專(zhuān)利名稱(chēng)：重復(fù)產(chǎn)生重組蛋白的高產(chǎn)細(xì)胞系的方法和物質(zhì)的制作方法
重復(fù)產(chǎn)生重組蛋白的高產(chǎn)細(xì)胞系的方法和物質(zhì)
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于在真核細(xì)胞中制備重組基因產(chǎn)物的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及快速、可 重復(fù)地生成適于大規(guī)模生產(chǎn)重組基因產(chǎn)物的高產(chǎn)真核生產(chǎn)細(xì)胞系的方法和物質(zhì)。本發(fā)明包 括特異性載體系統(tǒng)，特征性的(characterized)、經(jīng)遺傳改造的宿主細(xì)胞和使用方法。2.
背景技術(shù)：
CHO細(xì)胞系是最廣泛使用的制備生物藥的宿主細(xì)胞。傳統(tǒng)上，所述宿主細(xì)胞用表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染，所述載體含有編碼重組基因產(chǎn)物(例如蛋白)的目標(biāo)基因(GOI)和選擇標(biāo)記，所 述選擇標(biāo)記諸如抗生素例如新霉素或氨甲喋呤的抗性基因。在一小部分宿主細(xì)胞中，所述 表達(dá)構(gòu)建體經(jīng)非同源重組而隨機(jī)引入基因組。這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在抗生素化合物的選擇 壓力下被選出。為了獲得調(diào)節(jié)順應(yīng)性單細(xì)胞衍生細(xì)胞系，隨后通過(guò)有限稀釋進(jìn)行進(jìn)一步的 克隆步驟。雖然分析了數(shù)百個(gè)單細(xì)胞衍生克隆，但表達(dá)水平常常仍然很低，其需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染 過(guò)程或擴(kuò)增表達(dá)構(gòu)建體的初始整合拷貝，例如通過(guò)增加氨甲喋呤濃度或另一種擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái) 實(shí)現(xiàn)。全部過(guò)程需要至少6個(gè)月，有時(shí)多達(dá)一年。該方法的主要問(wèn)題是整合事件的隨機(jī)特性。周?chē)幕蚪MDNA對(duì)所整合的表達(dá)構(gòu) 建體的轉(zhuǎn)錄活性有主要的影響(“位置效應(yīng)")。由于這種非同源整合過(guò)程的stochastic 特性，無(wú)法針對(duì)具有高轉(zhuǎn)錄活性的基因座(轉(zhuǎn)錄熱點(diǎn))進(jìn)行整合。由于大部分哺乳動(dòng)物DNA 并非編碼序列，甚至編碼部分也只有小部分具有轉(zhuǎn)錄活性，因此，絕大多數(shù)整合事件導(dǎo)致轉(zhuǎn) 基因的低水平表達(dá)?？傊?，表達(dá)構(gòu)建體的隨機(jī)整合將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平的寬范圍差異， 僅有一部分細(xì)胞顯示高水平表達(dá)。為避免所需的繁重篩選過(guò)程和減少產(chǎn)生高水平生產(chǎn)者細(xì)胞系所需的時(shí)間，最好是 有將任意GOI定向插入宿主細(xì)胞基因組的表達(dá)熱點(diǎn)的系統(tǒng)。為了重復(fù)地將GOI引入此位點(diǎn)，所找的位點(diǎn)可以補(bǔ)加允許通過(guò)序列特異性重組酶 如Cre或FLP來(lái)進(jìn)行插入的序列。用FIp進(jìn)行的這種修飾參見(jiàn)W092/15694，在無(wú)標(biāo)記的反 復(fù)DNA表達(dá)盒交換方面的改動(dòng)見(jiàn)US2001/0032341。用Cre在植物細(xì)胞基因組中進(jìn)行的修飾 見(jiàn) WO 91/09957，進(jìn)一步的改動(dòng)見(jiàn) US2006/0014264A1。這兩種重組酶都依賴(lài)特異性識(shí)別位點(diǎn)，需先將這些位點(diǎn)引入基因組中的合適位 置。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的情況中，這通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)。為了使用這些特異性重組酶生成生產(chǎn)細(xì)胞系，主要的問(wèn)題是鑒定適于經(jīng)同源重組 插入識(shí)別位點(diǎn)的基因。該基因需被高水平轉(zhuǎn)錄，但同時(shí)應(yīng)不是該細(xì)胞所必需的。黑素瘤細(xì) 胞或雜交瘤細(xì)胞中的免疫球蛋白基因座是所述合適位置的例子。用Cre通過(guò)同源重組和序 列特異性重組的組合進(jìn)行的抗體生成見(jiàn)WO 96/30498。一種類(lèi)似的方法在EP11405908A1中 被描述為高產(chǎn)通用表達(dá)系統(tǒng)。雖然可以應(yīng)用，但這些方法限用于相應(yīng)宿主細(xì)胞中已知的、非必需的、高水平表達(dá) 的細(xì)胞性基因(cellular gene)。自發(fā)同源重組除了很少見(jiàn)以外，其效力也有賴(lài)于相應(yīng)的位 點(diǎn)。要想效率高，就得使用大的同源序列，此時(shí)等基因(isogenic)序列是最有效的。因此， 在序列信息知之有限的宿主(象倉(cāng)鼠)中使用這種方法時(shí)，其應(yīng)用性會(huì)受到限制。
為了鑒定允許高表達(dá)水平的隨機(jī)基因組座位，有人建議在靶位點(diǎn)引入含有報(bào)告基 因以及所用重組酶的識(shí)別位點(diǎn)的載體(wo 2004/029284A3)。一方面報(bào)告基因允許鑒定隨機(jī) 標(biāo)記的整合位點(diǎn)的表達(dá)能力，另一方面這些識(shí)別位點(diǎn)也允許該報(bào)告基因與GOI進(jìn)行交換。Puttini et al. (J. Biotechnol. 116 (2005)，145-151)披露了在細(xì)胞系進(jìn)行定向、 雙鏈斷裂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的方法。據(jù)此獲得了表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。該靶向載體含有兆堿 基核酸酶(meganuclease)的單個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。報(bào)道的靶向效率很低，為2. 5X 10_6(10個(gè)克隆 /2X IO7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率為20%)。故，該文獻(xiàn)并未提供可信賴(lài)的獲得高產(chǎn)宿主細(xì)胞的方法。WO 2004/029284描述了用FLP重組酶催化位點(diǎn)特異性重組來(lái)產(chǎn)生生產(chǎn)者 (producer)宿主細(xì)胞的方法。所得表達(dá)細(xì)胞系仍包含F(xiàn)LP重組酶識(shí)別位點(diǎn)，在有些情況下， 在引入目標(biāo)基因后，處在編碼序列內(nèi)。這導(dǎo)致生產(chǎn)者細(xì)胞系的穩(wěn)定性下降。該文獻(xiàn)還建議 將組II內(nèi)含子作為備選的識(shí)別位點(diǎn)，但未披露相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。兆堿基核酸酶識(shí)別位點(diǎn)組I 內(nèi)含子編碼的歸巢內(nèi)切核酸酶未被披露。Sorrel & KoIb (Biotech. ADV 23 (2005)，431-469)描述了 用具有兆堿基核酸酶 I-Sce-I的單個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的靶向載體經(jīng)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物基因組進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾。 靶/替換載體的整合經(jīng)由定向同源重組而發(fā)生，但不經(jīng)由隨機(jī)整合而發(fā)生。Belfort & Roberts (Nucleic Acids Res. 25 (1997)，3379-3388)描述了歸巢內(nèi)切 核酸酶，包括組I和組II內(nèi)含子編碼的分子。所有這些方法中，交換反應(yīng)的效率取決于所用的重組酶的效力。此外，隨機(jī)選出的 基因座可能有較好的轉(zhuǎn)錄活性，但它有可能不支持所用重組酶的有效重組。為了找出合適 的整合位置，該方法需要額外進(jìn)行篩選。使用所述重組酶的另一個(gè)潛在障礙是，所需宿主細(xì) 胞中存在假識(shí)別位點(diǎn)。這些假識(shí)別位點(diǎn)可以引起不良重組事件。這將導(dǎo)致該系統(tǒng)的效率降 低，并有可能產(chǎn)生具有不良表型的遺傳修飾細(xì)胞。同樣，進(jìn)行了鑒定最適細(xì)胞的篩選。雖然 該方法看似有用，其產(chǎn)生高產(chǎn)生產(chǎn)細(xì)胞的效力和通用性較低?？傊孕枰焖?、有效的通 用系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生高產(chǎn)真核生產(chǎn)細(xì)胞系，其具有經(jīng)證實(shí)的大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的能力。本發(fā)明披露了滿(mǎn)足這一需求的方法和物質(zhì)。3.發(fā)明概述本發(fā)明描述了涉及wildcard-策略的方法和物質(zhì)，所述策略用于產(chǎn)生高產(chǎn)真核細(xì) 胞系以制備生物藥，其涉及將含有GOI的表達(dá)盒定點(diǎn)引入事先已形成、且已鑒定清楚的宿 主細(xì)胞系(wildcard細(xì)胞)。wildcard細(xì)胞在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中選擇大規(guī)模生產(chǎn)所需的特 性。其通過(guò)將靶報(bào)告盒隨機(jī)引入起始細(xì)胞系的基因組、并通過(guò)鑒定整合位點(diǎn)的表達(dá)能力來(lái) 產(chǎn)生。通過(guò)將報(bào)告基因與目標(biāo)基因(GOI)交換，獲得了能有效表達(dá)所需基因產(chǎn)物的生產(chǎn)者 細(xì)胞系。用交換載體(exchange vector)來(lái)提供GOI，該載體不允許GOI自身強(qiáng)表達(dá)，優(yōu)選 對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不賦予可選擇的特性。與文獻(xiàn)記載的系統(tǒng)不同，wildcard策略不使用重組酶來(lái)介導(dǎo)表達(dá)盒的交換。第一 報(bào)告基因與選擇標(biāo)記的交換通過(guò)雙鏈斷裂(DSB)誘導(dǎo)的同源重組來(lái)介導(dǎo)。為了在所需基因 組位置誘導(dǎo)DSB，靶基因組合有少見(jiàn)的DSB介導(dǎo)酶例如少見(jiàn)的切割兆堿基核酸酶或歸巢內(nèi) 切核酸酶(HE)如I-SceI的一或兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作為特異性標(biāo)簽。HE被帶入細(xì)胞，在指定位 置賦予對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的限制。DSB斷裂的修復(fù)通過(guò)該細(xì)胞的內(nèi)源修復(fù)機(jī)制以高頻進(jìn)行。平行的經(jīng)轉(zhuǎn)染的交換載體由于與交換盒(exchanged cassette)的側(cè)翼區(qū)有序列同源性而用作 修復(fù)基質(zhì)(repair matrix)。這種新的宿主細(xì)胞有利于在短時(shí)間內(nèi)將GOI克隆到預(yù)定的基因組表達(dá)熱點(diǎn)，以獲 得重組基因產(chǎn)物(尤其重組蛋白)的可重復(fù)的高效生產(chǎn)細(xì)胞系。所述方法包括以下步驟-對(duì)含有選擇標(biāo)記的靶載體、可定量的報(bào)告基因、以及介導(dǎo)DSB誘導(dǎo)型同源重組的 識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)整合。-選出通用宿主細(xì)胞系(“wildcard”細(xì)胞)，其在轉(zhuǎn)錄活性基因座優(yōu)先帶有單個(gè) 整合拷貝，對(duì)此通過(guò)報(bào)告基因來(lái)進(jìn)行判定。-將報(bào)告基因和第一選擇標(biāo)記與目標(biāo)基因(GOI)交換，同時(shí)通過(guò)DSB誘導(dǎo)的同源重 組生成至少一個(gè)額外的選擇標(biāo)記，所述重組以具有所需元件的交換載體作為修復(fù)基質(zhì)。通用的wildcard宿主細(xì)胞中的交換過(guò)程可對(duì)另一 GOI進(jìn)行，每次都產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì) 胞，其具有可預(yù)測(cè)的高表達(dá)水平，高質(zhì)量的產(chǎn)物(即糖基化)，以及允許大規(guī)模生產(chǎn)基因產(chǎn) 物(例如蛋白)的生長(zhǎng)特性。所述方法優(yōu)先允許生成任何重組蛋白。所得蛋白可以是酶，尤其蛋白酶，蛋白酶抑 制劑，激素，細(xì)胞因子，有或無(wú)跨膜域或胞內(nèi)域的報(bào)告蛋白(即膜結(jié)合型或可溶型)，全長(zhǎng)抗 體或抗體功能域。具體地，所得蛋白可以象所述蛋白的融合蛋白組合成分或域。本系統(tǒng)因此允許產(chǎn)生有效、經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)生物藥所需的高產(chǎn)細(xì)胞。它具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)-省時(shí)可以在數(shù)周內(nèi)從預(yù)制的wildcard細(xì)胞系獲得穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系。-由于整合至預(yù)定的表達(dá)熱點(diǎn)，能夠更可靠地預(yù)計(jì)該生產(chǎn)細(xì)胞系的表達(dá)水平，并且 用于不同GOI都可以再現(xiàn)該水平。-高效，因?yàn)榻粨Q后獲得的僅是表達(dá)GOI的細(xì)胞。-可有可無(wú)的載體序列在位點(diǎn)特異性整合期間不會(huì)有額外整合。_為了證實(shí)產(chǎn)生了物質(zhì)，可以在數(shù)月內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在后期進(jìn)展階段，產(chǎn)品質(zhì)量不會(huì) 改變，因?yàn)閺囊婚_(kāi)始就能獲得同質(zhì)且遺傳相同的細(xì)胞群體。因此，本發(fā)明第一方面是產(chǎn)生生產(chǎn)者細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞用于生成重組基因產(chǎn) 物，尤其是多肽，所述方法包括以下步驟(a)提供靶載體，其包含(i)報(bào)告基因(RGl)，該基因與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，(ii)第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，該基因與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，(iii)第二非功能選擇標(biāo)記基因(SM2)，該基因未與表達(dá)控制序列可操作相連，其中序列(i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之間，序列(iii)位于 3’ -位置，(iv)雙鏈斷裂_介導(dǎo)酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn)位于第一表達(dá) 控制序列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和序列(iii)之 間，(b)將所述靶載體引入宿主細(xì)胞，所用條件允許該靶載體隨機(jī)整合到該宿主細(xì)胞 的基因組中，
(c)選出宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞具有穩(wěn)定整合的靶載體、并顯示RGl的轉(zhuǎn)錄活性，優(yōu) 選高水平穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄活性，(d)提供交換載體，該載體包含(i)目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)失活的第二選擇標(biāo)記基因(Δ SM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(Ρ3)可操作 相連，其中，交換載體包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與靶載 體的序列進(jìn)行重組，(e)將交換載體引入步驟(C)獲得的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a) (iv)項(xiàng) 所述第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處(優(yōu)選第一和第二識(shí)別位點(diǎn)處)斷裂、并允許交換載體通 過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中，其中，失活的第二選擇標(biāo)記基因(ASM2)因交換載體的整合而被激活，(f)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)與整合的靶載體同源重組而整合的交換載體，其 中所述生產(chǎn)者細(xì)胞表達(dá)GOI。本發(fā)明另一方面是生成通用的宿主細(xì)胞(wildcard細(xì)胞)的方法，其允許快速產(chǎn) 生適于大規(guī)模制備重組基因產(chǎn)物的高產(chǎn)生產(chǎn)細(xì)胞系。此方法包括(a)提供靶載體，其包含(i)報(bào)告基因(RGl)，該基因與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，(ii)第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，該基因與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，(iii)第二非功能選擇標(biāo)記基因(SM2)，該基因未與表達(dá)控制序列可操作相連，其中序列(i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之間，序列(iii)位于 3’ -位置，(iv)雙鏈斷裂_介導(dǎo)酶(尤其兆堿基核酸酶)的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一 識(shí)別位點(diǎn)位于第一表達(dá)控制序列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列 (ii)和序列(iii)之間，(b)將所述靶載體引入宿主細(xì)胞，所用條件允許該靶載體隨機(jī)整合到該宿主細(xì)胞 的基因組中，和(c)選出宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞具有穩(wěn)定整合的靶載體、并顯示RGl的轉(zhuǎn)錄活性。本發(fā)明另一方面是制備重組基因產(chǎn)物的方法，包括以下步驟(a)提供wildcard宿主細(xì)胞，在其基因組中整合了表達(dá)盒，所述盒包含(i)報(bào)告基因(RGl)，該基因與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，(ii)第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，該基因與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，(iii)第二非功能選擇標(biāo)記基因(SM2)，該基因未與表達(dá)控制序列可操作相連，其中序列(i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之間，序列(iii)位于 3’ -位置，(iv)雙鏈斷裂_介導(dǎo)酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn)位于第一表達(dá) 控制序列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和序列(iii)之 間，其中所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中并顯示報(bào)告基因(RGl)的轉(zhuǎn)錄活CN 101981196 A
說(shuō)明書(shū)
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性，(b)提供交換載體，該載體包含目標(biāo)基因(GOI)，和失活的第二選擇標(biāo)記基因(Δ SM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(Ρ3)可操作相 連，其中，交換載體包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與靶載 體的序列重組，(c)將交換載體引入步驟(C)獲得的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a) (iv)項(xiàng) 所述第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)(優(yōu)選第一和第二識(shí)別位點(diǎn))處斷裂、并允許交換載體通過(guò) 雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中，其中，失活的第二選擇標(biāo)記基因(ASM2)因交換載體的整合而被激活，(d)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)與整合的靶載體同源重組而整合的交換載體，其 中所述生產(chǎn)者細(xì)胞表達(dá)GOI。本發(fā)明另一方面是產(chǎn)生用于制備重組基因產(chǎn)物的生產(chǎn)者宿主細(xì)胞的方法，包括以 下步驟(a)將含有雙鏈斷裂介導(dǎo)酶第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列通過(guò)定向同源重組而 引入宿主細(xì)胞基因組中支持轉(zhuǎn)錄活性的位置，(b)選出具有穩(wěn)定整合的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的wildcard宿主細(xì)胞，(c)提供交換載體，該載體包含⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與第一和/或第二識(shí)別 位點(diǎn)的整合位點(diǎn)處的序列重組，(d)將交換載體引入步驟(b)獲得的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a)項(xiàng)所述 第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂、并允許交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到 宿主細(xì)胞基因組中，和(e)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)同源重組而整合的交換載體，其中所述生產(chǎn)者細(xì) 胞表達(dá)GOI。本發(fā)明另一方面是制備用于引入目標(biāo)基因(GOI)的wildcard宿主細(xì)胞的方法，包 括以下步驟(a)將含有雙鏈斷裂介導(dǎo)酶第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列通過(guò)定向同源重組而 引入宿主細(xì)胞基因組中支持轉(zhuǎn)錄活性的位置，(b)選出具有穩(wěn)定整合的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的wildcard宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一方面是制備重組基因產(chǎn)物的方法，包括(a)提供wildcard宿主細(xì)胞，在其基因組中整合了含有雙鏈斷裂介導(dǎo)酶第一和第 二識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列，其中的核酸序列穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中支持轉(zhuǎn)錄活性的位置，(b)提供交換載體，該載體包含(i)目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)的整合位點(diǎn)處的序列進(jìn)行重組，(c)將交換載體引入步驟(a)提供的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a)項(xiàng)所述 第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂、并允許交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到 宿主細(xì)胞基因組中，和(d)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)同源重組而整合的交換載體，其中所述生產(chǎn)者細(xì) 胞表達(dá)GOI。本發(fā)明另一方面是靶載體，其包含(a)與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連的報(bào)告基因(RGl)，(b)與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連的第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，(c)未與表達(dá)控制序列可操作相連的非功能第二選擇標(biāo)記基因(SM2)，其中序列 (i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之間，序列(iii)位于3’ -位置，雙鏈斷裂-介導(dǎo)酶尤其兆堿基核酸酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn) 位于第一表達(dá)控制序列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和 序列(iii)之間。本發(fā)明另一方面是交換載體，其包含⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)失活的第二選擇標(biāo)記基因(Δ SM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(Ρ3)可操作 相連，其中，交換載體包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與宿主 細(xì)胞基因組中預(yù)定位點(diǎn)的序列(例如與靶載體的序列)進(jìn)行重組。本發(fā)明的多個(gè)其它方面涉及可通過(guò)上述方法獲得的、用于引入并有效表達(dá)目標(biāo)基 因的、通用的wildcard宿主細(xì)胞，和用于用所述such wildcard宿主細(xì)胞和所述方法大規(guī) 模制備重組基因產(chǎn)物的高產(chǎn)生產(chǎn)細(xì)胞。4.發(fā)明詳述4.1宿主細(xì)胞本發(fā)明涉及生成生產(chǎn)者宿主細(xì)胞或wildcard宿主細(xì)胞。優(yōu)選宿主細(xì)胞是真核細(xì) 胞，例如酵母細(xì)胞，真菌細(xì)胞或脊椎動(dòng)物細(xì)胞如昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如嚙齒動(dòng)物細(xì)胞如小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠細(xì)胞或靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞如人類(lèi)細(xì)胞。在 特別優(yōu)先實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)先的細(xì)胞是NSO細(xì) 胞，雜交瘤，例如小鼠或小鼠/人細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞或Per C6細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中， 宿主細(xì)胞能在無(wú)血清的懸浮培養(yǎng)中以高細(xì)胞密度生長(zhǎng)。4. 2載體系統(tǒng)本發(fā)明涉及不同載體的應(yīng)用，即靶載體用于將報(bào)告基因盒引入宿主細(xì)胞以獲得 wildcard宿主細(xì)胞，交換載體或整合載體用于將目標(biāo)基因(GOI)引入wildcard宿主細(xì)胞以 產(chǎn)生生產(chǎn)者細(xì)胞。任選地，使用第三載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)雙鏈斷裂介導(dǎo)酶。選出的載體應(yīng)與相應(yīng)宿主細(xì)胞兼容。因此，所述載體尤其適于真核細(xì)胞，優(yōu)選地， 所述載體為非病毒載體，例如環(huán)狀或線(xiàn)性質(zhì)粒載體。4. 2.1 靶載體4. 2. 1. 1用于隨機(jī)整合的靶載體
本發(fā)明的靶載體優(yōu)選包含報(bào)告基因(RGl)和第一選擇標(biāo)記基因(SMl)。這兩種基 因優(yōu)選形成雙順?lè)醋颖磉_(dá)盒，其中RGl與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，SMl基因與 第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連。RGl優(yōu)選位于SMl基因5’側(cè)。此外，靶載體包含非功 能性第二選擇標(biāo)記基因(SM2)。此外，靶載體優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含元和細(xì)胞的序列元件。RGl可以是任何報(bào)告基因，其表達(dá)可檢測(cè)的基因產(chǎn)物，例如酶或化學(xué)發(fā)光 (luminescent)基因產(chǎn)物。優(yōu)選地，報(bào)告基因是能控制并定量其表達(dá)的基因。報(bào)告基因的典 型實(shí)例是堿性磷酸酶，例如分泌型堿性磷酸酶(SEAP)，熒光素酶(Iuciferase)，β -半乳糖 苷酶或諸如GFP等熒光蛋白或它們的變體。RGl與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，后者優(yōu)選包含能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在宿主 細(xì)胞中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，Pl可包含強(qiáng)效組成型啟動(dòng)子，例如CMV啟 動(dòng)子(如立即/早期啟動(dòng)子，帶有來(lái)自人或鼠CMV病毒的增強(qiáng)子)，其可通過(guò)例如添加CMV 內(nèi)含子A來(lái)額外增強(qiáng)，從而轉(zhuǎn)錄活性和mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)。通常，允許在真核細(xì)胞中高水平重 組表達(dá)的任何控制序列都可以使用。這些序列可以是天然元件或天然元件的組合。此外， 還可以使用合成的啟動(dòng)子-元件。合適的第一表達(dá)控制序列(Pl)的進(jìn)一步實(shí)例有，人延伸 因子Ialpha(EF-Ialpha)啟動(dòng)子(有和無(wú)相應(yīng)的第一內(nèi)含子)，衍生自勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV) LTR的啟動(dòng)子，或HIV2LTR或它們的衍生序列的組合。在另一實(shí)施方案中，Pl可包含減弱的啟動(dòng)子，其強(qiáng)度比野生型啟動(dòng)子減弱，例如改 變的CMV啟動(dòng)子。啟動(dòng)子強(qiáng)度可以減弱，例如通過(guò)修飾內(nèi)含子A序列的表達(dá)增強(qiáng)效應(yīng)來(lái)減 弱。這可以通過(guò)在內(nèi)含子的3' _區(qū)插入短的異源核苷酸序列(例如，多達(dá)IOObp)來(lái)實(shí)現(xiàn)。 這些插入并不負(fù)面影響與交換載體的同源重組。通過(guò)選擇交換載體中的合適序列，可以在 將交換載體插入宿主細(xì)胞基因組以后，將啟動(dòng)子的減弱形式用完全活化形式替換。第一選擇標(biāo)記基因(SMl)可以是任何能在宿主細(xì)胞中提供可選擇的表型的選擇 標(biāo)記基因。例如，SMl可以是抗生素抗性基因如新霉素或潮霉素抗性基因。還可以使用選 擇標(biāo)記，諸如賦予對(duì)殺稻瘟素(blasticidin)、嘌呤霉素，烏苯苷(ouabain)的抗性的基因 或谷氨酰胺合成酶基因。SMl與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，后者優(yōu)選包含組成型啟動(dòng)子，例如 SV-40啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，P2可包含減弱的啟動(dòng)子，即野生型啟動(dòng)子的減弱形式。 或者，或另外，SMl可以是減弱的選擇標(biāo)記基因，其與野生型選擇標(biāo)記基因相比活性減弱。通 過(guò)使用減弱的啟動(dòng)子和/或選擇標(biāo)記基因，有利于選出具有整合在整合位點(diǎn)的高轉(zhuǎn)錄活性 靶載體的宿主細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，SMl的表達(dá)是通過(guò)使用位于RGl編碼序列3'-端與SMl編碼 序列5'-端的IRES元件來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外，靶載體通常在RGl和SMl編碼序列3'-包含聚腺苷酸化信號(hào)，例如牛生長(zhǎng) 激素的聚腺苷酸化信號(hào)或SV-40的聚腺苷酸化信號(hào)。靶載體還包含未與表達(dá)控制序列可操作相連的第二非功能性選擇標(biāo)記基因 (SM2)。SM2位于RGl和SMl雙順?lè)醋颖磉_(dá)盒的外部，優(yōu)選位于該盒的3'-側(cè)。在具體實(shí) 施方案中，SM2編碼序列不含ATG起始密碼子和/或上游終止密碼子，優(yōu)選在所有三個(gè)閱讀 框中具有上游終止密碼子。SM2可以是能在宿主細(xì)胞中提供可選擇的表型的選擇標(biāo)記。優(yōu)選地，SM2不同于SMl0例如，SM2可以是抗生素抗性基因如新霉素或潮霉素抗性基因。進(jìn)一步的實(shí)例有，賦 予對(duì)殺稻瘟素、嘌呤霉素，烏苯苷的抗性的基因或谷氨酰胺合成酶基因。為了在靶載體中誘導(dǎo)特異性雙鏈斷裂，要包含雙鏈斷裂介導(dǎo)酶，尤其兆堿基核酸 酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)、第一識(shí)別位點(diǎn)位于RGl編碼序列與Pl之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于 SMl編碼序列與非功能性序列SM2之間。靶載體上側(cè)翼為兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的部分可稱(chēng)為交換 區(qū)。在具體實(shí)施方案中，第二識(shí)別位點(diǎn)可位于SMl終止密碼子與后續(xù)聚腺苷酸化信號(hào) 之間(靶載體A)。在另一實(shí)施方案中，第二識(shí)別位點(diǎn)可位于SMl聚腺苷酸化信號(hào)與SM2編 碼序列的起點(diǎn)之間(靶載體B)。所述兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)可以具有相同的取向或彼此取向相反。在優(yōu)選實(shí)施方案中，識(shí) 別位點(diǎn)上對(duì)應(yīng)于野生型位點(diǎn)下游外顯子的部分在切割后位于交換區(qū)以外。雙鏈斷裂介導(dǎo)酶優(yōu)選兆堿基核酸酶或歸巢核酸酶(homing nuclease)，其具有宿 主細(xì)胞基因組中罕見(jiàn)的識(shí)別位點(diǎn)，例如編碼歸巢核酸酶的組I內(nèi)含子。優(yōu)選地，兆堿基核酸 酶或歸巢核酸酶具有宿主細(xì)胞基因組中非天然出現(xiàn)的識(shí)別位點(diǎn)。所述識(shí)別位點(diǎn)通常有至少 10個(gè)，優(yōu)選至少12個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，所述核酸酶具有18個(gè)核苷酸的識(shí)別位點(diǎn)，因此屬 于內(nèi)切核酸酶的十二肽家族。所述酶的實(shí)例見(jiàn)US 2005/0032223，其內(nèi)容引入本文作參考。 優(yōu)選地，兆堿基核酸酶選自 I-Scel，I-SceII, I-SceIII, 1-SceIV，I-CeuI, I-CreI, I-Ppol, I-TevI，I-TevII，I-TevIII，HO 和 Endo SceI0 更優(yōu)選地，兆堿基核酸酶是 I-Scel。本發(fā)明靶載體的兩個(gè)實(shí)例見(jiàn)

圖1(靶載體Α)和圖2 (靶載體B)。報(bào)告基因與包括 內(nèi)含子A的增強(qiáng)型CMV啟動(dòng)子(eCMV)可操作相連。第一選擇標(biāo)記基因(SMl)與SV40啟動(dòng) 子(Psv40)可操作相連。第二選擇標(biāo)記基因(SM2)未與啟動(dòng)子可操作相連，因此不具有功 能。4. 2. 1. 2用于非隨機(jī)整合的靶載體在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，靶載體可額外包含第一 5’和第二 3' _同源序列，它 們側(cè)翼于靶載體的上述遺傳元件，并允許在宿主細(xì)胞的預(yù)定基因座位，即已知支持轉(zhuǎn)錄活 性的基因座位，例如免疫球蛋白基因座，進(jìn)行非隨機(jī)同源重組。在此實(shí)施方案中，報(bào)告基因 可與上述表達(dá)控制序列可操作相連，或者，當(dāng)所選的側(cè)翼同源序列允許在將報(bào)告基因(RGl) 與內(nèi)源表達(dá)控制序列可操作相連的位置進(jìn)行同源重組時(shí)，也可以缺乏表達(dá)控制序列。備選地，缺乏報(bào)告基因的靶載體可用于該實(shí)施方案。4. 2. 2交換載體交換載體優(yōu)選包含目標(biāo)基因(GOI)和滅活的第二選擇標(biāo)記基因(ASM2)例如其不 完整編碼序列。目標(biāo)基因可以是任何編碼所需基因產(chǎn)物(尤其重組蛋白)的基因，但也可 以是重組核酸，例如所需RNA分子。優(yōu)選地，GOI以不含功能性表達(dá)控制序列的形式存在。 更優(yōu)選地，GOI在5’端包含部分表達(dá)控制序列，其與靶載體中第一表達(dá)控制序列(Pl)的 3'-引子部分(prime part)相同或基本相同。此外，優(yōu)選適于GOI的聚腺苷酸化信號(hào)位 于靶載體所述編碼序列的3’端。SM2的失活編碼序列不允許產(chǎn)生功能性選擇標(biāo)記。為此，通常交換載體中SM2編碼 序列的3'部分可以缺失。但SM2的失活編碼序列與功能性表達(dá)控制序列，例如組成型啟動(dòng) 子如SV40啟動(dòng)子可操作相連。
在另一實(shí)施方案中，交換載體還包含第三選擇標(biāo)記基因(SM3)，其與GOI共轉(zhuǎn)錄。 為此，與IRES元件可操作相連的SM3編碼序列可位于GOI編碼序列3’端與聚腺苷酸化位 點(diǎn)之間。備選地，GOI和SM3的排列順序可呼喚。在另一實(shí)施方案中，GOI和SM3由帶不同 表達(dá)控制元件(啟動(dòng)子)的不同表達(dá)盒表達(dá)。SM3不同于SM2，其允許不依賴(lài)SM2而選擇細(xì) 胞。因此，雙重選擇允許富集表達(dá)兩種選擇標(biāo)記的細(xì)胞。這兩種選擇標(biāo)記可以選自，但不限 于，賦予對(duì)潮霉素、新霉素、G418、殺稻瘟素、嘌呤霉素，烏苯苷的抗性的基因或谷氨酰胺合 成酶基因。對(duì)GOI 5’側(cè)的部分啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度和不完整SM2的長(zhǎng)度進(jìn)行選擇，使得有可能 在靶載體上相應(yīng)同源元件之間進(jìn)行有效的同源重組。此外，交換載體包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，其允許與靶載體 的序列進(jìn)行重組。各個(gè)同源序列的長(zhǎng)度優(yōu)選至少約500個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少約700個(gè)核 苷酸。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，5'-同源序列具有至少約1000個(gè)核苷酸，3'-同源序列 具有至少約700個(gè)核苷酸。同源序列的最大長(zhǎng)度優(yōu)選約2000個(gè)核苷酸。靶載體和交換載 體上同源序列之間的同一性程度，以整個(gè)序列來(lái)看，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%。最優(yōu) 選地，同源序列基本相同，以便獲得最大交換率。還優(yōu)選交換載體的5'-同源序列不含功 能性啟動(dòng)子。交換載體的3' _同源序列優(yōu)選不含功能性選擇標(biāo)記序列。額外地，交換載體可在第一 5' _和第二 3’ -同源序列限定的序列區(qū)以外包含第 四選擇標(biāo)記基因。第四選擇標(biāo)記基因是陰性選擇標(biāo)記基因，例如自殺基因如HSV-胸苷激 酶，其允許在也整合了陰性選擇標(biāo)記的宿主細(xì)胞基因組中對(duì)交換載體的任何隨機(jī)整合進(jìn)行 選擇。所述交換載體的兩個(gè)實(shí)例見(jiàn)圖3(交換載體A)和圖4(交換載體B)。目標(biāo)基因 (GOI)與5 ‘-缺失的部分eCMV啟動(dòng)子(Δ CMV)可操作相連。第二選擇標(biāo)記(SM2)與SV40 啟動(dòng)子(Psv40)可操作相連。帶有靶載體的同源序列用點(diǎn)線(xiàn)表示。交換載體B(圖4)還包 含位于同源序列以外的自殺基因(HSV-tk)，以及可操作連接至IRES元件的與GOI基因共傳 遞的第三選擇標(biāo)記(SM3)。在另一實(shí)施方案中，交換載體可包含與表達(dá)控制序列可操作相連的活性第二選擇 標(biāo)記基因(SM2)，而不含失活的第二選擇標(biāo)記基因。4. 3 產(chǎn)生 Wildcard 細(xì)胞系4. 3.1隨機(jī)整合為了產(chǎn)生wildcard宿主細(xì)胞，可以將4.2. 1. 1節(jié)所述的靶載體引入宿主細(xì)胞，所 用的引入條件允許該靶載體通過(guò)非同源重組，即隨機(jī)重組而隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組 中。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，靶載體在轉(zhuǎn)染之前缺乏非必需的細(xì)菌元件。這將消除細(xì) 菌DNA元件介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)。對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行選擇，使僅單個(gè)整合位點(diǎn)被優(yōu)先標(biāo)記。此外，有利于單拷貝靶載體 的整合。對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的選擇通過(guò)使用SMl來(lái)促進(jìn)，SMl通常是抗生素抗性基因 如新霉素或潮霉素抗性基因。因此，選擇過(guò)程優(yōu)選包括，在有抗生素存在的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞，所述抗生素是SMl介導(dǎo)的抗性所針對(duì)的抗生素。
下一步，選出整合了靶載體、并高水平表達(dá)報(bào)告基因(RGl)的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地， 通過(guò)有限稀釋策略產(chǎn)生了用于此目的的克隆化或寡克隆化細(xì)胞群體。優(yōu)選地，此步驟在無(wú) 血清培養(yǎng)條件下、用適應(yīng)了懸浮生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。在該選擇過(guò)程的優(yōu)選實(shí)施方案中，以從優(yōu)先衍生自1-5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群體進(jìn)行選 擇后得到的密度來(lái)接種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。擴(kuò)增克隆化或寡克隆化細(xì)胞群體，用報(bào)告基因(RGl) 分析隨機(jī)標(biāo)記的基因組座位的轉(zhuǎn)錄活性。優(yōu)選地，進(jìn)行RGl表達(dá)的定量分析。根據(jù)RGl的表達(dá)水平選出高產(chǎn)克隆。為了得到從宿主細(xì)胞群體衍生的單細(xì)胞作為 潛在的wildcard細(xì)胞系，優(yōu)先進(jìn)行第二輪有限稀釋克隆過(guò)程。在進(jìn)一步優(yōu)先的步驟中，根 據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性來(lái)選擇細(xì)胞，特別優(yōu)選的細(xì)胞在低倍增時(shí)間、尤其在無(wú)血清培養(yǎng)條件下， 表現(xiàn)出快速的生長(zhǎng)速率。在優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇過(guò)程可涉及以下步驟(i)從具有整合的靶載體的宿主細(xì)胞中選出高水平穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因(RGl)的那 些細(xì)胞；(ii)從(i)所獲細(xì)胞中選出那些其表型允許在工業(yè)化培養(yǎng)條件(即動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系 統(tǒng)，如旋轉(zhuǎn)器(spinner)，攪拌罐(stirred tank)，波反應(yīng)器(wave-reactor)，流化床反應(yīng) 器(fluidized-bed reactor)或固定床反應(yīng)器(fixed-bed reactor))下有效地大規(guī)模培 養(yǎng)的細(xì)胞；和(iii)從(ii)所獲細(xì)胞中選出那些用報(bào)告基因盒對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)盒進(jìn)行有效交 換的細(xì)胞。對(duì)具有足夠生產(chǎn)能力的合適〃 wildcard"細(xì)胞系的選擇可通過(guò)篩選分泌型報(bào)告 蛋白的活性來(lái)進(jìn)行，所述報(bào)告蛋白如人胎盤(pán)分泌型堿性磷酸酶(hSEAP)或其它合適的可定 量的報(bào)告蛋白。為了得到從宿主細(xì)胞群體衍生的單細(xì)胞作為潛在的wildcard細(xì)胞系，優(yōu)選 進(jìn)行第二輪有限稀釋克隆。在另一實(shí)施方案中，高表達(dá)的wildcard宿主細(xì)胞的選擇也可以用熒光蛋白如綠 色熒光蛋白(GFP)或變體來(lái)進(jìn)行，所述變體即紅色熒光蛋白(RFP)，藍(lán)色熒光蛋白(BFP)，青 色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)，黃色熒光蛋白(YFP)或其它變體。借助表達(dá) 的報(bào)告蛋白，可以通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(fluorescent activated cell sorting，F(xiàn)ACS)， 或用磁富集(MACS或類(lèi)似技術(shù))進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)記后，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的群體中富集高表達(dá)的細(xì)胞。 經(jīng)過(guò)數(shù)輪富集循環(huán)，可獲得各個(gè)報(bào)告蛋白的高表達(dá)群體。最終的wildcard細(xì)胞優(yōu)選還通過(guò) 這些富集的多克隆細(xì)胞群體的有限稀釋克隆過(guò)程來(lái)產(chǎn)生。報(bào)告基因的其它優(yōu)選例有，氯霉素轉(zhuǎn)移酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶， 熒光素酶等等。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，選出〃超性能(outperformer) “ wildcard細(xì)胞系，其 報(bào)告基因表達(dá)水平優(yōu)選至少10倍于、更優(yōu)選至少20倍于、還更優(yōu)選至少25倍于所得克隆 群體的平均表達(dá)水平。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，分析了至少1000個(gè)，例如至少2000個(gè)或至少3000個(gè)
初步克隆化或寡克隆化細(xì)胞群體，以便鑒定高表達(dá)的wildcard宿主細(xì)胞系，例如超性能 wildcard宿主細(xì)胞系。優(yōu)選的wildcard細(xì)胞系在高轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)整合了單拷貝的靶載體。為了選出合適的wildcard細(xì)胞，優(yōu)先考慮整合位點(diǎn)數(shù)和靶載體的整合拷貝數(shù)。對(duì)靶載體整合數(shù)和整合 位點(diǎn)數(shù)的分析可通過(guò)PCR-(優(yōu)先通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR)和Southern印跡分析或原位雜交來(lái)進(jìn) 行。在另一實(shí)施方案中，最終的wildcard host-cell除了攜有穩(wěn)定整合的靶載體以 外，可能還攜有在交換反應(yīng)期間用到的雙鏈斷裂(DSB)介導(dǎo)酶的表達(dá)盒。該表達(dá)盒可以是 靶載體的一個(gè)部分，或者可以作為不同的載體來(lái)引入。該表達(dá)盒優(yōu)先包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以 便能定時(shí)控制DSB-介導(dǎo)酶的表達(dá)。4. 3. 2非隨機(jī)整合在另一實(shí)施方案中，DSB介導(dǎo)酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)可通過(guò)定向同源重組引入 宿主細(xì)胞基因組的預(yù)定位點(diǎn)，所述位點(diǎn)已知支持轉(zhuǎn)錄活性，例如免疫球蛋白基因座。為此， 優(yōu)選使用4. 2. 1. 2節(jié)所述的用于非隨機(jī)整合的靶載體。選擇過(guò)程可按4. 3. 1節(jié)所述來(lái)進(jìn)行。但應(yīng)注意，該實(shí)施方案的有些改良方案可能不需要選擇過(guò)程，因?yàn)樽R(shí)別位點(diǎn)被引 入了已知支持轉(zhuǎn)錄活性的預(yù)定位點(diǎn)。4. Wildcard細(xì)胞內(nèi)表達(dá)盒的交換為了進(jìn)行表達(dá)盒的交換，將上述交換載體引入wildcard宿主細(xì)胞(即通過(guò)將靶載 體隨機(jī)或非隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組中獲得的wildcard宿主細(xì)胞)，所用的引入條件允 許雙鏈在靶載體的第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂。由此，交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的 同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中。為此，wildcard宿主細(xì)胞優(yōu)選與上述交換載體和另一載體共轉(zhuǎn)染，所述另一載體 表達(dá)與靶載體中識(shí)別位點(diǎn)兼容的兆堿基核酸酶，尤其歸巢核酸酶(HE)，例如I-SceI。備選 地，雙鏈斷裂介導(dǎo)酶可在用編碼所需酶的相應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)染后，或通過(guò)直接將此酶運(yùn)送至宿主 細(xì)胞，而在該細(xì)胞中表達(dá)。所述酶切割靶載體中的識(shí)別位點(diǎn)。根據(jù)切割位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，這將簡(jiǎn)單地打開(kāi)基因組 中整合的靶載體(一個(gè)識(shí)別位點(diǎn))或從靶載體釋放可交換的表達(dá)盒(兩個(gè)位于表達(dá)盒側(cè)翼 的識(shí)別位點(diǎn))。在這兩種情況下，HE活性導(dǎo)致在wildcard細(xì)胞中靶載體內(nèi)部的給定位置產(chǎn) 生雙鏈斷裂(DSB)。此DSB誘導(dǎo)出比內(nèi)源同源重組(HR)頻率高100-1000倍的HR。在此修復(fù)過(guò)程中， 轉(zhuǎn)染的交換載體作為修復(fù)基質(zhì)(repair matrix)來(lái)用，因?yàn)槠渫葱蛄猩煺怪帘磉_(dá)盒側(cè)翼。結(jié)果，整個(gè)表達(dá)盒包括RGl和SMl從wildcard細(xì)胞基因組剔除，被含有GOI的表 達(dá)盒替代，在另外的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，含有GOI的表達(dá)盒還含有經(jīng)IRES元件與GOI偶 聯(lián)的SM3。SM3還允許，無(wú)需分析GOI表達(dá)，而額外選出轉(zhuǎn)錄帶有GOI和SM3的表達(dá)盒的細(xì)胞。HR的另一重要結(jié)果是激活靶載體中不含啟動(dòng)子的的SM2。由于與交換載體進(jìn)行 HR, SM2將添加啟動(dòng)子、并因此促進(jìn)SM2在成功修復(fù)的wildcard細(xì)胞中表達(dá)。由于啟動(dòng)子僅與交換載體中截短型ASM2可操作相連，它不向細(xì)胞傳遞抗性。同 源重組后，SM2被激活，允許有效選擇已通過(guò)從交換載體弓I入表達(dá)盒而成功修復(fù)了雙鏈斷裂 情形的細(xì)胞。由于該單選(用SM2)或雙選(用SM2和SM3)，無(wú)需過(guò)多篩選，就可產(chǎn)生高水平表 達(dá)GOI的生產(chǎn)者細(xì)胞同質(zhì)群體。
由于wildcard細(xì)胞的基因組修飾僅限于在標(biāo)記位置交換表達(dá)盒，細(xì)胞的表型不 受影響。甚至在需要由單細(xì)胞衍生的細(xì)胞群體的情況下，這可以在短時(shí)間內(nèi)獲得，因?yàn)閷?duì) 選擇后獲得的群體進(jìn)行的有限稀釋很容易以高成功率進(jìn)行。因此，本發(fā)明提供了快速且可重復(fù)地產(chǎn)生生產(chǎn)者宿主細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞用于 獲得大量的所需重組基因產(chǎn)物，例如重組蛋白或核酸。靶和交換載體通過(guò)同源重組進(jìn)行交換反應(yīng)的兩個(gè)實(shí)例見(jiàn)圖5和6。在另一實(shí)施方案中，交換載體可以引入wildcard宿主細(xì)胞基因組，其通過(guò)在基因 組的預(yù)定位置非隨機(jī)整合DSB介導(dǎo)酶的第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)，優(yōu)選通過(guò)用4. 2. 1. 2節(jié) 所述的靶載體，而獲得。在該實(shí)施方案中，交換載體優(yōu)選包含⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與第一和/或第二整合 位點(diǎn)的整合位點(diǎn)處的序列進(jìn)行重組。更優(yōu)選地，使用4. 2. 2節(jié)所述的交換載體。此外，以下附圖和實(shí)施例更詳細(xì)解釋本發(fā)明。附1 一例靶載體(靶載體A)中遺傳元件的圖示該靶載體包含交換盒，所述盒帶有CMV-啟動(dòng)子(Pl)驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因(RGl)和 PSV40(P2)驅(qū)動(dòng)的第一選擇標(biāo)記(SMl)，用于選擇該載體對(duì)宿主細(xì)胞基因組的穩(wěn)定整合。該 交換盒側(cè)翼是歸巢內(nèi)切核酸酶(I-SceI)的兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。交換盒外的第二選擇標(biāo)記(SM2) 不含啟動(dòng)子，因此在該靶載體中不具有功能。圖2另一例靶載體(靶載體B)中遺傳元件的圖示在改良版靶載體中，3' -I-SceI位點(diǎn)位于第一選擇標(biāo)記(SMl)的poly-A信號(hào) (PA)之前。在I-SceI切割靶載體的再連接(末端連接(endjoning)而非同源重組)的情 況中，用PA-元件作為隔離子(isolator)，阻止SM2轉(zhuǎn)錄。此外，終止密碼子位于不含啟動(dòng) 子的選擇標(biāo)記2 (SM2)之前，以便終止未能被pA元件終止的轉(zhuǎn)錄物翻譯過(guò)程。圖3 —例交換載體(交換載體A)中遺傳元件的圖示交換載體包含GOI的⑶S和選擇標(biāo)記(Δ SM2)的不完整⑶S。僅GOI⑶S之后有合 適的聚腺苷酸化信號(hào)。雖然SM2的不完整CDS由功能性組成型啟動(dòng)子P3(PSV40)驅(qū)動(dòng)，但 該GOI在其5'-端僅含有與靶構(gòu)建體中CMV-啟動(dòng)子3'-部分相同的部分啟動(dòng)子。圖4另一例交換載體(交換載體B)中遺傳元件的圖示該實(shí)施方案中，交換載體除包含圖3所示載體外，還包含第三選擇標(biāo)記(SM3)，該 標(biāo)記的表達(dá)與GOI的表達(dá)經(jīng)由IRES-元件而偶聯(lián)。這允許通過(guò)用選擇標(biāo)記2和3進(jìn)行雙重 選擇而分離出具有成功交換的表達(dá)盒的細(xì)胞。為了消除那些已在基因組中隨機(jī)整合了完整的交換載體的細(xì)胞，本例的交換載體 包含HSV-TK-基因作為自殺基因。圖5靶載體和交換載體通過(guò)同源重組(HR)進(jìn)行的交換反應(yīng)的圖示位于標(biāo)記的基因組位置、帶有報(bào)告基因(RGl)和選擇盒(SMl)的靶載體，在其側(cè)翼 是歸巢內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)(I-SceI)。啟動(dòng)子Pl由"增強(qiáng)子-PCMV-內(nèi)含子"元件來(lái)代表。啟動(dòng)子P2由SV40-啟動(dòng)子(PSV40)來(lái)代表。交換載體攜有GOI和非功能性選擇標(biāo)記 (ASM2)。用于通過(guò)同源重組(HR)修復(fù)歸巢內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的DSB的同源區(qū)在圖中示出。 交換載體中的啟動(dòng)子P3由SV40-啟動(dòng)子(PSV40)來(lái)代表。下圖顯示表達(dá)盒成功交換后的標(biāo)記的基因組位置。圖6用第三選擇標(biāo)記(SM3)進(jìn)行改良的交換反應(yīng)的圖示如圖5所示進(jìn)行交換載體與標(biāo)記的基因組位置的靶載體之間的交換反應(yīng)。在該 例中，交換載體除了含G0I，還包含第三選擇標(biāo)記(SM3)，該標(biāo)記的表達(dá)與GOI的表達(dá)借 IRES-元件而偶聯(lián)。圖7在一組初步細(xì)胞克隆中測(cè)量hSEAP活性單個(gè)的克隆化或寡克隆化細(xì)胞群體(χ-軸)根據(jù)用于穩(wěn)定整合靶載體的SMl活性 來(lái)選擇。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)RGl (hSEAP)活性篩選隨機(jī)標(biāo)記的整合座位的轉(zhuǎn)錄活性。報(bào) 告子hSEAP的活性以ng/ml為單位在y-軸給出。A. 39個(gè)細(xì)胞群體中的hSEAP-活性分布。 B. 92個(gè)細(xì)胞群體中的hSEAP-活性分布。圖8初步篩選潛在的通用宿主細(xì)胞如圖7所示，通過(guò)在用靶載體轉(zhuǎn)染后用SMl選擇細(xì)胞，而產(chǎn)生細(xì)胞群體。這些信息 表明鑒定出了稱(chēng)為"超性能者"的所需高產(chǎn)細(xì)胞群體。鑒定是基于RGl (hSEAP)的表達(dá)。報(bào) 告子hSEAP的活性以ng/ml為單位在y-軸給出。圖9次級(jí)篩選超性能01 A438超性能細(xì)胞以高表達(dá)RGl (hSEAP)為特征，從這些細(xì)胞起始，通過(guò)在無(wú)血清條件下 對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋(LD)克隆操作，產(chǎn)生高表達(dá)的克隆化細(xì)胞群體。圖A和B描繪了各 個(gè)克隆化細(xì)胞群體經(jīng)RGl (hSEAP)活性證實(shí)的不同表達(dá)能力。報(bào)告子hSEAP的活性以ng/ml 為單位在y-軸給出。圖B中的星號(hào)表示選出作為wildcard-細(xì)胞(標(biāo)記為07-022)以備 后續(xù)使用的細(xì)胞克隆。選擇是基于表達(dá)和生長(zhǎng)特性。圖10雙鏈斷裂介導(dǎo)的交換優(yōu)化兆堿基核酸酶質(zhì)粒量在事先形成的帶有穩(wěn)定整合的靶載體的wildcard細(xì)胞07-022中進(jìn)行表達(dá)盒的交 換。借助DSB-介導(dǎo)的靶載體與交換載體之間的HR，來(lái)自標(biāo)記的wildcard細(xì)胞的表達(dá)盒被 交換為GFP-IRES-SM3盒(以GFP為模型G0I)。該交換通過(guò)交換載體(ecv2)與兆堿基核 酸酶表達(dá)載體(Mnv)的共轉(zhuǎn)染來(lái)進(jìn)行。為了優(yōu)化交換反應(yīng)，用不同量的兆堿基核酸酶質(zhì)粒 測(cè)試了恒量的交換載體。通過(guò)靶載體與交換載體之間同源重組進(jìn)行的表達(dá)盒成功交換激活 了 SM2 (NeoR)。在用G418對(duì)2 X IO6進(jìn)行11天的選擇后，確定G418-抗性菌落的總數(shù)，以及 GFP-陽(yáng)性菌落數(shù)。該圖顯示不同方案中的GFP-陽(yáng)性細(xì)胞百分比。注意，方案5產(chǎn)生比方案 3多6倍的表達(dá)GFP的克隆化細(xì)胞。圖11雙鏈斷裂介導(dǎo)的交換優(yōu)化兆堿基核酸酶質(zhì)粒量對(duì)圖10所示方案獲得的細(xì)胞，除用SM2活性進(jìn)行選擇以外，還用SM3 (ZeoR)活性 進(jìn)行選擇。雙重選擇之后，通過(guò)UV顯微鏡檢確定雙重耐藥菌落的總數(shù)，以及GFP陽(yáng)性菌落 數(shù)。方案5顯示最高百分比(_94%)，有261個(gè)克隆顯示雙重抗性和亮GFP-表達(dá)細(xì)胞的最 高絕對(duì)數(shù)。圖12雙鏈斷裂介導(dǎo)的交換優(yōu)化兆堿基核酸酶質(zhì)粒量克隆化細(xì)胞的實(shí)例，這些細(xì)胞是通過(guò)靶載體與交換載體之間由雙鏈斷裂(DSB)-誘導(dǎo)的同源重組，在wildcard-細(xì)胞中交換表達(dá)盒而獲得的。此照片顯示圖10和 11中方案5所得GFP-陽(yáng)性菌落的重疊圖(可見(jiàn)光/紫外光)。比例尺表示100 μ m。圖13從wildcard-細(xì)胞克隆01C090衍生的GFP-陽(yáng)性菌落用另一 wildcard細(xì)胞群(01C090)按所述方法進(jìn)行成功的盒交換的實(shí)例。此照片 顯示盒交換、并根據(jù)SM2和SM3進(jìn)行雙重選擇后獲得的GFP-表達(dá)細(xì)胞。比例尺表示100 μ m。圖14交換反應(yīng)和雙重選擇后的GFP-陽(yáng)性菌落 在已建立的wi Idcard-細(xì)胞克隆中，通過(guò)DSB-介導(dǎo)的表達(dá)盒交換進(jìn)行成功的盒交 換的實(shí)例。以對(duì)比的方式顯示了從wildcard-細(xì)胞克隆07-022 (A)和克隆08-018 (B)進(jìn)行 交換或雙重選擇后獲得的細(xì)胞。比例尺表示100 μ m。圖15基于PCR證實(shí)交換反應(yīng)來(lái)自三個(gè)不同的wildcard克隆(07-022，08-018，01C090)的DNA在交換反應(yīng)之前 (泳道1，4，6)和交換反應(yīng)之后(泳道3，5，7)用PCR進(jìn)行分析。對(duì)于07-022，還分析了帶 有隨機(jī)整合的交換載體的對(duì)照(泳道2)。(A.) 368bp產(chǎn)物證實(shí)交換前存在hSEAP-表達(dá)盒 (泳道1，4，6)。交換后消失的條帶(泳道3，5，7)表明徹底除去該表達(dá)盒。(B.)293bp產(chǎn)物 證實(shí)交換后存在GFP-表達(dá)盒(泳道3，5，7)，隨機(jī)整合后也存在(泳道2)。(C.)971bp產(chǎn) 物僅在SM2完整(completion)后產(chǎn)生，因此表明通過(guò)HR進(jìn)行了表達(dá)盒的交換(泳道3，5， 7)。相應(yīng)的質(zhì)粒用做陽(yáng)性對(duì)照(泳道8)。注意，圖(C)中的對(duì)照顯示一條917bp的泳帶，歸 因于所用的質(zhì)粒DNA。陰性對(duì)照包含水(泳道9)或來(lái)自親本對(duì)照細(xì)胞的、未經(jīng)任何修飾的 基因組DNA (泳道10)，以代替模板DNA。將不同瓊脂糖凝膠的數(shù)據(jù)匯編(compiled)。
5.實(shí)施例5. 1生成載體系統(tǒng)5. 1. 1生成靶載體載體pcDNA3. 1 (+)上的原始CMV-啟動(dòng)子用NheI和NruI去除。載體pMG用XbaI 處理成平端后，用PacI取出帶有內(nèi)含子A的延伸型CMV-啟動(dòng)子。將該1. 7kb長(zhǎng)片段連接 至經(jīng)過(guò)NruI和NheI (與XbaI兼容)切割的pcDNA3. 1片段。由此產(chǎn)生載體CV001。5’ I-SceI通過(guò)銜接子引入CV001?；パa(bǔ)寡核苷酸帶有I-SceI位點(diǎn) TAGGGATAACAGGGTAAT以及HindIII突出端，使其雜交并克隆至CVOO1的HindIII，得到 CV001-MN。pcDNA3. 1⑴的原始新霉素抗性(NeoR)基因在CV001-MN中被作為SMl的潮霉素 抗性(HygroR)基因替代。為此，從質(zhì)粒擴(kuò)增含polyA位點(diǎn)的HygroR基因，使HygroR-CDS缺 失5’端的前4個(gè)核苷酸(包括起始ATG)、并在其3 ‘-端包含PciI限制性位點(diǎn)。PciI消化 后，將PCR連接至BsaBI和PciI消化的非甲基化CV001-MN。通過(guò)克隆進(jìn)BsaBI位點(diǎn)，Hygro R-⑶S因在載體5’端添加所丟失的ATGA而被補(bǔ)充完整。在所得載體CVOOl-MN-Hygro中引 入不含啟動(dòng)子的NeoR基因作為SM2。為此，從合適的質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增完整的NeoR-⑶S。 用5'-引物引入I-SceI位點(diǎn)，進(jìn)而允許通過(guò)PciI進(jìn)行NeoR-⑶S的克隆。3'-引物引入 BstZ171(TAC)位點(diǎn)。PciI和BstZ17I消化后，對(duì)PCR片段進(jìn)行凝膠純化，將其連接至已用相同的限制酶 切割的載體CVOOI-MN-Hygro。
為完成靶載體，給所得載體CV001-MN2-HygrO-NeO不佳分泌型堿性磷酸酶 (hSEAP)-基因作為RG1。通過(guò)KpnI和XbaI消化，從合適的載體上取出含poly-A信號(hào)的 hSEAP-CDS。將該片段克隆到載體CV001-MN2-Hygro-Neo的Kpnl和Xbal位點(diǎn)。最終的靶 載體稱(chēng) pCTV-SAP-Hyg-01。5. 1.2牛成交換載體基于載體CV001生成圖4的交換載體B。為了產(chǎn)生非功能截短型SM2，通過(guò)BstZ17I 和 BInI 消化，從 CV001 取出 NeoR-CDS。NeoR-CDS 用 631bp 的 BInI-Nael NeoR-片段。該 截短的NeoR-基因缺失該酶C末端24個(gè)氨基酸的編碼序列，這部分對(duì)其功能而言很關(guān)鍵。在所得CVOOl-Δ NeoR載體中，通過(guò)BsmBI and MunI雙重消化，取出CMV啟動(dòng)子的 5' _區(qū)，其包含增強(qiáng)子和RNA-聚合酶II啟動(dòng)子。這將主要留下CVOOl中CMV-內(nèi)含子A 啟動(dòng)子元件的內(nèi)含子A序列。用Klenow酶填充凹陷的3'-端后，該載體通過(guò)平末端移交 (relegation)而閉合。所得載體CVOOI-InA- Δ NeoR已準(zhǔn)備好引入游離的可選擇的GOI、并作為一般 性交換載體。作為GOI的例子，可選綠色熒光蛋白(GFP)。在本例中，GFP表達(dá)與第三選 擇標(biāo)記(SM3)的表達(dá)借IRES元件而偶聯(lián)。作為SM3，選用零霉素(Zeocine)抗性基因 (ZeoR)。表達(dá)盒由L-GFP序列及其后的IRES元件組成，ZeoR⑶S以AgeI-SaII片段的形 式從載體pMono-Zeo-GFP (Invitrogen)取出。將該盒通過(guò)平端連接而放置到EcoRV切割的 CVOOl-InA-ANeoR 中。最終的載體稱(chēng)為 pCEV-GFP-Zeo-01。5. 2生成通用的Wildcard細(xì)胞系為產(chǎn)生潛在的wildcard細(xì)胞系，使用已適應(yīng)無(wú)血清條件下懸浮生長(zhǎng)、并能長(zhǎng)至高 細(xì)胞密度(至少2-5 X IO6細(xì)胞/ml)的CHO細(xì)胞系。為了用靶載體pCTV-SAP-Hyg-01轉(zhuǎn)染 懸浮細(xì)胞，采用Nucleofector技術(shù)。在核轉(zhuǎn)染(nucleofection)之前，靶載體pCTV-SAP-Hyg-Ol用SspI消化，原因有-消除不想要的細(xì)菌元件(復(fù)制起點(diǎn)，氨芐青霉素抗性基因)以阻止由這些元件介 導(dǎo)的靶載體沉默。-增加宿主細(xì)胞基因組中靶載體相關(guān)功能性元件完整整合(intactintegration) 的可能性。SspI消化產(chǎn)生1. 698kb片段，其包含pUC ori以及AmpR基因的主要部分。剩余 的相關(guān)7. 41kb靶載體元件用QIAquick凝膠純化試劑盒按廠(chǎng)家建議進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純 化。為了用凝膠純化的靶載體進(jìn)行核轉(zhuǎn)染，確立了允許已適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的CHO細(xì)胞高 效轉(zhuǎn)染的調(diào)節(jié)。一般而言，70-90%轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率常規(guī)就可以實(shí)現(xiàn)。對(duì)經(jīng)過(guò)核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行24h的回收，然后根據(jù)作為SMl的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (HygroR)的表達(dá)選出具有穩(wěn)定整合的靶載體的細(xì)胞。為了用潮霉素B (200 μ g/ml)進(jìn)行選 擇，將經(jīng)過(guò)核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96-孔板，其密度允許分離單克隆或寡克隆細(xì)胞群體(有限 稀釋)。這可以通過(guò)1-60個(gè)細(xì)胞/孔，最優(yōu)選1-30個(gè)細(xì)胞/孔的密度來(lái)完成。這些單克隆或寡克隆細(xì)胞群體每一個(gè)代表靶載體的不同隨機(jī)整合位點(diǎn)。這些整合 位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性用微滴板比色實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的上清中hSEAP-報(bào)告基因的活性來(lái)確定。
當(dāng)達(dá)到近70-80%鋪滿(mǎn)時(shí)，將所選細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。用上清分 析hSEAP-活性。內(nèi)源堿性磷酸酶經(jīng)65°C保溫30min而滅活。hSEAP活性在hSEAP反應(yīng)緩沖液(2M 二乙醇胺，ImM MgCl2, 20mM L-高精氨酸，pH 9.8)中于37°C進(jìn)行測(cè)量。底物對(duì)硝基苯磷酸 (p-nitrophenol phosphate, 120mM)的水解通過(guò)讀取0D405來(lái)測(cè)量?；钚詳?shù)據(jù)針對(duì)胎盤(pán)堿 性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量。大多數(shù)克隆顯示極低的hSEAP報(bào)告子活性。所分離的具有穩(wěn)定整合的靶載體的克 隆僅有一部分顯示該報(bào)告子的高表達(dá)。這些初級(jí)克隆或寡克隆細(xì)胞群體中表達(dá)水平的變動(dòng) 的典型分布，由圖7A和B中概述的hSEAP-表達(dá)來(lái)顯示。為了鑒定罕見(jiàn)的稱(chēng)為"超性能克 隆"的高表達(dá)克隆，分析了超過(guò)3000個(gè)初級(jí)克隆化/寡克隆化細(xì)胞群體。為確保用高表達(dá)克隆作為通用wiIdcard細(xì)胞，用顯示最高h(yuǎn)SEAP水平的克隆進(jìn) 行再次有限稀釋?zhuān)员汨b定出具有最大表達(dá)水平的亞克隆。針對(duì)第一輪有限稀釋所得克隆 01A438顯示了一個(gè)實(shí)例，作為超性能克隆(圖8)。來(lái)自克隆01A438的細(xì)胞個(gè)體在第二輪 有限稀釋中接種，以允許產(chǎn)生單細(xì)胞衍生的細(xì)胞群體。如圖9A和B所示，所得多個(gè)亞克隆 總體上展示比大多數(shù)來(lái)自初步篩選的起始克隆更高的hSEAP表達(dá)。有可能在該組高表達(dá) 克隆中鑒定出那些具有最高h(yuǎn)SEAP表達(dá)的克隆。在該階段選擇克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析時(shí)，除 了考慮報(bào)告基因的表達(dá)，還考慮克隆的生長(zhǎng)能力(倍增時(shí)間)。根據(jù)該額外標(biāo)準(zhǔn)，選出克隆 07-022(圖9中用星號(hào)標(biāo)記)?？傊瑸楂@得具有高水平hSEAP表達(dá)的宿主細(xì)胞系，通過(guò)無(wú)血清的有限稀釋克隆 過(guò)程，產(chǎn)生了數(shù)千個(gè)克隆。由于隨機(jī)整合至基因組，這些克隆中僅約50%展示可檢測(cè)的 hSEAP表達(dá)。在這些hSEAP表達(dá)克隆中，僅0.3%的克隆被鑒定為高表達(dá)克隆，8卩"超性能 克隆"(比所有克隆的平均表達(dá)高25倍以上)。5. 3交換報(bào)告基因?yàn)榱擞肦Gl和SMl交換G0I，亞克隆07-022的wildcard細(xì)胞與圖4的交換載體 pEV-GFP-Zeo-01以及用于罕見(jiàn)切割的歸巢內(nèi)切核酸酶I-SceI的表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染。用綠 色熒光蛋白(GFP)編碼序列作為G0I。GFP之前的可剪接型內(nèi)含子A區(qū)具有足夠的長(zhǎng)度(1077bp)以允許有效同源重組， 但含有減弱的啟動(dòng)子活性。交換載體中的SMl是C-端截短型新霉素抗性基因(NeoR)。由于NeoR編碼區(qū)缺失 163bp，所得截短的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶不賦予對(duì)G418的抗性。NeoR基因的5，端(719bp)足 以允許與靶載體中的完整NeoR進(jìn)行同源重組。此策略允許在不產(chǎn)生NeoR細(xì)胞的情況下， 因交換載體的隨機(jī)整合，而活化靶載體中不含啟動(dòng)子的NeoR基因。此系統(tǒng)允許選出，用交換載體作為修復(fù)基質(zhì)，通過(guò)同源重組修復(fù)了歸巢酶誘導(dǎo)的 DSB的細(xì)胞。作為額外的選擇標(biāo)記，SM3(零霉素抗性基因)借助GFP與Zeo抗性基因之間的 IRES元件，從GFP-表達(dá)盒表達(dá)。此SM3被用于確定交換載體的隨機(jī)整合頻率，并檢查，是否無(wú)需表達(dá)盒的整合形 成交換載體，僅憑缺失靶載體中的交換區(qū)，就能由其它修復(fù)事件產(chǎn)生新霉素抗性細(xì)胞。為此，雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞先用G418進(jìn)行選擇，記錄所產(chǎn)生的克隆數(shù)，用UV顯微鏡檢分析這些克隆的GFP表達(dá)。如圖10所示，用G418進(jìn)行11天的選擇后，獲得NeoR細(xì)胞的異質(zhì)群體，其中 45-62%顯示亮GFP表達(dá)，而其余NeoR細(xì)胞為GFP陰性。這些細(xì)胞可代表通過(guò)簡(jiǎn)單的末端連接或通過(guò)單側(cè)同源重組進(jìn)行的DSB修復(fù)。在后 一種情況下，僅鄰接NeoR基因的DSB被HR修復(fù)，而鄰接CMV-啟動(dòng)子的DSB被非同源的末 端連接修復(fù)。利用以零霉素進(jìn)行的額外選擇，根據(jù)與恒量交換質(zhì)粒工轉(zhuǎn)染的I-SceI表達(dá)質(zhì)粒 Mnv的量，GFP陽(yáng)性細(xì)胞級(jí)分增加至多達(dá)94% (圖11)。當(dāng)使用兆堿基核酸酶表達(dá)載體與交 換載體之間的最佳比例(圖11的方案5)時(shí)，可檢測(cè)到總共291個(gè)表達(dá)GFP的菌落。轉(zhuǎn)染 并用G418和磷霉素進(jìn)行選擇后，得到2 X IO6個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，這代表大約1X10_4的頻率。 此前公開(kāi)的雙鏈斷裂誘導(dǎo)的同源重組的頻率是1-2，5X10_6，因此，我們的結(jié)果是令人意外 的好結(jié)果?？傊褂脙煞N選擇標(biāo)記能選出展示亮GFP熒光的同質(zhì)細(xì)胞群體(圖12)。 除了克隆07-022，還用另一 wiIdcard克隆證實(shí)RGl和SMl對(duì)由GFP-IRES-ZeoR組 成的表達(dá)盒的交換能力(圖13和14)。總體上，用hSEAP低表達(dá)的wildcard克隆進(jìn)行交換，在用G418和零霉素進(jìn)行雙重 選擇后，僅發(fā)現(xiàn)無(wú)熒光或弱熒光的細(xì)胞。。與此相反，用hSEAP高表達(dá)的wildcard克隆，導(dǎo)致表達(dá)盒通過(guò)所述兆堿基核酸 酶_介導(dǎo)的交換基質(zhì)進(jìn)行有效交換，并產(chǎn)生雙重抗性的亮GFP表達(dá)細(xì)胞，如圖13中克隆 01-C090 所示。Wildcard克隆08-018與克隆07-022的比較見(jiàn)圖14。使用克隆08-018，能在兆堿 基核酸酶_介導(dǎo)的表達(dá)盒交換后，產(chǎn)生同質(zhì)的GFP表達(dá)細(xì)胞群體。此GFP表達(dá)強(qiáng)度與衍生 自克隆07-022的細(xì)胞中所見(jiàn)相當(dāng)。wildcard細(xì)胞經(jīng)歷基于兆堿基核酸酶的交換反應(yīng)后衍生的細(xì)胞，可以在無(wú)血清的 懸浮培養(yǎng)中擴(kuò)增，并用于生產(chǎn)目的。為了確保單細(xì)胞衍生的生產(chǎn)細(xì)胞系，可以在較少費(fèi)力的情況下，用有限稀釋快速 產(chǎn)生交換的細(xì)胞。5. 4分子鑒定為監(jiān)控交換反應(yīng)期間的分子事件，用三種不同引物組合(表1的PCR 1-3)進(jìn)行基 于PCR的方案。表1用于分子鑒定的引物組合PCR 編號(hào)引物結(jié)合 5'-3'靶鑒定的表型PCR產(chǎn)物大 小(bp)1IntA-SEAP宿主wildcard細(xì)J包中 的靶載體SEAP+, HygroR GFP-3682IntA-GFP交換載體ZeoR GFP(+)2933SVlOP-3'Neo同源重組后活化的 SM2(NeoR)G418+ Zeo+ GFP+971用PCR 1在wildcard-宿主細(xì)胞基因組中檢測(cè)到穩(wěn)定整合的靶載體。用PCR 2證 實(shí)了，交換反應(yīng)后，細(xì)胞中確實(shí)存在來(lái)自交換載體的表達(dá)盒。由于交換載體也可隨機(jī)摻入， 用PCR 3證實(shí)靶構(gòu)建體內(nèi)部交換區(qū)3’端的同源重組。該P(yáng)CR的5'-引物結(jié)合交換構(gòu)建體 中的SV40啟動(dòng)子，3'-引物結(jié)合僅見(jiàn)于靶構(gòu)建體、未見(jiàn)于交換構(gòu)建體的NeoR基因的3'部 分。僅在同源重組激活了不含啟動(dòng)子的SM2(NeoR基因)后，PCR 3能產(chǎn)生971bp的PCR產(chǎn) 物。將不同PCR分析的結(jié)果組合，可證實(shí)來(lái)自靶構(gòu)建體的表達(dá)盒的消除，以及來(lái)自交 換載體的表達(dá)盒的引入。圖15顯示了對(duì)三種不同的通用wildcard細(xì)胞系進(jìn)行所述分析的結(jié)果，這三種細(xì) 胞系都成功進(jìn)行了交換反應(yīng)。在圖(A.)中，靶構(gòu)建體的存在通過(guò)結(jié)合CMV-啟動(dòng)子元件的 內(nèi)含子中、以及結(jié)合hSEAP CDS 5'-區(qū)的引物證實(shí)。圖(B.)用與圖(A.)同樣的內(nèi)含子引 物以及與GFP CDS 5’區(qū)結(jié)合的引物證實(shí)了交換載體B的穩(wěn)定整合的表達(dá)盒。相應(yīng)PCR產(chǎn) 物的成功擴(kuò)增表明通過(guò)HR或通過(guò)隨機(jī)整合引入了表達(dá)盒。圖(C.)顯示，PCR證實(shí)靶載體 中活化的NeoR基因的存在，這是與交換載體進(jìn)行HR的結(jié)果。由于該P(yáng)CR的5'-引物結(jié)合 僅見(jiàn)于交換載體的SV40啟動(dòng)子，3'-引物結(jié)合僅見(jiàn)于靶構(gòu)建體的NeoR CDS的3'部分，成 功的擴(kuò)增表明，交換載體與靶載體在3' -I-SceI介導(dǎo)的DSB處發(fā)生了 HR。作為圖(A.)和(B.)的陽(yáng)性對(duì)照(泳道8)，分別使用靶載體和交換載體2。圖(C.) 的陽(yáng)性對(duì)照是帶有相同的引物結(jié)合序列、但距離略有不同的載體(CVOOl)。因此，陽(yáng)性對(duì)照 產(chǎn)生了比從基因組DNA預(yù)計(jì)的略小的PCR產(chǎn)物(917bp，而非971bp)。作為陰性對(duì)照，模板 DNA被水替換(泳道9)，或者，為檢查CHO基因組DNA的非特異性擴(kuò)增，使用來(lái)自無(wú)靶構(gòu)建 體核轉(zhuǎn)染的親本CHO細(xì)胞系的DNA(泳道10)。對(duì)克隆07-022的鑒定最深入，除了起始細(xì)胞及其成功交換細(xì)胞的衍生物，還分析 了用于交換載體B隨機(jī)整合的對(duì)照。該對(duì)照所用細(xì)胞克隆在僅有交換載體B的核轉(zhuǎn)染之后 顯示零霉素抗性和極弱的GFP熒光。對(duì)于克隆08-018和01C090，分析了起始細(xì)胞，以及成功交換的細(xì)胞，后者經(jīng)歷雙
重選擇后幸存，并展示亮GFP熒光。
對(duì)于所有克隆，hSEAP-⑶S的存在可以在起始細(xì)胞群體中清楚地證實(shí)(圖A)。對(duì) 于克隆07-022，該⑶S的存在也可以在隨機(jī)整合產(chǎn)生的細(xì)胞克隆中證實(shí)。經(jīng)過(guò)兆堿基核 酸酶介導(dǎo)的交換反應(yīng)后，在所測(cè)試的顯示NeoR/ZeoR和亮GFP熒光的所有交換克隆中， hSEAP-⑶S不再能擴(kuò)增。這表明所有分析例中消除了來(lái)自整合的靶載體的起始表達(dá)盒。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，來(lái)自交換載體的表達(dá)盒的存在也可以通過(guò)對(duì)僅僅那些進(jìn)行了交換反 應(yīng)的GFP-⑶S進(jìn)行PCR來(lái)證實(shí)(圖B泳道3，5，7)。所測(cè)試的克隆的起始細(xì)胞在該P(yáng)CR實(shí)驗(yàn) 中為陰性(圖B，泳道1，4，6)。該P(yáng)CR實(shí)驗(yàn)并不特異于經(jīng)HR引入GFP-表達(dá)盒。克隆07-022 的交換載體B隨機(jī)整合的例子表明，這里用GFP-⑶S特異性引物也可以獲得陽(yáng)性信號(hào)。不同細(xì)胞群體進(jìn)行交換反應(yīng)后產(chǎn)生的GFP表達(dá)的亮度表明，在泳道3，5和7所用 細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的表達(dá)熱點(diǎn)中引入了 GFP-⑶S。為了最終證實(shí)所觀(guān)察到的表型是基于消除了靶載體中的表達(dá)盒、并在相同位置引 入了交換載體的表達(dá)盒，進(jìn)行另外的PCR分析(圖C.)。當(dāng)靶載體中3' I-SceI介導(dǎo)的DSB 用交換載體2作為修復(fù)基質(zhì)通過(guò)HR修復(fù)后，該P(yáng)CR僅產(chǎn)生預(yù)計(jì)的971bp PCR產(chǎn)物。正如預(yù) 計(jì)僅見(jiàn)于雙重抗性的亮GFP細(xì)胞的那樣，可檢測(cè)到預(yù)計(jì)的PCR產(chǎn)物(圖C，泳道3，5，7)，但 在交換載體隨機(jī)整合所產(chǎn)生的細(xì)胞中未檢測(cè)到(圖C，泳道2)。
權(quán)利要求
產(chǎn)生生產(chǎn)者宿主細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞用于生成重組基因產(chǎn)物，所述方法包括以下步驟(a)提供靶載體，其包含(i)報(bào)告基因(RG1)，該基因與第一表達(dá)控制序列(P1)可操作相連，(ii)第一選擇標(biāo)記基因(SM1)，該基因與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，(iii)第二非功能選擇標(biāo)記基因(SM2)，該基因未與表達(dá)控制序列可操作相連，其中序列(i)位于5′ 位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之間，序列(iii)位于3’ 位置，(iv)雙鏈斷裂介導(dǎo)酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn)位于第一表達(dá)控制序列(P1)和第一報(bào)告基因(RG1)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和序列(iii)之間，(b)將所述靶載體引入宿主細(xì)胞，所用條件允許該靶載體隨機(jī)整合到該宿主細(xì)胞的基因組中，(c)選擇具有穩(wěn)定整合的靶載體、并顯示報(bào)告基因(RG1)的轉(zhuǎn)錄活性的宿主細(xì)胞，(d)提供交換載體，該載體包含(i)目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)失活的第二選擇標(biāo)記基因(ΔSM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(P3)可操作相連，其中，交換載體包含第一5′ 同源序列和第二3′ 同源序列，它們?cè)试S與靶載體的序列進(jìn)行重組，(e)將交換載體引入步驟(c)獲得的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a)(iv)項(xiàng)所述第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂、并允許交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中，其中，失活的第二選擇標(biāo)記基因(ΔSM2)因交換載體與靶載體同源重組導(dǎo)致交換載體整合而被激活，(f)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)與整合的靶載體發(fā)生同源重組而整合的交換載體，其中所述生產(chǎn)者細(xì)胞表達(dá)GOI。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，尤其哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中的報(bào)告基因(RGl)編碼酶或化學(xué)發(fā)光或熒光基因產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1-3之一的方法，其中的第一表達(dá)控制序列(Pl)包含組成型啟動(dòng)子，例如 CMVo啟動(dòng)子，任選補(bǔ)充有CMV內(nèi)含子A。
5.權(quán)利要求1-4之一的方法，其中第二表達(dá)控制序列(P2)包含組成型啟動(dòng)子，例如 SV40啟動(dòng)子，或IRES元件。
6.權(quán)利要求1-5之一的方法，其中失活的第二選擇標(biāo)記基因(SM2)無(wú)ATG起始密碼子 和/或有上游終止密碼子。
7.權(quán)利要求1-6之一的方法，其中雙鏈斷裂誘導(dǎo)酶是具有由至少10個(gè)、優(yōu)選至少12 個(gè)、更優(yōu)選18個(gè)核苷酸組成的識(shí)別位點(diǎn)的兆堿基核酸酶或歸巢核酸酶，例如選自I-Scel， I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-CeuI, I-CreI, I-Ppol, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, HO 和 Endo SceI0
8.權(quán)利要求1-7之一的方法，其中第二識(shí)別位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄隔離子(transcriptionalisolator)如 poly-A 位點(diǎn)之前。
9.權(quán)利要求1-8之一的方法，其中第一和第二識(shí)別位點(diǎn)彼此取向相反。
10.權(quán)利要求1-9之一的方法，其中選出以下細(xì)胞，在該細(xì)胞中，靶載體以單拷貝形式 具體整合至宿主細(xì)胞染色體的單個(gè)位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求1-10之一的方法，其中的選擇步驟(C)是基于選擇第一選擇標(biāo)記基因 (SMl)的活性。
12.權(quán)利要求1-11之一的方法，其中選出具有較高的報(bào)告基因(RGl)轉(zhuǎn)錄活性的宿主 細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1-12之一的方法，其中交換載體包含不帶有功能性表達(dá)控制序列的目標(biāo) 基因(GOI)，尤其帶有與靶載體中第一表達(dá)控制序列(Pl)的3’部分實(shí)質(zhì)相同的部分表達(dá)控 制序列。
14.權(quán)利要求1-13之一的方法，其中交換載體包含不完整的第二選擇標(biāo)記基因 (Δ SM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(Ρ3)可操作相連，該Ρ3具體包含組成型啟動(dòng)子，例如 SV40啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求1-14之一的方法，其中交換載體還包含(iii)第三選擇標(biāo)記基因(SM3)，其與GOI共轉(zhuǎn)錄。
16.權(quán)利要求1-15之一的方法，其中第一5'-同源序列具有至少約1000個(gè)核苷酸和 /或第二 3'-同源序列具有至少約700個(gè)核苷酸。
17.權(quán)利要求1-16之一的方法，其中交換載體中的第一5'-同源序列不含功能性表 達(dá)控制序列。
18.權(quán)利要求1-17之一的方法，其中交換載體中的第二3'-同源序列不含功能性選 擇標(biāo)記基因序列。
19.權(quán)利要求1-18之一的方法，其中交換載體還包含(iv)陰性選擇標(biāo)記基因，尤其自殺基因，例如HSV胸苷激酶基因，其位于由第一 5' _和第二 3' _同源序列限定的序列以外。
20.權(quán)利要求1-19之一的方法，還包括(i)在步驟(e)之前或期間，將包含編碼雙鏈斷裂介導(dǎo)酶的核酸序列或mRNA的載體引 入宿主細(xì)胞，并表達(dá)此酶，以便允許進(jìn)行步驟(e)，或( )在步驟(e)之前或期間，將雙鏈斷裂介導(dǎo)酶引入宿主細(xì)胞，并提供此酶，以便進(jìn)行 步驟(e)。
21.權(quán)利要求15-20之一的方法，其中的選擇步驟(f)是基于選擇第二選擇標(biāo)記基因 (SM2)的活性。
22.權(quán)利要求1-21之一的方法，其中的選擇步驟(f)是基于選擇第二選擇標(biāo)記基因 (SM2)和第三選擇標(biāo)記基因(SM3)的活性。
23.權(quán)利要求1-22之一的方法，還包括表達(dá)目標(biāo)基因(GOI)和獲得所表達(dá)的基因產(chǎn)物。
24.產(chǎn)生用于引入目標(biāo)基因(GOI)的wildcard宿主細(xì)胞的方法，包括(a)提供靶載體，其包含(i)報(bào)告基因(RGl)，該基因與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，( )第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，該基因與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，(iii)第二非功能選擇標(biāo)記基因(SM2)，該基因未與表達(dá)控制序列可操作相連，其中序列⑴位于5'-位置，序列(ii)位于⑴和(iii)之間，序列(iii)位于3’-位置，(iv)雙鏈斷裂介導(dǎo)酶尤其兆堿基核酸酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn)位 于第一表達(dá)控制序列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和序 列(iii)之間，(b)將所述靶載體引入宿主細(xì)胞，所用條件允許該靶載體隨機(jī)整合到該宿主細(xì)胞的基 因組中，和(c)選擇具有穩(wěn)定整合的靶載體、并顯示報(bào)告基因(RGl)的轉(zhuǎn)錄活性的宿主細(xì)胞。
25.制備重組基因產(chǎn)物的方法，包括以下步驟(a)提供wildcard宿主細(xì)胞，在其基因組中整合了表達(dá)盒，所述盒包含(i)報(bào)告基因(RGl)，該基因與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連，(ii)第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，該基因與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連，(iii)第二非功能選擇標(biāo)記基因(SM2)，該基因未與表達(dá)控制序列可操作相連，其中序列⑴位于5'-位置，序列(ii)位于⑴和(iii)之間，序列(iii)位于3’-位置，(iv)雙鏈斷裂介導(dǎo)酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn)位于第一表達(dá)控制序 列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和序列(iii)之間，其中所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中并顯示報(bào)告基因(RGl)的轉(zhuǎn)錄活性，(b)提供交換載體，該載體包含 ⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)失活的第二選擇標(biāo)記基因(ASM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(P3)可操作相連，其中，交換載體包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與靶載體的 序列重組，(c)將交換載體引入步驟(a)提供的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a)(iv)項(xiàng)所述 第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂、并允許交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到 宿主細(xì)胞基因組中，其中，失活的第二選擇標(biāo)記基因(ASM2)因交換載體的整合而被激活，(d)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)與整合的靶載體發(fā)生同源重組而整合的交換載體，其 中所述生產(chǎn)者細(xì)胞表達(dá)GOI。
26.產(chǎn)生用于制備重組基因產(chǎn)物的生產(chǎn)者宿主細(xì)胞的方法，包括(a)將含有雙鏈斷裂介導(dǎo)酶第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列通過(guò)定向同源重組而引入 宿主細(xì)胞基因組中支持轉(zhuǎn)錄活性的位置，(b)選出具有穩(wěn)定整合的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的wildcard宿主細(xì)胞，(c)提供交換載體，該載體包含 ⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn) 的整合位點(diǎn)處的序列重組，(d)將交換載體引入步驟(b)獲得的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a)項(xiàng)所述第一 和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂、并允許交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到宿主 細(xì)胞基因組中，和(e)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)同源重組而整合的交換載體，其中所述生產(chǎn)者細(xì)胞表 達(dá) G0I。
27.制備用于引入目標(biāo)基因(GOI)的wildcard宿主細(xì)胞的方法，包括(a)將含有雙鏈斷裂介導(dǎo)酶第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列通過(guò)定向同源重組而引入 宿主細(xì)胞基因組中支持轉(zhuǎn)錄活性的位置，和(b)選出具有穩(wěn)定整合的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)的wildcard宿主細(xì)胞。
28.制備重組基因產(chǎn)物的方法(a)提供wildcard宿主細(xì)胞，在其基因組中整合了含有雙鏈斷裂介導(dǎo)酶第一和第二識(shí) 別位點(diǎn)的核酸序列，其中的核酸序列穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中支持轉(zhuǎn)錄活性的位置，(b)提供交換載體，該載體包含 ⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與第一和/或第二識(shí)別位點(diǎn) 的整合位點(diǎn)處的序列重組，(c)將交換載體引入步驟(a)提供的宿主細(xì)胞中，所用條件允許雙鏈在(a)項(xiàng)所述第一 和/或第二識(shí)別位點(diǎn)處斷裂、并允許交換載體通過(guò)雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組而整合到宿主 細(xì)胞基因組中，和(d)選出生產(chǎn)者細(xì)胞，其具有通過(guò)同源重組而整合的交換載體，其中所述生產(chǎn)者細(xì)胞表 達(dá) G0I。
29.靶載體，其包含(a)與第一表達(dá)控制序列(Pl)可操作相連的報(bào)告基因(RGl)，(b)與第二表達(dá)控制序列(P2)可操作相連的第一選擇標(biāo)記基因(SMl)，(c)未與表達(dá)控制序列可操作相連的非功能第二選擇標(biāo)記基因(SM2)，其中序列(i)位 于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之間，序列(iii)位于3’ -位置，(d)雙鏈斷裂_介導(dǎo)酶尤其兆堿基核酸酶的第一和第二識(shí)別位點(diǎn)，其中第一識(shí)別位點(diǎn) 位于第一表達(dá)控制序列(Pl)和第一報(bào)告基因(RGl)之間，第二識(shí)別位點(diǎn)位于序列(ii)和 序列(iii)之間。
30.交換載體，用于將目標(biāo)基因(GOI)引入宿主細(xì)胞，其包含 ⑴目標(biāo)基因(GOI)，和(ii)失活的第二選擇標(biāo)記基因(ASM2)，該基因與第三表達(dá)控制序列(P3)可操作相連，其中，交換載體包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它們?cè)试S與宿主細(xì)胞 基因組中預(yù)定位點(diǎn)的序列重組。
31.權(quán)利要求30的交換載體，其中的同源序列允許與權(quán)利要求29所述靶載體的序列重組。
32.用于制備重組基因產(chǎn)物的生產(chǎn)者細(xì)胞，其能通過(guò)權(quán)利要求1-23或26之一的方法獲得。
33.用于引入目標(biāo)基因(GOI)的wildcard宿主細(xì)胞，其能通過(guò)權(quán)利要求24或27的方法獲得。
34.權(quán)利要求33的wildcard宿主細(xì)胞，還包含編碼雙鏈斷裂介導(dǎo)酶的核酸序列，優(yōu)選 與誘導(dǎo)型表達(dá)控制序列可操作相連。
35.權(quán)利要求33或34的wildcard宿主細(xì)胞與權(quán)利要求30或31的交換載體的組合。
36.權(quán)利要求33，34或35的wildcard宿主細(xì)胞用于制備生產(chǎn)者細(xì)胞系的用途。
37.權(quán)利要求32的生產(chǎn)者細(xì)胞或按照權(quán)利要求36所述獲得的生產(chǎn)者細(xì)胞用于制備重 組基因產(chǎn)物的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于在真核細(xì)胞中制備重組基因產(chǎn)物的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及快速、可重復(fù)地生成適于大規(guī)模生產(chǎn)重組基因產(chǎn)物的生產(chǎn)細(xì)胞系的方法和物質(zhì)。本發(fā)明包括特異性載體系統(tǒng)，遺傳改造的宿主細(xì)胞和使用方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101981196SQ200980111274
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者哈里·阿布茨, 安德烈亞斯·赫爾曼, 貝內(nèi)迪克特·格羅伊利希 申請(qǐng)人:塞洛尼克股份公司