專利名稱：調(diào)節(jié)種子內(nèi)油脂含量的突變基因、種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)種子內(nèi)油脂含量的突變基因，該突變基因是以種子內(nèi)所存在的油 體的變化為指標(biāo)而被鑒定的，本發(fā)明還涉及通過使特定基因突變來調(diào)節(jié)種子內(nèi)油脂含量的 方法。
背景技術(shù)：
油體(Oil body，也有時稱為類脂體(lipid body))是一種在植物、尤其是在糧油 作物的種子細(xì)胞中大量存在的細(xì)胞器。油體是由一層含有被稱為油質(zhì)蛋白(oleosin)、油 體固醇蛋白(steroleosin)、油體鈣蛋白(caleosin)等特異性蛋白質(zhì)的磷脂膜形成的，其 內(nèi)部的植物油脂以三酰甘油(TAG、中性脂肪、中性脂質(zhì))的形式存在，油體尤其在植物種子 中大量蓄積。一直以來，作為油體中所蓄積的油脂的分析方法，一般是破壞種子提取油脂成 分，再利用氣相色譜或液相色譜等進行分析的方法。在這些分析方法過程中，需要加入脂質(zhì) 分解抑制劑，和/或處理溫度需要低溫條件，而且，在處理過程中油脂成分可能會分解。另一方面，非專利文獻1中公開了油體的大小受油質(zhì)蛋白的存在量影響。另外， 非專利文獻2中公開了通過使油質(zhì)蛋白基因與GFP(綠色熒光蛋白，green fluorescent protein)基因融合，可以利用來自GFP的熒光來觀察油體。但是，即使能觀察油體，關(guān)于油 體的數(shù)目和/或形狀、以及油體中蓄積的油脂量和/或與油脂種類的關(guān)系仍然不明。非專利文獻1 :Siloto，R. M. P.等，Plant Cell 18,1961-1974, (2006)非專利文獻2 :Wahlroos 等，GENESIS，35(2) :125_132，(2003)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于，確立能夠測定植物細(xì)胞中的油體的數(shù)量和大小等各種 性狀的體系，利用該體系闡明油體性狀與油脂含量的相關(guān)關(guān)系，提供具有調(diào)節(jié)種子內(nèi)油脂 含量的功能的突變基因以及種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進行了深入研究，表達了油質(zhì)蛋白-GFP融合蛋白 質(zhì)，發(fā)現(xiàn)GFP熒光強度總和與油脂含量之間存在正相關(guān)?；谠撘娊?，發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)具有影 響種子中油脂含量的功能的基因以及該基因中氨基酸置換突變會影響種子中油脂含量的 事實，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明的突變基因包括以下(1) (7)。(1)突變基因，編碼突變蛋白質(zhì)，所述突變蛋白質(zhì)具有在序列號1所示氨基酸序列 中N末端第12位氨基酸殘基被其他氨基酸取代而得的共有序列，且所述突變蛋白質(zhì)具有調(diào) 節(jié)植物種子內(nèi)油脂含量的功能。(2)根據(jù)(1)所述的突變基因，其特征在于，上述其他氨基酸是選自異亮氨酸、纈 氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一種氨基酸。(3)根據(jù)(1)所述的突變基因，其特征在于，上述其他氨基酸是異亮氨酸。
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(4)根據(jù)(1)所述的突變基因，其特征在于，上述突變蛋白質(zhì)是在序列號4 17的 氨基酸序列中的任一個所示氨基酸序列中所包含的上述共有序列中，N末端第12位氨基酸 殘基被其他氨基酸取代而得的蛋白質(zhì)。(5)根據(jù)(1)所述的突變基因，其特征在于，是使來自植物的基因發(fā)生突變而得 的。(6)根據(jù)(1)所述的突變基因，其特征在于，是使來自屬于選自禾本科、十字花科 和楊柳科中的一科的植物的基因發(fā)生突變而得的。(7)根據(jù)⑴所述的突變基因，其特征在于，是使來自屬于選自大麥、稻、擬南芥、 蕪青(Brassica rapa)和白楊中的一種的植物的基因發(fā)生突變而得的。此外，本發(fā)明包含由上述突變基因編碼的突變蛋白質(zhì)、導(dǎo)入上述突變基因而形成 的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、導(dǎo)入上述突變基因而形成的轉(zhuǎn)化植物。另一方面，本發(fā)明的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法包括以下⑶ (13)。(8)種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，對編碼具有由序列號1所示氨基酸序列構(gòu)成的 共有序列的蛋白質(zhì)的基因引入變異，所述變異是將序列號1所示氨基酸序列的N末端第12 位氨基酸殘基置換成其他氨基酸。(9)根據(jù)⑶所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，上述其他氨基酸是 選自異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一種氨基酸。(10)根據(jù)(8)所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，上述其他氨基酸
是異亮氨酸。(11)根據(jù)(8)所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，使變異蛋白質(zhì)表 達，所述變異蛋白質(zhì)是在序列號4 17的氨基酸序列中的任一個所示氨基酸序列中所包含 的上述共有序列中，N末端的第12位氨基酸殘基被其他氨基酸取代而得的蛋白質(zhì)。(12)根據(jù)(8)所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，使來自屬于選自 禾本科、十字花科和楊柳科中的一科的植物的基因發(fā)生突變。(13)根據(jù)(8)所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，使來自屬于選自 大麥、稻、擬南芥、蕪青和白楊中的一種的植物的基因發(fā)生突變。本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請2008-048612號的說明 書及/或附圖中所記載的內(nèi)容。


圖1是顯示氨基酸殘基的置換突變的得分矩陣(BLOSUM)的示意圖。圖2-1是顯示對14種氨基酸序列進行比對分析的結(jié)果的比對圖。圖2-2是顯示對14種氨基酸序列進行比對分析的結(jié)果的比對圖。圖2-3是顯示對14種氨基酸序列進行比對分析的結(jié)果的比對圖。圖2-4是顯示對14種氨基酸序列進行比對分析的結(jié)果的比對圖。圖3是顯示由圖2所示比對圖獲得的分子進化系統(tǒng)樹的圖。圖4中，A是顯示油質(zhì)蛋白-GFP融合基因的構(gòu)成示意圖，B D分別是OleG、突變 體A和突變體B在暗處發(fā)芽第6天時子葉的熒光照片。圖5是顯示GFP熒光總和％與種子的脂質(zhì)含量的關(guān)系的特性圖。
圖6是顯示OleG、突變體A和突變體B中的種子貯藏脂質(zhì)的脂肪酸組成分析的結(jié) 果的特性圖。圖7是顯示使用從野生型擬南芥、OleG、突變體A和突變體B的種子中提取出的蛋 白質(zhì)樣品的SDS-PAGE結(jié)果，使用抗油質(zhì)蛋白抗體的免疫印跡分析結(jié)果，以及使用抗GFP抗 體(C)的免疫印跡分析的照片。圖8是顯示用電子顯微鏡觀察OleG、突變體A和突變體B的種子細(xì)胞的結(jié)果的照 片。圖9中，A是顯示用于鑒定突變體A中原因基因的高精度圖譜的結(jié)果的特性圖，B 是顯示存在于所定位的位置的基因Atlg54570的結(jié)構(gòu)的示意圖。
具體實施例方式以下，參照附圖對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。本發(fā)明中，通過油體特異性蛋白質(zhì)與熒光蛋白質(zhì)而使油體可視化，具體地說，使用 油質(zhì)蛋白-GFP融合基因轉(zhuǎn)化作為模型植物的擬南芥，通過熒光使從轉(zhuǎn)化擬南芥中采摘的 子葉中所含的油體可視化。誘發(fā)該轉(zhuǎn)化擬南芥進行突變，在觀察油體的形狀和數(shù)量等各種 性狀變化的同時，測定油脂含量和/或油脂組成的變化。令人驚訝的是，明確了在油體的各 種性狀中，子葉中熒光總和(換言之，即每單位面積的熒光強度)與種子中所含的油脂含量 之間存在正相關(guān)?；谝陨弦娊猓囟酥参镏械挠椭?、油脂量和/或油脂中的脂肪酸 組成發(fā)生了變化的突變體的原因基因以及作為原因的突變。S卩，本發(fā)明的突變基因編碼具有調(diào)節(jié)植物中油脂含量和/或油脂量的功能的蛋白 質(zhì)，在該蛋白質(zhì)中，被稱為二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的進化上保守的氨基酸序列中的規(guī) 定氨基酸被置換成了其他氨基酸。本發(fā)明的突變基因編碼具有被稱為二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶 結(jié)構(gòu)域的進化上保守的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，且所述氨基酸序列包含規(guī)定氨基酸被置換成 了其他氨基酸的氨基酸序列。在以下說明中，將構(gòu)成被稱為二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的 進化上保守的區(qū)域的氨基酸序列稱為共有序列。序列號1顯示共有序列。具體地說，序列號1所示共有序列可改寫成以下的氨基酸序列(用氨基酸單字母 縮寫表示)(D/E) xxxxxGxxxx (T/S) xxxx (Y/F) (R/K/N/Q) L (F/L) xxxx (F/H) VxL (Y/F) PGGxRE(A/S)LHx(K/R)(G/D)Ex(Y/H)(K/R/Q)L(F/I)WP(D/E)(Q/H/R)xEFVRxA(A/S)(R/K/Q) F(G/N)(A/V/T)(T/K)(I/V)(I/V)PFGxVGEDD(V/F/I/L/M)χ(E/D/H)(L/V/M/I)x上述氨基酸序列中，括號內(nèi)的多個氨基酸表示該位置上可取的氨基酸殘基的變 異。此外，下述氨基酸序列中，X代表該位置上可以取任意的氨基酸殘基。規(guī)定位置上可取 的氨基酸殘基的變異基于以下理由。即，上述共有序列如后面所述，可以通過對來自植物種 的多個同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行多重比對分析來規(guī)定。其中如參考文獻(1)(《7 , ^ 一生化學(xué)》第3版第5章7 S 7酸·《f K ·夕> /、1質(zhì)5. 1 7 S 7酸、主編市川厚、 主譯福R伸一、出版人曾根良介、出版社(株)化學(xué)同人、ISBN4-7598-0944-9)所記載 的那樣，氨基酸可以按照具有同樣性質(zhì)(化學(xué)性質(zhì)和/或物理大小)側(cè)鏈來分類已經(jīng)為人 們所熟知。此外，在保持蛋白質(zhì)活性的條件下分類于規(guī)定組的氨基酸殘基之間的分子進化 上的置換高頻率地發(fā)生也已經(jīng)為人們所熟知。以該想法為基礎(chǔ)，在參考文獻(2) =HenikofTS. , Henikoff J. G. , Amino—acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10915-10919 (1992)中的圖2中，提出氨基酸殘基的置換突變的得 分矩陣(BLOSUM)，該得分矩陣已被廣泛應(yīng)用(見本說明書的圖1)。在參考文獻(2)中，具 有側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸彼此的置換，是基于給蛋白質(zhì)整體帶來的結(jié)構(gòu)和/或功能 變化少這樣的見解而進行的。根據(jù)上述參考文獻(1)以及(2)，在多重比對中考慮的氨基酸 的側(cè)鏈的組，可以基于化學(xué)性質(zhì)和/或物理大小等指標(biāo)來思考。這可以顯示為圖1所示的 具有得分為0以上的值的氨基酸的組，優(yōu)選為具有得分為1以上的值的氨基酸的組。作為 代表性的組，可列舉下述8個組。至于其他細(xì)致的分組，只要是如圖1中彼此值為0以上的 氨基酸組即可，優(yōu)選彼此值為1以上的氨基酸組，更優(yōu)選彼此值為2以上的氨基酸組。1)脂肪族疏水性氨基酸組(ILMV組)該組是上述參考文獻(1)所示的中性非極性氨基酸中具有脂肪屬性的疏水性側(cè) 鏈的氨基酸的組，包括V(Val、纈氨酸)、L(Leu、亮氨酸)、I (He、異亮氨酸)和M(Met、蛋氨 酸)。參考文獻(1)中被分類為中性非極性氨基酸的氨基酸中，F(xiàn)GACffP由于以下原因而不 包含在該“脂肪族疏水性氨基酸組”中。G(Gly、甘氨酸)、A(Ala、丙氨酸)是因為由于大小 為甲基以下而非極性效應(yīng)弱的原因。C(Cys、半胱氨酸)是因為有時S-S鍵發(fā)揮重要作用、 且有時具有與氧原子和/或氮原子形成氫鍵的特性的原因。F(Phe、苯丙氨酸)和W(Trp、色 氨酸)是因為側(cè)鏈具有特別大的分子量，且芳香族效應(yīng)強的緣故。而P (Pro、脯氨酸)是因 為亞氨基酸效應(yīng)強、會固定多肽主鏈的角度的緣故。2)具有羥基亞甲基的氨基酸組(ST組)該組是中性極性氨基酸中的側(cè)鏈具有羥基亞甲基的氨基酸的組，包括S(Ser、絲氨 酸)和T(Thr、蘇氨酸)。存在于S和T側(cè)鏈的羥基是糖的結(jié)合部位，因此很多情況下是使 某些多肽(蛋白質(zhì))具有特定活性的重要部位。3)酸性氨基酸(DE組)該組是側(cè)鏈具有酸性羧基的氨基酸的組，包括D (Asp、天冬氨酸)和E(Glu、谷氨 酸)。4)堿性氨基酸(KR組)該組是堿性氨基酸的組，包括K(Lys、賴氨酸)和R(Arg、精氨酸)。該K和R具有 在較寬的PH范圍內(nèi)帶正電且顯堿性的性質(zhì)。另一方面，被分類為堿性氨基酸的H(His、組氨 酸)在PH7時幾乎不離子化，因此不將其分類至該類組。5)亞甲基=極性基團(DHN組)該組全部具有α位碳原子上作為側(cè)鏈結(jié)合了亞甲基、且該亞甲基前端具有極性 基團這樣的特征。包括具有與作為非極性基團的亞甲基的物理大小極其相近的特征的 N(Asn、天冬酰胺、極性基團為酰胺基)、D(Asp、天冬氨酸、極性基團為羧基)和H(His、組氨 酸、極性基團為咪唑基)。6) 二亞甲基=極性基團(EKQR組)該組全部具有α位碳原子上作為側(cè)鏈結(jié)合了二亞甲基以上的直鏈烴、且該直鏈 烴前端具有極性基團這樣的特征。包括具有與作為非極性基團的二亞甲基的物理大小極其 相近的特征的E(Glu、谷氨酸、極性基團為羧基)、K(Lys、賴氨酸、極性基團為氨基)、Q(Gln、 谷氨酰胺、極性基團為酰胺基)和R(Arg、精氨酸、極性基團為亞氨基和氨基)。
7)芳香族(FYW 組)該組是側(cè)鏈具有苯核的芳香族氨基酸的組，以芳香族特有的化學(xué)性質(zhì)為特征。包 括F(Phe、苯丙氨酸)、Y(Tyr、酪氨酸)和W(Trp、色氨酸)。8)環(huán)狀和極性(HY組)該組是側(cè)鏈具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)同時具有極性的氨基酸的組，包括H(His、組氨酸、環(huán)狀 結(jié)構(gòu)和極性基團均為咪唑基)、Y (Tyr、酪氨酸、環(huán)狀結(jié)構(gòu)為苯核，極性基團為羥基)。本發(fā)明的突變基因編碼上述共有序列中的N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸(T) 或絲氨酸(S))被置換成了其他氨基酸、并具有調(diào)節(jié)植物中油脂量的功能的蛋白質(zhì)。這里， 上述共有序列中的N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸(T)或絲氨酸(S))是被蘇氨酸激 酶或絲氨酸激酶磷酸化的可能性高的氨基酸殘基，且作為對二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性貢獻 較大的氨基酸殘基的概率較高。因此，通過將上述共有序列中的N末端第12位氨基酸殘基 (蘇氨酸(T)或絲氨酸(S))置換成其他氨基酸，可以使本發(fā)明的突變基因所編碼的蛋白質(zhì) 的活性變化。所謂該基因編碼的蛋白質(zhì)活性變化，是指提高酶活性、抑制酶活性、改變底物 特異性以及改變與底物和/或輔酶等其他因子的親和性。此處作為置換后的其他氨基酸，可列舉異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和蛋氨酸，特別 優(yōu)選為異亮氨酸。在將上述共有序列中N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸(T)或絲氨酸 (S))置換為異亮氨酸的情況下，會呈現(xiàn)每一粒種子所含油脂量比野生型增加、但每一粒種 子的油脂含量％比野生型減少這樣的特征表型。此外，上述共有序列可以是在序列號1所示氨基酸序列的C末端添加了由10個 氨基酸殘基構(gòu)成的序列(XXX(N/H/E/D) (D/E)xx(N/K)xP)而形成的序列(示于序列號2)。 即，本發(fā)明的突變基因包括編碼在序列號1所示的氨基酸序列的C末端側(cè)添加了規(guī)定序列 (xxx(N/H/E/D) (D/E)xx(N/K)xP)而得的共有序列中N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸(T) 或絲氨酸(S))被置換成其他氨基酸、且具有調(diào)節(jié)植物內(nèi)油脂量的功能的蛋白質(zhì)的基因。作為編碼具有上述共有序列的蛋白質(zhì)的基因，可以從廣泛種類植物種中鑒定、分 離，而不限制特定的植物種。具體來說，編碼具有上述共有序列蛋白質(zhì)的基因，可以從屬 于十字花科的擬南芥(Arabidopsis thaliana)、屬于禾本科的大麥(Hordeum vulgare)、 屬于禾本科的稻(Oryza sativa)、屬于十字花科的蕪青以及屬于楊柳科的白楊(Populus trichocarpa、也有時稱為美國黑楊或三葉楊)中鑒定、分離。此處，蕪青包括分類于同種 中的亞種，例如油菜籽、油菜、油菜花、大白菜、青菜(★4 )、蕪青、野澤菜、日本蕪 青、小松菜和小白菜(m f 3 4 )。作為擬南芥中編碼具有上述共有序列的蛋白質(zhì)的基因，可列舉GenBank登錄號 BT005958.所特定的 Atlg54570 基因、GenBank 登錄號 NM_123478. 3 所特定的 At5g41130 基因、GenBank登錄號AY09638. 1所特定的At5g41120基因和GenBank登錄號AF360145. 1 所特定的At3g26840基因。此外，作為大麥中編碼具有上述共有序列的蛋白質(zhì)的基因，可 列舉GenBank登錄號AK251457. 1所特定的FLbaf 127k09基因。作為稻中編碼具有上述共 有序列的蛋白質(zhì)的基因，可列舉GenBank登錄號NM_001049558. 1所特定的0s01g0361500 基因、GenBank登錄號NM_001049562. 1所特定的0s01g0362100基因、GenBank登錄號 NM_001049559. 1 所特定的 0s01g0361700 基因和 GenBank 登錄號 NM_001070165. 1 所特定 的0s09g0509500基因。蕪青(例如油菜籽、油菜、油菜花、大白菜、青菜(f >少‘ > 寸4 )、蕪青、野澤菜、日本蕪青、小松菜和小白菜(〃々★ 3 4 ))中編碼具有上述共有序列的蛋白 質(zhì)的基因，可列舉GenBank登錄號AC189616. 1所特定的KBrH099I08基因。作為白楊中編 碼具有上述共有序列的蛋白質(zhì)的基因，可列舉以GenBank登錄號AC213081. 1注冊的克隆名 P0P002-D20的全堿基序列中，存在于第41811位堿基 第50309位堿基區(qū)域的基因、存在于 第62687位堿基 第71216位堿基區(qū)域的基因、存在于第89072位堿基 第97258位堿基 區(qū)域的基因和存在于第75984位堿基 第83278位堿基區(qū)域的基因。上述Atlg54570基因的堿基序列和由Atlg54570基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序 列分別示于序列號3和4。由上述At5g41130基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號 5。由上述At5g41120基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號6。由上述At3g26840 基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號7。由上述FLbafl27k09基因所編碼的蛋白 質(zhì)的氨基酸序列示于序列號8。由上述0s01g0361500基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示 于序列號9。由上述0s01g0362100基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號10。由上 述0s01g0361700基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號11。由上述0s09g0509500 基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號12。由上述KBrH099I08基因所編碼的蛋白 質(zhì)的氨基酸序列示于序列號13。以AC213081. 1注冊的克隆名P0P002-D20的全堿基序列中 存在于第41811位堿基 第50309位堿基區(qū)域的基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序 列號14?？寺∶鸓0P002-D20的全堿基序列中存在于第62687位堿基 第71216位堿基區(qū) 域的基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號15?？寺∶鸓0P002-D20的全堿基序列 中存在于第89072位堿基 第97258位堿基區(qū)域的基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于 序列號16?？寺∶鸓0P002-D20的全堿基序列中存在于第75984位堿基 第83278位堿基 區(qū)域的基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號17。對于序列號4 17所示氨基酸序列，使用CLUSTAL ff(l. 83)multiple sequence alignment程序(可以通過國立遺傳學(xué)研究所的DDBJ使用(http//clustalw. ddbj. nig. ac. jp/top-j.html))進行比對分析，結(jié)果示于圖2 (所使用的氨基酸序列置換行列表采用 默認(rèn)值的BLOSUM矩陣)。如圖2所示，判定這14種蛋白質(zhì)具有上述共有序列(下劃線部 分)。此外，本發(fā)明的突變基因是將圖2所示多重比對中箭頭所示位置的蘇氨酸(T)或絲氨 酸(S)置換成其他氨基酸而得的。另外，圖3顯示由圖2所示14種氨基酸序列的比對結(jié)果 獲得的分子進化系統(tǒng)樹。作為將圖2所示14種蛋白質(zhì)中箭頭所示位置的蘇氨酸(T)或絲氨酸(S)置換成 其他氨基酸的方法，可以適當(dāng)使用歷來公知的基因工程學(xué)方法?？傊?，特定編碼突變引入對 象蛋白質(zhì)的野生型基因的堿基序列，使用定點突變導(dǎo)入試劑盒等引入突變，使其編碼上述 置換后的蛋白質(zhì)。此外，對于已引入突變的基因，可按照常規(guī)方法回收，例如以重組到表達 載體中的狀態(tài)回收。此外，可以采用Kunkel法或缺口雙鏈體(Gapped duplex)法等公知方 法或依據(jù)這些方法的方法在基因中引入突變，例如，使用利用了定點突變誘發(fā)法的突變導(dǎo) 入試劑盒(例如Mutant-K (TAKARA Bio社制)、Mutan-G (TAKARA Bio社制)等)，或者使用 TAKARA Bio社的LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒來引入突變。另外，本發(fā)明的突變基因并不限于編碼含有序列號4 17所示的氨基酸序列中上 述共有序列中N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸(T)或絲氨酸(S))被置換成其他氨基 酸而得的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的突變基因還可以產(chǎn)生下述突變在序列號4 17所示的氨基酸序列中序列號1所示共有序列中N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸 (T)或絲氨酸(S))被置換成其他氨基酸而得的氨基酸序列中，多個、優(yōu)選為1個或幾個氨基 酸發(fā)生缺失、置換、添加等突變。例如，在序列號4 17所示氨基酸序列中，可以缺失、添加 或置換1 10個、1 8個，優(yōu)選1 5個氨基酸。此外，本發(fā)明的突變基因是編碼與序列號4 17所示氨基酸序列具有70%以上的 同源性的蛋白質(zhì)的基因，可以是編碼具有上述共有序列中N末端側(cè)第12位氨基酸殘基(蘇 氨酸(T)或絲氨酸(S))被置換成其他氨基酸而得的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。上述同 源性優(yōu)選為80%以上，更優(yōu)選為85%以上，進一步優(yōu)選為90%以上，最優(yōu)選為95%以上。上述氨基酸的缺失、添加和置換可以通過采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法改變編碼上 述蛋白質(zhì)的基因來進行?？梢圆捎肒unkel法或缺口雙鏈體(Gapped duplex)法等公知方 法或依據(jù)這些方法的方法在基因中引入突變，例如，使用利用了定點突變誘發(fā)法的突變導(dǎo) 入試劑盒(例如Mutant-K (TAKARA Bio社制)、Mutan-G (TAKARA Bio社制)等)，或者使用 TAKARA Bio社的LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒來引入突變。作為本發(fā)明的 在突變基因中引入突變的方法，可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5_溴尿嘧啶、2-氨基嘌 呤、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍以及其他致癌性化合物為代表的化學(xué)誘變劑的 方法，也可以是利用以X射線、α射線、β射線、Υ射線、離子束為代表的放射處理和/或 紫外線處理的方法。而且，本發(fā)明的突變基因包含編碼與含有由序列號3所示堿基序列構(gòu)成的DNA的 互補堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有調(diào)節(jié)種子內(nèi)油脂含量的功能的突變蛋 白質(zhì)的DNA。此處所謂嚴(yán)格條件，是指能形成特異性雜種、而不能形成非特異性雜種的條件。 例如，可列舉在45°C、6XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)的條件下進行雜交、然后在50 65°C、 0. 2 1 X SSC、0. 1 % SDS的條件下洗滌，或者作為這樣的條件，可列舉在65 70°C、1 X SSC 的條件下進行雜交、然后在65 70°C、0. 3XSSC的條件下洗滌。另外，如果確定了本發(fā)明的突變基因的堿基序列，然后就可以通過化學(xué)合成，或通 過以克隆cDNA為模板進行PCR，或通過以含有該堿基序列的DNA片段為探針進行雜交，從而 從各種植物中獲得該基因。以上所說明的本發(fā)明的突變基因，通過將植物基因中野生型基因進行如下改變從 而在所需的植物內(nèi)進行功能性表達將上述共有序列中N末端第12位氨基酸殘基(蘇氨酸 (T)或絲氨酸(S))置換成其他氨基酸。即，具有本發(fā)明的突變基因的植物可以通過如上所 述的定點突變誘發(fā)法來制成，也可以通過事先準(zhǔn)備好的突變基因與基因組中的野生型基因 之間的同源重組來制成?；蛘?，具有本發(fā)明的突變基因的植物也可以通過在使植物基因組 內(nèi)的野生型基因缺失的同時將該突變基因?qū)胧蛊淠鼙磉_來制成。另外，具有本發(fā)明的突 變基因的植物也可以通過在不使植物基因組內(nèi)的野生型基因缺失的條件下將該突變基因 導(dǎo)入使其過量表達來制成。另外，作為將本發(fā)明的突變基因?qū)胫参飪?nèi)的方法，可以適當(dāng)采用歷來公知的方 法。例如，作為用于將本發(fā)明的突變基因?qū)胫参锛?xì)胞使其表達的載體，優(yōu)選使用PBI系 載體、pUC系載體、pTRA系載體。pBI系載體和pTRA系載體可以介由農(nóng)桿菌將目標(biāo)基因?qū)?入植物中。優(yōu)選使用PBI系的雙元載體或使用中間載體系，可列舉例如，ρΒΙ121、ρΒΙΙΟΙ、 ρΒΙΙΟΙ. 2、ρΒΙΙΟΙ. 3等。而pUC系載體可以將基因直接導(dǎo)入植物中，可列舉例如，pUC18、pUC19、pUC9等。此外還可以使用花椰菜花葉病毒(CaMV)、菜豆金色花葉病毒(BGMV)、煙草 花葉病毒(TMV)等植物病毒載體。此外，本發(fā)明的突變基因也可以不與具有載體功能的DNA —起導(dǎo)入，而采用基因 槍法直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。本發(fā)明的突變基因優(yōu)選包含在能發(fā)揮該基因功能那樣地構(gòu)建的DNA中。因此，基 因?qū)胗玫腄NA上除了啟動子之外，還可以根據(jù)需要連接增強子、剪接信號、加poly-A信 號、選擇標(biāo)記、5’ -UTR序列等。此外，作為選擇標(biāo)記，可列舉例如，二氫葉酸還原酶基因、氨 芐青霉素抗藥性基因、新霉素抗藥性基因、潮霉素抗藥性基因和雙丙氨磷抗藥性基因等。作為“啟動子”，只要是能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能、在植物特定組織內(nèi)或特定發(fā) 育階段誘導(dǎo)表達的DNA即可，也可以不是植物來源的DNA。作為具體例，可列舉例如，花椰菜 花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、胭脂堿合成酶基因的啟動子(Pnos)、來自玉米或稻的遍在蛋 白啟動子、來自玉米或稻的肌動蛋白質(zhì)啟動子、來自煙草的I3R蛋白質(zhì)啟動子等?！敖K止子”只要是能終止被上述啟動子轉(zhuǎn)錄的基因的轉(zhuǎn)錄的序列即可。作為具體 例，可列舉胭脂堿合成酶基因的終止子(Tnos)、花椰菜花葉病毒poly-A終止子等?！霸鰪娮印庇糜谔岣吣康幕虻谋磉_效率，例如，優(yōu)選含有CaMV 35S啟動子的上游 側(cè)的序列的增強子區(qū)域。此外，可以使用含有本發(fā)明的突變基因的表達載體，按照常規(guī)方法制備轉(zhuǎn)化植物。 轉(zhuǎn)化植物可以通過將上述表達載體導(dǎo)入宿主中使得導(dǎo)入的突變基因能夠表達來獲得。另 外，只要是包含在使本發(fā)明的突變基因的功能能夠發(fā)揮那樣地構(gòu)建的DNA片段中即可，也 可以在缺乏具有載體功能的DNA的狀態(tài)下通過基因槍法來制備出轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化植物(轉(zhuǎn) 基因植物)可以如下獲得。轉(zhuǎn)化的對象是植物組織(包括例如，表皮、韌皮部、薄壁組織、木 質(zhì)部、維管束等、以及植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等))或植物細(xì)胞。另一方面，作為具有本發(fā)明的突變基因的植物，可列舉雙子葉植物、單子葉植物， 例如，屬于十字花科、禾本科、茄科、豆科、楊柳科等的植物(參考下述)，但并不限于這些植 物。
lt^f (Arabidopsis thaliana)>^^| (Brassica rapa、Brassica napus) λ^- ι^ (Brassica oleracea var. cap it at a)、 胃 ff (Brassica r&p&、Brassica napus) λ ^ (Brassica r&p&、Brassica napus)、力白胃(Brassica rapa var. pekinensis)、冑胃(Brassica rapa var. chinensis)、胃冑(Brassica rapa var. rapa)、
(Brassica rapa var. hakabura) Λ(Brassica rapa var. lancinifolia) Λ
小松菜(Brassica rapa var. peruviridis)、小白菜('、。夕子 3 彳，Brassica rapa var. chinensis)、蘿卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。前禾斗煙草(Nicotiana tabacum)、前子(Solanum melongena)、馬鈴薯(Solaneum tuberosum)、番前(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、矮牽牛 (Petunia)等。豆科大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蠶豆(Vicia faba)、多花紫 藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis· hypogaea)、日本百脈根(Lotus corniculatus var. japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vign a angular is)、金合歡 (Acacia)等。
菊禾斗菊(Chrysanthemum morifolium)、向曰葵(Helianthus annuus)等。禾斗油掠(Elaeis guineensis> Elaeis oleifera)、才耶子(Cocos nucifera) > 海棗(Phoenix dactyl if era)、巴西棕櫚(Copernicia)■ M 禾斗里予■ W (Rhus succedanea)、月要胃(Anacardium occidentale)、■ W (Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、P可月t軍子(Pistacia vera) (Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbitapepo)、 (Cucumis sativus) > ΞΕ/R (Trichosanthes cucumeroides) > (Lagenaria siceraria var. gourda)薔薇科扁桃(Amygdaluscommunis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、櫻 (Prunus)、蘋果(Malus pumila var. domestica)等。石竹科康乃馨(Dianthuscaryophyllus)等。楊柳禾斗白楊(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)禾本禾斗玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥 (Triticum aestivum)、毛竹屬(Phyllostachys)、甘蔴(Saccharum officinarum)等。百合科郁金香屬(Tulipa)、百合屬(Lilium)等。作為具有本發(fā)明的突變基因的表達載體或DNA片段導(dǎo)入植物中的方法，可列舉農(nóng) 桿菌法、PEG-磷酸鈣法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、基因槍法(轟擊法)、微注射法等。例如，在使 用農(nóng)桿菌法時，有使用原生質(zhì)體的情況和使用組織片的情況。在使用原生質(zhì)體的情況下，可 以通過與具有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的方法、與原生質(zhì)球化后的農(nóng)桿菌融合的方法(原生 質(zhì)球法)等來進行；在使用組織片的情況下，可以通過利用葉盤轉(zhuǎn)化來感染對象植物的無 菌培養(yǎng)葉片的方法(葉盤轉(zhuǎn)化法)、感染愈傷組織(未分化的培養(yǎng)細(xì)胞)的方法、直接浸透 到花組織的方法等來進行。此外，在利用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化單子葉植物時，為了提高轉(zhuǎn)化率，可 以加入乙酰丁香酮?？梢酝ㄟ^PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法等來確認(rèn)突變基因是否重組 到了植物內(nèi)。例如，從轉(zhuǎn)化植物中制備DNA，設(shè)計DNA特異性引物進行PCR。PCR之后，對擴增 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等，再用溴乙錠、SYBR Green 液等染色，然后通過擴增產(chǎn)物作為1條帶被檢測出，可以確認(rèn)該植物已被轉(zhuǎn)化。此外，也可 以使用事先已用熒光色素等標(biāo)記的引物進行PCR來檢測擴增產(chǎn)物。另外，還可以采用使擴 增產(chǎn)物結(jié)合在微板等固相上，通過熒光或酶反應(yīng)等來確認(rèn)擴增產(chǎn)物的方法?？梢詫⑥D(zhuǎn)化所得腫瘤組織、芽、毛狀根、種子等直接在細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或器官 培養(yǎng)中使用，還可以使用歷來公知的植物組織培養(yǎng)法，通過施與適當(dāng)濃度的植物激素(生 長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、蕓苔素內(nèi)酯等)而使植物體再生。由培養(yǎng)細(xì)胞再 生植物體一般如下進行在混合有適當(dāng)種類的生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上分化出根， 然后移植至含有大量細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上分化出芽，再移植至不含激素的土壤中。這樣，導(dǎo)入了上述突變基因的轉(zhuǎn)化植物顯示如下特征表型與導(dǎo)入突變基因前的 植物相比，特定組織中所含的油脂總量相比野生型的特定組織中所含的油脂總量增加，但 特定組織中的油脂含量％比野生型的特定組織所含的油脂含量％減少。這時作為特定組 織，可以是葉、子葉、根、根毛、毛狀體、花、種子、果實、花莖、塊根、塊莖和球莖等，優(yōu)選是子 葉、種子、果實，更優(yōu)選是種子。此外，可以通過歷來公知的方法對從植物采摘的種子中所含
11的油脂成分進行定量檢測。作為特定組織中所含油脂成分的測定方法，可列舉使用脈沖NMR 裝置的方法作為一個例子。此外，可以通過利用熒光使從導(dǎo)入了油質(zhì)蛋白-GFP融合基因的轉(zhuǎn)化擬南芥采摘 的子葉中所含的油體可視化，從而鑒定本發(fā)明的突變基因。然而，在本發(fā)明中，作為油體特 異性蛋白質(zhì)，并不僅限于油質(zhì)蛋白，可以廣泛使用在油體中特異性存在的蛋白質(zhì)。作為油體 特異性蛋白質(zhì)，可列舉例如，油質(zhì)蛋白、油體固醇蛋白和/或油體鈣蛋白。此外，在本發(fā)明 中，作為使子葉中的油體可視化的熒光蛋白質(zhì)，只要是具有熒光能力的蛋白質(zhì)即可，例如， 可以使用GFP(綠色熒光蛋白，green fluorescent protein)、YFP(黃色熒光蛋白，yellow fluorescent protein)、RFP (紅色焚光蛋白，red fluorescent protein)、OFP (橙色焚光 蛋白，orange fluorescent protein)禾口 BFP(藍色焚光蛋白，blue fluorescent protein) 等。但是，只要能將子葉中的油體可視化即可，并不限于熒光蛋白質(zhì)，可以廣泛使用能利用 可見光檢測出的蛋白質(zhì)。即，作為能利用可見光檢測出的蛋白質(zhì)，例如，可以使用螢光素酶 等發(fā)光蛋白質(zhì)。以下通過實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于以下實施 例。[實施例1]本實施例中，對作為模型植物被廣泛應(yīng)用的擬南芥進行轉(zhuǎn)化，使其表達油質(zhì)蛋 白-GFP融合基因，制作出能通過熒光觀察而觀察到油體的轉(zhuǎn)化植物。然后，對得到的轉(zhuǎn)化 植物實施突變處理，以油體的性狀變化為指標(biāo)，鑒定出種子內(nèi)油脂量發(fā)生了變化的突變體。 然后特定鑒定出的突變體中的原因基因，并在鑒定具有改變種子內(nèi)油脂量的功能的基因的 同時，鑒定改變植物內(nèi)油脂量的氨基酸置換突變。以下詳細(xì)敘述具體的實驗流程和實驗結(jié)^ ο材料和方法〈植物材料〉使用擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型。將植物按照常規(guī)方法，經(jīng) 種子滅菌，再在無菌瓊脂培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基、0.8%瓊脂)中于22°C光照條件下培養(yǎng)7 天，使其發(fā)芽。然后，移入放有蛭石珍珠巖=1 1的盆中，于22°C、16小時光照、8小時 避光的條件下培育。<制備油質(zhì)蛋白-GFP基因>使用Qiagen社的RNeasy plant mini kit從擬南芥的鞘中分離RNA，再使用 Invitrogen 社的 SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR 進行逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用得到的 cDNA、引物 1 (5’ AAAAAGCAGGCTCAATGGCGGATACAGCTAGAGGA3'序列號 18)和引物 2(5'CTCGCCCTTGCTCACCATAGTAGTGTGCTGGCCACC3’:序列號 19)進行 PCR，擴增出在 油質(zhì)蛋白S3 cDNA的兩端具有attBl序列的一部分和GFP基因的一部分的DNA片段A。同 時，使用編碼維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白GFP的cDNA、 引物 3(5’GGTGGCCAGCACACTACTATGGTGAGCAAGGGCGAG3’ 序列號 20)和引物 4(5’AGAAAGCTGGG TCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3’ 序列號21)進行PCR反應(yīng)，從而擴增出在GFP cDNA的兩端添 加了油質(zhì)蛋白S3cDNA的一部分和attB2序列的一部分的DNA片段B。接著，將DNA片段A 和 DNA 片段 B、引物 5 (5’ GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC Τ3’ 序列號 22)和引物6 (5’ GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG G3'序列號 23)混合，再進行 PCR 反應(yīng)，從而 制成兩端具有attBl和attB2序列的油質(zhì)蛋白-GFP融合基因。油質(zhì)蛋白-GFP融合基因的 堿基序列和該基因產(chǎn)物的氨基酸序列分別示于序列號24和25。按照Invitrogen公司的Gateway system方案，將所得融合基因介由pD0NR221 載體克隆到Ti載體中，該Ti載體在CaMV 35S啟動子的下游具有attRl和attR2序列， 且含有卡那霉素抗藥性標(biāo)記。通過電穿孔法將所得質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacience C58C1 rifR)中，將該產(chǎn)物稱為 Ti-OleG?！崔D(zhuǎn)化擬南芥〉通過農(nóng)桿菌法將油質(zhì)蛋白-GFP融合基因?qū)霐M南芥的基因組中。首先，使 Ti-OleG在YEB培養(yǎng)基(5g/l多聚蛋白胨、5g/l牛肉提取物、lg/1酵母提取物、5g/l蔗糖、 0. 5g/l MgSO4)中在28°C增殖至A600 = 0. 8-1. 0，然后離心分離收集菌體。將所得菌體懸 浮于滲透液(IOmM MgCl2、5%蔗糖、0. 05% Silwet L-77)中使得A600 = 0.8。將處于開花 狀態(tài)的擬南芥的花莖置于該懸浮液中浸潤1分鐘，然后采摘已經(jīng)結(jié)果的種子。將采摘的種 子經(jīng)種子滅菌處理后播種到含25mg/l卡那霉素的無菌瓊脂培養(yǎng)基上，以卡那霉素抗藥性 為指標(biāo)，分離出基因組中插入了油質(zhì)蛋白-GFP融合基因的轉(zhuǎn)化擬南芥。從所得的轉(zhuǎn)化擬南 芥采摘種子，選擇出后代中均質(zhì)地具有卡那霉素抗藥性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體，將其命名為OleG。〈轉(zhuǎn)化體的突變原處理〉將OleG的種子用0. 2%甲磺酸乙酯處理16小時后，播種到放有蛭石珍珠巖= 1 1的盆中。在22°C、16小時光照、8小時避光的條件下培育，采摘后代的種子，將其稱為 M2種子。<GFP熒光觀察〉使用熒光實體顯微鏡(Carl Zeiss SteREO Lumar V12)對突變體進行篩選。將 OleG和M2種子置于垂直放置的無菌瓊脂培養(yǎng)基中，于暗處使其發(fā)芽6天，然后在熒光實體 顯微鏡(Carl Zeiss)下觀察黃化子葉、胚軸和根的各細(xì)胞中的油質(zhì)蛋白-GFP融合蛋白質(zhì) 的GFP熒光。將與OleG的GFP熒光強度和/或分布不同的鑒定為突變體。使用共聚焦激光顯微鏡(Carl Zeiss LSM 510)比較OleG和突變體中的油質(zhì)蛋 白-GFP融合蛋白質(zhì)的GFP熒光。從在暗處發(fā)芽6天的OleG和突變體上分別切取黃化子葉、 胚軸、根，置于載玻片上。在相同條件下拍攝各細(xì)胞中GFP熒光圖像，并使用顯微鏡附帶的 圖像分析軟件進行分析，計算出同一面積內(nèi)熒光強度相對于像素的度數(shù)分布，并計算出熒 光總和a = sum(熒光強度X像素數(shù))。〈種子蛋白質(zhì)的電泳和免疫印跡分析〉將20粒種子在40μ 1的SDS樣品緩沖液中破碎后離心，將上清液作為種子蛋白 質(zhì)的樣品。按照常規(guī)方法，將15 μ 1樣品用于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后的凝膠用 0.2%考馬斯亮藍R250溶液(含25%甲醇、10%乙酸)進行染色。為了進行免疫印跡分析，將5μ 1樣品用SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后使用 半干轉(zhuǎn)印法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。使用轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上的蛋白 質(zhì)的抗蛋白質(zhì)抗體的檢測，是按照GE Healthcare BioScience的方案，使用ECL Western 印跡檢測試劑進行的。檢測時，一次抗體(抗油質(zhì)蛋白抗體或抗GFP抗體)和二次抗體均 使用1/5000稀釋的溶液。使用富士 7 O A制的發(fā)光圖像分析儀LAS-1000 plus來檢測發(fā)光。<種子細(xì)胞的電子顯微鏡觀察>將切成一半的種子用固定液(4%多聚甲醛、戊二醛、10% DMS0、0.05M卡可 基酸緩沖液PH7.4)固定。將固定后的樣品用Epon812樹脂包埋，并使用Leica制切片機 Ultracut UCT制成超薄切片。將超薄切片用4%乙酸雙氧鈾和0. 4%檸檬酸鉛進行電子染 色，然后用電子顯微鏡(日立制作所H-7600)觀察。〈種子的油脂量測定〉一邊進行除靜電處理一邊使用硫酸紙將種子在精密電子天平上稱重，稱取種子重 量為10 12mg。將種子放入脈沖NMR用的試管中，使用Resonance制MARAN-23脈沖NMR 由1H-脈沖NMR的弛豫時間值求出種子中的油脂含量(重量％ )。具體測定步驟可參考脈 沖NMR測定手冊。<種子油脂中所含的脂肪酸組成的分析>稱取重量為lmg-5mg左右的種子樣品后，將其放入1. 5ml微量試管中。在微量試 管中加入1粒3mm 0的碳化鎢珠后，再加入450 μ 1甲醇、與甲醇溶劑以0. 2 % (w/v)的濃 度混合的丁基羥基甲苯溶液50 μ 1、以及作為內(nèi)標(biāo)物的0. 2% C15:0脂肪酸10 μ 1。然后加 入了這些各種試劑和樣品的微量試管使用Retsch制的ΜΜ301型混磨機以l/20s的頻率振 動1分鐘，使種子粉碎。然后將樣品轉(zhuǎn)移至IOml的帶螺旋蓋的試管中。再將微量試管內(nèi)部 用甲醇250 μ 1洗滌2次，洗滌而得的甲醇溶液加入到上述試管中，使樣品液約為Iml左右。 再向其中加入Iml的10%鹽酸/甲醇溶液，在80°C處理1小時，然后加入1. 5ml正己烷，用 渦旋混合器攪拌，再將正己烷層移至IOml的Spitz管中。用Iml正己烷進一步洗滌用于甲 醇分解作用的試管內(nèi)部，將洗滌而得的正己烷層加入上述Spitz管中。將所得正己烷溶劑 溶液在40°C進行氮氣吹洗，使脂肪酸甲酯干燥凝固。將干燥凝固的脂肪酸甲酯用500μ1正 己烷溶解，通過GC-FID分離、定量各種脂肪酸甲酯。定量時參照內(nèi)標(biāo)物(C15:0脂肪酸)的 面積值?！赐蛔兓虻蔫b定〉突變原處理后，為了對種子中的油脂量發(fā)生了變化的突變體中原因基因進行 高精度基因圖譜定位，將具有哥倫比亞生態(tài)型背景的突變體與野生型擬南芥蘭茲貝格 (Landsberg erecta)生態(tài)型進行雜交，從而獲得均質(zhì)地帶有突變基因的310系統(tǒng)F2代。 使用多種分子標(biāo)記，按照常規(guī)方法，對這些310系統(tǒng)、共計620條染色體的遺傳背景進行得 分分析。使用PCR方法擴增由OleG和突變體基因組DNA推斷為原因基因的基因，并使用 Applied Biosystem制的3130x1遺傳分析儀確定堿基序列。結(jié)果與討論<油體形成不全突變體的篩選方法的確立>制備編碼油質(zhì)蛋白與GFP (綠色熒光蛋白，green fluorescent protein)的融合 蛋白質(zhì)的融合基因(Oleosin-GFP)，并將其連接到來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子DNA的 下游(圖4A)。使用農(nóng)桿菌法將該DNA構(gòu)建體導(dǎo)入擬南芥(Arabidopsis thaliana)的基因 組DNA中，制備轉(zhuǎn)化擬南芥，并將其命名為oleG。使用熒光顯微鏡觀察在黑暗條件下發(fā)芽6 天后的oleG子葉，將結(jié)果示于圖4B。由圖4B可知，油體膜被GFP熒光所標(biāo)記，以大量的小 的油體聚集成凝集體的狀態(tài)存在。另外還得知，除了在黑暗條件下發(fā)芽的子葉中存在油體以外，在胚和/或光照條件下發(fā)芽的綠色子葉中和/或母葉中、花瓣中也存在油體。為了確定與油體中的植物油脂蓄積機理相關(guān)的基因，將OleG種子用甲磺酸乙酯 進行突變處理，得到后代M2種子。對在黑暗條件下發(fā)芽6天后的M2植物進行熒光顯微鏡 觀察，獲得熒光強度與oleG不同的突變體A(圖4C)和突變體B(圖4D)。這些突變體的已 發(fā)芽的子葉中的GFP熒光強度低于oleG。<GFP熒光總和與種子脂質(zhì)含量的關(guān)系>對于OleG、突變體A和突變體B，其在黑暗條件下發(fā)芽6天后的子葉的GFP熒光 以相同條件、相同面積、相同像素數(shù)下的共聚焦激光顯微鏡圖像獲得，并根據(jù)各圖像的像素 數(shù)相對于GFP熒光強度的度數(shù)分布求出GFP熒光總和a(a = sum(熒光強度X像素數(shù)))。 如果設(shè)OleG的熒光總和為100%，則突變體A的熒光總和為37. 9 %，突變體B的熒光總和 為85. 1%。另一方面，測定OleG、突變體A和突變體B的種子中所含的脂質(zhì)含量，結(jié)果分別 % 34. 66% ±0. 43%,26. 91% 士0. 34%和 32. 34% 士0. 49%，由此確認(rèn) GFP 熒光總和與種 子的脂質(zhì)含量存在正相關(guān)(圖5)。此外，分析這些突變體的種子中所積累的脂質(zhì)所含的脂 肪酸組成(圖6)。其結(jié)果是突變體A和突變體B與OleG相比C20 :l(ll)cis的含量均降 低。本說明書中所述脂肪酸如下表記。C碳原子數(shù)碳原子彼此間的不飽和鍵數(shù)(存在不 飽和鍵的碳原子從羧基側(cè)起的編號)不飽和鍵的順反幾何異構(gòu)(cis-trans)。在順反幾何 異構(gòu)不明確的情況下，不進行順反幾何異構(gòu)的表記。例如，硬脂酸表記為C18 0，一般的油酸 表記為C:18:l(9)ciS。另一方面，在突變體A中發(fā)現(xiàn)C18:3 (9，12，15)增加，在突變體B中 C18:1(9) cis增加。以上結(jié)果表明，通過測定油質(zhì)蛋白-GFP融合蛋白質(zhì)的GFP熒光總和，可 以在生存狀態(tài)下對植物油脂的蓄積機理發(fā)生異常的突變體進行鑒定。此外，在圖6中，顯示各脂肪酸的柱狀圖從左邊起依次代表OleG、突變體A和突變 體B?！捶N子蛋白質(zhì)的分析〉圖7是野生型擬南芥、OleG、突變體A和突變體B的種子所含的蛋白質(zhì)的分析結(jié) 果。由考馬斯亮藍染色(圖7A)、利用抗油質(zhì)蛋白抗體的免疫印跡分析(圖7B)以及利用抗 GFP抗體的免疫印跡分析(圖7C)可明確在突變體A、突變體B的種子中，內(nèi)在性油質(zhì)蛋白 量和油質(zhì)蛋白-GFP量均比OleG減少。此外，在圖7A C中，泳道1表示來自野生型擬南 芥的樣品，泳道2表示來自O(shè)leG的樣品，泳道3表示來自突變體A的樣品，泳道4表示來自 突變體B的樣品。〈油體的電子顯微鏡觀察〉圖8顯示將OleG、突變體A和突變體B的種子細(xì)胞在電子顯微鏡下的觀察結(jié)果。 與野生型擬南芥同樣地，OleG的種子細(xì)胞中也塞滿了小的油體。另一方面，在突變體A和 突變體B中，油體彼此之間存在被認(rèn)為是胞質(zhì)溶膠的間隙，每個油體均呈球形。認(rèn)為這是由 于種子的貯藏脂肪量減少的緣故。另外，種子中的若干個油體巨大化。認(rèn)為這是由于油體 膜中的油質(zhì)蛋白量的減少的緣故?！丛蚧虻蔫b定〉將具有哥倫比亞生態(tài)型背景的突變體A與蘭茲貝格(Landsberg erecta)生態(tài)型 的野生型擬南芥進行雜交，并對原因基因進行高精度基因圖譜定位。使用分子標(biāo)記對620 條染色體遺傳背景的得分分析，結(jié)果示于圖9A。來自蘭茲貝格(Landsberg erecta)的染色體數(shù)目顯示突變體A原因基因的基因座與分子標(biāo)記之間發(fā)生了重組。如圖9A所示，由 高精度基因圖譜定位可知，突變體A原因基因的基因座極其靠近第1染色體的Atlg54560， 且位于Atlg54150與Atlg54970之間。這暗示了在該區(qū)域存在包含功能尚未被鑒定的基因 Atlg54570(圖 9B)的 87 基因。Atlg54570編碼包含被認(rèn)為是二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DAGAT)結(jié)構(gòu)域的部分的多 肽。盡管DAGAT結(jié)構(gòu)域是一種被認(rèn)為與作為一種參與三酰甘油合成的酶的二酰甘油?；D(zhuǎn) 移酶共同存在的氨基酸序列，但這是基于堿基序列信息的推測，因此具有DAGAT結(jié)構(gòu)域的 多肽未必全都具有DAGAT活性。此外，對于DAGAT的研究目前主要集中在出芽酵母中進行， 判定植物種子中的特定多肽是DAGAT的例子尚未被人們所知。確定了存在于突變體A的基因組DNA中的Atlg54570基因區(qū)域的堿基序列，結(jié)果 是Atlg54570中的堿基序列存在C3252T的點突變(C3252T的表記表示以相對于mRNA的 cDNA的起始密碼子5’ ATG3'中的A作為1時，第3252位的C置換突變成T)。該點突變位于 第10個外顯子中，引發(fā)Atlg54570基因產(chǎn)物氨基酸序列的DAGAT結(jié)構(gòu)域內(nèi)T508I的錯義突 變(T508I的表記表示自多肽的N末端起第508個氨基酸殘基T (Thr)置換突變成I(Ile))。 由以上結(jié)果可以得出結(jié)論突變體A的原因基因是Atlg54570，Atlg54570基因產(chǎn)物中的 T508I突變是改變植物內(nèi)油脂量的氨基酸置換突變。產(chǎn)業(yè)可利用性根據(jù)本發(fā)明的突變基因，可以調(diào)節(jié)種子內(nèi)的油脂含量和/或油脂組成等。此外，根 據(jù)本發(fā)明的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，可以提供油脂含量和/或油脂組成得到了調(diào)節(jié)的 植物。本說明書中所引用的所有出版物、專利和專利申請均直接作為參考而包含在本說 明的內(nèi)容中。
權(quán)利要求
突變基因，編碼突變蛋白質(zhì)，所述突變蛋白質(zhì)具有在序列號1所示的氨基酸序列中N末端第12位氨基酸殘基被其他氨基酸取代而得的共有序列，且所述突變蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)植物種子內(nèi)的油脂含量的功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變基因，其特征在于，上述其他氨基酸是選自異亮氨酸、纈 氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一種氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變基因，其特征在于，上述其他氨基酸是異亮氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變基因，其特征在于，上述突變蛋白質(zhì)是在序列號4 17 的氨基酸序列中的任一個所示氨基酸序列中所包含的上述共有序列中，N末端第12位氨基 酸殘基被其他氨基酸取代而得的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變基因，其特征在于，是使來自植物的基因發(fā)生突變而得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變基因，其特征在于，是使來自屬于選自禾本科、十字花科 和楊柳科中的一科的植物的基因發(fā)生突變而得的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變基因，其特征在于，是使來自屬于選自大麥、稻、擬南芥、 蕪青和白楊中的一種的植物的基因發(fā)生突變而得的。
8.由權(quán)利要求1 7的任一項所述的突變基因編碼的突變蛋白質(zhì)。
9.導(dǎo)入權(quán)利要求1 7的任一項所述的突變基因而形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
10.導(dǎo)入權(quán)利要求1 7的任一項所述的突變基因而形成的轉(zhuǎn)化植物。
11.種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，對編碼具有由序列號1所示氨基酸序列構(gòu)成的共有 序列的蛋白質(zhì)的基因引入變異，所述變異是將序列號1所示氨基酸序列的N末端第12位氨 基酸殘基置換成其他氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，上述其他氨基 酸是選自異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和蛋氨酸中的一種氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，上述其他氨基 酸是異亮氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，使變異蛋白質(zhì) 表達，所述變異蛋白質(zhì)是在序列號4 17的氨基酸序列中的任一個所示氨基酸序列中所包 含的上述共有序列中，N末端的第12位氨基酸殘基被其他氨基酸取代而得的蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，使來自屬于選 自禾本科、十字花科和楊柳科中的一科的植物的基因發(fā)生突變。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法，使來自屬于選自大麥、稻、擬 南芥、蕪青和白楊中的一種的植物的基因發(fā)生突變。
全文摘要
本發(fā)明提供具有調(diào)節(jié)種子內(nèi)油脂含量的功能的突變基因以及種子內(nèi)油脂含量的調(diào)節(jié)方法。作為本發(fā)明的解決問題的方法是，提供一種突變基因，編碼突變蛋白質(zhì)，所述突變蛋白質(zhì)具有在序列號1所示的氨基酸序列中N末端第12位氨基酸殘基被其他氨基酸取代而得的共有序列，且所述突變蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)植物種子內(nèi)的油脂含量的功能。
文檔編號C12N5/10GK101960010SQ200980106810
公開日2011年1月26日 申請日期2009年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者光川典宏, 大音德, 林誠 申請人:豐田自動車株式會社