎn)生GABA或其相應(yīng)鹽的合適方法。


圖1顯示來(lái)自馬鈴薯EST的疊連群(contig)與來(lái)自植物的GAD同源物的比較。圖2顯示本發(fā)明的嵌合GAD基因的示意圖。圖3顯示pClik5aMCS克隆載體的質(zhì)粒圖。

發(fā)明內(nèi)容
通過(guò)本發(fā)明教導(dǎo)GABA或其鹽的發(fā)酵產(chǎn)生解決了上述問(wèn)題，該發(fā)酵生產(chǎn)通過(guò)培養(yǎng) 表達(dá)GAD酶的重組谷氨酸產(chǎn)生微生物實(shí)現(xiàn)，該酶將該微生物中形成的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镚ABA。
具體實(shí)施例方式1.優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明涉及發(fā)酵產(chǎn)生Y-氨基丁酸(GABA)的方法，該方法包括培養(yǎng)優(yōu)選衍生自具 有產(chǎn)生谷氨酸能力的親本微生物的重組微生物，該重組微生物定性地或定量地保持該親本 微生物的該能力，還具有表達(dá)異源谷氨酸脫羧酶(E. C. 4. 1. 1. 15)的能力，由此谷氨酸轉(zhuǎn)變 為GABA ；以及該方法任選地包括將GABA從發(fā)酵液中分離。該經(jīng)修飾微生物還可以或可以 不保持其產(chǎn)生谷氨酸的能力。特別地，該微生物是谷氨酸產(chǎn)生細(xì)菌，特別是棒桿菌，例如棒桿菌屬 (Corynebacterium)的細(xì)菌，例如谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)。該異源谷氨酸脫羧酶是原核或真核來(lái)源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該異源谷氨酸脫羧酶是植物谷氨酸脫羧酶或嵌合谷氨酸 脫羧酶，其包含至少一個(gè)來(lái)源于植物谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列部分。該“至少一個(gè)來(lái)源于 植物谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列部分”包含該植物酶的至少十個(gè)連續(xù)氨基酸殘基?？傆?jì)，可能有1至10個(gè)，特別地，1至5個(gè)，優(yōu)選1或2個(gè)的氨基酸序列部分來(lái)源于該植物序列。該 部分的每一個(gè)可具有10至500、10至450、10至400、20至350、40至300、50至250、60至 200,70至150或80至100個(gè)該植物酶的連續(xù)氨基酸殘基。特別地，該異源谷氨酸脫羧酶是茄屬(Solanum)植物的脫羧酶，特別是馬鈴薯 (Solanum tuberosum)，即土豆。例如，該異源谷氨酸脫羧酶來(lái)自馬鈴薯，包含SEQ ID NO: 2的Thr94至Leu336的氨基酸序列，或者與其具有80%至小于100%同一性的序列，例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性。另外，該異源谷氨酸脫羧酶可以在N端和/或C-端添加來(lái)自馬鈴薯谷氨酸脫羧酶 的對(duì)應(yīng)末端氨基酸序列，或者在N端和/或C端添加不同于馬鈴薯的第二植物的谷氨酸脫 羧酶的對(duì)應(yīng)末端氨基酸序列。例如，該第二植物是番茄，即西紅柿。在一個(gè)特別實(shí)施方案中，該異源谷氨酸脫羧酶包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列， 或者與其具有80%至小于100%同一性的序列，例如85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該異源谷氨酸脫羧酶是細(xì)菌谷氨酸脫羧酶，例如 來(lái)自埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌，特別是大腸桿菌(E. coli)。該大腸桿菌谷氨酸脫羧酶可選自SEQ ID NO 6的GadA，包含SEQ IDNO 8的GadB 以及SEQ ID NO :9的GadC的GadBC復(fù)合物，以及分別與GadA或GadBC具有80%至小于 100%同一性的序列。合適序列可具有，例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有谷氨酸脫羧酶活性的酶由核酸序列編碼，其經(jīng)調(diào)整適 于具有產(chǎn)生谷氨酸能力的該親本微生物的密碼子使用。特別地，具有谷氨酸脫羧酶活性的酶可由包含選自下列的編碼序列的核酸序列所 編碼a)根據(jù) SEQ ID NO 1 的 472 至 1200 位或者根據(jù) SEQ ID NO 1 的 193 至 1605 位；b)SEQ ID NO 5 ；c)SEQ ID NO 7 ；d)或者編碼如上定義的谷氨酸脫羧酶的任何編碼序列。本發(fā)明還涉及如上定義的谷氨酸脫羧酶；以及包含此類谷氨酸脫羧酶編碼序列的 核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表達(dá)盒，其包含至少一種如上定義的核酸序 列，其序列與至少一個(gè)調(diào)控核酸序列有效連接；以及包含至少一個(gè)此類表達(dá)盒的重組載體。本發(fā)明還涉及原核或真核宿主，其由至少一個(gè)如上定義載體轉(zhuǎn)化；特別地涉及選 自重組棒桿菌的宿主，特別是重組棒桿菌屬，例如重組谷氨酸棒桿菌。最后，本發(fā)明涉及制備聚合物，特別是聚酰胺的方法，該方法包括a)由如上該方法制備GABA ；b)分離 GABAjPc)聚合該GABA，任選地在至少一種其他的合適多價(jià)可共聚共聚用單體存在下進(jìn) 行，該共聚用單體例如選自氨基羧酸和羥基羧酸。2.特定術(shù)語(yǔ)的說(shuō)明
除非另有說(shuō)明，認(rèn)為表述“ Y-氨基丁酸”和“GABA”是同義的。本發(fā)明得到的GABA 產(chǎn)物可以是游離酸的形式，該酸性與堿性官能團(tuán)的部分或完全鹽的形式，或者非帶電酸和 其任何鹽混合物的形式或者混合物。GABA “鹽”包括例如金屬鹽，例如GABA的單-或二-堿金屬鹽，如單鈉或二鈉、單 鉀和二鉀鹽，以及堿土金屬鹽，例如鈣鹽或鎂鹽或者質(zhì)子化形式的GABA?！笆д{(diào)”理解為其廣義形式，包括通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的不同方式使得酶(目 標(biāo)酶)活性完全關(guān)閉的增加或減少。合適方法包括例如生物體中基因和/或酶分子拷貝 數(shù)的增加或減少，或者影響其酶活性的酶另一個(gè)特征的修飾，隨后其導(dǎo)致對(duì)所研究代謝途 徑的預(yù)期效應(yīng)，特別是谷氨酸生物合成途徑或者與其偶聯(lián)的任何途徑或酶促反應(yīng)。合適的 基因操作還可包括但不限于改變或修飾與特定基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控序列或位點(diǎn)(例如通 過(guò)除去強(qiáng)啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子)、修飾特定基因的染色體定位(location)、 改變鄰近于特定基因(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子)的核酸序列、減少特定基因的 拷貝數(shù)、修飾參與特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白質(zhì)(例如調(diào)節(jié)蛋白、阻抑基 因、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等)，或者本領(lǐng)域技術(shù)中常規(guī)的任何其他失調(diào)特定基因表達(dá)的傳統(tǒng) 方法(包括但不限于使用反義核酸分子或敲除或阻斷靶蛋白表達(dá)的其他方法)。術(shù)語(yǔ)“異源”或“外源”指引入或通過(guò)本文定義的遺傳操縱微生物產(chǎn)生(轉(zhuǎn)錄或翻 譯)的本文該蛋白質(zhì)、核酸和對(duì)應(yīng)序列，該微生物在該操縱之前不含有或不產(chǎn)生該序列。特 別地，該微生物在該操縱之前可不含有或表達(dá)該異源酶活性，或者可含有或表達(dá)具有相當(dāng) 活性或特異性的內(nèi)源酶，其由不同的編碼序列或者由不同氨基酸序列的酶編碼，該內(nèi)源酶 可轉(zhuǎn)化與該外源酶相同的一個(gè)或多個(gè)底物。本發(fā)明的“親本”微生物是具有產(chǎn)生谷氨酸能力的任何微生物。“來(lái)源于親本微生物”的微生物指通過(guò)任何類型的操縱修飾的微生物，該操縱選自 的、生物化學(xué)的或微生物學(xué)的方法，特別是遺傳工程方法。該操縱導(dǎo)致該親本微生物的生物 學(xué)特征發(fā)生至少一種變化。例如，可將異源酶的編碼序列引入該生物體。通過(guò)該變化，可將 至少一種特征加入該親本微生物、將其替換或除去。該變化可以，例如，導(dǎo)致該微生物的改 變的代謝特征，使得，例如，該微生物表達(dá)的酶(其底物完全不被該親本微生物所利用或者 以不同效率利用)以特征性方式代謝(例如，與親本微生物相比時(shí)以不同的量、比例或者不 同的效率)，和/或該修飾微生物以特征性方式(例如，與親本微生物相比時(shí)以不同的量、比 例或者不同的效率)形成代謝終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。“中間產(chǎn)物”應(yīng)理解為在化學(xué)或生物化學(xué)過(guò)程中以不一定可在分析中直接檢出的 濃度暫時(shí)或連續(xù)形成的產(chǎn)物。該“中間產(chǎn)物”可通過(guò)第二化學(xué)或生化反應(yīng)從該生物化學(xué)過(guò) 程中除去，特別地通過(guò)由本文定義的“谷氨酸脫羧酶”催化的反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“谷氨酸脫羧酶”指具有將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镚ABA能力的任何來(lái)源的任何酶。這 些酶歸類于EC. 4. 1. 1. 15?！爸亟M宿主”可以是任何原核或真核細(xì)胞，其含有克隆載體或表達(dá)載體。此術(shù) 語(yǔ)也意為包括已經(jīng)遺傳改造在宿主細(xì)胞的染色體或基因組中含有一個(gè)或多個(gè)克隆基因 的原核或真核細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞，例如可見于Sambrook等人，MOLE⑶LAR CLONING A LABORATORYMANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。
術(shù)語(yǔ)“重組微生物”包括微生物(例如細(xì)菌、酵母、真菌等)或微生物菌株，其已經(jīng) 遺傳改變、修飾或改造(例如遺傳改造)使得相比于天然微生物或其來(lái)源的“親本”微生物 顯示出改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如在遺傳修飾影響微生物的編碼核 酸序列時(shí))。本文使用的“基本上純的”蛋白質(zhì)或酶表示所需純化的蛋白質(zhì)基本上不含雜質(zhì)細(xì) 胞組分，通過(guò)聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)的單條帶證實(shí)。術(shù)語(yǔ)“基本 上純的”還意在描述本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的一種或多種純度或均一性特性是均勻的分子。 例如，基本上純的谷氨酸脫羧酶對(duì)于例如下列的參數(shù)會(huì)顯示在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)偏差之內(nèi)的恒定和 可重現(xiàn)特征分子量、色譜遷移、氨基酸組成、氨基酸序列、封閉或未封閉的N端、HPLC洗脫 特征、生物學(xué)活性以及其他此類參數(shù)。但是，該術(shù)語(yǔ)不意為排除谷氨酸脫羧酶與其他化合物 的人工或合成混合物。另外，該術(shù)語(yǔ)不意為排除任選地從重組宿主分離的谷氨酸脫羧酶融 合蛋白質(zhì)。3.本發(fā)明的其他實(shí)施方案3.1其他基因的失調(diào)如果與如下所列至少一種其他基因的失調(diào)相組合，使用表達(dá)谷氨酸脫羧酶的重組 棒桿菌屬谷氨酸產(chǎn)生者的GABA發(fā)酵產(chǎn)生可進(jìn)一步改進(jìn)。
權(quán)利要求
發(fā)酵產(chǎn)生γ 氨基丁酸(GABA)的方法，所述方法包括培養(yǎng)重組微生物，所述重組微生物來(lái)自于具有產(chǎn)生谷氨酸的能力，并且還具有表達(dá)異源谷氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.15)能力的親本微生物，由此將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是谷氨酸產(chǎn)生細(xì)菌。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述谷氨酸產(chǎn)生細(xì)菌是棒桿菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)菌是棒桿菌屬細(xì)菌。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述異源谷氨酸脫羧酶是原核或真核來(lái)源的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述異源谷氨酸脫羧酶是植物谷氨酸脫羧酶或者包含來(lái)自 植物谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列的部分的嵌合谷氨酸脫羧酶。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述異源谷氨酸脫羧酶是茄屬植物的脫羧酶，特別是馬 鈴薯的脫羧酶。
9.權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)的方法，其中異源谷氨酸脫羧酶來(lái)自馬鈴薯，其包含SEQID NO 2的Thr94至Leu336的氨基酸序列，或者與其具有至少80%同一性的序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中異源谷氨酸脫羧酶在N端和/或C端補(bǔ)充了來(lái)自馬鈴薯的 谷氨酸脫羧酶的對(duì)應(yīng)末端氨基酸序列。
11.權(quán)利要求9的方法，其中異源谷氨酸脫羧酶在N端和/或C端補(bǔ)充了的不同于馬鈴 薯的第二植物的谷氨酸脫羧酶的對(duì)應(yīng)末端氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述第二植物是番茄。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述谷氨酸脫羧酶包含SEQID NO :2的氨基酸序列或者 與其具有至少80%同一性的序列。
14.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述異源谷氨酸脫羧酶是細(xì)菌谷氨酸脫羧酶。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)菌谷氨酸脫羧酶來(lái)自埃希氏菌屬的細(xì)菌，特別是 來(lái)自大腸桿菌。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述大腸桿菌谷氨酸脫羧酶選自SEQIDNO 6的Gad A、 包含SEQ ID NO :8的Gad B序列和SEQ ID NO :9的GadC序列的Gad BC復(fù)合物，以及與Gad A或Gad BC具有至少80%同一性的序列。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中具有谷氨酸脫羧酶活性的酶由下述核酸序列 編碼，所述核酸序列適應(yīng)于具有產(chǎn)生谷氨酸能力的所述親本微生物的密碼子使用。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中具有谷氨酸脫羧酶活性的酶由包含選自下列 的編碼序列的核酸序列編碼a)根據(jù)SEQID NO 1的472至1200位，或者根據(jù)SEQ ID NO 1的193至1605位；b)SEQID NO 5 ；c)SEQID NO 7 ；d)或者編碼權(quán)利要求6至17中任一項(xiàng)所定義的谷氨酸脫羧酶的任何編碼序列。
19.權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)定義的谷氨酸脫羧酶。
20.核酸序列，其包含權(quán)利要求19的谷氨酸脫羧酶的編碼序列。
21.表達(dá)盒，其包含至少一個(gè)權(quán)利要求20的核酸序列，所述序列有效連接至少一個(gè)調(diào)控核酸序列。
22.重組載體，其包含至少一個(gè)權(quán)利要求21的表達(dá)盒。
23.原核或真核宿主，其轉(zhuǎn)化了至少一個(gè)權(quán)利要求22的載體。
24.權(quán)利要求23的宿主，其選自重組棒桿菌，特別是重組棒桿菌屬細(xì)菌。
25.權(quán)利要求24的宿主，其為重組谷氨酸棒桿菌。
26.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法，其中由此產(chǎn)生的GABA分離自發(fā)酵液。
27.制備聚酰胺的方法，所述方法包括a)通過(guò)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法制備GABA；b)分離GABA；禾口c)聚合所述GABA，任選在至少一種另外的合適多價(jià)共聚用單體存在下進(jìn)行，所述共聚 用單體選自氨基羧酸和羥基羧酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)表達(dá)具有谷氨酸脫羧酶活性的酶的重組微生物發(fā)酵產(chǎn)生γ-氨基丁酸(GABA)的新方法。本發(fā)明還涉及相應(yīng)的重組宿主、重組載體、表達(dá)盒和適于制備這些宿主的核酸以及利用發(fā)酵產(chǎn)生獲得的GABA用于制備聚酰胺的方法。
文檔編號(hào)C12N15/60GK101945997SQ200980105702
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日
發(fā)明者A·赫羅爾德, C·克洛普羅格, H·施羅德, O·策爾德爾, W·K·鄭 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司