專利名稱：：對短鏈脂肪酸具有高度特異性的脂肪酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸序列，包括編碼新穎脂解酶的基因。本發(fā)明描述了新穎基因的全長編碼序列以及全長功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列，和所述基因或氨基酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及在工業(yè)工藝中，例如在食品工業(yè)(如乳制品工業(yè))中使用這些蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明還包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述多核苷酸適用于生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)和細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：脂肪酶是催化脂質(zhì)底物中酯鍵水解，導(dǎo)致釋放脂肪酸的酶。脂肪酶在乳制品應(yīng)用中為了產(chǎn)生香味而使用，最重要地是在乳酪中使用。傳統(tǒng)上，使用來自于山羊、幼山羊、小?；蚋嵫虻姆雌c動(dòng)物脂肪酶制劑。這些制劑衍生自來自這些反芻動(dòng)物的前胃(pregastric)組織，并且這些脂肪酶制劑也被稱作前胃酯酶。市場上存在商業(yè)制劑，如PiccantaseC,L，KGandK(DSMFoodSpecialties,荷蘭)。這些脂肪酶被用于多種意大利、西班牙、希臘和法國乳酪的制備中。這些類型乳酪熟化期間特定香味譜的產(chǎn)生很大程度上歸因于脂肪酶對乳脂肪的作用。脂肪酶催化乳脂肪的水解，產(chǎn)生游離脂肪酸。所述脂肪酸可以具有短鏈(C4-C6脂肪酸，如含有4或6個(gè)碳原子，即丁酸、己酸)和中到長鏈(C12-C18脂肪酸)。隨后游離脂肪酸可參與化學(xué)反應(yīng)，例如香味化合物如乙酸乙酯、β-酮酸、甲基酮、酯和內(nèi)酯的形成。香味組分中脂肪酸的轉(zhuǎn)化可以由來自乳酪中微生物種群的酶催化。已知乳酪中由脂肪酶釋放的游離脂肪酸的類型可以受到使用的脂肪酶類型的影響。例如，主要釋放短鏈脂肪酸(例如含C4和C6的脂肪酸)的脂肪酶導(dǎo)致產(chǎn)生辛辣(piquant，spicy)、尖銳、強(qiáng)烈的香味，而中到長鏈脂肪酸的釋放可以導(dǎo)致肥皂樣的口味。在除乳酪之外的其它乳制品應(yīng)用中，脂肪酶具有越來越多的用途，如經(jīng)酶修飾的乳酪(EMC；WilkinsonetalinEncyclopediaofDairySciences,(2003；Foxetalleds,AcademicPress)pp.434-438)或黃油脂肪和奶油的水解及其應(yīng)用(KilarainEnzyclopediaofDairySciences,(2003;Foxetalleds，AcademicPress)pp.914-918)。反芻動(dòng)物脂肪酶是超出微生物脂肪酶而被優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兙哂袕娜橹局嗅尫哦替溨舅?含C4、C6的脂肪酸)的特異性。這些化合物是香味化合物自身，或者被轉(zhuǎn)化成具有具體香味影響的揮發(fā)性酯(Liuetal，Int.DairyJ.2004,14，923-945)。一個(gè)有趣的問題是反芻動(dòng)物脂肪酶的組合物，其為若干文獻(xiàn)的主題(例如AddisetalInt.dairyJ.(2005)15,1271-1278；Richardsonetal，!DairySci.(1967)50,1061-1065；AddidetalInt.DairyJ.(2005)15，563-569；HamoshNutrition(1990)6，421-428；Calvoetal(2004)J.DairySci.87,1132-1142)。所示數(shù)據(jù)導(dǎo)致結(jié)論大多數(shù)反芻動(dòng)物酶可能是兩種或更多脂肪酶的混合物，并且組合物中改變的發(fā)生導(dǎo)致乳酪香味形成性能的改變。所述改變是工業(yè)上尋找具有改良的相容性的替代性酶來源的驅(qū)動(dòng)力。動(dòng)物疾病如綿羊瘙癢病和瘋牛病的出現(xiàn)是工業(yè)上尋找替代方式的另一驅(qū)動(dòng)力。其它支持來自于容易獲得KosherandHalal品質(zhì)產(chǎn)品的期望。因此，工業(yè)上對于衍生自動(dòng)物的脂肪酶的替代方式具有強(qiáng)烈的需頁求。專利申請US2004/0001819描述了酵母Pichiapastoris中小山羊(kidpregastricesterase)的克隆和表達(dá)。盡管可能是感興趣的，但是所述酶生產(chǎn)較差，除此之外，與原始小山羊酯酶相比游離脂肪酸釋放譜遷移至更長的脂肪酸。這兩方面使得所述酶在應(yīng)用中由于不經(jīng)濟(jì)和缺乏性能而沒有吸引力。一種優(yōu)選的替代方式應(yīng)當(dāng)是微生物脂肪酶或由微生物重組生產(chǎn)的(微生物)脂肪酶。市場上有若干微生物脂肪酶(例如參閱Bjurlinetal,JAOCS(2001)78，153-160)。用于乳酪應(yīng)用的微生物脂肪酶的最重要特征是它們來自乳脂肪的脂肪酸釋放譜，其可盡可能接近地模擬衍生自動(dòng)物的脂肪酶。然而，微生物脂肪酶在下述方面中表現(xiàn)較差，因?yàn)樗鼈兿鄬τ诙替溨舅?C4，C6)而言具有釋放長鏈(C12-C18)脂肪酸的偏好。這通常導(dǎo)致肥皂樣味道而不是期望的辛辣香味的形成。因此，盡管市場中存在大量商業(yè)微生物脂肪酶制劑，但是對于能夠代替衍生自動(dòng)物的脂肪酶(如反芻動(dòng)物前胃脂肪酶)的非衍生自動(dòng)物的脂肪酶仍然具有工業(yè)需求。S1與Parmesan乳酪的FFA譜相比，Cheddar乳酪糊中由脂解酶LOl、L03、L04和來自Rhizomucormiehei的商業(yè)微生物脂肪酶(PiccantaseR8000)生產(chǎn)的FFA譜。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供適用于乳制品工業(yè)、更具體地適用于制造乳酪或乳酪樣制品、適用于脂解黃油脂肪或奶油或生產(chǎn)經(jīng)酶修飾的乳酪的新穎的脂解酶。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼新穎的脂解酶的新穎多核苷酸。另一個(gè)目的是提供重組生產(chǎn)的脂解酶以及生產(chǎn)所述脂解酶的重組菌株。融合多肽以及制造和使用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的方法也是本發(fā)明的一部分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了適用于乳制品工業(yè)中的新穎脂解酶(lipolyticenzyme)。令人驚訝地，新穎的脂解酶極度適用于通過含脂質(zhì)食物成分(優(yōu)選乳酪)的酶修飾來產(chǎn)生香味(flavour)。新穎的脂解酶還可有利地用于乳酪熟化、乳酪樣制品的生產(chǎn)、奶油或黃油脂肪的修飾中。另外，也可以在其它食物應(yīng)用中、如烘焙制品的制造中適當(dāng)?shù)厥褂盟雒浮１景l(fā)明還提供了編碼新穎脂解酶的新穎多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列(a)如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少90%同源性；(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO:1的互補(bǔ)序列的多核苷酸雜交，并且其中所述核苷酸序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少90%同源；(c)核苷酸序列，其編碼根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90%的同源性；(d)核苷酸序列，其編碼具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽是SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，與所述成熟多肽至少60%同源，并且所述經(jīng)分離的多肽具有至少0.7的針對甘油三酯的特異性程度Rspto；(e)由于遺傳密碼子簡并性，是(a)、(b)、(c)、(d)中任一所定義序列的簡并序列的序列；(f)核苷酸序列，其為(a)、(b)、(c)、(d)、(e)任一所定義序列的互補(bǔ)序列。具體地，本發(fā)明提供了具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下與是SEQIDNO:1互補(bǔ)序列的多核苷酸雜交，并且其中所述序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少90%同源。因此，本發(fā)明提供了與根據(jù)SEQIDNO1的序列至少90%，優(yōu)選地至少91%，更優(yōu)選地至少92%、93%,94%,95%,進(jìn)一步更優(yōu)選地至少96%、97%,98%或99%同源的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以例如通過固相合成，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，合成獲得這類經(jīng)分離的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)SEQIDNO:1的脂解酶基因或其仍然編碼活性酶的功能等同物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸是DNA序列。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列的載體，和可用于擴(kuò)增或檢測根據(jù)本發(fā)明的DNA的引物、探針和片段。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了下述載體，其中根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸與允許所述多核苷酸序列在合適宿主中表達(dá)的至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接。優(yōu)選地，所述合適的宿主細(xì)胞是絲狀真菌，更優(yōu)選地是Aspergillus的物種。合適的菌株屬于Aspergillusniger、oryzae或nidulans。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是Aspergillusniger。本發(fā)明還涉及含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了制備根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和載體的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組宿主細(xì)胞，其中根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)被顯著提高，或者其中脂解活性的生產(chǎn)水平被顯著提高。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)本發(fā)明的異源或同源DNA，并且其中所述細(xì)胞能夠生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的功能脂解酶，即所述細(xì)胞能夠表達(dá)或優(yōu)選地過表達(dá)編碼本發(fā)明脂解酶的多核苷酸，例如包含提高拷貝數(shù)本發(fā)明基因的Aspergillus菌株。在本發(fā)明的另一方面中，提供了具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽包含選自以下的氨基酸序列(a)根據(jù)下述成熟多肽或其功能等同物的氨基酸序列，所述成熟多肽是根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽，所述功能等同物具有與根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90%同源的氨基酸序列；(b)是SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽功能等同物的多肽，所述多肽與所述成熟多肽至少60%同源，并且所述多肽具有至少0.7的針對甘油三酯的特異性程度^spec(C)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有至少0.7，優(yōu)選地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的針對甘油三酯的特異性程度Rspec°在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，其是SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，與所述成熟多肽至少60%、65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%同源，并且所述經(jīng)分離的多肽具有至少0.7、優(yōu)選地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的針對甘油三酯的特異性程度Rspe^本發(fā)明還涉及包含編碼所述多肽的多核苷酸。Rspto在稍后的申請文件中定義。包含本發(fā)明多肽的融合蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了制造根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的脂解酶在本文所述任何工業(yè)方法中、更具體地在食品工業(yè)中、例如乳制品或烘焙制品中的用途。發(fā)明詳述多核苷酸本發(fā)明在第一方面中提供了經(jīng)分離的多核苷酸，其包含選自以下的核苷酸序列(a)如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少90%的同源性；(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO:1互補(bǔ)序列的多核苷酸雜交，并且其中所述序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少90%同源；(c)核苷酸序列，其編碼根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90%的同源性；(d)核苷酸序列，其編碼具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽是SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，與所述成熟多肽至少60%同源，并且所述經(jīng)分離的多肽具有至少0.7的針對甘油三酯的特異性程度Rspto；(e)由于遺傳密碼子簡并性，是(a)、(b)、(c)、(d)任一所定義序列的簡并序列的序列；(f)核苷酸序列，其為(a)、(b)、(c)、(d)、(e)任一所定義序列的互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼脂解酶的多核苷酸，所述脂解酶具有對應(yīng)于根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物與對應(yīng)于根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的氨基酸序列具有至少90%的同源性。在本發(fā)明的上下文中，“成熟多肽”被定義為在翻譯和任何翻譯后修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式具有脂解活性的多肽。成熟過程可取決于使用的具體表達(dá)載體、表達(dá)宿主和生產(chǎn)工藝。優(yōu)選地，成熟多肽是根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的氨基酸34到304?！熬幋a成熟多肽的核苷酸序列”在本文中被定義為編碼所述成熟多肽的多核苷酸序列。優(yōu)選地，編碼成熟多肽的核苷酸序列是SEQIDNO1中的核苷酸100到912。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽的經(jīng)分離的多核苷酸，所述多肽是SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，與所述成熟多肽至少60%、65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%同源，并且所述經(jīng)分離的多肽具有至少0.7，優(yōu)選地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的針對甘油三酯的特異性程度Rspe。。本發(fā)明還涉及包含編碼所述多肽的多核苷酸。Rspto在申請文件下文中定義。本發(fā)明提供了下述多核苷酸序列，其包含編碼脂解酶的基因及其編碼序列。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列或其變體，如與SEQIDNO1具有至少90%同源性的功能等同物。具體地，本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與根據(jù)SEQIDNO:1的多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下雜交，更優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下雜交，并且其中優(yōu)選地所述序列與SEQIDNO:1的核苷酸序列至少90%同源。更特定地，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列或基本由之組成。這類經(jīng)分離的多核苷酸可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過合成獲得。本文使用的術(shù)語“基因”和“重組基因”指可從染色體DNA中分離的、包含編碼蛋白質(zhì)(例如脂解酶)的開放讀碼框的核酸分子?；蚩砂幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列。此外，基因是指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子或多核苷酸?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息，來分離本發(fā)明的核酸分子(如具有SEQIDNO1的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQIDNO1的所有或部分核酸序列作為雜交探針，能夠使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如描述于Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,andManiatis，T.MolecularCloningALaboratoryManual.2nd，ed.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中)分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，來分離包含SEQIDNO1所有或部分的核酸分子，所述引物以SEQIDNO:1中含有的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。可以使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锔鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，來擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。這樣擴(kuò)增的核酸可以被克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體中并通過DNA序列分析被表征。另外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)(例如使用自動(dòng)化DNA合成儀)制備下述寡核苷酸，所述寡核苷酸對應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列或能夠與本發(fā)明的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列。SEQIDNO1的序列編碼根據(jù)SEQIDNO2的多肽和根據(jù)SEQIDNO2中成熟多肽的脂解酶。根據(jù)根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的脂解酶被表示為LOl。根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列被表示為DNALOl。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQIDNO1中所示核苷酸序列或這些核苷酸序列功能等同物的互補(bǔ)序列。與另一核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與所述另一核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其能夠與所述另一核苷酸序列雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明的多肽或其變體如功能等同物(例如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域)，以及足夠用作雜交探針(以鑒定編碼本發(fā)明多肽的核酸分子)的核酸分子，和適合用作PCR引物(用于擴(kuò)增或突變核酸分子)的這類核酸分子的片段。“經(jīng)分離的多核苷酸”或“經(jīng)分離的核酸”是與所述DNA或RNA來源的天然存在的生物基因組中緊鄰的兩條編碼序列(一個(gè)在5’端，一個(gè)在3’端)均不緊鄰的DNA或RNA。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸包含與編碼序列緊鄰的部分或所有5’非編碼(例如啟動(dòng)子)序列。該術(shù)語因此包括例如被整合進(jìn)載體、整合進(jìn)自主復(fù)制的制粒或病毒、或整合進(jìn)原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為不依賴于其它序列的獨(dú)立分子(例如通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括編碼下述額外多肽的雜交基因的一部分的重組DNA，所述額外多肽基本不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基(通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)品(化學(xué)合成時(shí))。另外，“經(jīng)分離的核酸片段”是天然不作為片段存在并且在天然狀態(tài)下不被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?？梢允褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)來合成核酸。這類寡核苷酸可被用于例如制備核酸，所述核酸具有改變的堿基配對能力或提高的核酸酶抗性。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子(例如根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的編碼鏈)是反義的。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的互補(bǔ)鏈也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。核酸片段、探針和引物根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可僅包含根據(jù)SEQIDNO1的核酸序列的部分或片段，例如可以用作探針或引物的片段或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部分的片段。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列允許生產(chǎn)探針和引物，所述探針和引物被設(shè)計(jì)為用于鑒定和/或克隆根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等同物，所述功能等同物與根據(jù)SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)具有至少90%同源性。探針/引物典型地包含基本上被純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的條件下與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的至少約12或15個(gè)、優(yōu)選約18或20個(gè)、優(yōu)選約22或25個(gè)、更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸雜交。以根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列為基礎(chǔ)、更優(yōu)選地以SEQIDNO:1為基礎(chǔ)的探針可以被用于檢測轉(zhuǎn)錄本或基因組序列，所述轉(zhuǎn)錄本或基因組序列編碼例如生物中的相同或同源蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針還包含與之結(jié)合的標(biāo)簽基團(tuán)，例如所述標(biāo)簽基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶，或酶輔因子。這類探針也可以被用作診斷測試試劑盒的部分，所述試劑盒用于鑒定表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。同一性&同源性術(shù)語“同源性”或“同一性百分比”在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在本文中定義，為了測定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的同一性百分比，將所述序列就最適比較的目的進(jìn)行排列。為了優(yōu)化兩條序列之間的比對，可以在比較的兩條序列的任一條中引入缺口。這類比對可以在被比較的序列的全長上進(jìn)行?；蛘撸葘梢栽谳^短的長度上，例如約20、約50、約100或更多個(gè)核酸/堿基或氨基酸上進(jìn)行。同一性是報(bào)告的比對區(qū)中兩條序列之間相同匹配的百分比。序列的比較和兩條序列之間同一性百分比的測定可以使用數(shù)學(xué)算法完成。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白下述事實(shí)可獲得若干種不同的計(jì)算機(jī)程序來比對兩條序列并測定兩條序列之間的同源性(Kraskal,J.B.(1983)AnoverviewofsquencecomparisonInD.SankoffandJ.B.Kraskal,(ed.)，Timewarps,stringeditsandmacromoleculesthetheoryandpracticeofsequencecomparison,pp.1-44AddisonWesley)ο兩條氨基酸序列之間或兩條核苷酸序列之間的同一性百分比可以使用用于比對兩條序列的NeedlemanandWunsch算法測定(Needleman,S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)?？梢酝ㄟ^所述算法比對氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法在計(jì)算機(jī)程序NEEDLE中執(zhí)行。就本發(fā)明的目的而言，使用來自EMBOSS軟件包的NEEDLE程序(第2.8.0版或更高，EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,LandBleasby，A.TrendsinGenetics16,(6)pp276-277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。對蛋白質(zhì)序列而言，使用EBLOSUM62作為取代矩陣(substitutionmatrix)。對核苷酸序列而言，使用EDNAFULL。使用的可選參數(shù)是10的缺口罰分和0.5的缺口延伸罰分。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，所有這些不同的參數(shù)應(yīng)當(dāng)?shù)玫捷p微差異的結(jié)果，但是使用不同算法時(shí)兩條序列的總體同一性百分比不被顯著改變。通過上述程序NEEDLE比對后，如下計(jì)算查詢序列和本發(fā)明序列之間的同一性百分比用兩條序列中展示相同氨基酸或相同核苷酸的比對中相應(yīng)位置的數(shù)量除以比對總長度，所述比對總長度減去了比對中的缺口總數(shù)。本文定義的同一性可以通過使用NOBRIEF選項(xiàng)從NEEDLE獲得，并且在程序輸出中被標(biāo)記為“最長同一性”。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可以被用作“查詢序列”，針對公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。這類搜索可以使用Altschul，etal.(1990)J.MoI.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行。可以使用NBLAST程序(計(jì)分=100，字長=20)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(計(jì)分=50，字長=3)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得加缺口的比對用于比較的目的，可以如Altschuletal.，(1997)NucleicAcidsRes.25(17)3389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見國立生物信息中心(NataionalCenterforBiotechniologyInformation)的主頁http://www.ncbi.nlm.nih.gov。本文使用術(shù)語“雜交”旨在描述用于下述雜交和洗滌的條件，在所述條件下彼此至少約60%、65%,80%,85%,90%,優(yōu)選地至少93%，更優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少98%同源的核苷酸序列保持與彼此的互補(bǔ)序列雜交。這類雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性例子是于約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50°C、優(yōu)選55°C、優(yōu)選60°C和進(jìn)一步更優(yōu)選65°C下，在IXSSC、0.1%SDS中洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格條件包括例如于68°C下在5xSSC/5xDenhardt's溶液/1.0%SDS中雜交并于室溫下在0.&SSC/0.1%SDS中洗滌?；蛘?，洗滌可以在42°C進(jìn)行。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對于嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件而言應(yīng)用何種條件。涉及這類條件的其它指示在該領(lǐng)域能夠容易地獲得，例如在Sambrooketal.，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.；禾口Ausubeletal.(eds.)，1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與多聚A序列(例如mRNA的3’末端多聚(A))或互補(bǔ)的T(或U)殘基段雜交的多核苷酸不應(yīng)被包括于與本發(fā)明的核酸部分特異雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)檫@類多核苷酸會與含有多聚(A)段或其補(bǔ)體的任何核酸分子(例如尤其是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。從其它牛物獲得全長DNA可以以一種典型的途徑，來篩選從其它生物(例如絲狀真菌，尤其是來自Fusarium的種)構(gòu)建的cDNA文庫。例如，可以通過Northern印跡針對SEQIDNO1的同源多核苷酸篩選Fusarium菌株。檢測到與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離自適當(dāng)菌株的RNA構(gòu)建cDNA文庫。或者，可以使用能夠與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸雜交的探針來篩選總基因組DNA文庫?？梢岳缤ㄟ^進(jìn)行PCR分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩個(gè)簡并寡核苷酸引物池。用于反應(yīng)的模板可以是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA，所述mRNA從已知或懷疑表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備。可以對PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測序，以確保被擴(kuò)增的序列代表了根據(jù)本發(fā)明的新核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過多種已知方法，使用PCR片段來分離全長cDNA克隆。例如，被擴(kuò)增的片段可以被標(biāo)記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫?；蛘?，被標(biāo)記的片段可以被用于篩選基因組文庫。也可以用PCR技術(shù)來從其它生物中分離全長cDNA序列。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟從合適的細(xì)胞或組織來源中分離RNA?？梢允褂锰禺愑诒粩U(kuò)增片段最5’端的寡核苷酸引物，引導(dǎo)第一鏈合成，針對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)將得到的RNA/DNA雜交體“加尾”(例如用鳥嘌呤)，可以用RNaseH消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二鏈合成。因此，被擴(kuò)增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文Sambrooketal.；和上文的Ausubeletal.。本發(fā)明的另一方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列的載體，包括克隆和表達(dá)載體，所述多核苷酸序列編碼根據(jù)本發(fā)明的具有脂解活性的多肽或其功能等同物。本發(fā)明還涉及在合適的宿主細(xì)胞中培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染這類載體的方法，例如在發(fā)生本發(fā)明12多肽表達(dá)的條件下。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸可以被摻入重組的可復(fù)制載體中，例如克隆或表達(dá)載體中。載體可被用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下制造本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體中，將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞中，并在使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。載體可以從宿主細(xì)胞中被回收。合適的宿主細(xì)胞在下文討論。其中插入本發(fā)明表達(dá)盒或多核苷酸的載體可以是能夠便利地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，并且所述載體的選擇通常應(yīng)取決于要引入它的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的載體可以是自主復(fù)制載體，即顯示為染色體外實(shí)體的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。或者載體可以是被引入宿主細(xì)胞中后被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，并與整合了它的染色體一起復(fù)制的載體。一種類型的載體是“質(zhì)?！保|(zhì)粒是指其中可以連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可以被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主細(xì)胞的基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中被稱作“表達(dá)載體”。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式存在的。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”在本文中可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這類表達(dá)載體的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)和噬菌體載體。根據(jù)本發(fā)明的載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體可包含兩種或更多，例如三種、四種或五種本發(fā)明的多核苷酸，例如用于過表達(dá)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適合核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體含有一個(gè)或多個(gè)與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，以要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞為基礎(chǔ)選擇所述調(diào)節(jié)序列。在重組表達(dá)載體中，“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)的方式連接，即術(shù)語“可操作地連接”是指一種連接，其中所述組分處于允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。與編碼序列“可操作地連接”的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號以下述方式放置在與所述控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)所述編碼序列的表達(dá)；或者所述調(diào)節(jié)序列被布置為使得它們與其預(yù)期目的一致地發(fā)揮功能，例如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子處開始并通過編碼多肽的DNA序列繼續(xù)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel；GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的那些序列和僅在某種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些(例如組織特異調(diào)節(jié)序列)。針對指定宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)構(gòu)建體因此可包含以下元件，所述元件以相對于編碼第一發(fā)明的多肽的序列的編碼鏈從5’-端到3’-端的連續(xù)順序彼此可操作地連接ω能夠在給定的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列；(2)任選地，能夠指導(dǎo)多肽從給定的宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的信號序列；(3)本發(fā)明的DNA序列，其編碼成熟和優(yōu)選地活性形式的、具有本發(fā)明脂解活性的多肽；和優(yōu)選地還有(4)能夠終止編碼多肽的核苷酸序列下游轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(終止子)。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的下游可以是含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(例如終止子)的3’非翻譯區(qū)。終止子的起點(diǎn)較不關(guān)鍵。終止子可以例如對編碼多肽的DNA序列而言是天然的。然而，優(yōu)選地在酵母宿主細(xì)胞中使用酵母終止子并在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用絲狀真菌終止子。更優(yōu)選地，終止子對宿主細(xì)胞(其中要表達(dá)編碼多肽的核苷酸序列)而言是內(nèi)源的。在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中，可存在用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體所表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分應(yīng)當(dāng)包括位于要翻譯的多肽起點(diǎn)處的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥诮Y(jié)尾處的終止密碼子。增強(qiáng)的本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)也可以通過異源調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)肽和/或終止子區(qū))的選擇來實(shí)現(xiàn)，所述異源調(diào)節(jié)區(qū)可發(fā)揮以下作用提高表達(dá)宿主對感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和需要時(shí)的分泌水平，和/或提供本發(fā)明多肽表達(dá)的誘導(dǎo)型控制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以以下述因素為基礎(chǔ)，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如具有本發(fā)明脂解活性的多肽、多肽的突變體形式，其任何的片段、變體或功能等同物，融合蛋白等)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以被設(shè)計(jì)，來用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽。例如根據(jù)本發(fā)明的多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞如E.coli和Bacilli、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel,GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中進(jìn)一步討論?；蛘?，可以例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體。對大部分絲狀真菌和酵母而言，載體或表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。然而，對某些酵母而言還可獲得合適的附加體載體，可以向其中并入表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行穩(wěn)定和高水平的表達(dá)，其例子包括分別衍生自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKDl質(zhì)粒的載體，或含有AMA序列(例如來自Aspergillus的AMA1)的載體。將表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中的情況下，所述構(gòu)建體被整合進(jìn)基因組中隨機(jī)基因座處，或者使用同源重組整合進(jìn)預(yù)定的目標(biāo)基因座處，在這種情況下目標(biāo)基因座優(yōu)選地包含高度表達(dá)的基因。因此，可用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括來自染色體、附加體和病毒的載體，例如來自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)的載體和來自其組合的病毒，如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。核苷酸插入物應(yīng)與合適的啟動(dòng)子可操作地連接。除了對編碼本發(fā)明多肽的基因是天然的啟動(dòng)子以外，可以使用其它啟動(dòng)子來指導(dǎo)本發(fā)明多肽的表達(dá)。啟動(dòng)子可針對其在期望的表達(dá)宿主中指導(dǎo)本發(fā)明多肽表達(dá)的效率來選擇。可用于本發(fā)明中的啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λPL啟動(dòng)子，E.colilac、trp和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子，但不限于這些。其它合適的啟動(dòng)子是技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道的。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，能夠在真菌或酵母中指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的多肽高水平表達(dá)的啟動(dòng)子是優(yōu)選的。這類啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的?？梢允褂媚軌蛟诒景l(fā)明的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的多種啟動(dòng)子。優(yōu)選地，啟動(dòng)子序列衍生自高表達(dá)的基因。優(yōu)選的高表達(dá)基因(啟動(dòng)子優(yōu)選地從其中衍生和/或其包含在用于整合表達(dá)構(gòu)建體的優(yōu)選的預(yù)定目標(biāo)基因座中)的例子包括但不限于編碼糖解酶如丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、甘油醛-磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK或PKI)、醇脫氫酶(ADH)的基因，以及編碼淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白的基因。合適的高表達(dá)基因的特定例子包括例如來自Kluyveromycessp.的LAC4基因、分別來自Hansenula和Pichia的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、來自A.niger和A.awamori的葡萄糖淀粉酶(glaA)基因、A.oryzaeTAKA-淀粉酶基因、A.nidulansgpdA基因和T.reesei纖維二糖水解酶基因。優(yōu)選地用于真菌表達(dá)宿主中的強(qiáng)組成型和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子是可得自以下真菌基因的啟動(dòng)子木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亞基9(oliC)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、a_淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(glaA基因的AG-形式)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛_3_磷酸脫氫酶(gpd)啟動(dòng)子。強(qiáng)酵母啟動(dòng)子的例子是可得自醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子。強(qiáng)細(xì)菌啟動(dòng)子的例子是α-淀粉酶和啟動(dòng)子以及來自細(xì)胞外蛋白酶基因的啟動(dòng)子。適用于植物細(xì)胞的啟動(dòng)子包括胭脂堿合酶(nos)、章魚堿合酶(OCS)、甘露堿合酶(mas)、核酮糖小亞基(核酮糖二膦酸羧化酶-加氧酶ssu)、組蛋白、水稻肌動(dòng)蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(CMV)35S和19S和環(huán)病毒啟動(dòng)子。所有上述啟動(dòng)子是本領(lǐng)域可容易獲得的。載體可還包括得到RNA的多核苷酸側(cè)翼的序列，所側(cè)翼的序列包含與真核基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。這會允許將本發(fā)明的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的基因組中。載體可含有以反義方向本導(dǎo)向的發(fā)明的多核苷酸，以提供反義RNA的生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA弓丨入原核或真核細(xì)胞中。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在表示用于向宿主細(xì)胞中引入外源核酸(例如DNA)的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見于Sambrook,etal.(MolecularCloningALaboratoryManual，2nd，ed.ColdSpring15HarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，Davisetal.，BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊中。對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，已知取決于使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有非常小的細(xì)胞級分可以將外源DNA整合進(jìn)它們的基因組中。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(例如抗性或抗生素)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括但不限于賦予藥物抗性或補(bǔ)足宿主細(xì)胞缺陷的可選擇標(biāo)記。它們包括例如可用于轉(zhuǎn)化大部分絲狀真菌和酵母的通用標(biāo)記基因，如乙酰胺酶基因或cDNA(來自A.nidulans、A.oryzae或A.niger的amdS、niaD、facA基因或cDNA),或提供抗生素抗性如G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素或苯菌靈抗性(benA)的基因。或者，可以使用特異性選擇標(biāo)記，如需要相應(yīng)突變體宿主菌株的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，例如URA3(來自S.cerevisiae或來自其它酵母的類似基因)、pyrG或pyrA(來自A.nidulans或A.niger)、argB(來自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在引入表達(dá)構(gòu)建體后從經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中缺失選擇標(biāo)記，從而獲得能夠生產(chǎn)下述多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述多肽不含選擇標(biāo)記基因。其它標(biāo)記包括ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(pvrA)、細(xì)菌G418抗性基因(這也可在酵母中使用，但是不能在真菌中使用)、氨芐西林抗性基因(E.coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)和編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的E.coliuidA基因。載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)常在E.coli中用下述載體完成，所述載體含有指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。融合載體對其中編碼的蛋白質(zhì)、例如對重組蛋白的氨基端添加大量氨基酸。這類融合載體典型地具有三個(gè)目的1)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的溶解度；3)通過在親和層析中發(fā)揮配體作用來幫助純化重組蛋白。通常在融合表達(dá)載體中，在融合片段和重組蛋白的接合處引入蛋白水解切割位點(diǎn)，使得能夠在融合蛋白的純化后將重組蛋白與融合片段分開。如所指出的，表達(dá)載體優(yōu)選地含有可選擇標(biāo)記。這類標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在E.coli和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐西林抗性。合適的宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、Streptomyces>Salmonellatyphimurium和某些Bacillus的物種；真菌細(xì)胞，如Aspergillus的物種，例如A.niger、A.oryzae禾口A.nidulans,如酵母如Kluyveromyces，例如K.lactis禾口/或Puchia，例如P.pastoris；昆蟲細(xì)胞如DrosophilaS2和SpodopteraSffi；動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS和Bowesmelanoma；和植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選用于細(xì)菌的載體例如公開于W0-Al-2004/074468中，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文。其它合適的載體應(yīng)是技術(shù)人員容易知道的。適用于本發(fā)明的已知細(xì)菌啟動(dòng)子包括W0-Al-2004/074468中公開的啟動(dòng)子，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文?？梢酝ㄟ^向載體中插入增強(qiáng)子序列，來提高高等真核生物對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10到300bp，其作用于提高啟動(dòng)子在給定的宿主細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子的例子包括SV40增強(qiáng)子(其位于復(fù)制起點(diǎn)下游的bp100到270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)下游的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、進(jìn)入壁膜間隙中或進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境中，可以向被表達(dá)的基因中整合進(jìn)適當(dāng)?shù)姆置谛盘枴Ｋ鲂盘枌Χ嚯目梢允峭吹幕蛩鼈兛梢允钱愒葱盘?。根?jù)本發(fā)明的多肽可以以經(jīng)修飾的方式(例如作為融合蛋白)被生產(chǎn)，并可不僅含有分泌信號而且含有額外的異源功能區(qū)。因此，例如額外氨基酸區(qū)(尤其是帶電荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促進(jìn)純化期間或隨后的操作和儲存期間在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。還可向多肽添加肽基元，以便于純化。根據(jù)本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽包括(a)根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物，所述功能等同物具有與根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90%同源的氨基酸序列；(b)是SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽功能等同物的多肽，所述多肽與所述成熟多肽至少60%同源，并且所述多肽具有至少0.7的針對甘油三酯的特異性程度^spec(C)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列。因此，本發(fā)明提供了具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽，優(yōu)選地包含SEQIDNO2的氨基酸34-304，和能夠通過在合適宿主中表達(dá)SEQIDNO1的多核苷酸獲得的氨基酸序列。本發(fā)明還包括下述肽或多肽，其是根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物并且與之至少90%同源。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，其是SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，與所述成熟多肽至少60%、65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%同源，并且所述經(jīng)分離的多肽具有至少0.7、優(yōu)選地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的針對甘油三酯的特異性程度Rspe^Rspec在稍后的申請文件中定義。上述多肽集體包含在術(shù)語“本發(fā)明的多肽”中。術(shù)語“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義的(如其通常被認(rèn)為的那樣)，且當(dāng)上下文需要表示通過肽鍵偶合的至少兩個(gè)氨基酸鏈時(shí)，每個(gè)術(shù)語可以互換使用。詞語“多肽”(或蛋白質(zhì))在本文中使用表示含有多于七個(gè)氨基酸殘基的鏈。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中從左到右和從氨基端到羧基端的方向書寫。本文使用的單字母氨基酸代碼是本領(lǐng)域普遍已知的，并可見于Sambrook，etal.(MolecularCloningALaboratoryManual,2nd，ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)?！胺蛛x的”多肽或蛋白質(zhì)表示被從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，就本發(fā)明的目的而言，在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，與通過任何合適的技術(shù)已基本純化的天然或重組多肽一樣，所述合適的技術(shù)例如SmithandJohnson,Gene6731-40(1988)中公開的單步驟純化方法。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，由于成熟期間的加工錯(cuò)誤，可能SEQIDNO:2的N-端或根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的N_端以及SEQIDNO2的C-端或根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的C-端可以是異源的。具體地，這類加工錯(cuò)誤可能發(fā)生于多肽的過表達(dá)后。另外，外切-蛋白酶活性可導(dǎo)致異質(zhì)性。異質(zhì)性發(fā)生的程度取決于使用的宿主和發(fā)酵方案。這類C-端加工制品(artefacts)可能導(dǎo)致SEQIDNO2所示或根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽所示的更短多肽或更長多肽。這類錯(cuò)誤的結(jié)果是N-端也可以是異源的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)SEQIDNO:2的多肽或根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，所述成熟多肽含有額外的殘基并在-1或_2或_3位起始?；蛘咂淇扇狈δ承埢⒁虼嗽?或3或4等位置起始。額外的殘基還可存在于C-端，例如347、348等位置?；蛘撸珻-端可能缺乏某些殘基，并因此在345或344等位置終止?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法(ProteinPurificationProtocols,MethodsinMolecularBiologyseriesbyPaulCutler,HumanaPress,2004)從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化根據(jù)本發(fā)明的脂解酶。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物，和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。取決于重組生產(chǎn)步驟中使用的宿主，可以將本發(fā)明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可以包含最初被修飾的殘基(在一些情況下由宿主介導(dǎo)的過程產(chǎn)生)。多肽片段本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的生物活性片段。本發(fā)明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽)足夠同一或來自后者，所述片段包含比全長蛋白質(zhì)更少的氨基酸但是顯示相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的至少一種生物活性，優(yōu)選地所述片段顯示脂解活性。典型地，生物活性片段包含具有根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性片段可以是多肽，所述多肽長度為例如比SEQIDNO:2的成熟多肽的長度短5、10、15、20、25或更多個(gè)氨基酸，并且與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%的同源性。另外，其它生物活性部分(其中蛋白質(zhì)的其它區(qū)域被缺失)可以通過重組技術(shù)被制備，并針對本發(fā)明多肽的天然形式的一種或多種生物活性做出評價(jià)。本發(fā)明還包括編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的上述生物活性片段的核酸片段。融合蛋白根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能等同物，例如其生物活性部分，可以與并非根據(jù)本發(fā)明的多肽(例如異源氨基酸序列)可操作地連接，形成融合蛋白?！安⒎歉鶕?jù)本發(fā)明的多肽”是指具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列對應(yīng)于與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)不大量同源的蛋白質(zhì)。這類“并非根據(jù)本發(fā)明的非-多肽”可衍生自相同或不同的生物。在融合蛋白中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的全部或其生物活性片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白包含根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的至少兩個(gè)生物活性部分。在融合蛋白中，術(shù)語“可操作地連接”旨在表示根據(jù)本發(fā)明的多肽和并非根據(jù)本發(fā)明的多肽彼此按照讀碼框融合。并非根據(jù)本發(fā)明的多肽可以與多肽的N-端或C-端融合。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白是其中氨基酸序列與GST序列C-端融合的融合蛋白。這類融合蛋白可有助于根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白的純化。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白是其N-端含有異源信號序列的蛋白質(zhì)。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物和酵母宿主細(xì)胞)中，可以通過使用異源信號序列提高根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或分泌。在另一個(gè)例子中，可以使用桿狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列作為異源信號序列(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubeletal.，eds.，JohnWiley&Sons,1992)。真核異源信號序列的其它例子包括蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；LaJolla,California)。還在另一例子中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等，上文)和A蛋白分泌信號(PharmaciaBiotech；Piscataway，NewJersey)?？梢允褂眯盘栃蛄衼韰f(xié)助本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的分泌和分離。信號序列的典型特征是疏水氨基酸核，其通常在分泌期間的一個(gè)或多個(gè)切割事件中從成熟蛋白質(zhì)上被切割。這類信號肽含有加工位點(diǎn)，所述加工位點(diǎn)允許在經(jīng)過分泌通路時(shí)從成熟蛋白質(zhì)上切下信號序列。信號序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)如從轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體的真核宿主中分泌，并且隨后或同時(shí)切割信號序列。然后可以通過已知方法，從細(xì)胞外介質(zhì)中容易地純化蛋白質(zhì)?；蛘?，可以使用簡化純化的序列(如具有GST結(jié)構(gòu)域)，將信號序列與感興趣的蛋白質(zhì)連接。因此，例如編碼多肽的序列可以與簡化融合多肽純化的標(biāo)記序列(如編碼肽的序列)融合。在本發(fā)明這一方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是六-組氨酸肽，如pQE載體(Qiagen，Inc.)中提供的標(biāo)簽，以及其它，其中許多可商業(yè)獲得。例如如Gentzetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824(1989)中所述，六-組氨酸提供了融合蛋白的便利純化。HA標(biāo)簽是可用于純化的另一種肽，其對應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白的表位，由例如Wilsonetal.,Cell37767(1984)描述。優(yōu)選地，通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段按照讀碼框連接在一起，所述常規(guī)技術(shù)例如通過使用平末端或交錯(cuò)末端(stagger-endedtermini)用于連接、使用限制性酶消化來提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適當(dāng)時(shí)填平粘末端、使用堿性磷酸酶處理來避免不想要的接合，和酶促連接。在另一實(shí)施方案中，可以通過常規(guī)技術(shù)(包括自動(dòng)化DNA合成儀)合成融合基因。或者，可以使用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物在兩條相鄰的基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)性懸突，所述相鄰基因片段可隨后退火并被再擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合基因序列(參閱例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，eds.Ausubeletal.JohnWiley&Sons1992)。另外，可以商業(yè)獲得已經(jīng)編碼融合片段(例如GST多肽)的許多表達(dá)載體。編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸可以被克隆進(jìn)這樣的表達(dá)載體中，從而將融合片段與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)按照讀碼框連接。功能等同物術(shù)語“功能等同物”和“功能變體”在本文可互換使用。19根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能等同物是經(jīng)分離的多核苷酸，其與SEQIDNO:1的核苷酸序列具有至少60%、65%,70%,75%,80%,85%,優(yōu)選地至少90%的同源性，并且編碼下述多肽，所述多肽至少展示根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的一種具體功能，優(yōu)選地是具有脂解活性的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能等同物是下述多肽，其與SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少60%、65%,70%,75%,80%,85%,優(yōu)選地至少90%的同源性，并且至少展示根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的一種功能，優(yōu)選地是展示脂解活性的多肽。本文提到的功能等同物還包括具有上述脂解活性的生物活性片段。根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能等同物可含有根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，或不影響酶的具體功能的氨基酸取代、插入或缺失。因此，功能上中性的氨基酸取代是根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽中的取代，所述取代不顯著影響所述多肽的具體功能性。例如，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間保守的氨基酸殘基被預(yù)測為尤其順應(yīng)于改變。另外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其它脂解酶之間保守的氨基酸不可能順應(yīng)于改變。典型地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能核酸等同物可含有沉默突變或不改變所編碼的多肽生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸分子，所述多肽含有對于具體生物活性并非必需的氨基酸殘基改變。這類蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽差異，但仍保留其至少一種生物活性，優(yōu)選地保留脂解活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能等同物包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少約60%、65%,70%,75%,80%,85%,優(yōu)選地至少90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90%同源性的功能等同物是下述多肽(下文表示為L02)，所述多肽的氨基酸序列根據(jù)氨基酸序列根據(jù)SEQIDNO:4的成熟多肽，在另一實(shí)施方案中是下述多肽(下文表示為L03),所述多肽的氨基酸序列根據(jù)氨基酸序列根據(jù)SEQIDNO:6的成熟多肽，還在另一實(shí)施方案中是下述多肽(下文表示為L04)，所述多肽的氨基酸序列根據(jù)氨基酸序列根據(jù)SEQIDNO8的成熟多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分別根據(jù)SEQIDNO4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的氨基酸序列中的成熟多肽分別是根據(jù)SEQIDNO4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的氨基酸序列中的氨基酸序列34到304。編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明多核苷酸的功能等同物應(yīng)當(dāng)包含下述多核苷酸序列，所述多核苷酸序列與根據(jù)SEQIDNO:1的核酸序列至少約60%、65%,70%,75%,80%,85%,優(yōu)選地至少90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更同源。在一個(gè)實(shí)施方案中，與根據(jù)SEQIDNO1的多核苷酸具有至少90%同源性的功能等同物是具有根據(jù)SEQIDNO3的核苷酸序列的多核苷酸(表示為DNAL02)，在另一實(shí)施方案中是具有根據(jù)SEQIDNO5的核苷酸序列的多核苷酸(表示為DNAL03),還在另一實(shí)施方案中是具有根據(jù)SEQIDNO:7的核苷酸序列的多核苷酸(表示為DNAL04)。根據(jù)SEQIDNO:3的多核苷酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO:4的多肽，根據(jù)SEQIDNO5的多核苷酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO6的多肽，根據(jù)SEQIDNO7的多核苷酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO:8的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，位于SEQIDNO:3、5、7中的多核苷酸100-912分別編碼SEQIDNO4、6、8中的成熟多肽。編碼根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽同源蛋白質(zhì)的經(jīng)分離的多核苷酸可以如下產(chǎn)生向根據(jù)SEQIDNO1的編碼核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失，使得所編碼的蛋白質(zhì)中被引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。這類突變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變來引入。因此，下述編碼具有脂解活性的其它家族成員的核酸屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，其具有與SEQIDNO:1、3、5、7不同的核苷酸序列并且滿足上述條件。另外，編碼具有脂解活性的蛋白質(zhì)的核酸屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述蛋白質(zhì)具有與氨基酸序列SEQIDNO2、4、6、8中成熟多肽不同的氨基酸序列并且滿足上述條件。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以優(yōu)化其密碼子使用，優(yōu)選地根據(jù)W02006/077258和/或W02008/000632中所述方法進(jìn)行。W02008/000632涉及密碼子對優(yōu)化。密碼子對優(yōu)化是這樣一種方法，其中在密碼子使用方面修飾編碼多肽的核苷酸序列，尤其是使用的密碼子對，來獲得編碼多肽的核苷酸序列提高的表達(dá)和/或所編碼多肽的提高的生產(chǎn)。密碼子對被定義為編碼序列中一組兩個(gè)相繼的三聯(lián)體(密碼子)?？梢愿鶕?jù)它們與本文公開的核酸的同源性，使用本文公開的CDNA或其合適的片段作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)，優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下，來分離對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的變體(例如天然等位基因變體)或同源物的核酸分子。在本發(fā)明的另一方面中，提供了經(jīng)改進(jìn)的蛋白質(zhì)。經(jīng)改進(jìn)的蛋白質(zhì)是與具有根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的生物活性相比時(shí)，其中至少一種生物活性被改進(jìn)的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)可以如下獲得例如通過飽和誘變沿編碼序列SEQIDNO:1的全部或部分隨機(jī)引入突變，并可重組表達(dá)得到的突變體并針對生物活性進(jìn)行篩選。例如，本領(lǐng)域提供了測量脂解酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測定法，從而可以容易地選擇經(jīng)改進(jìn)的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有根據(jù)SEQIDNO:2中氨基酸34到304的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，多肽與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90%同源，并且保留根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中成熟多天的至少一種生物活性，優(yōu)選地保留脂解活性，并且仍由于上述天然變異或誘變而在氨基酸序列上有所差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有由下述經(jīng)分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述核酸片段與是SEQIDNO:1互補(bǔ)序列的多核苷酸雜交并且其中所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的核苷酸序列至少90%同源，優(yōu)選地在高度嚴(yán)格雜交條件下雜交。因此，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地是下述蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中成熟多肽至少約90%、91%92%93%94%,95%,96%,97%,98%,99%或更同源的氨基酸序列，并且保留根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中成熟多肽的至少一種功能活性。也可以如下文所述來鑒定根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等同物例如，針對脂解酶活性，篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體(例如截短突變體)的組合文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生有斑文庫(variegatedlibrary)?？梢酝ㄟ^例如將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列來產(chǎn)生變體的有斑文庫，從而可能的蛋白質(zhì)序列的簡并集合(degenerateset)可作為個(gè)體多肽表達(dá)，或者作為一組更大的融合蛋白表達(dá)(例如用于噬菌體展示)。存在可用于從簡并寡核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明多肽的可能變體文庫的多種方法。用于合成簡并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Narang(1983)Tetrahedron393；ltakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；ltakuraetal.(1984)Science1981056；Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.ll477)。另外，本發(fā)明多肽的編碼序列的片段文庫可以被用于產(chǎn)生有斑的多肽群，用于篩選隨后的變體選擇。例如，可以如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫在每個(gè)分子僅發(fā)生約一次切割的條件下用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，將DNA復(fù)性形成雙鏈DNA(其可包含來自被不同切割的產(chǎn)物的有義/反義對)，通過用Sl核酸酶處理從再形成的雙鏈體上去除單鏈部分，并將得到的片段文庫連接進(jìn)表達(dá)載體中。通過該方法，可以得到下述表達(dá)文庫，所述表達(dá)文庫編碼感興趣的蛋白質(zhì)的不同大小的N-末端和內(nèi)部片段。本領(lǐng)域已知有若干種技術(shù)可用于篩選組合文庫(其通過截短的點(diǎn)突變制造)的基因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫以獲得具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫的、適用于高通量分析的、最廣泛使用的技術(shù)典型地包括將基因文庫克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體中，用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，和在下述條件下表達(dá)組合基因，所述條件下想要的活性的檢測簡化編碼基因(其產(chǎn)物被檢測)的載體的分離。循環(huán)總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis,REM),一種增強(qiáng)文庫中功能突變體頻率的技術(shù)，可以與篩選實(shí)驗(yàn)組合使用以鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897811-7815；Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3)327-331)。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為PCR反應(yīng)的探針或引物作用。根據(jù)本發(fā)明的核酸無論是編碼功能多肽還是無功能的多肽，均可被用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有根據(jù)本發(fā)明的脂解活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途尤其包括(1)從cDNA文庫分離編碼蛋白質(zhì)的基因或其等位基因變體；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供基因的精確染色體定位，如Vermaetal.，HumanChromosomesaManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)所述；(3)Northern印跡分析，用于檢測mRNA在特定組織中的表達(dá)；和4)能夠被用作診斷工具來分析給定的生物(例如組織)樣品中核酸存在的探針和引物，所述核酸能與探針雜交。本發(fā)明還包括獲得根據(jù)本發(fā)明的基因的功能等同物的方法。這類方法需要獲得被標(biāo)記的含有被分離的核酸的探針，所述被分離的核酸編碼根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中成熟多肽的蛋白質(zhì)序列或其中任何的變體的全部或部分；在允許探針與文庫中的核酸片段雜交從而形成核酸雙鏈體的條件下，用被標(biāo)記的探針篩選核酸片段文庫，和從任何被標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備全長的基因序列，以獲得與根據(jù)本發(fā)明的基因基因相關(guān)的基因。宿主細(xì)胞在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或包含根據(jù)本發(fā)明的載體的細(xì)胞，例如經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組的宿主細(xì)胞?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”是其中(或其祖先中)已經(jīng)借助于重組DNA技術(shù)引入了本發(fā)明核酸的細(xì)胞。原核和真核細(xì)胞均包括在內(nèi)，例如細(xì)菌、真菌、酵母等等。宿主細(xì)胞還包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如CHO、VERO>BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡(luò)叢細(xì)胞系。公眾可獲得適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大量載體，用于構(gòu)件這類細(xì)胞系的方法也是公眾在例如Ausubeletal.(上文)中已知的。特別優(yōu)選的是來自絲狀真菌(尤其是Aspergillus物種如Aspergillusniger或oryzae或awamori)的細(xì)胞。可選用調(diào)控插入序列表達(dá)并以特異的、期望的方式加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)揮最佳功能。多種宿主細(xì)胞具有用于翻譯前加工和修飾蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的特性和特異機(jī)制?？蛇x用分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對所生產(chǎn)的外源蛋白質(zhì)的想要的和正確的修飾與加工。為此，可以使用具有下述細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞機(jī)制用于適當(dāng)?shù)丶庸ぴ嫁D(zhuǎn)錄本、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物。這類宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。如果需要的話，可以在根據(jù)本發(fā)明的多肽制劑中使用上述細(xì)胞。這樣的方法典型地包含在提供編碼多肽的編碼序列(的載體)表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞(例如用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的)，并任選地從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收、更優(yōu)選地回收和純化產(chǎn)生的多肽。可以將本發(fā)明的多核苷酸并入重組可復(fù)制載體例如表達(dá)載體中?？梢允褂幂d體在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下制造本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體中，將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞中，并在使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。可以從所述宿主細(xì)胞中回收載體。優(yōu)選地，多肽作為分泌型蛋白質(zhì)被生產(chǎn)，在這種情況下，表達(dá)構(gòu)建體中編碼多肽成熟形式的核苷酸序列與編碼信號序列的核苷酸序列可操作地連接。優(yōu)選地，信號序列對編碼多肽的核苷酸序列而言是天然的(同源的)?；蛘?，信號序列對編碼多肽的核苷酸序列而言是外來的(異源的)，在這種情況下信號序列優(yōu)選地對其中表達(dá)本發(fā)明核苷酸序列的宿主細(xì)胞而言是內(nèi)源的。對酵母宿主細(xì)胞而言合適的信號序列的例子是衍生自酵母a-因子基因的信號序列。類似地，對絲狀真菌宿主細(xì)胞而言合適的信號序列是例如衍生自絲狀真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如AigerglaA基因的信號序列。這可與淀粉糖苷酶(也稱作(葡糖)淀粉酶)啟動(dòng)子自身組合使用，以及與其它啟動(dòng)子組合使用。在本發(fā)明上下文中也可以使用雜種信號序列。優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列是來自于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-例如來自Aspergillus的18和24個(gè)氨基酸版本)、α-因子基因(酵母，例如Saccharomyces禾口Kluyveromyces)或α-淀粉酶基因(Bacillus)的分泌前導(dǎo)序列?？扇缟衔乃鰧⑤d體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞中，以提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。該方法可包括在提供編碼本發(fā)明多肽的編碼序列的載體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞用如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明因此提供了用本發(fā)明多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述多核苷酸在用于復(fù)制和表達(dá)多核苷酸的載體中載有。應(yīng)選擇與所述載體相容的細(xì)胞，并且其可以是原核(例如細(xì)菌)、真菌、酵母或植物細(xì)胞。也可選擇下述異源宿主，其中以基本不含可能干擾應(yīng)用的酶活性(例如不含淀粉降解酶、纖維素降解酶或半纖維素降解酶)的形式生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這可通過選擇通常不生產(chǎn)這類酶的宿主來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明包括通過編碼多肽的DNA序列的重組表達(dá)來生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。就這一目的而言，本發(fā)明的DNA序列可用于基因擴(kuò)增和/或改變表達(dá)信號如啟動(dòng)子、分泌信號序列，從而允許合適同源或異源宿主細(xì)胞中多肽的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。同源宿主細(xì)胞是下述宿主細(xì)胞，其與DNA序列衍生自的物種是相同物種或是相同物種內(nèi)的變體。合適的宿主細(xì)胞優(yōu)選地是原核微生物如細(xì)菌，或更優(yōu)選地是真核生物，例如真菌，如酵母或絲狀真菌，或植物細(xì)胞。通常，酵母細(xì)胞是超過真菌細(xì)胞優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兏子诓僮?。然而，一些蛋白質(zhì)在酵母中分泌較差，或者在一些情況下不被正確加工(例如酵母中的超糖基化)。在這些情況下，應(yīng)當(dāng)選擇真菌宿主生物。宿主細(xì)胞可過表達(dá)多肽，并且用于進(jìn)行過表達(dá)的技術(shù)是公知的。宿主細(xì)胞因此可具有兩個(gè)或更多拷貝的編碼多核苷酸(因此載體可相應(yīng)地具有兩個(gè)或更多拷貝)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞能夠表達(dá)或過表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或載體。根據(jù)本發(fā)明，可以通過在常規(guī)營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)，所述宿主細(xì)胞已用本發(fā)明的一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)化。可以使用本領(lǐng)域已知的方案培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞。對于啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每種組合而言，可以獲得有助于編碼多肽的DNA序列表達(dá)的培養(yǎng)條件。達(dá)到期望的細(xì)胞密度或多肽滴度后，終止培養(yǎng)并使用已知方案回收多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)、有機(jī)氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、胨等)和無機(jī)養(yǎng)分來源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等)的已知培養(yǎng)基。對適當(dāng)培養(yǎng)基的選擇可基于表達(dá)宿主的選擇和/或表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)節(jié)需求。這類培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。需要時(shí)，培養(yǎng)基可含有額外的成分，所述額外成分偏好經(jīng)轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主超過可能的污染性微生物。發(fā)酵可以在0.5-30天的時(shí)間段中進(jìn)行。其可以是分批、連續(xù)或進(jìn)料-分批的過程，適當(dāng)?shù)卦诶鐝募s0°C到45°C的溫度范圍內(nèi)和/或從約2到約10的pH下進(jìn)行。優(yōu)選的發(fā)酵條件是從約20°C到約37°C范圍內(nèi)的溫度和/或從約3到約9的pH。適當(dāng)?shù)臈l件通?；诒磉_(dá)宿主的選擇和要生產(chǎn)的蛋白質(zhì)來選擇。發(fā)酵后，需要時(shí)可以通過離心或過濾從發(fā)酵液中去除細(xì)胞。發(fā)酵終止或去除細(xì)胞后，可以通過常規(guī)手段回收和需要時(shí)純化與分離本發(fā)明的多肽。脂解酶在工業(yè)過程中的用途本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的脂解酶在大量工業(yè)過程中的用途。盡管用這些過程獲得了長期的經(jīng)驗(yàn)，但是根據(jù)本發(fā)明的脂解酶具有超出目前所用酶的大量顯著優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)特定的應(yīng)用，這些優(yōu)點(diǎn)可包括下述方面，如更低的生產(chǎn)成本、更高的底物特異性、更低的抗原性、更少的不想要的副活性、在合適的微生物中生產(chǎn)時(shí)更高的產(chǎn)率、更合適的pH和溫度范圍、更好的最終產(chǎn)物味道以及食物級別和猶太教規(guī)方面(kosheraspect)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽可用于食品工業(yè)，更優(yōu)選地用于食品制造中。乳制品應(yīng)用在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可用于乳制品工業(yè)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽用于乳制品(優(yōu)選地乳酪、乳酪樣制品、EMC)或乳脂肪衍生的無脂肪酸混合物的制造中，優(yōu)選地用于產(chǎn)生和/或強(qiáng)化乳制品的香味。在本發(fā)明的上下文中，“乳制品”是指任何種類的基于乳的制品，包括但不限于乳酪、黃油、EMC、奶油、乳制品類似物等。本發(fā)明上下文中特別感興趣的是含乳脂肪的制品及其等同物，包括常規(guī)乳酪、乳酪類似物、經(jīng)加工的乳酪、黃油、涂抹物、人造黃油、EMC等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乳制品為乳酪。乳酪可以是任何變種，例如硬乳酪如Chester、Danbo>Manchego>SaintPaulin>Cheddar、Monterey、Colby、Edam、Gouda>Muenster>Swisstype、Gruyere>Emmenthaler>Parmesan>Pecorino>Provolone禾口Romano;凝乳乳酪如Feta、帕斯塔費(fèi)拉塔乳酪(pastafilatacheese)如Mozzarella；經(jīng)加工的乳酪；白霉乳酪(whitemouldcheese)如Brie和Camembert；或藍(lán)霉乳酪(bluemouldcheese)如Gorgonzola和Danish藍(lán)乳酪，或新鮮乳酪如例如Ricotta、奶油乳酪、Neufchatel或Cottage乳酪。本發(fā)明上下文中優(yōu)選的乳酪類型是Parmesan、Pecorin、Provolone>Romano、Feta。術(shù)語“乳類似物”是指乳樣制品，其含有脂肪(例如乳脂(例如奶油))作為組合物的部分，并且還含有非乳成分例如植物油作為組合物的部分。本發(fā)明還涉及制備乳制品的方法，其中向用于生產(chǎn)乳制品的乳組合物中添加根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的多肽。在本發(fā)明的上下文中，乳組合物可以是包含乳和/或一種或多種乳組分和/或乳級分的組合物，所述組合物是根據(jù)本發(fā)明的乳制品生產(chǎn)中的起始組合物，其可以是乳制品生產(chǎn)中的中間產(chǎn)物(例如凝乳或乳清)。乳組合物是脂解酶的合適底物，因此乳組合物應(yīng)包含至少一種乳脂肪和/或其它脂肪，例如衍生自植物的脂肪。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶能夠催化乳組合物中存在的甘油三酯的酯鍵水解，因此它們具有脂肪酶活性。甘油三酯是甘油和脂肪酸的酯。甘油三酯(也稱作三?；视突蛉；视王?主要存在于植物油和動(dòng)物脂肪中。脂肪酶(EC3.1.1.3)在本文中定義為從脂質(zhì)上水解一個(gè)或多個(gè)脂肪酸的酶，更特定地，它們水解脂肪酸和甘油羥基之間的酯鍵。乳組分可以是乳的任何成分，如乳脂、乳蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、乳糖。乳級分可以是乳的任何級分，例如脫脂乳、酪乳、乳清、奶油、黃油、通過超濾處理的乳、乳粉、全乳粉、酪乳粉或脫脂乳粉。在本發(fā)明的上下文中，乳可以是任何哺乳動(dòng)物的乳糜管分泌物。因此，可通過對例如奶牛、綿羊、山羊、水牛或駱駝擠奶獲得乳。用本發(fā)明這一方面方法生產(chǎn)的乳制品可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適工藝生產(chǎn)，并且可以在足以使酶顯示其直接活性的合適條件(例如酶濃度、溫度和時(shí)間)下，在乳制品生產(chǎn)期間的任何合適步驟中，向乳制品中添加脂解酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法是用于乳酪生產(chǎn)的方法。在這種情況下，所述方法應(yīng)包括下述步驟，其中通過使用粗制凝乳酶(rennet)的乳組合物的酶促凝固，或者通過食品級別酸或乳酸細(xì)菌生長產(chǎn)生的酸的酸性凝固，形成凝乳，并隨后將凝乳與乳清分離。根據(jù)要生產(chǎn)的乳酪類型，乳酪的生產(chǎn)可還包含凝乳的加工和得到的乳酪的陳化(aging)。根據(jù)本發(fā)明的這一方面生產(chǎn)乳酪的方法應(yīng)優(yōu)選地包括得到的乳酪的陳化?？梢栽谌槔抑苽涞亩鄠€(gè)階段向乳組合物添加脂解酶。優(yōu)選地，在添加凝固劑(例如凝乳酶)之前或一起對乳添加酶。在此時(shí)添加確保酶在乳酪各處均勻分布。或者可以在更晚的階段添加酶，例如對凝乳添加，但是這引入了乳酪中酶不均勻分布的風(fēng)險(xiǎn)。因此，優(yōu)選對乳添加酶。在另一實(shí)施方案中，生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳制品的方法是制造乳脂肪衍生的游離脂肪酸混合物，所述混合物通過乳脂肪(例如黃油脂肪或奶油)的水解獲得，得到游離脂肪酸混合物，并可被用于例如在藍(lán)色乳酪香味中調(diào)味。這些游離脂肪酸混合物可在其它制品例如涂抹物、湯、調(diào)味汁、點(diǎn)心、薯片、玉米片等的生產(chǎn)中用作香料。其它脂肪酶應(yīng)用包括在經(jīng)修飾的乳粉中的用途(KilarainEncyclopediaofDairySciences,(2003；Foxetalleds，AcademicPress)pp.914-918)。在又一實(shí)施方案中，生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳制品的方法是生產(chǎn)EMC的方法。在這種情況下，所述方法典型地可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件進(jìn)行(參閱例如Ch.2.12inIndustrialEnzymology,2ndEd.,Godfrey,West,Eds,MacMillanPress,London,1996；WilkinsonetalinEncyclopediaofDairySciences，(2003;Foxetalleds，AcademicPress)pp.434-438)。在上述方法任一中要添加的酶量應(yīng)取決于酶活性和最終產(chǎn)物中期望的香味作用。應(yīng)用中要添加的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用劑量應(yīng)答曲線決定。在這一途徑中，對乳組合物添加遞增量的酶，隨后由經(jīng)過培訓(xùn)的品嘗小組(trainedtastepanel)分析最終產(chǎn)物中香味譜的強(qiáng)度。在根據(jù)本發(fā)明的用途或生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳制品的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶被用于產(chǎn)生和/或強(qiáng)化香味。乳制品生產(chǎn)中的香味發(fā)生歸因于酶(無論由乳制品生產(chǎn)期間使用的微生物生產(chǎn)，或是在制造期間特定地添加)的作用以及其它，更特定地歸因于脂解酶和蛋白水解酶。脂解酶負(fù)責(zé)乳制品中存在的乳脂肪的水解，和隨后制品中游離脂肪酸混合物(下文稱作FFA)的釋放。游離脂肪酸混合物的組成部分造成乳制品的最終香味。從含有乳脂肪的底物開始，脂解酶會生產(chǎn)含C4到C18的游離脂肪酸的特定FFA混合物，其中混合物中每種組分的相對量會取決于酶對下述特定甘油三酯酯鍵水解的特異性，所述酯鍵涉及甘油三酯中存在的含C4到C18脂肪酸。例如，對含C4脂肪酸具有高度特異性的脂解酶會優(yōu)先水解具有含C4脂肪酸而不是含C6到C18脂肪酸的三甘油片段的甘油三酯鍵，并且與含C6到C18的游離脂肪酸的相對含量相比，混合物中含C4的游離脂肪酸的相對含量會更高。另外，混合物中每種成分的相對量也應(yīng)取決于起始底物和其中存在的甘油三酯的組成。因?yàn)槊糠N脂肪酸負(fù)責(zé)貢獻(xiàn)給予產(chǎn)物特定的香味特征，所以在足以使酶反應(yīng)的酶濃度、溫度和時(shí)間條件下對含特定乳脂肪的底物進(jìn)行脂解酶作用時(shí)，產(chǎn)生特定的FFA混合物，得到底物中特定的香味譜。可以在每種酶使用相同底物時(shí)，通過測定FFA譜將若干脂解酶對游離脂肪酸釋放的特異性彼此比較，并且因此可將所產(chǎn)生的香味譜彼此比較。FFA譜給出相對于脂解酶對底物作用所釋放的游離脂肪酸總量而言，每種含C4到C18的游離脂肪酸的相對量。FFA譜通常會取決于起始底物、脂解酶對脂質(zhì)組合物中脂肪酸組分的特異性。如下計(jì)算脂肪轉(zhuǎn)化程度(D)(以％為單位表述)D=[(用脂解酶處理過的組合物中FFA的總量)_(未經(jīng)處理的組合物中FFA的總量)]/(組合物中存在的總脂肪酸)。FFA的總量和脂肪酸的總量以mol/kg底物為單位表述。實(shí)施例中描述了從底物開始測定FFA譜的合適方法。與更長鏈脂肪酸(即含C12到C18的游離脂肪酸)相比時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶優(yōu)選地對短鏈游離脂肪酸(即含C4到ClO的游離脂肪酸，優(yōu)選地含C4的游離脂肪酸)的釋放具有更高的特異性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與含C12到C18的游離脂肪酸相比，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶對含C4到ClO游離脂肪酸的特異性程度通過特異性比例(RspJ表述時(shí)至少為0.7，優(yōu)選地至少0.8、0.9、1、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3。通常Rspec應(yīng)當(dāng)盡可能高地獲得?？扇缦掠?jì)算Rspec:Rspec=Σ相對C4-C10含量/Σ相對C12-C18含量。其中“Σ相對C4-C10含量”是用脂解酶處理過的組合物中存在的含C4、含C6、含C8和含ClO的游離脂肪酸的相對含量的總和，并且其中“Σ相對C12-C18含量”是用脂解酶處理過的組合物中存在的含C12、含C14、含C16和含C18的游離脂肪酸的相對含量的總和。“相對Cx含量”(其中X可以是4、6、8、10、12、14、16、18任一)對應(yīng)于用脂解酶處理過的組合物中含Cx的游離脂肪酸量相對于用脂解酶處理過的組合物中存在的游離脂肪酸總量的百分比(％)。上述式中FFA(或游離脂肪酸)量以mol/kg為單位表述。在使用初期乳酪(優(yōu)選地為Cheddar或Gouda乳酪，優(yōu)選地熟化時(shí)間少于2周的初期乳酪)制造的下述乳制品組合物中測定Rspto,所述乳制品組合物在導(dǎo)致被孵育樣品中包含的脂肪轉(zhuǎn)化率程度在5%-25%之間的條件(如劑量、孵育時(shí)間和孵育溫度)下用脂解酶孵育，其中所述脂肪轉(zhuǎn)化程度如上文所述計(jì)算。本發(fā)明還涉及能夠通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乳制品。在根據(jù)本發(fā)明的任何經(jīng)分離的多肽的用途或生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳制品的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Σ相對C4-C10含量/Σ相對C12-C18含量至少為0.7，優(yōu)選地至少為0.8、0.9、1、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3。在例如用反芻動(dòng)物前胃酯酶處理的Parmesan乳酪中，該比例約為1.7(從來自D.T丄ai，A.D.Mackenzie,C.J.O，Connor,K.W.TurnerJ.DairySci.802249-2257(1997)，page2255的數(shù)據(jù)計(jì)算)?！跋鄬4-C10含量”和“Σ相對C12-C18”具有與上文相同的含義。本領(lǐng)域已知作用于含乳脂肪底物的脂解酶主要釋放短鏈脂肪酸(例如含C4和C6的脂肪酸)，這導(dǎo)致產(chǎn)生辛辣(piquant，spicy)、尖銳、強(qiáng)烈的香味，而例如中鏈脂肪酸的釋放可以導(dǎo)致肥皂樣的口味。因此在本發(fā)明的用途或生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳制品的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乳制品香味譜中尖銳、強(qiáng)烈、辛辣的香調(diào)被提高，優(yōu)選地乳制品香味譜中的肥皂樣香調(diào)被降低。在另一方面中，本發(fā)明涉及能夠通過制備根據(jù)本發(fā)明的乳制品的方法獲得的乳制品。合適的乳制品的例子是本發(fā)明前述方面中提到的例子。烘焙應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的脂解酶在食物中的工業(yè)應(yīng)用的另一例子是其在烘焙應(yīng)用中改進(jìn)面團(tuán)和/或烘焙制品品質(zhì)的用途。驚訝地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可作用于烘焙應(yīng)用中的若干類型的脂質(zhì)，包括甘油酯(例如甘油三酯)、磷脂或糖脂，如半乳糖脂。更特定地，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶在面團(tuán)中使用時(shí)原位顯示至少一種以下特性·對非極性脂質(zhì)相對低的活性?！O性二?；鵢脂質(zhì)、至少對二?；肴樘侵鄬Ω叩幕钚浴O性單?；衔锶缛苎肴樘侵?lysogalactolipids)和溶血磷脂(Iysophospholipids)相對低的活性。發(fā)現(xiàn)作為面團(tuán)中化學(xué)乳化劑的替代物使用時(shí)，這些出乎意料的特性極度有利。甘油酯和脂肪酶已在上文定義。糖脂(例如半乳糖脂)由甘油主鏈與外部(sn-Ι)和中間(sn-2)位置中兩個(gè)經(jīng)酯化的脂肪酸組成，同時(shí)第三個(gè)羥基與糖殘基結(jié)合，如在半乳糖脂的情況下與半乳糖結(jié)合，例如為單半乳糖基甘油二酯或二半乳糖基甘油二酯。半乳糖脂肪酶(EC3.1.1.26)催化Ot-I和sn-2位置中一個(gè)或兩個(gè)脂肪?；謩e從半乳糖基甘油二酯上水解。磷脂由甘油主鏈與外部(sn-Ι)和中間(sn-2)位置中兩個(gè)經(jīng)酯化的脂肪酸組成，同時(shí)甘油的第三個(gè)羥基用磷酸酯化。磷酸可隨后被酯化為例如氨基醇，如乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)、膽堿(磷脂酰膽堿)。磷脂酶在本文中被定義為參與磷脂中一個(gè)或多個(gè)鍵水解的酶?？梢詤^(qū)分若干類型的磷脂酶活性，它們水解連接脂肪?；闻c甘油主鏈的酯鍵·磷脂酶Al(EC3.1.1.32)和A2(EC3.1.1.4)分別催化來自二酰基甘油磷脂中sn-Ι和位置中的一個(gè)脂肪?；拿擋；饔?，產(chǎn)生溶血磷脂。這是乳化劑替代物的期望活性。·溶血磷脂酶(EC3丄1.5，也被生物化學(xué)和分子生物學(xué)國際聯(lián)盟命名協(xié)會稱作磷脂酶B(EnzymeNomenclature，AcademicPress,NewYork,1992))催化溶血磷脂中剩余脂肪?；乃?。已報(bào)道了來自Penicilliumnotatum(Saitoetal.，1991，MethodsinEnzymology197446-456)的磷脂酶B，其催化來自二?；视土字袃蓚€(gè)脂肪酸的脫酰基作用，并且本質(zhì)上具有溶血磷脂酶活性。對于乳化劑替代而言較不期望使用溶血磷脂酶，因?yàn)檫@會導(dǎo)致極性頭和非極性尾組合的缺失，使得到的產(chǎn)物不能夠影響表面特性。驚訝地顯示，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶在面團(tuán)中顯示相對低的溶血磷脂酶活性。小麥粉含有約2.2-2.9%的脂質(zhì)。面粉脂質(zhì)可以被分為淀粉脂質(zhì)(0.8_0.9%)和非淀粉脂質(zhì)(1.4-2.0%)。而淀粉脂質(zhì)主要由極性溶血脂質(zhì)組成，非淀粉脂質(zhì)由約40%的中性甘油三酯和40%的極性磷脂和糖脂組成。為了優(yōu)化面粉脂質(zhì)級分，能夠通過添加根據(jù)本發(fā)明的脂肪酶，使根據(jù)本發(fā)明的脂肪酶能夠在面團(tuán)中原位水解極性脂質(zhì)，即磷脂和糖脂，更特定地為半乳糖脂?？梢栽诙喾N烘焙制品中使用烘焙酶。術(shù)語“烘焙制品”在本文中被定義為包括面包制品，如模制面包(tinbread)、面包塊(loavesoftread)、法式面包以及小型法式面包(Frenchroll)、層壓面團(tuán)制品(laminateddoughproducts)如丹麥糕餅(Danishpastry)、牛角面包(croissants)或酥餅制品(puffpastryproducts)、蛋糕、派、瑪芬、酵母制成品(yeastraised)和蛋糕甜甜圈(cakedoughnuts)等。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可例如用于烘焙制品中。烘焙制品例如面包由面團(tuán)制成。因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的多肽在面團(tuán)制備中的用途，和提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的面團(tuán)。本發(fā)明還提供了面團(tuán)的制備，包括對至少一種面團(tuán)成分添加根據(jù)本發(fā)明的多肽的步驟。面團(tuán)通常由基本成分(小麥)粉、水和任選地鹽制成。取決于烘焙制品，添加的其它成分為糖、香料等。對發(fā)酵劑制品而言，在化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)之后主要使用面包酵母(baker'syeast),所述化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)如酸(產(chǎn)酸化合物)和碳酸氫鹽的組合。酵母、酶和化學(xué)添加劑一般分別向面團(tuán)中添加?？梢砸愿稍?例如顆粒形式)或液體形式添加酶。大部分情況下化學(xué)添加劑以粉末形式添加。另外，針對特定烘焙應(yīng)用定制的加工助劑組合物可由化學(xué)添加劑和酶的專用混合物組成。從上述成分和加工助劑制備面團(tuán)是本領(lǐng)域公知的，并且包括將所述成分和加工助劑混合，和一個(gè)或多個(gè)成形和發(fā)酵步驟。從這類面團(tuán)制備烘焙制品也是本領(lǐng)域公知的，并可包括面團(tuán)的成型和整形還有發(fā)酵，之后在需要的溫度和烘焙時(shí)間下烘焙。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備烘焙制品的方法，所述方法包括烘焙根據(jù)本發(fā)明的面團(tuán)的步驟。本發(fā)明還提供了能夠根據(jù)所述方法獲得的烘焙制品。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的烘焙制品是面包。本發(fā)明還涉及用于制備面團(tuán)或烘焙制品的方法，所述方法包括向面團(tuán)中摻入有效量的本發(fā)明的脂解酶，這相對于其中未摻入多肽的面團(tuán)或烘焙制品而言促進(jìn)面團(tuán)或得自面團(tuán)的烘焙制品的一種或多種特性。短語“摻入面團(tuán)中”在本文中定義為向面團(tuán)中、要用于制造面團(tuán)的任何成分中、和/或要制造面團(tuán)的面團(tuán)成分的混合物中添加根據(jù)本發(fā)明的脂解酶。換言之，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可以在面團(tuán)制備的任何步驟中被添加，并可以在一個(gè)、兩個(gè)或更多步驟中被添加。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶被添加進(jìn)面團(tuán)的成分中，所述成分使用本領(lǐng)域公知的方法被揉捏和烘焙以制造烘焙制品。參閱例如U.S.專利No.4,567,046、EP-A-426,211、JP-A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。術(shù)語“有效量”在本文中定義為根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的下述量，所述量足夠?qū)γ鎴F(tuán)和/或烘焙制品的至少一個(gè)感興趣的特性提供可測量的作用。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的特性”在本文中定義為面團(tuán)和/或得自面團(tuán)的制品(尤其是烘焙制品)的任何特性，所述特性相對于其中未摻入本發(fā)明脂解酶的面團(tuán)或產(chǎn)物而言被本發(fā)明的脂解酶的作用改進(jìn)。經(jīng)改進(jìn)的特性可包括但不限于提高的面團(tuán)強(qiáng)度、提高的面團(tuán)彈性、提高的面團(tuán)穩(wěn)定性、降低的面團(tuán)粘稠度、提高的面團(tuán)延展性、經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)可加工性、提高的烘焙制品體積、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品香味、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品的碎屑結(jié)構(gòu)、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品的碎屑柔軟性、降低的烘焙制品起泡和/或經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品抗腐性?？梢愿鶕?jù)以下實(shí)施例中所述的本發(fā)明的方法，通過將添加和不添加本發(fā)明多肽而制備的面團(tuán)和/或烘焙制品進(jìn)行比較，來測定經(jīng)改進(jìn)的特性。感覺品質(zhì)可以使用烘焙工業(yè)中明確的流程來評價(jià)，并可包括例如使用一組受過訓(xùn)練的口味測試人員(apaneloftrainedtaste-testers)。術(shù)語“提高的面團(tuán)強(qiáng)度”在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)一般具有更具彈性的特性和/或需要更多的勞動(dòng)輸入來用模具成形和造型。術(shù)語“提高的面團(tuán)彈性”在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)具有在經(jīng)受過某些物理張力之后恢復(fù)其原始形狀的更高趨勢。術(shù)語“提高的面團(tuán)穩(wěn)定性”在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)對機(jī)械損傷更不敏感，因此更好地維持其形狀和體積，并且通過正常和/或延長的醒發(fā)后面包塊橫斷面的高度寬度比例來評價(jià)。術(shù)語“降低的面團(tuán)粘稠度”在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)具有更小的與表面(例如在面團(tuán)生產(chǎn)機(jī)器中)粘附的趨勢，并如本領(lǐng)域所已知的，由熟練的測試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評價(jià)或通過使用紋理分析儀(例如TAXT2)測量。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)延展性”在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)可以接受提高的張力或拉伸而不破裂。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)可加工性”在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)一般更不粘和/或更堅(jiān)硬和/或更有彈性。術(shù)語“提高的烘焙制品的體積”被測量為通過自動(dòng)化面包體積分析儀(例如BVM-3,TexVolInstrumentsAB，Viken,瑞典)測定的給定的面包塊的體積，所述測定使用本領(lǐng)域已知的超聲或激光檢測。術(shù)語“降低的烘焙制品起泡”在本文中定義為目測的烘焙面包外皮上起泡的降低。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品面包屑結(jié)構(gòu)”在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品的面包屑中具有更精細(xì)和/或更薄的細(xì)胞壁和/或細(xì)胞在面包屑中更均一/均勻的分布，并通常由烘焙者視覺評價(jià)或者通過本領(lǐng)域已知的數(shù)字成像分析(例如C-cell，CalibreControlInternationalLtd,Appleton,Warrington,UK)來評價(jià)。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品柔軟性”是“硬度”的反義詞，并在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品更容易被壓縮，并且如本領(lǐng)域已知由熟練的測試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評價(jià)或通過使用紋理分析儀(例如TAXT2)測量。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品香味”由受過訓(xùn)練的測試組評價(jià)。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品抗腐性”在本文中被定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品儲存期間具有降低的品質(zhì)參數(shù)(例如柔軟度和/或彈性)衰退速率。術(shù)語“經(jīng)改進(jìn)的脆性”在本文中定義為烘焙制品的下述特性，所述特性給予比本領(lǐng)域已知的參照制品更脆的感覺，以及將該更脆的感覺維持比參照制品更長的時(shí)間。這一特性可以如下定量使用例如紋理分析儀TA-XTPlus(StableMicroSystemsLtd,Surrey,UK)在壓縮實(shí)驗(yàn)中測量力比距離的曲線，并從該壓縮曲線獲得物理參數(shù)，即(i)第一峰的力，(ii)第一峰的距離，(iii)初始斜率，Gv)最高峰的力，(ν)曲線下面積，和(Vi)斷裂事件量(力降低大于某一預(yù)定值)。經(jīng)改進(jìn)的脆性讀數(shù)是第一峰的更高力，第一峰的更短距離，更高的初始斜率，更高的最高峰力，更高的曲線下面積和更大的斷裂事件數(shù)。更脆的制品與參照制品相比時(shí)應(yīng)當(dāng)在至少兩個(gè)這些參數(shù)上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的更好的評分。在本領(lǐng)域中，“脆性”還涉及脆性、易碎性(cranchiness)或硬性(crustiness)，表示具有松脆、易碎或硬性斷裂行為的材料。本發(fā)明提供了具有至少一種選自下組的經(jīng)改進(jìn)特性的根據(jù)本發(fā)明的面團(tuán)，所述組由面團(tuán)的提高的強(qiáng)度、提高的彈性、提高的穩(wěn)定性、降低的粘稠度和/或經(jīng)改進(jìn)的延展性組成。本發(fā)明還提供了具有提高的塊體積的根據(jù)本發(fā)明的烘焙制品。本發(fā)明同樣提供了具有至少一種選自下組的經(jīng)改進(jìn)特性的根據(jù)本發(fā)明的烘焙制品，所述組由提高的體積、經(jīng)改進(jìn)的香味、經(jīng)改進(jìn)的碎屑結(jié)構(gòu)、經(jīng)改進(jìn)的碎屑柔軟性、經(jīng)改進(jìn)的脆性、降低的起泡和/或經(jīng)改進(jìn)的抗腐性組成。術(shù)語“面團(tuán)”在本文中定義為面粉和其它成分的混合物，所述混合物足夠堅(jiān)硬到被揉捏或滾動(dòng)。面團(tuán)可以是新鮮的、冷凍的、預(yù)先暴露的(pre-bared)或預(yù)先烘焙的。冷凍面團(tuán)的制備由KuIpandLorenz在FrozenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。術(shù)語“烘焙制品”在本文中定義為從面團(tuán)制備的、具有軟或脆特征的任何制品?？捎欣赜杀景l(fā)明生產(chǎn)的烘焙制品(無論是白色、淺色或深色類型)的例子為面包(尤其是白面包、全麥面包或裸麥面包)，典型地以棍或卷(loavesorrolls)的形式，法棍面包，糕餅，牛角面包，意大利面，面條(煮或(炒)炸的)，皮塔(pita)面包，玉米餅(tortillas),墨西哥玉米卷，蛋糕，煎餅，餅干，曲奇，甜甜圈，百吉餅(bagles)，餡餅皮(piecrust),饅頭和脆面包(crispbread)等等。本發(fā)明的脂解酶和/或本發(fā)明方法中要使用的其它酶可以是適用于所述用途的任何形式，例如干粉、凝聚的粉末、顆粒(尤其是無塵顆粒)、液體(尤其是經(jīng)穩(wěn)定的液體)或受保護(hù)的酶(如W001/11974和W002/26044中所述)的形式?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法制備顆粒和凝聚的粉末，例如通過將根據(jù)本發(fā)明的脂解酶噴霧在流動(dòng)床顆粒劑上的運(yùn)載體上。運(yùn)載體可由顆粒核心組成，所述顆粒核心具有合適的顆粒大小。運(yùn)載體可以是可溶的或不溶的，例如鹽(例如NaCl或硫酸鈉)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、米粉、小麥粉、玉米粒、麥芽糖糊精、大豆。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶和/或其它酶可以含在緩釋的配方中。用于制備緩釋配方的方法是本領(lǐng)域公知的。添加營養(yǎng)學(xué)可接受的穩(wěn)定劑(如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或根據(jù)已知方法的其它有機(jī)酸)可例如對液體酶制劑加以穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶也可以被摻入包含酵母的組合物中，如EP-A-0619947、EP-A-0659344和W002/49441中公開的組合物。對于包含在面粉的預(yù)先混合物中而言，根據(jù)本發(fā)明的多肽是干燥制品(例如無塵顆粒)是有利的，而對于與液體一起被包含而言，液體形式是有利的。也可以向面團(tuán)中摻入一種或多種其它酶。因此，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的脂解酶和一種或多種其它酶的烘焙酶組合物。所述其它酶可以是任何來源，包括哺乳動(dòng)物和植物來源，優(yōu)選地為微生物(細(xì)菌、酵母或真菌)來源，并可通過本領(lǐng)域常用技術(shù)獲得。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其它酶可以是淀粉酶如α-淀粉酶(適用于提供可被酵母發(fā)酵的糖并延緩腐敗)，淀粉酶，麥芽糖淀粉酶或非麥芽糖淀粉酶，環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶，蛋白酶，肽酶尤其是外肽酶(適用于增強(qiáng)香味)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，脂肪酶(適用于修飾面團(tuán)或面團(tuán)組分中存在的脂質(zhì)從而軟化面團(tuán))，半乳糖脂肪酶，磷脂酶，纖維素酶，半纖維素酶，尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(適用于戊聚糖、更特定地是阿拉伯木聚糖的部分水解，這提高面團(tuán)的延展性)，蛋白酶(適用于削弱谷蛋白，尤其是使用硬小麥粉時(shí))，蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，例如WO95/00636中公開的蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，過氧化物酶(適用于改進(jìn)面團(tuán)的稠度)，漆酶，氧化酶，己糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，醛糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，脂肪氧化酶或L-氨基酸氧化酶(適用于改進(jìn)面團(tuán)的稠度)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法要添加一種或多種其它酶添加劑時(shí)，這些添加劑可以單獨(dú)地或與根據(jù)本發(fā)明的多肽一起，任選地作為面包改進(jìn)和/或面團(tuán)改進(jìn)組合物的組分被添力口。其它酶活性可以是上述的任何酶，并可以根據(jù)已確立的烘焙實(shí)踐確定劑量。本發(fā)明還涉及用于制備烘焙制品的方法，包括烘焙通過本發(fā)明方法獲得的面團(tuán)，以生產(chǎn)烘焙制品。烘培面團(tuán)以生產(chǎn)烘培制品可以通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的脂解酶制備層壓面團(tuán)(laminateddough)，用于具有經(jīng)改進(jìn)的脆性的烘焙制品。本發(fā)明還涉及分別通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的面團(tuán)和烘焙制品。本發(fā)明還涉及用于面團(tuán)和/或由面團(tuán)制成的烘焙制品的預(yù)混合物(例如為面粉組合物形式)，其中所述預(yù)混合物包含本發(fā)明的多肽。術(shù)語“預(yù)混合物”在本文定義為以其常規(guī)含義理解，即作為烘焙劑的混合物，一般包含面粉，其不僅可用于工業(yè)面包烘焙工廠/設(shè)施、而且也可用于零售面包房?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明的多肽或包含多肽的本發(fā)明的面包改進(jìn)和/或面團(tuán)改進(jìn)組合物與合適的運(yùn)載體(如面粉、淀粉、糖或鹽)混合來制備預(yù)混合物。預(yù)混合物可含有其它面團(tuán)改進(jìn)和/或面包改進(jìn)添加劑，例如包括上述酶的任何添加劑。本發(fā)明還涉及顆?；蚰鄯勰┬问降暮姹禾砑觿?，所述添加劑包含本發(fā)明的多肽。烘焙添加劑優(yōu)選地具有狹窄的顆粒大小分布，多于95%(按重量計(jì))的顆粒在25到500μm的范圍內(nèi)。在面團(tuán)和面包制造中，本發(fā)明可與前文定義的加工助劑組合使用，所述加工助劑如化學(xué)加工助劑，如氧化劑(例如抗壞血酸)、還原劑(例如L-半胱氨酸)、和/或乳化劑(例如DATEM、SSL和/或CSL)和/或乳化劑的任何前體，其可以是本發(fā)明的脂解酶的底物，和/或酶加工助劑如氧化還原酶(例如葡萄糖氧化酶)、多糖修飾酶(例如α-淀粉酶、半纖維素酶、分支酶等)和/或蛋白質(zhì)修飾酶(內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可被用于完全或部分代替面團(tuán)乳化劑DATEM。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明脂解酶和DATEM的烘焙組合物。DATEM是甘油單酯和甘油二酯的二乙?；剖狨サ氖鬃帜缚s寫。DATEM中的主要組分之一可以是1-硬脂酰-3-二乙?；剖；?甘油。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，烘焙組合物包含DATEM和選自LOl、L02、L03和L04的根據(jù)本發(fā)明的脂解酶。優(yōu)選地，月旨解酶是LOl或L02。驚訝地發(fā)現(xiàn)包含本發(fā)明脂解酶和DATEM的烘焙組合物對使用所述組合物制造的面團(tuán)和/或可通過烘焙所述面團(tuán)獲得的烘焙制品具有協(xié)同效應(yīng)。協(xié)同效應(yīng)可以通過制造面團(tuán)或烘焙制品，其中單獨(dú)或組合地添加DATEM或本發(fā)明脂解酶來測量?？梢员容^在一方面使用烘焙組合物，在另一方面各自以雙倍劑量單獨(dú)使用DATEM或單獨(dú)使用脂解酶，對面團(tuán)或烘焙制品的至少一種特性所產(chǎn)生的影響。在組合的效果比以雙倍劑量單獨(dú)使用DATEM和以雙倍劑量單獨(dú)使用脂解酶所產(chǎn)生的兩種效果更好時(shí)，存在協(xié)同作用。協(xié)同作用可以通過例如經(jīng)改進(jìn)的生面團(tuán)穩(wěn)定性、經(jīng)改進(jìn)的烘箱開裂(ovenspring)、經(jīng)改進(jìn)的碎屑結(jié)構(gòu)、經(jīng)改進(jìn)的碎屑顏色、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品體積來顯示。例如，在例如通過使用包含0.15%w/w(以面粉為基礎(chǔ))DATEM和0.12ppm脂解酶(即每kg面粉0.12mgBradford蛋白質(zhì)的脂解酶)的組合物制造的面團(tuán)的穩(wěn)定性比單獨(dú)使用0.3%w/wDATEM制造的面團(tuán)穩(wěn)定性更好，并且比單獨(dú)使用0.24ppm脂解酶制造的面團(tuán)的穩(wěn)定性更好時(shí)，存在協(xié)同效益。技術(shù)人員能夠容易地確定要在根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物中使用的合適的脂解酶和DATEM量。可以首先確定DATEM或脂解酶各自的最適量，從而在與既不添加DATEM又不添加脂解酶而獲得的面團(tuán)或烘焙制品的特性相比時(shí)面團(tuán)或用所述面團(tuán)生產(chǎn)的烘焙制品的一種或多種特性被改進(jìn)。然后可以在組合物中使用每種制品的30%到50%w/w的最適量，并且技術(shù)人員能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在組合物中使用何種DATEM和脂解酶比例時(shí)觀察到協(xié)同效應(yīng)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含DATEM和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的烘焙組合物在生產(chǎn)本發(fā)明的面團(tuán)或烘焙制品的方法中使用。根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物除根據(jù)本發(fā)明的脂解酶以外，可包含一種或多種用于烘焙中的加工助劑，如上文提到的那些，和/或一種或多種上述額外的酶。包含DATEM和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的烘焙組合物可以是適合在烘焙中使用的任何形式，如固體或液體形式。固體形式的組合物可以例如是粉末或顆粒。液體組合物可以例如是基于水或油的組合物，并任選地可以被穩(wěn)定化。包含根據(jù)本發(fā)明的脂解酶和DATEM的烘焙組合物也可以是上文定義的預(yù)混物的部分。包含根據(jù)本發(fā)明的脂解酶和DATEM的烘焙組合物可以原樣添加至用于制備面團(tuán)的面粉。任選地，可以通過以適當(dāng)量單獨(dú)地對面團(tuán)成分添加根據(jù)本發(fā)明的脂解酶和DATEM，在面團(tuán)中脂解形成所述烘焙組合物。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可用于生產(chǎn)蛋糕，和用于生產(chǎn)可產(chǎn)生蛋糕的牛奶雞蛋面糊(batter)。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可用于任何類型的蛋糕中，包括縮短的蛋糕，如例如磅蛋糕(poundcake)和黃油蛋糕，并且包括泡沫蛋糕(foamcake)，如例如蛋白霜(meringues)、海綿蛋糕、餅干蛋糕(biscuitcake)、蛋糕卷(roulade)、杰諾瓦士蛋糕(genoise)和槭風(fēng)蛋糕(chiffoncake)。海綿蛋糕是以小麥粉、糖、烘焙粉和蛋(和任選地烘焙粉)為基礎(chǔ)的一種軟蛋糕。存在的唯一脂肪來自于蛋黃，其有時(shí)與蛋白分開添加。蛋黃通常被用作其它類型蛋糕和甜點(diǎn)的基礎(chǔ)。磅蛋糕傳統(tǒng)上用面粉、黃油、蛋和糖各一磅制備，任選地補(bǔ)充烘焙粉。在槭風(fēng)蛋糕中，黃油/人造黃油已用油代替。與磅蛋糕或海綿蛋糕相比，糖和蛋黃含量已經(jīng)降低，并且蛋白含量提高。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可用于常規(guī)蛋糕中，以及其中蛋和/或脂肪量降低的蛋糕中。蛋和/或脂肪量的降低可能對每種蛋糕而言不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知通常存在于蛋糕配方中并且依賴于蛋糕類型的蛋和/或脂肪量。通常，可以達(dá)到至少5%w/w的蛋量減少。更優(yōu)選地，可以實(shí)現(xiàn)至少10%w/w的蛋量減少，進(jìn)一步更優(yōu)選地可以實(shí)現(xiàn)至少15%w/w的減少。顯示甚至可以實(shí)現(xiàn)使用的蛋量的至少20%w/w的減少。蛋量的減少可至少為30%w/w>40%w/w或甚至至少50%w/w。通常，可以實(shí)現(xiàn)至少10%的脂肪量減少。更優(yōu)選地，可以實(shí)現(xiàn)至少20%的脂肪量減少，進(jìn)一步更優(yōu)選地，可以實(shí)現(xiàn)至少30%的脂肪量減少。顯示甚至可以實(shí)現(xiàn)至少50%的使用的脂肪量減少。在國際專利申請?zhí)朠CT/EP2008/051147中，公開了可以在蛋糕的生產(chǎn)中使用磷脂酶A來改進(jìn)至少一種選自下組的特性，所述組由⑴牛奶雞蛋面糊粘度、Gi)比重、(iii)初始碎屑柔軟性、Gv)碎屑孔均勻性、(ν)碎屑孔直徑、(vi)儲存后的碎屑柔軟性、(vii)保質(zhì)期和/或(viii)蛋糕體積組成。在相同申請中還公開了磷脂酶可用于蛋糕的生產(chǎn)中，使得能夠減少蛋糕配方中使用的蛋和/或脂肪的量。具體地，顯示使用磷脂酶A時(shí)可能減少配方中使用的蛋和/或脂肪的量，同時(shí)維持至少一種選自下組的特性，所述組由G)牛奶雞蛋面糊粘度、Gi)比重、(iii)初始碎屑柔軟性、Gv)碎屑孔均勻性、(ν)碎屑孔直徑、(vi)儲存后的碎屑柔軟性、(vii)保質(zhì)期和/或(viii)蛋糕體積組成。術(shù)語至少維持在本文中用于表示一種特性被維持或改進(jìn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，至少包含磷脂酶A和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的組合物可在蛋糕的生產(chǎn)中用于改進(jìn)至少一種選自下組的特性，所述組由ω牛奶雞蛋面糊粘度、Gi)比重、(iii)初始碎屑柔軟性、Gv)碎屑孔均勻性、(V)碎屑孔直徑、(Vi)儲存后的碎屑柔軟性、(Vii)保質(zhì)期和/或(Viii)蛋糕體積組成。還發(fā)現(xiàn)至少包含磷脂酶A和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的組合物可在蛋糕的生產(chǎn)中用于減少配方中使用的蛋和/或脂肪的量，優(yōu)選地同時(shí)維持至少一種選自下組的特性，所述組由ω牛奶雞蛋面糊粘度、Gi)比重、(m)初始碎屑柔軟性、Gv)碎屑孔均勻性、(V)碎屑孔直徑、(Vi)儲存后的碎屑柔軟性、(Vii)保質(zhì)期和/或(Viii)蛋糕體積組成。具體地，在蛋糕配方中蛋和/或脂肪量減少的蛋糕中，或包含常規(guī)蛋和/或脂肪量的蛋糕中，使用至少包含磷脂酶A和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的組合物時(shí)，與單獨(dú)使用磷脂酶A相比可進(jìn)一步改進(jìn)一種或多種上述特性。在本文上下文中可以使用所有種類磷脂酶A，例如磷脂酶Al或磷脂酶A2。可以使用任何種類的磷脂酶Al。磷脂酶Al廣泛分布于自然中，例如微生物E.coli中、蛇毒液中和哺乳動(dòng)物腦、睪丸和肝中。合適的可商業(yè)獲得的磷脂酶Al的一個(gè)例子是LecitaseUltra(Novozymes)。可以使用任何類型的磷脂酶A2。優(yōu)選地使用磷脂酶A2。合適的可商業(yè)獲得的磷脂酶A2的一個(gè)例子是Cakezyme(DSM)或LecitaseIOL(Novozymes)。一種優(yōu)選的磷脂酶A2是例如在Aspergillusniger中表達(dá)的豬胰腺磷脂酶A2(Cakezyme,DSM)。測量一種特性是否被維持、改進(jìn)或削弱通常如下測量按照不含任何磷脂酶A和任何根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的原始配方制備牛奶雞蛋面糊和/或蛋糕，和按照含有磷脂酶A、任選地含有更少蛋和/或脂肪和任選地含有根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的配方制備其它牛奶雞蛋面糊和/或蛋糕，并比較某些特性。在要比較的兩種牛奶雞蛋面糊或蛋糕的特性基本相同的情況下，所述特性被維持，在它們差異的情況下發(fā)生改進(jìn)或削弱。對所有提到的特性而言，下文給出了測量方法以及一種特性可以被認(rèn)為經(jīng)改進(jìn)的指征?？梢酝ㄟ^根據(jù)國際谷物化學(xué)協(xié)會(ICC)和美國谷物化學(xué)協(xié)會(AACC54-2，ICC115)的標(biāo)準(zhǔn)方法用Farinograph測量牛奶雞蛋面糊粘度。相對于相同但是包含單獨(dú)的磷脂酶A或既不包含磷脂酶A也不包含脂解酶的牛奶雞蛋面糊而言，用減少的蛋和/或脂肪量制成并包含磷脂酶和本發(fā)明脂解酶的牛奶雞蛋面糊的粘度是否被改進(jìn)或削弱可以例如如下測量。在含有減少的蛋和/或脂肪量的牛奶雞蛋面糊并用磷脂酶A和本發(fā)明脂解酶制備的牛奶雞蛋面糊的粘度與例如相同但是不用磷脂酶A和不用脂解酶制備的牛奶雞蛋面糊的粘度相同時(shí)，或與例如僅用磷脂酶A制備的相同牛奶雞蛋面糊的粘度相同時(shí)，所述牛奶雞蛋面糊粘度被維持。在牛奶雞蛋面糊粘度提高的情況下，其被改進(jìn)。牛奶雞蛋面糊比重可以通過稱重預(yù)定體積的牛奶雞蛋面糊來測量。如果其降低則其比重被改進(jìn)。蛋糕的碎屑柔軟性由熟練的測試烘焙者憑經(jīng)驗(yàn)評價(jià)或者使用本領(lǐng)域已知的紋理分析儀(TAXT)測量。實(shí)際上，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知地測量蛋糕的碎屑硬度。在烘焙后24小時(shí)內(nèi)測量的碎屑柔軟性稱作初始碎屑柔軟性。烘焙后大于24小時(shí)的碎屑柔軟性稱作儲存后碎屑柔軟性，并且也是用于測定保質(zhì)期的度量。初始碎屑柔軟性提高的情況下，其被改進(jìn)。在儲存后碎屑柔軟性提高的情況下，其被改進(jìn)。蛋糕的碎屑孔均勻性可以由熟練的測試烘焙者憑經(jīng)驗(yàn)評價(jià)或者通過本領(lǐng)域已知的數(shù)字成像分析(例如C-cell,CalibreControlInternationalLtd,Appleton,Warrington,UK)來評價(jià)。當(dāng)孔尺寸偏差小時(shí)，碎屑被稱作更加均勻。當(dāng)孔徑偏差變得更小時(shí)，該特性被改進(jìn)。蛋糕的碎屑孔直徑可以使用本領(lǐng)域已知的數(shù)字成像分析(例如C-cell，CalibreControlInternationalLtd,Appleton,Warrington,UK)來評價(jià)。當(dāng)平均碎屑孔直徑降低時(shí)，所述特性被改進(jìn)。優(yōu)選地，同時(shí)維持相同蛋糕體積時(shí)尤其是這樣。蛋糕的保質(zhì)期可以通過測定蛋糕隨時(shí)間的回彈來測量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，這是測量碎屑柔軟性的方法的一部分，從而也可以使用本領(lǐng)域已知的紋理分析儀(例如TAXT2)來測量蛋糕的松弛?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的超聲或激光檢測，通過自動(dòng)化面包體積分析儀(例如BVM-3,TexVolInstrumentsAB，Viken,瑞典)測定給定蛋糕的體積。體積增加時(shí)特性被改進(jìn)?；蛘呦嗤叽绻拗泻姹汉蟮牡案飧叨仁堑案怏w積的指征。蛋糕高度增加時(shí)蛋糕體積增加。可以通過測定蛋糕高度和視覺分析蛋糕結(jié)構(gòu)來測定牛奶雞蛋面糊的乳液穩(wěn)定性。蛋糕高度降低時(shí)牛奶雞蛋面糊的乳液穩(wěn)定性降低。蛋糕結(jié)構(gòu)更密時(shí)牛奶雞蛋面糊的乳液穩(wěn)定性降低。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如在常規(guī)海綿蛋糕或含有減少的蛋量的海綿蛋糕中添加包含磷脂酶A和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶時(shí)，與其中可僅使用磷脂酶A或者不使用磷脂酶A也不使用本發(fā)明脂解酶的相同蛋糕或牛奶雞蛋面糊相比，可以至少觀察到一種或多種以下特性，例如牛奶雞蛋面糊經(jīng)改進(jìn)的乳液穩(wěn)定性，牛奶雞蛋面糊的更有效的乳化，蛋糕的經(jīng)改進(jìn)的彈性，蛋糕的經(jīng)改進(jìn)的碎屑柔軟性，牛奶雞蛋面糊的經(jīng)改進(jìn)的體積。因此本發(fā)明提供了包含本發(fā)明脂解酶和磷脂酶A的組合物在蛋糕生產(chǎn)中用于改進(jìn)至少一種選自下組的特性的用途，所述組由ω牛奶雞蛋面糊粘度、Gi)比重、(m)初始碎屑柔軟性、Gv)碎屑孔均勻性、(V)碎屑孔直徑、(Vi)儲存后的碎屑柔軟性、(Vii)保質(zhì)期和/或(Viii)蛋糕體積組成。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明脂解酶和磷脂酶A的組合物在蛋糕的生產(chǎn)中使得能夠減少蛋糕配方中使用的蛋和/或脂肪量，優(yōu)選地同時(shí)維持至少一種選自下組的特性的用途，所述組由ω牛奶雞蛋面糊粘度、Gi)比重、Gii)初始碎屑柔軟性、Gv)碎屑孔均勻性、(V)碎屑孔直徑、(Vi)儲存后的碎屑柔軟性、(Vii)保質(zhì)期和/或(Viii)蛋糕體積組成。技術(shù)人員能夠取決于蛋糕配方和類型，容易地分別確定組合物中要使用的磷脂酶A和本發(fā)明脂解酶的合適量。任選地，組合物中除磷脂酶A和本發(fā)明的脂解酶以外，可存在一種或多種其它成分，例如用于允許減少蛋糕中的蛋和/或脂肪，如例如替代性蛋白質(zhì)來源、水膠體、改性淀粉、酵母提取物、鈣。優(yōu)選的成分是酵母提取物、改性淀粉、鈣?？墒褂孟率鼋湍柑崛∥铮浒詿o氯化鈉干重為基礎(chǔ)至少30%w/w的5’-核糖核苷酸，優(yōu)選地至少34%w/w、38%w/w>40%w/w或42%w/w，更優(yōu)選地至少44%w/w>46%w/w>48%w/w或至少50%w/w的5’-核糖核苷酸。已發(fā)現(xiàn)使用這類酵母提取物不僅改進(jìn)蛋糕的口味，而且也具有驚人的乳化作用，因?yàn)樵谄涫褂煤笈Ｄ屉u蛋面糊的粘度提高。在本發(fā)明的上下文中，短語“5’_核糖核苷酸”是指在RNA降解期間形成的5’-單磷酸核糖核苷酸，即5’-單磷酸鳥嘌呤(5’-GMP)、5’-單磷酸尿嘧啶(5’-UMP)、5’-單磷酸胞嘧啶(5’-CMP)、5’-單磷酸腺嘌呤(5’-AMP)的總量，其中5’-AMP可被部分或全部轉(zhuǎn)化為5’-單磷酸肌苷(5’-IMP)。例如，在包含以無氯化鈉干物質(zhì)為基礎(chǔ)30%w/w5’-核糖核苷酸的酵母提取物中，5’-GMP,5，-UMP>5'-CMP>5'-AMP和5，-IMP的總量以無氯化鈉干物質(zhì)為基礎(chǔ)為30%w/w。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中使用下述酵母提取物，其中5’-GMP力卩5’-IMP的總量以無氯化鈉干物質(zhì)為基礎(chǔ)至少為15%w/w，優(yōu)選地至少為17%w/w、19%w/w>20%w/w或21%w/w，更優(yōu)選地至少為22%w/w、23%w/w、24%w/w或25%w/w。由于產(chǎn)生5’-核糖核苷酸的RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，該實(shí)施方案中5’-GMP和5’-IMP會始終以大致相等的量存在。在本發(fā)明的上下文中，除非另有說明，5’-核糖核苷酸的重量百分比計(jì)算以其二鈉鹽七水合物為基礎(chǔ)。所有的百分比基于無氯化鈉的干物質(zhì)(sfdm)計(jì)算。在本發(fā)明中，短語“無氯化鈉的干物質(zhì)(sfdm)”是指下述事實(shí)對重量百分比計(jì)算而言，從組合物中排除酵母提取物中存在的任何氯化鈉的重量。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行酵母提取物中氯化鈉的測量和上述計(jì)算。包含40%w/w5’-核糖核苷酸(其中20%w/w是5’-GMP力卩5，-IMP,重量百分比以無氯化鈉的酵母提取物干物質(zhì)為基礎(chǔ))的酵母提取物的一個(gè)例子以商標(biāo)MaxariteDelite(DSMFoodSpecialties,荷蘭)出售?？梢允褂酶男缘矸凵踔吝M(jìn)一步減少蛋糕配方中使用的脂肪量?？梢允褂盟蓄愋偷母男缘矸?，例如改性馬鈴薯淀粉或改性小麥淀粉。優(yōu)選地使用如例如US6,864,063中公開的改性馬鈴薯淀粉。最優(yōu)選地使用通過用淀粉麥芽糖酶處理馬鈴薯淀粉獲得的改性的馬鈴薯淀粉。優(yōu)選的馬鈴薯淀粉的一個(gè)例子以商標(biāo)Etenia(AvebeFood)出售。已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)在包含減少的脂肪量(例如低至30%w/w)并且使用磷脂酶Α、本發(fā)明脂解酶和改性馬鈴薯淀粉的組合制備的蛋糕中，與通過使用30%w/w更少脂肪并且不添加磷脂酶、脂解酶和改性馬鈴薯淀粉來生產(chǎn)的蛋糕相比，如上文所述的期望的蛋糕特性(例如牛奶雞蛋面糊粘度)被改進(jìn)。優(yōu)選地添加鈣來增強(qiáng)磷脂酶A的活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對蛋糕配方添加每5,OOOCPU磷脂酶A(下文表示為PLA)約40-200mgCaCl2-H2O是特別有利的。優(yōu)選地，對蛋糕配方添加每5,OOOCPUPLA在50和150mg之間CaCl2.H20，最優(yōu)選地每5,000CPUPLA至少90mgCaCl2.H20。CPU(生色磷脂酶單位=IEYU(蛋黃單位))在本文中被定義為40°C和pH8.0下從蛋黃中每分鐘釋放1μmol酸的酶量。該方法中的底物外消旋1，2-二辛酰二硫代磷脂酰膽堿，在405nm處分光光度計(jì)測量。已驚訝地發(fā)現(xiàn)蛋糕牛奶雞蛋面糊不提供磷脂酶A有效工作所需的足夠鈣。本發(fā)明還提供了制備牛奶雞蛋面糊的方法或制備蛋糕的方法，其中對蛋糕成分添加包含磷脂酶A和本發(fā)明脂解酶的組合物。蛋糕的典型成分是小麥粉、蛋和糖。任選地，添加烘焙粉、鹽、水、乳化劑(例如PEG和甘油單酯)、人造黃油、黃油和/或油(例如對磅蛋糕和瑪芬而言)。制備根據(jù)本發(fā)明的牛奶雞蛋面糊的方法優(yōu)選地包括步驟a.通過添加至少i.糖ii.面粉iii.磷脂酶A、根據(jù)本發(fā)明的脂解酶和蛋來制備蛋糕的牛奶雞蛋面糊。制備根據(jù)本發(fā)明的蛋糕的方法還包括步驟b.烘焙所述牛奶雞蛋面糊得到蛋糕。根據(jù)上述方法，可以制備包含減少的蛋和/或脂肪量的蛋糕，以及不應(yīng)用蛋和/或脂肪減少的蛋糕。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何從蛋糕成分開始制備牛奶雞蛋面糊或蛋糕。任選地，組合物中可存在一種或多種其它成分，例如以允許減少蛋糕中的蛋和/或脂肪，例如蛋白質(zhì)來源、水膠體、酵母提取物、改性淀粉、鈣。優(yōu)選的成分是上文定義的酵母提取物、改性淀粉、鈣。本發(fā)明還提供了能夠通過上述方法獲得的蛋糕或牛奶雞蛋面糊，本發(fā)明還提供了可例如用于蛋糕或牛奶雞蛋面糊生產(chǎn)中的烘焙組合物，其包含磷脂酶A和根據(jù)本發(fā)明的脂解酶。該烘焙組合物也可以用于面團(tuán)制品和從這類面團(tuán)獲得的烘焙制品中。例如，其可以在還含有蛋的面團(tuán)制品中和從其中衍生的烘焙制品(如奶油蛋卷(brioche)和潘那多尼(panettone))中使用，無論是常規(guī)的還是具有減少的蛋量。所述烘焙組合物也可以是還包含面粉和任選地其它成分的蛋糕預(yù)混物的一部分。根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的上述工業(yè)應(yīng)用僅包含少量例子，并且該列表不意圖限制。脂解酶可便利地在微生物中生產(chǎn)。在上述方法中，使用通過重組DNA技術(shù)獲得的脂解酶是有利的。重組酶的生產(chǎn)可以具有低成本價(jià)格、高產(chǎn)量、無污染物質(zhì)如細(xì)菌或病毒也無細(xì)菌毒素或污染性的其它酶活性。下文中通過以下非限制性實(shí)施例闡述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1牛產(chǎn)本發(fā)明的脂肪酶如下獲得由本文提供的核苷酸序列SEQIDNO1(DNAL01)、SEQIDNO3(DNAL02)、SEQIDNO5(DNAL03)、SEQIDNO7(DNAL04)編碼的脂解酶LOUL02、L03、L04構(gòu)建含有所述DNA序列的表達(dá)質(zhì)粒，用這類質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Aspergillusniger菌株，并以下文的方式培養(yǎng)所述A.niger菌株。將A.niger菌株的新鮮孢子(IO6-IO7)接種在20mlCSL-培養(yǎng)基(IOOml燒瓶，擋板)中，并在34°C和170rpm下培養(yǎng)20-24小時(shí)。在IOOmlCSM培養(yǎng)基(500ml燒瓶，擋板)中接種5-10mlCSL預(yù)培養(yǎng)物后，將菌株在34°C和170rpm下發(fā)酵3_5天。通過將發(fā)酵液在4°C下以5000xg離心獲得無細(xì)胞的上清液。將無細(xì)胞上清液儲存于-20°C下，直至使用。任選地可以將所述上清液在GF/AWhatmarai玻璃微纖維濾器(150mm0)上進(jìn)一步過濾，以去除更大的顆粒。需要時(shí)，用4NKOH將上清液的pH調(diào)節(jié)至pH5并在帶有抽吸的0.2μm(瓶口)濾器上無菌過濾，以去除真菌材料。CSL培養(yǎng)基由以下組成(以每升用量計(jì))IOOg玉米浸漬固體(Roquette)、IgNaH2P04*H20、0.5gMgS04*7H20、IOg葡萄糖*H20和0.25gBasildon(消泡劑)。將所述成分溶于去礦物質(zhì)水(demi-water)中，并用NaOH或H2SO4將pH調(diào)節(jié)至pH5.8，用20ml發(fā)酵液填充具有擋板和起泡球的IOOml燒瓶，在120°C下滅菌20分鐘，之后在冷卻至室溫后向每個(gè)燒瓶中添加200μ1含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的無菌溶液。CSM培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成(以每升用量計(jì))150g麥芽糖*H20、60gSoytone(胨)、IgNaH2P04*H20、15gMgS04*7H20、0.08gTween80、0.02gBasildon(消泡劑)、20gMES>IgL-精氨酸。將所述成分溶于去礦物質(zhì)水中，并用NaOH或H2SO4將pH調(diào)節(jié)至pH6.2；用IOOml發(fā)酵液填充具有擋板和起泡球的500ml燒瓶，在120°C下滅菌20分鐘，之后在冷卻至室溫后向每個(gè)燒瓶中添加Iml含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的無菌溶液。實(shí)施例2純化本發(fā)明的脂解酶將實(shí)施例1中獲得的冷凍無細(xì)胞上清液解凍后，在4°C下徹底離心上清液，以去除任何固體。為了去除低分子量污染物，使用裝有IOkDa截?cái)酁V器的Millip0reLabscaleTFF系統(tǒng)對上清液進(jìn)行超濾。將樣品用40ml體積冷的IOOmM磷酸鹽緩沖液pH6.0(包括0.5mMCaCl2)洗滌3-5次。酶溶液的最終體積為30ml，并且被進(jìn)一步稱作“超濾液”。為了進(jìn)一步純化，可以將超濾液應(yīng)用在MonoQ陰離子交換柱上。在20倍柱體積中將鹽梯度設(shè)為IMNaCL。緩沖液是70mMBis-TRIS和50mMTRIS的混合物。用0.1MHCl設(shè)定pH。驚訝地觀察到在pH=9時(shí)進(jìn)行純化時(shí)獲得最好的結(jié)果，其中脂肪酶在35mS/cm的電導(dǎo)率下洗脫。使用Bradford方法(TheProteinProtocolsHandbook,2ndedition,EditedbyJ.M.Walker,HumanaPressInc,Totowa2002,pl5_21)測定樣品的總蛋白質(zhì)含量。通過A280和HPSEC測定脂解酶濃度或者，可以從脂解酶造成的280nm(A280)處的消光和所計(jì)算的脂解酶分子消光系數(shù)來計(jì)算脂解酶的濃度。A280的測量在UvikonXLSecomam分光光度計(jì)(BeundeRonde,Abcoude,荷蘭)中進(jìn)行。酶的分子消光系數(shù)可以從每個(gè)酶分子的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基數(shù)來計(jì)算(S.C.GillandP.H.vonHippel，Anal.Biochem.182,319-326(1989))這些氨基酸的分子消光系數(shù)分別為1280、5690和UOM^cm^本發(fā)明脂解酶中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基可演繹自下述蛋白質(zhì)序列，所述蛋白質(zhì)序列選自由SEQIDN0:2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8組成的組。針對包含氨基酸34-304的SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8進(jìn)行計(jì)算。由上述多核苷酸序列編碼的脂解酶的摩爾消光系數(shù)是βδδθΟλ/Τ.αη1，對lmg/ml而言應(yīng)于1.25cm1的280nm下的0D。計(jì)算出的成熟多肽的分子量對脂肪酶L01、L04、L03和L02而言分別為28.4、28.3、28.4、28.5kD，僅考慮氨基酸34-304。脂解酶造成的280nm(A280)下的超濾液消光取決于酶樣品的純度?？梢允褂脦в蠺SKSW-XL柱(300*7,8mm；MW范圍10_300kDa)的HP-SEC(高效尺寸排除色譜)測定該特異性脂肪酶含量。洗脫緩沖液由25mM磷酸鈉緩沖液pH6.0組成，并以Iml/分鐘的流速使用。注射5-100μ1樣品。測量280nm下的吸光度。從色譜圖中相應(yīng)脂解酶峰的峰表面與280nm處吸收峰的總表面的比值，獲得本發(fā)明脂解酶造成的A280。然后通過用樣品的A280乘以上述比例并除以針對脂解酶計(jì)算的消光系數(shù)，來計(jì)算脂解酶濃度。實(shí)施例3測定法通過使用發(fā)色底物對硝基苯基棕櫚酸酯(pNPP，SigmaN-2752)，用分光光度計(jì)測定脂肪酶活性。在該測定法中，將pNPP溶于2-丙醇(每IOml2-丙醇40mgpNPP(Merck1.09634))中，并懸浮于含1.0%TritonX-100(Merck1.12298)的IOOmM乙酸鹽緩沖液pH=5.0中(45ml緩沖液中5ml底物)。最終的底物濃度是l.lmM。將脂肪酶與該底物在37°C下孵育10分鐘。通過添加相對于反應(yīng)混合物比例為11的終止緩沖液2%TRIS(Merck1.08387)+1%TritonX-IOO來終止反應(yīng)，隨后在405nm處測量形成的對硝基苯酚(pNP)。也可以在不同的pH值下應(yīng)用該測定法，從而測定脂肪酶的pH依賴性。應(yīng)當(dāng)理解在不同的pH值下可能需要不同的緩沖液，或者可能需要不同的去污劑來乳化底物。一個(gè)脂肪酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚的酶量。應(yīng)當(dāng)理解在常規(guī)分析中以下是罕見的實(shí)踐使用具有在不同測定法中測定的已知活性的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)酶溶液，將給定測定法的活性與在校準(zhǔn)測定法中將要測定的單位相關(guān)聯(lián)?；蛘?，可以通過使用2，3-巰基-1-丙醇-三丁酸酯(TBDMP)作為底物來測定脂肪酶活性。脂肪酶水解TBDMP的硫酯鍵，從而釋放丁酸和2，3-巰基-1-丙醇-二丁酸酯、2，3-巰基-1-丙醇-單丁酸酯或2，3-巰基-1-丙醇。在隨后與4，4，-二硫代二吡啶(DTDP)的反應(yīng)中滴定釋放的硫醇基，形成4-硫代吡啶酮。后者處于和4-巰基吡啶的互變異構(gòu)平衡中，所述4-巰基吡啶在334nm處吸收。反應(yīng)在含0.2%Triton-XlOO、0.65mMTBDMP和0.2mMDTDP的0.1M乙酸鹽緩沖液pH5.0中于37°C下進(jìn)行。一個(gè)脂肪酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾4-硫代吡啶酮的酶量。除了分光光度計(jì)測量以外，也可以使用滴定分析測量測定脂肪酶活性。例如，可以根據(jù)FoodChemicalCodex，F(xiàn)orthEdition,NationalAcademyPress,1996，p803,在作為底物的三丁酸甘油酯上測量脂解酶的酯酶活性?；罴y量表1如實(shí)施例1中制備的無細(xì)胞上清液中的脂解酶活性(脂肪酶活性使用對硝基苯基棕櫚酸酯作為底物在pH5下測定。脂肪酶活性作為單位/mg總Bradford蛋白質(zhì)給出)。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的多核苷酸，其包含(a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少90%的同源性；(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO:1互補(bǔ)序列的多核苷酸雜交，并且其中所述核苷酸序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少90%同源；(C)核苷酸序列，其編碼根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90%的同源性；(d)核苷酸序列，其編碼具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽是SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，與所述成熟多肽至少60%同源，并且所述經(jīng)分離的多肽針對甘油三酯的特異性程度Rspec為至少0.7；(e)下述序列，作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，所述序列是(a)、(b)、(c)、(d)中任一定義的序列的簡并序列；(f)核苷酸序列，其為(a)、(b)、(c)、(d)、(e)中任一定義的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼脂解酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的經(jīng)分離的多核苷酸，其是合成生產(chǎn)的。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多核苷酸，其為與根據(jù)SEQIDNO:1的多核苷酸具有至少90%同源性的功能等同物，并且是具有根據(jù)SEQIDNO3或根據(jù)SEQIDNO5或根據(jù)SEQIDNO7的核苷酸序列的多核苷酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多核苷酸，其在高度嚴(yán)格條件下與是SEQIDNO1互補(bǔ)序列的核苷酸序列雜交。6.包含根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的多核苷酸序列的載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6的載體，其為表達(dá)載體，其中根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的多核苷酸序列與允許所述多核苷酸序列在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)的至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接。8.根據(jù)權(quán)利要求7的載體，其中所述合適的宿主細(xì)胞是絲狀真菌。9.重組的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的多核苷酸或包含根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的載體。10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組宿主細(xì)胞，其能夠表達(dá)或過表達(dá)所述多核苷酸或載體。11.用于制造根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的載體的方法，所述方法包括下述步驟培養(yǎng)經(jīng)所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及從所述宿主細(xì)胞分離所述多核苷酸或所述載體。12.具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽，其包含(a)根據(jù)下述成熟多肽或其功能等同物的氨基酸序列，所述成熟多肽是根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽，所述功能等同物具有與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90%同源的氨基酸序列；(b)是SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽功能等同物的多肽，所述多肽與所述成熟多肽至少60%同源，并且所述多肽針對甘油三酯的特異性程度Rspee為至少0.7；(C)由根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求12的經(jīng)分離的多肽，所述多肽是與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90%同源性的功能等同物，并且是具有根據(jù)SEQIDNO4的氨基酸序列中的成熟多肽的氨基酸序列的多肽，或者是具有根據(jù)SEQIDNO:6的氨基酸序列中成熟多肽的氨基酸序列的多肽，或者是具有根據(jù)SEQIDNO:8的氨基酸序列中成熟多肽的氨基酸序列的多肽。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的經(jīng)分離的多肽，所述多肽能夠通過在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的載體來獲得。15.用于制造根據(jù)權(quán)利要求12到13中任一項(xiàng)的多核苷酸的方法，所述方法包括在允許根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的載體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求9或10的重組宿主細(xì)胞，以及任選地從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收被編碼的多肽。16.根據(jù)權(quán)利要求12到14中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽在食物制造中的用途。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，所述用途是在乳制品制造中，優(yōu)選地乳酪、乳酪樣制品、經(jīng)酶修飾的乳酪(EMC)的制造中，或在制造能夠通過黃油脂肪或奶油的水解獲得的游離脂肪酸混合物中的用途。18.用于制備乳制品的方法，其中在足以使酶反應(yīng)的條件下，向乳制品生產(chǎn)中使用的乳組合物中添加根據(jù)權(quán)利要求12到14中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽。19.根據(jù)權(quán)利要求16或17的用途或根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述Σ相對C4-C10含量/Σ相對C12-C18含量至少為0.7，其中“Σ相對C4-C10含量”是用具有脂解活性的多肽處理過的組合物中存在的含C4、含C6、含C8和含ClO的游離脂肪酸的相對含量的總和，并且其中“Σ相對C12-C18含量”是用具有脂解活性的多肽處理過的組合物中存在的含C12、含C14、含C16和含C18的游離脂肪酸的相對含量的總和。20.根據(jù)權(quán)利要求16、17或19的用途或根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中使用所述多肽來發(fā)展出香味。21.根據(jù)權(quán)利要求19的用途或方法或根據(jù)權(quán)利要求20的用途或方法，其中在乳制品香味譜中，尖銳、強(qiáng)烈、辛辣的香調(diào)比肥皂樣香調(diào)更高。22.能夠通過權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的方法獲得的乳制品。23.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，所述用途是烘焙制品制造中的用途。24.烘焙酶組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求12到14的具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽和一種或多種其它酶。25.烘焙組合物，其包含DATEM和根據(jù)權(quán)利要求12到14的具有脂解活性的經(jīng)分離的多肽。26.制備面團(tuán)的方法，所述方法包括下述步驟向面團(tuán)成分中的至少一種添加根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的多肽或根據(jù)權(quán)利要求24或25的組合物。27.面團(tuán)，其包含根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的多肽，或根據(jù)權(quán)利要求24或25的組合物。28.根據(jù)權(quán)利要求27的面團(tuán)，其具有經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)穩(wěn)定性。29.根據(jù)權(quán)利要求27-28中任一項(xiàng)的面團(tuán)，其具有選自由面團(tuán)的提高的強(qiáng)度、提高的穩(wěn)定性、提高的彈性、降低的粘稠度和經(jīng)改進(jìn)的延展性組成的組的至少一種經(jīng)改進(jìn)的特性。30.制備烘焙制品的方法，所述方法包括烘焙根據(jù)權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的面團(tuán)的步驟。31.能夠通過根據(jù)權(quán)利要求30的方法獲得的烘焙制品。32.根據(jù)權(quán)利要求31的烘焙制品，其具有至少一種選自由提高的體積、經(jīng)改進(jìn)的香味、經(jīng)改進(jìn)的碎屑結(jié)構(gòu)、經(jīng)改進(jìn)的碎屑柔軟性、經(jīng)改進(jìn)的脆性、降低的起泡和經(jīng)改進(jìn)的抗腐性組成的組的經(jīng)改進(jìn)的特性。33.根據(jù)權(quán)利要求32的烘焙制品，其中所述制品是由層壓面團(tuán)制成的烘焙制品、蛋糕或面包。34.根據(jù)權(quán)利要求33的烘焙制品，其中所述蛋糕是無乳化劑的蛋糕或者蛋減少的蛋糕。全文摘要本發(fā)明涉及新穎的多核苷酸序列，所述序列包括編碼新穎脂解酶的基因，以及所述基因的功能等同物，或與之具有高度同源性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在工業(yè)工藝中，例如在乳制品或烘焙工業(yè)中使用這些脂解酶的方法。文檔編號C12N9/20GK102016015SQ200980107049公開日2011年4月13日申請日期2009年2月26日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者凱里恩·特克,尤利亞·M·艾菲莫瓦,瑪格特·伊麗莎白·弗蘭克希斯·休恩瓦爾德-貝格曼斯,簡·米特斯卡·拉恩·范德,阿伯圖斯·阿拉德·蒂克·范,阿利亞·格瑞特·特魯,阿里恩·塞恩申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司