專利名稱：表達血凝素之轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)的重組流感病毒樣顆粒(vlp)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒樣顆粒的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及包含流感抗原之病毒樣 顆粒的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
流感是人由于呼吸道病毒引起的死亡的首要原因。常見的癥狀包括發(fā)熱、喉嚨 疼痛、氣短和肌肉酸痛等。在流感季節(jié)，流感病毒感染全世界10 20 %的人口，每年導(dǎo)致 250 500，000人死亡。流感病毒是從受感染之哺乳動物和禽類細胞的質(zhì)膜出芽的包膜病毒。根據(jù)所存在 的核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原，流感病毒分為A型、B型或C型。根據(jù)所存在的血凝素(HA)和神 經(jīng)氨酸酶(NA)表面糖蛋白的組合，A型流感病毒可進一步分成若干亞型。HA支配病毒與宿 主細胞結(jié)合以及穿入宿主細胞的能力。NA從宿主細胞和病毒表面蛋白上的聚糖鏈除去末端 唾液酸殘基，這防止病毒凝集并有利于病毒運動。目前，已鑒定出16種HA(H1-H16)和9種 NA(N1-N9)亞型。每種A型流感病毒具有一種HA糖蛋白類型和一種NA糖蛋白類型。一般 而言，每種亞型均表現(xiàn)出物種特異性；例如，已知所有HA和NA亞型均感染鳥類，而只有HI、 H2、H3、H5、H7、H9、H10、m、N2、N3 和 N7 顯示感染人類(Horimoto 2006 ；Suzuki 2005)。含 有H5、H7和H9的流感病毒被認為是致病性最強的A型流感病毒形式，并且最有可能引起將 來的大流行。流感大流行通常由高傳播性且致病性強的流感病毒引起，并可導(dǎo)致全球性疾病和 死亡水平升高。在20世紀，新的A型流感亞型的出現(xiàn)導(dǎo)致四次主要的大流行。1918 1919 年由Hmi病毒引起的西班牙流感在1917年至1920年之間導(dǎo)致世界范圍內(nèi)超過五千萬人 死亡。當(dāng)前，新亞型出現(xiàn)的風(fēng)險或者動物中特有的亞型向人傳播的風(fēng)險總是存在。特別受 到關(guān)注的是高致病性形式的禽流感(也稱作“鳥流感”)，據(jù)報道其已經(jīng)在全世界若干國家 爆發(fā)。在許多情形下，該禽流感可在48小時內(nèi)導(dǎo)致接近100%的死亡率。據(jù)推測，1997年 在香港首次鑒定的禽流感病毒(H5N1)向其它亞洲國家和歐洲的傳播與野生鳥類的遷徙模 式有關(guān)。目前對抗人中流感的方法是每年接種疫苗。疫苗通常是預(yù)測為即將到來之“流感 季節(jié)”強勢毒株(dominant strain)的幾種毒株的組合。所述預(yù)測由世界衛(wèi)生組織來協(xié)調(diào) 完成。一般而言，每年生產(chǎn)的疫苗劑量數(shù)不足以接種全世界的人群。例如，加拿大和美國獲 得足以免疫其約三分之一人口的疫苗劑量，而歐盟僅有17%的人口可接種疫苗。很顯然，在 世界范圍的流感大流行到來時，目前全世界的流感疫苗生產(chǎn)不能滿足需求。即使所需的年產(chǎn)量在給定年份中可以某種方式實現(xiàn)，然而強勢毒株每年都在變化，因此在一年的低需求 時間大量儲備是不切實際的。經(jīng)濟地、大規(guī)模地生產(chǎn)有效流感疫苗是政府和私營企業(yè)等非 常關(guān)心的。用于疫苗中的病毒儲液是在受精的蛋中生產(chǎn)的。收獲病毒顆粒，為了得到滅活病 毒疫苗，通過去污劑破壞進行滅活。減毒活疫苗由適于在低溫下生長的流感病毒制備，這意 味著在正常體溫下所述疫苗的毒力減弱。這樣的疫苗在美國被批準(zhǔn)用于5 49歲的個體。 全病毒滅活疫苗是通過化學(xué)試劑滅活而變?yōu)闊o害的，并且其已在胚蛋或哺乳動物細胞培養(yǎng) 物中生產(chǎn)。所有這些類型的疫苗都顯示出一些特定的優(yōu)點和缺點。全病毒來源之疫苗的一 個優(yōu)點是這種疫苗所引起的免疫類型。通常，裂解型疫苗誘導(dǎo)強的抗體應(yīng)答，而由全病毒制 得的疫苗誘導(dǎo)抗體(體液)應(yīng)答和細胞應(yīng)答。盡管功能性抗體應(yīng)答是與疫苗誘導(dǎo)之保護作 用相關(guān)的獲批標(biāo)準(zhǔn)，然而越來越多的證據(jù)表明T細胞應(yīng)答對流感免疫也很重要，其還可為 老年人提供更好的保護。為了誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，開發(fā)了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒株(例如H5m) 的高致病性，因此在BL3+設(shè)備中生產(chǎn)這些疫苗。對于高致病性流感毒株(例如H5N1)來 說，為了降低流感毒株的致病性、使其無毒且更容易在胚蛋或哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)， 一些制造商對血凝素的基因序列進行了修飾。另一些人還使用重排列(reassortant)流感 株，其中血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白的基因序列被克隆進高產(chǎn)量、低致病性的流感供體株(A/ PR/8/34 ；Quan F_S等，2007)中。盡管這些方法可產(chǎn)生有用的疫苗，但是它們不能提供以滿 足正常年份全球需求的所需規(guī)模來大量、低成本及快速生產(chǎn)疫苗的解決方法，并且當(dāng)大流 行到來時幾乎必然地不能滿足需求。利用該反向遺傳技術(shù)，還可能需要對HA蛋白的基因序列進行突變以使其無毒。就 高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生產(chǎn)需要防護(confinement)程序或者所得疫苗不與 循環(huán)病毒的基因序列完全匹配。在減毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可與來自宿 主的流感病毒重組而產(chǎn)生新流感病毒的風(fēng)險。盡管該方法保持了抗原表位和翻譯后修飾，但是該方法存在許多缺點，包括由于 使用全病毒而引起的污染風(fēng)險以及取決于病毒株的可變的產(chǎn)量。亞最佳水平的保護可由以 下原因?qū)е掠捎趯⒉《疽氲爸卸鸬牟《具z傳異質(zhì)性。其它缺點包括為了獲得蛋而 進行大量計劃，由于在純化中使用的化學(xué)品引起的污染風(fēng)險以及生產(chǎn)時間長。此外，對蛋中 蛋白質(zhì)過敏的人可能不適于接種所述疫苗。在大流行的情形中，裂解型疫苗的生產(chǎn)受到需要使毒株適于在蛋中生長以及所得 產(chǎn)量不同的限制。盡管此技術(shù)用于生產(chǎn)季節(jié)性疫苗已使用了多年，但是它很難在合理的時 間范圍內(nèi)響應(yīng)于大流行，并且世界范圍的生產(chǎn)能力有限。為了避免使用蛋，已經(jīng)在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中(例如在MDCK或PERC. 6細胞等 中)生產(chǎn)流感病毒。另一種方法是反向遺傳方法，其中通過用病毒基因轉(zhuǎn)化細胞來生產(chǎn)病 毒。然而，這些方法也需要使用全病毒以及精準(zhǔn)的方法和特定的培養(yǎng)環(huán)境。已開發(fā)了幾種作為候選重組流感疫苗的重組產(chǎn)物。這些方法關(guān)注A型流感病毒HA 和NA蛋白的表達、制備以及純化，包括利用桿狀病毒感染的昆蟲細胞(Crawford等，1999 ； Johansson, 1999)、病毒載體和DNA疫苗構(gòu)建體(Olsen等，1997)來表達這些蛋白質(zhì)。流感病毒感染的特異性是公知的。簡言之，感染循環(huán)是從病毒體表面HA蛋白與含有唾液酸的細胞受體(糖蛋白和糖脂)結(jié)合開始的。NA蛋白介導(dǎo)對唾液酸受體的處理，病 毒穿入細胞則取決于HA依賴性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。在含有流感病毒體的內(nèi)化內(nèi)涵體的 酸性界限內(nèi)，HA蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，這導(dǎo)致病毒與細胞膜融合，病毒脫殼以及M2介導(dǎo)的從 核衣殼相關(guān)核糖核蛋白(RNP)釋放Ml蛋白，Ml蛋白遷移到細胞核內(nèi)用于病毒RNA合成?？?HA蛋白的抗體通過中和病毒感染性來預(yù)防病毒感染，而抗NA蛋白的抗體介導(dǎo)其對病毒復(fù) 制早期步驟的作用。Crawford等(1999)公開了流感病毒HA在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的表達。 所表達的蛋白質(zhì)被描述為能夠預(yù)防由禽類H5和H7流感亞型引起的致命性流感疾病。 Johansson等(1999)教導(dǎo)了桿狀病毒表達的流感病毒HA和NA蛋白在動物中誘導(dǎo)了優(yōu)于常 規(guī)疫苗所誘導(dǎo)之應(yīng)答的免疫應(yīng)答。桿狀病毒表達的馬流感病毒血凝素的免疫原性和效力可 與同源DNA候選疫苗相比較(Olsen等，1997)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，使用多種實驗方法以 及在不同動物模型中，可利用重組HA或NA蛋白誘導(dǎo)針對流感病毒攻擊的高度保護。由于先前的研究已顯示表面流感病毒糖蛋白HA和NA是用于誘導(dǎo)針對流感病毒之 保護性免疫的主要靶標(biāo)，并且Ml提供了用于流感病毒之細胞免疫的保守性靶標(biāo)，所以新的 候選疫苗可作為蛋白質(zhì)大分子顆粒(例如病毒樣顆粒(VLP))包含這些病毒抗原。作為疫 苗產(chǎn)品，VLP提供了如下優(yōu)點比亞基或重組抗原具有更強的免疫原性，能刺激體液和細胞 免疫應(yīng)答(Grgacic和Anderson，2006)。此外，含有這些流感抗原的顆粒可展示出構(gòu)象表 位，其誘導(dǎo)針對多種流感病毒株的中和抗體。生產(chǎn)用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免發(fā)生意外感染的一種方法。作為 替代，已研究出用作培養(yǎng)病毒之替代物的病毒樣顆粒(VLP)。VLP模擬病毒衣殼的結(jié)構(gòu)，但 缺少基因組，因此不能復(fù)制或提供二次感染的機會。一些研究表明，使用哺乳動物表達質(zhì)?；驐U狀病毒載體，重組流感病毒蛋白在細 胞培養(yǎng)物中自組裝成 VLP (Gomez-Puertas 等，1999 ；Neumann 等，2000 ；Latham 和 Galarza， 2001)。Gomez-Puertas等(1999)公開了流感病毒VLP的有效形成取決于幾種病毒蛋白質(zhì) 的表達水平。Neumann等(2000)建立了基于哺乳動物表達質(zhì)粒的系統(tǒng)，其用于完全從克隆 cDNA產(chǎn)生感染性流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza (2001)報道了在用共表達HA、NA、M1 和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中形成流感病毒VLP。這些研究表明，流感病毒 體蛋白質(zhì)可在真核細胞中共表達后進行自組裝。Gomez-Puertas等(2000)教導(dǎo)，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基質(zhì)蛋白(Ml) 對于VLP從昆蟲細胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007)教導(dǎo)了 Ml可能不是VLP形成 所需的，并觀察到Ml和VLP的有效釋放需要存在HA和由NA提供的唾液酸酶活性。NA切割 產(chǎn)生VLP之細胞表面上的糖蛋白的唾液酸，并將VLP釋放到介質(zhì)中。Quan等(2007)教導(dǎo)了在桿狀病毒表達系統(tǒng)(昆蟲細胞)中產(chǎn)生的VLP疫苗誘導(dǎo) 針對某些流感病毒株(A/PR8/34(Hmi))的保護性免疫。經(jīng)觀察，Quan所研究的VLP從質(zhì) 膜出芽，并被認為具有合適的大小和形態(tài)，與在哺乳動物系統(tǒng)(MDCK細胞)中得到的相似。PCT 公開 W0 2004/098530 和 W0 2004/098533 教導(dǎo)了在培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化 NT-1 (煙草) 細胞中表達新城疫病毒HN或禽流感病毒A/火雞/威斯康星/68 (H5N9)。包含植物細胞培 養(yǎng)物所表達多肽的組合物可在兔和雞中誘發(fā)不同的免疫應(yīng)答。包膜病毒可在從感染細胞“出芽”時獲得脂質(zhì)包膜，并且從質(zhì)膜獲得膜，或者從內(nèi)
6部細胞器的質(zhì)膜獲得膜。流感病毒顆粒和VLP從宿主細胞的質(zhì)膜出芽。例如，在哺乳動物 或桿狀病毒細胞系統(tǒng)中，流感病毒從質(zhì)膜出芽(Quan等，2007)。已知僅有少數(shù)包膜病毒感 染植物(例如，番茄斑萎病毒屬(Topovirus)和彈狀病毒屬(Rhabdovirus)的成員)。在已 知的植物包膜病毒中，它們的特征在于從宿主細胞的內(nèi)膜出芽，而不是從質(zhì)膜出芽。雖然已 在植物宿主中產(chǎn)生了少數(shù)的重組VLP，但是它們均非源自質(zhì)膜，于是提出了這樣的問題—— 是否可以在植物中生產(chǎn)質(zhì)膜來源的VLP(包括流感病毒VLP)。目前的流感病毒VLP生產(chǎn)技術(shù)依賴于多種病毒蛋白質(zhì)的共表達，這種依賴性代表 了這些技術(shù)的缺點，這是因為在全世界大流行和每年流行的情形中，響應(yīng)時間對于疫苗接 種來說是至關(guān)重要的。例如，依賴于表達一種或很少病毒蛋白且不需要表達病毒非結(jié)構(gòu)蛋 白的更為簡單的VLP生產(chǎn)系統(tǒng)對加快疫苗的開發(fā)來說是有必要的。為了保護全世界人口免于患流感并且擊退將來的大流行，疫苗生產(chǎn)商需要開發(fā)有 效的、快速的生產(chǎn)疫苗制劑的方法。目前使用受精的蛋生產(chǎn)疫苗不能滿足需求，并且生產(chǎn)過 程長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供改進的流感病毒樣顆粒(VLP)。本發(fā)明提供了核酸，其包含編碼來自包膜病毒之抗原的核苷酸序列，所述核苷酸 序列與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接。所述抗原可以是流感病毒血凝素(HA)。所述HA可包含天然或非天然的信號肽；所述非天然的信號肽可以是蛋白質(zhì)二硫 鍵異構(gòu)酶信號肽。所述核酸編碼的HA可以是A型流感病毒、B型流感病毒或者是A型流感病毒的亞 型，其選自包含機、!12、!13、!14、!15、!16、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、!115 和 H16 的組。 在本發(fā)明的一些方面中，由所述核酸編碼的HA可來自A型流感病毒，并選自包含H1、H2、H3、 H5、H6、H7 和 H9 的組。本發(fā)明還提供了在植物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括a)將與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接的、編碼來自包膜病毒之抗原(例如流 感病毒血凝素(HA))的核酸導(dǎo)入植物或其部分中，以及b)在允許表達所述核酸的條件下培養(yǎng)所述植物或其部分，從而產(chǎn)生VLP。所述方法還可包括收獲所述植物以及從所述植物組織中純化或分離VLP的步驟。所述方法還可在導(dǎo)入步驟(步驟a)中包含含有編碼一種或多種伴侶蛋白之核苷 酸序列的核酸。所述一種或多種伴侶蛋白可選自包含Hsp40和Hsp70的組。本發(fā)明包括上述方法，其中在導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述核酸可在植物中瞬時表 達或在植物中穩(wěn)定表達。此外，可使用體積排阻色譜對VLP進行純化。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在植物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其 包括提供了包含如下核酸的植物或植物部分，所述核酸包含與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有 效連接的、編碼來自包膜病毒之抗原的核苷酸序列，并在允許表達所述核酸的條件下培養(yǎng) 所述植物或其部分，從而產(chǎn)生VLP。所述方法還可包括收集植物以及從植物組織中純化或分離VLP的步驟。
本發(fā)明包括上述方法，其中在提供步驟后，導(dǎo)入這樣的核酸，其包含與在植物中有 活性的調(diào)控區(qū)有效連接的、編碼一種或多種伴侶蛋白的核苷酸序列；以及在允許表達所述 核酸的條件下培養(yǎng)所述植物或植物部分，從而產(chǎn)生VLP。所述一種或多種伴侶蛋白可選自包含Hsp40和Hsp70的組。本發(fā)明包括上述方法，其中在導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述編碼HA的核酸在植物中 穩(wěn)定表達。此外，可使用體積排阻色譜對VLP進行純化。本發(fā)明還提供了病毒樣顆粒(VLP)，其包含流感病毒HA蛋白以及一種或多種源自 植物的脂質(zhì)。所述VLP的HA蛋白可以來自A型流感病毒、B型流感病毒或者是A型流感病毒HA 的亞型，其選自 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16。在 本發(fā)明的一些方面中，所述HA來自A型流感病毒，并選自包含HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9 的組。此外，本發(fā)明還涉及包含有效劑量之VLP的組合物，該VLP包含流感病毒HA蛋白、 一種或多種植物脂質(zhì)以及可藥用載體。本發(fā)明還涉及在植物中形成VLP的HA蛋白片段或部分。本發(fā)明還涉及包含具有植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖之流感病毒HA的 VLP。所述VLP的HA蛋白可以來自A型流感病毒、B型流感病毒或者是A型流感病毒HA的 亞型，其選自 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16。在本 發(fā)明的一些方面中，所述HA來自A型流感病毒，并選自包含HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9的組。所述VLP可包含一種或多種亞型的HA蛋白，包括HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15或H16或者其片段或部分。含有這些HA蛋白的亞型的 實例包括A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/2006 (H5N1)、A/雞/紐約 /1995、A/ 銀鷗 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、A/ 綠頭鴨 /MN/33/00、A/ 鴨 / 上海 /1/2000、A/ 針尾鴨 /TX/828189/02、A/ 火雞 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56(H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾伯達 /60/76 (H12N5)、A/ 鷗 / 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大 利亞 /341/83 (H15N8)、A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99 (H16N3)、B/Lee/40、C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、A/ 波多黎各 /8/34 (Hmi)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 3/2006 (HlNl)、A/ 布 里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 馬來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅里 達 /4/2006、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安微 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)。在本發(fā)明的一個方面中，所述HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亞型。在另 一方面中，所述Hl蛋白可來自A/新喀里多尼亞Λ0/99 (HlNl)、A/波多黎各/8/34 (HlNl)、 A/布里斯班/59/2007 (HlNl)或A/所羅門群島3/2006 (HlNl)株。所述H3蛋白可來自A/ 布里斯班10/2007 (H3N2)或A/威斯康星/67/2005 (H3N2)株。在本發(fā)明的又一方面中，所述 H2蛋白可來自A/新加坡/1/57(H2N2)株。所述Η5蛋白可來自A/安徽/1/2005 (H5m)、Α/ 越南/1194/2004 (Η5Ν1)或A/印度尼西亞/5/2005株。在本發(fā)明的一個方面中，所述Η6蛋 白可來自A/水鴨/香港/W312/97 (Η6Ν1)株。所述Η7蛋白可來自A/馬/布拉格/56 (Η7Ν7)
8株。在本發(fā)明的一個方面中，所述H9蛋白來自A/香港/1073/99(H9N2)株。在本發(fā)明的又 一方面中，所述HA蛋白可來自可以是B型病毒的流感病毒，包括B/馬來西亞/2506/2004 或B/佛羅里達/4/2006。來自Hl、Η2、Η3、Η5、Η6、Η7、Η9或B亞型的HA蛋白的氨基酸序列 的實例包括SEQ ID NO 48-59ο所述流感病毒HA蛋白可以是Η5(印度尼西亞)。本發(fā)明還提供了包含編碼HA蛋白之序列的核酸分子。所述核酸分子還可包含 與所述編碼HA蛋白之序列有效連接的一個或多個調(diào)控區(qū)。所述核酸分子可包含編碼HI、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、B 或 C 亞型的序列。在本 發(fā)明的另一個方面中，由所述核酸分子編碼的HA蛋白可以是HI、H2、H3、H5、H6、H7、H9或 B亞型。所述核酸分子編碼的Hl蛋白來自A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/波多黎各 /8/34 (HlNl)、A/布里斯班/59/2007 (HlNl)或A/所羅門群島3/2006 (HlNl)株。在本發(fā)明 的一個方面中，所述核酸分子編碼的H3蛋白可來自A/布里斯班10/2007 (H3N2)或A/威斯 康星/67/2005 (H3N2)株。在本發(fā)明的又一方面中，所述核酸分子編碼的H2蛋白可來自A/ 新加坡/1/57 (H2N2)株。所述核酸分子編碼的H5蛋白可來自A/安微/l/2005(H5m)、A/ 越南/1194/2004 (H5N1)或A/印度尼西亞/5/2005株。在本發(fā)明的一個方面中，所述核酸 分子編碼的H6蛋白可來自A/水鴨/香港/W312/97(H6m)株。所述核酸分子編碼的H7蛋 白可來自A/馬/布拉格/56 (H7N7)株。另外，所述核酸分子編碼的H9蛋白可來自A/香港 /1073/99 (H9N2)株。所述核酸編碼的B亞型HA蛋白可來自B/佛羅里達/4/2006或B/馬 來西亞/2506/2004株。編碼來自Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亞型的這些HA蛋白的核酸 分子序列的實例包括SEQ ID NO 36-47和60-73。所述核酸序列可編碼流感病毒HA蛋白H5 (印度尼西亞)?？膳c編碼HA蛋白之序列有效連接的調(diào)控區(qū)包括在植物細胞、昆蟲細胞或酵母細 胞中可操作的調(diào)控區(qū)。這樣的調(diào)控區(qū)可包括質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 / 力口氧Bl (Ribulose 1, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase, RuBisCO) i周控區(qū)、卩十參錄素 a/b結(jié)合蛋白(CAB)、ST-LS1、多角體蛋白調(diào)控區(qū)或gp64調(diào)控區(qū)。其它調(diào)控區(qū)包括5’ UTR、 3’UTR或終止子序列。所述質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)可以是苜蓿質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)；所述5’UTR、3’UTR 或終止子序列也可以是苜蓿序列。還提供了誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法，該方法包括施用含有流感 病毒HA蛋白、一種或多種植物脂質(zhì)和可藥用載體的病毒樣顆粒。所述病毒樣顆?？山?jīng)口、 皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對象。本發(fā)明還涉及病毒樣顆粒(VLP)，其包含源于選自流感病毒、麻疹病毒、埃博拉病 毒、馬爾堡病毒和HIV病毒之病毒的一種或多種蛋白質(zhì)，以及源于非唾液酸化宿主生產(chǎn)細 胞的一種或多種脂質(zhì)。所述HIV蛋白可以是p24、gpl20或gp41 ；所述埃博拉病毒蛋白可以 是VP30或VP35 ；所述馬爾堡病毒蛋白可以是Gp/SGP ；所述麻疹病毒蛋白可以是H蛋白或F 蛋白。另外，本發(fā)明涉及含有流感病毒HA蛋白和一種或多種宿主脂質(zhì)的病毒樣顆粒 (VLP) 0例如，如果宿主是昆蟲，那么所述病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白和一種 或多種昆蟲脂質(zhì)，或者，如果宿主是酵母，那么所述病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋 白和一種或多種酵母脂質(zhì)。
本發(fā)明還涉及組合物，其包含兩種或更多種流感毒株或亞型的VLP。所述兩種或更 多種亞型或毒株可選自-Al新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/2006 (H5N1)、A/ 雞 / 紐約 /1995、A/ 銀鷗 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、A/ 綠頭鴨 /MN/33/00、 A/ 鴨 / 上海 /1/2000、A/ 針尾鴨 /TX/828189/02、A/ 火雞 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴 鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56(H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾 伯達 /60/76 (H12N5)、A/ 鷗 / 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大利亞 /341/83 (H15N8)、A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、 A/ 波多黎各 /8/34 (HlNl)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 3/2006 (HlNl)、A/ 布里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 馬來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅 里達 /4/2006,A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽/1/2005 (H5N1)、A/ 越南/1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)或 A/ 香港/1073/99 (H9N2)。所 述兩種或更多種亞型或毒株的VLP可以大致相等的量存在；或者，一種或多種亞型或毒株 可以占所存在毒株或亞型的大部分。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)動物或靶標(biāo)生物中針對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用 含有一種或多種VLP的有效劑量疫苗，所述VLP是利用非唾液酸化宿主(例如植物宿主、昆 蟲宿主或酵母宿主)生產(chǎn)的。所述疫苗可經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施 用。所述靶標(biāo)生物可選自人、靈長類、馬、豬、鳥(禽)類、水禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、 駱駝、犬科動物、狗、貓科動物、貓、虎、豹、麝貓、水貂、石貂、雪貂、寵物、家畜、小鼠、大鼠、海 豹、鯨等。本發(fā)明提供了用于在能夠生產(chǎn)VLP的合適宿主(例如植物、昆蟲或酵母)中生產(chǎn) 含有來自不同流感毒株之血凝素(HA)的VLP的方法。在植物中生產(chǎn)的VLP含有植物來源 的脂質(zhì)，在昆蟲細胞中生產(chǎn)的VLP含有來自昆蟲細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)(通常稱為“昆蟲脂質(zhì)”)， 在酵母中生產(chǎn)的VLP含有來自酵母細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)(通常稱為“酵母脂質(zhì)”)。本發(fā)明還涉及包含如下核酸的植物、植物組織或植物細胞，所述核酸包含與在植 物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接的、編碼來自包膜病毒之抗原的核苷酸序列。所述抗原可以 是流感病毒血凝素(HA)。所述植物還可包含這樣的核酸，其包含與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接的、 編碼一種或多種伴侶蛋白的核苷酸序列。所述一種或多種伴侶蛋白可選自包含Hsp40和 Hsp70的組。與在昆蟲細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)VLP相比，在植物中生產(chǎn)這些顆粒具有若干優(yōu)點。植 物脂質(zhì)可刺激特定免疫細胞并增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。植物的膜由脂質(zhì)、磷脂酰膽堿(PC) 和磷脂酰乙醇胺(PE)組成，并且還含有植物以及某些細菌和原生動物所特有的鞘糖脂。鞘 脂類之所以不常見的原因是，它們不是甘油酯(例如PC或PE)，而是由與含有18個以上碳 的脂肪酸鏈形成酰胺連接的長鏈氨基醇組成。PC和PE以及鞘糖脂可結(jié)合哺乳動物免疫細 胞(例如抗原呈遞細胞(APC)，如樹突狀細胞和巨噬細胞)和另一些細胞(包括胸腺和肝臟 中的B淋巴細胞和T淋巴細胞))中表達的⑶1分子(Tsuji M，.2006)。此外，除了植物脂 質(zhì)的存在具有潛在的佐劑作用以外，植物N-聚糖促進抗原呈遞細胞捕獲糖蛋白抗原的能 力(Saint-Jore-Dupas，2007)也可能是在植物中生產(chǎn)VLP的優(yōu)點。不希望受理論限制，預(yù)計由植物生產(chǎn)的VLP會比在其它生產(chǎn)體系中制得的VLP誘
10導(dǎo)出更強的免疫反應(yīng)，并且與由活的或減毒的全病毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相比，由這些植 物生產(chǎn)的VLP誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)會更強。與由全病毒制得的疫苗相比，VLP具有優(yōu)勢，這是因為它們無感染性，因此限制性 生物防范問題不再像使用感染性全病毒時那么重要，并且不是生產(chǎn)所必需的。由植物生產(chǎn) 的VLP的另一優(yōu)點是，允許表達系統(tǒng)生長在溫室或田間，從而具有更顯著的經(jīng)濟效益并適 于擴大規(guī)模。另外，植物不含有參與合成唾液酸殘基以及將唾液酸殘基添加到蛋白質(zhì)中的酶。 VLP的生產(chǎn)可以不需要神經(jīng)氨酸酶(NA)，并且不需要共表達NA或者用唾液酸酶(神經(jīng)氨酸 酶)處理生產(chǎn)細胞或提取物以確保在植物中生產(chǎn)VLP。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP不包含已知與RNA結(jié)合的Ml蛋白。RNA是VLP制備物中的 污染物，其在VLP產(chǎn)品獲得監(jiān)管部門審批時是不期望的。所述發(fā)明內(nèi)容不必然描述本發(fā)明的所有特征。


通過以下描述以及參考附圖，本發(fā)明的這些和其它特征會更加明顯，其中圖IA顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用于表達來自A/新喀里多尼亞 /20/99 (HlNl)株之Hl的基于苜蓿質(zhì)體藍素之表達盒的序列(SEQ ID NO :8)。下劃線標(biāo)示 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)信號肽。粗體顯示用于克隆的 BglII(AGATCT)和SacI (GAGCTC)限制性位點。圖IB顯示流感病毒血凝素的功能結(jié)構(gòu)域的 示意圖。切割HAO后，HAl和HA2片段仍通過二硫橋結(jié)合在一起。圖2A顯示被組裝用于表達來自A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)株之HA的Hl亞 型的質(zhì)粒540的示意圖。圖2B顯示被組裝用于表達來自A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1)株 之HA的H5亞型的質(zhì)粒660的示意圖。圖3顯示來自產(chǎn)生血凝素Hl或H5的葉的蛋白質(zhì)提取物的體積排阻色譜。圖3A顯 示Blue Dextran 2000 (三角形)和蛋白質(zhì)(菱形)的洗脫模式。圖3B顯示在體積排阻色 譜(S500HR珠)后Hl (A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl))洗脫級分的免疫檢測(Western印 跡；抗Hl抗體)。圖3C顯示H5的洗脫模式；Blue Dextran 2000 (三角形)和蛋白質(zhì)(菱 形)。圖3D顯示在體積排阻色譜(S500HR珠)后H5 (A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1))洗脫 級分的免疫檢測(Western印跡；抗H5抗體)。圖4A顯示編碼H1(A/新喀里多尼亞/20/99(Η1Ν1))Ν末端片段的序列(SEQ ID NO: 1)。圖4B顯示編碼Hl (A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)) C末端片段的序列(SEQ ID NO :2)。圖5顯示編碼Hl (A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl))的HAO的全長序列(SEQ ID NO 28)。圖6顯示編碼H5 (A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1))的序列，其側(cè)翼為緊鄰起始ATG 上游的HindIII位點以及緊鄰終止密碼子(TAA)下游的SacI位點(SEQ ID NO :3)。圖7A顯示引物Plasto_443c的序列(SEQ ID NO :4)。圖7B顯示引物 SpHA(Ind)-Plasto. r 的序列(SEQ ID NO :5)。圖 7C 顯示引物 Plasto-SpHA (Ind). c 的序列 (SEQ ID NO :6)。圖 7D 顯示引物 HA(Ind)-Sac. r 的序列(SEQ ID NO :7)。圖8A顯示Hl (A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl))肽序列的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)。圖8B顯示H5(A/印度尼西亞/5/2005(H5m))肽序列的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。 粗體指示天然信號肽。圖9顯示A型流感病毒H7亞型的HA核苷酸序列(SEQ ID NO 11)。圖IOA顯示A型流感病毒HA的H2亞型核苷酸序列(SEQ ID NO 12)。圖IOB顯示 A型流感病毒HA的H3亞型核苷酸序列(SEQ ID NO :13)。圖IOC顯示A型流感病毒HA的 H4亞型核苷酸序列(SEQ ID NO :14)。圖IOD顯示A型流感病毒HA的H5亞型核苷酸序列 (SEQ ID NO: 15)。圖IOE顯示A型流感病毒HA的H6亞型核苷酸序列(SEQ ID NO: 16)。圖 IOF顯示A型流感病毒HA的H8亞型核苷酸序列(SEQ ID NO 17)。圖IOG顯示A型流感病 毒HA的H9亞型核苷酸序列(SEQ ID NO :18)。圖IOH顯示A型流感病毒HA的HlO亞型核 苷酸序列(SEQ ID NO :19)。圖101顯示A型流感病毒HA的Hll亞型核苷酸序列(SEQ ID NO 20)。圖IOJ顯示A型流感病毒HA的H12亞型核苷酸序列(SEQ ID NO 21)。圖IOK顯 示A型流感病毒HA的H13亞型核苷酸序列(SEQ ID NO :22)。圖IOL顯示A型流感病毒HA 的H14亞型核苷酸序列(SEQ ID NO 23)。圖IOM顯示A型流感病毒HA的H15亞型核苷酸 序列(SEQ ID N0:24)。圖ION顯示A型流感病毒HA的H16亞型核苷酸序列(SEQ ID NO: 25)。圖100顯示B型流感病毒的HA核苷酸序列(SEQ ID NO 26)。圖IOP顯示C型流感病 毒的HA核苷酸序列(SEQ ID NO 27)。圖IOQ顯示引物Xmal-pPlas. c的核苷酸序列(SEQ ID N0:29)。圖 IOR 顯示引物 SacI-ATG-pPlas. r 的核苷酸序列(SEQ ID NO :30)。圖 IOS 顯 示引物 SacI-PlasTer. c 的核苷酸序列(SEQ ID NO :31)。圖 IOT 顯示引物 EcoRI-PlasTer. r的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)。圖11顯示本文使用的幾種構(gòu)建體的示意圖。構(gòu)建體660包含與質(zhì)體藍素啟動子 (Plasto)和終止子(Pter)有效連接的編碼HA之H5亞型(A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1)) 的核苷酸序列；構(gòu)建體540包含編碼HA的Hl亞型(A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl))連 同苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶信號肽(SP PDI)的核苷酸序列，并且其與質(zhì)體藍素啟動子 (Plasto)和終止子(Pter)有效連接；構(gòu)建體544被組裝用于表達HA的Hl亞型(A/新喀里 多尼亞/20/99 (HlNl))，編碼Hl的核苷酸序列與苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶信號肽(SP PDI) 和GCMpII亮氨酸拉鏈(替代Hl的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾)相組合并與質(zhì)體藍素啟動子 (Plasto)和終止子(Pter)有效連接；用于表達流感A/PR/8/34之Ml編碼區(qū)的構(gòu)建體750 與煙草蝕紋病毒(tobacco etch virus, TEV)的5，UTR相組合，并與雙35S啟動子和Nos終 止子有效連接。圖12顯示使用抗H5 (越南)抗體對用構(gòu)建體660轉(zhuǎn)化的本塞姆氏煙草 (N. benthamiana)葉蛋白質(zhì)提取物中的H5 (A/印度尼西亞/5/2005 (H5m))進行免疫檢測 (泳道3)。使用來自流感病毒A/越南/1203/2004的市售H5作為檢測的陽性對照(泳道 1)，用空載體轉(zhuǎn)化的葉蛋白質(zhì)提取物用作陰性對照(泳道2)。圖13顯示通過體積排阻色譜對血凝素結(jié)構(gòu)進行表征。利用S-500HR通過凝膠過濾 分離來自產(chǎn)生H5 (A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1))、H1 (A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl))、可 溶性Hl或Hl以及Ml之各生物質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物。還對市售的玫瑰花結(jié)形式的Hl (A/新 喀里多尼亞/20/99 (HlNl))進行分級分離(Hl玫瑰花結(jié))。圖13A顯示用于分析相對蛋白 質(zhì)含量的洗脫級分(相對蛋白質(zhì)水平——顯示生物質(zhì)分級分離的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)洗脫模式)。 標(biāo)出了 Blue Dextran 2000 (2MDa標(biāo)準(zhǔn)參照物)的洗脫峰。圖13B顯示通過使用抗H5 (越南)抗體(針對H5)時行免疫印跡用于分析洗脫級分中的血凝素存在情況。圖13C顯示用 于分析針對Hl之抗A型流感病毒抗體的洗脫級分。圖13D顯示用于分析針對可溶性Hl之 抗A型流感病毒抗體的洗脫級分。圖13E顯示用于分析針對Hl玫瑰花結(jié)之抗A型流感病 毒抗體的洗脫級分。圖13F顯示用于分析針對H1+M1之抗A型流感病毒抗體的洗脫級分。圖14顯示通過蔗糖梯度離心濃縮流感病毒H5 (A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1))結(jié) 構(gòu)以及對血凝素濃縮級分進行電子顯微鏡檢查。圖14A顯示由蔗糖密度梯度離心得到的級 分的表征。通過利用抗H5(越南)抗體進行免疫印跡(上圖)分析每一級分中H5的存在 情況及其相對蛋白質(zhì)含量和血細胞凝集能力(曲線圖)。圖14B顯示來自蔗糖梯度離心的 合并級分17、18和19的負染色透射電子顯微鏡檢查。比例尺表示lOOnm。圖15顯示流感病毒H5 VLP的純化。圖15A顯示澄清步驟和胎球蛋白親和純化步驟 中用考馬斯藍染色的SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)含量。在澄清步驟中，泳道1，粗提物；泳道2，pH6 經(jīng)調(diào)節(jié)提取物；泳道3，經(jīng)熱處理的提取物；泳道4，經(jīng)DE過濾的提取物；在胎球蛋白親和純 化步驟中，泳道5，加樣；泳道6，穿透液(flowthrough)；泳道7，洗脫(10倍濃縮)。圖15B 顯示對純化的H5 VLP樣品的負染色透射電子顯微鏡檢查。比例尺表示lOOnm。圖15C顯示 放大的經(jīng)分離H5VLP以顯示結(jié)構(gòu)細節(jié)。圖15D顯示利用考馬斯染色的還原型SDS-PAGE (泳 道A)以及利用針對來自A/越南/1203/2004毒株(H5N1)的HA產(chǎn)生的兔多克隆抗體進行 的Western印跡(泳道B)顯示的H5VLP產(chǎn)物。圖16顯示A型流感病毒(A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)血凝素(HA)基因全長 cds 的核苷酸序列。GenBank 登錄號 AY289929 (SEQ ID NO :33)。圖17顯示紫花苜蓿(Medicago sativa)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶mRNA的核苷酸序 列。GenBank 登錄號 Zl 1499 (SEQ ID NO :34)。圖18顯示A型流感病毒(A/波多黎各/8/34 (HlNl))區(qū)段7全長序列的核苷酸序 列。GenBank 登錄號 NC_002016. 1 (SEQ ID NO 35)。圖19顯示正染色透射電子顯微鏡所觀察的產(chǎn)生H5之組織的VLP累積定位。CW 細胞壁，ch 葉綠體，pm 質(zhì)膜，VLP 病毒樣顆粒。比例尺表示lOOnm。圖20顯示在用植物生產(chǎn)的流感病毒H5 VLP (A/印度尼西亞/5/2005 (H5m))或重 組可溶性H5(A/印度尼西亞/5/2005 (H5W))接種的Balb/c小鼠中加強后14天誘導(dǎo)的血 清抗體應(yīng)答。圖20(A)通過肌內(nèi)注射免疫的小鼠的抗體應(yīng)答。圖20(B)通過鼻內(nèi)施用免 疫的小鼠的抗體應(yīng)答。測量針對失活的H5W全病毒(A/印度尼西亞/5/05)的抗體應(yīng)答。 GMT:幾何平均效價。數(shù)值是每組中五只小鼠的終點效價倒數(shù)的GMT(In)。短線表示平均偏 差。與重組可溶性H5相比，*p < 0.05。圖21顯示在用植物生產(chǎn)的流感病毒H5 VLP (A/印度尼西亞/5/2005 (H5m))或重 組可溶性H5(A/印度尼西亞/5/2005 (H5W))接種的Balb/c小鼠中加強后14天的血細胞 凝集抑制(hemagglutination inhibition，HAI)抗體應(yīng)答。圖21 (A)通過肌內(nèi)注射免疫 的小鼠的抗體應(yīng)答。圖21(B)通過鼻內(nèi)施用免疫的小鼠的抗體應(yīng)答。使用失活的H5W全 病毒(A/印度尼西亞/5/05)測量HAI抗體應(yīng)答。GMT 幾何平均效價。數(shù)值是每組中五只 小鼠的終點效價倒數(shù)的GMT(In)。短線表示平均偏差。與重組可溶性H5相比，*p< 0.05， **p < 0· 01。圖22顯示佐劑對Balb/c小鼠中VLP免疫原性的作用。圖22 (A)明礬對通過肌內(nèi)
13注射免疫之小鼠的作用。圖22(B)殼聚糖對通過鼻內(nèi)施用免疫之小鼠的作用。使用失活的 H5N1全病毒(A/印度尼西亞/5/05)測量HAI抗體應(yīng)答。GMT 幾何平均效價。數(shù)值是每組 中五只小鼠的終點效價倒數(shù)的GMT(In)。短線表示平均偏差。與相應(yīng)的重組可溶性H5相 比，*p < 0. 05。圖23顯示施用H5VLP (A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1))的抗體應(yīng)答。圖23 (A)通 過肌內(nèi)施用接種的小鼠加強后30天的抗印度尼西亞/5/05免疫球蛋白同種型。數(shù)值是每 組中五只小鼠的終點效價倒數(shù)的GMT(lo&)。使用失活H5m(A/印度尼西亞/5/2005)全 病毒作為涂覆劑進行ELISA。短線表示平均偏差。與相應(yīng)的重組可溶性H5(A/印度尼西亞 /5/2005 (H5N1))相比，*p < 0. 05，**p < 0. 001。圖23(B)針對失活全病毒(A/印度尼西 亞/5/2005 (H5W)和A/越南/1194/04 (H5N1))的抗體效價。所有組均與陰性對照具有統(tǒng) 計學(xué)差異。圖24顯示初次劑量后14天后(第2周)、加強后14天(第5周)或加強后30天 (第7周)，用H5VLP (A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1))免疫的Balb/c小鼠針對同源失活全 病毒(A/印度尼西亞/5/05)的抗體效價。GMT:幾何平均效價。數(shù)值是每組中五只小鼠的 終點效價倒數(shù)的GMT(In)。與重組可溶性H5相比，*p < 0. 05。圖25顯示來自用H5VLP(A/印度尼西亞/5/2005(H5m))免疫的Balb/c小鼠加強 后30天的血清抗體的體外交叉反應(yīng)性。(A)針對失活全病毒的抗體效價。(B)針對多種失 活全病毒的血細胞凝集抑制效價。數(shù)值是每組中五只小鼠的終點效價倒數(shù)的GMT(In)。短 線表示平均偏差。所有組均與陰性對照具有統(tǒng)計學(xué)差異。與相應(yīng)的重組可溶性H5相比，*p < 0. 05。所有小于10的數(shù)值被賦予任意值5 (其In值為1. 6)，并認為其是陰性的。圖26顯示由植物生產(chǎn)的H5 VLP (A/印度尼西亞/5/2005 (H5m))的效力。(A)用 1000倍LD5C1(4. 09 X IO6CCID50)的流感毒株A/土耳其/582/06 (H5m)攻擊后小鼠的存活率。
(B)攻擊后免疫小鼠的體重。數(shù)值是存活小鼠的平均體重。圖27顯示植物來源的流感病毒VLP的來源。(A)純化的流感病毒VLP的極性 脂質(zhì)組成。將包含在相當(dāng)于40 μ g蛋白質(zhì)中的脂質(zhì)從上述VLP中提取出來，通過HP-TLC 進行分離，并與從高度純化的煙草質(zhì)膜(PM)中分離的脂質(zhì)的遷移模式進行比較。脂質(zhì)縮 寫如下D⑶G，雙半乳糖二酰甘油；gluCER，葡萄糖神經(jīng)酰胺；PA，磷酸；PC，磷脂酰膽堿； PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷酯酰肌醇；PS，磷脂酰絲氨酸；SG，類固醇糖苷 (Steryl-glycoside)。(B)純化的流感病毒VLP的中性脂質(zhì)組成。將包含在相當(dāng)于20 μ g蛋 白質(zhì)中的脂質(zhì)從上述VLP中提取出來，通過HP-TLC進行分離，并與谷固醇的遷移進行比較。
(C)對純化的VLP、來自煙草葉的高度純化PM(PMl)和BY2煙草細胞的高度純化PM(PMby2)中 質(zhì)膜標(biāo)志物質(zhì)子泵ATP酶(PMA)進行免疫檢測。在每一泳道中加入18 μ g蛋白質(zhì)。圖28顯示克隆774的DraIII至SacI位點之間的序列——A/布里斯班 /59/2007 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :36)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖29顯示克隆775的DraIII至SacI位點之間的序列——A/所羅門群島 3/2006 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :37)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用
14下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖30顯示克隆776的DraIII至SacI位點之間的序列——A/布里斯班 10/2007 (H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :38)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖31顯示克隆777的DraIII至SacI位點之間的序列——A/威斯康星 /67/2005 (H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :39)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖32顯示克隆778的DraIII至SacI位點之間的序列——B/馬來西亞/2506/2004 的核苷酸序列(SEQ ID NO :40)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5’端以DraIII限制性位點起始 的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用下劃線標(biāo)出；ATG 以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖33顯示克隆779的DraIII至SacI位點之間的序列——B/佛羅里達/4/2006 的核苷酸序列(SEQ ID NO :41)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5’端以DraIII限制性位點起始 的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用下劃線標(biāo)出；ATG 以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖34顯示克隆780的DraIII至SacI位點之間的序列——A/新加坡/1/57 (H2N2) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :42)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5’端以DraIII限制性位點起始 的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用下劃線標(biāo)出；ATG 以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖35顯示克隆781的DraIII至SacI位點之間的序列——A/安徽/1/2005 (H5N1) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :43)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5’端以DraIII限制性位點起始 的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用下劃線標(biāo)出；ATG 以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖36顯示克隆782的DraIII至SacI位點之間的序列——A/越南 /1194/2004(H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :44)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以 DraIII限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性 位點用下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖37顯示克隆783的DraIII至SacI位點之間的序列——A/水鴨/香港/ W312/97(H6N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :45)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖38顯示克隆784的DraIII至SacI位點之間的序列——A/馬/布拉格 /56 (H7N7)的核苷酸序列(SEQ ID NO :46)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII限制 性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用下劃 線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖39顯示克隆785的DraIII至SacI位點之間的序列——A/香港/1073/99 (H9N2) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :47)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5’端以DraIII限制性位點起始的質(zhì)體藍素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點。限制性位點用下劃線標(biāo)出；ATG 以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖40A顯示由克隆774 (A/布里斯班/59/2007 (HlNl))翻譯的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:48)。克隆774的開放閱讀框從圖28中所示的ATG開始。圖40B顯示由克隆 775 (A/所羅門群島3/2006 (HlNl))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :49)?？寺?75 的開放閱讀框從圖29中所示的ATG開始。圖41A顯示由克隆776 (A/布里斯班/10/2007 (H3N2))翻譯的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:50)?？寺?76的開放閱讀框從圖30中所示的ATG開始。圖41B顯示由克隆 777 (A/威斯康星/67/2005 (H3N2))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :51)?？寺?77 的開放閱讀框從圖31中所示的ATG開始。圖42A顯示由克隆778 (B/馬來西亞Λ506/2004)翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)?？寺?78的開放閱讀框從圖32中所示的ATG開始。圖42B顯示由克隆779 (B/ 佛羅里達/V2006)翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :53)?？寺?79的開放閱讀框從 圖33中所示的ATG開始。圖43A顯示由克隆780(A/新加坡/1/57(H2N2))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:54)。克隆780的開放閱讀框從圖34中所示的ATG開始。圖43Β顯示由克隆781 (A/ 安微/1/2005 (H5W))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :55)?？寺?81的開放閱讀框 從圖35中所示的ATG開始。圖44A顯示由克隆782 (A/越南/1194/2004 (H5N1))翻譯的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:56)?？寺?82的開放閱讀框從圖36中所示的ATG開始。圖44B顯示由克隆 783(A/水鴨/香港/W312/97(H6m))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :57)?？寺?83 的開放閱讀框從圖37中所示的ATG開始。圖45A顯示由克隆784(A/馬/布拉格/56(H7N7))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 58)。克隆784的開放閱讀框從圖38中所示的ATG開始。圖45B顯示由克隆785 (A/ 香港/1073/99 (H9N2))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :59)?？寺?85的開放閱讀 框從圖39中所示的ATG開始。圖46顯示在體積排阻色譜之后對由植物生產(chǎn)的VLP的7-17洗脫級分進行免疫檢 測(Western印跡)。BlueDextran的洗脫峰(級分10)用箭頭標(biāo)出。顯示了血凝素亞型 HI、H2、H3、H5、H6和H9。在級分7_14中檢出血凝素，其對應(yīng)于VLP洗脫物。圖47顯示來自年度流行毒株的一系列血凝素之表達的免疫印跡分析。將針對表 達來自不同流感病毒株之HA (標(biāo)示于免疫印跡上部)的植物的10 μ g和20 μ g葉蛋白質(zhì)提 取物分別加至泳道1和2中。圖48A顯示來自潛在大流行毒株的一系列H5血凝素之表達的免疫印跡分析。將 10 μ g和20 μ g蛋白質(zhì)提取物分別加至泳道1和2中。圖48B顯示來自選定流感毒株的H2、 H7和H9血凝素之表達的免疫印跡分析。將10 μ g和20 μ g蛋白質(zhì)提取物分別加至泳道1 和2中。圖49顯示來自利用AGL1/660農(nóng)桿菌滲入的煙草(Nicotiana tabacum)葉之蛋白 質(zhì)提取物中A/印度尼西亞/5/2005毒株H5的免疫印跡。對兩株植物(植物1和植物2) 進行滲入，并將10 μ g和20 μ g提取自各植物的可溶性蛋白質(zhì)分別加至泳道1和2中。
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圖50顯示血清抗體的體外交叉反應(yīng)性。用植物生產(chǎn)的流感病毒H5VLP (A/印度尼 西亞/5/2005 (H5m)) (A)第一次免疫后14天以及(B)第二次加強后14天，雪貂血清中的 血細胞凝集抑制(HI)效價。使用下述失活H5W全病毒測量HAI抗體應(yīng)答Al火雞/ 土耳 其/1/05、A/越南/1194/04、A/安微/5/05以及同源株A/印度尼西亞/5/05。數(shù)值是每組 中五只雪貂的終點效價倒數(shù)的GMT(Iog2)15斜條一A/印度尼西亞/6/06 (進化枝2. 1.3)； 方格圖案一A/火雞/ 土耳其/1/05 (進化枝2. 2)；白柱一A/越南/1194/04(進化枝1)；黑 柱一A/安微/5/05。標(biāo)出了響應(yīng)者。短線表示平均偏差。圖51顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :60)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/印度尼西亞/5/2005 (構(gòu)建體#660)的H5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素 3’ UTR和終止子序列。圖52顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :61)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/新喀里多尼亞/20/1999 (構(gòu)建體#540)的Hl的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體 藍素3’ UTR和終止子序列。圖53顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :62)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5’ UTR、來自A/布里斯班/59/2007 (構(gòu)建體#774)的Hl的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素 3’ UTR和終止子序列。圖54顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :63)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5’UTR、來自A/所羅門群島/3/2006 (HlNl)(構(gòu)建體#775)的Hl的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì) 體藍素3’ UTR和終止子序列。圖55顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :64)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/新加坡/1/57(H2N2)(構(gòu)建體#780)的Η2的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素 3’ UTR和終止子序列。圖56顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :65)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，^^、來自々/安微/1/2005 015附)(構(gòu)建體#781)的Η5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素 3’ UTR和終止子序列。圖57顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :66)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/越南/1194/2004(Η5Ν1)(構(gòu)建體#782)的Η5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體 藍素3’ UTR和終止子序列。圖58顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :67)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/水鴨/香港/W312/97 (Η6Ν1)(構(gòu)建體#783)的Η6的血凝素編碼序列、苜蓿 質(zhì)體藍素3’ UTR和終止子序列。圖59顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :68)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/香港/1073/99 (Η9Ν2)(構(gòu)建體#785)的Η9的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍 素3’ UTR和終止子序列。圖60顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :69)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/布里斯班/10/2007(Η3Ν2)的Η3的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素3，UTR 和終止子序列。圖61顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :70)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/威斯康星/67/2005(Η3Ν2)的Η3的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素3，UTR和終止子序列。圖62顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :71)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自A/馬/布拉格/56 (H7N7)的H7的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素3，UTR和終 止子序列。圖63顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :72)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5，UTR、來自B/馬來西亞/2506/2004的HA的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素3，UTR和終 止子序列。圖64顯示HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :73)，其含有苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和 5’ UTR、來自B/佛羅里達/4/2006的HA的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素3’ UTR和終止子 序列。圖65顯示A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)(由SEQ ID NO :33編碼)、A/布里斯班 /59/2007 (HlNl) (SEQ ID NO 48)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl) (SEQ ID NO 49)的 HA 與 SEQ ID NO 9的共有氨基酸序列(SEQ ID NO :74)。Xl (第3位)是A或V ;X2 (第52位) 是D或N;X3(第90位)是K或R;X4(第99位)是K或T ;X5(第111位)是Y或H;X6(第 145位)是V或T ;X7 (第154位)是E或K ;X8 (第161位)是R或K ;X9 (第181位)是 V或A;X10(第203位)是D或N ;X11(第205位)是R或K ;X12 (第210位)是T或K; X13 (第225位)是R或K ；X14 (第268位)是W或R ；X15 (第283位)是T或N ；X16 (第 290位)是E或K ；X17 (第432位)是I或L ；X18 (第489位)是N或D。圖66顯示由SEQ ID NO 33編碼的Hl (新喀里多尼亞)(AAP34324. 1)的氨基酸序 列(SEQ ID NO 75)。圖67顯示由SEQ ID NO 35編碼的Hl (波多黎各)(NC_0409878. 1)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 76)。圖68顯示828#表達盒之一部分(從PacI (啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS終止 子下游))的核酸序列。CPMV HT 5’ UTR序列與經(jīng)突變ATG用下劃線標(biāo)出。ApaI限制性位 點(緊鄰待表達之蛋白質(zhì)(在該情形中為C5-1 κ輕鏈)編碼序列的ATG上游)。圖69顯示663#構(gòu)建體之一部分(從HindIII(在多克隆位點中，質(zhì)體藍素啟動子 的上游)至EcoRI(緊鄰質(zhì)體藍素終止子的下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示H5(來自A/ 印度尼西亞/5/2005)編碼序列與PDI SP融合。圖70顯示787#構(gòu)建體之一部分(從HindIII(在多克隆位點中，質(zhì)體藍素啟動子 的上游)至EcoRI(緊鄰質(zhì)體藍素終止子的下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示Hl (來自A/ 布里斯班/59/2007)編碼序列與PDI SP融合。圖71顯示790#構(gòu)建體之一部分(從HindIII(在多克隆位點中，質(zhì)體藍素啟動子 的上游)至EcoRI(緊鄰質(zhì)體藍素終止子的下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示H3(來自A/ 布里斯班/10/2007)編碼序列與PDI SP融合。圖72顯示798#構(gòu)建體之一部分(從HindIII(在多克隆位點中，質(zhì)體藍素啟動子 的上游)至EcoRI(緊鄰質(zhì)體藍素終止子的下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示HA(來自B/ 佛羅里達/4/2006)編碼序列與PDI SP融合。圖73顯示580#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示Hl (來自A/新喀里多尼亞/20/1999)編碼序列與
18PDI SP融合。圖74顯示685#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示H5 (來自A/印度尼西亞/5/2005)編碼序列。圖75顯示686#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示H5(來自A/印度尼西亞/5/2005)編碼序列與PDI SP融合。圖76顯示732#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示Hl (來自A/布里斯班/59/2007)編碼序列。圖77顯示733#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示Hl (來自A/布里斯班/59/2007)編碼序列與PDI SP融合。圖78顯示735#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示H3 (來自A/布里斯班/10/2007)編碼序列。圖79顯示736#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示H3(來自A/布里斯班/10/2007)編碼序列與PDI SP融合。圖80顯示738#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS 終止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示HA (來自B/佛羅里達/4/2006)編碼序列。圖81顯示739#構(gòu)建體之一部分(從PacI (35S啟動子上游)至AscI (緊鄰NOS終 止子下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示HA(來自B/佛羅里達/4/2006)編碼序列與PDI SP融合。圖82顯示編碼Msjl的核酸序列(SEQ ID NO :114)。圖83顯示1 850#構(gòu)建體之一部分(從HindIII (在多克隆位點中，啟動子上游) 至EcoRI (緊鄰NOS終止子的下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示HSP40編碼序列。圖84顯示1 860#構(gòu)建體之一部分(從HindIII (在多克隆位點中，啟動子上游) 至EcoRI (緊鄰NOS終止子的下游))的核酸序列。下劃線標(biāo)示HSP70編碼序列。圖85顯示1 870#構(gòu)建體之一部分(從HindIII (在多克隆位點中，啟動子上游) 至EcoRI (緊鄰NOS終止子的下游))的核酸序列。HSP40編碼序列用下劃線加斜體標(biāo)示， HSP70編碼序列用下劃線標(biāo)示。A) 1-5003位核苷酸；B) 5004-9493位核苷酸。圖86顯示構(gòu)建體R472的示意圖。圖87顯示使用來自苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶之信號肽的HA的表達的免疫印跡分 析。將獲得自3株單獨植物的20 μ g葉蛋白質(zhì)提取物加至SDS-PAGE，而對于Hl (A/新喀里多 尼亞Λ0/99 (HlNl)來說使用5 μ g。所示對照(同源毒株的失活全病毒(whole inactivated virus, WIV))以5或20 μ g被摻入經(jīng)模擬滲入的植物中。a)來自A/新喀里多尼亞/20/99 之Hl的表達，b)來自A/布里斯班/59/2007之Hl的表達，c)來自A/布里斯班/10/2007 之H3的表達，d)來自A/印度尼西亞/5/2005之H5的表達，e)來自B/佛羅里達/4/2006 之HA的表達。箭頭表示對應(yīng)于HAO的免疫條帶。SP WT 天然的信號肽，PS PDI 苜蓿PDI 信號肽。圖88顯示通過對葉蛋白質(zhì)提取物進行免疫印跡分析來對HA表達策略進行比較。使用基于質(zhì)體藍素或基于CPMV-HT的盒產(chǎn)生HA。對于CPMV-HT而言，還比較了野生型HA信 號肽與來自苜蓿PDI的信號肽。對于所分析的HA亞型來說，將20yg的蛋白質(zhì)提取物加樣 至SDS-PAGE，而對于Hl (新喀里多尼亞)來說加樣5yg蛋白質(zhì)。a)來自A/新喀里多尼亞 /20/1999之Hl的表達，b)來自A/布里斯班/59/2007之Hl的表達，c)來自A/布里斯班 /10/2007之H3的表達，d)來自A/印度尼西亞/5/2005之H5的表達，e)來自B/佛羅里達 /4/2006之B型的表達。箭頭表示對應(yīng)于HAO的免疫條帶。包含用于HA表達之特異性載體 的特異性農(nóng)桿菌屬菌株在泳道上方示出。圖89顯示當(dāng)與HSP40和HSP70共表達時HA累積的免疫印跡。Hl (新喀里多尼亞) (AGL1/540)和H3(布里斯班)(AGL1/790)單獨表達或者與AGL1/R870共表達。通過對來 自經(jīng)滲入葉的蛋白質(zhì)提取物進行免疫印跡分析來評估HA累積水平。毒株A/新喀里多尼亞 /20/99或布里斯班/10/2007的失活全病毒(WIV)用作對照。
具體實施例方式本發(fā)明涉及病毒樣顆粒的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及含有流感病毒抗原的病 毒樣顆粒的生產(chǎn)。下面的描述是優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明提供了含有編碼來自包膜病毒的抗原(例如流感血凝素(HA))之核苷酸序 列的核酸，其與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接。此外，本發(fā)明提供了在植物中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法。所述方法包括將編 碼抗原并與在植物中有活性之調(diào)控區(qū)有效連接的核酸導(dǎo)入所述植物或其部分中，以及在允 許所述核酸表達的條件下培養(yǎng)所述植物或其部分，從而產(chǎn)生VLP。VLP可由流感病毒制得，然而，VLP還可由其它質(zhì)膜來源的病毒制得，包括但不限 于麻疹病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒和HIV。本發(fā)明包括可感染人的所有類型流感病毒的VLP，包括例如但不限于非常流行的 A型(HlNl)亞型(例如A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl) )、A/印度尼西亞/5/05亞型(H5N1) (SEQ ID NO 60)以及較不常見的 B 型(例如 SEQ ID NO :26，圖 100)、C 型(SEQ ID NO :27， 圖10P)以及從其它流感病毒亞型得到的HA。本發(fā)明中其它流感病毒亞型的VLP還包括例 如 A/布里斯班/59/2007 (Hmi ； SEQ ID NO :48)、A/所羅門群島/3/2006 (Hmi ； SEQ ID NO: 49)、A/ 新加坡/1/57 (H2N2 ；SEQ ID NO 54)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO 55)、A/ 越 Fl/1194/2004 (H5N1 ；SEQ IDNO :56)、A/水鴨 / 香港/W312/97 (H6N1 ;SEQ ID N0:57)、A/香 港/1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 59)、A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 50)、A/ 威斯 康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ ID NO :51)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7 ；SEQID NO 58)、B/ 馬來西 亞/2506/2004 (SEQ ID NO 52)或 B/佛羅里達/4/2006 (SEQ ID NO :53)。本發(fā)明還涉及感染其它哺乳動物或宿主動物的流感病毒，所述哺乳動物或宿主動 物為例如人、靈長類、馬、豬、鳥類、禽類、水禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動物、 狗、貓科動物、貓、虎、豹、麝貓、水貂、石貂、雪貂、寵物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等?？稍谫|(zhì)膜來源的病毒中表達的其它抗原的非限制性實例包括HIV的衣殼蛋白 P24 ；包膜蛋白gpl20、gp41 ；結(jié)構(gòu)蛋白VP30和VP35 ；絲狀病毒(例如埃博拉病毒或馬爾堡 病毒)的Gp/SGP(糖基化內(nèi)膜蛋白)，或副粘病毒(例如麻疹病毒)的H蛋白以及F蛋白。
本發(fā)明還包括但不限于從細胞質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜的流感病毒來源的VLP，所述 VLP蛋白在所述細胞中表達。例如，如果VLP在基于植物的系統(tǒng)中表達，那么VLP可從該細 胞的質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜。一般而言，術(shù)語“脂質(zhì)”是指脂溶性的(親脂性的)天然分子。更具體地，該術(shù)語 還用于指脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘油單酯以及磷脂)以及其它脂 溶性的含固醇的代謝物或固醇類。磷脂連同糖脂、固醇和蛋白質(zhì)是所有生物膜的主要組分。 磷脂的實例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。固 醇的實例包括動物固醇(例如膽固醇)和植物固醇(例如谷留醇)以及固醇糖苷。已經(jīng)在 多種植物中鑒定了超過200種的植物固醇，最常見的有菜油固醇、豆固醇、麥角固醇、菜子 固醇、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麥固醇、胡蘿卜固醇(daunosterol)、谷固醇、24-甲基膽固醇、 膽固醇或β-谷固醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)組成可隨細胞或獲得細 胞之生物體的培養(yǎng)或生長條件而變化。細胞膜通常包含脂雙層以及各種功能的蛋白質(zhì)。在脂雙層中可發(fā)現(xiàn)局部濃縮的特 定脂質(zhì)，稱為“脂質(zhì)筏”。不希望受理論限制，脂質(zhì)筏可在內(nèi)吞和胞吐作用、病毒或其它感染 原的進入或逸出、細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細胞或生物體的其它結(jié)構(gòu)組分(例如細胞內(nèi)和細胞 外基質(zhì))相互作用中起重要作用。針對流感病毒，本文所用的術(shù)語“血凝素”或“ΗΑ”是指存在于流感病毒顆粒外部 的糖蛋白。HA是同三聚體I型膜糖蛋白，通常含有信號肽、HAl結(jié)構(gòu)域和ΗΑ2結(jié)構(gòu)域，所述 ΗΑ2結(jié)構(gòu)域含有C端的跨膜錨定位點以及小的胞質(zhì)尾(圖1Β)。編碼HA的核苷酸序列是 公知的并且是可獲得的，參見例如BioDefence Public Health base (流感病毒；參見URL biohealthbase. org)或美國國立生物技術(shù)信息中心(參見URL :ncbi. nlm. nih. gov)，其均 通過引用并入本文。術(shù)語“同三聚體”或“同三聚體的”表示寡聚體由三個HA蛋白分子形成。不希望受 理論限制，HA蛋白是作為約75kDa的單體前體蛋白(HAO)合成的，其在表面處組裝成長形 的三聚體蛋白。在三聚化發(fā)生之前，前體蛋白在保守的活化切割位點(也稱為“融合肽”) 處被切割成2條通過二硫鍵連接的多肽鏈——HAl和HA2 (包含跨膜區(qū))。HAl區(qū)段的長度 可以為328個氨基酸，HA2區(qū)段的長度可以為221個氨基酸。盡管該切割對于病毒感染性 可能是重要的，但是其對于蛋白質(zhì)三聚化卻不是必需的。HA插入宿主細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜 內(nèi)，信號肽切割和蛋白質(zhì)糖基化是共翻譯事件。正確的HA重折疊需要蛋白質(zhì)糖基化以及形 成6個鏈內(nèi)二硫鍵。HA三聚體在順式-和反式-高爾基體復(fù)合物內(nèi)組裝，跨膜結(jié)構(gòu)域在三 聚化加工中起作用。經(jīng)菠蘿蛋白酶處理的HA蛋白(缺少跨膜結(jié)構(gòu)域)的晶體結(jié)構(gòu)顯示在 流感毒株之間具有高度保守的結(jié)構(gòu)。還已明確，HA在感染過程中發(fā)生重大的構(gòu)象變化，這 需要將前體HAO切割成2條多肽鏈(HAl和HA2)。HA蛋白可被加工(即包含HAl和HA2結(jié) 構(gòu)域)，或者可以不進行加工(即包含HAO結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明涉及包含跨膜結(jié)構(gòu)域并包含HAl和HA2結(jié)構(gòu)域的HA蛋白的用途，例如所述 HA蛋白可以是ΗΑ0，或是包含HAl和HA2的經(jīng)加工HA。所述HA蛋白可用于利用植物、植物 細胞或表達系統(tǒng)生產(chǎn)或形成VLP。本發(fā)明的HA可得自任意亞型。例如，HA可以是HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16亞型或B型流感病毒。本發(fā)明的重組HA還可包含基
21于本領(lǐng)域公知的任意血凝素序列的氨基酸序列——參見例如BioDefence Public Health base (流感病毒；參見URL:bi0healthbase.0rg)或者美國國立生物技術(shù)信息中心(參見 URL :ncbi. nlm. nih. gov)。此外，HA可基于從一種或多種新發(fā)現(xiàn)的或新鑒定出的流感病毒 中分離出的血凝素的序列。本發(fā)明還包括VLP，其包含得自一種或多種流感病毒亞型的HA。例如，VLP可包含 來自以下亞型的一種或多種HA :H1 (由SEQ ID NO :28編碼)、H2 (由SEQ ID而12編碼)、 H3 (由 SEQ ID NO 13 編碼)、H4 (由 SEQ ID NO 14 編碼)、H5 (由 SEQ ID NO 15 編碼)、 H6(由 SEQID NO :16 編碼)、H7(由 SEQ ID NO :11 編碼)、H8 (由 SEQ ID N0:17 編碼)、 H9(由 SEQ ID NO :18 編碼)、H10(由 SEQ ID NO :19 編碼)、H11(由 SEQ ID NO :20 編碼)、 H12 (由 SEQ ID NO 21 編碼)、H13 (由 SEQ ID NO 27 編碼)、H14 (由 SEQ ID NO 23 編碼)、 H15 (由 SEQ IDNO 24 編碼)、H16 (由 SEQ ID NO 25 編碼)或 B 型流感病毒(由 SEQ IDNO 26編碼)，或其組合。來自一種或多種流感病毒亞型的一種或多種HA可以在植物或昆蟲細 胞內(nèi)共表達，以確保所述一種或多種HA的合成導(dǎo)致形成含有得自一種或多種流感病毒亞 型之HA組合的VLP。對HA之組合的選擇可通過由VLP制得之疫苗的目的用途來確定。例 如，用于接種鳥類的疫苗可包含HA亞型的任意組合，而用于接種人的VLP可包含一種或多 種HI、H2、H3、H5、H7、H9、H10、Ni、N2、N3和N7亞型。然而，也可根據(jù)接種用途來制備其它 HA亞型的組合。因此，本發(fā)明涉及含有一種或多種HA亞型的VLP，例如兩個、三個、四個、五個、六 個或更多HA亞型。本發(fā)明還提供了編碼血凝素的核酸，當(dāng)其在植物中表達時形成VLP。示例性核酸可包含來自選定流感病毒亞型毒株的血凝素的核苷酸序列。例如， A(HlNl)亞型例如A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl) (SEQ IDNO :33)、A/印度尼西亞/5/05亞 型(H5N1)(包含構(gòu)建體#660 ；SEQ ID NO 60)以及較不常見的B型(例如SEQ ID NO :26， 圖100)和C型(SEQ IDNO :27，圖10P)，以及從其它流感病毒亞型獲得的HA。本發(fā)明中其 它流感病毒亞型的VLP還包括例如A/布里斯班/59/2007 (H1N1 ；SEQ IDNO 36)、A/所羅 門群島 /3/2006 (H1N1 ；SEQ ID NO 37)、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2 ；SEQ ID NO 42)、A/ 安微 /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO :43)、A/越南/1194/2004 (H5m ;SEQ ID NO :44)、A/水鴨 / 香 港 /W312/97 (H6N1 ；SEQID NO 45)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 47)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 38)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ ID NO 39)、A/ 馬 / 布 拉格 /56 (H7N7 ；SEQ ID NO 46)、B/ 馬來西亞 /2506/2004 (SEQ IDNO 40)或 B/ 佛羅里達 /4/2006(SEQ ID NO 41)。血凝素的正確折疊對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、多聚體形成、VLP形成和HA之功能(血細胞 凝集能力)等流感病毒血凝素特性可以是重要的。蛋白質(zhì)折疊可受一個或多個因素影響， 包括但不限于蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)相對豐度，細胞內(nèi)擁擠程度，可與折疊的、部分折疊的或 未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合或瞬時締合的輔因子的利用度，一種或多種伴侶蛋白的存在情況等。熱休克蛋白(Hsp)或應(yīng)激蛋白是伴侶蛋白的實例，其可參與多種細胞過程包括蛋 白質(zhì)合成、細胞內(nèi)運輸、防止錯誤折疊、防止蛋白質(zhì)凝集、蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝和去組裝、蛋 白質(zhì)折疊以及蛋白質(zhì)解聚。這樣的伴侶蛋白的實例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、 Hsp90、HsplOO、Hsp20_30、HsplO、Hspl00-200、HsplOO、Hsp90、Lon, TF55、FKBP、親環(huán)蛋白(CyCl0philin)、ClpP、GrpE、泛素、鈣聯(lián)接蛋白(calnexin)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。參見， 例如 Macario, A. J. L. , Cold Spring HarborLaboratory Res. 25 :59_70· 1995 ；Parsell, D. Α. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27 :437_496 (1993)；美國專利 No. 5，232，833。在一些 實例中，特定組的伴侶蛋白包括Hsp40和Hsp70。Hsp70的實例包括來自哺乳動物細胞的Hsp72和Hsc73、來自細菌特別是分 枝桿菌(如麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(例如 BaciHe-Calmette Guerin，本 文中稱為Hsp71))的DnaK。來自大腸桿菌、酵母和其它原核生物的DnaK、以及來自真核生物 (例如擬南芥)的BiP和Grp78 (Lin等，2001 (Cell Stress and Chaperones 6:201-208))。 Hsp70的一個具體實例是擬南芥Hsp70(由SEQ ID NO: 122或SEQ ID NO :123編碼)。Hsp70 能夠特異性地結(jié)合ATP以及未折疊多肽和肽，從而參與蛋白質(zhì)折疊和解折疊以及參與蛋白 質(zhì)復(fù)合物的組裝和去組裝。Hsp40的實例包括來自原核生物(例如大腸桿菌和分枝桿菌)的DnaJ以及來自 真核生物(例如苜蓿(Frugis 等，1999. Plant MolecularBiology 40:397-408))的 HSJ1、 HDJl 和 Hsp40。Hsp40 的一個具體實例是紫花苜蓿(M. sativa)MsJl(由 SEQ ID NO :121、 123或114編碼)。Hsp40在蛋白質(zhì)折疊、耐熱性和DNA復(fù)制等細胞活動中作為分子伴侶起作用。在各Hsp中，Hsp70及其輔伴侶蛋白(co-chaperone) Hsp40與合成完成前還在翻 譯的新合成多肽的穩(wěn)定性相關(guān)。不希望受理論的限制，Hsp40與未折疊(新生或新轉(zhuǎn)移的) 多肽的疏水片區(qū)結(jié)合，因而有利于Hsp70-ATP復(fù)合物與該多肽的相互作用。ATP水解導(dǎo)致多 肽、Hsp70和ADP之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物并釋放Hsp40。Hsp70_ADP復(fù)合物與多肽之疏水片 區(qū)的締合阻止其與其它疏水片區(qū)相互作用，并防止不正確折疊以及與其它蛋白質(zhì)形成凝集 體(綜述見于 Hartl，F(xiàn)U. 1996. Nature381 :571_579)。同樣不希望受理論限制，隨著重組蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加，重組蛋 白質(zhì)表達的擁擠效應(yīng)可能導(dǎo)致由于錯誤折疊之多肽發(fā)生降解導(dǎo)致的重組蛋白質(zhì)的凝集和/ 或累積減少。天然的伴侶蛋白能夠有利于低水平重組蛋白質(zhì)的正確折疊，然而當(dāng)表達水平 增加時，天然伴侶蛋白可變?yōu)橄拗埔蛩?。?jīng)農(nóng)桿菌滲入之葉中血凝素的高水平表達可導(dǎo)致 血凝素多肽在胞質(zhì)溶膠中累積，而與一種或多種伴侶蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70 及Hsp40兩者)可提高表達該多肽之細胞的胞質(zhì)溶膠中的穩(wěn)定性，因而減少錯誤折疊或凝 集之血凝素多肽的水平，并增加作為穩(wěn)定血凝素(其呈現(xiàn)允許發(fā)生血細胞凝集和/或病毒 樣顆粒形成的三級和四級結(jié)構(gòu)特征)之多肽累積物的數(shù)目。因此，本發(fā)明還提供了在植物中生產(chǎn)流感病毒VLP的方法，其中將編碼流感病毒 HA的第一核酸與編碼伴侶蛋白的第二核酸共表達。所述第一核酸和第二核酸可在同一步驟 中導(dǎo)入植物，或者可先后導(dǎo)入植物。本發(fā)明還提供了在植物中生產(chǎn)流感病毒VLP的方法，其 中所述植物包含所述第一核酸，所述第二核酸隨后被導(dǎo)入。本發(fā)明還提供了包含編碼一種或多種流感病毒血凝素之核酸以及編碼一種或多 種伴侶蛋白之核酸的植物。已提出，在流感病毒血凝素表達和/或分泌過程中加工N端信號肽(SP)序列對折 疊過程起作用。術(shù)語“信號肽” 一般是指通常見于血凝素多肽N端的短(約5 30個氨基酸)氨基酸序列，其可指導(dǎo)新翻譯之多肽轉(zhuǎn)運至特定細胞器或者輔助多肽特定結(jié)構(gòu)域的定 位。血凝素的信號肽將該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并已提出其輔助新生血凝素多肽 相對于近N端結(jié)構(gòu)域之膜錨定結(jié)構(gòu)域的定位，以輔助成熟血凝素的切割和折疊。除去信號 肽(例如，通過信號肽酶)可需要精確的切割以及去除信號肽以提供成熟血凝素——這一 精確切割可取決于若干因素中的任意因素，包括信號肽的一部分還是全部、切割位點側(cè)翼 的氨基酸序列、信號肽的長度，或者這些因素的組合，并且并非所有因素均適用于任一給定 序列。信號肽可以是所表達之血凝素天然存在的，或者重組血凝素包含來自第一流感病 毒類型、亞型或毒株的信號肽，而其余部分來自第二流感病毒類型、亞型或毒株。例如，HA亞 型HI、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B型流感病毒的天然信號肽可用于在植物系統(tǒng)中表達HA。信號肽還可以是非天然的，例如來自結(jié)構(gòu)蛋白或非流感病毒之病毒的 HA，或者來自植物、動物或細菌多肽。示例性信號肽是苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 (PDISP)(登記號Zl 1499的32-103位核苷酸；SEQ ID NO :34 ；圖17 ；氨基酸序列 MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE)。本發(fā)明還提供了包含天然或非天然信號肽的流感病毒血凝素以及編碼此類血凝 素的核酸。流感病毒HA蛋白在分子量、等電點、大小、聚糖成分等方面表現(xiàn)出一系列相似之 處和不同之處。各種血凝素的物理化學(xué)性質(zhì)可用于區(qū)分在植物、昆蟲細胞或酵母系統(tǒng)中表 達的HA，并且當(dāng)多于一種HA在單一系統(tǒng)中共表達時其可具有特殊用途。所述物理化學(xué)性質(zhì) 的實例示于表1中。
2權(quán)利要求
核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)控區(qū)有效連接的編碼流感血凝素(HA)的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述HA包含天然或非天然的信號肽。
3.權(quán)利要求2的核酸，其中所述非天然的信號肽是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶信號肽。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述HA是A型流感病毒、B型流感或者是A型流感的亞型， 其選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
5.權(quán)利要求1的核酸，其中所述HA來自A型流感，選自H1、H2、H3、H5、H6、H7*H9。
6.在植物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括a)將權(quán)利要求1的核酸導(dǎo)入所述植物或植物部分中，以及b)在允許所述核酸表達的條件下培養(yǎng)所述植物或植物部分，從而生產(chǎn)VLP。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在所述導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述核酸在該植物中瞬時表達。
8.權(quán)利要求6的方法，其中在所述導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述核酸在該植物中穩(wěn)定表達。
9.權(quán)利要求6的方法，其還包括以下步驟c)收獲所述宿主并純化所述VLP。
10.權(quán)利要求6的方法，其中在所述導(dǎo)入步驟(步驟a)中，包含編碼一種或多種伴侶蛋 白之核苷酸序列的第二核酸被導(dǎo)入所述植物中。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種伴侶蛋白選自Hsp40和Hsp70。
12.在植物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括a)提供包含權(quán)利要求1之核酸的植物或植物部分，以及b)在允許所述核酸表達的條件下培養(yǎng)所述植物或植物部分，從而生產(chǎn)所述VLP。
13.包含權(quán)利要求1之核酸的植物。
14.權(quán)利要求13的植物，其還包含含有與在植物中有活性之調(diào)控區(qū)有效連接的編碼一 種或多種伴侶蛋白的核苷酸序列的核酸。
15.權(quán)利要求14的植物，其中所述一種或多種伴侶蛋白選自Hsp40和Hsp70。
16.病毒樣顆粒(VLP)，其包含流感病毒血凝素(HA)蛋白以及一種或多種源自植物的 脂質(zhì)。
17.權(quán)利要求16的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述HA是A型流感、B型流感或者是A型 流感的亞型，其選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
18.權(quán)利要求17的VLP，其中所述HA來自A型流感，其選自HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9。
19.組合物，其包含有效劑量的權(quán)利要求16之VLP以及可藥用載體。
20.誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用權(quán)利要求16的病毒樣顆粒。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述病毒樣顆粒經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi) 或皮下施用給對象。
22.病毒樣顆粒(VLP)，其包含具有植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖的流感病毒HA。
23.權(quán)利要求22的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述HA是A型流感、B型流感或者是A型 流感的亞型，其選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
24.權(quán)利要求23的VLP，其中所述HA來自A型流感，其選自HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9。
25.組合物，其包含有效劑量的權(quán)利要求22之VLP以及可藥用載體。
26.誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用權(quán)利要求25的組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述組合物經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮 下施用給對象。
全文摘要
本發(fā)明提供了在植物或植物部分內(nèi)合成流感病毒樣顆粒(influenzavirus-like particle，VLP)的方法。所述方法包括在植物中表達流感HA并通過體積排阻色譜進行純化。本發(fā)明還涉及包含流感HA蛋白和植物脂質(zhì)的VLP。本發(fā)明還涉及編碼流感HA的核酸以及載體。所述VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于充實現(xiàn)有的疫苗。
文檔編號C12N7/01GK101978066SQ200980109781
公開日2011年2月16日 申請日期2009年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者弗雷德里克·奧爾斯, 皮埃爾-奧列弗·拉瓦, 米凱萊·達吉斯, 索尼婭·特雷帕尼耶, 納薩莉·蘭德里, 路易斯-菲利普·韋齊納, 馬克-安德烈·德奧斯特, 馬農(nóng)·科圖雷 申請人:麥迪卡格公司