專利名稱：利用合成氣或其它氣態(tài)碳源和甲醇的方法和有機體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及生物合成方法，且更特定地涉及能夠使用合成氣或其它氣態(tài)碳源 和甲醇的有機體。
背景技術：
合成氣體(合成氣)是主要由H2和CO組成的混合物，可經由氣化任何有機進料， 例如煤、煤油、天然氣、生物質或有機廢物來獲得。已經開發(fā)出眾多氣化方法，且大部分設計 是基于在高溫(500-1500°C )下部分氧化(其中限制氧氣含量以避免完全燃燒)有機物質 以提供作為0.5 1-3 1 H2/C0混合物的合成氣。有時候添加蒸汽以增加氫氣含量，這 通常伴隨著經水煤氣變換反應增加CO2產量?，F(xiàn)今，煤是用于工業(yè)制造合成氣的主要基質，而合成氣傳統(tǒng)上用于加熱和供能，并 且用作甲醇和液態(tài)烴的費托合成(Fischer-Tropsch synthesis)的原料。許多大型化學和 能源公司大規(guī)模地利用煤氣化方法，并在工業(yè)上應用這種技術。除煤以外，許多類型的生物質也用于產生合成氣。例如合成氣和CO2等氣態(tài)基質 代表著可用于以生物學方法制造再生化學物和燃料的最廉價且取材最靈活的原料。在第二 次世界大戰(zhàn)期間，有超過一百萬個的小規(guī)模生物質氣化裝置投入運行，主要是在歐洲，用于 驅動小汽車、卡車、輪船和公共汽車。目前有至少3種主要的生物質氣化技術已被驗證在工 業(yè)規(guī)模下(> 20，000, 000磅生物質/年)有效或正處在被驗證的過程中。生物質氣化技 術正在進行商業(yè)實踐，尤其用于熱量和能量產生。生物質氣化技術與燃料或化學物制造的 整合還在開發(fā)中，且尚未被證明以商業(yè)規(guī)模廣泛應用?？偟膩碚f，在幾乎世界上任何地點，從包括煤、生物質、廢物、聚合物等在內的眾多 物質節(jié)省成本地產生合成氣的技術當前是存在的。因為可以從包括生物質在內的大多數有 機物質產生合成氣，所以使用合成氣的好處包括取材靈活。另一個好處在于合成氣很便宜， 每百萬英熱單位的成本為< $6，表示每磅產物的原料成本為< $0. 10。另外，還存在有效利 用合成氣的已知途徑，正如在例如梭菌屬(Clostridium spp.)等有機體所發(fā)現(xiàn)的。雖然可以獲得利用合成氣的有機體，但一般來說，已知有機體的特征不清楚且不 是非常適用于商業(yè)開發(fā)。舉例來說，梭菌和相關細菌是嚴格厭氧菌，無法耐受高濃度的某些 產物(例如丁醇)，因此限制了滴定度和商業(yè)化潛力。梭菌還產生很多種產物，這在獲得期 望產物方面帶來了分離問題。最后，用于操作梭菌基因的靈巧基因工具的開發(fā)尚處在初期； 因此，它們不能容易地經受基因工程以便改進期望產物的產率或生產特征。因此，需要開發(fā)可利用合成氣或其它氣態(tài)碳源來產生期望化學物和燃料的微生物 和其使用方法。更特定地說，需要開發(fā)用于合成氣利用的微生物，其還具有現(xiàn)有的有效基因工具，使其能夠經受快速工程改造以便以有用的速率和數量產生有價值產物。本發(fā)明滿足 此項需求且提供相關優(yōu)勢。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有乙酰-CoA途徑且能夠利用 合成氣或合成氣和甲醇。在一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一 種或多種賦予所述微生物將⑶、CO2和/或H2轉化為乙酰輔酶A(乙酰-CoA)、甲基四氫葉 酸(甲基-THF)或其它期望產物的途徑的外源蛋白質，其中在不存在所述一種或多種外源 蛋白質的情況下，所述微生物缺乏將CO或CO2和H2轉化為乙酰-CoA或甲基四氫葉酸的能 力。舉例來說，微生物有機體可含有至少一種編碼乙酰-CoA途徑中的酶或蛋白質的外源核 酸。微生物有機體能單獨利用包含CO、CO2和/或H2的合成氣或組合利用合成氣和甲醇以 產生乙酰_CoA。本發(fā)明另外提供一種產生乙酰-CoA的方法，例如通過培養(yǎng)產生乙酰-CoA 的微生物有機體，其中所述微生物有機體在用于產生乙酰-CoA的條件和足夠時間下足量 表達至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的外源核酸以產生乙酰-CoA。


圖1顯示利用合成氣作為碳源的示例性Wood-Ljimgdahl途徑。描繪甲基分支，其 顯示利用合成氣產生甲基_四氫葉酸(Me-THF)。圖2顯示利用合成氣作為碳源的示例性Wood-Ljimgdahl途徑。描繪羰基分支，其 顯示利用合成氣產生乙酰輔酶A(乙酰-CoA)。氫化酶(12)是合成氣的氫轉化為還原當量 所必需的，而還原當量是許多所述反應所必需的。圖3顯示代謝途徑圖解，其描繪Wood-Ljimgdahl和丁醇產生途徑的整合。能利 用合成氣生長的有機體典型地獨有的轉化有1)C0脫氫酶，2)氫化酶，3)能量守恒氫化酶 (ECH)，和4)雙功能CO脫氫酶/乙酰-CoA合成酶。圖4顯示描繪利用合成氣產生丁醇的過程的圖解。圖4A顯示合成氣產丁醇過程 的方塊流程圖。圖4B顯示氣化器的細節(jié)。ASU代表氣體分離單元。圖5顯示建議的對深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)的聚羥基丁酸(PHB)途 徑的改造，以便形成1-丁醇。粗體箭頭指示經由異源表達形成丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum/C. acetobutylicum)的1_ 丁醇途徑的4_基因操縱子而引入的反應步驟。 所用的縮寫有PHB，聚β -羥基丁酸；PhbC，PHB合成酶；Crt，巴豆酸酶；Bed，丁酰輔酶A脫 氫酶；Etf，電子傳遞黃素蛋白；AdhE2，醛/醇脫氫酶。圖6顯示完全Wood-Ljungdahl途徑，其允許包含CO、CO2和/或H2的氣體轉化為 乙酰-CoA，乙酰-CoA隨后可被轉化為例如乙醇或乙酸等細胞物質和產物?？山浌こ谈脑鞛?生產宿主中的示例性的特異性酶促轉化被編號?？s寫10FTHF，10-甲酰四氫葉酸；5MTHF， 5-甲基四氫葉酸；ACTP，乙酰磷酸；FOR，甲酸；METHF，亞甲基四氫葉酸；MLTHF，次甲基四氫 葉酸；THF，四氫葉酸。圖7顯示合成代謝途徑，其允許包含CO、CO2和/或H2的氣體和甲醇轉化為乙 酰-CoA?？山浌こ谈脑鞛樯a宿主的特異性酶促轉化被編號。其它縮寫MeOH，甲醇。圖8顯示將甲醇、CO和CO2轉化為細胞物質(cell mass)和發(fā)酵產物的途徑。
圖9顯示10 μ g ACS90 (泳道1)、ACS91 (泳道2)、Mta98/99 (泳道3和4)的細胞提 取物、大小標準物(泳道5)和熱乙酸穆爾氏菌(M. thermoacetica)CODH(Moth_1202/1203) 或Mtr(Moth_1197)蛋白的對照(50、150、250、350、450、500、750、900 和 IOOOng)的 Western 印跡。圖10顯示CO氧化分析結果。培養(yǎng)細胞(具有C0DH/ACS操縱子的熱乙酸穆爾氏 菌或大腸桿菌；ACS90或ACS91或空白載體pZA33S)并制備提取物。在55°C在提取物制備 當天的各個時間點執(zhí)行分析。歷經120秒的時間，在578nm下跟蹤甲基紫精的還原。圖11顯示合成代謝途徑，其用于將包含CO、CO2和/或H2的氣體和甲醇轉化為乙 酰-CoA并進一步轉化為4-羥基丁酸。圖12顯示合成代謝途徑，其用于將包含CO、CO2和/或H2的氣體和甲醇轉化為乙 酰-CoA并進一步轉化為1，4- 丁二醇。圖13顯示合成代謝途徑，其用于將包含C0、C02和 并進一步轉化為4-羥基丁酸。圖14顯示合成代謝途徑，其用于將包含C0、C02和
或H2的氣體轉化為乙酰-CoA
或H2的氣體轉化為乙酰-CoA
并進一步轉化為1，4-丁:
具體實施例方式本發(fā)明涉及開發(fā)和使用能夠利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產生期望產物的微生物。 本發(fā)明另外涉及擴展利用合成氣的微生物的產物范圍和產生能夠利用合成氣產生期望產 物且優(yōu)化產物的產量、滴定度和生產率的重組有機體?？捎行Ю煤铣蓺庾鳛樯L和化學 制備的基質的重組有機體，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或其它適合于商業(yè)規(guī)?；?有機體的研制為產生可再生的化學物和燃料提供了具有成本優(yōu)勢的方法。這些有機體可經 優(yōu)化且以合理的成本快速測試。合成氣用作進料的巨大潛力在于其能夠有效且節(jié)省成本地轉化為目的化學物和 燃料。合成氣轉化的兩種主要技術是費托法和發(fā)酵法。費托(F-T)技術自從第二次世界大 戰(zhàn)就已被開發(fā)出來，其涉及基于無機物和金屬的催化劑，從而允許有效地產生甲醇或混合 烴作為燃料。F-T方法的缺點在于1)缺乏產物選擇性，導致難以分離期望產物；2)催化劑 容易中毒；3)因為需要高溫和高壓，所以能源成本很高；和4)在具有商業(yè)競爭力的成本下 可獲得的產物的范圍很有限。對于發(fā)酵法，已顯示合成氣可在能將其轉化為例如乙醇、乙酸和氫氣等產物的許 多厭氧微生物中用作碳源和能源(參看下文和表1)。合成氣的發(fā)酵轉化的主要好處有有 機體選擇性地產生單一產物，對合成氣雜質的耐受性較大，操作溫度和壓力較低，和可能從 合成氣獲得大量產物。發(fā)酵法的主要缺點在于，已知能轉化合成氣的有機體傾向于只產生 有限范圍的化學物(例如乙醇和乙酸)，且不能有效地產生其它化學物；有機體缺乏基因操 作的公認工具；且有機體對高濃度的最終產物敏感。本發(fā)明涉及產生可有效地從合成氣或其它氣態(tài)碳源產生期望產物(包括化學物 和燃料)的微生物。本發(fā)明的有機體和方法允許與基于石油的傳統(tǒng)產物和直接衍生自葡萄 糖、蔗糖或木質纖維素糖的產物相比，顯著節(jié)省成本地產生化學物和燃料。在一實施方案 中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其能夠利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產生期望產物，其中所述母體微生物缺乏利用合成氣的天然能力(參看實施例VIII)。在所述微生物 中，一種或多種蛋白質或酶在微生物中表達，從而賦予利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產生期 望產物的途徑。在其它實施方案中，本發(fā)明提供一種經基因修飾的非天然存在的微生物，其 例如通過表達一種或多種外源蛋白質或酶，從而使期望產物的產生效率提高，其中所述母 體微生物具有利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產生期望產物的能力。因此，本發(fā)明涉及產生具 有能利用合成氣的新穎代謝途徑的微生物，以及產生利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產生期望 產物的效率得到提高的微生物。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其表達編碼以下的基因與MtaABC型 甲基轉移酶系統(tǒng)一起催化Wood-Ljimgdahl途徑的羰基分支的酶，和與所述羰基分支有關 的蛋白質。所述有機體能將甲醇(一種可來源于合成氣的相對廉價的有機原料)和包含 CO、CO2和/或H2的氣體轉化為乙酰_CoA、細胞物質和產物。大腸桿菌是工業(yè)工作母體有機體(workhorse organism)，具有無與倫比的一 套基因工具。將合成氣轉化為乙酰-CoA(重要代謝物，可由其獲得所有細胞物質組分 和許多有價值的產物)的能力可被工程改造入外部宿主，例如大腸桿菌，其隨后表達編 碼Wood-Ljimgdahl途徑的各種蛋白質的外源基因。所述途徑在例如熱乙酸穆爾氏菌 (Moorella thermoacetica)(以前稱作熱乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)) 等產乙酸有機體中高度活躍，熱乙酸穆爾氏菌早在1942年被分離出時就作為闡明 Wood-Ljungdahl 途徑的模型有機體(Fontaine 等人，J Bacteriol. 43 :701_715 (1942))。 Wood-Ljungdahl途徑包含兩個分支東部或甲基分支，其允許CO2轉化為甲基四氫葉酸 (Me-THF)；和西部或羰基分支，其允許甲基四氫葉酸、CO和輔酶A轉化為乙酰-CoA(參見圖 1和2)。如本文所公開，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其表達催化Wood-Ljimgdahl 途徑的兩個分支的基因。所述有機體能將包含CO、CO2和/或H2的氣體轉化為乙酰-CoA、 細胞物質和產物。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其表達與MtaABC型甲基轉移 酶系統(tǒng)一起催化Wood-Ljimgdahl途徑的羰基分支的酶的編碼基因。所述有機體能將甲醇 (一種可來源于合成氣的相對廉價的有機原料)和包含CO、CO2和/或H2的氣體轉化為乙 酰-CoA、細胞物質和產物。合成氣也稱為發(fā)生爐煤氣，是煤和碳質材料(例如生物質材料，包括農作物和殘 余物)的主要氣化產物。合成氣是主要由H2和CO組成的混合物，可經由氣化任何有機原 料，包括(但不限于)煤、煤油、天然氣、生物質和有機廢物來獲得。氣化通常在高燃料/氧 氣比下進行。雖然合成氣主要是H2和⑶，但也可包含少量的CO2和其它氣體。因此合成氣 提供一種節(jié)省成本的氣態(tài)碳源，例如CO和C02。如本文所公開，例如包含CO和/或CO2的合成氣等氣態(tài)碳源可被本發(fā)明的非天然 存在的微生物利用以產生期望產物。雖然碳源在本文中一般例示為合成氣，但應了解任何 包含CO和/或CO2的氣態(tài)碳源都可被本發(fā)明的非天然存在的微生物利用。因此，本發(fā)明涉 及能利用CO和/或CO2作為碳源的非天然存在的微生物。Wood-Ljimgdahl途徑催化CO和 H2轉化為乙酰-CoA和其它產物，例如乙酸。能利用CO和合成氣的有機體一般也具有經由 Wood-Ljungdahl途徑所涵蓋的相同的一組基礎酶和轉化作用利用CO2和C02/H2混合物的 能力。微生物依賴于H2將CO2轉化為乙酸早在CO也可被相同的微生物利用且涉及相同的 途徑揭示之前已被公認。已顯示許多產乙酸菌可在CO2存在下生長且產生例如乙酸等化合物，只要存在氫以便供應必需的還原當量即可(參見例如Drak^Acetogenesis，第3-60頁， Chapman and Hall, New York, (1994))。這可由以下等式概括2C02+4H2+n ADP+n Pi — CH3C00H+2H20+n ATP因此，具有Wood-Ljungdahl途徑的非天然存在的微生物也可利用CO2與H2的混合 物來產生乙酰-CoA和其它期望產物。Wood-Ljungdahl途徑在本領域中為人所熟知，且由可分為2個分支的12個反應組 成(1)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支將合成氣轉化為甲基四氫葉酸(甲基-THF)， 而羰基分支則將甲基四氫葉酸轉化為乙酰-CoA。甲基分支中的反應是由以下酶或蛋白質依 次催化鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化 脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。羰基分支中的反應是由以下酶 或蛋白質依次催化甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白、 鎳蛋白裝配蛋白(例如AcsF)、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝 配蛋白(例如CooC)。按照本文提供的關于引入足夠數量的編碼核酸以便產生乙酰-CoA途 徑方面的教導和指導，所屬領域技術人員將了解，也可實施同樣的工程設計導入宿主有機 體中沒有的編碼Wood-Ljimgdahl酶或蛋白質的核酸。因此，將一種或多種編碼核酸引入到 本發(fā)明的微生物有機體中，以致經修飾的有機體含有一個分支或完全Wood-Ljimgdahl途 徑，這會賦予合成氣利用能力。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物可利用合成氣或其它提供CO和/或CO2的氣 態(tài)碳源來產生期望產物。在CO2的情況下，其它來源包括(但不限于)氨氣和氫氣工廠里 作為副產物產生的CO2，其中甲烷轉化為CO2 ；木材和化石燃料的燃燒；啤酒、威士忌和其它 酒精飲料釀造過程中或其它發(fā)酵過程中作為糖發(fā)酵副產物產生的CO2 ；石灰CaO制造中石 灰石CaCO3的熱分解；磷酸鈉制造中作為副產物產生的CO2 ；和直接來自于天然二氧化碳來 源，其中二氧化碳是通過酸化水對石灰石或白云石的作用而產生。當關于本發(fā)明的微生物有機體或微生物使用時，如本文所用的術語“非天然存在” 欲意謂微生物有機體具有至少一處在天然存在的所提及物種的菌株(包括所提及物種的 野生型菌株)中通常未發(fā)現(xiàn)的基因變異?；蜃儺惏ɡ缫肟杀磉_的編碼代謝多肽 的核酸的修飾、其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物遺傳物質的其它功能性破壞。所述 修飾包括例如所提及物種的異源、同源或異源與同源多肽的編碼區(qū)和其功能片段。其它修 飾包括例如非編碼調控區(qū)，其中修飾會改變基因或操縱子的表達。示例性代謝多肽包括乙 酰-CoA生物合成途徑內的酶或蛋白質。代謝修飾是指自天然存在的狀態(tài)發(fā)生改變的生化反應。因此，非天然存在的微生 物可具有對編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的基因修飾。本文公開了示例性代謝修飾。當關于微生物有機體或微生物使用時，如本文所用的術語“經分離的”欲意謂有機 體基本上不含在自然界中發(fā)現(xiàn)所提及的微生物有機體時所伴隨的至少一種組分。所述術語 包括移除自然環(huán)境中所伴隨的部分或所有組分的微生物有機體。所述術語還包括移除非天 然存在的環(huán)境中伴隨微生物有機體的部分或所有組分的微生物有機體。因此，分離的微生 物有機體是在自然界中發(fā)現(xiàn)時或在非天然存在的環(huán)境中生長、儲存或生存時與其它物質部 分或完全分離。經分離的微生物有機體的特定實例包括部分純的微生物、基本上純的微生 物和在非天然存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。
如本文所用的術語“微生物性”、“微生物有機體”或“微生物”欲意謂以古菌域、細 菌域或真核域內所包括的顯微細胞形式存在的任何有機體。因此，所述術語欲涵蓋具有顯 微尺寸的原核或真核細胞或有機體，且包括所有種類的細菌、古細菌和真細菌，以及真核微 生物，例如酵母和真菌。所述術語還包括可經培養(yǎng)以用于產生生化物質的任何種類的細胞 培養(yǎng)物。如本文所用的術語“CoA”或“輔酶A”欲意謂有機輔因子或輔基(酶的非蛋白質部 分)，其存在為許多酶(脫輔基酶蛋白)形成活性酶系統(tǒng)的活性所必需。輔酶A在某些縮合 酶中，在乙?；蚱渌；D移中，在脂肪酸合成和氧化，在丙酮酸氧化中和在其它乙?；?作用中發(fā)揮功能。當關于培養(yǎng)或生長條件使用時，如本文所用的術語“基本上厭氧”欲意謂液體培養(yǎng) 基中的含氧量小于溶解氧飽和含量的約10%。所述術語還打算包括維持在小于約氧氣 的氣氛下的液體或固體培養(yǎng)基的密封室。如本文所用的“外源”欲意謂所提及的分子或所提及的活性是引入到宿主微生物 有機體中。分子可例如通過將編碼核酸引入到宿主遺傳物質中而引入，例如通過編碼核酸 整合到宿主染色體中或編碼核酸作為非染色體遺傳物質(例如質粒)。因此，在關于編碼核 酸的表達使用時，所述術語是指將編碼核酸以可表達形式引入到微生物有機體中。當關于 生物合成活性使用時，所述術語是指活性被引入到宿主參考有機體中。來源可為例如同源 或異源編碼核酸，其在引入到宿主微生物有機體中之后表達所提及的活性。因此，術語“內 源”是指所提及的分子或活性是存在于宿主中。類似地，當關于編碼核酸的表達使用時，所 述術語是指表達微生物有機體內所含的編碼核酸。術語“異源”是指分子或活性是來源于 除所提及的物種以外的來源，而“同源”是指分子或活性是來源于所述宿主微生物有機體。 因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源表達可利用異源編碼核酸或同源編碼核酸或其兩者。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可含有穩(wěn)定的基因變異，這是指微生物在培 養(yǎng)超過5代后仍不會損失所述變異。一般來說，穩(wěn)定的基因變異包括持續(xù)超過10代的修 飾，特定來說，穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過約25代，且更特定來說，穩(wěn)定的基因修飾將持續(xù)超過 50代，包括無限持續(xù)下去。所屬領域技術人員將了解，對基因變異(包括本文示例的代謝修飾)的描述是關 于合適的宿主有機體(例如大腸桿菌)和其對應的代謝反應，或產生期望遺傳物質(例如 針對期望代謝途徑的基因)的合適來源有機體。然而，鑒于多種有機體的完整基因組測序 和基因組學領域中的高度技術水平，所屬領域技術人員能夠容易地將本文提供的教導和指 導應用于基本上所有其它有機體。舉例來說，通過并入來自除所提及物種以外的物種的相 同或類似的編碼核酸，本文示例的大腸桿菌代謝變化可容易地應用于其它物種。所述基因 變異一般包括例如種間同源物的基因變異，且特定來說，直系同源物、旁系同源物或非直系 同源基因置換。直系同源物是通過垂直家系產生關聯(lián)且在不同有機體中負責基本上相同或一致 的功能的基因。舉例來說，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人類環(huán)氧化物水解酶可被視為環(huán)氧化物 水解的生物功能的直系同源物。例如，當基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的，或 通過從共同祖先進化而產生關聯(lián)時，所述基因通過垂直家系產生關聯(lián)。如果基因具有足量 的三維結構相似性但未必具有足量的序列相似性，從而在無法鑒別到一級序列相似性的范圍內表明其是進化自共同祖先，那么所述基因也可被視為直系同源物。直系同源的基因可 編碼序列相似性為氨基酸序列同一性的約25%到100%的蛋白質。如果編碼氨基酸相似性 小于25%的蛋白質的基因的三維結構也顯示相似性，那么其也可被視為是由垂直家系產生 的。絲氨酸蛋白酶家族的成員(包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶)被視為是通過垂 直家系從共同祖先產生的。直系同源物包括經由例如進化而在結構或總體活性上趨異的基因或其編碼的基 因產物。舉例來說，在一種物種編碼展現(xiàn)兩種功能的基因產物的情況下，以及在所述功能分 離成第二物種中的不同基因的情況下，這三種基因和其對應產物被視為直系同源物。為了 產生生物化學產物，所屬領域技術人員將了解可對具有欲引入或破壞的代謝活性的直系同 源基因進行選擇，以便構建非天然存在的微生物。展現(xiàn)可分離活性的直系同源物的一實例 是不同活性已在兩種或兩種以上物種之間或在單一物種內被分離成不同基因產物。一特定 實例是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)被分離 成作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶的不同分子。另一實例是支原體5’_3’核酸外切酶和 果蠅DNA聚合酶III活性的分離。第一物種的DNA聚合物可被視為第二物種的核酸外切酶 或聚合酶中一者或兩者的直系同源物，且反之亦然。相反，旁系同源物是通過例如復制和隨后的進化趨異而產生關聯(lián)且具有相似或共 同、但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可來源于或衍生自例如相同物種或不同物 種。舉例來說，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán) 氧化物水解酶II)可被視為旁系同源物，因為其代表兩種共同進化自共同祖先的不同酶， 催化不同反應且在相同物種中具有不同功能。旁系同源物是來自相同物種的彼此具有顯著 序列相似性的蛋白質，表明其是同源的或通過共同進化自共同祖先而產生關聯(lián)。旁系同源 蛋白質家族的分組包括HipA同源物、熒光素酶基因、肽酶等。非直系同源基因置換是來自一個物種的非直系同源基因可取代不同物種中的參 考基因功能。取代包括例如能夠在起源物種中執(zhí)行與不同物種中的參考功能相比基本上相 同或類似的功能。雖然一般來說，非直系同源基因置換可被鑒別為在結構上與編碼參考功 能的已知基因相關，但是結構相關性較小但功能類似的基因和其對應的基因產物在本文中 使用時仍然處于所述術語的含義內。功能相似性需要例如非直系同源基因產物的活性位點 或結合區(qū)域與編碼設法取代的功能的基因相比具有至少一些結構相似性。因此，非直系同 源基因包括例如旁系同源物或無關基因。因此，在鑒別和構建具有乙酰-CoA生物合成能力的本發(fā)明的非天然存在的微生 物有機體的過程中，所屬領域技術人員將了解，通過對特定物種應用本文提供的教導和指 導，代謝修飾的鑒別可包括直系同源物的鑒別和納入或失活。只要參考微生物中存在旁系 同源物和/或非直系同源基因置換以用于編碼催化類似或基本上類似的代謝反應的酶，那 么所屬領域技術人員也可利用這些進化上相關的基因。直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換可通過所屬領域技術人員熟知的 方法來確定。舉例來說，檢查兩種多肽的核酸或氨基酸序列將會揭示所比較序列之間的序 列同一性和相似性?；谒鱿嗨菩裕绻嗨菩宰銐蚋?，那么所屬領域技術人員可確定 蛋白質是通過進化自共同祖先而產生關聯(lián)。所屬領域技術人員熟知的算法(例如Align、 BLAST、Clustal W等)比較和確定粗略序列相似性或同一性，并且確定序列中可被指派權重或分數的空位的存在或意義。所述算法在本領域中也是已知的，且類似地可用于確定核 苷酸序列相似性或同一性。足以確定關聯(lián)性的相似性的參數是基于用于計算統(tǒng)計相似性的 熟知方法，或在隨機多肽中發(fā)現(xiàn)類似匹配的概率和所確定匹配的意義來計算得出。兩種或 兩種以上序列的計算機比較在必要時也可由所屬領域技術人員目測優(yōu)化。預期相關的基因 產物或蛋白質可具有高相似性，例如25%到100%序列同一性。如果掃描足夠大小的數據 庫，那么無關的蛋白質可具有與預期偶然發(fā)生的概率基本上相同的同一性(約5%)。5% 與24%之間的序列可能代表或可能不代表足以推斷所比較序列是相關序列的同源性?？蓤?zhí) 行鑒于數據集的大小確定所述匹配的意義的其它統(tǒng)計分析，以便確定這些序列的相關性。使用BLAST算法確定兩種或兩種以上序列的關聯(lián)性的示例性參數可例如說明如 下。簡言之，氨基酸序列比對可使用2. 0.8版(1999年1月5日)BLASTP和以下參數來進 行矩陣0 BL0SUM62 ；空位開放11 ；空位延伸1 ;x_扣分50 ；期望值10. 0 ；字長3 ；過 濾器開。核酸序列比對可使用2. 0. 6版(1998年9月16日)BLASTN和以下參數來進行匹 配1 ；錯配-2 ；空位開放5 ；空位延伸2 ；x_扣分50 ；期望值10. 0 ；字長11 ；過濾器 開。所屬領域技術人員知悉，為了增加或降低比較嚴格度并確定兩種或兩種以上序列的關 聯(lián)性，可對上述參數作哪些修改。在一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予 所述微生物將CO和/或CO2和H2轉化為乙酰輔酶A (乙酰-CoA)的途徑的外源蛋白質，其 中在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下，所述微生物缺乏將CO和/或CO2和H2轉 化為乙酰-CoA的能力。舉例來說，所述一種或多種外源蛋白質或酶可選自鈷酰胺類咕啉/ 鐵硫蛋白甲基轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶 和氫化酶(參見圖1和實施例VII和VIII)。微生物也可表達兩種或兩種以上、三種或三種 以上以及以此類推(包括直到所有)的賦予將CO和/或CO2和H2轉化為乙酰-CoA的途徑 的蛋白質和酶，例如鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成 酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶。如本文所公開的本發(fā)明的一實施方案涉及產生一種可利用CO和/或CO2作為碳 源以產生期望產物的非天然存在的微生物。舉例來說，將Wood-Ljimgdahl途徑的羰基和/ 或甲基分支的蛋白質和酶(圖1和2)引入到天然不含Wood-Ljimgdahl酶的微生物中。尤 其適用于Wood-Ljimgdahl途徑的基因工程的有機體是大腸桿菌，其可用的基因操縱工具 和發(fā)酵條件已經得到充分表征(參見實施例VIII)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦 予所述微生物將包含CO和H2的合成氣或其它氣態(tài)碳源轉化為乙酰輔酶A (乙酰-CoA)的 途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下，缺乏 將CO和H2轉化為乙酰-CoA的能力。所述合成氣或其它氣體可進一步包含C02。因此，本 發(fā)明的非天然存在的微生物可包含提高C02、CO和/或H2到乙酰-CoA的轉化效率的途徑。 此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含CO2 和H2的氣態(tài)碳源轉化為乙酰-CoA的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一 種或多種外源蛋白質的情況下，缺乏將CO2和H2轉化為乙酰-CoA的能力。氣體可進一步包 含CO。如本文所論述，外源蛋白質可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉移酶、一氧化碳脫 氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦 予所述微生物將CO和/或CO2和H2轉化為甲基-四氫葉酸(甲基-THF)的途徑的外源蛋 白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下，缺乏將CO和/或CO2 和H2轉化為甲基-四氫葉酸的能力。如本文所公開，所述一種或多種外源蛋白質可選自鐵 氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞 甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶(參見圖1和實施例VIII)。微生物也可表 達兩種或兩種以上、三種或三種以上以及以此類推(包括直到所有)的賦予將CO和/或CO2 和H2轉化為甲基-四氫葉酸的途徑的蛋白質和酶，包括至多以下所有酶鐵氧還蛋白氧化 還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸 脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將 包含CO和H2的合成氣或其它氣態(tài)碳源轉化為甲基-四氫葉酸的途徑的外源蛋白質，其中所 述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下，缺乏將CO和H2轉化為甲基-四 氫葉酸的能力。合成氣可進一步包含C02。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其 包含一種或多種賦予所述微生物將包含CO2和H2的氣態(tài)碳源轉化為甲基_四氫葉酸的途徑 的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下，缺乏將CO2 和H2轉化為甲基-四氫葉酸的能力。氣態(tài)碳源可進一步包含CO。如上所述，外源蛋白質可 選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水 酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。因此，本發(fā)明涉及非天然存在的微生物和利用所述微生物從包含CO和/或CO2的 合成氣或其它氣體產生期望產物(例如乙酰-CoA或甲基-四氫葉酸)的方法，尤其涉及產 生能利用包含CO和/或CO2的合成氣或其它氣體的微生物，所述微生物先前不能利用包含 CO和/或CO2的合成氣或其它氣體作為碳源(參見實施例VIII)。此外，微生物可經工程 改造以便含有Wood-Ljimgdahl途徑的甲基和羰基分支(圖1、2和6)。此外，也可通過對微 生物進行工程改造產生期望產物也能產生其它期望產物，所述工程改造是通過表達能產生 期望產物(例如產生作為前體的具有乙酰-CoA或甲基-四氫葉酸的產物)的蛋白質或酶 來進行(參見圖3)。如本文所公開，所述微生物可通過表達賦予期望代謝途徑的蛋白質或 基因或者通過確定可驅使代謝產生期望產物的缺失來產生。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含基因修飾，所述基因修飾使所 述微生物從CO和/或CO2和H2產生乙酰-CoA的效率相對于不存在所述基因修飾的情況 下的所述微生物獲得提高，其中所述微生物包含將CO和/或CO2和H2轉化為乙酰-CoA的 途徑。在所述微生物中，基因修飾可包括使編碼一種或多種外源蛋白質的一種或多種核酸 分子得到表達，借此所述一種或多種外源蛋白質的表達會提高從CO和/或CO2和H2產生乙 酰-CoA的效率。所述一種或多種外源蛋白質可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉移酶、 一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶，包括至多所 有如本文所公開的這些蛋白質。所述非天然存在的微生物可另外或替代地具有包括一種或 多種基因破壞的基因修飾，借此所述一種或多種基因破壞會提高從CO和/或CO2和H2產生 乙酰-CoA的效率。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含使得使用本文所公 開的方法產生甲基-四氫葉酸或其它期望產物的效率得到提高的基因修飾。因此，本發(fā)明另外涉及提高微生物產生期望產物的效率，所述微生物已經具有從包含CO和/或CO2的合 成氣或其它氣體產生期望產物的能力。本發(fā)明還涉及一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用 包含CO和/或CO2的合成氣或其它氣體作為碳源的能力的蛋白質，其中所述微生物在不存 在所述一種或多種賦予利用CO和/或CO2的能力的蛋白質的情況下缺乏利用碳源的能力。 此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用一氧 化碳和/或二氧化碳作為碳源的能力的蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或一種 蛋白質的情況下缺乏利用碳源的能力。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的 微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用CO和/或CO2以及H2作為碳源的能力的蛋 白質，其中所述微生物缺乏在不存在所述一種或一種蛋白質的情況下利用碳源的能力。本 發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用CO以及H2 和CO2作為碳源的能力的蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或一種蛋白質的情況 下缺乏利用碳源的能力。所述微生物可用于從碳源產生期望產物，例如甲基-四氫葉酸或 乙酰輔酶A(乙酰-CoA)或其它期望產物，如本文所公開，包括從乙酰-CoA或甲基-四氫葉 酸合成而來的產物。所述非天然存在的微生物可表達一種或多種增加產物產量的外源蛋白 質，如本文所公開(參見圖1和2)。本發(fā)明進一步提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物 利用合成氣或其它氣態(tài)碳源的能力的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多 種外源蛋白質的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外源蛋白質的表達會提 高碳源的利用效率。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所 述微生物利用一氧化碳作為碳源的能力的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種 或多種外源蛋白質的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外源蛋白質的表達 會提高碳源的利用效率。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦 予所述微生物利用CO和/或CO2以及H2作為碳源的能力的外源蛋白質，其中所述微生物在 不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外 源蛋白質的表達會提高碳源的利用效率。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包 含一種或多種賦予所述微生物利用CO以及吐和CO2的能力的外源蛋白質，其中所述微生物 在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種 外源蛋白質的表達會提高碳源的利用效率。所述微生物可用于從碳源產生期望產物，例如 乙酰-CoA、甲基-四氫葉酸或其它期望產物，如本文所公開。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機體，其能夠利用甲醇和合成氣產生乙 酰-CoA0因此，微生物有機體能利用甲醇和COXO2和/或H2 (例如CO2 ；CO2和H2 ；CO ；CO和 H2 ；CO2和CO ；或C02、C0和H2)產生乙酰-CoA。因為乙酰-CoA在大多數微生物有機體中產 生，所以應當理解能產生乙酰-CoA的本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體是經工程改造 以便包含期望途徑的微生物有機體。此外，微生物有機體經工程改造以便利用甲醇和合成 氣產生乙酰-CoA(參見實施例)。在一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物 有機體，其具有包含至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的外源核酸的乙酰輔酶A(乙 酰-CoA)途徑，所述外源核酸足量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑包含甲醇-甲基轉移酶和乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶。在所述非天然存在的微生物有機體中，乙 酰-CoA途徑可賦予將CO2、CO和/或H2、即其組合轉化為乙酰-CoA的能力。所述乙酰-CoA 途徑的甲醇-甲基轉移酶活性可包括例如選自甲醇甲基轉移酶、類咕啉蛋白(例如MtaC) 和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如MtaA)的酶或蛋白質(參見實施例II和 III)的酶和蛋白質。所述乙酰-CoA途徑的乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶活性可包 括例如選自甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白(例如 AcsD)、鎳蛋白裝配蛋白(例如AcsF)、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳 蛋白裝配蛋白(例如CooC)的酶或蛋白質(參見實施例II和III)。如本文所公開，兩種 或兩種以上、三種或三種以上、四種或四種以上、五種或五種以上、六種或六種以上、七種或 七種以上、八種或八種以上、九種或九種以上等的編碼乙酰-CoA途徑的核酸可在本發(fā)明的 非天然存在的微生物有機體中表達。在一特定實施方案中，非天然存在的微生物有機體可 包含十種編碼甲醇_甲基轉移酶和乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶的外源核酸，所述甲 醇-甲基轉移酶包括甲醇甲基轉移酶、類咕啉蛋白(例如MtaC)和甲基四氫葉酸類咕啉蛋 白甲基轉移酶(例如MtaA)，且所述乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶包括甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白(例如AcsD)、鎳蛋白裝配蛋白(例 如CooC)、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如AcsF)。在另一實施方案中，非天然存在的微生物有機體可進一步包含丙酮酸鐵氧還蛋白 氧化還原酶。舉例來說，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶可由外源核酸編碼。在另一實施方 案中，非天然存在的微生物有機體可進一步包含氫化酶，其可由內源或外源核酸編碼，如本 文所公開(參見實施例II和III)。如本文所公開，非天然存在的微生物有機體可含有例如至少一種作為異源核酸的 外源核酸。如本文所進一步公開，非天然存在的微生物有機體可例如在基本上厭氧的培養(yǎng) 基中生長。本文對本發(fā)明的描述一般是通過代謝反應、反應物或其產物，或具體通過一種或 多種核酸或基因描述，所述核酸或基因編碼與所提及的代謝反應、反應物或產物相關的酶 或催化所提及的代謝反應、反應物或產物的酶，或與所提及的代謝反應、反應物或產物相關 的蛋白質。除非本文明確說明，否則所屬領域技術人員將了解提及反應時同樣表示提及反 應的反應物和產物。類似地，除非本文明確說明，否則指代反應物或產物時同樣表示提及反 應，且提及任何這些代謝組分時同樣表示提及一種或多種編碼催化所提及的反應、反應物 或產物的酶或與所提及的反應、反應物或產物相關的蛋白質的基因。同樣，鑒于代謝生物化 學、酶學和基因組學是熟知領域，本文提及基因或編碼核酸也等同于提及對應的所編碼酶 和其催化的反應，或反應的相關蛋白質，以及反應的反應物和產物。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可通過引入編碼一種或多種乙酰-CoA生物 合成途徑中所涉及的一種或多種酶或蛋白質的可表達核酸來產生。取決于為生物合成所選 的宿主微生物有機體，可表達部分或所有的特定乙酰-CoA生物合成途徑的核酸。舉例來 說，如果所選宿主缺乏期望生物合成途徑的一種或多種酶或蛋白質，那么將用于所缺乏酶 或蛋白質的可表達核酸引入到宿主中以供隨后的外源表達?；蛘撸绻x宿主展現(xiàn)一些 途徑基因的內源表達，但缺乏其它基因，那么需要編碼所缺乏酶或蛋白質的核酸以便實現(xiàn) 乙酰-CoA生物合成。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可通過引入外源酶或蛋白質活性以獲得期望生物合成途徑來產生，或者期望生物合成途徑可通過引入一種或多種外 源酶或蛋白質活性來獲得，所述一種或多種外源酶或蛋白質活性與一種或多種內源酶或蛋 白質一起產生例如乙酰-CoA等期望產物。取決于所選宿主微生物有機體的乙酰-CoA生物合成途徑組分，本發(fā)明的非天然 存在的微生物有機體將包含至少一種外源表達的編碼乙酰-CoA途徑的核酸，最多為一種 或多種乙酰-CoA生物合成途徑所有的編碼核酸。舉例來說，乙酰-CoA生物合成可在缺乏 途徑酶或蛋白質的宿主中經由對應編碼核酸的外源表達來實現(xiàn)。在缺乏乙酰-CoA途徑的 所有酶或蛋白質的宿主中，可包含所有途徑酶或蛋白質的外源表達，但應了解即使宿主含 有途徑酶或蛋白質中的至少一種，也可表達所有的途徑酶或蛋白質。舉例來說，可包含用 于產生乙酰-CoA的所有途徑酶或蛋白質的外源表達，例如甲醇-甲基轉移酶，其可包括甲 醇甲基轉移酶、類咕啉蛋白(例如MtaC)和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如 MtaA)；和乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶，其可包括甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉 移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白(例如AcsD)、鎳蛋白裝配蛋白(例如AcsF)、鐵氧還蛋 白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如CooC)。在另一實施方案中，在用于從合成氣或其它氣態(tài)碳源產生乙酰-CoA的途徑中，生 物合成途徑中的一種或多種蛋白質可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉移酶、一氧化碳 脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶(參見圖2和實施例 VII和VIII)。在用于產生甲基-四氫葉酸的途徑中，生物合成途徑中的一種或多種蛋白質 可選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫 水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶(參見圖1和實施例VIII)。此外， 編碼乙酰-CoA和甲基-四氫葉酸的產生所必需的酶的基因可引入到微生物中(參見圖3和 實施例VIII)。美國申請案第11/891，602號(2007年8月10曰申請)和TO/2008/115840 例如描述用于產生其它期望產物(包括檸檬酸、4-羥基丁酸和1，4_ 丁二醇)的代謝途徑。根據本文所提供的教導和指導，所屬領域技術人員將了解以可表達形式引入的編 碼核酸的數目至少與選定宿主微生物有機體的乙酰-CoA途徑缺乏的相當。因此，本發(fā)明的 非天然存在的微生物有機體可具有一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或 至多所有的編碼組成本文所公開的乙酰-CoA生物合成途徑的酶或蛋白質的核酸。在一些 實施方案中，非天然存在的微生物有機體也可包含其它基因修飾，其促進或優(yōu)化乙酰-CoA 生物合成或賦予宿主微生物有機體其它有用的功能。一種所述其它功能可包括例如增加一 種或多種乙酰-CoA途徑前體(例如甲醇)的合成。一般來說，對宿主微生物有機體進行選擇，以便其能產生作為天然產生的分子或 工程產物的乙酰-CoA途徑的前體，所述工程產物提供期望前體的從頭產生，或導致由宿主 微生物有機體天然產生的前體的產生增多。宿主有機體可經工程改造以便增加前體的產 量，如本文所公開。此外，已經工程改造以產生期望前體的微生物有機體可用作宿主有機 體，且進一步經工程改造以表達乙酰-CoA途徑的酶或蛋白質。在一些實施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體是從含有合成乙酰-CoA 的酶促能力的宿主產生。在此特定實施方案中，可以增加乙酰-CoA途徑產物的合成或積累 以便例如驅動乙酰-CoA途徑反應朝產生乙酰-CoA的方向進行。增加的合成或積累可通過 例如編碼一種或多種上述乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的核酸的過度表達來實現(xiàn)。乙酰-CoA途徑的一種或多種酶和/或蛋白質的過度表達可例如經由一種或多種內源基因的外源表 達或經由一種或多種異源基因的外源表達來進行。因此，天然存在的有機體可容易地變?yōu)?本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體，從而例如經由過度表達一種、兩種、三種、四種、五 種、六種、七種、八種、九種或十種、即至多所有的編碼乙酰-CoA生物合成途徑酶或蛋白質 的核酸來產生乙酰_CoA。此外，非天然存在的有機體可通過誘發(fā)內源基因的突變，從而導致 乙酰-CoA生物合成途徑中的酶活性增加來產生。在尤其有用的實施方案中，利用編碼核酸的外源表達。外源表達賦予宿主定制表 達和/或調控元件的能力，以及實現(xiàn)由使用者控制的期望表達水平的應用。然而，其它實施 方案中也可利用內源表達，例如通過移除負調控效應分子或當連接于可誘導的啟動子或其 它調控元件時誘導基因的啟動子。因此，具有天然存在的可誘導啟動子的內源基因可通過 提供適當的誘導劑而得到上調，或內源基因的調控區(qū)可經工程改造以并入可誘導的調控元 件，從而允許在期望時間對內源基因增加的表達進行調控。類似地，可包含可誘導的啟動子 作為引入非天然存在的微生物有機體中的外源基因的調控元件。應了解，在本發(fā)明的方法中，所述一種或多種外源核酸中的任一種皆可引入到微 生物有機體中以產生本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體?？梢牒怂嵋员憷缳x予微生 物有機體乙酰-CoA生物合成途徑?；蛘?，可引入編碼核酸以便產生中間微生物有機體，其 具有催化一些賦予乙酰-CoA生物合成能力所必需的反應的生物合成能力。舉例來說，具 有乙酰-CoA生物合成途徑的非天然存在的微生物有機體可包含至少兩種編碼期望酶或蛋 白質的外源核酸，所述期望酶或蛋白質為例如甲醇甲基轉移酶與類咕啉蛋白的組合、甲醇 甲基轉移酶與甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶的組合、類咕啉蛋白與類咕啉鐵硫蛋 白的組合、鎳蛋白裝配蛋白與鐵氧還蛋白的組合等。因此，應了解本發(fā)明的非天然存在的微 生物有機體可包含生物合成途徑的兩種或兩種以上酶或蛋白質的任何組合。類似地，應了 解本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可視需要包含生物合成途徑的三種或三種以上酶 或蛋白質的任何組合，例如甲醇甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白(例如AcsD)和乙酰-CoA合 成酶；類咕啉蛋白(例如MtaC)、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如CooC或AcsF)； 甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、鐵氧還蛋白和乙酰-CoA合成酶等，只 要期望生物合成途徑的酶和/或蛋白質的組合導致產生對應的期望產物即可。類似地，本 發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可視需要包含如本文所公開的生物合成途徑的四種、五 種、六種、七種、八種、九種或以上酶或蛋白質的任何組合，只要期望生物合成途徑的酶和/ 或蛋白質的組合導致產生對應的期望產物即可。除了本文所述的乙酰-CoA的生物合成外，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體 和方法也可以彼此的各種組合以及與本領域中熟知的其它微生物有機體和方法的各種組 合來利用，以便通過其它途徑實現(xiàn)產物的生物合成。舉例來說，除了使用產乙酰-CoA微生 物有機體外，一種產生乙酰-CoA的替代方案是添加另一種能將乙酰-CoA途徑中間物轉化 為乙酰-CoA的微生物有機體。一種所述程序包括例如發(fā)酵可產生乙酰-CoA途徑中間物的 微生物有機體。乙酰-CoA途徑中間物可接著用作底物以供第二微生物有機體將乙酰-CoA 途徑中間物轉化為乙酰_CoA。乙酰-CoA途徑中間物可直接添加到第二有機體的另一培 養(yǎng)物中，或者可例如通過細胞分離從乙酰-CoA途徑中間物生產者的原始培養(yǎng)物移除這些 微生物有機體，隨后可向發(fā)酵液中添加第二有機體以便無需中間純化步驟即可產生最終產物。在其它實施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體和方法可以眾多亞途徑 裝配以便實現(xiàn)例如乙酰-CoA的生物合成。在這些實施方案中，本發(fā)明的期望產物的生物 合成途徑可分到不同的微生物有機體中，且不同的微生物有機體可共培養(yǎng)以便產生最終產 物。在所述生物合成方案中，一種微生物有機體的產物是另一種微生物有機體的底物，直 到合成最終產物為止。舉例來說，乙酰-CoA的生物合成可通過構建含有用于將一種途徑 中間物轉化為另一種途徑中間物或產物的生物合成途徑的微生物有機體來實現(xiàn)?；蛘?，乙 酰-CoA也可經由使用兩種有機體在同一容器中共培養(yǎng)或共發(fā)酵而以生物合成方法從微生 物有機體產生，其中第一微生物有機體產生乙酰-CoA中間物，而第二微生物有機體將中間 物轉化為乙酰-CoA。根據本文所提供的教導和指導，所屬領域技術人員將了解，本發(fā)明的非天然存在 的微生物有機體和方法，連同其它微生物有機體、具有亞途徑的其它非天然存在的微生物 有機體的共同培養(yǎng)物、和本領域中熟知的用于產生乙酰-CoA的其它化學和/或生物化學 程序的組合存在眾多組合和置換。此外，因為乙酰-CoA是其它期望產物的前體，所以本發(fā) 明的非天然存在的微生物有機體可用作宿主有機體，其根據需要被賦予其它利用乙酰-CoA 作為前體或中間物的期望途徑。乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的編碼核酸的來源可包括例如其中經編碼基因產 物能催化所提及的反應的任何物種。所述物種包括原核和真核有機體，其包括(但不 限于)細菌(包括古細菌和真細菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆蟲、動物和哺 乳動物，包括人類)。所述來源的示例性物種包括例如大腸桿菌、巴氏甲烷八疊球菌 (Methanosarcina barkeri)、嗜乙酸甲焼八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)、熱 乙酸穆爾氏菌、生氫氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、深紅紅螺 菌(Rhodospirillumrubrum)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)、食甲基丁酸桿菌 (Butyribacterium methylotrophicum)、自產乙焼梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、 口譽幾酸梭菌(Clostridium carboxidivorans)、楊氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、 粘液真桿菌(Eubacterium limosum)、普氏產醋桿菌(Oxobacter pfennigii)、產生消 化鏈球菌(Peptostreptococcusproductus)、沼澤紅假單胞菌 P4 (Rhodopseudomonas palustris P4)、膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)、梓檬酸桿菌 Y19 (Citrobacter sp Y19)、嗜乙酸甲烷八疊球菌C2A、巴氏甲烷八疊球菌、東方脫硫芽孢彎曲菌 (Desulfosporosinus orientis)、脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)、普通脫 硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、熱自氧禾裏爾氏菌(Moorella thermoautotrophica)、 太平洋羧酸雙分枝菌(Carboxydibrachiumpacificus)、熱自氧羧酸胞菌(Carboxydocella thermoautotrophica) ΛThermincola carboxydiphi^ (Thermo 1 ithobact ercarboxydivorans)、0譽幾酸熱彎曲菌(Thermosinus carboxydivorans)、fl譽熱自#甲@桿 菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus)、嗜羧酸脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum carboxydivorans)、庫氏脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、致漂脫硫腸 狀菌(Desulfotomaculumnigrificans)、熱苯脫硫腸狀菌熱共養(yǎng)亞種(Desulfotomacu lumthermobenzoicum subsp. Thermosyntrophicum)、弗氏互營桿菌(Syntrophobacter fumaroxidans)、尿酸梭菌(Clostridium acidurici)、非洲脫硫弧菌(Desulfovibrioafricanus)等，以及本文公開的或可作為對應基因的來源有機體獲得的其它示例性物種。 然而，因為現(xiàn)在可從超過550種物種獲得完整基因組序列(其中超過一半可從例如NCBI等 公開數據庫獲得)，包括395種微生物基因組和多種酵母、真菌、植物和哺乳動物基因組，所 以對于相關或遠親物種中的一種或多種基因鑒別編碼必需乙酰-CoA生物合成活性的基因 是常規(guī)的且在本領域中為人所熟知，包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物 和非直系同源基因置換，和有機體之間基因變異的互換。因此，本文參考特定有機體(例如 大腸桿菌)描述的能實現(xiàn)乙酰-CoA的生物合成的代謝變化可容易地應用于其它微生物，同 樣包括原核和真核有機體。根據本文所提供的教導和指導，所屬領域技術人員將知悉在一 種有機體中示例的代謝變化可同樣地應用于其它有機體。在一些情況下，例如當無關物種中存在替代乙酰-CoA生物合成途徑時，宿主物種 可被賦予乙酰-CoA生物合成，例如通過從無關物種外源表達一種或多種旁系同源物，這會 催化類似但不相同的代謝反應置換所提及的反應。因為不同有機體的代謝網絡之間存在某 些差別，所以所屬領域技術人員將了解不同有機體之間的實際基因使用可有所不同。然而， 根據本文所提供的教導和指導，所屬領域技術人員還將了解，本發(fā)明的教導和方法可應用 于所有的微生物有機體，其中使用本文中示例的用于在合成乙酰-CoA的目的物種中構建 微生物有機體的代謝變化的同源代謝變化。宿主微生物有機體可選自以下物種且非天然存在的微生物有機體可在以下物種 中產生例如細菌、酵母、真菌或各種適用于發(fā)酵過程的其它微生物中的任一種。示例性細 菌包括選自以下的物種大腸桿菌、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、產琥珀酸厭 氧螺菌(Ahaerobiospirillumsucciniciproducens)、產玻拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、產琥拍酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌 (Rhizobium etli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、(Gluconobacter oxydans)、氧化葡萄糖酸桿菌(Zymomonas mobilis)、乳
(Lactococcus lactis)(Lactobacillus plantarum)
菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)、焚光假 單胞菌(Pseudomonasfluorescens)禾口惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。示例性酵 母或真菌包括選自以下的物種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克其Jf克魯維 酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。大腸桿菌是尤其有用的宿主有機體，因為其是得 到充分表征的適用于基因工程的微生物有機體。其它尤其有用的宿主有機體包括酵母，例 如釀酒酵母。適合作為宿主有機體的示例性產乙酸菌包括(但不限于)深紅紅螺菌、熱乙 酸穆爾氏菌和哈氏脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)(參見實施例)。用于構建非天然存在的乙酰-CoA生產宿主和測試其表達水平的方法可例如通 過本領域中熟知的重組和檢測方法來執(zhí)行。例如Sambrook等人，MolecularCloning =A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork(2001)；禾口Ausubel 等人’ Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley and Sons, Baltimore, MD(1999)描述所述方法。用于產生乙酰-CoA的途徑中所涉及的外源核酸序列可使用本領域中熟知的技術穩(wěn)定地或暫時地引入宿主細胞中，所述技術包括(但不限于)接合、電穿孔、化學轉化、轉 導、轉染和超聲波轉化。對于在大腸桿菌或其它原核細胞中的外源表達，真核核酸的基因或 cDNA中的一些核酸序列可編碼導向信號，例如N端線粒體導向信號或其它導向信號，必要 時其可在轉化到原核宿主細胞中之前被移除。舉例來說，移除線粒體前導序列會導致在大 腸桿菌中的表達有所增加(Hoffmeister 等人，J. Biol. Chem. 280 :4329_4338 (2005))。對于 在酵母或其它真核細胞中的外源表達，基因可在細胞溶質中表達而無需添加前導序列，或 可通過添加合適的導向序列(例如適用于宿主細胞的線粒體導向或分泌序列)而導向到線 粒體或其它細胞器或經導向用于分泌。因此，應了解為了移除或包含導向序列而對核酸序 列所作的適當修飾可并入外源核酸序列中以便賦予所需性質。此外，可使用本領域中熟知 的技術對基因進行密碼子優(yōu)化以獲得蛋白質的優(yōu)化表達。可構建一種或多種表達載體以包括如本文示例的一種或多種乙酰-CoA生物合成 途徑編碼核酸，所述編碼核酸可操作性連接到在宿主有機體中具有功能的控制序列上。適 用于本發(fā)明的微生物宿主有機體的表達載體包括例如質粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體 (episome)和人工染色體，其包括可用于穩(wěn)定整合到宿主染色體中的載體和選擇序列或標 記。另外，表達載體可包括一種或多種選擇標記基因和適當的表達控制序列。也可包括選擇 標記基因，其例如提供抗生素或毒素抗性、補充營養(yǎng)缺陷或供應培養(yǎng)基中沒有的關鍵營養(yǎng) 物。表達控制序列可包括本領域中熟知的組成型和誘導型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子 等。當打算共表達兩種或兩種以上外源編碼核酸時，這兩種核酸皆可插入例如單一表達載 體中或單獨的表達載體中。對于單一載體表達，編碼核酸可操作性地連接于一種常用表達 控制序列或連接于不同的表達控制序列，例如一種誘導型啟動子和一種組成型啟動子。代 謝或合成途徑中所涉及的外源核酸序列的轉化可使用本領域中熟知的方法進行證實。所述 方法包括例如核酸分析，例如mRNA的Northern印跡技術或聚合酶鏈反應(PCR)，或基因產 物表達的免疫印跡技術，或其它用于測試所引入核酸序列或其對應基因產物的表達的合適 分析方法。所屬領域技術人員應了解外源核酸是足量表達以產生期望產物，且應進一步了 解可使用本領域中熟知且如本文所公開的方法優(yōu)化表達水平以獲得充分表達。本發(fā)明另外提供一種通過培養(yǎng)具有乙酰-CoA途徑的本發(fā)明的非天然存在的微生 物有機體來產生乙酰-CoA的方法。乙酰-CoA途徑可包含例如至少一種編碼乙酰-CoA途 徑酶或蛋白質的外源核酸，其在用于產生乙酰-CoA的條件和足夠時間下足量表達以產生 乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑包含甲醇-甲基轉移酶和乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫 酶。在所述乙酰-CoA途徑中，甲醇-甲基轉移酶可包括選自甲醇甲基轉移酶、類咕啉蛋白 (例如MtaC)和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)的酶或蛋白質。此外，在所 述乙酰-CoA途徑中，乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶可包括例如選自甲基四氫葉酸類 咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白(例如AcsD)、鎳蛋白裝配蛋白(例如 AcsF)、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如CooC)的 酶或蛋白質。非天然存在的微生物有機體可處在基本上厭氧培養(yǎng)基中。在一特定實施方案 中，非天然存在的微生物有機體可在C02、CO和/或H2、即其組合以及甲醇存在下培養(yǎng)。非 天然存在的微生物有機體可進一步包含丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，其可由外源核酸表 達。非天然存在的微生物有機體還可進一步包含氫化酶，其例如由內源或外源核酸編碼。在另一實施方案中，非天然存在的微生物有機體可在存在電子受體(例如硝酸鹽)、尤其在基本上厭氧條件下培養(yǎng)(參見實施例III)。應了解可向微生物培養(yǎng)物中添加 適量硝酸鹽以實現(xiàn)生物質的期望增加，例如ImM到IOOmM硝酸鹽，或視需要更低或更高濃 度，只要添加量為生物質的期望增加提供足量的電子受體即可。所述量視情況包括(但不 限于)5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM 以實現(xiàn)生物質的期望增加?？墒褂檬熘椒▓?zhí)行用于測試乙酰-CoA產生的合適純化和/或分析。對于打算 測試的每種經工程改造的菌株，可培養(yǎng)合適的復制菌株，例如一式三份培養(yǎng)物。舉例來說， 可監(jiān)測經工程改造的生產宿主中的產物和副產物形成。可通過例如HPLC(高效液相色譜)、 GC-MS (氣相色譜-質譜法)和LC-MS (液相色譜-質譜法)或其它合適的分析方法等方法， 使用本領域中熟知的常規(guī)程序來分析終產物和中間物和其它有機化合物。也可用培養(yǎng)物上 清液來測試發(fā)酵液中的產物釋放情況。副產物和殘余葡萄糖可通過HPLC，使用例如針對葡 萄糖和醇類的折射率檢測器和針對有機酸的UV檢測器(Lin等人，Biotechnol. Bioeng. 90 775-779(2005))，或其它在本領域中熟知的合適分析和檢測方法來定量。來自外源DNA序 列的單獨酶或蛋白質活性也可使用本領域中熟知的方法來分析(參見實施例III)。乙酰-CoA或來源于乙酰-CoA的產物可使用本領域中熟知的各種方法與培養(yǎng)物中 的其它組分分離。來源于乙酰-CoA的產物包括(但不限于)乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、 1，4_ 丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸 和丙烯酸。所述分離方法包括例如萃取程序，以及包括連續(xù)液液萃取、滲透蒸發(fā)、膜過濾、膜 分離、反滲透、電滲析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離子交換色譜、尺寸排阻色譜、吸附色譜 和超濾的方法。所有上述方法皆為本領域中所熟知?？膳囵B(yǎng)本文所述的任何非天然存在的微生物有機體以產生和/或分泌本發(fā)明的 生物合成產物。舉例來說，可培養(yǎng)產乙酰-CoA微生物有機體以便以生物合成產生乙酰-CoA 或來源于乙酰-CoA的產物。為了產生乙酰-CoA，在具有甲醇和包含CO、CO2和/或H2的氣體以及其它必需營 養(yǎng)物作為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株。非常需要在發(fā)酵罐中維持厭氧條件以降低 全過程的成本。所述條件可例如通過首先用氮氣噴射培養(yǎng)基，然后用隔膜和螺旋蓋密封燒 瓶來獲得。對于在厭氧條件下未觀察到生長的菌株，可通過在隔膜上打出用于有限通氣的 小孔來應用微氧條件。示例性厭氧條件先前已有描述且為本領域中所熟知。例如美國專利 申請案第11/891，602號(2007年8月10日申請)和TO/2008/115840描述示例性需氧和 厭氧條件。發(fā)酵可如本文所公開以分批、補料分批或連續(xù)方式進行。必要時，可通過根據需要添加堿(例如NaOH或其它堿)或酸使培養(yǎng)基維持在所需 PH下而使培養(yǎng)基的pH維持在期望pH，尤其中性pH，例如約7的pH。生長速率可通過使用 分光光度計(600nm)測量光學密度來測定，且葡萄糖攝取速率可通過監(jiān)測碳源隨時間的消 耗來測定。生長培養(yǎng)基可包含例如任何可向非天然存在的微生物供應碳源的碳水化合物源。 所述碳水化合物源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。 其它碳水化合物源包括例如再生原料和生物質。可在本發(fā)明方法中用作原料的生物質的示 例性類型包括纖維素類生物質、半纖維素類生物質和木質素原料或所述原料的部分。所述 生物質原料含有例如可用作碳源的碳水化合物基質，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、 甘露糖、果糖和淀粉。根據本文提供的教導和指導，所屬領域技術人員將了解除上文示例者之外的再生原料和生物質也可用于培養(yǎng)本發(fā)明的微生物有機體以供產生乙酰-CoA。因此，根據本文所提供的教導和指導，所屬領域技術人員將了解可產生非天然存 在的微生物有機體，其在利用例如碳水化合物、甲醇和包含CO、CO2和/或H2的氣體等碳源 生長時，可細胞內表達或分泌經生物合成的本發(fā)明化合物。所述化合物包括(但不限于)乙 酰-CoA和乙酰-CoA途徑中的任何中間代謝物，以及來源于乙酰-CoA的產物，包括乙醇、丁 醇、異丁醇、異丙醇、1，4_ 丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、 甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸。為了實現(xiàn)期望化合物或中間物的生物合成，需要對一種或多 種所需酶或蛋白質活性進行工程改造，包括例如并入部分或所有乙酰-CoA生物合成途徑。 因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其在利用碳水化合物或其它碳源生長 時產生乙酰-CoA，且在利用碳水化合物或其它碳源生長時產生和/或分泌乙酰-CoA途徑中 所示的任何中間代謝物或產生和/或分泌來源于乙酰-CoA的產物。本發(fā)明的產乙酰-CoA 微生物有機體可引發(fā)從例如5-甲基-四氫葉酸(Me-THF)等中間物啟動合成。可使用如本文示例的本領域中熟知的方法構建本發(fā)明的非天然存在的微生物有 機體，以便以足夠量外源表達至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的核酸以產生乙 酰-CoA。應了解本發(fā)明的微生物有機體是在足以產生乙酰-CoA的條件下培養(yǎng)。根據本文 提供的教導和指導，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可實現(xiàn)乙酰-CoA的生物合成，從 而產生約0. 001-200mM或以上的細胞內濃度。乙酰-CoA的細胞內濃度一般介于約3_150mM 之間，尤其介于約5-125mM之間，且更尤其介于約8_100mM之間，包括約10mM、20mM、50mM、 80mM或以上。還可從本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體獲得介于這些示例性范圍之間和 在這些示例性范圍以上的細胞內濃度。在一些實施方案中，培養(yǎng)條件包括厭氧或基本上厭氧的生長或維持條件。示例 性厭氧條件先前已有描述且為本領域中所熟知。本文描述了用于發(fā)酵過程的示例性厭氧 條件，且其也例如描述于美國專利申請案第11/891，602號(2007年8月10日申請)和 W0/2008/115840中。這些條件中的任一種以及本領域中熟知的其它厭氧條件皆可用于非天 然存在的微生物有機體。在所述厭氧條件下，產乙酰-CoA微生物有機體可以5-10mM或以 上的細胞內濃度以及本文示例的所有其它濃度合成乙酰-CoA。應了解以上描述是指細胞 內濃度，且產乙酰-CoA微生物有機體可細胞內產生乙酰-CoA。此外，可細胞內產生和/或 分泌來源于乙酰-CoA的產物。所述產物包括(但不限于)乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1， 4- 丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和 丙烯酸。培養(yǎng)條件可包括例如液體培養(yǎng)程序以及發(fā)酵和其它大規(guī)模培養(yǎng)程序。如本文所 述，本發(fā)明的生物合成產物的尤其有用的產量可在厭氧或基本上厭氧的培養(yǎng)條件下獲得。如本文所述，一種用于實現(xiàn)乙酰-CoA的生物合成的示例性生長條件包括厭氧培 養(yǎng)或發(fā)酵條件。在某些實施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機體可在厭氧或基本 上厭氧條件下維持、培養(yǎng)或發(fā)酵。簡言之，厭氧條件是指沒有氧的環(huán)境?；旧蠀捬鯒l件包 括在例如培養(yǎng)基中的溶解氧濃度保持在O與10%飽和度之間的條件下培養(yǎng)、分批發(fā)酵或連 續(xù)發(fā)酵?；旧蠀捬鯒l件還包括在維持于小于1 %氧的氣氛的密封室內，在液體培養(yǎng)基中或 固體瓊脂上生長或放置細胞。氧的百分比可通過例如用N2/CO2混合物或其它合適的一種或 多種非氧氣體噴射培養(yǎng)物來維持。
本文所述的培養(yǎng)條件可以按比例擴大和連續(xù)擴大以供產生乙酰_CoA。示例性生長 程序包括例如補料分批發(fā)酵和分批分離；補料分批發(fā)酵和連續(xù)分離；或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分 離。所有這些過程皆為本領域中所熟知。發(fā)酵程序尤其適用于以生物合成方法產生商業(yè)數 量的乙酰_CoA。通常情況下且如同不連續(xù)培養(yǎng)程序中的情況一樣，乙酰-CoA的連續(xù)和/或 接近連續(xù)產生將包括在充足的營養(yǎng)物和培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的非天然存在的產乙酰-CoA 有機體以保持和/或接近保持指數生長期的生長。在所述條件下的連續(xù)培養(yǎng)可包括例如1 天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或以上。此外，連續(xù)培養(yǎng)可包括1周、2周、3周、4周或5 周或以上和至多數月?；蛘?，本發(fā)明的有機體可根據特定應用的需要培養(yǎng)數小時。應了解 連續(xù)和/或接近連續(xù)培養(yǎng)條件還可包括這些示例性時段之間的所有時間間隔。應進一步了 解，本發(fā)明的微生物有機體的培養(yǎng)時間是足以產生足量產物用于期望目的的時段。發(fā)酵程序為本領域中所熟知。簡言之，用于以生物合成方法產生乙酰-CoA的發(fā)酵 可例如以下列方式利用補料分批發(fā)酵和分批分離；補料分批發(fā)酵和連續(xù)分離；或連續(xù)發(fā) 酵和連續(xù)分離。分批和連續(xù)發(fā)酵程序的實例為本領域中所熟知。除了使用本發(fā)明的產乙酰-CoA微生物有機體連續(xù)產生大量乙酰-CoA的上述發(fā)酵 程序外，產乙酰-CoA微生物有機體也可例如根據需要同時經歷化學合成程序以將產物轉 化為其它化合物，或產物可自發(fā)酵培養(yǎng)物分離，和依次經歷化學轉化以將產物轉化為其它 化合物。多年來，已經分離出至少三十種不同的野生型有機體，且其顯示可利用合成氣 或合成氣的組分生長，包括能將合成氣轉化為乙醇的微生物(Vega等人，Appl. Biochem. Biotechnol. 20/21 :781_797 (1989))(參見表1)。用于改良型合成氣發(fā)酵的候選有機體包 括產乙酸菌、光能利用菌、硫酸還原菌和產甲烷菌，其可利用CO和/或C02/H2作為唯一的 碳源和能源(Sipma等人，Crit. Rev. Biotechnol. 26 =41-65. (2006))。嗜溫產乙酸菌嗜羧 酸梭菌代表最有前景用于合成氣生成化學物平臺(syngas-to-chemicals platform)的有 機體中的一種，因為其具有快速倍增時間且已顯示可利用合成氣生長期間天然產生乙醇和 少量的丁醇(Henstra 等人，Curr. Opin. Biotechnol. 18 200~206 (2007))?？砷_發(fā)用于這 種有機體的基因工具。針對產氫紫色非硫細菌、即深紅紅螺菌的目標基因缺失或插入的基 因工具已經存在，所述細菌是另一種用于開發(fā)合成氣利用以產生期望產物的優(yōu)良候選有機 體，但其天然從合成氣產生氫且因此可根據需要工程改造代謝改變，一些合成氣利用型有機體的代謝是已知的。舉例來說，例如嗜羧酸梭菌等產乙酸 菌可通過利用Wood-Ljungdahl途徑在CO或CO2存在下生長，甚至可在不存在葡萄糖的情 況下生長，只要存在氫以便供應必需的還原當量即可。圖3說明Wood-Ljimgdahl途徑(也 參見圖1和2)，且所述途徑顯示產乙酸菌經由產生關鍵的代謝中間物乙酰-CoA而利用CO 作為唯一碳源和能源的能力。特定來說，CO可經氧化以產生還原當量和CO2，或可被直接 同化成乙酰-CoA，其隨后轉化為生物質或代謝物。重要的是，乙酰-CoA是關鍵的代謝中間 物，可用作許多代謝物和其它化學實體的前體。因此，微生物從合成氣或其它氣態(tài)碳源產生 乙酰-CoA的能力允許對合成氣利用型有機體或能利用其它氣態(tài)碳源的有機體進行工程改 造，以便產生作為期望產物的許多化學物和燃料。為了表征合成氣或其它氣態(tài)碳源作為可行的原料經由發(fā)酵來商業(yè)制造化學物和 燃料的應用，進行可行性研究以解決與當前系統(tǒng)有關的關鍵問題和難題。初步代謝建模工作已經表明合成氣轉化為化學物可在熱力學上非常有利，且特定化學物可作為專有產物制 得。這不僅會降低下游加工需求，而且會最大化產物產量。此外，期望產物的產生可與生長 關聯(lián)，因此可根據需要連續(xù)進行發(fā)酵。因為連續(xù)過程是維持在高細胞濃度下且節(jié)約分批往 返時間，所以其在經濟上更為有利。如本文所公開，本發(fā)明涉及開發(fā)能利用合成氣或其它氣態(tài)碳源的微生物，從而允 許以高產率、滴度和生產率將CO和/或CO2有效地轉化為化學產物。一個示例性的適用 商業(yè)實施方案涉及開發(fā)能以> 80%理論最大值的產率、> 50g/L的產物耐受性(product tolerance)、^ 50g/L的滴度和至少2g/L/h的生產率產生特定化學物的有機體。雖然這 些標準在商業(yè)上很有用，但應了解能獲得小于任何或所有這些標準的結果的有機體也適 用于本發(fā)明。舉例來說，有機體可以大于或等于75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、 40 %、35 %、30 %、25 %、20 %等中的任一種的產率產生特定化學物，只要所得產率足以滿足 期望應用即可。類似地，有機體可獲得大于或等于45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/ L、15g/L、10g/L等中的任一種的產物耐受性，只要所得產率足以滿足期望應用即可。此外， 有機體可獲得大于或等于 200g/L、190g/L、180g/L、170g/L、160g/L、150g/L、140g/L、130g/ L、120g/L、110g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、 25g/L、20g/L、15g/L、10g/L等中的任一種的滴度，只要所得產率足以滿足期望應用即可。此 外，有機體可獲得1. 5g/L/h、lg/L/h、0. 5g/L/h等中的至少任一種的生產率，只要所得產率 足以滿足期望應用即可。如本文所公開，對丁醇作為合成氣利用產物的假設分析表明，能有效利用便宜且 容易獲得的合成氣作為原料，且可得到可能比當前石油化學方法節(jié)省> 50%成本的方法， 特別是在合成氣作為原料的低成本方面。除了低成本外，合成氣還是一種豐富且適應性強 的基質，可從煤和許多類型的生物質產生，所述生物質包括能源作物，例如柳枝稷，以及廢 物，例如廢木材、農業(yè)廢物、乳業(yè)廢物和市政固體廢物。因此，產生能利用合成氣或其它氣態(tài) 碳源產生期望產物的有機體的能力允許從幾乎任何生物質源產生期望產物。這種特征避免 了針對用于生物燃料或化學物生產的每種類型的生物質特別開發(fā)不同方法的需求。對于合 成氣產生中的廢物的利用也可用于降低環(huán)境污染并緩解生物廢物的嚴重處理問題。此外， 合成氣作為原料不會引起在例如基于玉米產生乙醇的情況下存在的進料與燃料的爭議。鑒 于可用于產生合成氣的基質的范圍很廣，預期這種原料的供應和成本結構在很多年內都會 保持相對穩(wěn)定。最后，合成氣廣泛用于加熱和供能，且因此可用作生物質能的來源，其可補 充或消除生產上對基于石油的能量的需求，從而提供額外的成本節(jié)約。雖然在本文的各個實施方案中示例丁醇作為期望產物，但應了解可產生任何能由 本發(fā)明的微生物產生的產物并利用其產生期望產物。期望產物一般包括(但不限于)可用 于化學合成或可用作燃料的烴類。示例性期望產物包括(但不限于)甲醇、乙醇、丁醇、乙 酸、丁酸、乳酸、琥珀酸、4-羥基丁酸、1，4_ 丁二醇等。在其它方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有可包含至少一 種編碼4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸的4-羥基丁酸途徑，所述外源核酸足量表達以產生 4-羥基丁酸。4-羥基丁酸途徑酶可包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、 巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉移酶、磷酸轉-4-羥基丁酰酶和4-羥基 丁酸激酶。
在其它方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有可包含至少一 種編碼1，4-丁二醇途徑酶的外源核酸的1，4-丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達以產生 1，4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途徑酶可包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴 豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原 酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脫氫酶。所述有機體還可包含具有至少一種編碼乙酰-CoA 途徑酶的外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達以產生乙酰-CoA。乙酰-CoA 途徑酶可包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋 白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原 酶和氫化酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有可包含至少一 種編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的外源核酸的1，4_ 丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達以產生 1，4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途徑酶可包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴 豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原 酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脫氫酶。所述有機體還可包含具有至少一種編碼乙酰-CoA 途徑酶的外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達以產生乙酰-CoA。乙酰-CoA 途徑酶可包括乙酰-CoA合成酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化 水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種產生4-羥基丁酸的方法，其可包含培養(yǎng)具有4-羥基 丁酸途徑的非天然存在的微生物有機體。所述途徑可包含至少一種編碼4-羥基丁酸途徑 酶的外源核酸，所述外源核酸在用于產生4-羥基丁酸的條件和足夠時間下足量表達以產 生4-羥基丁酸。4-羥基丁酸途徑酶可包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫 酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉移酶、磷酸轉-4-羥基丁酰酶和4-羥 基丁酸激酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種產生1，4- 丁二醇的方法，其可包含培養(yǎng)具有1，4- 丁 二醇途徑的非天然存在的微生物有機體。所述途徑可包含至少一種編碼1，4_ 丁二醇途徑 酶的外源核酸，所述外源核酸在用于產生1，4_ 丁二醇的條件和足夠時間下足量表達以產 生1，4_ 丁二醇。1，4_ 丁二醇途徑可包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、 巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還 原酶(醛形成型)和1，4_丁二醇脫氫酶。所述有機體還可包含具有至少一種編碼乙酰-CoA 途徑酶的外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達以產生乙酰-CoA。乙酰-CoA 途徑酶可包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋 白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原 酶和氫化酶。最后，在一些方面，本發(fā)明提供一種產生1，4_ 丁二醇的方法，其可包含培養(yǎng)具有 1，4_ 丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機體。所述途徑可包含至少一種編碼1，4_ 丁二 醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸在用于產生1，4_ 丁二醇的條件和足夠時間下足量表 達以產生1，4_ 丁二醇。1，4_ 丁二醇途徑可包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁 酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機體還可包含具有至少一種編
35碼乙酰-CoA途徑酶的外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達以產生乙酰-CoA。 乙酰-CoA途徑酶可包括乙酰-CoA合成酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫 葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。在其它實施方案中，本發(fā)明的有機體具有功能性甲基轉移酶系統(tǒng)、合成乙酰-CoA 的能力和從乙酰-CoA合成4-HB的能力，如圖11所描繪。本文所述的其它有機體具有功能 性甲基轉移酶系統(tǒng)、合成乙酰-CoA的能力和從乙酰-CoA合成BDO的能力，如圖12所描繪。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有可包含至少一種編碼 4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸的4-羥基丁酸途徑，所述外源核酸足量表達以產生4-羥基 丁酸。4-羥基丁酸途徑酶可包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸 酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉移酶、磷酸轉-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸激 酶。所述有機體還可包含至少一種例如以下的酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成 酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實施方案中，具有4-羥基丁酸途徑的有機體可包含甲醇甲基轉移酶。所述 有機體利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲 醇和包含CO和H2的合成氣，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣。其它具有4-羥基丁酸途徑的有機體可具有甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次 甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。所述有機體 利用例如以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣，和5)包含 CO、CO2和吐的合成氣。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有可包含至少一種編碼1， 4-丁二醇途徑酶的外源核酸的1，4_ 丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達以產生1，4_ 丁二 醇。1，4- 丁二醇途徑酶包括例如乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸 酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶 (醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機體還可包含至少一種例如以下的酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成 酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實施方案中，具有1，4_ 丁二醇途徑的有機體可包含甲醇甲基轉移酶。所述 有機體利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲 醇和包含CO和H2的合成氣，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣。在其它實施方案中，具有1，4_ 丁二醇途徑的有機體可包含甲酸脫氫酶、甲酰四氫 葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原 酶。所述有機體利用選自由諸如以下組成的組的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包 含CO和H2的合成氣，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣。本發(fā)明的示例性微生物有機體可含有如圖13所描繪的途徑。所述有機體可含有 Wood-Ljungdahl途徑的功能性甲基分支、合成乙酰-CoA的能力和從乙酰-CoA合成4-羥基 丁酸的能力。本發(fā)明的另一示例性微生物有機體可含有如圖14所描繪的途徑。所述有機
36體可含有Wood-Ljungdahl途徑的功能性甲基分支、合成乙酰-CoA的能力和從乙酰-CoA合 成1，4_ 丁二醇的能力。為了產生更好的生產者，可利用代謝建模來優(yōu)化生長條件。也可用建模來設 計基因剔除，其另外優(yōu)化途徑的利用(參見例如美國專利公開案US2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723,US2003/0059792,US 2002/0168654 和US 2004/0009466，和美國專利第7，127，379號)。建模分析允許可靠地預測使代謝朝著 更有效產生乙酰-CoA或來源于乙酰-CoA的產物的方向移動對細胞生長的影響。一種鑒別和設計有利于期望產物的生物合成的代謝改變的計算方法是OptKnock 計算框架(Burgard 等人，Biotechnol. Bioeng. 84 :647_657 (2003))。OptKnock 是一種代 謝建模和模擬程序，其暗示可形成過量產生目標產物的遺傳穩(wěn)定的微生物的基因缺失策 略。特定來說，所述框架檢查微生物的完整代謝和/或生物化學網絡，以便暗示促使期望 生物化學產物變成細胞生長的專性副產物的基因操作。通過用具有戰(zhàn)略意義的基因缺失 或其它功能基因破壞使生物化學生產與細胞生長偶聯(lián)，在生物反應器中歷經長時間后施加 于經工程改造的菌株的生長選擇壓力可導致性能提高，因為生長與生物化學生產被強制偶 聯(lián)。最后，當構建基因缺失時，經設計的菌株還原成其野生型狀態(tài)的可能性可以忽略，因為 OptKnock所選擇的基因會從基因組完全移除。因此，所述計算方法可用于鑒別可實現(xiàn)期望 產物的生物合成的替代途徑，或與非天然存在的微生物有機體結合使用以便進一步優(yōu)化期 望產物的生物合成。簡言之，OptKnock是本文中用于指代建模細胞代謝的計算方法和系統(tǒng)的術語。 OptKnock程序涉及將特定約束納入通量平衡分析(FBA)模型中的模型和方法的框架。這些 約束包括例如定性動態(tài)信息、定性調控信息和/或DNA微陣列實驗數據。OptKnock還例如 通過縮窄經由通量平衡模型產生的通量邊界，隨后探測在基因添加或缺失存在下代謝網絡 的性能極限來計算各種代謝問題的解決方案。OptKnock計算框架允許構建能夠有效地詢問 代謝網絡的性能極限的模型公式，并提供對所得混合整數線性規(guī)劃問題求解的方法。本文 中稱為OptKnock的代謝建模和模擬方法是描述于例如2002年1月10日申請的美國公開 案2002/0168654、2002年1月10日申請的國際專利第PCT/US 02/00660號和2007年8月 10日申請的美國專利申請案第11/891，602號，以及TO/2008/115840中。另一種鑒別和設計有利于產物的生物合成產生的代謝變化的計算方法是被稱作 SimPheny 的代謝建模和模擬系統(tǒng)。這種計算方法和系統(tǒng)是描述于例如2002年6月14 日申請的美國公開案2003/0233218和2003年6月13日申請的國際專利申請案第PCT/ US03/18838號中。SimPheny 是一種計算系統(tǒng)，可用于產生硅中(in silico)網絡模型 并模擬質量、能量或電荷通過生物系統(tǒng)的化學反應的通量，以便界定含有化學反應在系統(tǒng) 中任何和所有可能的功能性的解空間，從而確定生物系統(tǒng)的允許活性的范圍。這種方法被 稱作基于約束的建模，因為解空間是由例如所包括反應的已知化學計量以及反應熱力學和 與通過反應的最大通量能力約束等約束界定?？稍儐栠@些約束所界定的空間以確定生物系 統(tǒng)或其生物化學組分的表型能力和行為。這些計算方法與生物現(xiàn)實一致，因為生物系統(tǒng)適用性強且可以許多不同方式獲得 相同結果。經由進化機制設計生物系統(tǒng)，所述進化機制已經受所有活系統(tǒng)必須面對的基本 約束限制。因此，基于約束的建模策略涵蓋這些一般現(xiàn)實。此外，經由縮窄約束而對網絡模型連續(xù)施加進一步約束的能力導致解空間的尺寸變小，從而提高生理性能或表型的預測精 確性。根據本文所提供的教導和指導，所屬領域技術人員將能夠應用代謝建模和模擬的 各種計算框架，以便設計和實施期望化合物在宿主微生物有機體中的生物合成。所述代謝 建模和模擬方法包括例如上文以SimPheny 和OptKnock示例的計算系統(tǒng)。為了說明本發(fā) 明，本文關于建模和模擬的OptKnock計算框架描述了一些方法。所屬領域技術人員將知悉 如何使用OptKnock對本領域中熟知的任何其它代謝建模和模擬計算框架和方法應用代謝 變化的鑒別、設計和實施。上文所述的方法將提供一組用于破壞的代謝反應。所述組內每個反應的消除或代 謝修飾可導致期望產物在有機體的生長期中作為專性產物產生。因為這些反應是已知的， 所以二層OptKnock問題的解決方案也將提供催化這一組反應內每個反應的一種或多種酶 的相關編碼基因。對于一組反應和其參與每個反應的酶的對應編碼基因的鑒別一般是自 動化方法，這可經由將所述反應與在酶和編碼基因之間具有關系的反應數據庫相關聯(lián)來實 現(xiàn)。一旦得到鑒別，就通過至少一種編碼這一組反應內每個代謝反應的基因的功能破 壞在目標細胞或有機體中實施打算破壞以產生期望產物的這一組反應。一種尤其有用的實 現(xiàn)反應組的功能破壞的方法是缺失每種編碼基因。然而，在一些情況下，通過其它基因畸變 破壞反應可能是有利的，包括例如突變、調控區(qū)(例如啟動子或調控因子的順式結合位點) 缺失或在許多位置中的任一個位置截斷編碼序列。舉例來說，當希望快速評定產物偶聯(lián)時， 或當遺傳逆轉不太可能發(fā)生時，產生少于基因集合的總體缺失的缺失的這些畸變可能是有 利的。為了針對上述二層OptKnock問題確定其它生產解決方案，從而產生用于破壞的 其它各組反應或可實現(xiàn)生物合成(包括期望產物的生長偶聯(lián)型生物合成)的代謝修飾，可 實施被稱作整數分割的優(yōu)化方法。所述方法是通過對上文示例的OptKnock問題迭代求解 來進行，其中在每次迭代時納入被稱作整數分割的另一種約束。整數分割約束有效地防止 求解過程選擇在任何先前迭代中鑒別的完全相同的一組反應，所述迭代強制產物生物合成 與生長偶聯(lián)。舉例來說，如果先前鑒別的生長偶聯(lián)型代謝修飾規(guī)定反應1、2和3用于破壞， 那么以下約束防止在隨后求解中同時考慮相同的反應。整數分割方法在本領域中是熟知的 且可描述于例如Burgard等人，Biotechnol. Prog. 17 :791_797 (2001)。和本文關于與代謝 建模和模擬的OptKnock計算框架組合使用而描述的所有方法一樣，減少迭代計算分析中 的冗余度的整數分割方法也可與本領域中熟知的其它計算框架(包括例如SimPheny ) 一起應用。本文中示例的方法允許構建以生物合成方式產生期望產物的細胞和有機體，包括 強制目標生物化學產物的產生與經工程改造以具有所鑒別基因變異的細胞或有機體的生 長偶聯(lián)。因此，本文所述的計算方法允許鑒別和實施通過選自OptKnock或SimPheny 的 硅中方法鑒別的代謝修飾。這組代謝修飾可包括例如一種或多種生物合成途徑酶的添加和 /或一種或多種代謝反應的功能破壞，包括例如通過基因缺失來破壞。如上文所討論，OptKnock方法的開發(fā)是基于突變型微生物網絡當經歷長期生長選 擇時可朝向其以計算機預測的最大生長表型進化這一前提。換句話說，所述方法調節(jié)有機體在選擇性壓力下自我優(yōu)化的能力。OptKnock框架允許對基于網絡化學計量迫使生物化學 生產與細胞生長偶聯(lián)的基因缺失組合進行窮舉。對于最佳基因/反應剔除的鑒別需要對二 層優(yōu)化問題求解，所述問題選擇活性反應組，使得所得網絡的最佳生長答案過量產生目的 生物化學物(Burgard 等人，Biotechnol. Bioeng. 84 :647_657 (2003))。大腸桿菌代謝的硅中化學計量模型可用于鑒別先前示例的代謝途徑的必需基因， 且描述于例如美國專利公開案 US 2002/0012939、US 2003/0224363、US2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654 和 US2004/0009466,以及美國專利第 7，127，379號中。如本文所公開，OptKnock數學框架可用于定位導致期望產物的生長偶聯(lián) 型生產的基因缺失。此外，二層OptKnock問題的解決方案僅提供一組缺失。為了列舉所有 有意義的解決方案、即導致生長偶聯(lián)型生產形成的所有剔除集合，可實施被稱作整數分割 的優(yōu)化技術。這要求對OptKnock問題迭代求解，其中在每次迭代時納入被稱作整數分割的 另一種約束，如上文所討論。應了解不會對本發(fā)明的各種實施方案的活性造成實質影響的修飾也可涵蓋在本 文提供的本發(fā)明的定義中。因此，以下實施例打算說明但不限制本發(fā)明。
實施例實施例I用于合成氣發(fā)酵的有機體和途徑本實施例描述能利用合成氣的有機體和示例性途徑。多年來，已經分離出至少三十種不同的有機體，且其顯示可利用合成氣或合 成氣的組分(例如 CO、CO2 和 H2)生長(Henstra 等人，Curr. Opin. Biotechnol. 18 200-206(2007) :Sipma 等人，Crit. Rev. Biotechnol. 26 41~65 (2006))。表 1 提供所述有機 體的實例以及其許多性質，例如最佳生長溫度、最佳生長PH、倍增時間、產物概況和生理群。表1 ⑶利用物種的實例和其生理特征。
權利要求
一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將CO和H2轉化為乙酰輔酶A(乙酰 CoA)的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下缺乏將CO和H2轉化為乙酰 CoA的能力。
2.根據權利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質選自 鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成 酶二硫鍵還原酶和氫化酶。
3.根據權利要求2所述的非天然存在的微生物，其中鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基轉 移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶各自被 表達。
4.一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含CO和H2的合 成氣轉化為乙酰輔酶A(乙酰-CoA)的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一 種或多種外源蛋白質的情況下缺乏將CO和H2轉化為乙酰-CoA的能力。
5.根據權利要求4所述的非天然存在的微生物，其中所述合成氣進一步包含C02。
6.根據權利要求5所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質選自 鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成 酶二硫鍵還原酶和氫化酶。
7.根據權利要求6所述的非天然存在的微生物，其中鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基轉 移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶各自被 表達。
8.一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將CO2和H2轉化為乙 酰輔酶A(乙酰-CoA)的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源 蛋白質的情況下缺乏將CO2和H2轉化為乙酰-CoA的能力。
9.根據權利要求8所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質選自 鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成 酶二硫鍵還原酶和氫化酶。
10.根據權利要求9所述的非天然存在的微生物，其中鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基 轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶各自 被表達。
11.一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將CO和H2轉化為甲 基-四氫葉酸(甲基-THF)的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多 種外源蛋白質的情況下缺乏將CO和H2轉化為甲基-四氫葉酸的能力。
12.根據權利要求11所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質 選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水 酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
13.根據權利要求12所述的非天然存在的微生物，其中鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸 脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲 基四氫葉酸還原酶各自被表達。
14.一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含CO和H2的合 成氣轉化為甲基-四氫葉酸(甲基-THF)的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下缺乏將CO和H2轉化為甲基-四氫葉酸的能力。
15.根據權利要求14所述的非天然存在的微生物，其中所述合成氣進一步包含C02。
16.根據權利要求15所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質 選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水 酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
17.根據權利要求16所述的非天然存在的微生物，其中鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸 脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲 基四氫葉酸還原酶各自被表達。
18.一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將CO2和H2轉化為 甲基-四氫葉酸(甲基-THF)的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物在不存在所述一種或 多種外源蛋白質的情況下缺乏將CO2和H2轉化為甲基-四氫葉酸的能力。
19.根據權利要求18所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質 選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水 酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
20.根據權利要求19所述的非天然存在的微生物，其中鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸 脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲 基四氫葉酸還原酶各自被表達。
21.一種非天然存在的微生物，其包含基因修飾，所述基因修飾使所述微生物從C02、C0 和H2或其組合產生乙酰-CoA的效率相對于不存在所述基因修飾的情況下的所述微生物獲 得提高，其中所述微生物包含將C02、CO和H2或其組合轉化為乙酰-CoA的途徑。
22.根據權利要求21所述的非天然存在的微生物，其中所述基因修飾包括使編碼一種 或多種外源蛋白質的一種或多種核酸分子得到表達，借此所述一種或多種外源蛋白質的表 達提高從C02、CO和H2或其組合產生乙酰-CoA的效率。
23.根據權利要求22所述的非天然存在的微生物，其中所述一種或多種外源蛋白質選 自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合 成酶二硫鍵還原酶和氫化酶。
24.根據權利要求23所述的非天然存在的微生物，其中鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、甲基 轉移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶各自 被表達。
25.一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有乙酰輔酶A (乙酰-CoA)途徑的微生 物有機體，所述途徑包含至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的外源核酸，所述外源核 酸被足量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑包含甲醇-甲基轉移酶和乙酰-CoA合 成酶/ 一氧化碳脫氫酶。
26.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述乙酰-CoA途徑賦予 將C02、CO或H2或其組合和甲醇轉化為乙酰-CoA的能力。
27.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲醇-甲基轉移酶 包括選自甲醇甲基轉移酶、類咕啉蛋白和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶的酶或蛋 白質。
28.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述乙酰-CoA合成酶/3一氧化碳脫氫酶包括選自甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白 裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白的酶或蛋白 質。
29.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲醇-甲基轉移酶 包括選自甲醇甲基轉移酶、類咕啉蛋白和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶的酶或蛋 白質，且所述乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶包括選自甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基 轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫 酶和鎳蛋白裝配蛋白的酶或蛋白質。
30.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 兩種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
31.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 三種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
32.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 四種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
33.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 五種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
34.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 六種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
35.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 七種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
36.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 八種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
37.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 九種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
38.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含 十種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
39.根據權利要求38所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述十種外源核酸編碼 甲醇-甲基轉移酶和乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶，所述甲醇-甲基轉移酶包括甲醇 甲基轉移酶、類咕啉蛋白和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶，且所述乙酰-CoA合成 酶/ 一氧化碳脫氫酶包括甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白 裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白。
40.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述至少一種外源核酸 是異源核酸。
41.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述非天然存在的微生 物有機體是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
42.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述非天然存在的微生 物有機體進一步包含丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶。
43.根據權利要求42所述的非天然存在的微生物有機體，其中丙酮酸鐵氧還蛋白氧化 還原酶是由外源核酸編碼。
44.根據權利要求25所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述非天然存在的微生 物有機體進一步包含氫化酶。
45.根據權利要求44所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述氫化酶是由內源核 酸編碼。
46.根據權利要求44所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述氫化酶是由外源核酸編碼。
47.一種產生乙酰-CoA的方法，其包含培養(yǎng)具有乙酰-CoA途徑的非天然存在的微生物 有機體，所述途徑包含至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的外源核酸，所述外源核酸 在用于產生乙酰-CoA的條件和足夠時間下足量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑 包含甲醇_甲基轉移酶和乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述甲醇-甲基轉移酶包括選自甲醇甲基轉移 酶、類咕啉蛋白和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶的酶或蛋白質。
49.根據權利要求47所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶/一氧化碳脫氫酶包括選 自甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、 乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白的酶或蛋白質。
50.根據權利要求47所述的方法，其中所述甲醇-甲基轉移酶包括選自甲醇甲基轉移 酶、類咕啉蛋白和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶的酶或蛋白質，且所述乙酰-CoA 合成酶/ 一氧化碳脫氫酶包括選自甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋 白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白的 酶或蛋白質。
51.根據權利要求47所述的方法，其中所述非天然存在的微生物有機體是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述非天然存在的微生物有機體是在C02、C0或 H2或其組合和甲醇存在下培養(yǎng)。
53.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含兩種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
54.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含三種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
55.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含四種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
56.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含五種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
57.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含六種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
58.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含七種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
59.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含八種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
60.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含九種外源核酸，其各自編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
61.根據權利要求47所述的方法，其中所述微生物有機體包含十種外源核酸，其各自 編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質。
62.根據權利要求61所述的方法，其中所述十種外源核酸編碼甲醇-甲基轉移酶和乙 酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶，所述甲醇-甲基轉移酶包括甲醇甲基轉移酶、類咕啉蛋 白和甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶，且所述乙酰-CoA合成酶/ 一氧化碳脫氫酶包 括甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、 乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白。
63.根據權利要求47所述的方法，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
64.根據權利要求47所述的方法，其中所述非天然存在的微生物有機體進一步包含丙 酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶。
65.根據權利要求64所述的方法，其中丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶是由外源核酸編碼。
66.根據權利要求47所述的方法，其中所述非天然存在的微生物有機體進一步包含氫化酶。
67.根據權利要求66所述的方法，其中所述氫化酶是由內源核酸編碼。
68.根據權利要求66所述的方法，其中所述氫化酶是由外源核酸編碼。
69.根據權利要求51所述的方法，其中所述非天然存在的微生物有機體是在硝酸鹽存 在下培養(yǎng)。
70.一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有4-羥基丁酸途徑的微生物有機體， 所述4-羥基丁酸途徑包含至少一種編碼4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被 足量表達以產生4-羥基丁酸，所述4-羥基丁酸途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基 丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉移酶、磷酸轉_4_羥 基丁酰酶和4-羥基丁酸激酶。
71.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解 酶是由選自由atoB、thlA、thlB和erglO組成的組的基因編碼。
72.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶是由選自由hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389和msed_1933組成的組的基因 編碼。
73.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述巴豆酸酶是由選自 由 crt、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG 組成的組的基因編碼。
74.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述巴豆酰-CoA水合酶 是由選自由abfD、msed_1321和msed_1220組成的組的基因編碼。
75.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述4-羥基丁酰-CoA 轉移酶是由選自由cat2、abfT-2、abfT-1和abfT組成的組的基因編碼。
76.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述磷酸轉-4-羥基丁 酰酶是由選自由Pta和ptb組成的組的基因編碼。
77.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述4-羥基丁酸激酶是 由選自由ackA、bukl、buk2和proB組成的組的基因編碼。
78.根據權利要求70所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含至少一種選自 由以下組成的組的酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉 鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧 還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
79.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述類咕啉蛋白是由選 自由mtaC、mtaCl、mtaC2和mtaC3組成的組的基因編碼。
80.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲基四氫葉酸類 咕啉蛋白甲基轉移酶是由選自由mtaA、mtaAl和mtaA2組成的組的基因編碼。
81.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲基四氫葉酸類 咕啉蛋白甲基轉移酶是由基因acsE編碼。
82.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述類咕啉鐵硫蛋白是 由基因acsD編碼。
83.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述鎳蛋白裝配蛋白是 由至少一種選自由acsF和cooC組成的組的基因編碼。
84.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述鐵氧還蛋白是由基 因orf7編碼。
85.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述乙酰-CoA合成酶是 由至少一種選自由acsB和acsC組成的組的基因編碼。
86.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述一氧化碳脫氫酶是 由基因acsA編碼。
87.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述丙酮酸鐵氧還蛋白 氧化還原酶是由選自由por和ydbK組成的組的基因編碼。
88.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述氫化酶是由至 少一種選自由 hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、 moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、 hycH、hycl、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、 moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、 moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、 moth_0809、moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、 moth_0816、moth_1193、moth_l 194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、 moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、 moth_1452、moth_1453和moth_1454組成的組的塞因編碼。
89.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含由基因acsEps 編碼的多肽AcsEps。
90.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含至少一種由選 自由以下組成的組的基因編碼的酶或多肽codh、codh-I, cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、 cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
91.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含甲醇甲基轉移酶。
92.根據權利要求91所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲醇甲基轉移酶是 由選自由mtaB、mtaBl、mtaB2和mtaB3組成的組的基因編碼。
93.根據權利要求91所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述有機體利用選自由 以下組成的組的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包 含CO和H2的合成氣，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣。
94.根據權利要求78所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含甲酸脫氫酶、 甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫 葉酸還原酶。
95.根據權利要求94所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲酸脫氫酶是由選 自由 moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、 chy_073Uchy_0732和chy_0733組成的組的基因編碼。
96.根據權利要求94所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲酰四氫葉酸合成 酶是由選自由moth_0109、chy_2385和fhs組成的組的基因編碼。
97.根據權利要求94所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán) 化水解酶是由選自由moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
98.根據權利要求94所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述亞甲基四氫葉酸脫 氫酶是由選自由moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
99.根據權利要求94所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述亞甲基四氫葉酸還 原酶是由選自由moth_l 191、metF和chy_1233組成的組的基因編碼。
100.根據權利要求94所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述有機體利用選自 由以下組成的組的原料1)C0，2)C02*H2，3)C0和CO2,4)包含CO和H2的合成氣，和5)包 含CO、CO2和吐的合成氣。
101.一種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4_ 丁二醇途徑的微生物有機體， 所述1，4-丁二醇途徑包含至少一種編碼1，4-丁二醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被 足量表達以產生1，4_ 丁二醇，所述1，4_ 丁二醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基 丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、 4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶；所述有機體進一步包含乙 酰-CoA途徑，所述途徑包含至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被足 量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋 白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化 碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
102.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述乙酰乙酰-CoA硫 解酶是由選自由atoB、thlA、thlB和erglO組成的組的基因編碼。
103.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述3-羥基丁 酰-CoA 脫氫酶是由選自由 hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 和 msed_1933 組成的組 的基因編碼。
104.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述巴豆酸酶是由選 自由 crt、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG 組成的組的基因編碼。
105.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述巴豆酰-CoA水合酶是由選自由abfD、msed_1321和msed_1220組成的組的基因編碼。
106.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述4-羥基丁 酰-CoA還原酶(醇形成型)是由選自由adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、napl_02720和 mgp2080_00535組成的組的基因編碼。
107.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述4-羥基丁 酰-CoA還原酶(酸形成型)是由選自由acrl、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2和 saci_2370組成的組的基因編碼。
108.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述1，4-丁二醇脫氫 酶是由選自由alrA、adh2、yqhD、bdhI、bdhII和4hbd組成的組的基因編碼。
109.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述類咕啉蛋白是由 選自由mtaC、mtaCl、mtaC2和mtaC3組成的組的基因編碼。
110.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉移酶是由選自由mtaA、mtaAl和mtaA2組成的組的基因編碼。
111.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉移酶是由基因acsE編碼。
112.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述類咕啉鐵硫蛋白 是由基因acsD編碼。
113.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述鎳蛋白裝配蛋白 是由至少一種選自由acsF和cooC組成的組的基因編碼。
114.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述鐵氧還蛋白是由 基因orf7編碼。
115.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述乙酰-CoA合成酶 是由至少一種選自由acsB和acsC組成的組的基因編碼。
116.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述一氧化碳脫氫酶 是由基因acsA編碼。
117.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述丙酮酸鐵氧還蛋 白氧化還原酶是由選自由por和ydbK組成的組的基因編碼。
118.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述氫化酶是由至 少一種選自由 hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、 moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、 hycH、hycl、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、 moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、 moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、 moth_0809、moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、 moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、 moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、 moth_1452、moth_1453和moth_1454組成的組的塞因編碼。
119.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含由基因 acsEps編碼的多月太AcsEpsο
120.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含至少一種由 選自由以下組成的組的基因編碼的酶或多肽codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、 cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
121.根據權利要求101所述的非天然存在的微生物有機體，其進一步包含甲醇甲基轉 移酶。
122.根據權利要求121所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲醇甲基轉移酶 是由選自由mtaB、mtaBl、mtaB2和mtaB3組成的組的基因編碼。
123.根據權利要求121所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述有機體利用選自 由以下組成的組的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和 包含CO和H2的合成氣，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣。
124.—種非天然存在的微生物有機體，其包括具有1，4_ 丁二醇途徑的微生物有機體， 所述1，4-丁二醇途徑包含至少一種編碼1，4-丁二醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被 足量表達以產生1，4_ 丁二醇，所述1，4_ 丁二醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基 丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、 4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶；所述有機體進一步包含乙 酰-CoA途徑，所述途徑包含至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被足 量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸脫氫酶、甲酰四 氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還 原酶。
125.根據權利要求124所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲酸脫氫酶是由 選自由 moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、 chy_073Uchy_0732和chy_0733組成的組的基因編碼。
126.根據權利要求124所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述甲酰四氫葉酸合 成酶是由選自由moth_0109、chy_2385和fhs組成的組的基因編碼。
127.根據權利要求124所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述次甲基四氫葉酸 環(huán)化水解酶是由選自由moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
128.根據權利要求124所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述亞甲基四氫葉酸 脫氫酶是由選自由moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
129.根據權利要求124所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述亞甲基四氫葉酸 還原酶是由選自由moth_1191、metF和chy_1233組成的組的基因編碼。
130.根據權利要求124所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述有機體利用選自 由以下組成的組的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO 2，4)包含CO和H2的合成氣，和5)包 含CO、CO2和吐的合成氣。
131.一種產生4-羥基丁酸的方法，其包含培養(yǎng)具有4-羥基丁酸途徑的非天然存在的 微生物有機體，所述途徑包含至少一種編碼4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸，所述外源核酸 在用于產生4-羥基丁酸的條件和足夠時間下被足量表達以產生4-羥基丁酸，所述4-羥基 丁酸途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合 酶、4-羥基丁酰-CoA轉移酶、磷酸轉-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸激酶。
132.根據權利要求131所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶是由選自由atoB、thlA、thlB和erglO組成的組的基因編碼。
133.根據權利要求131所述的方法，其中所述3-羥基丁酰-CoA脫氫酶是由選自由 hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 和 msed_1933 組成的組的基因編碼。
134.根據權利要求131所述的方法，其中所述巴豆酸酶是由選自由crt、paaA、paaB、 phaA、phaB、maoC、paaF和paaG組成的組的基因編碼。
135.根據權利要求131所述的方法，其中所述巴豆酰-CoA水合酶是由選自由abfD、 msed_1321和msed_1220組成的組的基因編碼。
136.根據權利要求131所述的方法，其中所述4-羥基丁酰-CoA轉移酶是由選自由 cat2、abfT-2、abfT-1和abfT組成的組的基因編碼。
137.根據權利要求131所述的方法，其中所述磷酸轉-4-羥基丁酰酶是由選自由pta 和Ptb組成的組的基因編碼。
138.根據權利要求131所述的方法，其中所述4-羥基丁酸激酶是由選自由ackA、 bukl、buk2和proB組成的組的基因編碼。
139.根據權利要求131所述的方法，其中所述有機體進一步包含至少一種選自由以下 組成的組的酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋 白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白 氧化還原酶和氫化酶。
140.根據權利要求131所述的方法，其中所述類咕啉蛋白是由選自由mtaC、mtaCU mtaC2和mtaC3組成的組的基因編碼。
141.根據權利要求139所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶 是由選自由mtaA、mtaAl和mtaA2組成的組的基因編碼。
142.根據權利要求139所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶 是由基因acsE編碼。
143.根據權利要求139所述的方法，其中所述類咕啉鐵硫蛋白是由基因acsD編碼。
144.根據權利要求139所述的方法，其中所述鎳蛋白裝配蛋白是由至少一種選自由 acsF和cooC組成的組的基因編碼。
145.根據權利要求139所述的方法，其中所述鐵氧還蛋白是由基因orf7編碼。
146.根據權利要求139所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶是由至少一種選自由 acsB和acsC組成的組的基因編碼。
147.根據權利要求139所述的方法，其中所述一氧化碳脫氫酶是由基因acsA編碼。
148.根據權利要求139所述的方法，其中所述丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶是由選自 由por和ydbK組成的組的基因編碼。
149.根據權利要求139所述的方法，其中所述氫化酶是由至少一種選自由hypA、 hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、 moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、hyfA、hyfB、 hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、 moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、 moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、 moth 0811、moth 0812、moth 0813、moth 0814、moth 0815、moth 0816、moth 1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、 moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453 禾口 moth_1454組成的組的基因編碼。
150.根據權利要求139所述的方法，其進一步包含由基因acsEps編碼的多肽AcsEps。
151.根據權利要求139所述的方法，其進一步包含至少一種由選自由以下組成的組的 基因編碼的酶或多肽codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、coo T、cooj 禾口 codh-IIο
152.根據權利要求139所述的方法，其進一步包含甲醇甲基轉移酶。
153.根據權利要求152所述的方法，其中所述甲醇甲基轉移酶是由選自由mtaB、 mtaBl、mtaB2和mtaB3組成的組的基因編碼。
154.根據權利要求152所述的方法，其中所述有機體利用選自由以下組成的組的原 料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包含CO和H2的合成 氣，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣。
155.根據權利要求139所述的方法，其中所述有機體進一步包含甲酸脫氫酶、甲酰四 氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還 原酶。
156.根據權利要求155所述的方法，其中所述甲酸脫氫酶是由選自由moth_2312、 moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732 和chy_0733組成的組的基因編碼。
157.根據權利要求155所述的方法，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶是由選自由 moth_0109、chy_2385和fhs組成的組的基因編碼。
158.根據權利要求155所述的方法，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶是由選自由 moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
159.根據權利要求155所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶是由選自由 moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
160.根據權利要求155所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶是由選自由 moth_l 19UmetF和chy_1233組成的組的基因編碼。
161.根據權利要求155所述的方法，其中所述有機體利用選自由以下組成的組的原 料1) C0, 2) CO2和H2, 3) CO和C02，4)包含CO和H2的合成氣，和5)包含CO、CO2和H2的合成 氣。
162.一種產生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培養(yǎng)具有1，4_ 丁二醇途徑的非天然存在的 微生物有機體，所述途徑包含至少一種編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸 在用于產生1，4-丁二醇的條件和足夠時間下被足量表達以產生1，4-丁二醇，所述1，4-丁 二醇途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合 酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)、1，4_ 丁 二醇脫氫酶；所述有機體進一步包含乙酰-CoA途徑，所述乙酰-CoA途徑包含至少一種編碼 乙酰-CoA途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被足量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途 徑酶包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝 配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和12氫化酶。
163.根據權利要求162所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶是由選自由atoB、 thlA、thlB和erglO組成的組的基因編碼。
164.根據權利要求162所述的方法，其中所述3-羥基丁酰-CoA脫氫酶是由選自由 hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 和 msed_1933 組成的組的基因編碼。
165.根據權利要求162所述的方法，其中所述巴豆酸酶是由選自由crt、paaA、paaB、 phaA、phaB、maoC、paaF和paaG組成的組的基因編碼。
166.根據權利要求162所述的方法，其中所述巴豆酰-CoA水合酶是由選自由abfD、 msed_1321和msed_1220組成的組的基因編碼。
167.根據權利要求162所述的方法，其中所述4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型) 是由選自由 adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、napl_02720 和 mgp2080_00535 組成的組的基因 編碼。
168.根據權利要求162所述的方法，其中所述4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型) 是由選自由acrl、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2和saci_2370組成的組的基因編碼。
169.根據權利要求162所述的方法，其中所述1，4_丁二醇脫氫酶是由選自由alrA、 adh2、yqhD、bdh I、bdhII和4hbd組成的組的基因編碼。
170.根據權利要求162所述的方法，其中所述類咕啉蛋白是由選自由mtaC、mtaCU mtaC2和mtaC3組成的組的基因編碼。
171.根據權利要求162所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶 是由選自由mtaA、mtaAl和mtaA2組成的組的基因編碼。
172.根據權利要求162所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶 是由基因acsE編碼。
173.根據權利要求162所述的方法，其中所述類咕啉鐵硫蛋白是由基因acsD編碼。
174.根據權利要求162所述的方法，其中所述鎳蛋白裝配蛋白是由至少一種選自由 acsF和cooC組成的組的基因編碼。
175.根據權利要求162所述的方法，其中所述鐵氧還蛋白是由基因orf7編碼。
176.根據權利要求162所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶是由至少一種選自由 acsB和acsC組成的組的基因編碼。
177.根據權利要求162所述的方法，其中所述一氧化碳脫氫酶是由基因acsA編碼。
178.根據權利要求162所述的方法，其中所述丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶是由選自 由por和ydbK組成的組的基因編碼。
179.根據權利要求162所述的方法，其中所述氫化酶是由至少一種選自由hypA、 hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、 moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、hyfA、hyfB、 hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、 moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、 moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、 moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、 moth 1194、moth 1195、moth 1196、moth 1717、moth 1718、moth 1719、moth 1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453 禾口 moth_1454組成的組的基因編碼。
180.根據權利要求162所述的方法，其中所述有機體進一步包含由基因acsEps編碼的 多肽 AcsEps0
181.根據權利要求162所述的方法，其進一步包含至少一種由選自由以下組成的組的 基因編碼的酶或多肽codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、 cooJ 禾口 codh-IIο
182.根據權利要求162所述的方法，其進一步包含甲醇甲基轉移酶。
183.根據權利要求162所述的方法，其中所述甲醇甲基轉移酶是由選自由mtaB、 mtaBl、mtaB2和mtaB3組成的組的基因編碼。
184.根據權利要求162所述的方法，其中所述有機體利用選自由以下組成的組的原 料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包含CO和H2的合成 氣，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣。
185.—種產生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培養(yǎng)具有1，4_ 丁二醇途徑的非天然存在的 微生物有機體，所述途徑包含至少一種編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸 在用于產生1，4-丁二醇的條件和足夠時間下被足量表達以產生1，4-丁二醇，所述1，4-丁 二醇途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合 酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)、1，4_ 丁 二醇脫氫酶；所述有機體進一步包含乙酰-CoA途徑，所述途徑包含至少一種編碼乙酰-CoA 途徑酶的外源核酸，所述外源核酸被足量表達以產生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括 乙酰-CoA合成酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基 四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
186.根據權利要求185所述的方法，其中所述甲酸脫氫酶是由選自由moth_2312、 moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732 和chy_0733組成的組的基因編碼。
187.根據權利要求185所述的方法，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶是由選自由 moth_0109、chy_2385和fhs組成的組的基因編碼。
188.根據權利要求185所述的方法，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶是由選自由 moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
189.根據權利要求185所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶是由選自由 moth_1516、folD和chy_1878組成的組的基因編碼。
190.根據權利要求185所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶是由選自由 moth_l 19UmetF和chy_1233組成的組的基因編碼。
191.根據權利要求185所述的方法，其中所述有機體利用選自由以下組成的組的原 料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣，和5)包含CO、CO2和H2的合成 氣。
全文摘要
本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機體，其具有乙酰-CoA途徑且能夠利用合成氣或合成氣和甲醇。在一實施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將CO、CO2和/或H2轉化為乙酰輔酶A(乙酰-CoA)、甲基四氫葉酸(甲基-THF)或其它期望產物的途徑的外源蛋白質，其中所述微生物缺乏在不存在所述一種或多種外源蛋白質的情況下，將CO或CO2和H2轉化為乙酰-CoA或甲基四氫葉酸的能力。舉例來說，所述微生物有機體可含有至少一種編碼乙酰-CoA途徑中的酶或蛋白質的外源核酸。所述微生物有機體能夠單獨利用包含CO、CO2和/或H2的合成氣或組合利用所述合成氣與甲醇來產生乙酰-CoA。本發(fā)明另外提供一種產生乙酰-CoA的方法，例如通過培養(yǎng)產生乙酰-CoA的微生物有機體，其中所述微生物有機體在用于產生乙酰-CoA的條件和足夠時間下足量表達至少一種編碼乙酰-CoA途徑酶或蛋白質的外源核酸以產生乙酰-CoA。
文檔編號C12P11/00GK101978042SQ200980110100
公開日2011年2月16日 申請日期2009年1月22日 優(yōu)先權日2008年1月22日
發(fā)明者A·博加德, M·伯克, 克里斯托夫·H·席林, 約翰·D·特拉威克 申請人:基因組股份公司