專利名稱：質(zhì)粒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼復制蛋白的基因，對于制造外 源蛋白有用。
背景技術(shù)：
近年來，積極開展了基因工程研究，報道了很多使用重組微生物大規(guī)模生產(chǎn)有用 蛋白質(zhì)的技術(shù)。作為一個大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)的例子，可以提及具有高生產(chǎn)率的質(zhì)粒載體的發(fā) 展。例如，一種包括涉及胞外酶生成例如淀粉酶、蛋白酶或果聚糖蔗糖酶的各種基因啟動子 區(qū)，以及包括編碼涉及這些蛋白質(zhì)胞外分泌的信號肽區(qū)的表達和分泌載體(專利文獻1和 2)；一種復制區(qū)被改動以增加其拷貝數(shù)的載體(專利文獻3和4)等。然而，按照通常使用的、基于宿主載體系統(tǒng)制造蛋白質(zhì)的方法，蛋白質(zhì)的產(chǎn)量仍不 足。另外，也限制了可以大量生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的種類。專利文獻1 JP-A-01-273591專利文獻2 JP-A-2000-287687專利文獻3 JP-A-06-327480專利文獻4 JP-A-2003-986
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對下列1) 11)。1) 一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，所述復制蛋白包括選自用序列識別號2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b) 位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而 成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。2) 一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，所述復制蛋白包括與用序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的 氨基酸序列中的選自分別與序列識別號2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和 (d)位置198相對應的位置處的氨基酸殘基中的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基 取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。
3)上述1)或2)的質(zhì)粒載體進一步包含基因的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷酸序 列，其中，所述基因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。4)上述3)的質(zhì)粒載體，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因 的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷酸序列是具有由用序列識別號13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號堿 基的核苷酸序列；具有由用序列識別號14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號堿基的核苷酸序列；與前述任意一個核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序 列；或前述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。5) 一種轉(zhuǎn)化體，其含有上述4)的質(zhì)粒載體。6)上述5)的轉(zhuǎn)化體，其中，載體的宿主是微生物。7) 一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復制蛋白的 DNA，所述復制蛋白包括選自用序列識別號2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b) 位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而 成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標多肽。8) 一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復制蛋白的 DNA，其中，所述復制蛋白包括與用序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%同一 性的氨基酸序列中的選自分別與序列識別號2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149 和(d)位置198相對應的位置處的氨基酸殘基中的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘 基取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標多肽。9)上述7)或8)的方法，其中，所述質(zhì)粒載體進一步包含基因的啟動子區(qū)和分泌信 號區(qū)的核苷酸序列，其中，所述基因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。10)上述9)的方法，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因的 啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷酸序列是
具有由用序列識別號13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號堿 基的核苷酸序列；具有由用序列識別號14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號堿基的核苷酸序列；與前述任意一個核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序 列；或前述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。11) 一種多肽，其按照上述7)或8)的方法制備而成。


圖1表示構(gòu)建本發(fā)明質(zhì)粒載體的一個例子。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種質(zhì)粒載體以及利用該質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化體，其中，該質(zhì)粒載體對于 在工業(yè)上有價值和有用的蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)具有高生產(chǎn)效率。本發(fā)明者們研究通過質(zhì)粒改性來大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)通過在ρΑΜα 1的復制 蛋白中引入某個突變，其通常被用作質(zhì)粒的復制起始區(qū)域(Rep)，從而質(zhì)粒中包括的目標 蛋白結(jié)構(gòu)基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)胞外分泌量增加，這樣的質(zhì)粒對于蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)是有用 的。根據(jù)本發(fā)明質(zhì)粒載體，質(zhì)粒中包括的目標蛋白結(jié)構(gòu)基因所產(chǎn)生的目標蛋白質(zhì)的胞 外分泌量增加。從而通過使用本發(fā)明的質(zhì)粒載體，可以高效地制造目標蛋白質(zhì)。在本發(fā)明質(zhì)粒載體中包括并編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA編碼下列蛋白質(zhì)(i)或 (ii)。(i)蛋白質(zhì)，包含用下列(a) (d)的氨基酸殘基取代選自用序列識別號2表示的 氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個或多個氨
基酸殘基，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。(ii)蛋白質(zhì)，包含用下列(a) (d)的氨基酸殘基取代與用序列識別號2表示的 氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基，其中，所述一 個或多個氨基酸殘基選自分別與序列識別號2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149 和(d)位置198相對應的位置處的氨基酸殘基，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。至于具有用序列識別號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，可以提及糞腸球菌的質(zhì)粒 ρΑΜα 1的復制蛋白。至于由與用序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸殘基 組成的質(zhì)粒復制蛋白，可以提及其所具有的氨基酸序列不同于用序列識別號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，該氨基酸序列與用序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%、 優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、特別優(yōu)選至少98%的同一性。質(zhì)粒復制蛋白的例子包括那些相對于用序列識別號2表示的氨基酸序列，一個 或多個氨基酸被刪除、取代或添加的質(zhì)粒復制蛋白。具體例子包括來自腐生葡萄球菌 (Staphylococcus saprophyticus)的復制蛋白。其中，優(yōu)選那些具有自身克隆能力的質(zhì)粒 復制蛋白，例如用序列識別號2表示的氨基酸序列組成的質(zhì)粒復制蛋白。本發(fā)明質(zhì)粒復制蛋白是具有用序列識別號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或與其 有至少80%同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中選自(a)位置48或?qū)恢谩?b)位置262 或?qū)恢谩?c)位置149或?qū)恢?，?d)位置198或?qū)恢玫囊粋€或多個氨基酸殘 基，可以用其它氨基酸殘基取代。本發(fā)明質(zhì)粒復制蛋白可以是天然型、或其自然變異體或人 為突變變異體。另外，氨基酸的序列同一性是基于Lipman-Pearson法(Science, 227，1435， (1985))計算得到。具體說，通過使用基因信息處理軟件GenetyxWin(版本5. 1. LSoftware Development, Co.，Ltd.)的同源性檢索程序，ktup (比較的單元大小)設定為2，進行計算 分析。因而，本發(fā)明質(zhì)粒復制蛋白包括具有氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中用序列識別號2 表示的氨基酸序列的位置48 (賴氨酸殘基)的氨基酸殘基被丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨 酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基取代，位置262 (天冬氨酸殘基)的氨基酸殘基被甘氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸取代，位置149(賴氨酸殘基)的氨基酸殘基被天冬 酰胺殘基取代，或位置198 (賴氨酸殘基)的氨基酸殘基被谷氨酸殘基取代；以及具有與用 序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中與用序 列識別號2表示的氨基酸序列的位置48相對應的氨基酸殘基被丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精 氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基取代，與位置262相對應的氨基酸殘基被甘氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸取代，與位置149相對應的氨基酸殘基被天冬酰胺殘基 取代，或與位置198相對應的氨基酸殘基被谷氨酸殘基取代。另外，至于(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198，可以進行單 個或多個氨基酸取代。這里，關(guān)于識別“與(某個)位置相對應的氨基酸殘基”的方法，用例如 Lipman-Pearson法的公知算法將氨基酸序列進行比對，，然后通過給出對于每個質(zhì)粒復制 蛋白的氨基酸序列中存在的保守氨基酸殘基的最高同源性，從而可以進行識別。另外，對于 按照該方法對質(zhì)粒復制蛋白中所包含的氨基酸序列進行排列，無論在氨基酸序列中進行插 入或刪除，都可以根據(jù)每個質(zhì)粒復制蛋白的序列來確定具有同一性的每個氨基酸殘基的位 置。確信同源性位置存在于三維結(jié)構(gòu)的相同位點上，并且根據(jù)質(zhì)粒復制蛋白的特定功能推 測具有類似的效果。基于通常所用的定點突變，通過在編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA中引入突變，可以構(gòu) 建本發(fā)明質(zhì)粒載體。更具體地說，可以通過使用定點突變系統(tǒng)的Mutan-Super Express Km 試劑盒(Takara Bio Inc.)等進行。另外，通過使用重組聚合酶鏈反應(聚合酶鏈反應，聚 合酶鏈反應方法，Academic Press, New York，1990)，基因中的任意序列可以用其它基因中 與該任意序列相對應的序列來取代。
隨著拼接DNA片段，其中，所述DNA片段所述包括DNA復制起始區(qū)、抗生素抗性基 因、DNA區(qū)域(包括復制區(qū)、用于啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)、和分泌信號區(qū))、和將外源基因的目 標產(chǎn)物編碼到編碼本發(fā)明的質(zhì)粒復制蛋白的DNA上的基因，從而可以構(gòu)建重組質(zhì)粒，該重 組質(zhì)粒可用于大規(guī)模生產(chǎn)目標基因產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、多肽等。“外源基因”包括編碼酶的基因和編碼生理活性肽的基因，其中，酶可以列舉出淀 粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、支鏈淀粉酶、過氧化物酶、加氧酶、過氧化氫酶等； 生理活性肽可以列舉出胰島素、人生長激素、干擾素、降鈣素、白細胞介素等，但不限于此?！坝糜趩愚D(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)、和分泌信號區(qū)”是調(diào)控區(qū)的核苷酸序列，其涉及外源 基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌。“用于啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)”的例子包括包含啟動和轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn) 錄起始調(diào)控區(qū)、核糖體結(jié)合位點、包括起始密碼子的翻譯起始區(qū)、及其組合?！胺置谛盘枀^(qū)” 的例子包括分泌信號肽區(qū)域。在本發(fā)明的質(zhì)粒載體中，目標外源基因與涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌的調(diào)控區(qū)通過手 術(shù)相互拼接(例如，調(diào)控區(qū)被置于外源基因的上游區(qū)域)。調(diào)控區(qū)優(yōu)選含有三個區(qū)域，包 括轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、翻譯起始調(diào)控區(qū)和分泌信號區(qū)。更優(yōu)選分泌信號區(qū)來源于微生物芽 孢桿菌的纖維素酶基因，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和翻譯起始區(qū)為相應的纖維素酶基因的上游0.6 lkb。特別優(yōu)選調(diào)控區(qū)是來源于均屬于芽孢桿菌的菌株KSM-S237(FERM BP-7875)或菌株 KSM-64(FERM BP-2886)纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、翻譯起始區(qū)和分泌信號肽區(qū)。特 別更優(yōu)選調(diào)控區(qū)是序列識別號13表示的核苷酸序列的1 659號堿基的核苷酸序列，序 列識別號14表示的核苷酸序列的1 696號堿基的核苷酸序列，與相應的核苷酸序列具有 至少70 %、優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90 %、特別優(yōu)選至少95 %、特別更優(yōu)選至少98 %的同 一性的核苷酸序列，或刪除上述核苷酸序列任意部分的核苷酸序列。關(guān)于刪除上述核苷酸 序列任意部分的核苷酸序列，是指序列缺少上述核苷酸序列的部分，但仍保留涉及基因轉(zhuǎn) 錄、翻譯和分泌的功能。以下，描述從芽孢桿菌菌株KSM-KP43構(gòu)建用于生產(chǎn)KP43蛋白酶的本發(fā)明的質(zhì)粒 載體的一個例子(如圖1)。來源于芽孢桿菌菌株KSM-KP43的KP43蛋白酶基因被拼接到芽孢桿菌菌株 KSM-64(FERM BP-2886)纖維素酶的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的下游區(qū)域。另外，作為復制區(qū) WpAMa 1和作為抗生素抗性基因的四環(huán)素抗性基因也被拼接在其上。在這樣構(gòu)建的重組 質(zhì)粒載體中，制備正反方向上的引物，從而在兩者之間出現(xiàn)一個位于KP43基因下游區(qū)(例 如，圖1中引物a和d)的限制性酶切位點(Xba I )。另外，制備正反方向上的其它引物， 從而在Ori-ρΑΜα 1基因下游區(qū)(例如，圖1中引物b和c)形成一個新的限制性酶切位點 (Nhe I )。加入由PCR所得到的兩個片段(即，包括Tc和KP43的區(qū)域，和包括ρΑΜα 1的 區(qū)域)，以便在Xba I和Nhe I消化后將其拼接。在圖1中，對于通過引物b和d擴增的包 括ρΑΜα 1的區(qū)域，通過促進擴增過程中錯誤的發(fā)生，可以構(gòu)建復制蛋白區(qū)域中具有隨機突 變的質(zhì)粒載體。通過用上述方法獲得的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物，可以生產(chǎn)本發(fā)明的重組微生 物。進一步，通過培養(yǎng)該重組微生物并從培養(yǎng)物中收集目標蛋白質(zhì)或多肽，可以大規(guī)模生產(chǎn) 目標蛋白質(zhì)或多肽。關(guān)于用于轉(zhuǎn)化的宿主微生物，可以列舉出葡萄球菌、腸球菌、李斯特氏 菌、芽孢桿菌等。其中，優(yōu)選芽孢桿菌。
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用于培養(yǎng)重組微生物的培養(yǎng)基的類型沒有特別限定，只要重組微生物可以生長， 并可以從中生產(chǎn)出酶即可。另外，對于培養(yǎng)基，以適當濃度混合氮源和碳源，并加入適當濃 度的無機鹽、金屬鹽等。培養(yǎng)基的PH值和溫度沒有特別限制，只要重組微生物可以在其中 生長即可。另外，可以按照一般方法分離所產(chǎn)生的目標蛋白質(zhì)或多肽。如果需要，也可以進行 純化、結(jié)晶和造粒。實施例實施例1 R印48位置的突變效應基于具有提高的分泌特性或特定活性的突變蛋白酶的生產(chǎn)效率，該突變蛋白酶來 源于 JP-A-2002-218989、JP-A-2002-306176 或 JP-A-2004-122 所述芽孢桿菌菌株 KSM-KP43 的堿性蛋白酶(堿性蛋白酶具有序列識別號3或序列識別號4的核苷酸序列，其中位置46 的苯丙氨酸被亮氨酸取代，位置65的蘇氨酸被脯氨酸取代，位置195的酪氨酸被組氨酸取 代，位置273的纈氨酸被異亮氨酸取代，位置359的蘇氨酸被絲氨酸取代，位置369的天冬 氨酸被天冬酰胺取代，位置387的絲氨酸被丙氨酸取代。以下稱為“KP43H2”)，測定R印48 位置的突變效應。Rep的突變通過使用pHA64_KP43H2作為模板在Takara熱循環(huán)儀480型中進行聚 合酶鏈反應而引入。PHA64-KP43H2是質(zhì)粒載體，其中KP43H2的結(jié)構(gòu)基因和終止子被拼接在 表達載體PHA64的BamH I和Xba I位置；表達載體pHA64是質(zhì)粒載體，包括質(zhì)粒ρΑΜ α 1 或PUBllO的復制區(qū)域、復制蛋白(Itep)和抗生素抗性基因(JP-A-03-259086)，還具有芽孢 桿菌菌株KSM-64的堿性纖維素酶K-64的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)(JP-A-2000-287687)。具 體說，向0. 1 0. 5ng的作為模板的環(huán)型質(zhì)粒中，加入20pmol的每個引入突變的引物對(例 如，序列識別號5和序列識別號9，或序列識別號7和序列識別號10)、20nmol的每個dNTPs、 5 μ LTakara Pyrobest DNA聚合酶的緩沖液和2U Pyrobest DNA聚合酶，來制備反應溶液 (50 μ L)。作為聚合酶鏈反應條件，94°C下變性1分鐘后，以94°C下1分鐘、55°C下1分鐘、 72°C下4分鐘的周期，重復30次(S卩，30個周期)。作為最后的反應，混合物在72°C下孵育 10分鐘。所得到的聚合酶鏈反應產(chǎn)物用高純聚合酶鏈反應產(chǎn)物純化試劑盒(Roche)純化， 用100 μ L無菌水洗，單個片段用引物(序列識別號5和序列識別號7)擴增，每個引物位于 單個片段的尾端。具體說，將第一次聚合酶鏈反應所得到的兩個片段的每一個100倍稀釋、 混合，然后用上述相同條件進行聚合酶鏈反應。擴增的DNA片段用電泳法鑒定，用Nhe I 和Xba I消化。再通過使用DNA拼接試劑盒第2版(Takara Bio Inc.)，拼接到Nhe I和 Xba I消化得到的片段上。該片段是通過用PHA64-KP43H2作為模板，按照上述方法用序列 識別號6和序列識別號8的引物擴增后用Nhe I和Xba I消化所得到的，其中包括四環(huán)素 抗性基因和KP43H2基因。。所得到的反應溶液用高純聚合酶鏈反應產(chǎn)物純化試劑盒(Roche)純化，用100 μ L 無菌水洗?；陔姶┛追?，使用基因脈沖試管(Biorad)將得到的DNA溶液用于芽孢桿菌菌 株KSM-KP43的轉(zhuǎn)化。在包含脫脂牛奶的堿性瓊脂培養(yǎng)基[1% (w/v)脫脂牛奶(Difco)、
細菌用胰蛋白胨(Difco)、0. 5%酵母提取物(Difco)、0. 5%氯化鈉、1.5%瓊脂、0. 05% 無水碳酸鈉、15ppm四環(huán)素]中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞。再通過觀察脫脂牛奶裂解標志的形成，來測定細胞中蛋白酶基因的出現(xiàn)或消失。選擇包含質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，該質(zhì)粒具有插入PHA64的 蛋白酶基因，將該轉(zhuǎn)化體用于進一步培養(yǎng)。對于每個轉(zhuǎn)化體，確定單個菌落形成和暈形成。之后，在含5mL起子培養(yǎng)基試管 中[6.0% (w/v)多聚蛋白胨S(Nihon Seiyaku)、0. 1 %酵母提取物、1. 0%麥芽糖、0. 02% 七水硫酸鎂、0. 磷酸二氫鉀、0. 3%無水碳酸鈉、30ppm四環(huán)素]中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，30°C下過 夜，320rpm下離心。在含有20mL主要介質(zhì)[8% (w/v)多聚蛋白胨S、0. 3 %酵母提取物、 10%麥芽糖、0. 04%七水硫酸鎂、0. 2%磷酸二氫鉀、1. 5%無水碳酸鈉、30ppm四環(huán)素]的 500mLSakaguChi燒瓶中培養(yǎng)(1% (ν/ν))得到的起始培養(yǎng)溶液，30°C下培養(yǎng)3天，121rpm下 離心。離心得到的培養(yǎng)物，上清液用于測定蛋白酶活性。用酪蛋白法測定蛋白酶活性。通 過使用蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(Wako Pure Chemicals)測定蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比 于對照物(在相同條件下培養(yǎng)的PHA64-KP43H2轉(zhuǎn)化體)，用具有突變Rep基因的質(zhì)粒產(chǎn)生 的堿性蛋白酶KP43H2的活性提高了 8 12%的量(見表1)。另外，在培養(yǎng)物上清液中蛋 白質(zhì)的量幾乎與蛋白酶活性同比例增加，表明所得到的突變體含有提高蛋白質(zhì)的分泌所需 的突變。另外，從選擇的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，通過測序來測定其核苷酸序列。結(jié)果證實，生 成的質(zhì)粒與所想要突變體相符。表 1
Rep48位置KP43H2活性賴氨酸(天然)100丙氨酸112甘氨酸111蘇氨酸109精氨酸109谷氨酸111天冬酰胺108谷氨酰胺110除了在轉(zhuǎn)化體中酶分泌得到提高，由上述突變得到的堿性蛋白酶仍然保留了親代 堿性蛋白酶的性質(zhì)，例如氧化劑抗性和通過高濃度脂肪酸(由聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的 分子量為43，000士2，000)抑制酪蛋白降解活性抗性，以及在堿性條件下的活性。實施例2 R印262位置的突變效應與實施例1相似的方法，基于來源于芽孢桿菌菌株KSM-KP43的突變堿性蛋白酶的 生產(chǎn)效率，測定R印262位置的突變效應。具體說，通過使用0. 1 0. 5ng的pHA64_KP43H2作為模板，用引物對進行聚合酶鏈反應，引入突變(例如，序列識別號5和序列識別號11，或序列識別號7和序列識別號 12)，用實施例1相似的方法得到兩個擴增的片段。兩個片段在作為單個片段用引物(例如， 序列識別號5和序列識別號7)擴增，每個引物位于單個片段的尾端。獲得的DNA片段用電 泳法鑒定，用Nhe I和Xba I消化。再通過使用DNA拼接試劑盒第2版(Takara Bio Inc.)， 將DNA片段拼接到Nhe I和Xba I消化得到的片段上。該片段是通過用pHA64_KP43H2作 為模板，按照上述方法用序列識別號6和序列識別號8的引物擴增后用Nhe I和Xba I消 化所得到的，其中包括四環(huán)素抗性基因和KP43H2基因。接著，進行轉(zhuǎn)化。通過觀察從培養(yǎng)在包含脫脂牛奶的堿性瓊脂介質(zhì)的轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的脫脂牛奶裂 解標志的形成(實施例1)，來測定細胞中蛋白酶基因的出現(xiàn)或消失。質(zhì)粒具有插入PHA64的 蛋白酶基因，選擇含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，以實施例1相似的方法，再將其用于進一步培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對照物(在相同條件下培養(yǎng)的PHA64-KP43H2轉(zhuǎn)化體)，用具有 突變R印基因的質(zhì)粒產(chǎn)生的堿性蛋白酶KP43H2的活性增加了 3 13%的量(見表2)。另 外，在培養(yǎng)物上清液中蛋白質(zhì)的量幾乎與蛋白酶活性同比例增加，可以說明所得到的突變 體含有提高蛋白質(zhì)的分泌所需的突變。另外，從選擇的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，通過測序來測定 其核苷酸序列。結(jié)果證實，生成的質(zhì)粒與所想要突變體相符。表 2
權(quán)利要求
一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，所述復制蛋白包括選自用序列識別號2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。
2.一種質(zhì)粒載體，含有編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，所述復制蛋白包括與用序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基 酸序列中的選自分別與序列識別號2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d) 位置198相對應的位置處的氨基酸殘基中的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取 代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的質(zhì)粒載體，其中，所述質(zhì)粒載體進一步包含基因的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷酸序列，其中，所述基 因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。
4.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒載體，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷 酸序列是具有由用序列識別號13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號堿基的 核苷酸序列；具有由用序列識別號14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號 堿基的核苷酸序列；與前述任意一個核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列；或前 述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。
5.一種轉(zhuǎn)化體，其含有權(quán)利要求3或4所述的質(zhì)粒載體。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述質(zhì)粒載體的宿主是微生物。
7.一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，所述復制蛋白包括選自用序列識別號2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b) 位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基取代而 成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標多肽。
8.一種制備多肽的方法，其包括如下步驟構(gòu)建質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含編碼目標多肽的DNA和編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，所述復制蛋白包括與用序列識別號2表示的氨基酸序列具有至少80%同一性的 氨基酸序列中的選自分別與序列識別號2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和 (d)位置198相對應的位置處的氨基酸殘基中的一個或多個氨基酸殘基被下列氨基酸殘基 取代而成的物質(zhì)，(a)位置丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)位置甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)位置天冬酰胺，(d)位置谷氨酸；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主微生物；以及培養(yǎng)宿主微生物，并收集由此生成的目標多肽。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述質(zhì)粒載體進一步包含基因的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷酸序列，其中，所述基 因編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，編碼源于芽孢桿菌屬微生物的堿性纖維素酶的基因的啟動子區(qū)和分泌信號區(qū)的核苷 酸序列是具有由用序列識別號13表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 659號堿基的 核苷酸序列；具有由用序列識別號14表示的核苷酸序列組成的纖維素酶基因的1 696號 堿基的核苷酸序列；與前述任意一個核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列；或前 述核苷酸序列中部分被刪除的核苷酸序列。
11.一種多肽，其按照權(quán)利要求7或8所述的方法制備而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種質(zhì)粒載體以及提供使用該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，其中該質(zhì)粒載體具有高生產(chǎn)效率，可將其用于工業(yè)上有價值和有用的蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。該質(zhì)粒載體具有編碼質(zhì)粒復制蛋白的DNA，其中，選自用序列識別號2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一個或多個氨基酸殘基分別被(a)丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，(c)天冬酰胺和(d)谷氨酸所取代。
文檔編號C12N15/09GK101978056SQ20098010983
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者伊澤啟文, 住友伸行, 瀧村靖 申請人:花王株式會社