專利名稱：在木霉中表達(dá)過氧化氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明涉及在木霉宿主細(xì)胞中表達(dá)過氧化物酶，特別是在里氏木霉中表達(dá)來自黑曲 霉的catR基因。背景過氧化氫酶[過氧化氫過氧化氫氧化還原酶(EC 1. 11. 1. 6)]是催化過氧化氫 (H2O2)向氧(O2)和水(H2O)轉(zhuǎn)化的酶2H202- > 2H20+02已經(jīng)從多種動(dòng)物組織、植物和微生物(Chance和Maehly (1955)Methods in Enzymology 2 :764_791 Jones 和 Wilson(1978)在 H. Sigel(編著)，Metal Ions in Biological Systems,第 7巻，Marcel Dekker Inc. ,New York 中)中純化了過氧化S酶。大 部分已表征的過氧化氫酶含有4個(gè)多肽亞基，各具有50，000至60，000的分子量，每個(gè)亞基 一個(gè)氣化血紅素輔基(Wasserman 禾口 Hultin (1981) Arch. Biochem. Biophys. 212 385-392 ； Hartig和Ruis (1986) Eur. J. Biochem. 160 487-490)。來自牛肝的過氧化氫酶是最廣泛研 究的酶(Schonbaum 和 Chance (1976) in The Enzymes, Boyer 博士編著，第 3 版，第 13 卷， 第363-408頁，Academic Press, NewYork)。牛肝過氧化氫酶的完整氨基酸序列和三維結(jié) 構(gòu)是已知的(Schroeder et al. (1983)Arch. Biochem. Biophys. 214 397-412 ；Murphy et al. (1981) J. Mol. Biol. 152 465-499)。雖然從生物化學(xué)和生物物理學(xué)的觀點(diǎn)來看，對(duì)來自絲狀真菌的過氧化氫酶研究 較不深入，但是其具有區(qū)別于其哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)物的特征和優(yōu)勢(shì)。雖然亞基數(shù)和血紅素含 量是相似的，但真菌過氧化氫酶的分子顯著大于其它生物體的過氧化氫酶，具有80，000 至 97，000 的亞基分子量(Vainshtein 等人，(1986) J. Mol. Biol. 188 :63_72 Jacob 和 Orme-Johnson(1979)Biochem. 18 2967-2975 Jones 等人，(1987)Biochim. Biophys. Acta 913:395-398)。更重要的是，來自真菌(例如黑曲霉)的過氧化氫酶比牛肝過氧化氫酶對(duì) 水解更穩(wěn)定，并可以被戊二醛或SDS失活，對(duì)過氧化氫酶抑制劑具有更低的親和力，例如氰 化物、疊氮化物和氟化物(Wasserman和Hultin，見上文)。此外，當(dāng)經(jīng)受極端的pH、過氧 化氫濃度和溫度時(shí)，黑曲霉過氧化氫酶比牛肝過氧化氫酶顯著地更穩(wěn)定(Scott和Hammer (1960)Enzymologia 22 :229_237)。雖然真菌的過氧化氫酶提供了穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)，相應(yīng)的 哺乳動(dòng)物酶(例如，牛肝過氧化氫酶)表現(xiàn)出具有較高的催化活性(Gruft等人，(1978) Can. J. Biochem. 56 (9) 916-919 ；Kikuchi-Torii 等人，(1982) J. Biochem. (Tokyo) 92 (5) 1449-1456)。然而，由于酶的穩(wěn)定性是酶的生物技術(shù)應(yīng)用中的重要因素，真菌過氧化氫 酶的應(yīng)用已經(jīng)吸引了大量關(guān)注，特別是涉及中和高濃度過氧化氫的應(yīng)用。已經(jīng)觀察到黑 曲霉過氧化氫酶的H2O2失活速率比牛肝過氧化氫酶至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)(Vasudevan和
3Weiland(1990)Biotechnol. Bioeng. 36 :783_789)。兩種酶穩(wěn)定性的差異可以歸因于蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)特征和組成的差異(Vasudevan和Weiland，見上文)。傳統(tǒng)地，牛肝過氧化氫酶是診斷目的和制藥相關(guān)應(yīng)用(例如，隱形眼鏡清潔、消 毒、H2O2中和)的優(yōu)選酶。然而，對(duì)歐洲牛的瘋牛病的關(guān)注，以及對(duì)該疾病可能感染人類的擔(dān) 憂(Dealler 和 Lacey (1991) Neutr. Health (Bicester) 7 :117_134 ；Dealler 和 Lacey (1990) Food Microbiol. 7 253-280)，已經(jīng)激發(fā)了對(duì)替代的過氧化氫酶源的興趣。來自黑曲霉的過氧化氫酶制品是已商業(yè)銷售的，用于診斷酶試劑盒、來自葡萄糖 的葡萄糖酸鈉的酶制品、H2O2廢棄物的中和，在食物和飲料中去除H2O2和/或產(chǎn)生02。從黑 曲霉中已經(jīng)分離了兩種過氧化氫酶基因。黑曲霉catA基因編碼主要在脂肪酸上生長(zhǎng)的過 程中誘導(dǎo)的過氧化氫酶，認(rèn)為位于過氧化物酶體中。第二種基因命名為catR，編碼可溶性的 胞質(zhì)酶，代表可商購的黑曲霉過氧化氫酶制品中的主要活性。之前已經(jīng)描述了與黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的啟動(dòng)子和終止子元件功能性 連接的黑曲霉catR基因在黑曲霉菌株中的重組表達(dá)，所述菌株經(jīng)過改造消除了葡萄糖氧 化酶(goxA)的表達(dá)(美國(guó)專利號(hào)5，360，901)。然而，由于一部分表達(dá)的過氧化氫酶隔離在 黑曲霉宿主細(xì)胞的細(xì)胞壁中，降低了酶產(chǎn)量和回收，所以酶產(chǎn)量不是最優(yōu)的。因此，需要用 于最終過氧化氫酶的改良的宿主表達(dá)系統(tǒng)，其提供分泌的可溶性酶的更高產(chǎn)量。發(fā)明概述在一個(gè)方面，發(fā)明提供了生產(chǎn)能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽的方 法，包括在木霉宿主細(xì)胞中從編碼多肽的多核苷酸表達(dá)所述多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，多 肽是來自黑曲霉(A.niger)的過氧化氫酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸含有黑曲霉 catR基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼含有SEQ ID NO :1所述氨基酸序列的多 肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，木霉宿主細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中， 多肽在里氏木霉中的表達(dá)比相同多肽在黑曲霉中的表達(dá)高至少約20、30、40、50、60、70、80、 90或100%的任一值。在一些實(shí)施方案中，從所述里氏木霉宿主細(xì)胞分泌到生長(zhǎng)基質(zhì)中的 所述多肽的量比所述多肽從黑曲霉宿主細(xì)胞中分泌到生長(zhǎng)基質(zhì)中的量高至少約20、30、40、 50、60、70、80、90 或 100%的任一值。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(a)用包含編碼所述多肽的多核苷酸的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化木霉宿主細(xì)胞；(b)在適合所述多肽表達(dá)的條件下，在生長(zhǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)所述木霉宿主 細(xì)胞；和(c)從所述生長(zhǎng)基質(zhì)中分離所述多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有表達(dá)載體的木霉宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有 編碼能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多 肽是來自黑曲霉(A.niger)的過氧化氫酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸含有黑曲霉 catR基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼含有SEQ ID NO :1所述氨基酸序列的 多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，木 霉宿主細(xì)胞包含內(nèi)源T基因的缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是具有內(nèi)源T基因缺失 的里氏木霉細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽，其 中所述多肽在如本文所述的木霉宿主細(xì)胞中表達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的方法，包括將所述過氧化氫與能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽接觸，其中多肽在如本文所述的木 霉宿主細(xì)胞中表達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的組合物，包括能夠催 化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽，其中所述多肽在如本文所述的木霉宿主細(xì)胞中表 達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了試劑盒，所述試劑盒包括能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn) 化為氧氣和水的多肽，其中所述多肽在如本文所述的木霉宿主細(xì)胞中表達(dá)。附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1描述了黑曲霉catR過氧化氫酶的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。用斜體字表 示指導(dǎo)分泌的信號(hào)序列。圖2描述了編碼黑曲霉catR過氧化氫酶的核苷酸序列，包括內(nèi)含子(SEQ ID NO 2)。圖3描述了 pTrex3gM表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。圖4描述了 pTrex3gM (CATE)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。圖5顯示了 pH對(duì)黑曲霉或里氏木霉中表達(dá)的過氧化氫酶的熔點(diǎn)的影響。圖6顯示了 H2O2對(duì)黑曲霉或里氏木霉中表達(dá)的過氧化氫酶的熔點(diǎn)的影響。圖7是實(shí)施例6中描述的SDS-PAGE凝膠。圖8顯示了實(shí)施例7中描述的過氧化氫酶樣品的活性。艦除非另外說明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì) 胞生物學(xué)和生物化學(xué)的常規(guī)技術(shù)，在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)。此類技術(shù)是文獻(xiàn)中詳細(xì) 解釋的，例如;Molecular CloninR :A Laboratory Manual，第 2 版(Sambrook 等人，1989)； Oligonucleotide Synthesis(Μ. J. Gait 編著，1984 ；Current Protocols in Molecular BioloRY (F. M. Ausubel 等人編著，1994) ;PCR :The Polymerase Chain Reaction (Mullis 等人編著，1994)；禾口 Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual (Kriegler, 1990)。除非本文中另外定義，本文中使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular BioIory,第 2 版，John Wiley 禾口 Sons，New York(1994)，以及 Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY(1991)為 技術(shù)人員提供了本發(fā)明使用的許多術(shù)語的常規(guī)詞典。與本文所述相似或等同的任何方法和 材料都可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用。本文提供的數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)值。除非另外說明，核酸從左至右按5’至3’方向書寫；氨基酸序列從左至右按氨基至 羧基方向書寫。定義如本文中使用的，術(shù)語“多核苷酸”指任意長(zhǎng)度、任意三維結(jié)構(gòu)的核苷酸的多聚體 形態(tài)，是單鏈或多鏈的(例如，單鏈、雙鏈、三螺旋等)，其含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷 酸，和/或脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的類似物或修飾形式，包括修飾的核苷酸或堿基或其類似物。由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸，而 本發(fā)明涵蓋了編碼特定氨基酸序列的多種多核苷酸?？梢允褂萌魏晤愋偷男揎椇塑账峄?核苷酸類似物，只要該多核苷酸在使用條件下保留了希望的功能性，包括增加核酶(例如， 脫氧2’ -Ο-Me、硫代磷酸酯，等)耐受性的修飾。出于檢測(cè)或捕獲的目的，也可以摻入標(biāo) 記，例如放射性或非放射性的標(biāo)記或錨定物，例如生物素。術(shù)語多核苷酸還可以包括肽核酸 (PNA)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”和“寡核 苷酸”在本文中可互換使用。本發(fā)明的多核苷酸可以包含RNA、DNA或兩者，和/或其修飾形 式和/或類似物?？梢酝ㄟ^非核苷酸組分打斷核苷酸的序列?？梢杂锰娲倪B接基團(tuán)取代 一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵。這些替代的連接基團(tuán)包括但不限于這樣的實(shí)施方案，其中磷酸被 P (0) S ( “硫代磷酸酯”)、P (S) S ( “二硫代磷酸酯”)、(0) NR2 ( “酰胺化物”)、P (0) R、P (0) OR，、 CO或CH2 (formacetal)取代，其中每個(gè)R或R’獨(dú)立地是H或取代或非取代的烷基(1-20C)， 任選的含有醚鍵(-0-)、芳香基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的連 接都需要是相同的。多核苷酸可以是線性或環(huán)狀的，或者包含線性或環(huán)狀部分的組合。如本文中使用的，“多肽”指由氨基酸組成的，并由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可為蛋白質(zhì) 的任何組分。本文中使用氨基酸殘基的常規(guī)一字母或三字母代碼。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)” 在本文中可互換的使用，指任意長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，可 以包含修飾的氨基酸，可以被非氨基酸中斷。這些術(shù)語還涵蓋了已天然修飾的或通過介入 修飾的氨基酸聚合物；所述介入例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化或任何 其他的操作或修飾，例如與標(biāo)記組分綴合。該定義還包括例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似 物的多肽(包括例如，非天然氨基酸，等)，以及本領(lǐng)域已知的其它修飾。如本文中使用的，“載體”指設(shè)計(jì)成向一種或多種細(xì)胞類型中引入核酸的多核苷酸 序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒和盒等。如本文中使用的，術(shù)語“表達(dá)”指基于基因的核酸序列生產(chǎn)多肽的過程。該過程包 括轉(zhuǎn)錄和翻譯。如本文中使用的，“表達(dá)載體”指含有與一個(gè)或多個(gè)合適的控制序列有效連接的 DNA編碼序列(例如，基因序列)的DNA構(gòu)建體，所述控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列在宿主中 的表達(dá)。此類控制序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，控制此類轉(zhuǎn)錄的任選的操縱基因序列，編碼 合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬 菌體顆粒，或單純的是潛在的基因組插入序列。一旦轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，載體就可以復(fù)制 并獨(dú)立于宿主基因組發(fā)揮功能，或者在一些情況下，可以自身整合到基因組中。質(zhì)粒是最常 使用的表達(dá)載體形式。然而，本發(fā)明意在包括發(fā)揮等同功能的其它形式的表達(dá)載體，所述表 達(dá)載體是或者將是本領(lǐng)域已知的。“啟動(dòng)子”指涉及結(jié)合RNA聚合酶以起始基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例是里氏木霉 cbhl，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。術(shù)語“有效連接”指并置，其中元件以允許它們功能性相關(guān)的方式排列。例如，如 果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與編碼序列有效連接?！疤幱谵D(zhuǎn)錄控制下”是本領(lǐng)域普遍理解的術(shù)語，表示多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄依賴于其 與元件的有效連接，所述元件導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的起始或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。
“處于翻譯控制下”是本領(lǐng)域普遍理解的術(shù)語，表示在已形成mRNA后發(fā)生的調(diào)控過程?！盎颉敝冈诋a(chǎn)生多肽中涉及的DNA片段，包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及在 單個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。如本文中使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”指細(xì)胞或細(xì)胞系，用于多肽生產(chǎn)的重組表達(dá)載 體可以轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞或細(xì)胞系中以表達(dá)多肽。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，由于 天然的、偶然的或有意突變，后代不必須與原始親代細(xì)胞是完全相同的(在形態(tài)學(xué)或在全 基因組DNA互補(bǔ)序列上)。宿主細(xì)胞包括用表達(dá)載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?！八拗骷?xì)胞” 指從絲狀真菌菌株，特別是從木霉菌株的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體。術(shù)語“重組的”當(dāng)用于指細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，表示通過引入異源的核酸或 蛋白質(zhì)，或者改變天然的核酸或蛋白質(zhì)而修飾的細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或者所述細(xì)胞 源自這樣修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然形式的(非重組)的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn) 的基因，或者表達(dá)否則異常表達(dá)、低表達(dá)，或完全不表達(dá)的天然基因?！靶盘?hào)序列”(也稱為“前序列”、“信號(hào)肽”、“前導(dǎo)序列”或“前導(dǎo)肽”)指與蛋白質(zhì) 的N端部分結(jié)合的氨基酸序列，所述序列促進(jìn)從細(xì)胞分泌成熟形式的蛋白質(zhì)。信號(hào)序列使 多肽靶向分泌途徑，一旦其移位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，則被從新生多肽上切除。胞外蛋白質(zhì)的成熟 形式缺少信號(hào)序列，其在分泌過程中被切除。術(shù)語“選擇性標(biāo)記”或“選擇標(biāo)記”指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因，使那些含有 引入的核酸或載體的宿主易于選擇。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于抗微生物物質(zhì)(例如， 潮霉素、博來霉素或氯霉素)和/或在宿主細(xì)胞上產(chǎn)生代謝優(yōu)勢(shì)的基因，例如營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。術(shù)語“源自，，涵蓋了術(shù)語“起源自”、“獲得自”、“可獲得自”、“分離自，，和“從……產(chǎn)生”?！敖z狀真菌”指真菌亞門的所有絲狀形式(參見，Alexopoulos, C. J. (1962)， Introductory MycoIory, ffiley, New York)。這類真菌的特征是具有由幾丁質(zhì)、纖維 素和其他復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明的絲狀真菌與酵母在形態(tài)、生 理和遺傳上是不同的。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲伸長(zhǎng)，碳分解代謝是專性好氧 的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以是木霉屬的細(xì)胞，例如里氏木霉(原分類為長(zhǎng) 枝木霉(T. Iongibrachiatum)，現(xiàn)也稱為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、綠色木霉 (Trichoderma viride)、康寧木霄(Trichoderma koningii)或哈茨木 (Trichoderma harzianum)。如本文中使用的，術(shù)語“木霉”或“木霉屬”指原分類或現(xiàn)分類為木霉屬的任何真菌屬。術(shù)語“培養(yǎng)”指在液體或固體培養(yǎng)基中，在適合生長(zhǎng)的條件下，生長(zhǎng)微生物細(xì)胞群 體。當(dāng)涉及多核苷酸或蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語“異源的”指在宿主細(xì)胞中不天然存在的多核苷 酸或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。術(shù)語意在涵蓋由天 然存在的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。當(dāng)涉及多核苷酸或蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語 “同源的”指在宿主細(xì)胞中天然存在的多核苷酸或蛋白質(zhì)。在將核酸序列插入到細(xì)胞的上下文中，術(shù)語“引入”包括“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，指核酸序列摻入到真核或原核細(xì)胞中，其中核酸序列可以整合到細(xì)胞的基因組中(例如， 染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或瞬時(shí)表達(dá)。如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)基因”指具有非天然(例如，異 源的)核酸序列的細(xì)胞，所述核酸序列整合到其基因組中，或者作為附加體質(zhì)粒在多個(gè)世 代中維持。如本文中使用的，術(shù)語“回收”、“分離”、“純化，，和“分開”指從其天然相關(guān)的至少 一種組分中移出的材料(例如，蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞)。例如，這類術(shù)語可以指這樣的材料， 所述材料基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含其在天然狀態(tài)下(例如，完整的生物學(xué)系統(tǒng))發(fā)現(xiàn)時(shí)通常相 伴的組分。如本文中使用的，“過氧化氫酶”指催化過氧化氫分解為氧氣和水的酶(S卩，具有催 化活性的多肽)?！癆TCC”指位于馬納薩斯(Manassas，Va. 20108)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(www. atcc. org) 0“NRRL”指美國(guó)農(nóng)業(yè)研究服務(wù)培養(yǎng)物保藏中心，用于農(nóng)業(yè)用途研究的國(guó)立中心(原 稱為USDA北部區(qū)域研究實(shí)驗(yàn)室)，皮契里亞，伊利諾伊州。除非上下文另外清楚地說明，則“一”、“一個(gè)”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)指代。木霉宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了可以表達(dá)編碼過氧化氫酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞。宿主細(xì) 胞是木霉屬的絲狀真菌細(xì)胞，例如，里氏木霉、綠色木霉、康寧木霉或哈茨木霉。在一些 實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的；非限制性實(shí)例包括 ATCC No. 13631、ATCC No. 26921、ATCC No. 56764、ATCC No. 56765、ATCC No.56767 和 NRRL No. 15709。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞源自RL-P37里氏木霉菌株(描述在Sheir-Neiss 等人，(1984) Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53)。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞 是Morph 1. l(pyr+)里氏木霉菌株，其是四缺失的RL-P37里氏木霉菌株的自發(fā)pyr4回復(fù) 體(描述在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 05/001036中)。宿主細(xì)胞可以已通過遺傳工程操作。在一些實(shí)施方案中，已經(jīng)失活了真菌宿主細(xì) 胞的多種天然基因。這些基因包括例如，編碼纖維素分解酶的基因，例如內(nèi)切葡聚糖酶(EG) 和外切纖維二糖水解酶(CBH)(例如，cbhl、cbh2、egll和egl3)。美國(guó)專利號(hào)5，650，322公 開了 RL-P37的衍生菌株，具有cbhl基因和cbh2基因的缺失。在一些實(shí)施方案中，木霉宿 主細(xì)胞含有內(nèi)源T基因的缺失，降低或預(yù)防所表達(dá)的過氧化氫酶的去糖基化。在一個(gè)實(shí)施 方案中，宿主細(xì)胞是具有內(nèi)源T基因缺失的里氏木霉。可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼發(fā)明多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中?！稗D(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn) 化”指將外源多核苷酸插入到宿主細(xì)胞中。外源多核苷酸可以作為非整合載體維持，例如質(zhì) 粒，或者備選地，可以整合到宿主細(xì)胞基因組中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)染”意在涵蓋用于將 核酸引入宿主細(xì)胞的所有常規(guī)技術(shù)。轉(zhuǎn)染技術(shù)的實(shí)例包括但不限于磷酸鈣沉淀、DEAE-葡 聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和顯微注射。可以在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, M 2 片反,Cold Spring Harbor Laboratorypress 禾口其它的 實(shí)驗(yàn)室教科書中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法。還可以通過適合在體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的 遞送機(jī)制將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，例如通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見例如，F(xiàn)erry等人，(1991)Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 88 :8377_8381 ；和 Kay 等人，(1992) Human Gene Therapy 3 641-647)、腺病毒載體(參見例如，Rosenfeld(1992)Cell 68 143-155 ；以及 Herz 和 Gerard (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. , USA，90 :2812_2816)、受體-介導(dǎo)的 DNA 攝入(參 見例如，Wu 和 Wu(1988) J. Biol. Chem. 263 14621 ；Wilson 等人，(1992) J. Biol. Chem. 267 963-967 ；和美國(guó)專利號(hào)5，166，320)、DNA的直接注射(參見例如，Acsadi等人，(1991) Nature 332 :815_818 ；和 Wolff 等人，(1990) Science 247 1465-1468)或顆粒轟擊(生 物射彈)(參見例如，Cheng 等人，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，90 :4455_4459 ；和 Zelenin 等人，(1993)FEBS Letts. 315 :29_32)。一些載體以低頻率整合到細(xì)胞中。為了鑒別這類整合體，在一些實(shí)施方案中，將含 有選擇標(biāo)記(例如，藥物抗性)的基因與目的核酸一起引入宿主細(xì)胞中。選擇標(biāo)記的實(shí)例 包括產(chǎn)生對(duì)一些藥物的抗性的標(biāo)記，例如G418和潮霉素。選擇標(biāo)記可以在與目的核酸分離 的載體上或同一載體上引入。然后可以通過使用選擇標(biāo)記選擇細(xì)胞，來鑒別轉(zhuǎn)染的宿主細(xì) 胞。例如，如果選擇標(biāo)記編碼賦予新霉素抗性的基因，則可以通過在存在G418條件下細(xì)胞 的生長(zhǎng)，來鑒別攝入核酸的宿主細(xì)胞。已摻入了選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞可以生存，而其他的細(xì) 胞死亡。一旦表達(dá)，則可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化發(fā)明的多肽，包括但不限于親 和純化、硫酸銨沉淀、離子交換層析或凝膠電泳(通常參見，R. Scopes (1982) Protein Purification, SprinRer-VerlaR, N. Y. ；Deutscher(1990)Methods in Enzymology 第 182 卷:Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y.)。過氧化氫酶在發(fā)明的上下文中，過氧化氫酶是催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的酶。本文中描 述的在木霉宿主細(xì)胞中表達(dá)的過氧化氫酶對(duì)宿主物種是異源的，即，它們?cè)醋耘c其表達(dá)的 木霉種不同的物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，過氧化氫酶是黑曲霉的catR過氧化氫酶。在一些實(shí)施方案 中，過氧化氫酶包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，或由所述序列組成，或基本由所述序 列組成。在一些實(shí)施方案中，過氧化氫酶包含與SEQ ID而1所述序列具有約70、75、80、 85、90、95、97、98、99或99. 5%同一性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列組成，或基本由 所述序列組成，其中所述酶能夠催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水。在一些實(shí)施方案中，過氧化氫酶是源自SEQ ID NO :1所述序列的成熟加工的序列。 在一些實(shí)施方案中，源自SEQ ID NO :1所述氨基酸序列的成熟加工的序列含有從SEQ ID NO 1的N端的1至約25個(gè)氨基酸殘基的缺失，例如缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 個(gè) N 端氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，過氧化氫酶由黑曲霉的catR基因編碼。在一些實(shí)施方案中， 過氧化氫酶由這樣的多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQ ID NO :2所述多核苷酸序列，或 由所述序列組成，或基本由所述序列組成。在一些實(shí)施方案中，過氧化氫酶由與SEQ ID N0 2所述多核苷酸序列具有約70、75、80、85、90、95、97、98、99或99. 5%同一性的多核苷酸序 列，其中所述酶能夠催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水。載體根據(jù)發(fā)明，將包含編碼過氧化氫酶的多核苷酸序列的載體引入木霉宿主細(xì)胞。典型地，從包含編碼多肽的多核苷酸和包含與過氧化氫酶編碼序列有效連接的調(diào)控序列的表 達(dá)載體表達(dá)包含過氧化氫酶活性的多肽。載體可以是任何可以引入并在木霉細(xì)胞中復(fù)制的載體。合適的載體的實(shí)例可見 于，例如 Sambrook 等人，(1989)，見上文，Ausubel (1994)，見上文，van den Hondel 等人， (1991) in Bennet and Lasure (編著)，More Gene Manipulations in FunRi, Academic Press, San Diego，第396-428頁，和美國(guó)專利號(hào)5，874，276。有用的載體的實(shí)例包括但不 限于 pFB6、pBR322、PUC18、pUClOO 和 pENTR/D。典型地，編碼過氧化氫酶的多核苷酸與在木霉宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的合適 啟動(dòng)子有效連接。啟動(dòng)子可以源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。啟動(dòng)子 的合適的非限制性實(shí)例包括cbhl、cbh2、egll和egl2。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子對(duì)宿主 細(xì)胞是天然的。例如，當(dāng)里氏木霉是宿主細(xì)胞時(shí)，啟動(dòng)子可以是天然的里氏木霉啟動(dòng)子。在 一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是里氏木霉cbhl，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，并已保存在GenBank登錄號(hào) D86235中。“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”是在環(huán)境的或發(fā)育調(diào)控條件下活化的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，啟動(dòng)子對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在一些實(shí)施方案中，過氧化氫酶編碼序列與編碼信號(hào)序列的多核苷酸序列有效連 接。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列是與所表達(dá)的過氧化氫酶基因天然相關(guān)的序列。在一些 實(shí)施方案中，信號(hào)序列包含SEQ ID NO :1的1至16位殘基所示的氨基酸序列，或由所述序 列組成，或基本由所述序列組成。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列與SEQ ID N0:1的1至16 位殘基所示的信號(hào)序列具有至少約80、85、90、95、97、98或99%的序列同一性。在一些實(shí) 施方案中，信號(hào)序列是里氏木霉cbhl或nsp24信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)序列是 由 cbhl 核酸序列 ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT(SEQ ID NO: 3)編碼的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)序列是由nsp24核酸序列ATGCAGACCTTTG GAGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCC(SEQ ID NO 4)編碼的氨基酸序列。 在一些實(shí)施方案中，將引入木霉宿主細(xì)胞的載體包括源自同一來源的信號(hào)序列和啟動(dòng)子序 列。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列和啟動(dòng)子序列源自不同的來源。在一些實(shí)施方案中，載體還包括終止序列。在一些實(shí)施方案中，將引入木霉宿主細(xì) 胞的載體包含源自同一來源的終止序列和啟動(dòng)子序列。在一些實(shí)施方案中，終止序列和啟 動(dòng)子序列源自不同的來源。合適的終止子序列的非限制性實(shí)例是源自木霉菌株(例如里氏 木霉菌株)的cbhl的終止子序列。在一些實(shí)施方案中，載體包括選擇標(biāo)記。合適的選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于賦 予對(duì)抗微生物化合物(例如，潮霉素、腐草霉素)抗性的基因。還可以使用營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記，例 如，amdS、argB、pyr4。在用于轉(zhuǎn)化木霉的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的(參見例 如，F(xiàn)inkelstein (1992)Biotechnology of Filamentous Fungi,第 6 章，F(xiàn)inkelstein 等人 編著，Butterworth-Heinemann, Boston, Mass. ；Kinghorn 等人，(1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記是amdS基因，其編碼乙酰胺酶，允許轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞將乙酰胺作為氮源生長(zhǎng)。在Kelley等人，(1985)EMBO J. 4 :475_497和Penttila等人， (1987)Gene61 :155_164中描述了使用構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇標(biāo)記。包含編碼過氧化氫酶多肽的多核苷酸序列的表達(dá)載體可以是能夠在木霉宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或者能夠轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞DNA中的任何載體。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體 是質(zhì)粒。產(chǎn)生包含編碼過氧化氫酶多肽的多核苷酸和其他序列(例如啟動(dòng)子和終止子)的 DNA構(gòu)建體，并將它們插入到合適的載體中的方法是本領(lǐng)域普遍已知的。通常通過在方便的 限制性酶切位點(diǎn)連接來實(shí)現(xiàn)多核苷酸序列的連接。如果不存在此類位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐 使用合成的寡核苷酸接頭(參見例如，Sambrook (1989)，見上文；Bennett和Lasure (1991)， 見上文，第70-76頁)。將載體引入宿主細(xì)胞中可以使用任何本領(lǐng)域普遍已知的多種技術(shù)實(shí)施將載體引入到木霉宿主細(xì)胞中，所 述載體包含編碼過氧化氫酶多肽的多核苷酸序列，例如，轉(zhuǎn)化、電穿孔、核微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn) 染(例如，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)、用磷酸鈣DNA沉淀孵育、用DNA包被的 微粒高速轟擊或原生質(zhì)體融合。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，從而將編碼過氧化氫酶多肽的多核苷酸 穩(wěn)定的整合到宿主細(xì)胞染色體中。然后通過已知的技術(shù)純化轉(zhuǎn)化體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體是可區(qū)別的， 通過其在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上較快的生長(zhǎng)速度和形成具有光滑而非粗糙輪廓的環(huán) 形菌落進(jìn)行區(qū)別。此外，在一些情況下，通過將轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在固體非選擇性培養(yǎng)基(即，缺 少乙酰胺的基質(zhì))上，從該培養(yǎng)基中收獲孢子，并確定其后在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基 上萌發(fā)并生長(zhǎng)的這些孢子的百分比，來進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性測(cè)試。備選地，可以使用本領(lǐng)域 已知的其它方法選擇轉(zhuǎn)化體。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備用于轉(zhuǎn)化的木霉宿主細(xì)胞涉及從真菌的菌絲體制備原生 質(zhì)體(參見例如，Campbell等人，(1989)Curr. Genet. 16 :53_56)。在一些實(shí)施方案中，菌絲 體獲得自萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)孢子。用消化細(xì)胞壁的酶處理菌絲體，獲得原生質(zhì)體。通過懸浮基質(zhì) 中存在的滲透穩(wěn)定劑保護(hù)原生質(zhì)體。此類穩(wěn)定劑包括例如，山梨醇、甘露醇、氯化鉀和硫酸 鎂。典型地，穩(wěn)定劑濃度在約0.8M至約1.2M的范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，懸浮培養(yǎng)基中存 在的山梨醇濃度為約1.2M。典型地，將DNA攝入到宿主木霉細(xì)胞中依賴于攝入溶液中的鈣離子濃度。通常，攝 入溶液中包括約IOmM至約50mM CaCl20此外，攝入溶液通常還包括緩沖系統(tǒng)(例如，TE緩 沖液(IOmM Tris, pH 7. 4 ；ImM EDTA)或 IOmM 嗎啡代丙磺酸(MOPS)，pH 6. 0)和聚乙二醇 (PEG)。雖然不希望受理論局限，PEG可以發(fā)揮融合細(xì)胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基的內(nèi)容 物遞送到木霉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。該融合作用通常導(dǎo)致多拷貝 的質(zhì)粒DNA整合到宿主染色體中。通常，轉(zhuǎn)化使用含有木霉原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液，其已經(jīng)以約IO5至約107ml， 典型地約2x107ml的密度進(jìn)行滲透處理。將體積為100 μ 1的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞在適當(dāng) 溶液(例如，含有1. 2Μ山梨醇50mM CaCl2的溶液)中與DNA混合。通常，向攝入溶液中加 入高濃度的PEG。例如，可以向原生質(zhì)體懸浮液中添加約0. 1至約1體積的25% PEG 4000。 在一個(gè)實(shí)施方案中，添加約0. 25體積的25% PEG 4000?？梢韵驍z入溶液中添加添加劑，包 括但不限于二甲亞砜、肝素、亞精胺和氯化鉀，并幫助轉(zhuǎn)化。典型地，然后在0°C孵育攝入混合物約10至約30分鐘。然后，可以向混合物中添加其它的PEG，進(jìn)一步增加所希望基因或多核苷酸序列的攝入。例如，可以添加約5至約15 體積的25% PEG 4000。然而，更多或更少體積可以是所希望的。添加的25% PEG 4000的 量通常是轉(zhuǎn)化混合物體積的約10倍。在添加PEG后，可以在室溫或冰上溫育轉(zhuǎn)化混合物， 然后添加山梨醇和氯化鈣溶液。然后，將原生質(zhì)體懸浮液添加到等分的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如， 融化的生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中，所述培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)。過氧化氫酶的生產(chǎn)在例如美國(guó)專利號(hào)6，022，725 和 6，268，328，Harkki 等人，(1991) Enzyme Microb. Technol. 13 -.227-233, Harrki 等人，(1989)Bio Technol. 7 :596_603，EP 244，234，EP 215，594 禾口 Nevalainen 等人(1992) "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes,，，in Molecular In dustrial Mycoiory, Leong and Berka 編著，Marcel Dekker Inc. , ny,第 129-148頁中描述了異源蛋白質(zhì)在木霉中的表達(dá)。通常，在含有生理鹽和營(yíng)養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)木霉宿主細(xì)胞?？梢允褂闷胀?商業(yè)制備的培養(yǎng)基(例如，酵母麥芽膏(YM)肉湯；Luria Bertani (LB)肉湯；薩布羅氏右旋 糖(SD)肉湯)。典型地，在約28°C下，在振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐中培養(yǎng)細(xì)胞，直到實(shí)現(xiàn)理想水平 的過氧化氫酶表達(dá)。通常，基質(zhì)中包括誘導(dǎo)糖例如乳糖或葡萄糖_槐糖。當(dāng)在黑曲霉中生產(chǎn)過氧化氫酶時(shí)，產(chǎn)生約30g/l水平的草酸作為副產(chǎn)品。必須去 除大部分的草酸以避免在過氧化氫酶產(chǎn)品中不可控的沉淀。因此，用CaCl2W黑曲霉發(fā)酵培 養(yǎng)基中將草酸沉淀為草酸鈣。在里氏木霉中生產(chǎn)過氧化氫酶導(dǎo)致明顯較低水平的草酸。在 四次不同的里氏木霉發(fā)酵后，平均的草酸濃度僅為1. 24士0. 15g/l。有利地，這排除了進(jìn)行 草酸沉淀的需要。使用方法本發(fā)明提供了將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的方法，包括將過氧化氫與本文所述的 在木霉宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的過氧化氫酶接觸?？梢允褂冒l(fā)明的方法的應(yīng)用包括但不限于，在 織物漂白、紙漿或紙漂白后去除過氧化氫，或作為殺生物劑使用。用于本文描述的過氧化氫 酶的合適的處理?xiàng)l件的非限制性實(shí)例包括ph 3-9，20-80°c和高達(dá)5000ppm的過氧化氫。組合物本發(fā)明還提供了包含如本文所述在木霉宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的過氧化氫酶的組合物。 此類組合物可用于將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以以液體、固體、全肉湯液體或全肉湯固體制劑來提供過氧
化氫酶。在一些實(shí)施方案中，可以在ph約3-9提供澄清的過氧化氫酶，具有活性濃度范 圍約800至20，000U/g。液體制劑可以包括多元醇，例如5-40%山梨醇或甘油，鹽，例如 5-20%氯化鈉，緩沖劑，包括檸檬酸、磷酸或乙酸鹽，及其他成分，例如0.01-2%甲酸鹽和/ 或0.01-2%亞亞硝酸鈉，和/或抗微生物劑，例如山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸酯和/ 或Proxel (1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)。試劑盒本發(fā)明還提供了試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒提供了如本文所述在木霉宿 主細(xì)胞中生產(chǎn)的過氧化氫酶，任選地使用過氧化氫酶的說明，例如在織物漂白、紙漿或紙漂白后去除過氧化氫，和/或作為殺生物劑使用的方法或應(yīng)用。提供了合適的包裝。如本文 中使用的，“包裝”指系統(tǒng)中常規(guī)使用的固體基質(zhì)或材料，并且其能夠保持試劑盒的固定有 限的組分，例如過氧化氫酶。提供的說明可以是印刷的形式，或電子介質(zhì)的形式，例如軟盤、⑶或DVD，或網(wǎng)站 地址的形式，從所述網(wǎng)址地址可以獲得說明。下列實(shí)施例意在闡明，而并非限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)津 DTrex3gM (CATE)表汰載體通過修飾pTrex3g(描述在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 05/001036中)產(chǎn)生尺寸更小的質(zhì)粒 pTrex3gM。pTrex3gM與pTrex3g的區(qū)別主要在于負(fù)責(zé)質(zhì)粒在細(xì)菌中復(fù)制的序列。通過聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從PUC19擴(kuò)增復(fù)制起點(diǎn)和青霉素抗性基因來構(gòu)建pTreX3gM，使用兩種引 物對(duì)oM0B5(GGTTCTAGAGGCCTAAATGGCCATGAGACAATAACCCTGATAAATGC)(SEQ ID NO 5)力口oM0B31(AAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATC)(SEQ ID NO 6)；禾口oM0B51(TCGGCCCTGCAGGCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC)(SEQ ID NO 7)力口oM0B3(GGTTCTAGAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG)(SEQ ID NO :8)。用PstI和XbaI消化獲得的兩種PCR產(chǎn)物，并與pTrex3g的6. 17kb的XbaI-XbaI 片段連接，產(chǎn)生pTrex3gM表達(dá)載體。圖3中示例了 pTrex3gM的結(jié)構(gòu)。使用高保真DNA聚合酶PfuUltra II (Stratagene)擴(kuò)增來自黑曲霉菌株FSl (GICC 20047)的CatR基因的完整編碼區(qū)(包括內(nèi)含子)(SEQ ID NO :2)，該擴(kuò)增使用引物對(duì)oCAT 5 1 (CACCAAACAATAACAACAACAACAAACAACAACAACAACAACAAC ATGCGTCATTTCTGGCTTTTGCCAG)(SEQ ID NO 9)和 oCAT 3 (CGTGATACCCTTACTCATCCAGCGC) (SEQ ID NO 10)。除了 CatR基因的全部編碼區(qū)外，獲得的PCR產(chǎn)物還含有源自真菌病毒PcV的富AC 的5’非翻譯區(qū)。已經(jīng)提示了該區(qū)域作為“翻譯增強(qiáng)子”的可能功能(Jiang等人，(2004) J. Gen. Virol. 85 :2111-2121)。將 PCR 產(chǎn)物克隆到 pENTR 載體(Stratagene)中，然后使用 來自Invitrogen的Gateway⑧克隆系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到pTrex3gM (CATE)載體中，示例在圖4中。實(shí)施例2轉(zhuǎn)化里氏木霉和篩選轉(zhuǎn)化的菌株里氏木霉菌株Morph 1. 1 (pyr+)是四缺失RL-P37菌株的自發(fā)pyr4回復(fù)體(描 述在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 05/001036中)。將從該菌株新鮮收獲的孢子懸浮在冰冷的1. 2M山 梨醇中，用相同的溶液洗滌2次，并用來自pTrex3gM(CATE)質(zhì)粒的純化的7. 04kb含catR 的SfiI-SfiI片段進(jìn)行電穿孔。電穿孔參數(shù)如下電壓-16kV/cm;電容_25μΡ;電 阻-50Ω。在電穿孔后，在旋轉(zhuǎn)搖床上，在含有IM山梨醇、0. 3%葡萄糖、0. 3% Bacto蛋白胨
13和0. 15%酵母提取物的培養(yǎng)基中培育孢子過夜(30°C;200rpm)。將萌發(fā)的孢子平板接種在 含有以乙酰胺為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基(乙酰胺0. 6g/l ；氯化銫1. 68g/l ；葡萄糖20g/ 1 ；磷酸二氫鉀15g/l ；七水合硫酸鎂0. 6g/l ；無水氯化鈣0. 6g/l ；硫酸亞鐵5mg/l ；硫酸鋅 1. 4mg/l ；氯化亞鈷lmg/1 ；硫酸亞錳(II) 1. 6mg/l ；瓊脂20g/l ；pH 4. 25)上。約1周出現(xiàn) 轉(zhuǎn)化的菌落。將單個(gè)轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到新鮮的乙酰胺選擇平板上，讓其生長(zhǎng)2-4天。將在選擇性培養(yǎng)基上表現(xiàn)出穩(wěn)定生長(zhǎng)的分離物用于接種在微量滴定板的孔中的 0. 17ml 的乳糖確定成分培養(yǎng)基(W0 2005/001036，第 60 頁，(NH4)2SO4 5g/l ；PIPPS 緩沖 液 33g/l ；Bacto 酪蛋白氨基酸 9g/l ；KH2PO4 4. 5g/l ；CaCl2*2H20 1. 32g/l ；MgS04*7H20 lg/ 1 ；Mazu DF204 5ml/l ；400X 痕量元素 2. 5ml/l ；pH 5. 5 ；乳糖(單獨(dú)滅菌)16g/l。400X 痕 量元素溶液檸檬酸(無水)175g/l ；FeS04*7H20 200g/l ；ZnS04*7H20 16g/l ；CuS04*5H20 3. 2g/l ;MnS04*4H20 1. 4g/l ；H3BO3 0. 8g/l)中，所述孔的底部裝有微濾膜(Millipore MultiScreen-GV )。在純氧的氣氛中，在25_28°C溫育平板4_5天。過濾分離培養(yǎng)基，并通 過二十烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。觀察到比成熟的過氧 化氫酶多肽的計(jì)算分子量略大的一條新蛋白質(zhì)條帶。該差異可能是由于糖基化。在過氧化 氫酶條帶中的蛋白質(zhì)的量表現(xiàn)出強(qiáng)烈的克隆差異。選擇具有最高過氧化氫酶表達(dá)的克隆， 使能夠在土豆_右旋糖瓊脂上形成孢子，并通過分離單孢子亞克隆進(jìn)行純化。在轉(zhuǎn)化的里氏木霉中生產(chǎn)的過氧化氫酶是催化活性的。例如，將克隆329(如上 所述生長(zhǎng))的少量等分試樣(10 μ 1)的培養(yǎng)基與200μ1的I1^H2O2混合，導(dǎo)致立即可見的 H2O2降解，伴隨強(qiáng)烈的分子氧發(fā)生(可見氣泡)。用來自親本菌株Morph l.Kpyr+)的培養(yǎng) 基沒有觀察到此類反應(yīng)。實(shí)施例3比較里氏木霉和黑曲霉中表達(dá)的過氧化氫酶的表達(dá)和分布樣品制備如實(shí)施例2所述在里氏木霉中，并且如美國(guó)專利號(hào)5，360，732和5，360，901所述 在黑曲霉中生產(chǎn)過氧化氫酶(黑曲霉catR)。在4000rpm(3210xg)離心30ml樣品15分鐘。 倒出上清液，用50ml去離子水洗滌沉淀。然后，在4000rpm離心洗滌的細(xì)胞15分鐘，倒出上 清液，用50ml去離子水洗滌沉淀。在4000rpm再次離心洗滌的細(xì)胞15分鐘，倒出上清液。 用干冰冷凍細(xì)胞沉淀。黑曲霉的平均細(xì)胞質(zhì)量(干細(xì)胞重)為43.3g/kg，里氏木霉的平均 細(xì)胞質(zhì)量為43. 9g/kg。化學(xué)提取將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，懸浮在40ml去離子水中。然后，在30°C水浴溫育細(xì) 胞，用磁力攪拌器溫和混合。添加25ml提取貯存液(50g/lNaCl ；6g/l山梨酸鉀；12g/l甲 酸鈉；12g/l乙酸；添加約6g/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4. 8-5. 0 ；0. lg/Ι蛋白酶-C)，然后將pH 調(diào)節(jié)至4. 8-5.2。疏松的封閉樣品瓶頂部，然后繼續(xù)溫育72-84小時(shí)。將獲得的樣品溶液轉(zhuǎn) 移到IOOml燒杯中，并測(cè)量體積。然后使用Baker過氧化氫酶測(cè)定方法測(cè)定過氧化氫酶活 性。Raker過氧化氫酶測(cè)定Baker過氧化氫酶測(cè)定是“雙耗盡”分析，其基于過氧化氫對(duì)過氧化氫酶的失活作 用及同時(shí)過氧化氫酶對(duì)過氧化氫的分解。在實(shí)踐中，在pH7. 0和25°C與過氧化氫酶溫育60分鐘后，分析反應(yīng)混合物中剩余的過氧化氫。一個(gè)Baker單位定義為在檢測(cè)條件下，將降解 264mg過氧化氫的過氧化氫酶的量。試劑的制備將0. 2M 磷酸緩沖液，ph 7. 0 ；10. 76g NaH2PO4 和 17. 32g Na2HPO4 稀釋到 800ml 蒸 餾水中，并充分混合。檢測(cè)PH，然后用蒸餾水將溶液調(diào)節(jié)至終體積為1000ml。緩沖的底物500ml的0. 2M磷酸緩沖液，pH 7. 0，與450ml去離子水混合。添加 44-46ml的30%過氧化氫。該溶液在4°C可以穩(wěn)定一周。M硫酸將55.6ml濃縮的H2SO4稀釋到900ml蒸餾水中，充分混合，并使其冷卻。用 蒸餾水將最終體積調(diào)節(jié)至終體積1000ml。40% (w/v)碘化鉀溶液將200g碘化鉀添加到250ml蒸餾水中，充分混合。用蒸 餾水將體積調(diào)節(jié)至500ml。將溶液冷藏(4°C)儲(chǔ)存在棕色瓶中，一周后棄用。1 % (w/v)鉬酸銨溶液將1. Og(NH4)6Mo7O24 · 4H20添加到90ml蒸餾水中，充分混 合。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至100ml。0. 25M硫代硫酸鈉溶液將62g Na2S2O3 · 5H20添加到900ml蒸餾水中，充分混合。 用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1000ml。該溶液不能儲(chǔ)存超過一周。測(cè)定方法將樣品按下列方法一式三份進(jìn)行測(cè)定1、將 5ml 的 1. OM 硫酸移液到 IOOml 錐形瓶(Erlenmeyer flask)中。2、將4. Oml緩沖底物移液到硫酸中，并添加5ml的40%碘化鉀溶液。渦旋混合。3、添加2滴1 %鉬酸銨溶液，并立即用0. 25M硫代硫酸鈉溶液滴定。4、當(dāng)游離碘的顏色完全消失時(shí)，達(dá)到滴定終點(diǎn)。若干分鐘后可以恢復(fù)顏色，但應(yīng)該 忽視。5、應(yīng)該獲得14至16ml的滴定體積。如果需要，調(diào)節(jié)緩沖底物溶液中的過氧化氫 濃度，獲得該滴定體積。6、將50ml等分體積的緩沖底物分散到稍微加蓋的IOOml錐形瓶中，所述錐形瓶在 25°C水浴中預(yù)溫育15分鐘。7、用0. 2M磷酸緩沖液稀釋過氧化氫酶樣品至5_9Baker單位/ml。8、以3分鐘的時(shí)間間隔將200 μ 1稀釋的過氧化氫酶樣品移液到預(yù)溫育的IOOml 錐形瓶中，并立即通過渦旋混合。9、在25°C水浴中溫育60分鐘。偶爾振蕩從反應(yīng)混合物中釋放氧氣。10、在溫育期末，振蕩反應(yīng)混合物直到去除所有的氧氣。11、通過使用上文步驟1-4中描述的方法分析剩余的過氧化氫(將4. Oml測(cè)試溶 液移液到硫酸中，并遵循步驟2-4)。12、應(yīng)該相似的溫育并分析底物空白，所述空白使用2001的0. 2M磷酸緩沖液替代 步驟8中稀釋的過氧化氫酶樣品。(空白應(yīng)該需要14-16ml滴定體積)。計(jì)算活性以Baker單位(U/ml)計(jì)算過氧化氫酶活性=(B-S) xDFB是空白的滴定體積(ml)S是樣品的滴定體積(ml)
DF是樣品的稀釋因子出于最大精確度，差值(B-S)應(yīng)該在5-10ml。MM表1顯示了結(jié)果。表權(quán)利要求
生產(chǎn)能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽的方法，包括在木霉宿主細(xì)胞中從編碼該多肽的多核苷酸表達(dá)所述多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽是來自黑曲霉(A.niger)的過氧化氫酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含黑曲霉catR基因。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸編碼包含SEQID NO :1所示氨基酸序列的多肽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述木霉宿主細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述多肽在里氏木霉中的表達(dá)比相同多肽在黑曲霉中的表 達(dá)高至少約50%。
7.權(quán)利要求5的方法，其中從所述里氏木霉宿主細(xì)胞分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所述多肽 的量比所述多肽從黑曲霉宿主細(xì)胞中分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的量高至少約80%。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述木霉宿主細(xì)胞包含內(nèi)源T基因的缺失。
9.生產(chǎn)能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽的方法，包括(a)用包含編碼所述多肽的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化木霉宿主細(xì)胞；(b)在適合所述多肽表達(dá)的條件下，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述木霉宿主細(xì)胞；和(c)從所述生長(zhǎng)基質(zhì)中分離所述多肽。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述多肽是來自黑曲霉的過氧化氫酶。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述多核苷酸包含黑曲霉catR基因。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述多核苷酸編碼包含SEQID NO :1所示氨基酸序列的 多肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述木霉宿主細(xì)胞是里氏木霉細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述多肽在里氏木霉中的表達(dá)比相同多肽在黑曲霉中的 表達(dá)高至少約50%。
15.權(quán)利要求14的方法，其中從所述里氏木霉宿主細(xì)胞分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所述多 肽的量比所述多肽從黑曲霉宿主細(xì)胞中分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的量高至少約80%。
16.權(quán)利要求9的方法，其中所述木霉宿主細(xì)胞包含內(nèi)源T基因的缺失。
17.能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽，其中所述多肽是根據(jù)權(quán)利要求1 的方法生產(chǎn)的。
18.權(quán)利要求17的多肽，其中所述木霉宿主細(xì)胞包含內(nèi)源T基因的缺失。
19.能夠催化過氧化氫酶促轉(zhuǎn)化為氧氣和水的多肽，其中所述多肽是根據(jù)權(quán)利要求9 的方法生產(chǎn)的。
20.權(quán)利要求19的多肽，其中所述木霉宿主細(xì)胞包含內(nèi)源T基因的缺失。
21.將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的方法，包括將所述過氧化氫與權(quán)利要求17的多肽接觸。
22.將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水的組合物，其包含權(quán)利要求19的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了在木霉宿主細(xì)胞中表達(dá)過氧化氫酶的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在里氏木霉中表達(dá)來自黑曲霉的catR基因，獲得與黑曲霉中catR表達(dá)相比提高的過氧化氫酶產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101960006SQ200980107269
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者A·米亞斯尼科夫, K·M·霍夫曼, M·華德, T·C·道奇 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司