專(zhuān)利名稱(chēng)：一種增殖多能性干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增殖多能性干細(xì)胞的方法、層粘連蛋白-5作為細(xì)胞支持材料 (cell-supporting material)的用途以及多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)用試劑盒。本申請(qǐng)以2008年3月31日提出的日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)卦?008-93350和2008年9月 3日提出的日本專(zhuān)利申請(qǐng)2008-225686號(hào)為基礎(chǔ)要求優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
多能件干細(xì)胞的增殖方法多能性干細(xì)胞為具有分化成所有組織的細(xì)胞的能力(分化多能性)的干細(xì)胞。作 為多能性干細(xì)胞，目前已知有胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、通過(guò)在體細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)特定因子 的組合(例如，0ct3/4, Sox2, Klf4及c-Myc的組合)而制作的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS細(xì) 胞)、通過(guò)原始生殖細(xì)胞制作的胚胎生殖干細(xì)胞(EG細(xì)胞)、通過(guò)精巢的生殖細(xì)胞制作的種 系干細(xì)胞(GS細(xì)胞)等。胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells :ES細(xì)胞)是通過(guò)發(fā)育初期的胚泡內(nèi)細(xì)胞 群(ICM)建立的多能性干細(xì)胞(Nature. 292，154-156，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78， 7634-7638,1981, Science. 282，1145-1147，1998)。小鼠 ES 細(xì)胞在白血病抑制因子(LIF) 的存在下能夠維持其多能性(Nature. 336，684-687，1988，Nature. 336，688-690，1988)。通 常，在維持培養(yǎng)中使用產(chǎn)生LIF的細(xì)胞株或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為支持細(xì)胞(飼 養(yǎng)細(xì)胞)，或者使用添加有LIF的培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)闹С植牧稀Ｐ∈驟S細(xì)胞的培養(yǎng)中，支持細(xì)胞擔(dān)負(fù)著提供細(xì)胞粘附的支架及供給ES細(xì)胞生長(zhǎng) 因子和LIF的任務(wù)。另外除了從支持細(xì)胞供給LIF外，還可以在培養(yǎng)液中添加LIF。作為添 加LIF的方式，可以直接將LIF添加到培養(yǎng)液中，也可以在培養(yǎng)液中添加產(chǎn)生LIF的細(xì)胞株 的培養(yǎng)上清。另一方面，在不使用支持細(xì)胞的體系中，通過(guò)以明膠等各種胞外基質(zhì)作為支持 材料、并向培養(yǎng)液中添加LIF來(lái)進(jìn)行小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)。另一方面，在人ES細(xì)胞的培養(yǎng)中，為了維持多能性，需要存在堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(FGF2) (Dev Biol. 227，271-278，2000)，進(jìn)而還需要從MEF供給的因子。人ES細(xì)胞 在FGF2存在下，通過(guò)使用MEF作為支持細(xì)胞，或者使用MEF的培養(yǎng)上清和適當(dāng)?shù)闹С植牧希?能夠在保持多能性的狀態(tài)下進(jìn)行維持培養(yǎng)(Nature Biotech. 19，971-974，2001)。具體而言，在FGF2和血清存在下能夠培養(yǎng)人ES細(xì)胞，或者也可以用無(wú)血清的培養(yǎng) 基培養(yǎng)人ES細(xì)胞。現(xiàn)在一般采用的是用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人ES細(xì)胞，作為血清代替物可 使用例如 Invitrogen 公司的 KNOCKOUT 血清替代品(KSR，knockout serum replacement) 等。作為一般的人ES細(xì)胞的培養(yǎng)體系，可以使用如下的體系使用MEF作為支持細(xì)胞并將 FGF2添加到培養(yǎng)液中的體系、以Matrigel等各種胞外基質(zhì)蛋白作為支持材料并在添加有 FGF2的MEF培養(yǎng)上清中進(jìn)行培養(yǎng)的體系。另外，作為支持細(xì)胞不僅可以使用小鼠成纖維細(xì) 胞，還可以使用人成纖維細(xì)胞。此外，據(jù)報(bào)道，近年來(lái)在小鼠和人中由體細(xì)胞建立了具有與胚胎干細(xì)胞非常相似的性質(zhì)的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem cells :iPS 細(xì)胞)(Cell. 126， 663-672,2006，Cell. 131,861-872,2007，Science. 318，1917-1920,2007，國(guó)際公開(kāi) W02007/069666)。iPS細(xì)胞為在體細(xì)胞中導(dǎo)入0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等因子而建立的 體細(xì)胞來(lái)源的多能性干細(xì)胞。一般在iPS細(xì)胞的維持培養(yǎng)中，與ES細(xì)胞同樣也需要存在支 持細(xì)胞。iPS細(xì)胞可通過(guò)與ES細(xì)胞同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)。在STO細(xì)胞(穩(wěn)定產(chǎn)生LIF的 SIM小鼠成纖維細(xì)胞株)中、使用LIF產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠維持培養(yǎng)小鼠iPS細(xì)胞。并 且，作為不使用支持細(xì)胞的體系，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加LIF，能夠在包被有明膠的培養(yǎng)板上 維持培養(yǎng)小鼠iPS細(xì)胞。另外，據(jù)了解，STO細(xì)胞對(duì)于穩(wěn)定維持小鼠來(lái)源的ES細(xì)胞、EG細(xì) 胞、EC細(xì)胞是有效的。人iPS細(xì)胞還可以利用小鼠成纖維細(xì)胞作為支持細(xì)胞并在添加有FGF2的體系中 進(jìn)行培養(yǎng)。另外京都大學(xué)山中伸彌等的研究小組，使用SNL細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞株，同時(shí) 表達(dá)LIF和G418耐性基因)進(jìn)行培養(yǎng)(Cell. 131，861—872，2007)。在不使用支持細(xì)胞的體 系中維持培養(yǎng)人iPS細(xì)胞的情況下，采用使用Matrigel作為支持材料并在MEF的培養(yǎng)上清 中添加了 FGF2的體系。體細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞與初期胚來(lái)源的胚胎干細(xì)胞相比，倫理性的問(wèn)題較少，并 且，由于可由患者本人的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)制因此并不存在免疫排斥的問(wèn)題?？善诖湓谠偕t(yī) 療上的應(yīng)用。胚胎生殖干細(xì)胞(Embryonic germ cells :EG細(xì)胞)為在青灰因子(Kit-Ligand)、 LIF、FGF2的存在下培養(yǎng)原始生殖細(xì)胞而建立的細(xì)胞，通過(guò)小鼠的實(shí)驗(yàn)可知該細(xì)胞具有與 ES細(xì)胞大致相同的性質(zhì)。EG細(xì)胞的維持培養(yǎng)可以使用與ES細(xì)胞同樣的培養(yǎng)方法。S卩，在 MEF、STO細(xì)胞等支持細(xì)胞的存在下，能夠在添加有LIF的體系中培養(yǎng)EG細(xì)胞。(Cell 70 841-847，1992，Development 120，3197-3120，1994)。由精巢的生殖細(xì)胞制作的種系干細(xì)胞(Germline Stem cells :GS細(xì)胞)是通過(guò)在 至少含有GDNF(Glial cell-line derived neurotrophic growth factor，月交質(zhì)細(xì)胞源性神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)從而能夠在體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞(精子干細(xì)胞)的細(xì) 胞株，通過(guò)注入到精巢的曲細(xì)精管(seminiferous tubules)內(nèi)而能夠形成精子。GS細(xì)胞的 長(zhǎng)期培養(yǎng)可通過(guò)在作為支持細(xì)胞的MEF上使用添加有⑶NF、FGF2、EGF (epidermal growth factor)及LIF的培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行。還有在無(wú)支持細(xì)胞的體系內(nèi)培養(yǎng)GS細(xì)胞的報(bào)道，其通過(guò) 在用層粘連蛋白包被后的培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，能夠維持GS細(xì)胞(Biology of Reproduction 69 :612-616，2003，Biology of Reproduction 72 :985_991，2005)。GS 細(xì)胞中尤其是 mGS 細(xì)胞(multipotent germline stem cell)，具有與 ES 細(xì)胞 同樣的性質(zhì)，還具有分化多能性。mGS細(xì)胞通過(guò)在ES細(xì)胞的培養(yǎng)體系中使所建立的GS細(xì) 胞進(jìn)一步變成多能性干細(xì)胞而建立。所建立的mGS細(xì)胞也能夠采用與ES細(xì)胞同樣的方法 進(jìn)行培養(yǎng)，可在支持細(xì)胞存在下且在使用了添加有LIF的培養(yǎng)基的體系中進(jìn)行培養(yǎng)。(Cell 119 :1001-1012，2004，Nature 440 :1199_1203，2006)。上述那樣的多能性細(xì)胞被期待應(yīng)用在再生醫(yī)療等中。但是，為了應(yīng)用在臨床上而 尤為需要避免免疫排斥的問(wèn)題、未知的病毒混入等潛在的危險(xiǎn)性，可以說(shuō)需要開(kāi)發(fā)完全不 使用動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)的維持培養(yǎng)體系。即，可以預(yù)料，當(dāng)人所不具有的動(dòng)物來(lái)源的唾液酸被吸收到人ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞時(shí)，這些唾液酸所具有的抗原性將引發(fā)問(wèn)題，從而使再生后的組 織發(fā)生免疫排斥。此外，即使使用例如人蛋白質(zhì)，從胎盤(pán)等組織調(diào)制出的天然型蛋白質(zhì)，也 存在混入除艾滋病病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒以外的未知病毒等潛在的危險(xiǎn) 性。為此，對(duì)能夠維持人ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的多能性且支持該細(xì)胞 的增殖用培養(yǎng)液組成、以及代替MEF的適當(dāng)?shù)闹С植牧线M(jìn)行了探索(Nature Biotech. 24, 185-187，2006，Stem Cell. 24，2649-2660，2006)。然而，在使用 MEF 作為支持細(xì)胞(飼養(yǎng)細(xì) 胞)的情況下，細(xì)胞粘附效率也只得到百分之幾，現(xiàn)在探討的不使用支持細(xì)胞的體系該效 率還會(huì)進(jìn)一步降低。在多能性干細(xì)胞的維持培養(yǎng)中期望開(kāi)發(fā)出完全不使用動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì) 的體系，但上述細(xì)胞粘附效率低已成為重大問(wèn)題之一。要求一種維持多能性且顯示出有效 的粘附活性的人來(lái)源的支持材料，所述支持材料將成為對(duì)確保可用于再生醫(yī)療等臨床上的 細(xì)胞材料有用的工具。層粘連蛋白-5層粘連蛋白主要定位存在于各種組織的基底膜上，是在組織結(jié)構(gòu)的維持和細(xì)胞功 能的控制中發(fā)揮重要作用的胞外基質(zhì)蛋白(Matrix Biol. ,18 19-28,1999, Dev. Dyn.，218 213-234，2000)。作為層粘連蛋白的結(jié)構(gòu)，是α鏈、β鏈、Y鏈分別通過(guò)二硫鍵連接而成的異三聚 體分子，具有特征性的十字架結(jié)構(gòu)。各鏈由多個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域I和II形成三股螺旋。 在本申請(qǐng)前，層粘連蛋白分子通過(guò)5種α鏈(α 1 α 5)、3種β鏈(β 1 β 3)、3種γ鏈 (Yl Υ； )的不同的組合可至少被認(rèn)定為15種，實(shí)際上意味著存在其數(shù)倍的種類(lèi)(宮崎 等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué) Vol. 16 No. 16(增刊)1998 年，第 114-119 頁(yè)，Dev. Dyn.，218 :213-234,2000, J. Neurosci. ,20 :6517-6528,2000, Physiol Rev. 85，979-1000，2005)。這些 α、β、γ 鏈 分別被不同的基因編碼，各自的層粘連蛋白亞型具有特有的存在部位或功能，主要介由細(xì) 胞膜受體整合蛋白(cell membrane receptor integrin)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、增殖、運(yùn)動(dòng)、分化 等(Dev. Dyn. 218，213-234，2000，Physiol. Rev. 85，979-1000，2005)。表1表示15種層粘連蛋白分子種類(lèi)及其亞基構(gòu)成。表1層粘連蛋白分子種類(lèi)和亞基構(gòu)成正式名構(gòu)成別名層粘連蛋白-1α β γ EHS層粘連蛋白層粘連蛋白-2α β γ 分區(qū)蛋白(Merosin)層粘連蛋白-3α1β2γ1S-層粘連蛋白層粘連蛋白-4α2β2γ1S-分區(qū)蛋白層粘連蛋白-5α3β3γ2層粘連蛋白(Ladsin) 表皮整聯(lián)配體蛋白 (epiligrin) /韁蛋白(kalinin) /nicein層粘連蛋白-6α3β1γ1K-層粘連蛋白層粘連蛋白-7α3β2γ1KS-層粘連蛋白層粘連蛋白-8α4β1γ1層粘連蛋白-9α4β2γ1層粘連蛋白-10α5β1γ1層粘連蛋白-11α5β2γ1層粘連蛋白-12α2β1γ3層粘連蛋白-13α3β2γ3層粘連蛋白-14 4β2γ3層粘連蛋白-15α5β2γ3層粘連蛋白分子通過(guò)以3條鏈的氨基(N)末端部分(短臂)相互締合、或者與其 他基質(zhì)分子締合來(lái)構(gòu)建基底膜。另一方面，α鏈的羧基(C)末端存在5個(gè)相同的球狀結(jié)構(gòu) 域(Gl G5結(jié)構(gòu)域或LGl LG5)，該部分主要與整合蛋白或其他的受體結(jié)合。層粘連蛋白-5(也稱(chēng)作韁蛋白、表皮整聯(lián)配體蛋白、niceiruladsin)，為由α 3鏈、 β3鏈、Υ2鏈形成的層粘連蛋白亞型之一，被多個(gè)研究機(jī)關(guān)在不同的情況下發(fā)現(xiàn)(J.Cell Biol. 114,567-576,1991, Cell 65，599-610，1991，J.Invest Dermatol. 101，738-743， 1993，Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 90，11767-11771，1993)。據(jù)報(bào)道，層粘連蛋白-5對(duì)各種細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞粘附活性、細(xì)胞分散活 性、細(xì)胞增殖活性等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90，11767-11771，1993，J. Biochem. 116， 862-869,1994, J. Cell Biol. 125，205-214，1994，Mol. Biol. Cell. 16，881-890，2005，StemCell. 24,2346-2354,2006)。國(guó)際公開(kāi)W02007/023875記載了利用層粘連蛋白_5培養(yǎng)間充 質(zhì)系干細(xì)胞的技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開(kāi)W02007/069666專(zhuān)利文獻(xiàn)2 國(guó)際公開(kāi)W02007/023875專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2001-172196號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 =Nature. 292,154-156，1981非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78，7634-7638，1981非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :Science. 282，1145-1147，1998非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 =Nature. 336，684-687，1988非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 =Nature. 336，688-690，1988非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :Dev. Biol. 227，271-278，2000非專(zhuān)利文獻(xiàn)7 :Nature Biotech. 19，971-974，2001非專(zhuān)利文獻(xiàn)8 =Cell. 126，663-672，2006非專(zhuān)利文獻(xiàn)9 =Science. 318,1917-1920, 2007非專(zhuān)利文獻(xiàn)10 =Nature Biotech. 24，185-187，2006非專(zhuān)利文獻(xiàn)11 =Stem Cell. 24，2649-2660，2006非專(zhuān)利文獻(xiàn)12 =Matrix Biol.，18 19-28，1999非專(zhuān)利文獻(xiàn)13 :Dev. Dyn.，218 :213-234, 2000非專(zhuān)利文獻(xiàn)14 宮崎等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)Vol. 16 No. 16 (增刊)1998年第114-119頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)15 :J. Neurosci.，20 :6517-6528, 2000非專(zhuān)利文獻(xiàn)16 =Physiol. Rev. 85，979-1000，2005非專(zhuān)利文獻(xiàn)17 J. Cell Biol. 114，567-576，1991非專(zhuān)利文獻(xiàn)18 :Cell. 65，599-610，1991非專(zhuān)利文獻(xiàn)19 J. Invest Dermatol. 101，738-743，1993非專(zhuān)利文獻(xiàn)20 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90，11767-11771，1993非專(zhuān)利文獻(xiàn)21 J. Biochem. 116,862-869，1994非專(zhuān)利文獻(xiàn)22 J. Cell Biol. 125，205-214，1994非專(zhuān)利文獻(xiàn)23 :Mol. Biol. Cell. 16，881-890，2005非專(zhuān)利文獻(xiàn)24 =Stem Cell. 24，2346-2354, 2006非專(zhuān)利文獻(xiàn)25 :Dev. Biol. 163 :p. 288-292，1994非專(zhuān)利文獻(xiàn)26 :Dev. Biol. 127 :p. 224-227，1988非專(zhuān)利文獻(xiàn)27 =Reprod. Fertil. Dev. 6 :p. 563-568，1994非專(zhuān)利文獻(xiàn)28 =Reprod. Fertil. Dev. 6 :p. 553-562，1994非專(zhuān)利文獻(xiàn)29 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :p. 7844-7848，1995非專(zhuān)利文獻(xiàn)30 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13726-13731，1998非專(zhuān)利文獻(xiàn)31 =Nature Biotech. , 18, p. 399-404，2000
非專(zhuān)利文獻(xiàn)32非專(zhuān)利文獻(xiàn)33非專(zhuān)利文獻(xiàn)34非專(zhuān)利文獻(xiàn)35非專(zhuān)利文獻(xiàn)36非專(zhuān)利文獻(xiàn)37非專(zhuān)利文獻(xiàn)38非專(zhuān)利文獻(xiàn)39非專(zhuān)利文獻(xiàn)40非專(zhuān)利文獻(xiàn)41非專(zhuān)利文獻(xiàn)42非專(zhuān)利文獻(xiàn)43非專(zhuān)利文獻(xiàn)44非專(zhuān)利文獻(xiàn)45非專(zhuān)利文獻(xiàn)46非專(zhuān)利文獻(xiàn)47非專(zhuān)利文獻(xiàn)48非專(zhuān)利文獻(xiàn)49非專(zhuān)利文獻(xiàn)50非專(zhuān)利文獻(xiàn)51非專(zhuān)利文獻(xiàn)52非專(zhuān)利文獻(xiàn)53非專(zhuān)利文獻(xiàn)M非專(zhuān)利文獻(xiàn)55非專(zhuān)利文獻(xiàn)56非專(zhuān)利文獻(xiàn)57非專(zhuān)利文獻(xiàn)58
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Science 322 :949-953,2008

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于，提供在不使用支持細(xì)胞、血清等動(dòng)物性材料的體系中有效地 增殖多能性干細(xì)胞的技術(shù)。本發(fā)明人等，為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人等通過(guò)利用 胞外基質(zhì)分子中的層粘連蛋白_5，即使不使用支持細(xì)胞和血清，也能使多能性干細(xì)胞在保 持未分化狀態(tài)下進(jìn)行增殖，從而完成了本發(fā)明。由此，為了解決上述課題，本發(fā)明提供了一種增殖多能性干細(xì)胞的方法，所述方法 包括在不含有支持細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基中、且在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)該多能 性干細(xì)胞的工序。本發(fā)明還提供了層粘連蛋白-5作為用于增殖多能性干細(xì)胞的細(xì)胞支持材料的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含用層粘連蛋白-5處理過(guò)的培養(yǎng)容器和血清替代品的多 能性干細(xì)胞的培養(yǎng)用試劑盒。本發(fā)明的優(yōu)選方式包含如下方式。[方式1]一種增殖多能性干細(xì)胞的方法，所述方法包括在不含有支持細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基 中、且在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)該多能性干細(xì)胞的工序。[方式2]根據(jù)方式1所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。[方式3]根據(jù)方式1或方式2所述的方法，其中，所述誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞為人的誘導(dǎo)多能性 干細(xì)胞。[方式4]根據(jù)方式1所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞為選自由胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖 干細(xì)胞和種系干細(xì)胞組成的組中的細(xì)胞。[方式5]根據(jù)方式4所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。[方式6]根據(jù)方式1 方式5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在培養(yǎng)基中含有血清替代品。[方式7]根據(jù)方式6所述的方法，其中，所述血清替代品含有選自由甘氨酸、組氨酸、異亮 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸組 成的組中的1種或多種氨基酸，由硫胺素和/或抗壞血酸組成的維生素，選自由銀、鋁、鋇、 鎘、鈷、鉻、鍺、錳、硅、釩、鉬、鎳、銣、錫和鋯組成的組中的1種或多種微量金屬元素，選自由 溴、碘和氟組成的組中的1種或多種鹵素、以及選自由白蛋白、還原型谷胱甘肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 胰島素和亞硒酸鈉組成的組中的1種或多種成分。[方式8]根據(jù)方式1 方式7中任一項(xiàng)所述的方法，在含有層粘連蛋白-5的基礎(chǔ)上進(jìn)一步 含有其他胞外基質(zhì)蛋白的體系中培養(yǎng)所述多能性干細(xì)胞。[方式9]根據(jù)方式8所述的方法，其中，所述其他胞外基質(zhì)蛋白為膠原蛋白。[方式10]根據(jù)方式1 方式9中任一項(xiàng)所述的方法，其在用層粘連蛋白-5處理過(guò)的培養(yǎng)容 器中培養(yǎng)所述多能性干細(xì)胞。[方式11]根據(jù)方式10所述的方法，其中，所述層粘連蛋白-5為人層粘連蛋白_5。[方式12]根據(jù)方式1 方式11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞在培養(yǎng)中不 發(fā)生分化。
[方式13]層粘連蛋白-5作為用于增殖多能性干細(xì)胞的細(xì)胞支持材料的用途。[方式14]一種多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)用試劑盒，其包含用層粘連蛋白-5處理過(guò)的培養(yǎng)容器 和血清替代品。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，即使不使用支持細(xì)胞和血清，也能夠使多能性干細(xì)胞在維持未分化 狀態(tài)下有效地增殖。


圖1為用SDS聚丙烯酰胺凝膠對(duì)純化后的重組人層粘連蛋白-5進(jìn)行電泳而得到 的圖。另外圖ι右側(cè)的泳道為對(duì)ι μ g的重組人層粘連蛋白-5進(jìn)行電泳而得到的結(jié)果。圖2為比較重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白給對(duì)ES細(xì)胞的粘附效果所 帶來(lái)的效果的圖。圖2的A表示培養(yǎng)30分鐘后進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖2的B表示培養(yǎng)60 分鐘后進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖3為比較在支持細(xì)胞的非存在下胞外基質(zhì)蛋白給ES細(xì)胞的增殖所帶來(lái)的效果 的圖。圖3為增殖檢測(cè)的結(jié)果，圓形標(biāo)識(shí)表示S+G1，菱形標(biāo)識(shí)表示K+Lm5-4，X標(biāo)識(shí)表示 K+Lm5-2,星號(hào)標(biāo)識(shí)表示K+Lm-Mix，小黑方型標(biāo)識(shí)表示K+Mg。圖4為比較在支持細(xì)胞的非存在下胞外基質(zhì)蛋白給ES細(xì)胞的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)所帶 來(lái)的效果的圖。圖4為增殖檢測(cè)的結(jié)果，圓形標(biāo)識(shí)表示S+G1，菱形標(biāo)識(shí)表示K+Lm5-4，X標(biāo) 識(shí)表示K+Lm5-2，三角標(biāo)識(shí)表示K+Lm5-4 — S+G1。圖5所示為在經(jīng)重組人層粘連蛋白-5包被后的培養(yǎng)板中、在無(wú)血清培養(yǎng)基中 長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的ES細(xì)胞的形態(tài)以及將其恢復(fù)至在經(jīng)明膠包被培養(yǎng)板中、在血清培養(yǎng)基 中培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞的形態(tài)的圖。圖5自上而下分別表示S+G1的結(jié)果、K+Lm5-4的結(jié)果、 K+Lm5-4 — S+G1 的結(jié)果。圖6為在添加有KSR的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)對(duì)各培養(yǎng)條件下各種未分化標(biāo)記 的表達(dá)進(jìn)行比較的RT-PCR的圖。圖7所示為將用添加有KSR的培養(yǎng)基培養(yǎng)的ES細(xì)胞在不含有LIF的維持培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的胚狀體的狀態(tài)的圖。圖7的比例尺條為250 μ m。圖8所示為在經(jīng)明膠包被培養(yǎng)板中對(duì)用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)中的ES細(xì) 胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖(實(shí)施例5)。圖8的上段為S+Gl (LIF+)的結(jié)果，下段為 S+Gl (LIF-)的結(jié)果。圖8中的比例尺條為100μπι，1個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為50μπι，2 個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為25 μ m。圖9所示為在經(jīng)明膠包被培養(yǎng)板中、在添加有KSR的無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系 (K+G1)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究 的結(jié)果的圖(實(shí)施例6)。圖9的上段為κ+G1=>S + Gl (LIF+ )的結(jié)果，下段為 K + Gl^S + Gl ( LIF -)的結(jié)果。圖9中的比例尺條為iooym，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表 示比例尺條為25 μ m。圖10所示為在經(jīng)4yg/ml的重組人層粘連蛋白_5包被后的培養(yǎng)板中、在添加有KSR的無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(K+Lm5-4)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體 系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖10的上段為K + Lm5 - 4 馬S + Gl ( LIF + )的結(jié)果，下段為K + Lm5-4馬S + Gl ( LIF -)的結(jié)果。圖
10中的比例尺條為100 μ m, 2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為25 μ m。圖11所示為在經(jīng)2yg/ml的重組人層粘連蛋白_5包被后的培養(yǎng)板中、在添加 有KSR的無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(K+Lm5-2)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng) 體系(S+GI)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖Ii的上段為K+ Lm5 -+ Gl ( LIF + )的結(jié)果，下段為K+Lm5 - 2馬S + Gl ( LIF-)的結(jié)
果。圖11中的比例尺條為100 μ m, 1個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為50 μ m，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示 比例尺條為25 μ m。圖12為在支持細(xì)胞的非存在下使用添加有實(shí)施例6所述的血清代替物的培養(yǎng) 基(培養(yǎng)基Y)進(jìn)行ES細(xì)胞的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，對(duì)胞外基質(zhì)蛋白所帶來(lái)的效果進(jìn)行比較 的圖。圖12為增殖檢測(cè)的結(jié)果，三角標(biāo)識(shí)表示Y+Gl，X標(biāo)識(shí)表示Y+Lm5-4，星號(hào)標(biāo)識(shí)表示 Y+Lm5-2,圓形標(biāo)識(shí)表示K+Lm-Mix，+表示Y+Mg。圖13為在培養(yǎng)基Y中培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)，對(duì)在各培養(yǎng)條件下各種未分化標(biāo)記的表達(dá) 進(jìn)行比較的RT-PCR的圖。圖14所示為在培養(yǎng)基Y中培養(yǎng)ES細(xì)胞后在不含有LIF的維持培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) 時(shí)的胚狀體的狀態(tài)的圖。圖14的比例尺條為250 μ m。圖15所示為在經(jīng)明膠包被培養(yǎng)板中、在用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)中對(duì)ES 細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖(實(shí)施例7)。圖15的上段為S+G1(LIF+)的結(jié)果， 下段為S+Gl (LIF-)的結(jié)果。圖15中的比例尺條為100μπι，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為 25 μ m0圖16所示為在經(jīng)明膠包被培養(yǎng)板中、在添加有KSR的無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系 (K+G1)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究 的結(jié)果的圖(實(shí)施例7)。圖16的上段為κ + Gl與S + Gl ( LIF + )的結(jié)果，下段為 K + Gl^S + Gl ( LIF -)的結(jié)果。圖16中的比例尺條為100μπι，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表 示比例尺條為25 μ m。圖17所示為在經(jīng)明膠包被培養(yǎng)板中、在用培養(yǎng)基Y的培養(yǎng)體系(Y+G1)中培養(yǎng)后， 恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖 17 的上段為Y + GliS + Gl ( LIF + )的結(jié)果，下段為Y + Gl=^S + Gl ( LIF
-)的結(jié)果。圖17中的比例尺條為100 μ m，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為25 μ m。圖18所示為在經(jīng)4μ g/ml的重組人層粘連蛋白_5包被后的培養(yǎng)板中、在用培養(yǎng) 基Y的培養(yǎng)體系(Y+Lm5-4)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì) 胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖18的上段為Y + Lm5 - 4=^S + GK LIF + )的結(jié)果，下段為Y+Lm5-4#S + Gl ( LIF -)的結(jié)果。圖18中的比例尺條為 100 μ m, **表示比例尺條為25 μ m。圖19所示為在經(jīng)2 μ g/ml的重組人層粘連蛋白_5包被后的培養(yǎng)板中、在用培養(yǎng) 基Y的培養(yǎng)體系(Y+Lm5D中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞
的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖19的上段為Y + Lm5 -+ GK LIF+ )的結(jié)果，下段為Y + Lm5 -+ Gl ( LIF -)的結(jié)果。圖19中的比例尺條為
100 μ m，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為25 μ m。圖20所示為在Lm-Mix與培養(yǎng)基Y的培養(yǎng)體系(Y+Lm-Mix)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用 血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖20的上 段為Y +Lm - Mix= S + Gl ( LIF + )的結(jié)果，下段為Y +Lm- Mix= S +
Gl ( LIF -)的結(jié)果。圖20中的比例尺條為100 μ m，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為 25 μ m0圖21所示為在Mg與培養(yǎng)基Y的培養(yǎng)體系(Y+Mg)中培養(yǎng)后，恢復(fù)至用血清培 養(yǎng)基的培養(yǎng)體系(S+G1)，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖21的上段為 Y + Mg馬S + GK LIF+ )的結(jié)果，下段為 Y + Mg^S + Gl ( LIF 一)的結(jié)
果。圖21中的比例尺條為100 μ m，2個(gè)星號(hào)標(biāo)識(shí)表示比例尺條為25 μ m。圖22所示為在飼養(yǎng)細(xì)胞上的人iPS細(xì)胞的形態(tài)的圖。圖22的左側(cè)表示201B2的 形態(tài)，右側(cè)表示201B7的形態(tài)。圖22的比例尺條為1mm。圖23所示為比較重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白給對(duì)人iPS細(xì)胞的粘 附效果所帶來(lái)的影響的粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的圖。圖M所示為粘附實(shí)驗(yàn)中比較重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白給對(duì)人 iPS細(xì)胞的粘附效果所帶來(lái)的影響時(shí)的、細(xì)胞的粘附形態(tài)的圖。圖M的比例尺條為250 μ m。圖25所示為比較重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白對(duì)形成人iPS細(xì)胞的 集落的效果的集落檢測(cè)的結(jié)果的圖。圖25的上段為“單個(gè)”的結(jié)果，下段為“團(tuán)塊”的結(jié)果。圖26A所示為對(duì)于在重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白上由單個(gè)細(xì)胞所 形成的人iPS細(xì)胞的集落是否維持有未分化性進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖26A為以“單個(gè)”進(jìn) 行集落檢測(cè)時(shí)的免疫染色的結(jié)果，比例尺條為250 μ m。圖26B所示為對(duì)于在重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白上由細(xì)胞塊所形 成的人iPS細(xì)胞的集落是否維持有未分化性進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖26B為在“團(tuán)塊”上 進(jìn)行集落檢測(cè)時(shí)的免疫染色的結(jié)果，比例尺條為250 μ m。圖27所示為對(duì)在重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白上所形成的人iPS細(xì) 胞進(jìn)行長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)的、培養(yǎng)5周的人iPS細(xì)胞的形態(tài)的圖。就各個(gè)胞外基質(zhì)而言，比例 尺條在左側(cè)為1mm，比例尺條在右側(cè)為100 μ m。圖28所示為對(duì)在重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白的存在下培養(yǎng)人iPS 細(xì)胞時(shí)的、各種未分化標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖四所示為對(duì)在重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白的存在下培養(yǎng)的人 iPS細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)時(shí)的、人iPS細(xì)胞的形態(tài)的圖。圖四的比例尺條為1mm。圖30所示為對(duì)在重組人層粘連蛋白-5和各種胞外基質(zhì)蛋白的存在下培養(yǎng)的人 iPS細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)時(shí)的、各種分化標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式以下，基于實(shí)施方式詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)。1.增殖多能性干細(xì)胞的方法本發(fā)明提供一種增殖多能性干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方法包括在不含有支持細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基中、且在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)該多能性干細(xì)胞的工序。多能件干細(xì)胞本發(fā)明中所述“多能性干細(xì)胞”，是指具有分化成所有組織的細(xì)胞的能力(分化 多能性)的干細(xì)胞的總稱(chēng)。在本說(shuō)明書(shū)的后述實(shí)施例中使用ES細(xì)胞進(jìn)行了研究，能通過(guò) 本發(fā)明的方法增殖的多能性干細(xì)胞，不僅限于胚胎干細(xì)胞，還包括來(lái)源于哺乳動(dòng)物的成體 臟器或組織的細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、血液細(xì)胞、以及胚或胎兒的細(xì)胞等的、具有與胚胎干細(xì)胞類(lèi) 似的性狀的所有多能性干細(xì)胞。此種情況下，所述與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的性狀，可定義為胚 胎干細(xì)胞中特異的表面(抗原)標(biāo)記的存在或胚胎干細(xì)胞特異的基因的表達(dá)、或畸胎瘤 (teratoma)形成能力等胚胎干細(xì)胞所具有的特異的細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)。并非對(duì)其進(jìn)行限定，作為能夠通過(guò)本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞的具體例，可列舉出 例如，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)、胚胎生殖干細(xì)胞(EG細(xì)胞)、 種系干細(xì)胞(GS細(xì)胞)等。另外，作為本發(fā)明的多能性干細(xì)胞優(yōu)選ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞。根 據(jù)不構(gòu)成倫理性的問(wèn)題等的理由，特別優(yōu)選iPS細(xì)胞。本說(shuō)明書(shū)的“ES細(xì)胞”，是指取得處于發(fā)育初期的、具有分化成構(gòu)成個(gè)體的所有 組織細(xì)胞的能力的多能性干細(xì)胞并株化后的、能夠在體外培養(yǎng)的細(xì)胞。ES細(xì)胞與初期胚中 的多能性干細(xì)胞同樣也能夠在保持分化成構(gòu)成個(gè)體的所有細(xì)胞的能力的狀態(tài)下實(shí)際上無(wú) 限制地增殖。具體而言，ES細(xì)胞中，于1981年首次記載了小鼠的ES細(xì)胞(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78,7634-7638,1981, Nature292，154-156，1981)。ES 細(xì)胞具有分化多能性，能夠 產(chǎn)生構(gòu)成個(gè)體的所有的組織和細(xì)胞類(lèi)型。已從包括大鼠(Iannaconns et al.，Dev. Biol. 163，288-292，1994)、倉(cāng)鼠(Dev. Biol. 127，224-227，1988)、家兔(Mol. R印rod. Dev. 36，424-433，1993)、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、豬 (Reprod. Fertil. Dev. 6，563-568，1994)，牛(R印rod. Fertil. Dev. 6，553-562，1994)、以及 靈長(zhǎng)類(lèi)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92，7844-7848，1995)在內(nèi)的多種多樣的物種中分離獲 得分化多能性胚胎干細(xì)胞。若干研究小組在分離來(lái)自胚性人體組織的ES細(xì)胞和ES細(xì)胞樣干細(xì)胞方面也取 得了成功。初期的成功例如以下所述。(Science 282，1145-1147，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，13726-13731，1998, Nature Biotech.，18，399-404，2000)。通過(guò)在飼養(yǎng)細(xì)胞上 培養(yǎng)從胚泡分離的ICM而建立了這些ES細(xì)胞株。在其他最近的研究中顯示，通過(guò)將胚和成 熟哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的核移植到去核卵母細(xì)胞中能夠獲得胚和胚性細(xì)胞。2006 年，Advanced Cell Technology 公司的 Robert Lanza 等的研究小組，在小 鼠和人的胚盤(pán)中，僅使用胚泡期以前的卵裂期的胚的單卵裂球，在不損害胚的發(fā)育能力的 前提下，成功地建立了 ES 細(xì)胞(Nature 439:216-219,2006，Cell Stem Cell 2，113-117， 2008)。通過(guò)開(kāi)發(fā)該技術(shù)能夠不破壞受精卵地進(jìn)行ES細(xì)胞的建立。同年，紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)的 Miodrag Stojkovic等的研究小組從停止發(fā)育的人胚中成功地建立了 ES細(xì)胞(Stem Cells M，26694676，2006)。由此，因不孕而在治療中被廢棄的過(guò)剩的卵能夠得以使用。此外，2004年芝加哥生殖遺傳學(xué)研究所的Yury Verlinsky等的研究小組成功地 從具有遺傳病的人的胚建立20個(gè)ES細(xì)胞株。這些是可在深刻的遺傳病的治療研究中使用 的最初的ES細(xì)胞。Yury Verlinsky現(xiàn)在還保有另外的基因不同的200株以上的ES細(xì)胞，這些可在藥品的篩選(分選)等中使用。本發(fā)明的方法中能夠使用任意建立的ES細(xì)胞株。有時(shí)，為了防止將通過(guò)本發(fā)明的 方法制成的ES細(xì)胞適用在個(gè)體時(shí)的免疫排斥反應(yīng)，使用個(gè)體的體細(xì)胞制成克隆胚(clone embryos)再依此建立ES細(xì)胞株的方法是有效的。只要使用該方法，就能夠建立與個(gè)體具有 同一遺傳要素的ES細(xì)胞。有時(shí)，在制作體細(xì)胞克隆時(shí)被導(dǎo)入到卵子的體細(xì)胞的核變成與受精卵的核類(lèi)似的 狀態(tài)，認(rèn)為發(fā)生了稱(chēng)之為“再編程(r印rogramming)”的現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，ES細(xì)胞具有與卵子 所具備的此種活性類(lèi)似的活性(Curr. Biol.，11，1553-1558，2001)。即，通過(guò)將個(gè)體的體細(xì) 胞和ES細(xì)胞融合，可期待將體細(xì)胞變換成ES細(xì)胞這樣的細(xì)胞。由于ES細(xì)胞能夠在體外進(jìn) 行基因操作，因此通過(guò)在預(yù)先操作了 MHC基因組等與免疫排斥相關(guān)的因子的ES細(xì)胞中進(jìn)行 上述操作，可以期待不使用制作體細(xì)胞克隆胚等的手法來(lái)回避排斥反應(yīng)。本發(fā)明中，“ES細(xì)胞”優(yōu)選為人的ES細(xì)胞，現(xiàn)在，已建立的人ES細(xì)胞株可從例如京 都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所獲得?；蛘?，ES細(xì)胞還可根據(jù)本說(shuō)明書(shū)中上述各種文獻(xiàn)的記載來(lái)制得。本說(shuō)明書(shū)的“iPS細(xì)胞”是指，通過(guò)向體細(xì)胞中導(dǎo)入0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等 轉(zhuǎn)錄因子的基因而獲得的、具有與ES細(xì)胞類(lèi)似的分化多能性的細(xì)胞。因此，iPS細(xì)胞也與 ES細(xì)胞同樣，能夠在保持分化多能性的狀態(tài)下無(wú)限制地增殖。京都大學(xué)山中伸彌等的研究小組，為了僅分離出從體細(xì)胞變化成ES樣細(xì)胞的細(xì) 胞，而著眼于僅在ES細(xì)胞中表達(dá)、而在維持ES細(xì)胞的分化多能性方面非必要的1^x15這一 基因。使用同源重組技術(shù)在該基因部位導(dǎo)入新霉素耐性基因，在培養(yǎng)基中添加因該耐性基 因而不顯示出毒性的G418，從而構(gòu)建出僅使表達(dá)Fbxl5的ES樣細(xì)胞獲得G418耐性且留存 下來(lái)而通常未表達(dá) ^χ15的體細(xì)胞死滅的實(shí)驗(yàn)體系。使用該實(shí)驗(yàn)體系建立iPS細(xì)胞時(shí)，發(fā) 現(xiàn)采用 0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc4 基因就足夠了(Cell. 126，663-672，2006)。此外，該研究小組還使用了與小鼠iPS細(xì)胞建立中所使用的小鼠基因同源的人 基因即0CT3/4、S0X2、KLF4、C-MYC，成功地從成纖維細(xì)胞建立了人iPS細(xì)胞(Cell. 131， 861-872,2007)。同時(shí)，世界上首次建立人ES細(xì)胞的詹姆斯·湯姆森(James Thomson)等的研究 小組使用了與京都大學(xué)山中伸彌等成功建立小鼠iPS細(xì)胞時(shí)相同的戰(zhàn)略，通過(guò)向胎兒肺來(lái) 源的成纖維細(xì)胞或新生兒包皮來(lái)源的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入0CT3/4、S0X2、NANOG, LIN28這四 種在人ES細(xì)胞中特異地表達(dá)的基因，成功地建立了人iPS細(xì)胞(Science 318:1917-1920， 2007)。此外，2007年12月，京都大學(xué)山中伸彌等的研究小組表示，不導(dǎo)入c-Myc的基因而 僅通過(guò)Oct-4、Sox2、Klf4三個(gè)因子也能夠建立小鼠和人的iPS細(xì)胞，成功地抑制了 iPS細(xì) 胞變化成癌細(xì)胞(Nat. Biotechnol.沈101_106，2008)。幾乎與此同時(shí)，在馬薩諸塞工科大 學(xué)的魯?shù)婪颉ふ材崾?Rudolf Jaenisch)等的研究小組也成功地以小鼠完成了同樣的實(shí)驗(yàn) (Cell Stem Cell 2:10-12,2008)。另外，為了回避致癌等風(fēng)險(xiǎn)，作出了進(jìn)一步減少導(dǎo)入的因子的嘗試。其結(jié)果Max Planck研究所的漢斯 斯科勒(Hans R Scholer)等，在成體小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞中導(dǎo)入2 個(gè)基因即0ct4和Klf4、或者0ct4和c-Myc中的任意一組，從而成功地建立了 iPS細(xì)胞(Nature 454 =646-650,2008) 此外，最近漢斯 斯科勒(Hans R Scholer)等報(bào)道，在從神 經(jīng)干細(xì)胞制作iPS細(xì)胞時(shí)，僅單獨(dú)導(dǎo)入0ct4也是足夠的(Cell 136:411-419,2009)。此外，Sheng Ding等報(bào)道了在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)能夠以低分子對(duì)部分基因進(jìn)行輔助 (Cell Stem Cell 3，568-574，2008)。報(bào)道顯示，通過(guò)利用BIX、BayK這些低分子，僅在小鼠 胚胎性成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入0ct4和Klf4兩個(gè)基因就能夠誘導(dǎo)iPS細(xì)胞。此外，在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)作出了改善基因?qū)敕椒ǖ膰L試。現(xiàn)在廣泛使用的是反 轉(zhuǎn)錄病毒這樣的、導(dǎo)入的基因整合到染色體的可能性高的病毒，據(jù)報(bào)道有使用整合的可能 性低的腺病毒(Science 322，945-949，2008)、質(zhì)粒載體(Science 322，949-953，2008)的 方法。本發(fā)明中，“ iPS細(xì)胞”優(yōu)選為人的iPS細(xì)胞，現(xiàn)在，所建立的人iPS細(xì)胞株，可從例 如京都大學(xué)、理化學(xué)研究所生物資源中心獲得?；蛘?，也可參考以下文獻(xiàn)的記載制作iPS細(xì)胞。例如，誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞可按照 京都大學(xué)山中伸彌教授的研究小組的文獻(xiàn)(Cell 131,861-872, 2007,Nat. Biotechnol. 26， 101-106，2008)，Wisconsin 大學(xué)的 Thomson 的研究小組的文獻(xiàn)(Science 318，1917-1920，
2007)中記載的方法來(lái)制作。具體而言，iPS細(xì)胞可如下制作對(duì)任意的體細(xì)胞導(dǎo)入0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、 Nanog,LIN28中的至少一個(gè)以上基因，檢測(cè)多能性干細(xì)胞的特異的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)，以 對(duì)這些進(jìn)行分選。這樣制作的iPS細(xì)胞，與ES細(xì)胞同樣，能夠在失去增殖活性的小鼠成纖維細(xì)胞或 能夠代替其的細(xì)胞存在下與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一起進(jìn)行培養(yǎng)，并與ES細(xì)胞同樣能 夠用作多能性干細(xì)胞。到目前為止，已明確該iPS細(xì)胞在分化成各種組織的特征方面或在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 基因表達(dá)的特征方面具有與ES細(xì)胞同樣的性狀(Cell. 126,663-672,2006, Cell 131 861-872，2007，Science318,1917-1920，2007)，可直接將ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件或從ES細(xì)胞分 化誘導(dǎo)各種組織的條件應(yīng)用于iPS細(xì)胞(高橋和山中，細(xì)胞工學(xué)，Vol. 27，No. 3,252-253,
2008)。本說(shuō)明書(shū)的“EG細(xì)胞”是指從原始生殖細(xì)胞制作的任意的胚胎生殖干細(xì)胞，其起源 等沒(méi)有特別的限制。此外，本說(shuō)明書(shū)中的“GS細(xì)胞”，是從精巢的生殖細(xì)胞制作的種系干細(xì)胞，其是為了 能夠在體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞(精子干細(xì)胞)而制成的細(xì)胞株(Cell. 119，1001-1012,2004)。 GS細(xì)胞中特別優(yōu)選具有與ES細(xì)胞同樣的性質(zhì)且具有分化多能性的mGS細(xì)胞(multipotent germline stem cell，多能種系干細(xì)胞)。本說(shuō)明書(shū)中記載為“GS細(xì)胞”的情況，根據(jù)上下 文可能意味著mGS細(xì)胞。層粘連蛋白-5本發(fā)明的方法最顯著的特征為在培養(yǎng)多能性干細(xì)胞時(shí)，在含有層粘連蛋白-5的 體系中培養(yǎng)該多能性干細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，對(duì)于大多的細(xì)胞類(lèi)型而言，層粘連蛋白-5與包含其他層粘連蛋白亞型 的各種胞外基質(zhì)蛋白相比表現(xiàn)出較強(qiáng)的粘附活性(J. Biochem. 116，862-869，1994，J. Cell Biol.125,205-214，1994，Mol Biol Cell. 16，881-890，2005)。
如表1所示，層粘連蛋白-5為由α3鏈、β 3鏈、Y 2鏈構(gòu)成的層粘連蛋白分子， 對(duì)表皮與真皮的結(jié)合發(fā)揮出核心的作用，在大部分的細(xì)胞中優(yōu)先與整合蛋白(integrin) α 3β 1結(jié)合，根據(jù)細(xì)胞還與整合蛋白α6β1、α6β4結(jié)合。已解明層粘連蛋白_5的α 3鏈 G2結(jié)構(gòu)域的α 3G2A序列(RERFNISTPAFRGCMKNLKKTS)、G3結(jié)構(gòu)域的KRD序列為對(duì)整合蛋白 的主要的結(jié)合部位。此外，據(jù)了解，層粘連蛋白-5作為三聚體被分泌后，受到蛋白酶的限制性水解 (limited degradation)，從而除去存在于α 3鏈C末端的G4和G5結(jié)構(gòu)域，從190kDa (非 剪切型)轉(zhuǎn)換為160kDa(剪切型)。用通常的方法分離的層粘連蛋白-5不存在G4、G5結(jié) 構(gòu)域。據(jù)了解，這種α3鏈剪切型層粘連蛋白-5與非剪切型層粘連蛋白-5相比，具有高 的細(xì)胞粘附促進(jìn)活性、運(yùn)動(dòng)促進(jìn)活性、和神經(jīng)再生促進(jìn)活性(J. Biol. Chem. ,280(2005), 14370-14377)。本發(fā)明的層粘連蛋白_5，沒(méi)有特別的限制，可以為含有G4和G5結(jié)構(gòu)域狀態(tài)的非剪 切型，或者也可為除去G4和G5結(jié)構(gòu)域全部或部分的剪切型。此外，層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)可以為天然型，或者也可為保持其生物學(xué)的活性、尤 其是細(xì)胞粘附促進(jìn)活性的狀態(tài)下的、1個(gè)以上的氨基酸殘基被修飾后的修飾型。此外，本發(fā) 明的層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)只要具有本說(shuō)明書(shū)記載的特征即可，其起源、制法等不受限制。 即，本發(fā)明的層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)可以為由天然產(chǎn)的蛋白質(zhì)、通過(guò)基因工程的手法得到的 重組DNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)、或者化學(xué)合成蛋白質(zhì)的任一種。層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)的來(lái)源沒(méi)有特別的限制，優(yōu)選為人來(lái)源的蛋白質(zhì)。在為了獲 得再生醫(yī)療材料等而培養(yǎng)人多能性干細(xì)胞時(shí)，從避免使用來(lái)源于其他動(dòng)物的材料的意義來(lái) 看，優(yōu)選使用人來(lái)源的層粘連蛋白_5。本說(shuō)明書(shū)中的序列表的序列號(hào)1 6表示人層粘連蛋白-5的α 3鏈、β 3鏈和、2 鏈的堿基序列和氨基酸序列。本發(fā)明中使用的層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)，優(yōu)選為由下述的α 3 鏈、β 3鏈和Y 2鏈的各亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)所述α 3鏈為具有序列號(hào)2的氨基酸序列或 該序列中1個(gè)以上的氨基酸缺失、附加、或置換的氨基酸序列(氨基酸殘基No. I-No. 1713) (J. Biol. Chem. 269,22779-22787，1994)；所述β 3鏈為具有序列號(hào)4的氨基酸序列或該 序列中1個(gè)以上的氨基酸缺失、附加、或置換的氨基酸序列(氨基酸殘基No. I-No. 1170) (J.Biol· Chem. 269，11073-11080，1994)；及，所述Y 2鏈為具有序列號(hào)6的氨基酸序列或 該序列中1個(gè)以上的氨基酸缺失、附加、或置換的氨基酸序列(氨基酸殘基No. I-No. 1193) (J.Cell. Biol. 119,679—693，1992)。α 3鏈的球狀結(jié)構(gòu)域(G1-G5結(jié)構(gòu)域)分別相當(dāng)于序列號(hào)1的氨基酸 殘基 No. 794-Νο. 970、No. 971-Νο. 1139、No. 1140-No. 1353、No. 1354-No. 1529 禾P No.1530-No. 1713。層粘連蛋白-5的各鏈為具有對(duì)應(yīng)序列號(hào)表示的氨基酸序列中缺失、附加、或置換 1個(gè)以上的氨基酸殘基的氨基酸序列。這種具有與天然的蛋白質(zhì)同源的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)也可在本發(fā)明中使用。在α 3鏈、β 3鏈和Y 2鏈的各氨基酸序列中，可變更的氨基酸數(shù) 并沒(méi)有限定，優(yōu)選為1 300個(gè)氨基酸殘基、1 200個(gè)氨基酸殘基、1 150個(gè)氨基酸殘基、 1 120個(gè)氨基酸殘基、1 100個(gè)氨基酸殘基、1 80個(gè)氨基酸殘基、1 50個(gè)氨基酸殘 基、1 30個(gè)氨基酸殘基、1 20個(gè)氨基酸殘基、1 15個(gè)氨基酸殘基、1 10個(gè)氨基酸殘基、1 5個(gè)氨基酸殘基。更優(yōu)選為能夠通過(guò)公知的定點(diǎn)突變法修飾的數(shù)個(gè)氨基酸殘基，例 如，1 10個(gè)氨基酸殘基、1 5個(gè)氨基酸殘基。眾所周知，在本技術(shù)領(lǐng)域中通過(guò)進(jìn)行氨基酸的保守置換能夠獲得保持原有功能的 蛋白質(zhì)或多肽。此種置換包括用具有類(lèi)似的物理化學(xué)特性的殘基置換氨基酸，例如，用其 他殘基置換1個(gè)脂肪酸殘基(Ile、Val、LeU或Ala)；或者在堿性殘基Lys和Arg、酸性殘基 Glu和Asp、酰胺殘基Gln和Asn、羥基殘基Ser和Tyr、或芳香族殘基Phe和Tyr之間進(jìn)行置換。此外，本發(fā)明中使用的層粘連蛋白-5可以為與序列號(hào)2、4、6所記載的氨基酸序列 具有至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %或99 %的同源性，且能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附活性的蛋白 質(zhì)。對(duì)層粘連蛋白-5與層粘連蛋白-1的構(gòu)成亞基的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(shí)，各亞基間的氨基酸 序列的同源性為50%以下。尤其上述的α鏈的G結(jié)構(gòu)域的同源性低，為約25%。同源性通過(guò)相同殘基的數(shù)目除以已知的序列或已知序列結(jié)構(gòu)域中的殘基的總 數(shù)再乘以100來(lái)計(jì)算。使用標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)來(lái)決定序列的同源性的計(jì)算機(jī)程序，可利用例 如 Gapped BLAS T PSI-BLAST(Nucleic Acids Res. 25，3389-340，1997)、BLAST(J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)、和 Smith-Waterman (J. Mol. Biol. 147 :195-197,1981)。優(yōu)選使 用這些程序的默認(rèn)設(shè)定，但可根據(jù)要求改變這些設(shè)定。本發(fā)明的層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)除了具有本說(shuō)明書(shū)記載的特征外，其起源、制法等 不受限制。即，本發(fā)明的層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)可以為分泌層粘連蛋白-5的人或動(dòng)物細(xì)胞 的培養(yǎng)液上清、或從該培養(yǎng)上清純化得到的天然型層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)。然而通過(guò)使用本 技術(shù)領(lǐng)域中已知的重組DNA技術(shù)來(lái)表達(dá)各亞基從而能夠有效地制造作為基因重組蛋白質(zhì) 的層粘連蛋白_5。然而從避免不必要的動(dòng)物性因子的意義出發(fā)，特別優(yōu)選獲得的層粘連蛋 白-5為人重組蛋白質(zhì)?；诎幋a層粘連蛋白-5 α 3鏈的序列號(hào)1的核酸殘基No. I-No. 5139的DNA 序列、編碼β 3鏈的序列號(hào)3的核酸殘基No. 121-Νο. 3630及編碼、2鏈的序列號(hào)5的核酸 殘基No. 118-Νο. 3696的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，以適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)作為模板，通過(guò)聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)序列，從而可以制造層粘連蛋白_5。此種PCR手法為本技術(shù)領(lǐng)域中所 廣泛知曉的手法，記載于例如“PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications，，， Academic Press, Michael, et al.,1990，，。將編碼層粘連蛋白-5的各鏈基因的DNA引入適當(dāng)?shù)妮d體中，使用可在各種宿主中 表達(dá)的表達(dá)載體將其導(dǎo)入真核生物或原核生物細(xì)胞的任一者中，使其表達(dá)各個(gè)鏈，從而得 到所期望的蛋白質(zhì)。能夠用于表達(dá)層粘連蛋白-5的宿主細(xì)胞，沒(méi)有特別的限制，可列舉出 大腸桿菌、枯草桿菌等原核宿主細(xì)胞，以及酵母、真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核生物 宿主。另外，特別優(yōu)選以下述的實(shí)施例中所使用的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293作為宿主細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微 注射(direct microinjection)等能夠?qū)楸磉_(dá)層粘連蛋白_5而構(gòu)建的載體導(dǎo)入上述宿 主細(xì)胞中。使含有載體的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)，產(chǎn)生本發(fā)明中使用的層粘連蛋白-5 蛋白質(zhì)，從細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化，從而獲得層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)。純化通過(guò)使用尺寸排 阻色譜法(size exclusion chromatography)、HPLC、離子交換色譜法、和免疫親和色譜法 (immunoaffinity chromatography) ^jftiH^T °
對(duì)于層粘連蛋白-5，在日本特開(kāi)2001-172196中有詳細(xì)的記載，援引于本說(shuō)明書(shū)中。增殖多能件干細(xì)胞的方法本發(fā)明中，在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)多能性干細(xì)胞。本發(fā)明中“含有 層粘連蛋白-5的體系”，是指在多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)體系中以任意的狀態(tài)含有層粘連蛋 白-5，其方式?jīng)]有特別的限制。本發(fā)明中，為了在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)多能性干細(xì)胞，優(yōu)選的方式為 使用用層粘連蛋白-5處理后的培養(yǎng)容器。但并非限定于此，本發(fā)明的“含有層粘連蛋白-5 的體系”還包括為了培養(yǎng)多能性干細(xì)胞而在培養(yǎng)基中添加層粘連蛋白-5的方式等。此外，本發(fā)明中“用層粘連蛋白-5處理后的培養(yǎng)容器”，是指對(duì)其表面實(shí)施層粘連 蛋白-5包被等處理的培養(yǎng)容器。此外本發(fā)明的“培養(yǎng)容器”，沒(méi)有特別的限制，為了防止細(xì) 菌的混入可使用滅菌處理后的、且適合于培養(yǎng)細(xì)胞的任意材料、任意形狀的容器。作為此種 培養(yǎng)容器的例子，可列舉出本技術(shù)領(lǐng)域中一般使用的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)燒瓶、培養(yǎng)盤(pán)、96孔板、48 孔板、12孔板、6孔板、4孔板等培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等，但并不限定于此。對(duì)培養(yǎng)容器的表面用層 粘連蛋白包被的處理技術(shù)，為本技術(shù)領(lǐng)域公知的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員，可根據(jù)本發(fā)明的目 的而采用任意的培養(yǎng)容器并將該容器用層粘連蛋白-5進(jìn)行處理，使用層粘連蛋白-5處理 后的該容器用于通過(guò)本發(fā)明的方法培養(yǎng)多能性干細(xì)胞。處理培養(yǎng)容器時(shí)所使用的層粘連蛋白-5的量，沒(méi)有特別的限制。優(yōu)選的是，在以 0. 05 μ g/ml以上、優(yōu)選0. 5 15 μ g/ml、更優(yōu)選3. 75 μ g/ml 15 μ g/ml的層粘連蛋白_5 溶液進(jìn)行處理時(shí)，能夠獲得良好的結(jié)果。如本說(shuō)明書(shū)中后述的下述實(shí)施例所述，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，對(duì)于小鼠ES細(xì)胞，重組 人層粘連蛋白-5與Matrigel、層粘連蛋白混合物或其他胞外基質(zhì)蛋白相比，表現(xiàn)出較強(qiáng)的 粘附活性，從而完成了本發(fā)明。此外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中能夠用LIF和無(wú)血清培養(yǎng)基用以重組 人層粘連蛋白-5包被后的培養(yǎng)板在MEF非存在下維持培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞。在MEF非存在下 的小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)以往在用以明膠包被后的培養(yǎng)板在胎牛血清(FBQ存在下進(jìn)行。采 用本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，小鼠ES細(xì)胞在不存在MEF和FBS的條件下也能表現(xiàn)出與通常 法同等的增殖，進(jìn)而還可以確認(rèn)維持其未分化性。此外，采用本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，還 維持了其分化多能性。此外，還進(jìn)行了人iPS細(xì)胞的研究，結(jié)果如下述的實(shí)施例所示，對(duì)于人iPS細(xì)胞，重 組人層粘連蛋白-5也表現(xiàn)出較強(qiáng)的粘附活性。此外，用以重組人層粘連蛋白-5包被后的 培養(yǎng)板培養(yǎng)人iPS細(xì)胞時(shí)，在無(wú)血清的條件下形成集落，從而能夠進(jìn)行維持培養(yǎng)。進(jìn)而，通 過(guò)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞維持了未分化性。因此，本申請(qǐng)發(fā)明的方法包括在不含有支持細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能性細(xì) 胞的工序。更優(yōu)選在不含有人以外的動(dòng)物性來(lái)源的物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。關(guān)于人ES細(xì)胞，過(guò)去作為代替MEF的支持材料，嘗試了 Matrigel、纖連蛋白、層 粘連蛋白_1、1型膠原蛋白、4型膠原蛋白等多種胞外基質(zhì)蛋白，其粘附活性均為數(shù)％以下 (Stem Cell. 24,2649-2660,2006)。本發(fā)明中，通過(guò)在細(xì)胞粘附效率極差的、多能性干細(xì)胞， 例如人ES細(xì)胞或人iPS細(xì)胞的維持培養(yǎng)中利用層粘連蛋白-5的較強(qiáng)的粘附活性，能夠改 善在MEF非存在下的粘附效率和增殖效率。此外，為了將人ES細(xì)胞或人iPS細(xì)胞利用于再生醫(yī)療，作為構(gòu)建完全不含有動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)的培養(yǎng)體系的材料，重組人層粘連蛋白-5是 有用的。這樣，本發(fā)明中，通過(guò)用層粘連蛋白-5進(jìn)行處理，多能性干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)容器的細(xì) 胞粘附效率提高，即使不使用通常在多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)中所需的支持細(xì)胞，也能夠有效 地增殖該細(xì)胞。本說(shuō)明書(shū)中的“支持細(xì)胞(飼養(yǎng)細(xì)胞)”，是指為了達(dá)到使多能性干細(xì)胞發(fā)生增殖 或分化的目的而調(diào)整培養(yǎng)條件時(shí)所使用的發(fā)揮輔助作用的其他細(xì)胞。在ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞 等多能性細(xì)胞的情況下，采用以往的一般方法，使用小鼠來(lái)源的初代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞作為 支持細(xì)胞，從而由該支持細(xì)胞向多能性細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物，因此使細(xì)胞的培養(yǎng)成 為可能。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)層粘連蛋白-5的強(qiáng)力的粘附效率，即使不使用所述支持細(xì)胞，也 能夠培養(yǎng)ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞。此外，本發(fā)明中“支持材料”是指為了輔助細(xì)胞的增殖而使用的蛋白質(zhì)性的因子， 本發(fā)明中使用層粘連蛋白-5作為支持材料。如下述的實(shí)施例中所示，層粘連蛋白-5與各 種胞外基質(zhì)相比，具有較高的粘附能力，作為多能性干細(xì)胞的支持材料是優(yōu)異的。此外，本發(fā)明中多能性干細(xì)胞的“分化”，是指喪失具有分化成所有組織的潛在能 力即喪失分化多能性，變成具有構(gòu)成特定組織的細(xì)胞的性狀。例如可通過(guò)測(cè)定Ecatl、ERaS、 Nanog, 0ct4、RexU Sox2, Utfl等多能性干細(xì)胞的未分化標(biāo)記，評(píng)價(jià)培養(yǎng)中的多能性干細(xì)胞 是否未發(fā)生分化。如下述的實(shí)施例3、4所示，評(píng)價(jià)由本發(fā)明的方法培養(yǎng)的ES細(xì)胞的傳代導(dǎo) 致的分化，結(jié)果顯示，進(jìn)行10次以上傳代培養(yǎng)也未發(fā)生分化，保持了未分化狀態(tài)。此外，如 下述實(shí)施例5所示，通過(guò)由本發(fā)明的方法培養(yǎng)的ES細(xì)胞的傳代評(píng)價(jià)了分化多能性的維持， 結(jié)果仍顯示，即使進(jìn)行傳代也維持了分化多能性。此外，如下述實(shí)施例11所示，由本發(fā)明的方法培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞，進(jìn)行5周傳代培 養(yǎng)也未發(fā)生分化，保持了未分化狀態(tài)。此外，如下述實(shí)施例12所示，對(duì)本發(fā)明培養(yǎng)的人iPS 細(xì)胞還能夠誘導(dǎo)分化。本發(fā)明的一個(gè)方式中，可通過(guò)在培養(yǎng)容器的內(nèi)部表面包被層粘連蛋白-5后進(jìn)行 干燥等，用層粘連蛋白-5處理培養(yǎng)容器。在層粘連蛋白-5處理后的培養(yǎng)容器中裝入在 GMEM、DMEM等多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)中一般使用的培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中添加多能性干細(xì)胞。 接著，在公知的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，例如在37°C、5%二氧化碳?xì)庀鄺l件下等進(jìn)行該多能性 干細(xì)胞的培養(yǎng)，但這并非是進(jìn)行限定。本發(fā)明的優(yōu)選的一個(gè)方式中，進(jìn)一步優(yōu)選，除了含有層粘連蛋白-5的體系外，還 在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)奶砑游?。添加物?yōu)選為血清以外的添加物，更優(yōu)選不含有人以外的 動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)。并非對(duì)其進(jìn)行限定，添加物的一個(gè)例子為血清替代品。血清替代品是指，使其含有 與血清類(lèi)似的成分而構(gòu)成的人工的液體組合物，通過(guò)添加該血清替代品，即使在血清不存 在的情況下也能夠增殖細(xì)胞。另外，作為血清替代品的一個(gè)例子，可使用添加有各種氨基 酸、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、維生素、白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗氧化成分的血清替代品。各種氨基酸包 括例如，甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酸、L-苯丙 氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-蛋氨酸、 L-脯氨酸、L-羥基脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等。無(wú)機(jī)鹽類(lèi)包括例如 AgN03、AlCl3 · 6H20、Ba (C2H3O2) 2、CdSO4 · 8H20、CoCl2 · 6H20、Cr2 (SO4) 3 · IH2O, GeO2, Na2Se03、H2Se03、KBr、ΚΙ、MnCl2 · 4H20、NaF、Na2SiO3 · 9H20、NaVO3, (NH4)6Mo7O24 · 4H20、 NiSO4 · 6H20、RbCl、SnCl2, ZrOCl2 · 8H20及亞硒酸鈉等。維生素包括例如硫胺素、抗壞血酸 等?？寡趸煞职ɡ邕€原型谷胱甘肽等。此外，KNOCKOUT 血清替代品(KSR)為hvitrogen公司市售的ES細(xì)胞用血清替 代品。如下述實(shí)施例3和實(shí)施例4那樣，本發(fā)明的優(yōu)選的方式為在培養(yǎng)基中添加10%左右 的KSR，并在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能性干細(xì)胞。此外，使用下述實(shí)施例6所示組成的血清替代品也是本發(fā)明的優(yōu)選方式。實(shí)施例 6中公開(kāi)了包含甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸等氨基酸，硫胺素、抗壞血酸等維生素，銀、鋁、鋇、鎘、鈷、 鉻、鍺、錳、硅、釩、鉬、鎳、銣、錫、鋯等微量金屬元素，溴、碘、和氟等鹵素，以及，白蛋白、還原 型谷胱甘肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞硒酸鈉等成分的血清替代品的組成。然而，構(gòu)成本發(fā)明的 血清替代品的成分，不限定于這些，可施加各種改變，如用類(lèi)似的其他成分置換等。此外，血 清替代品所含有的各成分的含量也不限定為實(shí)施例6所記載的內(nèi)容，可根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)、 實(shí)驗(yàn)的目的而進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。作為添加物，只要是與KSR同樣的成分和發(fā)揮同樣的功能的添加物即可。2.層粘連蛋白-5作為細(xì)胞支持材料的用涂本發(fā)明還涉及層粘連蛋白-5作為用于增殖多能性干細(xì)胞的細(xì)胞支持材料的用 途。如前所述那樣，層粘連蛋白-5由于在細(xì)胞粘附中具有強(qiáng)力的作用，因此在不含有支持 細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能性干細(xì)胞時(shí)層粘連蛋白-5是有用的。3.多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)用試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含用層粘連蛋白-5處理后的培養(yǎng)容器和血清替代品的多能 性干細(xì)胞的培養(yǎng)用試劑盒。血清替代品優(yōu)選為KNOCKOUT 血清替代品(KSI )。有時(shí)，也可 利用實(shí)施例6所示組成的血清替代品。除此以外，該試劑盒可包含GMEM、DMEM等多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。并且， 若必要時(shí)，該試劑盒還可進(jìn)一步包含細(xì)胞培養(yǎng)所需的其他添加物、應(yīng)培養(yǎng)的多能性干細(xì)胞。 作為所述添加物的例子，可列舉出非必需氨基酸、丙酮酸鈉、巰基乙醇或抗生素?？梢源朔N 試劑盒作為1個(gè)包裝體構(gòu)成試劑盒，或者也可僅將需要低溫保存的多能性干細(xì)胞分開(kāi)包裝 從而制成的多個(gè)包裝體形式的試劑盒。實(shí)施例以下，基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1重組人層粘連蛋白_5(rLm5)的調(diào)制本實(shí)施例中按照公知的方法調(diào)制重組人層粘連蛋白-5蛋白質(zhì)。將從導(dǎo)入了 α 3鏈(序列號(hào)1)、β 3鏈(序列號(hào)3)、Y 2鏈(序列號(hào)5)的cDNA 的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293(Lm 5-HEK293)回收的無(wú)血清培養(yǎng)上清在4°C、3000rpm下離心 5分鐘。人胎兒腎細(xì)胞株HEK293按照J(rèn). Biochem. 132,607-612(2002)而獲得。接著，加 入到！feparin sepharose CL-6B (GE healthcare)中，并進(jìn)行洗脫。將含rLm5的級(jí)分通過(guò) 使Protein A sepharose CL-6B (GE healthcare)共價(jià)結(jié)合有小鼠抗Lm-α 3 (抗層粘連蛋 白單克隆抗體(BG5)的抗體柱，接著進(jìn)行洗脫。另外，單克隆抗體BG5為本發(fā)明人等用層粘連蛋白-α IBB鏈N末端片段為抗原按照公知的單克隆抗體制作方法制成的抗體。Hlyg的純化rLm5在還原條件下變性后，使用5 20 %凝膠通過(guò)SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳確認(rèn)了 α 3鏈、β 3鏈、γ 2鏈的大小、純度，結(jié)果可確認(rèn)出分別為160kDa、135kDa、 105kDa的區(qū)帶(band)。圖1中示出對(duì)純化rLm5進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照 片。使用CS-Analyzer進(jìn)行解析的結(jié)果，純化rLm5的純度為約98%。在以下的實(shí)施例 中使用上述那樣調(diào)制出的rLm5。實(shí)施例2使用了小鼠ES細(xì)胞株EB3的粘附實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例中示出了在使用各種細(xì)胞支持材料的情況下使用了小鼠ES細(xì)胞株EB3 的粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用添加有10%胎牛血清(FBS)、0. ImM非必需氨基酸(Gibco)、ImM丙酮酸鈉 (Gibco) U000U/ml ESGRO(Chemicon)及 1(Γ4Μ 2-巰基乙醇(WAKO)的 GMEM(SIGMA)作為小 鼠ES細(xì)胞株即EB3細(xì)胞的維持培養(yǎng)基。EB3細(xì)胞接受由大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)系研究科未來(lái)醫(yī)療開(kāi) 發(fā)專(zhuān)業(yè)G6分子治療學(xué)講座干細(xì)胞控制領(lǐng)域提供的EB3細(xì)胞。粘附實(shí)驗(yàn)中使用了未添加FBS的與維持培養(yǎng)基同樣組成的無(wú)血清培養(yǎng)基。作為細(xì) 胞支持材料，使用牛明膠(SIGMA)、rLm5、Matrigel (注冊(cè)商標(biāo)，BD)、人玻連蛋白(SIGMA)、 人IV型膠原蛋白(BD)、人纖連蛋白(BD)、人層粘連蛋白-2 (Chemicon)及人層粘連蛋白 (SIGMA)。而且，按下述那樣制作用各種細(xì)胞支持材料進(jìn)行處理后的培養(yǎng)板，對(duì)各細(xì)胞支持 材料進(jìn)行了粘附實(shí)驗(yàn)。用調(diào)整濃度后的各種胞外基質(zhì)蛋白處理96孔板(Corning)，用1. 2 % BSA(SIGMA)溶液在37°C下封閉處理1小時(shí)。將各種胞外基質(zhì)蛋白的濃度調(diào)制成明膠 (Gl) 1. 5mg/ml、層粘連蛋白 _2 (Lm2) 3. 75 μ g/ml、層粘連蛋白混合物(Lm-Mix) 3. 75 μ g/ ml、Matrigel (Mg) 150 μ g/ml、膠原蛋白(Co) 15 μ g/ml、纖連蛋白 0 ) 15 μ g/ml、玻連蛋白 (Vn) 15 μ g/ml。此外，rLm5 (Lm5)調(diào)制成 3. 75 μ g/ml、7. 5 μ g/ml 及 15 μ g/ml 的 3 個(gè)等級(jí) 的2倍稀釋系列。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌EB3細(xì)胞后，以30000個(gè)/孔接種到培養(yǎng)板上，在37 °C、5 % C02、95%空氣的氣相條件下培養(yǎng)30分鐘及60分鐘。培養(yǎng)后，用渦旋混合器(vortex mixer) 輕微振蕩，使粘附弱的細(xì)胞從培養(yǎng)板表面浮起，用Percoll(GE healthcare)處理除去該細(xì) 胞。將粘附的細(xì)胞用25%戊二醛(Nacalai)固定化，用2. 5%結(jié)晶紫(Nacalai)染色，比較 相對(duì)細(xì)胞數(shù)。圖2示出通過(guò)在培養(yǎng)30分鐘及60分鐘后測(cè)定0D595來(lái)評(píng)價(jià)各種胞外基質(zhì)蛋白給 EB3細(xì)胞的粘附所帶來(lái)的影響的結(jié)果。由圖2的結(jié)果可知，rLm5與包括Lm-Mix在內(nèi)的其他 各種胞外基質(zhì)蛋白相比，表現(xiàn)出對(duì)EB3細(xì)胞較強(qiáng)的粘附活性。另外，在粘附效率差的人ES細(xì)胞中，使用EHS來(lái)源層粘連蛋白時(shí)的粘附效率不足 1 %，在現(xiàn)在最廣泛使用的Matrigel (50 60 % EHS來(lái)源層粘連蛋白、30 % IV型膠原蛋白、 10%巢蛋白)中，粘附效率也只有3%。在本實(shí)施例中，使用小鼠ES細(xì)胞時(shí)，與以EHS層粘 連蛋白為主要構(gòu)成成分的Matrigel、層粘連蛋白-2、大量含有層粘連蛋白-10/11的胎盤(pán)來(lái) 源的層粘連蛋白(Lm-Mix)相比，顯示出更強(qiáng)的粘附活性。這認(rèn)為是本發(fā)明中使用的層粘連 蛋白-5的顯著的效果。
實(shí)施例3使用了小鼠ES細(xì)胞株EB3的增殖檢測(cè)本實(shí)施例中示出使用各種細(xì)胞支持材料時(shí)使用了小鼠ES細(xì)胞株EB3的增殖檢測(cè) 的結(jié)果。EB3細(xì)胞的維持培養(yǎng)基使用與實(shí)施例2相同的培養(yǎng)基。在增殖檢測(cè)中使用添加了 10% KNOCKOUT 血清替代品(KSR) (Invitrogen)的培養(yǎng)基(KSR-GMEM)來(lái)代替 10% FBS0 在用調(diào)整濃度后的各種胞外基質(zhì)蛋白處理后的12孔板(NUNC)上，以40000個(gè)/孔接種EB3 細(xì)胞。在37°C、5% C02、95%空氣的氣相條件下培養(yǎng)2天后，通過(guò)酶處理回收細(xì)胞，用計(jì)數(shù) 板計(jì)量細(xì)胞數(shù)。再次，在用濃度調(diào)整后的各種胞外基質(zhì)蛋白處理后的12孔板上以40000個(gè)/孔 接種EB3細(xì)胞。通過(guò)重復(fù)該操作，比較各種胞外基質(zhì)對(duì)EB3細(xì)胞的增殖效果。作為培養(yǎng)基 使用維持培養(yǎng)基⑶和KSR-GMEM(K)。細(xì)胞支持材料分別調(diào)制成lmg/ml的Gl、4y g/ml的 rLm5 (Lm5_4)、2 μ g/ml 的 rLm5 (Lm5_2)、4 μ g/ml 的 Lm-Miχ> 150 μ g/ml 的 Mg。此夕卜在該實(shí) 驗(yàn)區(qū)內(nèi)，使用預(yù)先以KSR-GMEM數(shù)次傳代培養(yǎng)而馴化的EB3細(xì)胞。圖3示出對(duì)在支持細(xì)胞的非存在下在維持培養(yǎng)基⑶或KSR-GMEM(K)中培養(yǎng)時(shí)各 種胞外基質(zhì)給EB3細(xì)胞的增殖所帶來(lái)的效果進(jìn)行研究的結(jié)果。由圖3的結(jié)果可確認(rèn)，在起 初的2 3次的傳代中，K+Lm-Mix和K+Mg與其他實(shí)驗(yàn)區(qū)相比，增殖遲緩。因此，對(duì)于K+Lm-Mix和K+Mg以外的實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)一步持續(xù)傳代。對(duì)胞外基質(zhì)在支持細(xì) 胞的非存在下對(duì)于EB3細(xì)胞的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖所帶來(lái)的效果進(jìn)行了研究。圖4 示出理論上計(jì)算出最終細(xì)胞增殖為幾倍的結(jié)果。由圖4的結(jié)果可知，rLm5表現(xiàn)出與以往作 為ES細(xì)胞的維持培養(yǎng)體系而廣泛使用的對(duì)照區(qū)(S+G1)同樣的對(duì)于EB3細(xì)胞的增殖效果。圖5示出在維持培養(yǎng)的體系(S+G1)、rLm5的體系(K+Lm5)、及從rLm5恢復(fù)至維 持培養(yǎng)體系的體系(K+Lm5-4 — S+G1)中長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的EB3細(xì)胞的形態(tài)。如圖5所示， K+Lm5的實(shí)驗(yàn)區(qū)的形態(tài)漸漸地變化為上皮細(xì)胞樣，當(dāng)恢復(fù)至通常的維持培養(yǎng)的體系時(shí)可確 認(rèn)到(K+Lm5-4 — S+G1)再度形成集落。一般認(rèn)為未分化的ES細(xì)胞形成集落，由上述結(jié)果 得出如下啟示通過(guò)在K+Lm5的實(shí)驗(yàn)條件下長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，即使EB3細(xì)胞的形態(tài)變成上皮細(xì) 胞樣，也能夠保持未分化性。實(shí)施例4未分化性標(biāo)記的檢測(cè)本實(shí)施例中，對(duì)已知的小鼠ES細(xì)胞未分化標(biāo)記Ecatl、ERas, Nanog、0ct4、RexU Sox2、Utfl的基因用RT-PCR來(lái)測(cè)定這些未分化標(biāo)記，從而研究了 rLm5是否對(duì)于EB3細(xì)胞 具有維持未分化性的效果。使用TRIZOL (Invitrogen)從實(shí)施例3中傳代10次以上而培養(yǎng)的EB3細(xì)胞中提取 總RNA。提取后，使用Thermo Script RT-PCR System(Invitrogen)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 CDNA0以合成的cDNA為模板使用表2所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。各基因的變性反應(yīng)在94°C 下進(jìn)行30秒，退火反應(yīng)進(jìn)行30秒，伸長(zhǎng)反應(yīng)在72°C下進(jìn)行20秒。有關(guān)退火反應(yīng)，Ecatl在 64°C的溫度下進(jìn)行，Eras、0ct4、Utfl在61°C的溫度下進(jìn)行，Rexl在59°C的溫度下進(jìn)行， Nanog、Sox2在的溫度下進(jìn)行。圖6示出在各培養(yǎng)下對(duì)各種未分化標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行研究的結(jié)果。由該結(jié)果可 知，與通常能夠維持的實(shí)驗(yàn)條件(S+G1)同樣，在rLm5包被且用KSR培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件下 (K+Lm5-4,K+Lm5-2),EB3細(xì)胞也表達(dá)出所解析的所有未分化標(biāo)記。此外，可見(jiàn)，當(dāng)恢復(fù)至通常的維持培養(yǎng)的體系(K+Lm5-4 —S+G1)時(shí)，這些未分化標(biāo)記的表達(dá)恢復(fù)至與用通常的維持 培養(yǎng)體系(S+G1)持續(xù)培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有區(qū)別的程度。綜上得出如下啟示即使用K+Lm5傳代培養(yǎng) 10次以上，EB3細(xì)胞也能夠維持未分化性。表2 RT-PCR 引物_Ecatl5，-TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT-3，(序列號(hào) 7)5，-ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT-3，(序列號(hào) 8)ERas5，-ACTGCCCCTCATCAGACTGCTACT-3，(序列號(hào) 9)5，-CACTGCCTTGTACTCGGGTAGCTG-3，(序列號(hào) 10)Nanog5，-AAGCAGAAGATGCGGACTGT-3，(序列號(hào) 11)5，-ACCACTGGTTTTTCTGCCAC-3，(序列號(hào) 12)0ct45，-TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC-3，(序列號(hào) 13)5，-TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC-3，(序列號(hào) 14)Rexl5，-ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA-3，(序列號(hào) 15)5，-TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT-3，(序列號(hào) 16)Sox25，-TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA-3，(序列號(hào) 17)5，-TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA-3，(序列號(hào) 18)Utfl5，-GGATGTCCCGGTGACTACGTCTG-3，(序列號(hào) 19)5，-GGCGGATCTGGTTATCGAAGGGT-3，(序列號(hào) 2O)Gapdh5，-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3，(序列號(hào) 21)5，-GACGGACACATTGGGGGTAG-3，(序列號(hào) 22)實(shí)施例5分化成3胚層系的分化能力的研究本實(shí)施例中示出對(duì)使用各種細(xì)胞支持材料培養(yǎng)小鼠細(xì)胞株EB3時(shí)的分化能力的 維持進(jìn)行研究的結(jié)果。在實(shí)施例3中添加了 KSR的無(wú)血清條件化下培養(yǎng)EB3細(xì)胞后，在維持培養(yǎng)(S+G1) 的條件下進(jìn)一步傳代5次，在血清條件下重新馴化后，進(jìn)行分化誘導(dǎo)試驗(yàn)。作為無(wú)血清 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件，使用了明膠包被培養(yǎng)板的體系(K+G1)和重組人層粘連蛋白-5 包被培養(yǎng)板的體系(K+Lm5-4、K+Lm5-2)。將它們?cè)谘鍡l件下馴化后的實(shí)驗(yàn)區(qū)標(biāo)記為 K + Gl^S + GKK+ Lm5 - 4^S + GKK + Lm5 - 2與S + GL分化誘導(dǎo)按以下步驟進(jìn)行。在不含LIF(ESGRO)的維持培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，制作 1000個(gè)/滴的懸滴，2天形成胚狀體。將所形成的胚狀體轉(zhuǎn)移到細(xì)菌培養(yǎng)板中，在不含有LIF的維持培養(yǎng)基中進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)5天。此時(shí)的胚狀體的狀態(tài)如圖7所示。將懸浮培養(yǎng)的胚狀體轉(zhuǎn)移到用lmg/ml的Gl包被后的腔室玻片(chamber slide) (NUNC)上粘附培養(yǎng)3天后，用免疫染色檢測(cè)分化標(biāo)記，對(duì)ES細(xì)胞的分化能力(向內(nèi)胚層系、 中胚層系、外胚層系的細(xì)胞的分化)進(jìn)行了研究。此時(shí)，作為內(nèi)胚層系的細(xì)胞的標(biāo)記使用甲胎蛋白(AFP)，作為中胚層系的細(xì)胞 的標(biāo)記使用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，作為外胚層系的細(xì)胞的標(biāo)記使用β_ΙΙΙ微 管蛋白(tubulin)。免疫染色如下實(shí)施用4%甲醛將細(xì)胞固定化后，用添加了 0.1% Triton-XlOO(Nacalai)的5% FBS溶液進(jìn)行封閉。封閉后，用第一抗體和第二抗體處理，進(jìn) 一步進(jìn)行 DAPI (Nacalai)染色，用 VECTASHIELD (VECTOR Laboratories)封片并用熒光顯微 鏡進(jìn)行觀(guān)察，從而檢測(cè)標(biāo)記的表達(dá)。作為免疫染色中的第一抗體，在檢測(cè)甲胎蛋白時(shí)使用抗AFP多克隆抗體(DAKO)； 在檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白時(shí)使用抗α-SMA單克隆抗體(DAKO)；在檢測(cè)β-III微管蛋白 時(shí)使用抗β "III微管蛋白單克隆抗體(Chemicon)。第二抗體使用抗家兔IgG多克隆抗體 (Santa Cruz Biotechnology)禾口抗小鼠 IgG 多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)。此夕卜，一方面，對(duì)于S+G1、κ + G14S + GKK + Lm5-4= S + Gl、 K + Lm5 - 2 =^S + Gl的實(shí)驗(yàn)區(qū)按照上述的步驟進(jìn)行分化誘導(dǎo)，另一方面制作 成陰性對(duì)照。陰性對(duì)照對(duì)于S+G1、K+ Gl=^S + GKK+ Lm5 - 4與S + GK K + Lm5 - 2=>S + Gl的實(shí)驗(yàn)區(qū)，并不進(jìn)行形成胚狀體等一系列的分化誘導(dǎo)操作而 是用LIF存在下的通常的維持培養(yǎng)體系(S+G1)進(jìn)行培養(yǎng)，同樣地進(jìn)行免疫染色。有關(guān)4個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)示出了 在進(jìn)行分化誘導(dǎo)操作的實(shí)驗(yàn)區(qū)和未進(jìn)行分化誘導(dǎo)操作的 陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)區(qū)之間，比較作為分化標(biāo)記的AFP、α-SMA、β-III微管蛋白的表達(dá)的結(jié) 果(圖8 圖11)。另外，圖8表示S+G1的實(shí)驗(yàn)區(qū)的結(jié)果，圖9表示K + G1= S + Gl 的實(shí)驗(yàn)區(qū)的結(jié)果，圖10表示K + Lm5 - 4=^S + Gl的實(shí)驗(yàn)區(qū)的結(jié)果，圖Ii表示 K + Lm5 - 2=>S + Gl的實(shí)驗(yàn)區(qū)的結(jié)果。其結(jié)果，在所有的實(shí)驗(yàn)區(qū)中，進(jìn)行分化誘導(dǎo)操作的實(shí)驗(yàn)區(qū)全部確認(rèn)到AFP、α-SMA、 β -III微管蛋白3個(gè)信號(hào)(圖8下段、圖9下段、圖10下段、圖11下段)。另一方面，用通 常的維持培養(yǎng)體系培養(yǎng)的陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)區(qū)并未確認(rèn)到AFP、α -SMA、β -III微管蛋白3個(gè) 信號(hào)，細(xì)胞分化的誘導(dǎo)并未發(fā)生(圖8上段、圖9上段、圖10上段、圖11上段)。該結(jié)果意味著通過(guò)一系列的分化誘導(dǎo)操作起初可誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，EB 3細(xì)胞成為 表達(dá)AFP、α SMA, β -III微管蛋白等標(biāo)記的3胚層系的分化細(xì)胞。由實(shí)施例4的結(jié)果和本 實(shí)施例的結(jié)果可得到如下啟示用Lm5維持的ES細(xì)胞在維持未分化狀態(tài)的同時(shí)，還可維持 通過(guò)誘導(dǎo)而分化成多種細(xì)胞的分化多能性。實(shí)施例6與KSR不同的其他組成的血清替代品的調(diào)制調(diào)制出與上述的KSR不同的其他組成的血清替代品。本實(shí)施例的血清替代品的組 成如表3所示。表3成分已知的血清替代品的組成甘氨酸(Nacalai)150mg/l組氨酸(Nacalai)940mg/l異亮氨酸(Nacalai)3400mg/l
蛋氨酸(Nacalai)90mg/l苯丙氨酸(Nacalai)1800mg/l脯氨酸(Nacalai)4000mg/l羥基脯氨酸(Nacalai)100mg/l絲氨酸(Nacalai) 800mg/l蘇氨酸(Nacalai)2200mg/l色氨酸(Nacalai) 440mg/l酪氨酸(SIGMA)77mg/l纈氨酸(Nacalai)2400mg/l硫胺素(Nacalai)33mg/l抗壞血酸(SIGMA)330mg/l還原型谷胱甘肽(SIGMA) 10mg/l人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Nacalai)55mg/l牛胰島素(SIGMA)100mg/l亞硒酸鈉(SIGMA)0. 07mg/lBSA(Invitrogen) 83000mg/lAgNO3 (Mediatech Inc.) 0. 0017mg/lAlCl3 · 6H20(Mediatech Inc. ) 0. 012mg/lBa (C2H3O2) 2 (Mediatech Inc.) 0. 0255mg/lCdCl2 (Mediatech Inc. ) 0. 0228mg/lCoCl2 · 6H20 (Mediatech Inc. ) 0. 0238mg/lCr2Cl3 (Mediatech Inc. ) 0. 0032mg/lGeO2 (Mediatech Inc.) 0. 0053mg/lKBr (Mediatech Inc. ) 0. 0012mg/lKI (Mediatech Inc. ) 0. 0017mg/lMnSO4 · H2O (Mediatech Inc. ) 0. 0017mg/lNaF (Mediatech Inc.) 0. 042mg/lNa2SiO3 · 9H20 (Mediatech Inc. ) 1. 4mg/lNH4VO3 (Mediatech Inc. ) 0. 0065mg/l(NH4)6Mo7O24 ‘ 4H20 (Mediatech Inc. ) 0. 0124mg/lNiSO4 · 6H20 (Mediatech Inc. ) 0. 0013mg/lRbCl(Mediatech Inc.) 0. 0121mg/lSnCl2 (Mediatech Inc. ) 0. 0012mg/lZrOCl2 · 8H20 (Mediatech Inc. ) 0. 0322mg/l在蒸餾水中溶解表3所述的各種氨基酸(甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸)使 其成為3倍濃度，調(diào)制成3倍濃縮氨基酸溶液。在該3倍濃縮氨基酸溶液中加入構(gòu)成3倍 濃度所需用量的硫胺素、抗壞血酸、還原型谷胱甘肽。以該溶液為溶液A。接著，在蒸餾水 中溶解人轉(zhuǎn)鐵蛋白和BSA使其成為2倍濃度，調(diào)制成2倍濃縮BSA溶液。以該溶液為溶液B。進(jìn)而在蒸餾水中溶解所需用量的亞硒酸鈉，調(diào)制成7%亞硒酸鈉溶液。以該溶液為溶液
C。在所調(diào)制的溶液A、B、C中添加牛胰島素溶液(SIGMA)和微量金屬元素，調(diào)制成本實(shí)施例 的血清替代品。另外這里所添加的微量金屬元素為組成已知的市售的！"race ElementB和 C(Mediatech Inc. ) 0本實(shí)施例中調(diào)制出的血清替代品并非市售品，只是組成已知。^MM 7 #用添力D有t施徹丨6階血清替代品的培養(yǎng)某的研究本實(shí)施例中，在GMEM中添加實(shí)施例6中所調(diào)制出的血清替代品作為與KSR同樣的 血清代替物，將其作為維持培養(yǎng)基用于小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)。以下以這樣調(diào)制出的培養(yǎng)基為 培養(yǎng)基Y。然后，使用培養(yǎng)基Y，按照實(shí)施例3進(jìn)行了增殖檢測(cè)。進(jìn)而按照實(shí)施例4進(jìn)行了 未分化標(biāo)記的檢測(cè)。進(jìn)而按照實(shí)施例5進(jìn)行了分化成3胚層系的分化能力的研究。(1)增殖檢測(cè)使用了培養(yǎng)基Y的增殖檢測(cè)的結(jié)果如圖12所示。使用培養(yǎng)基Y作為維持培養(yǎng)基， 除此以外，完全與實(shí)施例3同樣地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。由使用了小鼠ES細(xì)胞株EB3的增殖檢測(cè)的 結(jié)果可知，以rLm5包被后用培養(yǎng)基Y進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)區(qū)(Y+Lm5-4、Y+Lm5_2)顯示出對(duì)小鼠 ES細(xì)胞的增殖效果。此外，與使用其他胞外基質(zhì)(Gl、Lm-Mix、Mg)的實(shí)驗(yàn)區(qū)相比，使用Lm5 的情況可確認(rèn)到更好的增殖。(2)未分化標(biāo)記的檢測(cè)進(jìn)行上述的增殖檢測(cè)后，通過(guò)RT-PCR對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)的未分化標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行了研 究。使用培養(yǎng)基Y作為維持培養(yǎng)基，除此以外，完全與實(shí)施例4同樣地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。與實(shí)施 例4同樣地檢測(cè)7種未分化標(biāo)記的結(jié)果如圖13所示。即使在使用培養(yǎng)基Y培養(yǎng)小鼠ES細(xì) 胞的情況下，以rLm5包被的實(shí)驗(yàn)區(qū)(Y+Lm5)也確認(rèn)到所有的未分化標(biāo)記的表達(dá)。由此得出 如下啟示即使使用培養(yǎng)基Y對(duì)rLm5的體系傳代培養(yǎng)10次以上，EB3細(xì)胞也能夠維持未分 化性。(3)分化成3胚層系的分化能力的研究此外，使用培養(yǎng)基Y作為維持培養(yǎng)基，除此以外，通過(guò)與實(shí)施例5完全相同的方法 進(jìn)行了分化誘導(dǎo)試驗(yàn)。進(jìn)行了分化誘導(dǎo)操作的所有的實(shí)驗(yàn)區(qū)，均形成了與對(duì)照區(qū)(S+G1)形 態(tài)酷似的胚狀體。其結(jié)果如圖14所示。檢測(cè)在進(jìn)行分化誘導(dǎo)后分化成3胚層系的標(biāo)記(AFP、α-SMA、β-III微管 蛋白)。有關(guān) S+G1(圖 15)、K + G14S + Gl (圖 16)、Y + Gl=^s + Gl (圖 17)、 Y + Lm5 — 44S + Gl (圖 18)、 Y + Lm5 - 2與S + Gl (圖 19)、 Y + Lm - Mix=^S + Gl (圖 20)、Y+ Mg=^S + Gl (圖 21)的實(shí)驗(yàn)區(qū)，顯示出在
進(jìn)行分化誘導(dǎo)操作的實(shí)驗(yàn)區(qū)(下段，LIF-)與未進(jìn)行分化誘導(dǎo)操作的陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)區(qū)(上 段，LIF+)之間檢測(cè)分化標(biāo)記表達(dá)的結(jié)果。由圖15 圖21的下段(LIF-)可見(jiàn)，有關(guān)在分化誘導(dǎo)后進(jìn)行免疫染色的體系，所 有的實(shí)驗(yàn)區(qū)中AFP、α-SMA、β-III微管蛋白3個(gè)標(biāo)記均完全表達(dá)。另一方面，由圖15 圖21的上段(LIF+)可見(jiàn)，未進(jìn)行分化誘導(dǎo)的用通常的維持培養(yǎng)體系培養(yǎng)的陰性對(duì)照的實(shí) 驗(yàn)區(qū)，未出現(xiàn)AFP、α-SMA、β-III微管蛋白的表達(dá)，細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)并未發(fā)生。由以上得出如下啟示在使用培養(yǎng)基Y時(shí)rLm5也能夠維持小鼠ES細(xì)胞的增殖，同 時(shí)所增殖的小鼠ES細(xì)胞保持未分化性。由此可見(jiàn)，rLm5在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞和血清的條件 下能夠成為小鼠ES細(xì)胞的有用的支持材料。
實(shí)施例8使用了人iPS細(xì)胞的粘附實(shí)騎本實(shí)施例中示出了在使用各種細(xì)胞支持材料時(shí)使用了人iPS細(xì)胞的粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。人iPS細(xì)胞使用在京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所再生誘導(dǎo)研究領(lǐng)域所建立的細(xì)胞 株201B2或201B7。圖22中，左側(cè)表示細(xì)胞株201B2的形態(tài)，右側(cè)表示細(xì)胞株201B7的形 態(tài)。在將人iPS細(xì)胞從培養(yǎng)盤(pán)剝離之前在10 μ M Y-27632 (WAKO)存在下培養(yǎng)1小時(shí)， 然后將人iPS細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。另外，在實(shí)施例8以后的人iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)行同樣的處理。在人iPS細(xì)胞的維持中，用在DMEM/F12中添加有20% KSR、2mM谷氨酰胺、1 %非必 需氨基酸、及10_4M 2-巰基乙醇的培養(yǎng)基調(diào)制出小鼠胚胎性成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清，在該 培養(yǎng)上清中添加如g/ml bFGF(WAKO)后用作維持培養(yǎng)基(MEF-CM)。細(xì)胞支持材料使用用絲裂霉素C處理后的SNL飼養(yǎng)細(xì)胞(Fd)或各種胞外基質(zhì) (GU Lm5、Mg、Vn, Co、Fn, Lm2、Lm-Mix)。然后按下述所示制作用各種細(xì)胞支持材料進(jìn)行處 理后的培養(yǎng)板，對(duì)于各細(xì)胞支持材料使用人iPS細(xì)胞株201B7進(jìn)行了粘附實(shí)驗(yàn)。用調(diào)整濃度后的各種胞外基質(zhì)蛋白處理96孔培養(yǎng)板(Corning)，用1. 2 % BSA(SIGMA)溶液在37°C下封閉處理1小時(shí)。將各種胞外基質(zhì)蛋白的濃度調(diào)制成以下濃度。 即，將 Gl 調(diào)制成 5mg/ml 及 1. 25mg/ml。將 Lm2 調(diào)制成 50 μ g/ml 及 12. 5 μ g/ml。將 Lm-Mix 調(diào)制成50 μ g/ml及12. 5 μ g/ml。將Mg調(diào)制成500 μ g/ml及125 μ g/ml。將Co調(diào)制成 50 μ g/ml 及 12. 5 μ g/ml。將 Fn 調(diào)制成 50 μ g/ml 及 12. 5 μ g/ml。將 Vn 調(diào)制成 50 μ g/ml 及 12. 5μ g/ml。將 rLm5 調(diào)制成 50 μ g/ml、25 μ g/ml、12. 5 μ g/ml、6. 25 μ g/ml 及 3. 125 μ g/ ml的5等級(jí)的2倍稀釋系列。此外，還調(diào)制了用25 μ g/ml的Lm5和50 μ g/ml的Co同時(shí)處 理后的實(shí)驗(yàn)區(qū)(Lm5+Co)。用胰蛋白酶處理人iPS細(xì)胞，使其分散直到成為單個(gè)細(xì)胞，以20000個(gè)/孔接種 到培養(yǎng)板上，在37°C、5% C02、95%空氣的氣相條件下培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)后，通過(guò)輕微敲打 (tapping)使粘附弱的細(xì)胞從培養(yǎng)板表面浮起，用percoll(GE healthcare)處理除去該細(xì) 胞。將粘附后的細(xì)胞用25%戊二醛(Nacalai)固定化，用2. 5%結(jié)晶紫(Nacalai)染色后 比較相對(duì)細(xì)胞數(shù)。圖23示出通過(guò)在培養(yǎng)60分鐘后測(cè)定0D595來(lái)評(píng)價(jià)各種胞外基質(zhì)蛋白給人iPS細(xì) 胞的粘附所帶來(lái)的影響的結(jié)果。此外，圖M示出各實(shí)驗(yàn)區(qū)中的進(jìn)行檢測(cè)后的細(xì)胞的形態(tài)。由圖23中可知，rLm5的實(shí)驗(yàn)區(qū)與其他胞外基質(zhì)蛋白的實(shí)驗(yàn)區(qū)相比，表現(xiàn)出較高的 0D595的值，表現(xiàn)出對(duì)人iPS細(xì)胞的較強(qiáng)的粘附活性。圖M中，也在rLm5的實(shí)驗(yàn)區(qū)觀(guān)察到 大多細(xì)胞發(fā)生粘附。此外，還可知，rLm5通過(guò)與Co組合(rLm5+Co)，表現(xiàn)出比rLm5單獨(dú)時(shí) 更強(qiáng)的粘附活性。實(shí)施例9使用了人iPS細(xì)胞的集落檢測(cè)本實(shí)施例中示出使用人iPS細(xì)胞株201B2時(shí)使用各種細(xì)胞支持材料進(jìn)行集落檢測(cè) 的結(jié)果。作為細(xì)胞支持材料，使用61、1^5、1%、￥11、(0、!^、1^2及1^^1。而且如下述那樣 制作用各種細(xì)胞支持材料進(jìn)行處理后的60mm培養(yǎng)盤(pán)(IWAKI)，對(duì)各細(xì)胞支持材料進(jìn)行了集落檢測(cè)。將各種胞外基質(zhì)蛋白的濃度調(diào)制成以下濃度。即，將Gl調(diào)制成lmg/ml。將Lm5調(diào) 制成 30μ g/ml、15y g/ml、8y g/ml、4y g/ml 及 2μ g/ml。將 Lm2 調(diào)制成 30 μ g/ml、15 μ g/ ml、8y g/ml、4y g/ml 及 2μ g/ml。將 Lm-Mix 調(diào)制成 30 μ g/ml、15 μ g/ml、8 μ g/ml、4 μ g/ ml 及 2 μ g/ml。將 Mg 調(diào)制成 300 μ g/ml。將 Co 調(diào)制成 30 μ g/ml。將 Fn 調(diào)制成 30 μ g/ml。 將Vn調(diào)制成10 μ g/ml。本實(shí)施例中，將人iPS細(xì)胞，通過(guò)胰蛋白酶處理將集落調(diào)制成分散為單個(gè)細(xì)胞的 狀態(tài)(以下，稱(chēng)作“單個(gè)”)、和通過(guò)輕微吹打(pipetting)抑制分散而調(diào)制成細(xì)胞塊的狀態(tài) (以下，稱(chēng)作“團(tuán)塊”)，用兩者進(jìn)行了檢測(cè)。即，使人iPS細(xì)胞在“單個(gè)”或“團(tuán)塊”下以相當(dāng) 于1000個(gè)/60mm盤(pán)接種到培養(yǎng)盤(pán)中。在37°C、5% C02、95%空氣的氣相條件下，“單個(gè)”培 養(yǎng)13天，“團(tuán)塊”培養(yǎng)6天。培養(yǎng)后，計(jì)算所形成的集落數(shù)。其結(jié)果如圖25所示。圖25中上段表示“單個(gè)”的結(jié)果，下段表示“團(tuán)塊”的結(jié)果?！皢蝹€(gè)”時(shí)，在rLm5、Lm-Mix, Vn、Mg的實(shí)驗(yàn)區(qū)可確認(rèn)到集落形成，在8 μ g/ml Lm5 及30 μ g/ml Lm-Mix的實(shí)驗(yàn)區(qū)形成與陽(yáng)性對(duì)照即SNL飼養(yǎng)細(xì)胞(Fd)存在的實(shí)驗(yàn)區(qū)接近的 集落數(shù)。另一方面，“團(tuán)塊”時(shí)，在扎1115、1^2、1^^^、￥11、1%、&)的實(shí)驗(yàn)區(qū)確認(rèn)到集落形成， 在rLm5的實(shí)驗(yàn)區(qū)確認(rèn)到與Fd相比同等以上的集落形成。此外，通過(guò)對(duì)所形成的集落進(jìn)行免疫染色而檢測(cè)人多能性干細(xì)胞標(biāo)記，從而評(píng)價(jià) 了所培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞是否為未分化狀態(tài)。作為此處的人多能性干細(xì)胞的標(biāo)記，使用了細(xì) 胞表面抗原標(biāo)記即SSEA3。用4%甲醛將細(xì)胞固定化后，用添加有BSA的PBS進(jìn)行封閉，從而實(shí)施了免疫 染色。封閉后，用第一抗體和第二抗體進(jìn)行處理，進(jìn)而用H0eChiSt33342anvitr0gen)進(jìn)行 染色，通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，檢測(cè)標(biāo)記的表達(dá)。免疫染色中，第一抗體使用抗SSEA3單 克隆抗體，第二抗體使用抗大鼠IgM抗體(Jackson Immuno Research)。免疫染色的結(jié)果如圖沈所示。圖滅為“單個(gè)”的結(jié)果，圖26B為“團(tuán)塊”的結(jié)果。 在由“單個(gè)”所形成的集落中和由“團(tuán)塊”所形成的集落中均檢測(cè)出ES細(xì)胞標(biāo)記即SSEA3。 由此得出如下啟示由人iPS細(xì)胞所形成的集落維持了未分化性。由以上結(jié)果得出以下啟示rLm5維持了與其他胞外基質(zhì)相比同等或其以上的人 iPS細(xì)胞的集落形成，同時(shí)所形成的集落保持了未分化性。本實(shí)施例中示出了在使用各種細(xì)胞支持材料時(shí)使用了人iPS細(xì)胞株201B7的維持
培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果。作為細(xì)胞支持材料，使用了 Gl、Lm5、Lm2、Vn、Co及而。而且按下述那樣制作用各 種細(xì)胞支持材料進(jìn)行處理后的6孔板(Falcon)，對(duì)各細(xì)胞支持材料進(jìn)行了集落檢測(cè)。作為 維持培養(yǎng)基，使用實(shí)施例8所述的MEF-CM。將各種胞外基質(zhì)蛋白的濃度調(diào)制成Gl lmg/ml、Lm5 2 μ g/ml、Lm2 30 μ g/ml、Co 30 μ g/ml> Fn 30 μ g/ml> Vn 10 μ g/ml。本實(shí)施例中僅對(duì)人iPS細(xì)胞的“團(tuán)塊”的狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)。細(xì)胞以1周1次用各 種胞外基質(zhì)處理全部細(xì)胞的九分之一，重播種到新準(zhǔn)備的6孔板中。細(xì)胞在37°C、5% CO2, 95%空氣的氣相條件下培養(yǎng)5周。培養(yǎng)5周后的細(xì)胞的形態(tài)如圖27所示。
其結(jié)果為，在所研究的各種胞外基質(zhì)蛋白的實(shí)驗(yàn)區(qū)中，在傳代后培養(yǎng)1周時(shí)觀(guān)察 到與陽(yáng)性對(duì)照即SNL飼養(yǎng)細(xì)胞(Fd)的實(shí)驗(yàn)區(qū)同等程度的細(xì)胞增殖。如圖27所示，在培養(yǎng)5 周后也觀(guān)察到該傾向。由該結(jié)果可知，rLm5能夠維持與Fd大致同等的人iPS細(xì)胞的增殖。 另外，Lm2在培養(yǎng)中并未確認(rèn)到集落形成。實(shí)施例11人iPS細(xì)胞的未分化標(biāo)記的檢測(cè)本實(shí)施例中，對(duì)已知的人多能性干細(xì)胞的未分化標(biāo)記NANOG、0CT4、S0X2的基因通 過(guò)RT-PCR檢測(cè)上述未分化標(biāo)記，從而對(duì)rLm5對(duì)于人iPS細(xì)胞是否具有維持未分化性的效 果進(jìn)行了研究。使用TRIZOL(Invitrogen)從實(shí)施例10中傳代培養(yǎng)5周后的人iPS細(xì)胞提取總 RNA。提取后，使用Hiermo Script RT-PCR System Qnvitrogen)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成了 cDNA。以所合成的cDNA為模板使用表4所示的引物進(jìn)行了 PCR反應(yīng)。各基因的變性反應(yīng)在 94°C下進(jìn)行10秒，退火反應(yīng)進(jìn)行15秒，伸長(zhǎng)反應(yīng)在72°C進(jìn)行30秒。有關(guān)退火反應(yīng)，0CT4 和GAPDH在60°C的溫度下進(jìn)行，NANOG和S0X2在55°C的溫度下進(jìn)行。表4 RT-PCR 引物_0CT45，-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3，(序列號(hào) 23)5，-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3，(序列號(hào) 24)NANOG5，-CAGCCCTGATTCTTCCACCAGTCCC-3，(序列號(hào) 25)5，-TGGAAGGTTCCCAGTCGGGTTCACC-3，(序列號(hào)洸)S0X25，-GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3，(序列號(hào) 27)5，-TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3，(序列號(hào) 28)GAPDH5，-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3，(序列號(hào)四)5，-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3，(序列號(hào) 30)RT-PCR的結(jié)果如圖觀(guān)所示。在所有的實(shí)驗(yàn)區(qū)確認(rèn)到所研究的3個(gè)因子的表達(dá)。 由此得到啟示使用rLm5作為細(xì)胞支持材料培養(yǎng)人iPS細(xì)胞時(shí)，人iPS細(xì)胞維持了未分化性。實(shí)施例12人iPS細(xì)胞的分化誘導(dǎo)試驗(yàn)本實(shí)施例中示出對(duì)使用各種細(xì)胞支持材料培養(yǎng)人iPS細(xì)胞時(shí)的分化能力的維持 進(jìn)行研究的結(jié)果。通過(guò)RT-PCR從誘導(dǎo)分化后的人iPS細(xì)胞檢測(cè)分化標(biāo)記，從而對(duì)使用各種 細(xì)胞支持材料所培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞是否能夠維持分化能力進(jìn)行了研究。在實(shí)施例10中培養(yǎng)3周后、即第3次傳代時(shí)收集一部分細(xì)胞，使用其進(jìn)行了分化 誘導(dǎo)試驗(yàn)。分化誘導(dǎo)按以下步驟進(jìn)行。在DMEM/F12中添加20% KSR、2mM谷氨酰胺、1 %非必需氨基酸及1(Γ4Μ 2-巰基乙 醇調(diào)制成培養(yǎng)基，將培養(yǎng)中的人iPS細(xì)胞從培養(yǎng)板剝離而制作“團(tuán)塊”，使用低吸附培養(yǎng)板 (NUNC)在該培養(yǎng)基中對(duì)上述團(tuán)塊”懸浮培養(yǎng)8天。將由此所形成的胚狀體重新播種到以lmg/ml的Gl包被的6孔板(Falcon)中，進(jìn)一步粘附培養(yǎng)8天。粘附培養(yǎng)后的細(xì)胞的形態(tài)如圖四所示。在不存在bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化誘導(dǎo) 后的細(xì)胞中混雜有各種形態(tài)的細(xì)胞，這意味著細(xì)胞發(fā)生了分化。這里的細(xì)胞形態(tài)與圖27那 樣的在bFGF存在下進(jìn)行通常的維持培養(yǎng)時(shí)是明顯不同的。從進(jìn)行分化誘導(dǎo)操作后的人iPS細(xì)胞，按照與實(shí)施例11相同的步驟，進(jìn)行RNA提 取和cDNA合成，以所合成的cDNA為模板，使用表5所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。作為內(nèi)胚 層標(biāo)記，使用S0X17和AFP ；作為中胚層標(biāo)記，使用BRACHYURY和MSXl ；作為外胚層標(biāo)記，使 用PAX6 ；作為滋養(yǎng)外胚層(trophectodermal)標(biāo)記，使用⑶X2。各基因的變性反應(yīng)在94°C 下進(jìn)行10秒，退火反應(yīng)進(jìn)行10秒，伸長(zhǎng)反應(yīng)在72°C下進(jìn)行30秒。有關(guān)退火反應(yīng)，S0X17、 BRACHYURY, MSXU PAX6在63°C的溫度下進(jìn)行，AFP在65°C的溫度下進(jìn)行，CDX2在55°C的溫 度下進(jìn)行。此外，僅⑶X2的伸長(zhǎng)反應(yīng)在72°C下進(jìn)行15秒。RT-PCR的結(jié)果如圖30所示。在rLm5的實(shí)驗(yàn)區(qū)確認(rèn)到與陽(yáng)性對(duì)照即Fd的實(shí)驗(yàn)區(qū) 同樣地表達(dá)了所研究的全部6個(gè)因子。由此得到以下啟示rLm5對(duì)人iPS細(xì)胞具有維持分 化多能性的效果。另一方面可知，在rLm5以外的幾個(gè)胞外基質(zhì)(Vn、Co等)的實(shí)驗(yàn)區(qū)，中胚 層標(biāo)記即MSXl的表達(dá)非常弱。由此可知，這些胞外基質(zhì)的情況下，可能會(huì)部分喪失人iPS 細(xì)胞的分化能力、或?qū)Ψ只a(chǎn)生抵抗性。表5 RT-PCR 引物_SOX175，-CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG-3，(序列號(hào) 31)5，-TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG-3，(序列號(hào) 32)AFP5，-GAATGCTGCAAACTGACCACGCTGGAAC-3，(序列號(hào) 33)5，-TGGCATTCAAGAGGGTTTTCAGTCTGGA-3，(序列號(hào) 34)BRACHYURY5，-GCCCTCTCCCTCCCCTCCACGCACAG-3，(序列號(hào) 35)5，-CGGCGCCGTTGCTCACAGACCACAGG-3，(序列號(hào) 36)MSXl5，-CGAGAGGACCCCGTGGATGCAGAG-3，(序列號(hào) 37)5，-GGCGGCCATCTTCAGCTTCTCCAG-3，(序列號(hào) 38)PAX65，-ACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAG-3，(序列號(hào) 39)5，-ATGGTGAAGCTGGGCATAGGCGGCAG-3，(序列號(hào) 40)CDX25，-GCAGAGCAAAGGAGAGGAAA-3，(序列號(hào) 41)5，-CAGGGACAGAGCCAGACACT-3，(序列號(hào) 42)本發(fā)明通過(guò)在含有胞外基質(zhì)分子中的層粘連蛋白-5的體系中進(jìn)行培養(yǎng)，即使不 使用支持細(xì)胞和血清，也能夠使多能性干細(xì)胞以未分化狀態(tài)進(jìn)行增殖。根據(jù)本發(fā)明的方法， 不使用支持細(xì)胞、血清等動(dòng)物來(lái)源的材料也能夠培養(yǎng)多能性干細(xì)胞，因此不存在免疫排斥、病毒感染等的危險(xiǎn)性。人來(lái)源的多能性干細(xì)胞根據(jù)其分化全能性具有作為再生醫(yī)療的細(xì)胞 材料的較大的利用可能性，尤其人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)不存在倫理性的問(wèn)題，并 且由于能夠從患者本人的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行調(diào)制因而不存在免疫排斥的問(wèn)題。[序列表自由文本]〈序列號(hào)1>序列號(hào)1表示人層粘連蛋白α 3鏈的堿基序列?！葱蛄刑?hào)2>序列號(hào)2表示人層粘連蛋白α 3鏈的氨基酸序列?！葱蛄刑?hào)3>序列號(hào)3表示人層粘連蛋白β 3鏈的堿基序列。〈序列號(hào)4>序列號(hào)4表示人層粘連蛋白β 3鏈的氨基酸序列?！葱蛄刑?hào)5>序列號(hào)5表示人層粘連蛋白Y 2鏈的堿基序列?！葱蛄刑?hào)6>序列號(hào)6表示人層粘連蛋白Y 2鏈的氨基酸序列?！葱蛄刑?hào)7_22>序列號(hào)7-22表示用于檢測(cè)ES細(xì)胞的未分化性標(biāo)記的、RT-PCR用引物的堿基序列。〈序列號(hào)23-30〉序列號(hào)23-30表示用于檢測(cè)人iPS細(xì)胞的未分化性標(biāo)記的、RT-PCR用引物的堿基 序列?！葱蛄刑?hào)31-42>序列號(hào)31-42表示用于檢測(cè)人iPS細(xì)胞的分化標(biāo)記的、RT-PCR用引物的堿基序列。[序列表]
權(quán)利要求
1.一種增殖多能性干細(xì)胞的方法，所述方法包括在不含有支持細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基 中、且在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)該多能性干細(xì)胞的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞為人的誘導(dǎo)多能性干 細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞為選自由胚胎干細(xì)胞、胚胎生 殖干細(xì)胞和種系干細(xì)胞組成的組中的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在培養(yǎng)基中含有血清替代品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述血清替代品含有選自由甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸 組成的組中的1種或多種氨基酸；由硫胺素和/或抗壞血酸組成的維生素；選自由銀、鋁、 鋇、鎘、鈷、鉻、鍺、錳、硅、釩、鉬、鎳、銣、錫和鋯組成的組中的1種或多種微量金屬元素；選 自由溴、碘和氟組成的組中的1種或多種鹵素；以及選自由白蛋白、還原型谷胱甘肽、轉(zhuǎn)鐵 蛋白、胰島素和亞硒酸鈉組成的組中的1種或多種成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，在含有層粘連蛋白-5的基礎(chǔ)上進(jìn)一步含 有其他胞外基質(zhì)蛋白的體系中培養(yǎng)所述多能性干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述其他胞外基質(zhì)蛋白為膠原蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法，其在用層粘連蛋白-5處理過(guò)的培養(yǎng)容 器中培養(yǎng)所述多能性干細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述層粘連蛋白-5為人層粘連蛋白-5。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能性干細(xì)胞在培養(yǎng)中不發(fā) 生分化。
13.層粘連蛋白-5作為用于增殖多能性干細(xì)胞的細(xì)胞支持材料的用途。
14.一種多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)用試劑盒，其包含用層粘連蛋白-5處理過(guò)的培養(yǎng)容器和 血清替代品。
全文摘要
為了在不使用支持細(xì)胞、血清等動(dòng)物性材料的體系中有效地增殖多能性干細(xì)胞，本發(fā)明提供了一種增殖多能性干細(xì)胞的方法，其包括在不含有支持細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基中、且在含有層粘連蛋白-5的體系中培養(yǎng)該多能性干細(xì)胞的工序。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102131919SQ20098011154
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日
發(fā)明者保田尚孝, 宮崎香, 山田宗弘, 高橋和利 申請(qǐng)人:東方酵母工業(yè)株式會(huì)社, 國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué)