專利名稱：：微流體成像細(xì)胞分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的實(shí)施方案涉及微流體系統(tǒng)，更特別地涉及用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定的微流體系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
：本說明書引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用并入本文中。腦腫瘤分類問題星形細(xì)胞腦腫瘤包括具有獨(dú)特的臨床、組織病理學(xué)和遺傳特征的多種贅生物。自從先前在1993年的WHO分類以來，已收集的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)表明，組織學(xué)定義的各類星形細(xì)胞瘤在生物學(xué)水平上更加不同^例如，多數(shù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生不具有惡性較低的癌前病變的臨床或組織學(xué)征兆，這些病變已被稱為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。它們發(fā)生于短期(通常少于3個(gè)月)臨床病史后的較年長患者(平均年齡55歲)中。這些原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有如下特征EGFR擴(kuò)增(約40%的病例)和/或過表達(dá)(60%)，PTEN突變(30%)，pl6INK4a缺失(30%40%)，MDM2擴(kuò)增(<10%)和/或過表達(dá)(50%)，以及在整條10號(hào)染色體上雜合性缺失(Lossofheterozygosity,LOH)(50%80%的病例)。相反，繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤從彌漫性(WHOII級(jí))或間變性星形細(xì)胞瘤(WHOIII級(jí))惡性化的發(fā)展較慢，并且其發(fā)生于較年輕的患者(平均年齡40歲)中。繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在約60%的病例中包含TP53突變，這些突變中超過90%在之前的彌漫性(WHOII級(jí))或間變性星形細(xì)胞瘤(III級(jí))中已經(jīng)出現(xiàn)。導(dǎo)致繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的途徑還具有染色體19q和IOq等位基因缺失的特征1O在組織病理學(xué)上，對(duì)這些亞型的明確區(qū)分仍不清楚，但它們明顯地通過不同的遺傳途徑發(fā)展H。這些亞型在預(yù)后方面是否顯著不同仍有待于研究，但正如它們的發(fā)生一樣，它們可能對(duì)特定新療法具有不同的響應(yīng)4。因此，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)需要考慮分子亞型分型，并且未來的分類體系也將無疑基于這些差異5。腦癌中的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑EGFR禾ΠEGFRvIII在患有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(成人中最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤)的患者中，少數(shù)患者亞群似乎受益于EGFR激酶抑制劑埃羅替尼(erolotinib)和吉非替尼(gefitinib)6。然而，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的突變很少發(fā)生7_8，這表明這種EGFR突變不能解釋對(duì)EGFR激酶抑制劑的響應(yīng)性9。EGFR基因通常在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中得到擴(kuò)增1(1，但是這種異?，F(xiàn)象也與對(duì)EGFP激酶抑制劑的響應(yīng)性不相關(guān)9。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤常表達(dá)EGFRvIII，其是具有組成型活性的EGFR基因組缺失變體"_15。這種EGFR變體強(qiáng)烈并持續(xù)地激活磷酸肌醇3'激酶(PI3K)信號(hào)途徑，這對(duì)于細(xì)胞存活、增殖和運(yùn)動(dòng)性非常關(guān)鍵16_2°。認(rèn)為EGFRvIII對(duì)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的持續(xù)活化造成“途徑依賴(pathwayaddiction)”21；如果此途徑被酪氨酸激酶抑制劑破壞，則依賴此途徑的腫瘤細(xì)胞會(huì)死亡。通過促進(jìn)對(duì)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的長期依賴，EGFRvIII可以使得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)EGFR激酶抑制劑敏感。PTENPTEN(第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物，PTEN)腫瘤抑制蛋白是PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制劑，其通常在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中丟失1(1’17’22。這種丟失可通過將EGFR抑制與下游的PI3K途徑抑制分開而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)EGFR激酶抑制劑療法的抗性23。我們假設(shè)，EGFRvIII會(huì)使腫瘤對(duì)EGFR激酶抑制劑敏感，而PTEN丟失會(huì)削弱對(duì)該抑制劑的響應(yīng)23。為了驗(yàn)證這一假說，我們分析了用EGFR激酶抑制劑治療前的患者中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的EGFRvIII和PTEN的基因和蛋白質(zhì)水平。我們還探查了EGFR及其異二聚化配偶體Her2/neu中的突變情況，據(jù)報(bào)道它們?cè)谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)生突變并且也可能影響對(duì)EGFR激酶抑制劑的響應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中EGFRvIII和PTEN的共表達(dá)以及對(duì)EGFR激酶抑制劑的響應(yīng)性之間有強(qiáng)相關(guān)性。mTOR已鑒定出雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)(mammaliantargetofrapamycin，mTOR,也稱為FRAP、RAFTl和RAP1)是作用于PI3K活化下游的關(guān)鍵激酶25。在過去5年中，特異性阻斷mTOR的雷帕霉素和雷帕霉素衍生物已作為潛在抗癌藥劑被開發(fā)。mTOR調(diào)節(jié)關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并參與生長刺激與細(xì)胞周期進(jìn)程的偶聯(lián)。響應(yīng)于生長誘導(dǎo)信號(hào)，靜息細(xì)胞提高了一系列mRNA的翻譯，這些mRNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是通過細(xì)胞周期Gl期繼續(xù)進(jìn)行所必需的。PI3K和AKT是上游途徑的關(guān)鍵元件，所述上游途徑將生長因子受體連接與mTOR的磷酸化和活化狀態(tài)聯(lián)系起來26’27。就PI3K/AKT/mTOR途徑在癌細(xì)胞發(fā)生和增殖中的作用而言，已證實(shí)PI3K/AKT/mTOR途徑中的若干元件被成紅細(xì)胞白血病病毒致癌基因同源物(ERB)表面受體家族、胰島素樣生長因子受體(IGFR)和致癌的Ras所激活28_31。用于正電子發(fā)射斷層顯像(positronemissiontomography，PET)的放射性示蹤劑18F-2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖(18F-2-fluoro-2-deoxy-d_glucose，F(xiàn)DG)正電子發(fā)射斷層顯像(PET)的臨床應(yīng)用正在不斷擴(kuò)大，特別是在腫瘤學(xué)領(lǐng)域。在結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)中，對(duì)PET的不同應(yīng)用包括初步診斷、分期、再分期和對(duì)治療響應(yīng)的評(píng)估32_34。另據(jù)報(bào)道，與常規(guī)的、基于解剖的形態(tài)學(xué)方法相比，PET用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)和疾病轉(zhuǎn)移提供了多種優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)樗軌蛱峁┕δ軋D象和腫瘤行為的證據(jù)35’36。這基于這樣的認(rèn)識(shí)，即提高的葡萄糖攝入是惡性腫瘤代謝變化的主要特征之一。臨床上，F(xiàn)DG是最常用的PET示蹤劑。它以與葡萄糖代謝相似的方式被運(yùn)送到細(xì)胞中，但一經(jīng)酶促磷酸化，F(xiàn)DG-6-磷酸即被腫瘤細(xì)胞通過代謝而捕獲。因此，腫瘤表現(xiàn)出提高的FDG代償，并且可利用PET掃描圖像作為示蹤劑活性增加的區(qū)域進(jìn)行區(qū)分37。臨床上，已利用對(duì)來自同一來源之腫瘤(包括CRC)的PET掃描觀察到不同的FDG攝入，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的攝入值(standardizeduptakevalue，SUV)所半定量地。已針對(duì)腫瘤之間的FDG攝入差異及其攝入機(jī)制進(jìn)行了大量研究。新的證據(jù)表明，影響FDG攝入的因素是復(fù)雜的，因?yàn)槟[瘤的特異性生物學(xué)特征決定了葡萄糖代謝程度38_4°。認(rèn)為影響FDG攝入的大多數(shù)因素(例如缺氧和細(xì)胞密度)與糖酵解相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化有關(guān)41’42。認(rèn)為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(尤其是GLUT-1，其直接參與FDG攝入)的表達(dá)決定了癌細(xì)胞中的FDG攝入水平43_45。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑和PET探針攝入如上所述，F(xiàn)DG是最常用的PET示蹤劑，其通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glut)被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。所述被運(yùn)送的FDG被己糖激酶磷酸化并被限制于細(xì)胞中。因此，F(xiàn)DG的攝入受Glut及己糖激酶的調(diào)控。然而，令人感興趣的是，Glut的細(xì)胞膜定位隨Akt的活化而增強(qiáng)。此外，己糖激酶的表達(dá)也受Akt的調(diào)控。這意味著，F(xiàn)DG攝入與PI3K/Akt/mTOR途徑密切相關(guān)。在使用RAD001和AP23573的少數(shù)探索性試驗(yàn)中，使用18F_2_氟_2_脫氧_D_葡萄糖正電子發(fā)射斷層顯像(PET)監(jiān)測(cè)施用mTOR抑制劑后腫瘤對(duì)葡萄糖的攝入。在這些初步的研究中，一些腫瘤表現(xiàn)出葡萄糖攝入的降低，而這與放射性方法測(cè)定的目標(biāo)響應(yīng)不一致46。藥物篩選以及PET探針的發(fā)現(xiàn)(治療與診斷)如上所述，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑與癌細(xì)胞中的葡萄糖和FDG攝入緊密相關(guān)。這就是FDG作為評(píng)估靶向PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑之抑制劑和/或藥物的療效的重要替代標(biāo)志物的原因。此外，如上所述，腦腫瘤應(yīng)根據(jù)分子指紋圖譜進(jìn)行分類，而臨床試驗(yàn)應(yīng)遵循這一分類。用于癌癥診斷的PET成像也應(yīng)與這一分類結(jié)合。因此，提出分子療法的開發(fā)應(yīng)與基于疾病分子指紋圖譜分類的分子診斷的開發(fā)相結(jié)合是不無道理的。然而，目前尚沒有這樣可用的探索平臺(tái)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)具有包括多個(gè)移液器的移液系統(tǒng)、靠近該移液系統(tǒng)放置的微流體芯片、靠近該微流體芯片放置的光學(xué)成像檢測(cè)系統(tǒng)以及與所述光學(xué)成像檢測(cè)系統(tǒng)連接的圖像處理系統(tǒng)。所述微流體芯片具有由微流體芯片之主體限定的多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室與由微流體芯片限定的輸入通道和輸出通道呈流體連通。所述移液系統(tǒng)被構(gòu)建并安置成以下至少一種當(dāng)微流體系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，通過多個(gè)移液器將流體注入多個(gè)輸入通道中，或者通過多個(gè)移液器從多個(gè)輸出通道抽取流體。對(duì)多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行自動(dòng)化熒光成像的方法包括將多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物加載到微流體芯片的多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室中，所述多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室包括細(xì)胞外基質(zhì)材料的表面涂層用于使所述細(xì)胞培養(yǎng)物固定；向細(xì)胞培養(yǎng)物施加至少一種熒光探針；在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育所述細(xì)胞培養(yǎng)物以促進(jìn)探針與細(xì)胞中或細(xì)胞上的特異性靶標(biāo)結(jié)合；照射細(xì)胞培養(yǎng)物以使熒光探針發(fā)射熒光；以及對(duì)從各細(xì)胞培養(yǎng)室中細(xì)胞發(fā)出的熒光進(jìn)行成像，同時(shí)所述細(xì)胞培養(yǎng)物仍基本上固定于所述多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室中以提供有關(guān)細(xì)胞中或細(xì)胞上特異性靶標(biāo)的信息。本發(fā)明的其它特征將在本發(fā)明下述各實(shí)施方案的詳細(xì)描述并參考附圖中提供。此外，通過結(jié)合附圖并參閱詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明中上述及其它隨之產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定的微流體芯片的示意圖2是PI3K信號(hào)途徑與PET探針攝入之間關(guān)系的示意圖(左表顯示PI3K信號(hào)途徑的抑制劑，右表顯示PET探針及其靶標(biāo))；圖3A-3C顯示PTEN在U87細(xì)胞中的免疫熒光圖像，和PTEN針對(duì)U87-PTEN細(xì)胞(圖3A)、U87細(xì)胞(圖3B)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)，以及基于圖3A和3B之?dāng)?shù)據(jù)的與U87-PTEN細(xì)胞和U87細(xì)胞之流式細(xì)胞分析相應(yīng)的定量數(shù)據(jù)(圖3C)；圖4A-4C顯示EGFR在U87細(xì)胞中的免疫熒光圖像，和EGFR針對(duì)U87-EGFR細(xì)胞(圖4A)、U87細(xì)胞(圖4B)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)，以及基于圖4A和4B之?dāng)?shù)據(jù)的與U87-PTEN細(xì)胞和U87細(xì)胞之流式細(xì)胞分析相應(yīng)的定量數(shù)據(jù)(圖4C)；圖5A-5E顯示EGFRvIII在U87細(xì)胞中的免疫熒光圖像，和EGFRvIII針對(duì)U87-EGFRvIII細(xì)胞(圖5A)和U87細(xì)胞(圖5B)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)，圖5C顯示單個(gè)U87細(xì)胞的EGFRvIII的平均免疫熒光強(qiáng)度，圖5D顯示基于圖5A和5B之?dāng)?shù)據(jù)的與U87-PTEN細(xì)胞和U87細(xì)胞之流式細(xì)胞分析相應(yīng)的直方圖，圖5E顯示基于圖5A和5B之?dāng)?shù)據(jù)的DAPI與EGFRvIII的二維圖；圖6A-6E顯示U87細(xì)胞對(duì)葡萄糖類似物(2-NBDG)的攝入(圖6A和6B為U87細(xì)胞，圖6C和6D為U87-PTEN的細(xì)胞，圖6A和6C為明視場(chǎng)圖像，圖6B和6D為熒光圖像，圖6E為U87細(xì)胞對(duì)2-NBDG攝入的直方圖)。圖7是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)的示意圖。圖8A-8C.圖8A用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定的微流體設(shè)備的實(shí)際視圖；圖8B在6天期間U87細(xì)胞在微芯片中增殖的延時(shí)(timelapse)顯微照片；圖8C芯片培養(yǎng)的U87細(xì)胞的量化增殖。圖9-10.數(shù)據(jù)收集。圖9數(shù)據(jù)收集得到二維或三維散點(diǎn)圖。圖10數(shù)據(jù)收集得到直方圖。圖11A-11C.在顯微細(xì)胞分析平臺(tái)中對(duì)p-S6染色的抗體濃度的優(yōu)化。圖12A-12F.以自動(dòng)化方式進(jìn)行大規(guī)模信號(hào)傳導(dǎo)分析的機(jī)器人移液器。圖13.對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PI3K途徑上游標(biāo)志物的芯片上多參數(shù)測(cè)量EGFR、EGFRvIII禾ΠPTEN。圖14.EGFRvIII、EGFR、PTEN基因檢測(cè)——比較流式分析和芯片分析——同樣的細(xì)胞懸液利用芯片和流式分析平行運(yùn)行。圖15.對(duì)來自分子復(fù)雜的異質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品的單個(gè)細(xì)胞中的PI3K信號(hào)傳導(dǎo)(p-EGFR、p-akt、p_S6)進(jìn)行定量測(cè)量。圖16.對(duì)分子異質(zhì)群的芯片上表征。圖17.芯片上檢測(cè)群體中的“稀有細(xì)胞”。圖18.在實(shí)體膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床樣品中檢測(cè)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)。圖19.檢測(cè)低水平的內(nèi)源性PTEN。圖20A-20ESFK是GBM中對(duì)達(dá)沙替尼(dasatinib)敏感的分子靶標(biāo)。圖21A-21E.開發(fā)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中測(cè)量mTOR抑制作用的方法以及證實(shí)抗'性促進(jìn)反饋回路(resistancepromotingfeedbackloop)。圖22A-22C.微流體成像細(xì)胞分析(MIC)技術(shù)的概念性概述。圖23A-23C.用于可定量ICC的經(jīng)FITC標(biāo)記的pS6抗體濃度的優(yōu)化。圖24A-24C.在優(yōu)化的ICC條件下，用于EGFRvIII、EGFR、PTEN、pAKT禾口pS6單細(xì)胞分析的MIC技術(shù)的動(dòng)態(tài)范圍。圖25.兩組同基因小鼠細(xì)胞系(包括⑴PTENES細(xì)胞系，即p8(+/-)且CaP8(-/")，禾口(ii)MEF細(xì)胞系，即PTEN1——(+/+)且ΡΤΕΝΔ1°χρ/Δ1°χρ(_/_))中PTEN表達(dá)和pAKT磷酸化的定量。圖26.使用MIC技術(shù)進(jìn)行平行信號(hào)傳導(dǎo)分析。圖27Α-27Ε.用不同濃度雷帕霉素處理的個(gè)體細(xì)胞中pS6表達(dá)水平的量化。圖28.使用3維散點(diǎn)圖的兩個(gè)不同視角來表明在MIC芯片中分析的腦腫瘤樣品的細(xì)胞異質(zhì)性。圖29A-29F.以自動(dòng)化方式進(jìn)行大規(guī)模信號(hào)傳導(dǎo)分析的機(jī)器人移液系統(tǒng)。圖30.在MIC芯片12中分析的12例腦腫瘤樣品的3維散點(diǎn)圖，其表明各腫瘤樣品中明顯不同的細(xì)胞異質(zhì)性。圖31.使用等級(jí)聚類方法來分析和量化給定患者樣品中的細(xì)胞異質(zhì)性。圖32.個(gè)體細(xì)胞的熱圖(heatmap)，其中綠色代表低表達(dá)，紅色代表高表達(dá)，第一次傳代的NS和SC顯示了不同的細(xì)胞群。圖33A-33B.圖33A為個(gè)體細(xì)胞的熱圖，其中綠色代表低表達(dá)，紅色代表高表達(dá)，mTOR的阻斷解除了pAkt反饋回路的抑制，且η為1。圖33Β為個(gè)體細(xì)胞的熱圖，其中綠色代表低表達(dá)，紅色代表高表達(dá)，EGFR的阻斷顯示EGFR信號(hào)可通過pAkt傳導(dǎo)。發(fā)明詳述微全分析系統(tǒng)近年來，生物學(xué)研究人員對(duì)于微全分析系統(tǒng)(micrototalanalysissystem，μTAS)用于細(xì)胞分析產(chǎn)生極大的興趣。μTAS的一個(gè)突出特征是其能夠在微芯片上構(gòu)建高度集成/功能性系統(tǒng)。因此，可以將在常規(guī)細(xì)胞分析中許多復(fù)雜的過程集成到獨(dú)立的微芯片上。這種集成使得分析時(shí)間縮短以及操作簡化。此外，這些集成的微流體系統(tǒng)具有一些優(yōu)勢(shì)，例如減少細(xì)胞、試劑和樣品的消耗，實(shí)時(shí)分析以及實(shí)驗(yàn)條件恒定47。如上所述，在集成微芯片上的細(xì)胞分析可以提供多種益處。因此，利用微芯片的細(xì)胞分析已得到迅速推廣，例如，應(yīng)用于細(xì)胞分選48以及將基因?qū)爰?xì)胞。集成微流體設(shè)備基于聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane)，PDMS)的集成微流體設(shè)備代表大規(guī)模的流體通道構(gòu)造，其允許在同一設(shè)備上利用數(shù)字化操作控制對(duì)依序的物理、化學(xué)和生物學(xué)過程進(jìn)行執(zhí)行和自動(dòng)化處理49’5°。特別地，PDMS材料的彈性使得能夠平行構(gòu)建出微米級(jí)的功能模塊，如閥、泵和管路51，這對(duì)于依序操作來說是必須的。此外，使用這種技術(shù)構(gòu)建復(fù)雜的設(shè)備只需要相對(duì)簡單的設(shè)施使用標(biāo)準(zhǔn)的CAD軟件繪制流體和控制網(wǎng)絡(luò)，然后將其移至透明的光掩模?？墒褂霉饪碳夹g(shù)制備可重復(fù)使用的模具，在其上澆注PDMS樹脂，并通過烘烤成型。例如，可通過在大塊材料上穿孔構(gòu)成進(jìn)入流體通道的入口，并且此設(shè)備可容易地與玻璃或硅基底連結(jié)。大量的活動(dòng)組件(如閥和泵)可通過堆疊多個(gè)單獨(dú)構(gòu)建的層來制造。當(dāng)用空氣或惰性氣體加壓時(shí)，跨越流動(dòng)層通道的控制層發(fā)生偏斜，密封流動(dòng)通道并阻止流體運(yùn)動(dòng)。這種閥操作方法也構(gòu)成了微流體芯片的雙向開關(guān)(例如，打開或關(guān)閉)。利用這種簡單的構(gòu)建技術(shù)，我們的聯(lián)合研究小組展示了顯著多樣性的設(shè)備，包括具有化學(xué)反應(yīng)環(huán)路的微流體設(shè)備(PCT國際申請(qǐng)(2006)WO2006071470和美國專利申請(qǐng)(2007)No.60/876,525)、用于小鼠的集成微流體血液采樣器(UCLA案例No.2005-659-1)、用于高敏感度定量放射性同位素濃度的微流體平臺(tái)(美國臨時(shí)專利申請(qǐng)，UCLA案例No.2006-388-1)以及用于細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定的微流體平臺(tái)(2006年12月22日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/876,525)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文中?；陲@微鏡的細(xì)胞分析單細(xì)胞測(cè)量可以揭示群體平均數(shù)所掩蓋的信息。例如，對(duì)大腸桿菌和釀酒酵母?jìng)€(gè)體細(xì)胞52’53中基因表達(dá)變化的研究顯示，由于基因表達(dá)機(jī)制運(yùn)行中的隨機(jī)波動(dòng)，只有一小部分細(xì)胞與細(xì)胞之間的報(bào)告基因表達(dá)發(fā)生變化54_56，并已鑒定出決定和控制大部分變化的其它過程和基因54。收集單細(xì)胞數(shù)據(jù)的一種方法是流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)其的開發(fā)開始于20世紀(jì)30年代?，F(xiàn)代儀器非常強(qiáng)大，但是ω不能反復(fù)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞以產(chǎn)生每個(gè)細(xì)胞的時(shí)間序列數(shù)據(jù)，()由于細(xì)胞通過檢測(cè)器的時(shí)間短(通常為幾微秒)以及由于物鏡的數(shù)值孔徑所致，因此不能收集大量的光，所收集的光往往少于發(fā)射光的10%，(iii)通常捕獲不到細(xì)胞圖像，這使得難于分析細(xì)胞形狀、大小和熒光的細(xì)胞內(nèi)定位。最近的一些工作已試圖通過長期累積熒光信號(hào)以及使用定制的電荷耦合器件(charge-coupleddevice，CCD)檢測(cè)器捕獲細(xì)胞圖像來解決后兩項(xiàng)限制57。光學(xué)顯微鏡可以通過提供隨時(shí)間反復(fù)觀察個(gè)體細(xì)胞、長時(shí)間收集發(fā)射光和高分辨率捕獲細(xì)胞圖像的能力來彌補(bǔ)流式細(xì)胞分析的一些限制。由計(jì)算機(jī)輔助的細(xì)胞追蹤和圖像分析的自動(dòng)化操作始自20世紀(jì)60年代，其可允許生成一些這樣的高通量數(shù)據(jù)57_63。但是，這種單細(xì)胞追蹤的方法在實(shí)際應(yīng)用中存在局限性，如低通量和/或細(xì)胞生存力不佳。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，新的基于PDMS的微流體設(shè)備(見圖1)可允許進(jìn)行藥物篩選和PET探針的發(fā)現(xiàn)，其基于監(jiān)測(cè)PI3K/Atk/mT0R信號(hào)傳導(dǎo)途徑和對(duì)探針攝入成像，它們分別與熒光顯微鏡和嵌入式檢波器聯(lián)用。(見2007年4月20日提交的PCT/US2007/009705)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體設(shè)備中分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和經(jīng)基因操作的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系包括U87、U87-PTEN、U87-EGFR和U87_EGFRvIII。這種微流體系統(tǒng)的內(nèi)在優(yōu)勢(shì)可包括節(jié)省樣品和/或試劑、高通量操作、實(shí)驗(yàn)保真度、可擴(kuò)展性、靈活性和數(shù)字化可控性。本發(fā)明某些實(shí)施方案中的微流體平臺(tái)可用于高通量篩選藥物和對(duì)候選探針成像。通過包括本發(fā)明某些實(shí)施方案的機(jī)器人移液系統(tǒng)，可使用獨(dú)立設(shè)備平行篩選1000至10000個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物并且仍具有節(jié)省樣品以及在單細(xì)胞水平上定量/系統(tǒng)讀數(shù)的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，已發(fā)現(xiàn)10至1596個(gè)室是合適的。高通量藥物篩選本發(fā)明某些實(shí)施方案的微流體平臺(tái)具有顯著提高使用基于顯微鏡之細(xì)胞測(cè)量來分析細(xì)胞的通量的潛力。該設(shè)備可使得能夠在個(gè)體癌細(xì)胞中分析藥物對(duì)PI3K信號(hào)途徑的作用，并同時(shí)評(píng)估PET探針的攝入(圖2)。更小的尺寸和更低的成本在本發(fā)明某些實(shí)施方案的微流體設(shè)備中進(jìn)行藥物篩選和PET探針發(fā)現(xiàn)的內(nèi)在優(yōu)勢(shì)在于，我們可以減少培養(yǎng)基、抗體、PET示蹤劑等的用量。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，已發(fā)現(xiàn)每個(gè)微培養(yǎng)室中低至約200pL的量是合適的。監(jiān)測(cè)信號(hào)途徑在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用免疫熒光方法對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑的識(shí)別標(biāo)志進(jìn)行染色。然后，我們可以根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案使用基于顯微鏡的細(xì)胞分析系統(tǒng)分析藥物對(duì)PI3K信號(hào)途徑的作用。通過個(gè)體細(xì)胞中的分子指紋圖譜對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分類該設(shè)備允許我們使用針對(duì)個(gè)體細(xì)胞的分子指紋圖譜對(duì)患者的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行分類。根據(jù)這一分類，我們可以為每位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者選擇有效的藥物。PET探針發(fā)現(xiàn)與個(gè)體細(xì)胞分子指紋圖譜聯(lián)用同時(shí)，我們可以使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)為每位患者評(píng)估和選擇有效的PET示蹤劑。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，我們可以為癌細(xì)胞中每個(gè)分子事件開發(fā)出不同的PET示蹤劑。微芯片中的高通量哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)加州大學(xué)伯克利分校的LukeLee博士小組展示了用于在連續(xù)灌注培養(yǎng)基的微培養(yǎng)室陣列內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞的高縱橫比的微流體設(shè)備。該設(shè)備的設(shè)計(jì)提供了節(jié)省成本的自動(dòng)化培養(yǎng)細(xì)胞的有潛力的工具。該陣列中的單個(gè)單元由40μm高的圓形微流體室以及周圍的2μm高的多個(gè)窄灌注通道組成。微培養(yǎng)室和灌注通道之間的高縱橫比(20)可提供諸多優(yōu)勢(shì)，如將細(xì)胞定位在微培養(yǎng)室內(nèi)以及為細(xì)胞生長創(chuàng)造出均一的微環(huán)境。使用有限元法(finiteelementmethod)模擬該設(shè)備的流動(dòng)模式和物質(zhì)傳遞。于37°C在使用連續(xù)灌注培養(yǎng)基的設(shè)備內(nèi)培養(yǎng)人癌細(xì)胞(HeLa)，并生長至匯合。使用微芯片進(jìn)行藥物篩選利用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行離子通道活性的高通量測(cè)量作為表征治療性分子的工具進(jìn)行藥物篩選引起人們極大的興趣。結(jié)合高通量與小試劑量的微系統(tǒng)已導(dǎo)致出現(xiàn)了商業(yè)化的微型膜片鉗設(shè)備。在這些設(shè)備中，離子通道的記錄通常通過將細(xì)胞置于分隔兩電極的膜中微米尺寸的小孔上來實(shí)現(xiàn)64’65。通過使用微流體途徑將細(xì)胞引導(dǎo)至小孔上，可以減少將細(xì)胞置于記錄點(diǎn)所需的勞力密集型微操作并且給予細(xì)胞持續(xù)的刺激66。獲得用于高質(zhì)量離子通道記錄所必需的高電阻密封(109Ω)對(duì)于大型和微型檢測(cè)來說均在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，而微系統(tǒng)已在滿足高通量挑戰(zhàn)方面較為成功。單細(xì)胞分析在常規(guī)研究和微系統(tǒng)中，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分析通常使用基于圖像的技術(shù)和細(xì)胞內(nèi)熒光探針(如測(cè)量鈣流動(dòng)的熒光探針67)進(jìn)行。然而，集成微流體設(shè)備能夠精確地操作、處理和分析極小量，已為分析細(xì)胞內(nèi)組分提供了新途徑。能夠分離單細(xì)胞然后使用化學(xué)裂解緩沖液裂解所述單細(xì)胞的具有集成氣動(dòng)閥的微流體設(shè)備已顯示出能夠從單個(gè)細(xì)胞中提取和回收信使RNA68。還集成了電泳分離的類似設(shè)備可以分析單個(gè)細(xì)胞裂解物中的氨基酸69。還展示了，使用電動(dòng)流驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞上樣、加載(docking)和裂解的通過電泳分離的單細(xì)胞分析7°。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子指紋圖譜使用應(yīng)用于組織微陣列的免疫組化分析，Mischel博士的小組進(jìn)行等級(jí)聚類和多維尺度分析，以及單變量和多變量分析，以在體內(nèi)詳細(xì)研究PI3K途徑17。結(jié)果提供了在體內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PI3K途徑的首次詳細(xì)研究，并提出了針對(duì)靶向激酶抑制劑治療的患者分類的方法。此外，當(dāng)可以與臨床、影像和病理數(shù)據(jù)整合時(shí)，DNA微陣列分析是最有用的。需要大量的努力來開發(fā)合適的包含關(guān)鍵臨床信息(包括患者特征，如年齡和性別)的數(shù)據(jù)庫。定期進(jìn)行腦成像，并將圖像保存于中央數(shù)據(jù)庫中。組織學(xué)顯微照片記錄了細(xì)胞形態(tài)，臨床數(shù)據(jù)通過無線輸入裝置實(shí)時(shí)記入以確保信息的準(zhǔn)確和及時(shí)。保存活檢材料用于與臨床數(shù)據(jù)有關(guān)的進(jìn)一步分析，其用于提取RNA用于微陣列中的大規(guī)模表達(dá)分析71?；陲@微鏡的細(xì)胞分析在過去的20年中，大量的在臨床和藥物應(yīng)用之外的以研究為導(dǎo)向的基于顯微鏡之自動(dòng)細(xì)胞分析都仰賴于兩個(gè)商業(yè)軟件包——Metamorph(MolecularDevicesCorporation)和ImagePro(MediaCybernetics，Inc.)——來操控顯微鏡、收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。這些軟件包(其常與較一般目的分析程序一起使用)例如Matlab(TheMathworks,Inc.)和Labview(NationalInstrumentsCorporation)可能構(gòu)成了用于這些目的最先進(jìn)的商業(yè)軟件。同樣，開源項(xiàng)目可以提供用于圖像分析的有價(jià)值的工具。實(shí)例包括OpenMicroscopyEnvironment(OME)，其提供了針對(duì)microscopeimages14、ImageJ、基于Java的顯微鏡圖像分析工具包15以及CellProfilerl6的文件格式和元數(shù)據(jù)(metadata)標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中的微芯片設(shè)計(jì)并構(gòu)建了用于藥物篩選和PET探針發(fā)現(xiàn)(圖1)的基于以PDMS為基礎(chǔ)之微流體系統(tǒng)的原型芯片。通道參數(shù)為300μιη(寬)Χ2000μιη(長)Χ200μιη(高)。PDMS芯片牢固地粘附于經(jīng)30秒氧等離子體處理的載玻片上?？蓪⒓?xì)胞外基質(zhì)組分(如纖連蛋白(FN)和層粘蛋白、Matrigel和RGD肽)涂覆到所有通道的表面上用于固定細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用如下小尺寸的微流體芯片。培養(yǎng)室尺寸(IOOym(長)XlOOym(寬)Χ20μιη(高)，容積為200pL。迄今常用的微流體芯片尺寸如下。培養(yǎng)室尺寸(3000μιη(長)Χ500μιη(寬)ΧΙΟΟμιη(高)，容積為150nL。在另一些實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，使用如下大尺寸的培養(yǎng)室。培養(yǎng)室尺寸(6000μιη(*)Χ2000μιη(寬)Χ200μιη(高)，容積為2.4μL。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞首先選擇U87人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和來自在加州大學(xué)洛杉磯分校接受腦腫瘤治療之患者的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤穩(wěn)定生長細(xì)胞(NS107、NS117、NS146)用于“概念驗(yàn)證”試驗(yàn)。使用含有由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PTEN、EGFR或EGFRvIII的逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)U87細(xì)胞進(jìn)行改造，以構(gòu)建膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的模式細(xì)胞系(U87-PTEN、U87-EGFR和U87-EGFRvIII)。微芯片中細(xì)胞的免疫熒光染色將纖連蛋白(FN，細(xì)胞外基質(zhì))涂覆于所有通道的表面上用于細(xì)胞粘附。將250μg/ml濃度的8.0μ1FN導(dǎo)入每個(gè)通道中，并在37°C孵育30分鐘。將從常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境獲得的懸浮U87細(xì)胞系的混合物導(dǎo)入經(jīng)FN包被的通道，并在培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。然后，使用100μL細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium+10%小牛血清+1%青霉素-鏈霉素+1%L-谷氨酰胺)沖洗通道。過夜后，用4%的多聚甲醛在室溫下固定通道中的細(xì)胞15分鐘。15分鐘后，用PBS沖洗每個(gè)通道。為了防止抗體非特異性結(jié)合到每個(gè)通道表面上，將封閉溶液(含有10%正常羊血清、0.1%TritonX-100和0.1%N-十二烷基-D-麥芽糖苷的PBS)加載到每個(gè)通道中并孵育30分鐘。為了使ΡΙ3Κ/Akt/mTOR信號(hào)途徑可視化，使用如下抗體100μg/mL的小鼠抗人PTEN抗體(CascadeBioscience)、15μg/mL的小鼠抗人EGFR抗體(ZymedLaboratories)、87μg/mL的抗人EGFRvIII抗體(Dako)。所有抗體均使用小鼠IgG標(biāo)記試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行標(biāo)記。將這些抗體加載到每個(gè)通道中，并于室溫孵育3060分鐘。免疫染色后，將DAPI加載到每個(gè)通道中用于細(xì)胞核染色。完成所有染色后，使用NikonTE-2000顯微鏡監(jiān)測(cè)微芯片，并使用Metamorph(MolecularDevices)成像軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。圖3顯示了U87-PTEN細(xì)胞(圖3A)和U87細(xì)胞(圖3B)中PTEN表達(dá)的免疫熒光圖像，基于這些圖像，如流式細(xì)胞分析一樣，分析由Metamorph生成的定量數(shù)據(jù)(圖3C)。使用DAPI染色作為細(xì)胞的指示物，我們可以知道哪些細(xì)胞具有免疫熒光染色陽性或陰性信號(hào)，并監(jiān)測(cè)各細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。在U87-PTEN的情形中，觀察到兩個(gè)不同強(qiáng)度的PTEN免疫熒光峰。通過免疫熒光染色，強(qiáng)度較高的細(xì)胞顯示PTEN陽性細(xì)胞，強(qiáng)度較低的細(xì)胞顯示PTEN陰性細(xì)胞。在EGFR和EGFRvIII的情形中，我們還可以定量分析EGFR陰性/陽性細(xì)胞群和個(gè)體細(xì)胞的EGFR免疫熒光強(qiáng)度(圖4和圖5)。我們證實(shí)，我們的方法可應(yīng)用于分析和分類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在圖5的情形中，我們顯示了我們基于顯微鏡的細(xì)胞分析對(duì)雙染色進(jìn)行二維分析的能力。這使我們能夠從我們的免疫熒光圖像獲得更多的信息，例如鑒定個(gè)體細(xì)胞以及在單細(xì)胞水平上監(jiān)測(cè)信號(hào)途徑。監(jiān)測(cè)U87細(xì)胞中的葡萄糖攝入為監(jiān)測(cè)U87細(xì)胞中的葡萄糖攝入，使用熒光脫氧葡萄糖(2-[N_(7-硝基苯基-2-氧雜-1，3-重氮鹽-4-基)氨基]-2-脫氧葡萄糖；2-NBDG)72’73監(jiān)測(cè)U87和U87-PTEN細(xì)胞對(duì)2-NBDG的攝入(圖6)。將細(xì)胞加載到芯片中后，使用含氯化鈣的Hanks'平衡鹽溶液(HBSS)清洗培養(yǎng)基。然后，將HBSS中的2-NBDG加載到細(xì)胞培養(yǎng)室中，接著在培養(yǎng)箱中孵育20分鐘。在U87細(xì)胞的情形中，如圖6B所示觀察到2-NBDG信號(hào)。在U87-PTEN細(xì)胞中，未能檢測(cè)到由2-NBDG攝入而產(chǎn)生的熒光信號(hào)(圖6D)。U87細(xì)胞對(duì)2-NBDG攝入的直方圖見圖6E。這一結(jié)果顯示，PTEN的過表達(dá)下調(diào)了Glut的細(xì)胞膜定位、己糖激酶的活性以及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑。根據(jù)這一結(jié)果，同時(shí)監(jiān)測(cè)PI3K信號(hào)途徑和葡萄糖攝入應(yīng)在篩選針對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑之藥物以及發(fā)現(xiàn)新的PET探針中起重要作用。我們已證實(shí)，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的這種微流體設(shè)備可應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和分析(包括對(duì)患者樣品的分析)。本發(fā)明一些實(shí)施方案的微流體設(shè)備可提供監(jiān)測(cè)個(gè)體細(xì)胞的平臺(tái)。本發(fā)明一些實(shí)施方案的微流體設(shè)備可用于提供細(xì)胞分析。本發(fā)明一些實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)還可用于高通量藥物篩選。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞分析可實(shí)現(xiàn)降低成本。此外，本發(fā)明一些實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)可用于發(fā)現(xiàn)PET探針。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)100示意于圖7中。該微流體系統(tǒng)100具有移液系統(tǒng)102、靠近該移液系統(tǒng)102放置的微流體芯片104、靠近該微流體芯片104放置的光學(xué)成像檢測(cè)系統(tǒng)106以及與該光學(xué)成像檢測(cè)系統(tǒng)106連接的圖像處理系統(tǒng)108。所述移液系統(tǒng)102可包括多個(gè)移液器。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述微流體系統(tǒng)100還可包括照明系統(tǒng)100，其被構(gòu)建并安排具有通向微流體芯片104的光路。當(dāng)運(yùn)行時(shí)，該照明系統(tǒng)110適于照亮所述細(xì)胞培養(yǎng)室中培養(yǎng)的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述照明系統(tǒng)可以是白光或廣譜照明系統(tǒng)、具有多光譜線的多色照明系統(tǒng)和/或單色照明系統(tǒng)(如激光)。微流體芯片104具有由所述微流體芯片104之主體限定的多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室與由微流體芯片之主體限定的輸入通道和輸出通道呈流體連通。如上文中有關(guān)圖1的描述，所述微流體芯片104可以是基于PDMS的芯片。移液系統(tǒng)102被構(gòu)建并安置成以下至少一種當(dāng)微流體系統(tǒng)100運(yùn)行時(shí)，通過多個(gè)移液器將流體注入多個(gè)輸入通道中，或者通過多個(gè)移液器從多個(gè)輸出通道抽取液體。例如，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，移液系統(tǒng)102可注入含有所培養(yǎng)之細(xì)胞的流體，可注入培養(yǎng)基和/或待研究的藥物，以及可注入其它生物標(biāo)志物等。移液系統(tǒng)102還可以使用同樣的多個(gè)移液器或另外的多個(gè)移液器從微流體芯片104的輸出通道抽取流體，例如用于細(xì)胞灌注等。移液系統(tǒng)102也可以是機(jī)器人移液器(見圖12A-12F)。但是，本發(fā)明的范圍并不僅限于機(jī)器人移液系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案，移液系統(tǒng)102也可以是手動(dòng)或半自動(dòng)移液系統(tǒng)。然而，從最初的細(xì)胞培養(yǎng)/培養(yǎng)基更換到免疫染色的自動(dòng)化操作可允許用于高通量信號(hào)途徑研究的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)/測(cè)定。用戶友好型界面可包括芯片支架(見圖12A-12F)和移液器吸頭陣列(見圖12A-12F)。例如，可以設(shè)計(jì)機(jī)器人移液器使之處理96、396和/或1536孔板?？梢岳矛F(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，如使用適合目前孔板平臺(tái)尺寸的芯片支架。因此，可直接安裝兩個(gè)平板支架與機(jī)器人系統(tǒng)一起使用，而不需要進(jìn)一步改造。目前，一個(gè)芯片支架可以容納4個(gè)微流體芯片，而微流體芯片中有40個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)/測(cè)定室。細(xì)胞培養(yǎng)室的每個(gè)入口和出口孔的位置可以登記為1536孔板中的特定孔位置。本發(fā)明一些實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)可包括如下手動(dòng)、半自動(dòng)和/或自動(dòng)化的操作1.細(xì)胞培養(yǎng)樣品的制備，包括細(xì)胞加載、在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞以及用于維持細(xì)胞的培養(yǎng)基更換。2.免疫細(xì)胞化學(xué)包括細(xì)胞固定、透化和免疫染色。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，微流體系統(tǒng)100可提供如下應(yīng)用的系統(tǒng)用于(i)高通量篩選的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，(ii)用于精確定量單細(xì)胞生物分子的微流體細(xì)胞分析，(iii)與癌癥診斷和治療分類相關(guān)聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)分析，Gv)作為Western印跡之替代的動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)定量，以及針對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析的其它更廣泛的應(yīng)用。微流體系統(tǒng)100的潛在應(yīng)用可包括但不限于1.流式細(xì)胞術(shù)的替代技術(shù)，其可包括如下優(yōu)勢(shì)(i)成本低，(ii)患者樣品/試劑消耗少，(iii)適用于懸浮和貼附細(xì)胞，Gv)可提供實(shí)驗(yàn)保真度的微流體環(huán)境(具有半自動(dòng)或全自動(dòng)操作)，(V)通過觀察熒光圖像可以跟蹤個(gè)體細(xì)胞的原始數(shù)據(jù)，(Vi)能夠捕獲培養(yǎng)體系中微小變化的較高測(cè)量動(dòng)態(tài)范圍，以及(Vii)單細(xì)胞精確度允許處理腫瘤異質(zhì)性問題。2.WeStem印跡的替代技術(shù)，可包括以下優(yōu)勢(shì)(i)成本低，(ii)患者樣品/試劑消耗少，(iii)可提供實(shí)驗(yàn)保真度的微流體環(huán)境(具有半自動(dòng)或全自動(dòng)操作)，Gv)單細(xì)胞精確度可允許檢測(cè)腫瘤樣品中的蛋白質(zhì)缺失/下調(diào)，(V)平行進(jìn)行大規(guī)模分析，(Vi)通過觀察熒光圖像可以跟蹤單個(gè)細(xì)胞的原始數(shù)據(jù)，(Vii)超高的測(cè)量動(dòng)態(tài)范圍，以及(viii)捕獲培養(yǎng)體系中微小變化的能力。3.指出單細(xì)胞和細(xì)胞亞群中的改變。例如，提供了如下問題的答案在患者復(fù)發(fā)期間的癌細(xì)胞中、在轉(zhuǎn)移前細(xì)胞中以及在轉(zhuǎn)化的最早期階段，哪些信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制處于活化狀態(tài)？4.不僅可關(guān)注“途徑”，還可關(guān)注整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，例如用于回答下列問題什么是藥物的“靶效應(yīng)”和“脫靶效應(yīng)”？5.鑒定并追蹤癌癥干細(xì)胞。例如是否有表型不同的細(xì)胞亞群不被治療所殺死并介導(dǎo)復(fù)發(fā)？6.為開發(fā)藥物鑒定靶標(biāo)。例如哪些信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制使癌細(xì)胞對(duì)特定的化學(xué)治療具有抗性？7.選擇最佳療法。例如響應(yīng)于特定癌癥療法的患者是否具有類似的信號(hào)傳導(dǎo)特征？8.監(jiān)測(cè)抗癌療法。例如信號(hào)傳導(dǎo)特征是否可用作治療性響應(yīng)或副作用的生物標(biāo)志物？9.癌癥的早期檢測(cè)。例如循環(huán)癌細(xì)胞或免疫系統(tǒng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)特征是否可用于早期檢測(cè)癌癥？10.了解細(xì)胞與細(xì)胞間以及癌細(xì)胞與宿主間相互作用的機(jī)制。例如癌細(xì)胞如何與宿主微環(huán)境或免疫系統(tǒng)相互作用以及改變宿主微環(huán)境或免疫系統(tǒng)？根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析可提供如下作用1.不同于血清生物標(biāo)志物的分析(診斷癌癥的一種主要方法)，研究信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)可有助于更好地了解疾病和針對(duì)分子損傷的治療分類。2.與基于組織形態(tài)學(xué)、western印跡和免疫組化(IHC)的常規(guī)病理學(xué)方法相比，定量的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析(利用多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn))可以是更精確的癌癥診斷技術(shù)(對(duì)于分期和診斷來說)。3.可定期地在臨床中獲得活檢樣品。當(dāng)然，應(yīng)使用合適的組織處理技術(shù)。4.定量的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析允許多維度的系統(tǒng)生物學(xué)研究(一段時(shí)間內(nèi)的小變動(dòng)/測(cè)量值)，提供了所述系統(tǒng)如何處理信息的更加動(dòng)態(tài)的認(rèn)識(shí)。5.定量的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析可用于新藥療效的評(píng)估，這可以加快臨床試驗(yàn)(二期和三期)。6.基于芯片的研究可潛在地提供用于進(jìn)行體外治療的平臺(tái)(在該設(shè)備中處理患者的腫瘤組織樣品，以及在芯片中監(jiān)測(cè)它們的治療響應(yīng))，其可以在患者接受治療前預(yù)測(cè)治療效果。通過使用這種方法，可以在很短的時(shí)間內(nèi)(如48小時(shí))測(cè)試和評(píng)估多種藥物或雞尾酒治療方法，且沒有風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例A:測(cè)定實(shí)施例1)樣品制備，包括細(xì)胞加載、在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞以及用于維持細(xì)胞的培養(yǎng)基更換。2)免疫細(xì)胞化學(xué)包括細(xì)胞固定、透化和免疫染色。·可以測(cè)量膠質(zhì)母細(xì)胞瘤系統(tǒng)中參與PI3K-Akt_mTOR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的多種信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)(包括EGFR、EGFvIIKPTEN、pAkt、pmTOR、pS6)和增殖標(biāo)志物Ki67?！た梢詼y(cè)量乳腺癌系統(tǒng)中參與PI3K-Akt_mTOR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的多種信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)(包括EGFR、ErbB2、PTEN、pAkt、pmTOR、pS6)和增殖標(biāo)志物Ki67?；罴?xì)胞的生長曲線可如下監(jiān)測(cè)圖8所示的細(xì)胞培養(yǎng)/測(cè)定芯片由負(fù)責(zé)(i)平行操作72份細(xì)胞培養(yǎng)物和測(cè)定以及(ii)潤濕相鄰的細(xì)胞培養(yǎng)室(防止培養(yǎng)基蒸發(fā))的兩類微通道組成。同時(shí)，我們努力地研究微通道的表面修飾，以確保細(xì)胞在7天內(nèi)的生存力。使用具有12個(gè)移液吸頭的半自動(dòng)移液器加載細(xì)胞，更換培養(yǎng)基，加入固定試劑、透化試劑和免疫染色試劑。持續(xù)的培養(yǎng)基更換允許芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)物維持6天或更長的時(shí)間。已成功地在此設(shè)備中培養(yǎng)了多種經(jīng)基因操作的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(即，U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII和U87_EGFRvIII/PTEN)，其再生增長率與在大型設(shè)備中所獲得的相當(dāng)。圖8A是用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定的微流體設(shè)備的實(shí)際視圖，其中兩類流體通道已被加載了食用染料以助于使微流體芯片的不同功能可視化(紅色)潤濕通道，(綠色)細(xì)胞培養(yǎng)通道。圖8B是在6天期間微芯片中U87細(xì)胞增殖的延時(shí)顯微照片。圖8C是通過在一段時(shí)間中監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)室中U87細(xì)胞的數(shù)目來定量經(jīng)芯片培養(yǎng)的U87細(xì)胞的增殖。實(shí)施例B:數(shù)據(jù)收集本發(fā)明一些實(shí)施方案的方法獲得的數(shù)據(jù)可采用如下形式，例如二維或三維點(diǎn)圖(X軸——一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)的強(qiáng)度(在此情形中為EGFRvIII)，Y軸——另一信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)的強(qiáng)度(在此情形中為DAPI)，對(duì)于三維點(diǎn)圖來說，Z軸——第三信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)的強(qiáng)度))(圖9)。在另一實(shí)施方案中(圖10)，數(shù)據(jù)可采用直方圖的形式(X軸——一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)的強(qiáng)度(在此情形中為EGFRvIII)和Y軸——細(xì)胞數(shù)目)。芯片中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟材料24通道聚-L-賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)芯片細(xì)胞培養(yǎng)基500mLDulbecco‘sModifiedEagle培養(yǎng)基50mL胎牛血清5mL青霉素-鏈霉素/L-谷氨酰胺細(xì)胞系和同源(isogenetic)細(xì)胞U87U87-PTENU87-EGFRU87-EGFRvIIIU87-EGFRvIIl/PTEN自動(dòng)移液器多通道移液器(來自MatrixTechnologiesCorporation,兩種推薦的移液器產(chǎn)品號(hào)為2239和2139)單通道移液器(來自MatrixTechnologiesCorporation,移液器產(chǎn)品號(hào)為IO29)儀器Nikon_TE2000顯微鏡操作步驟細(xì)胞加載1.將芯片在生物安全柜中用紫外光照射消毒15分鐘。2.使用細(xì)胞培養(yǎng)基(每次2μL)清洗每個(gè)通道兩次；移液器的加載速度為6μL/S。使用移液器吸頭(與真空連接)移除廢液。3.向每個(gè)通道中加載含30%FBS的2μL細(xì)胞培養(yǎng)基。4.將芯片置于培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中滴加0.5mL無菌水。5.將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。6.從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿。使用2μL細(xì)胞培養(yǎng)基清洗每個(gè)通道兩次；移液器的加載速度為6μL/s。使用移液器吸頭(與真空連接)排除廢液。7.使用移液器以0.55μL/s的加載速度向每個(gè)通道加載每毫升8XIO5個(gè)細(xì)胞的2μL細(xì)胞懸液。8.將芯片置于培養(yǎng)箱中(37°C，5%CO2)9.使芯片在培養(yǎng)箱中過夜，以確保細(xì)胞良好貼附。10.通過以0.55μL/s的加載速度，每12小時(shí)加載每個(gè)通道2μL新鮮培養(yǎng)基來為細(xì)胞更換培養(yǎng)基。11.使用Nikon-TE2000顯微鏡，針對(duì)每個(gè)通道每天拍攝10張照片以監(jiān)測(cè)細(xì)胞。12.將細(xì)胞在芯片中培養(yǎng)6天。提示芯片中有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生氣泡。在入口處滴一滴培養(yǎng)基將有助于減少芯片中產(chǎn)生氣泡的機(jī)會(huì)。PDMS微流體芯片構(gòu)建的操作步驟材料Sylgard184PDMS(DowCorningCorp.貨號(hào)4019862)具有所限定光刻設(shè)計(jì)的硅晶片(SiliconQuest)培養(yǎng)皿(VWRLABshop，貨號(hào)為25384-302)聚-L-賴氨酸顯微鏡載玻片(Polysciences，Inc.,貨號(hào)No.22247)顯微鏡載玻片(預(yù)清洗，75X50mmComing)甲苯(Sigma，貨號(hào)為244511)程序微流體模具的制備1.將硅晶片模板置于鋁箔覆蓋的IOcm培養(yǎng)皿中2.在干凈的攪拌杯中使用攪拌棒混合33g的101(AB試劑比)SylgardPDMS3.將經(jīng)混合的PDMS倒入培養(yǎng)皿中的硅晶片上4.對(duì)PDMS/培養(yǎng)皿抽真空40分鐘，以去除所有空氣5.將培養(yǎng)皿置于烤箱中，在80°C孵育30分鐘6.從烤箱取出培養(yǎng)皿，使其在室溫冷卻30分鐘7.輕輕從培養(yǎng)皿中取出鋁箔/晶片/PDMS模具8.使用剃須刀片在晶片底面上輕輕地在鋁箔/PDMS中切出“X”，并剝離以暴露出硅晶片的底面9.輕壓PDMS模具的邊緣以從模具中釋放出硅晶片10.將PDMS模具切成芯片，并為每個(gè)芯片打孔(或者可以先打孔)11.通過在微通道和芯片上部上拉粘性膠帶兩次來清潔每個(gè)模具，以除去灰塵和PDMS碎片芯片制造1.在干凈的攪拌杯中用玻璃攪拌棒混合6g的5KAB試劑比)SylgardPDMS2.將5克經(jīng)混合的PDMS混合物溶于玻璃燒杯中的20mL甲苯，用玻璃攪拌棒使其混勻3.以4000rpm，30秒將PDMS甲苯溶液旋轉(zhuǎn)包被至顯微鏡載玻片(75X50mm)上4.將流體模具(上述)置于顯微鏡載玻片，使得一薄層PDMS膠涂覆PDMS微流體模具的微通道側(cè)5.將流體模具置于商業(yè)化的聚-L-賴氨酸載玻片上6.將微流體芯片置于真空烤箱，于80°C孵育24小時(shí)Metamorph顯微鏡操作步驟材料MetaMorph(Premier版)MolecularDevice顯微鏡Nikon_TE2000S(外熒光顯微鏡)樣品操作1.按如下操作順序開啟顯微鏡(i)明視野光源(光一)，(ii)熒光光源_氙燈(光二)，(iii)CCD監(jiān)測(cè)儀，(iv)相機(jī)，以及(ν)計(jì)算機(jī)(如果它還沒開啟的話)。***在開啟顯微鏡之前，請(qǐng)確保氙燈完全冷卻，并且每次使用時(shí)，氙燈至少開啟30分鐘。2.將載玻片置于載物臺(tái)上。3.打開Metamorph程序(通過點(diǎn)擊桌面上的圖標(biāo))，并下拉獲取菜單選擇“Acquire(獲取)，，。***有兩種查看圖像的選擇1)在目鏡上觀察時(shí)，PORT旋鈕(在相機(jī)的右側(cè))應(yīng)轉(zhuǎn)至“EYE(目鏡)”2)在顯示器上觀察時(shí)，PORT旋鈕轉(zhuǎn)至“SIDE(側(cè)面)”。這也是CCD相機(jī)的使用選項(xiàng)。4.在“獲取對(duì)話框窗口”的設(shè)置中或使用選項(xiàng)面板選擇適當(dāng)?shù)臑V光鏡。這將設(shè)置不同的選項(xiàng)，包括明視野、DAPI、FITC>TRITC>Cy5和Li_cor。還可在此時(shí)設(shè)定包括數(shù)字轉(zhuǎn)換器、增益(gain)和曝光時(shí)間的操作參數(shù)，。***a)在拍攝熒光圖像時(shí)，我們推薦“數(shù)字轉(zhuǎn)換器”使用“1MHz”以及“增益”為“3(4X)”。b)調(diào)整曝光時(shí)間使熒光強(qiáng)度介于2000(像素)到65535的范圍內(nèi)(通常介于0.1-IOs之間)。對(duì)于明視野，曝光時(shí)間應(yīng)約為50ms。對(duì)于DAPI，曝光時(shí)間應(yīng)約為10ms。對(duì)于FITC，曝光時(shí)間應(yīng)約為100_500ms。對(duì)于TRITC，曝光時(shí)間應(yīng)約為200_2000ms。對(duì)于Cy5，曝光時(shí)間應(yīng)約為500_2000ms。對(duì)于Li-cor，曝光時(shí)間應(yīng)約為1-lOs。5.點(diǎn)擊“Showlive”來查看圖像。使用對(duì)焦旋鈕對(duì)焦圖像并使用“ASI”控制框上的位置來操縱桿移動(dòng)載玻片。6.點(diǎn)擊“Acquire(獲取)”以獲取所需圖像。女女*在拍攝熒光圖像之前，使用Nikon控制框上的按鈕關(guān)閉明視野光。7.下拉“File(文件)”菜單并選擇“Saveas(另存為)”保存圖像。8.拍照后，按如下操作順序關(guān)閉顯微鏡(i)Metamorph軟件，(ii)熒光光源，(iii)明光源，(iv)CCD監(jiān)測(cè)儀和相機(jī)，以及(ν)計(jì)算機(jī)。使用MetaMorph進(jìn)行多重細(xì)胞打分1.打開一組上述操作保存的圖像(DAPI和FITC、TRITC>CY5或Li-COR)2.在“Apps”菜單下點(diǎn)擊“MultipleCellScoring(多重細(xì)胞打分)”3.點(diǎn)擊“AllNuclei(所有細(xì)胞核)”，并通過“Wlsourceimage(Wl來源圖像)”激活圖像4.根據(jù)每個(gè)細(xì)胞核的大小(來自DAPI圖像)，設(shè)置“Approximateminwidth(合適的最小寬度)”和“Approximatemaxwidth(合適的最大寬度)”參數(shù)5.根據(jù)信號(hào)和背景之間的最小像素差異(來自DAPI圖像)，設(shè)置“Intensityabovelocalbackground(高于局部背景的強(qiáng)度)，，參數(shù)6.點(diǎn)擊“FITC(或TRITC、CY5、Li-COR)",通過“W2sourceimage(W2來源圖象)”激活圖像7.根據(jù)每個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的大小(來自FITC圖像)，設(shè)置“Approximateminwidth(合適的最小寬度)”和“Approximatemaxwidth(合適的最大寬度)”參數(shù)8.根據(jù)信號(hào)(每個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域)和背景之間的最小像素差異(來自FITC圖像)，設(shè)置“Intensityabovelocalbackground(高于局部背景的強(qiáng)度)”參數(shù)9.點(diǎn)擊“Apply(應(yīng)用)”10.點(diǎn)擊“Openlog(開始記錄)”11.點(diǎn)擊“Logdata(記錄數(shù)據(jù))”，數(shù)據(jù)將自動(dòng)導(dǎo)出到Excel。12."Integratedintensity(累積強(qiáng)度)”或“Averageintensity(平均強(qiáng)度)”值可用于分析(類似于FACS分析的直方圖或散點(diǎn)圖)芯片中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫細(xì)胞化學(xué)操作步驟材料24通道聚-L-賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)芯片細(xì)胞培養(yǎng)基500mLDulbecco'sModifiedEagle培養(yǎng)基(Invitrogen，貨號(hào)為11965-118)50mL胎牛血清(OmegaScientific，貨號(hào)FB-01)5mL青霉素-鏈霉素/L-谷氨酰胺(Invitrogen-Gibco)4%多聚甲酸(ElectronMicroscopeSciences)TritonX—100(Fluka)甲醇磷酸鹽緩沖液(PBS)(Mediatech,Inc,貨號(hào)21040136)正常山羊血清(NGS)(Fisher)牛血清白蛋白(Sigma)N-十二烷基_β-D-麥芽糖苷(NDBM)(Pierce,貨號(hào)89902，89903)Zenon小鼠IgG標(biāo)記試齊[J盒(Invitrogen/MolecularProbes)HiLyte750標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo，LK16-10)DAPI細(xì)胞核染色試劑(MolecularProbes，貨號(hào)35033A)抗體(*當(dāng)您收到抗體時(shí)請(qǐng)進(jìn)行分裝抗)細(xì)胞系和同源細(xì)胞U87U87-PTENU87-EGFRU87-EGFRvIIIU87-EGFRvIIl/PTEN自動(dòng)移液器多通道移液器(來自MatrixTechnologiesCorporation,兩種推薦的移液器產(chǎn)品號(hào)為2239和2139)單通道移液器(來自MatrixTechnologiesCorporation,移液器產(chǎn)品號(hào)為IO29)操作步驟細(xì)胞加載1.將芯片置于生物安全柜中用紫外線照射消毒15分鐘。2.使用細(xì)胞培養(yǎng)基清洗每個(gè)通道兩次(每次4μL)；移液器的加載速度為6μL/S。使用移液器吸頭(與真空連接)排除廢液。3.向每個(gè)通道中加載含30%FBS的4μL細(xì)胞培養(yǎng)基。4.將芯片置于培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中滴入0.5mL無菌水以保持濕潤。5.將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中24小時(shí)。6.從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿。使用4μL細(xì)胞培養(yǎng)基清洗每個(gè)通道兩次；移液器的加載速度為6μL/s。使用移液器吸頭(與真空連接)排除廢液。7.使用移液器以0.55μL/s的加載速度向每個(gè)通道中加載4μL細(xì)胞懸液(對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)來說為8XIO5個(gè)細(xì)胞/mL(3200個(gè)細(xì)胞)，對(duì)于免疫染色來說為2XIO6個(gè)細(xì)胞/mL(8000個(gè)細(xì)胞))。8.將芯片放入培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)。9.將芯片于培養(yǎng)箱中過夜，以確保細(xì)胞的良好貼附。提示芯片中有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生氣泡。在入口處滴一滴培養(yǎng)基將有助于減少芯片中產(chǎn)生氣泡的機(jī)會(huì)。免疫染代所有用于染色的溶液都通過移液器以0.55μL/s的加載速度加載。類似地，使用真空來排掉廢液。1.將芯片置于冰上，通過加載4μL4°C(冷)的PBS來清洗細(xì)胞樣品。2.向每個(gè)通道中加載4yL4%的多聚甲醛以盡快地固定細(xì)胞樣品。在室溫下孵育芯片15分鐘，接著使用4μLPBS沖洗3次。3.向每個(gè)通道中加載4μL透化溶液(含0.3%TritonX-100的PBS)來使細(xì)胞透化。室溫孵育15分鐘。隨后，使用4μLPBS清洗通道3次。4.準(zhǔn)備封閉溶液，其由PBS中的10%NGS、0.1%NDBM和3%牛血清蛋白組成。加載4yL，在室溫保持1小時(shí)。5.向每個(gè)通道中加入4μLZenon熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體溶液并在4°C避光孵育過夜。接著使用4μLPBS清洗3次?？贵w溶液制備1.避光，加入15μL(91)ZenonIgG標(biāo)記試劑至1μg抗體溶液中。2.等待5分鐘。3.加入15μL(91)ZenonIgG封閉溶液至混合物。4.等待5分鐘。5.將適當(dāng)稀釋度的抗體加入含有10%NGS、0.1%NDBM和3%牛血清蛋白的PBS中。6.加載到芯片中。6.向每個(gè)通道中加入4yL4%的多聚甲醛以固定細(xì)胞樣品。室溫下孵育芯片15分鐘，接著使用4μLPBS沖洗3次。7.向每個(gè)通道中注入4μLDAPKlOμg/mL)染色試劑5分鐘，接著使用4yLPBS清洗通道3次。8.使用Nikon_TE2000顯微鏡檢測(cè)熒光。提示在EGFR染色的情形中，因?yàn)榭筯EGFR的抗體直接與HiLyteFluor750綴合，所以不需要制備抗體溶液。請(qǐng)參閱“經(jīng)HiLyteF1uot750標(biāo)記之抗體的操作步驟”。實(shí)施例C用于對(duì)在接受激酶抑制劑治療的小鼠和人中的PI3K途徑生物標(biāo)志物定量的納米技術(shù)本實(shí)施例利用技術(shù)和臨床專業(yè)知識(shí)之間的協(xié)同作用來開發(fā)、優(yōu)化和驗(yàn)證作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診斷工具的微流體集成納米電傳感器。我們?yōu)榇藢?shí)施例設(shè)定了以下目標(biāo)1)擴(kuò)展我們針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的微流體測(cè)定，以更好地在單細(xì)胞水平表征癌細(xì)胞混合群2)開始優(yōu)化我們針對(duì)臨床膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品進(jìn)行這些基于微流體之測(cè)定的能力，從而在單細(xì)胞水平表征它們的信號(hào)傳導(dǎo)。3)使用一系列補(bǔ)充性方法開發(fā)新的血清生物標(biāo)志物和細(xì)胞表面標(biāo)志物，并開始驗(yàn)證其中一些新標(biāo)志物。1)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多參數(shù)測(cè)量的基于芯片之微流體集成測(cè)定的開發(fā)和改良la)芯片開發(fā)和分析中的進(jìn)展我們的聯(lián)合小組最近展示了微流體細(xì)胞分析平臺(tái)，其基于微流體細(xì)胞陣列與半自動(dòng)化移液器和熒光顯微鏡相結(jié)合，用于在單細(xì)胞分辨率下對(duì)參與PI3K信號(hào)途徑的信號(hào)事件進(jìn)行分析。我們最初關(guān)注的是EGFR/PI3K信號(hào)傳導(dǎo)軸。憑借基礎(chǔ)機(jī)制的研究以及將其轉(zhuǎn)化到臨床中，我們已經(jīng)1)證明調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)之兩種關(guān)鍵蛋白(突變的表皮生長因子受體EGFRvIII和PTEN腫瘤抑制蛋白)的共表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者對(duì)EGFR激酶抑制劑的臨床反應(yīng)顯著相關(guān)，并鑒定出與PTEN丟失有關(guān)之抗性的機(jī)制(Mellinghoff等，NEJM2005)；2)開發(fā)了克服由PTEN丟失所介導(dǎo)之對(duì)EGFR激酶抑制劑產(chǎn)生抗性的策略(Wang等，CancerRes.2006)，其正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)；3)鑒定出可對(duì)EGFR激酶抑制劑具有敏感性的另一些EGFR突變(Lee等，PLoSMedicine2006)。我們也開始意識(shí)到獲得性抗性的挑戰(zhàn)，并發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞可憑借其產(chǎn)生抗性的一些潛在途徑(Mellinghoff等，ClinicalCancerRes.2007)。許多經(jīng)遺傳改造的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(即U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN)以及原代細(xì)胞已在所述設(shè)備中成功地培養(yǎng)，可定量地分析細(xì)胞中受體(EGFR和EFGRvIII)、蛋白酶(PTEN)、磷酸化的激酶(p_Akt、pmTOR和p-S6)的表達(dá)水平。在此實(shí)施例中，我們的研究關(guān)注于(i)開發(fā)強(qiáng)大的且可重復(fù)的操作步驟用于免疫染色和圖像采集/分析，以實(shí)現(xiàn)我們的基于芯片之細(xì)胞分析測(cè)量的最佳動(dòng)態(tài)范圍，以及Gi)在微流體細(xì)胞陣列和機(jī)器人移液器之間建立用戶友好型界面，以允許在密切相關(guān)的微環(huán)境中進(jìn)行大規(guī)模的信號(hào)傳導(dǎo)分析。⑴開發(fā)強(qiáng)大的且可重復(fù)的操作步驟用于免疫染色和圖像采集/分析，以實(shí)現(xiàn)我們的基于芯片之細(xì)胞分析測(cè)量的最佳動(dòng)態(tài)范圍。雖然我們的微流體細(xì)胞分析平臺(tái)可用于生成信號(hào)傳導(dǎo)途徑模式的直方圖，而原先用于細(xì)胞固定、透化和抗體處理的條件/技術(shù)以及半自動(dòng)化移液器和熒光顯微鏡的操作參數(shù)應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)最佳的保真度和測(cè)量動(dòng)態(tài)范圍。因此，可利用我們的基于芯片之細(xì)胞分析測(cè)量值來鑒定出細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的小變動(dòng)。基于系統(tǒng)性方法，我們測(cè)試了甲醛、甲醇、丙酮、TritonX-IOO的不同組合以獲得最佳的固定和透化條件。此外，使用Zenon小鼠IgG標(biāo)記試劑盒和HiLyte熒光團(tuán)試劑標(biāo)記磷酸化特異性抗體，從而在個(gè)體細(xì)胞中對(duì)不同的信號(hào)傳導(dǎo)事件同時(shí)進(jìn)行多重顏色分析。對(duì)熒光團(tuán)標(biāo)記之抗體的不同濃度進(jìn)行了研究。通過研究各種條件下顯示的對(duì)陰性和陽性對(duì)照系統(tǒng)獲得之兩個(gè)直方圖的最高分離能力來確定最優(yōu)條件。本文中，我們所提供的實(shí)施例確定了用于P-S6免疫染色的最佳抗體濃度。在此情形中，陽性對(duì)照是具有擴(kuò)大的p-S6信號(hào)的U87-EGFRvIII膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；陰性對(duì)照是經(jīng)雷帕霉素處理的U87細(xì)胞，其中p-S6的上游信號(hào)被阻斷了。使用不同濃度的(O、0.045、0.45禾Π4.5μg/mL)經(jīng)Zenon標(biāo)記的p_S6抗體處理兩組樣品。使用倒置熒光顯微鏡來獲取熒光圖像(圖11A)，進(jìn)而通過MetaMorph程序(MolecularDevice)來分析圖像。需注意的是，通過再次系統(tǒng)性優(yōu)化來確定操作/分析參數(shù)。如圖IlB所示，4.5μg/mL的抗體濃度得到最佳的陽性和陰性對(duì)照的分離。在圖像分析過程中，除了累積熒光強(qiáng)度以外，還獲得一個(gè)令人感興趣的信息，即個(gè)體細(xì)胞的鋪展表面積。我們注意到細(xì)胞表面積有一些變化。這個(gè)可變因素可通過用累積熒光強(qiáng)度除以個(gè)體細(xì)胞的表面積予以消除，從而得到非常尖銳的直方圖(圖11C)。與從流式細(xì)胞分析系統(tǒng)獲得的直方圖相比，所得的基于平均強(qiáng)度的直方圖給出了針對(duì)捕獲小信號(hào)傳導(dǎo)事件的更好的精度和動(dòng)態(tài)范圍。目前，已通過系統(tǒng)性研究建立了用于EGFR、EFGRvIII、PTEN和p_S6免疫染色的四種標(biāo)準(zhǔn)操作方法。圖11A-11C顯示了在微流體細(xì)胞分析平臺(tái)中用于p-S6染色的最佳抗體濃度。a)在不同的抗p_S6抗體濃度下(0、0.045、0.45和4.5μg/mL)獲得的陽性對(duì)照(U87-EGFRvIII)和陰性對(duì)照(雷帕霉素處理的U87)的顯微圖像。b)使用MetaMorph程序獲得個(gè)體細(xì)胞的累積熒光強(qiáng)度，以及獲得p-S6表達(dá)水平的直方圖。顯然，4.5μg/mL的抗體濃度得到了陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的最佳分離效果。c)p_S6的平均表達(dá)水平可通過用累積熒光強(qiáng)度除以個(gè)體細(xì)胞的細(xì)胞表面積而得到。通過消除與細(xì)胞表面積相關(guān)的因素，直方圖的顯著尖銳了，使得兩個(gè)直方圖得以更好地分離。以下描述針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的免疫染色操作步驟的集合，以及對(duì)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的一些探索。下面，我們描述了該方法的某些方面，以通過使用此微流體細(xì)胞分析平臺(tái)來表征分子異質(zhì)性的實(shí)體膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤樣品。()在微流體細(xì)胞陣列和機(jī)器人移液器之間建立用戶友好型界面，以允許在密切相關(guān)的微環(huán)境中進(jìn)行大規(guī)模信號(hào)傳導(dǎo)分析。原先的微流體細(xì)胞分析平臺(tái)使用半自動(dòng)化的移液器來依次處理細(xì)胞加載、培養(yǎng)基更換、固定、透化和抗體染色。除了流體注入以外，大部分的操作/處理實(shí)際上是手動(dòng)控制的。因此，大量的勞動(dòng)和不可避免的操作失誤制約了對(duì)這一用于需要大規(guī)模研究之應(yīng)用的半自動(dòng)化方法的進(jìn)一步探究。在與我們的同事(MikevanDam和ChrisBehrenbruch教授)的合作中，開發(fā)了在微流體細(xì)胞陣列和機(jī)器人移液器之間的用戶友好型界面(圖12A)。我們的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)從最初的細(xì)胞培養(yǎng)/培養(yǎng)基更換到免疫染色的自動(dòng)化操作，從而可進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)/測(cè)定用于高通量的信號(hào)傳導(dǎo)途徑分析。這樣的用戶友好型界面包括兩個(gè)定制設(shè)計(jì)的單元芯片支架(圖12B)和移液器吸頭陣列(圖12C-12E)。設(shè)計(jì)機(jī)器人移液器用于處理96、396和/或1536孔板。為了利用現(xiàn)有的設(shè)備(適合于孔板平臺(tái)尺寸的芯片支架)，可將其直接安裝在該機(jī)器人系統(tǒng)的兩個(gè)平板支架上而不需要進(jìn)一步改造。目前，一個(gè)芯片支架可以容納4個(gè)微流體芯片，而微流體芯片上具有40個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)/測(cè)定室。值得注意的是，細(xì)胞培養(yǎng)室每個(gè)入口和出口孔的位置都被登記為1536孔板中的特定孔位置。因此，可以應(yīng)用原先開發(fā)用于處理1536孔板的程序來設(shè)置我們的微流體細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定的自動(dòng)化操作。機(jī)器人移液器帶有8個(gè)獨(dú)立控制的吸頭，其具有精度為5nL的分配和抽取液體樣品的能力。為了將我們的微流體芯片與所述機(jī)器人移液器集成化，我們將8個(gè)吸頭重新組裝成不同取向，其中這8個(gè)吸頭被分為4對(duì)，分別平行處理四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室。在每對(duì)吸頭中，相對(duì)較長的吸頭負(fù)責(zé)樣品分配，而較短的吸頭負(fù)責(zé)樣品抽取?；赑DMS之微流體芯片的彈性賦予了吸頭與微流體芯片入口之間的良好密封，并容許微小的構(gòu)建缺陷。圖12C示意一對(duì)吸頭如何在微流體細(xì)胞培養(yǎng)室中處理樣品/溶液更換。半自動(dòng)化方法需花費(fèi)約20分鐘完成例行的細(xì)胞培養(yǎng)基更換，與之不同的是，使用該機(jī)器人系統(tǒng)完成同樣的過程可少于10秒鐘(圖12D和12E)。圖12A-12F顯示了用于以自動(dòng)化方式進(jìn)行大規(guī)模信號(hào)傳導(dǎo)分析的機(jī)器人移液器。a)設(shè)計(jì)用于孔板平臺(tái)的機(jī)器人移液器。b)定制設(shè)計(jì)的、與孔板平臺(tái)尺寸一致的芯片支架允許機(jī)器人系統(tǒng)與微流體芯片之間便利的界面。c)該示意圖表明一對(duì)移液器吸頭如何在微流體細(xì)胞培養(yǎng)室中分配和抽取樣品/溶液。d)四對(duì)移液器從試劑槽加載固定溶液。e)正在進(jìn)行中的自動(dòng)化染色。f)用于制備具有固定芯片高度的微流體芯片而定制設(shè)計(jì)的復(fù)本(replicate)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，可以使用機(jī)器人系統(tǒng)完成針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑分析的新的免疫染色操作步驟?？梢允箞D像采集和處理自動(dòng)化，從而為我們的微流體細(xì)胞分析技術(shù)提供包括樣品制備、圖像采集和數(shù)據(jù)分析的完整的解決方案。lb)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行包含在分子異質(zhì)性樣品中的PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的多參數(shù)測(cè)量。此設(shè)備顯然可應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分析，但也可能對(duì)其它癌癥類型的分析具有相當(dāng)重要的作用。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中上游信號(hào)蛋白EGFR、EGFRvIII和PTEN的單細(xì)胞定量檢測(cè)我們已在單細(xì)胞水平定量膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PI3K信號(hào)傳導(dǎo)上游標(biāo)志物方面取得了重大進(jìn)展。本文中，我們展示了如何以高度量化的方式、在單細(xì)胞分辨率的水平上同時(shí)對(duì)PI3K途徑的多種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白進(jìn)行定量分析。此外，我們還展示了這些數(shù)據(jù)可以使用與流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)分析相類似的方式進(jìn)行分析，以便于直接比較，并允許在復(fù)雜的異質(zhì)性混合物中分析信號(hào)傳導(dǎo)特征，包括在靶向分子的治療前后。圖13顯示了在芯片上對(duì)6種同源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(不同在于EGFR、EGFRvIII和PTEN)進(jìn)行免疫熒光染色。圖14顯示，與流式細(xì)胞分析比較，對(duì)同樣的樣品進(jìn)行定量分析。如所示，該基于芯片的方法可以像流式細(xì)胞分析一樣表征單細(xì)胞中的這些關(guān)鍵上游標(biāo)志物，但所需的細(xì)胞卻少得多。圖13顯示了在芯片上對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞PI3K途徑上游標(biāo)志物(EGFR、EGFRvIII和PTEN)的多參數(shù)測(cè)量。圖14顯示了對(duì)EGFRvIH、EGFR、PTEN的檢測(cè)，在芯片上和利用流式細(xì)胞分析平行運(yùn)行同樣的細(xì)胞懸液——流式細(xì)胞分析與芯片的比較。芯片上的定量檢測(cè)與流式細(xì)胞分析檢測(cè)相吻合，但前者需要少得多的細(xì)胞。圖15顯示了對(duì)來自分子復(fù)雜異質(zhì)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品的單個(gè)細(xì)胞中PI3K信號(hào)傳導(dǎo)(p-EGFR、p-akt、p_S6)的定量測(cè)量。這六種同源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系培養(yǎng)在一起作為復(fù)雜的混合物，然后在芯片上分析EGFR、akt和S6的磷酸化水平。這些數(shù)據(jù)以“流式細(xì)胞分析”的格式繪圖。如圖所示，akt和S6的磷酸化在所有缺失PTEN的細(xì)胞中相對(duì)上調(diào)，而相對(duì)于野生型受體，致癌基因突變體EGFRvIII大大增強(qiáng)了組成型EGFR的磷酸化。因此，很明顯，表達(dá)EGFRvIII的缺失PTEN的腫瘤細(xì)胞(藍(lán)點(diǎn))(占混合物的六分之一)是PI3K信號(hào)激活最強(qiáng)的細(xì)胞，這與我們先前的研究結(jié)果一致(Mellinghoff等，NEJM2005)，而這可以在分子異質(zhì)性腫瘤樣品中基于單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PI3K途徑下游信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)物——Akt和S6的單細(xì)胞定量檢測(cè)已知，組成型活化的EGFR、EGFRvIII的表達(dá)以及PTEN腫瘤抑制因子的丟失與PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的組成型活化有關(guān)(Mellinghoff等.NEJM，2005)。因此，預(yù)計(jì)這些信號(hào)傳導(dǎo)蛋白應(yīng)當(dāng)在上述表達(dá)EGFRvIII和/或PTEN丟失的細(xì)胞被活化。因此，我們進(jìn)一步在過表達(dá)EGFRvIII和PTEN丟失的上述的細(xì)胞中利用芯片分析了這些下游標(biāo)志物。如下面圖15所示，其中所述6種同源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞被混合(U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFR-PTEN、U87_EGFRvIII和U87-EGFRvIII-PTEN)，并在芯片上分析，以“流式細(xì)胞分析”的格式呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，很明顯，通過測(cè)量akt和S6的磷酸化，在表達(dá)EGFRvIII和PTEN缺失的腫瘤細(xì)胞中觀察到PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組成型活化。這些結(jié)果表明了在復(fù)雜異質(zhì)性腫瘤中鑒定獨(dú)特的和臨床相關(guān)的分子標(biāo)志物的可行性。在分子異質(zhì)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品中測(cè)量PI3K信號(hào)傳導(dǎo)早已認(rèn)識(shí)到，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是所有腫瘤中分子異質(zhì)性最高的腫瘤之一，因此得名“多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme)”。這種異質(zhì)性是指在一個(gè)腫瘤中各細(xì)胞顯著的表型差異和分子差異。因此，該實(shí)施例的一個(gè)目的是開發(fā)用于表征在這些分子水平不同之個(gè)體細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的工具。上面圖13-16展示了利用我們已開發(fā)的微流體集成芯片測(cè)量細(xì)胞混合物中PI3K信號(hào)途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)的能力。接下來的展示中，進(jìn)一步顯示了該基于芯片的方法如何能夠在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中挑選出個(gè)體細(xì)胞群以及如何表征腫瘤中包含在“稀有”細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)。在下面的圖16中，我們以11的比例混合了兩種同源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞類型(U87-PTEN和U87-EGFRvIII)，并檢測(cè)了這些細(xì)胞群是否可以利用芯片以及利用流式細(xì)胞分析進(jìn)行區(qū)分。如下所示，可以鑒定出兩個(gè)不同的細(xì)胞群(見圖16)。圖16顯示了在芯片上對(duì)分子異質(zhì)性細(xì)胞群的表征。將U87-PTEN和U87-EGFRvIII細(xì)胞以11的比例混合，并利用芯片(左圖)和流式細(xì)胞分析(右圖)進(jìn)行檢測(cè)。如所示，可以利用芯片檢測(cè)分子異質(zhì)性樣品。為了確定我們是否能夠基于關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物的表達(dá)在芯片上鑒定“稀有”細(xì)胞群，我們將U87(95%)和U87-PTEN_EGFR(5%)細(xì)胞混合，并在芯片上檢測(cè)該細(xì)胞群。如下面的圖16所示，我們能夠檢測(cè)到經(jīng)測(cè)量占細(xì)胞群之7.4%(+/-2%)的稀有細(xì)胞群。這也與流式細(xì)胞分析的評(píng)估一致，但是其需要的細(xì)胞數(shù)少得多(幾十至幾百個(gè)，而非上千個(gè))。這就提出了一種可能性，我們將能夠基于關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定稀有的細(xì)胞亞群，例如腦癌干細(xì)胞。圖17顯示了在細(xì)胞群中利用芯片檢測(cè)“稀有細(xì)胞”。在芯片上分析U87細(xì)胞(95%)和U87-EFGF-PTEN細(xì)胞(5%)的混合物。如所示，我們可以檢測(cè)到經(jīng)測(cè)量占7.4%(+/"2%)的稀有細(xì)胞群。臨床實(shí)體腫瘤樣品中關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑的多參數(shù)測(cè)量單細(xì)胞分析領(lǐng)域的大部分研究進(jìn)展來自非實(shí)體腫瘤，如白血病和淋巴瘤，它們可以很容易地分離成單細(xì)胞懸液用于表征。對(duì)于實(shí)體癌來說，主要挑戰(zhàn)之一是使這些基于技術(shù)的方法可用于表征實(shí)體腫瘤樣品中的信號(hào)傳導(dǎo)。我們?cè)谶@方面已經(jīng)開始取得重大進(jìn)展。作為重要的中間步驟，我們已開始研究由C.DavidJames(UCSF)和JannSarkaria(Mayoclinic)開發(fā)的人連續(xù)傳代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤顱內(nèi)異種移植物(Sarkaria等，Mol.CancerTher.2006)o這些模型由保留了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤之主要特征(例如，在正常培養(yǎng)和異種移植系統(tǒng)中缺失的EGFRvIII的表達(dá))的連續(xù)傳代人腫瘤組成。使用這種模型使我們利用可更新的臨床資源(其為針對(duì)各種目的和意圖的分子異質(zhì)性臨床實(shí)體腫瘤樣品，與直接來自手術(shù)室的樣品很相似)盡可能地優(yōu)化我們的方法。下面，我們將展示在這方面的諸多進(jìn)展。與此同時(shí)，我們正在優(yōu)化我們的從來自手術(shù)室的實(shí)體瘤樣品到芯片(無需進(jìn)行顯著改變腫瘤之分子組成的組織培養(yǎng))的制備技術(shù)。我們?cè)谶@一領(lǐng)域也取得了重大進(jìn)展。我們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了一種方法，使我們直接從腫瘤樣品制備芯片。主要的障礙是難于使細(xì)胞“貼附在”固體芯片上?，F(xiàn)在我們已開發(fā)了一些辦法來克服這一困難，而其并不改變腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)特征。實(shí)體GBM腫瘤樣品中EGFRvIII和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的多參數(shù)測(cè)量為了開始分析臨床實(shí)體樣品中的EGFRvIII和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)，我們使用了來自James/Sarkaria模型系統(tǒng)的GBM39。在獲得一塊實(shí)體腫瘤后，我們用膠原酶和機(jī)械方法對(duì)其進(jìn)行分離，并優(yōu)化一系列將其移至芯片上的方法以隨后進(jìn)行PI3K信號(hào)傳導(dǎo)分析。如下所示，我們展示了就我們所知首次在實(shí)體GBM樣品中對(duì)PI3K信號(hào)途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行單細(xì)胞定量。數(shù)據(jù)表明腫瘤具有EGFRvIII的表達(dá)和顯著的PI3K途徑活化(見圖18)。圖18顯示了在臨床實(shí)體膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品中檢測(cè)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)。我們分析了源自體內(nèi)連續(xù)傳代之GMB模型(SarkariaJames,Mol.CancerTher.2006)的臨床實(shí)體膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品GBM39中EGFRvIII、PTEN的表達(dá)和S6的磷酸化(作為PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的讀數(shù))。同時(shí)對(duì)U87-EGFRvIII-PTEN和U87-PTEN細(xì)胞進(jìn)行了分析，以提供比較的基礎(chǔ)。注意在GBM39中EGFRvIII的表達(dá)(左圖)和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的活化(右圖)。據(jù)我們所知，這是第一次在實(shí)體GBM樣品中對(duì)EGFRvIII和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行單細(xì)胞定量測(cè)量。解決測(cè)量關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(PTEN測(cè)量)之內(nèi)源性水平的挑戰(zhàn)。我們注意到這樣的挑戰(zhàn)，即我們的一些抗體不能提供理想的信噪比。當(dāng)用于表達(dá)水平較低的某些內(nèi)源性蛋白(如PTEN)時(shí)，這就成為一個(gè)挑戰(zhàn)。我們已應(yīng)用酪胺信號(hào)放大(tyramidesignalamplification)策略來提高我們檢測(cè)PTEN的信噪比，使得我們能夠檢測(cè)出內(nèi)源性水平的PTEN,同時(shí)使我們能夠繼續(xù)多重測(cè)量反應(yīng)。在下面的圖19中，注意到該方法使我們不僅能夠在PTEN過表達(dá)的情況下而且對(duì)于內(nèi)源性PTEN表達(dá)均檢測(cè)到和量化PTEN的表達(dá)，而在PTEN缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFS)中檢測(cè)不到PTEN的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，我們可能敏感地且特異性地檢測(cè)低水平的內(nèi)源性蛋白用于測(cè)量。在接下來的描述中，我們的目標(biāo)是進(jìn)一步完善這一方法(見圖19)。圖19顯示了對(duì)低水平內(nèi)源性PTEN的檢測(cè)。使用酪胺信號(hào)放大技術(shù)，我們能夠測(cè)量a)過表達(dá)系統(tǒng)U87-EGFR-PTEN中的PTEN，左圖；NIH3T3細(xì)胞中內(nèi)源性低水平的PTEN，中圖；以及PTEN缺失的MEF中PTEN的缺失，右圖。下面，PTEN表達(dá)未定量。2.開發(fā)在單細(xì)胞水平進(jìn)一步評(píng)估癌癥途徑的技術(shù)我們已開始使用DEAL、DNA編碼的抗體文庫以及開發(fā)新的細(xì)胞表面標(biāo)志物來開發(fā)用于分離和富集單細(xì)胞群的新策略。2a)DEAL技術(shù)——我們已驗(yàn)證了基于DEAL的方法根據(jù)EGFR表達(dá)來分選細(xì)胞的能力。我們目前正在研究將新的細(xì)胞表面標(biāo)志物與這一方法相結(jié)合。我們已開發(fā)了一系列新的細(xì)胞表面標(biāo)志物，其已被流式細(xì)胞儀和Western免疫印跡所驗(yàn)證，我們計(jì)劃將它們整合到此DEAL策略中。2b)檢測(cè)新的細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白。我們已取得相對(duì)于20例正常腦組織樣品的來自臨床樣品(63例GBM)的全基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并鑒定了潛在的可能在GBM細(xì)胞中高度過表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物。然后，我們?cè)谝淮笕篏BM和三級(jí)膠質(zhì)瘤患者中分析了它們的表達(dá)，以證實(shí)這些標(biāo)志物在GBM中的mRNA水平過表達(dá)(以及它們相對(duì)于三級(jí)腫瘤來說在GBM中的顯著過表達(dá))。然后，我們進(jìn)而檢測(cè)了它們?cè)贕BM細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，然后在一系列來自進(jìn)行尸檢之患者的相匹配的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤/正常組織對(duì)中檢測(cè)它們的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。隨后，我們開始在體外分析這些標(biāo)志物與EGFR/PI3K信號(hào)傳導(dǎo)軸之間的潛在關(guān)系。迄今為止，我們已鑒定出10種潛在的細(xì)胞表面標(biāo)志物，包括PSCLRl、CXCR4和PTRPZl(也被鑒定為分泌蛋白——參見下面的方法2)。2c)鑒定和驗(yàn)證新的分泌蛋白通過對(duì)來自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者和非腫瘤患者的腦組織樣品中差異基因表達(dá)的全面MPSS數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了約5000個(gè)基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腦組織樣品中差異表達(dá)。選擇了在腦中表達(dá)相對(duì)富集的38個(gè)基因用于靶向篩選膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的血清樣品，以作為針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的候選血液診斷生物標(biāo)志物。在ISB開發(fā)的基于質(zhì)譜的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法中，首先將來自血清樣品的蛋白質(zhì)消化成肽，用稱為iTRAQ(來自AppliedBiosystems)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑對(duì)所有肽進(jìn)行N_端標(biāo)記?？捎胕TRAQ試劑對(duì)來自多達(dá)4個(gè)樣品的肽進(jìn)行差異標(biāo)記，以測(cè)量四個(gè)不同樣品中百余種蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。為了克服由于樣品復(fù)雜性所導(dǎo)致的通過質(zhì)譜難于定量血清中低豐度蛋白質(zhì)的問題，使用了兩種技術(shù)(1)可利用基于免疫親和的去除方法選擇性地去除幾種優(yōu)勢(shì)血清蛋白；(2)通過在iTRAQ標(biāo)記的混合物中增加所選肽段的總量可以顯著增加質(zhì)譜對(duì)低豐度肽的檢測(cè)——低成本合成來自38種候選血液蛋白標(biāo)志物的84個(gè)肽段，并與一種iTRAQ試劑混合，而來自正常人和腫瘤患者的兩個(gè)肽段樣品則使用另兩種iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析是目前正在進(jìn)行之中。作為后續(xù)工作，我們已分離出25組匹配的成對(duì)樣品(腫瘤和正常腦)，并已開始通過質(zhì)譜來篩選差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。2d)這些新技術(shù)與以分子為導(dǎo)向之臨床試驗(yàn)的整合我們正在進(jìn)行用VEGF抑制劑阿瓦斯丁(Avastin)(與CPT-11聯(lián)用)治療患者的臨床試驗(yàn)，我們現(xiàn)在可以證明對(duì)于復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤患者，阿瓦斯丁使腫瘤發(fā)展的時(shí)間延長至近4倍，從平均56天(95%CI=49-97)延長至209天(95%CI=122-272)，并且使總存活天數(shù)增至近兩倍，從平均184天(95%CI=171-225)增至340天(95%CI=251-424)。阿瓦斯丁明顯的臨床效果一定會(huì)改變對(duì)惡性膠質(zhì)瘤患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。此外，我們具有相當(dāng)大數(shù)量的明確的臨床響應(yīng)者(以及無響應(yīng)者)，和在診斷時(shí)獲得的冰凍組織(以及石蠟組織)，以及雖有臨床響應(yīng)但治療失敗的一組患者中的冰凍組織以及在治療前、臨床響應(yīng)期間和治療失敗時(shí)收集的血清，這樣的事實(shí)提供了用于鑒定針對(duì)該藥物響應(yīng)的分子決定因素以及鑒定有效的靶向組合的顯著協(xié)作的分子/臨床資源。我們具有較大數(shù)量的明確的臨床響應(yīng)者(以及無響應(yīng)者)，和在診斷時(shí)獲得的冰凍組織(以及石蠟組織)，以及雖有臨床響應(yīng)但治療失敗的一組患者中的冰凍組織以及在治療前、具有臨床響應(yīng)期間以及治療失敗時(shí)收集的血清。我們要解決以下問題1)增加的血管是否更傾向于對(duì)阿瓦斯丁產(chǎn)生臨床響應(yīng)(這將與加州大學(xué)洛杉磯分校著名的血管生成專家LuisaIraela-Arispe博士合作完成)，2)在響應(yīng)期間，受VEGF調(diào)節(jié)的下游信號(hào)途徑是否被重新活化及其機(jī)制。被促進(jìn)VEGF表達(dá)的關(guān)鍵途徑(即EGFR/PI3K信號(hào)傳導(dǎo))驅(qū)動(dòng)的腫瘤是否對(duì)阿瓦斯丁更敏感？除了驗(yàn)證這些具體的假設(shè)，我們將應(yīng)用整體篩選策略。這些包括CGH陣列用于檢測(cè)與敏感性和抗性相關(guān)的目的染色體區(qū)域(將在MSKCC由Mellinghoff博士完成)，以及與全基因表達(dá)數(shù)據(jù)整合(在UCLA和MSKCC完成)。此外，通過我們的納米系統(tǒng)生物學(xué)癌癥中心(NanoSystemsBiologyCancerCenter)，我們已開始與LeeHood博士合作，利用表面等離子體共振來促進(jìn)對(duì)血清樣品中數(shù)千種蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。這將使我們能夠鑒定與敏感性和獲得性抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。3.針對(duì)新GBM靶標(biāo)之鑒定的系統(tǒng)生物學(xué)方法3a)靶向Src家族激酶靶向EGFR/PI3K信號(hào)傳導(dǎo)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子靶向治療的潛在療效提供了“原理驗(yàn)證”。鑒定新的藥物靶標(biāo)是下一個(gè)關(guān)鍵步驟。我們已開發(fā)并應(yīng)用了系統(tǒng)生物學(xué)方法來鑒定膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的新分子靶標(biāo)。將來自GBM樣品的全基因表達(dá)數(shù)據(jù)與分子相互作用數(shù)據(jù)庫整合以鑒定潛在的可靶向途徑，我們已鑒定出Src家族激酶(Srcfamilykinases，SFKS)Fyn、Lyn和Src作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子靶標(biāo)。我們使用來自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床樣品的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來鑒定和驗(yàn)證作為關(guān)鍵分子靶標(biāo)的Src家族激酶(SFK)Fyn、Lyn和Src。我們顯示，這些激酶在多達(dá)50%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中都是過表達(dá)和持續(xù)磷酸化的，并使用siRNA、小分子抑制劑和過表達(dá)研究來證實(shí)SFK對(duì)于促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲是充分且必要的，并且我們已證實(shí)小分子抑制劑達(dá)沙替尼(一種可安全地施用于對(duì)具有伊馬替尼抗性CML之患者的化合物)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲，促進(jìn)腫瘤衰退與細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)大大增強(qiáng)了小鼠模型的生存(見圖20)。在圖20中，SFK是在GBM中對(duì)達(dá)沙替尼敏感的分子靶標(biāo)。A，B)在多達(dá)50%的GBM中觀察到SFK磷酸化的升高。C，D)短期的達(dá)沙替尼治療(灰色陰影)導(dǎo)致腫瘤衰退(通過光學(xué)發(fā)光成像來測(cè)量，與DavidJames博士合作)，并在體內(nèi)顯著增強(qiáng)了人顱內(nèi)連續(xù)傳代GBM異種移植物模型的存活。E，F(xiàn))達(dá)沙替尼抑制SFK磷酸化并在體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3b)在體內(nèi)研究mTOR介導(dǎo)之抑制的機(jī)制我們?cè)赑TEN缺失的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者中進(jìn)行mTOR抑制劑雷帕霉素的臨床試驗(yàn)，并鑒定出敏感性和抗性的關(guān)鍵因素(Cloughesy等2007，PLoSMedicine,印制中)。我們顯示DmTOR抑制劑雷帕霉素以潛在治療性水平存在于體內(nèi)腫瘤組織中，2)雷帕霉素在所有患者中顯著抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，但抑制程度不盡相同(從10%80%的途徑抑制)，以及3)途徑抑制的程度是至關(guān)重要的。大于50%的mTOR途徑抑制顯著抑制了增殖；較低程度的mTOR抑制不轉(zhuǎn)化為生物學(xué)或臨床響應(yīng)。我們進(jìn)一步證明，這并非由于細(xì)胞內(nèi)在抗性所致，而更可能與藥物在體內(nèi)不能充分靠近其靶標(biāo)有關(guān)。最后，我們研究了生長抑制與持續(xù)的臨床響應(yīng)之間的關(guān)系，并在近一半的患者中發(fā)現(xiàn)Akt介導(dǎo)反饋回路的證據(jù)。這種Akt介導(dǎo)的反饋回路與獲得性臨床抗性顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)具有重要意義。首先，它們表明在未來的臨床試驗(yàn)中，開發(fā)用于記錄膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中足夠的靶標(biāo)抑制的方法非常關(guān)鍵，以便于解釋臨床活動(dòng)。其次，這些發(fā)現(xiàn)還指出聯(lián)合阻斷EGFR/mTOR的意義(上述1.2項(xiàng)中也給出同樣建議)。第三，針對(duì)Akt介導(dǎo)之反饋回路的數(shù)據(jù)表明了聯(lián)合抑制PI3K/mTOR以更好地抑制該途徑以及抑制上游反饋回路的重要性。這些想法將很快在一系列臨床試驗(yàn)(除了EGFR/mTOR抑制劑試驗(yàn)以外)中付諸實(shí)施(見圖21)。圖21顯示開發(fā)用于在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中測(cè)量mTOR之抑制效果的方法以及表明抗性促進(jìn)反饋回路。A)我們開發(fā)了圖像分析方法用于比較患者接受雷帕霉素治療前后的生物標(biāo)志物。B)該免疫組化方法通過傳統(tǒng)的生化反方法來驗(yàn)證。C)雷帕霉素在體內(nèi)顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中的mTOR，以及D)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，如通過Ki67所測(cè)量地。E)在一組患者中，雷帕霉素治療通過Akt激活反饋回路(通過PRAS40生物標(biāo)志物測(cè)量)，這種激活顯著縮短了腫瘤發(fā)展的時(shí)間。3c)在體內(nèi)測(cè)量EGFRvIII。我們開發(fā)了新的基于核酸的方法用于可靠地檢測(cè)EGFRvIII突變體(Yoshimoto等，ClinicalCancerRes，2007，印制中)。我們之前顯示過，EGFRvIII(在PTEN完好的情況下)使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)EGFR抑制劑敏感(Mellinghoff等，NEJM2005)。EGFRvIII還呈現(xiàn)出針對(duì)抗EGFRvIII之疫苗的獨(dú)特的抗原性靶標(biāo)。因此，可以保證在臨床樣品中的檢測(cè)。然而，冰凍組織通常并不易得，特別是對(duì)于在社區(qū)中治療的患者。因此，在用福爾馬林固定的石蠟包埋(formalin-fixedparaffinembedded，F(xiàn)FPE)臨床樣品中檢測(cè)EGFRvIII是一項(xiàng)主要挑戰(zhàn)。我們開發(fā)了用于從常規(guī)處理的經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活檢樣品中檢測(cè)EGFRvIII的實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定，其敏感性為92%，特異性為98%。該測(cè)定易于在病理實(shí)驗(yàn)室各處使用，以利于在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中廣泛地測(cè)試EGFRvIII突變。B)其它實(shí)施方案Bi:擴(kuò)展的微流體測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，可以繼續(xù)擴(kuò)展我們對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤關(guān)鍵信號(hào)途徑的芯片分析?？梢赃M(jìn)一步增加目前所測(cè)量的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的數(shù)量，評(píng)估我們?cè)谛酒涎芯啃盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑之作用效果的能力(包括在混合的GBM細(xì)胞群中)，以及將這些芯片與上述細(xì)胞表面分選方法相結(jié)合。我們還可以開始更多地研究來自患者的新鮮腫瘤樣品，以優(yōu)化用于定量分子異質(zhì)性以及用于優(yōu)化芯片上樣品培養(yǎng)的方法。B2在常規(guī)處理的臨床樣品中(以及在回顧性冰凍臨床樣品中)優(yōu)化關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑的檢測(cè)?？蓪⒃摲椒☉?yīng)用于臨床實(shí)體腫瘤樣品，以優(yōu)化臨床實(shí)體樣品的多參數(shù)測(cè)量。我們還旨在開發(fā)檢測(cè)先前被冰凍的樣品的方法，特別是來自進(jìn)行基于分子之臨床試驗(yàn)的患者的樣品，因?yàn)檫@允許我們?cè)谝堰M(jìn)行的試驗(yàn)中建立信號(hào)傳導(dǎo)狀態(tài)與靶向性治療之響應(yīng)之間的相關(guān)性。B3評(píng)估分子異質(zhì)性是整體性還是局部的。已意識(shí)到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中分子異質(zhì)性的程度，但沒有詳細(xì)地研究。事實(shí)上，還不清楚腫瘤中局部異質(zhì)性是否代表整個(gè)腫瘤，或者對(duì)于腫瘤的完整分子表征是否需要空間分配活檢(spatiallydispersedbiopsy)。這個(gè)問題的答案對(duì)于為患者設(shè)計(jì)合理的聯(lián)合治療法以抑制抗藥性具有明顯重要的意義。這些工具的開發(fā)可有利于我們回答這個(gè)問題。B4單細(xì)胞水平上的癌癥途徑我們可以使用針對(duì)上述細(xì)胞表面蛋白的抗體擴(kuò)展我們的DEAL方法。我們還可以將這些DEAL方法與基于微流體的芯片整合。B5開發(fā)新的血清標(biāo)志物UCLA、ISB和CIT小組可整合他們潛在的血清標(biāo)志物列表。UCLA和ISB均可獲得血清樣品以及腫瘤樣品，我們可以使用基于ISB的方法進(jìn)行對(duì)潛在血清蛋白質(zhì)的更大規(guī)模的分析。B6對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的其它鑒定和驗(yàn)證我們可以繼續(xù)分析列表中潛在的細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，以確定基于這些標(biāo)志物(利用DEAL和流式細(xì)胞分析)進(jìn)行的分選是否可以鑒定具有不同表型和生化特性(以及對(duì)靶向藥劑之敏感性和抗性的不同模式)的GBM細(xì)胞群。實(shí)施例C目前的病理模型目前的癌癥診斷病理模型是基于癌細(xì)胞與其假定的原始細(xì)胞或其發(fā)育前體的顯微相似性。根據(jù)組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)以及一些蛋白質(zhì)標(biāo)志物的存在或缺乏，病理學(xué)家總結(jié)出涉及腫瘤類型和分級(jí)的廣泛的病理學(xué)診斷。通常，患者要接受相對(duì)毒性的、非特異性的治療，如DNA損傷劑和輻射。雖然這種分類和附屬的分級(jí)系統(tǒng)已被證明對(duì)于預(yù)測(cè)患者群體的總體存活以及對(duì)于溝通廣泛的疾病分類信息有用24_29，但對(duì)于本質(zhì)的分子途徑損傷卻只能獲得相對(duì)有限的發(fā)現(xiàn)3°。此外，使用現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，不能監(jiān)測(cè)在病程和對(duì)治療之響應(yīng)上顯著不同的臨床相關(guān)亞群。被認(rèn)為是癌癥診斷“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的傳統(tǒng)病理學(xué)檢查可能不會(huì)非常適合靶向分子的療法，這是因?yàn)榛谛螒B(tài)學(xué)的譜系類型區(qū)別并未揭示有關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)的信息。癌癥是分子異質(zhì)性疾病31_35。過去十年已清楚表明，同一組織類型的腫瘤中涉及的分子損傷有很大的不同。更重要的是，患有同一組織類型之癌癥的患者對(duì)于治療的響應(yīng)可能完全不同，這取決于其腫瘤的分子組成。越來越多的證據(jù)表明在個(gè)體腫瘤中存在相當(dāng)高的分子異質(zhì)性，例如一小群重新生成的腫瘤干細(xì)胞，其可能是癌癥復(fù)發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。迫切需要開發(fā)強(qiáng)大的定量工具用于腫瘤中個(gè)體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的多參數(shù)測(cè)量?，F(xiàn)在很清楚，任何類型的癌癥均可分類成一系列疾病，每種疾病都有自己的分子特征。傳統(tǒng)的病理檢測(cè)不能區(qū)分這些相關(guān)的腫瘤亞群，因?yàn)樗麄兺陲@微層面上相同。靶向治療的出現(xiàn)使得開發(fā)出多種靶向特異性的藥物(如激酶抑制劑36)，并已表明在一些類型的癌癥中具有突出的效果6’37_42。靶向治療的實(shí)施需要新的分子診斷方法用于鑒定和定量與造成癌癥惡性轉(zhuǎn)化之準(zhǔn)確信號(hào)途徑相關(guān)的疾病靶標(biāo)。用于分子分析的常規(guī)技術(shù)(例如Western印跡)需要大量的組織，其受到動(dòng)力學(xué)特征和單細(xì)胞特性的限制。分子診斷的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一是在單細(xì)胞精確度下對(duì)分子不同的細(xì)胞中的信號(hào)途徑進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量。針對(duì)癌癥病理學(xué)的系統(tǒng)方法癌癥是復(fù)雜的疾病沒有兩種腫瘤是相同的。孤立地分析個(gè)體基因或蛋白質(zhì)不可能產(chǎn)生重大的癌癥診斷和治療的突破。相反，針對(duì)癌癥的系統(tǒng)生物學(xué)方法43_46目的在于確定造成癌癥發(fā)生之特性(即其增殖能力、侵襲能力、對(duì)治療抑制劑的抗性)的蛋白質(zhì)和基因“模塊”和網(wǎng)絡(luò)。通過獲取有關(guān)系統(tǒng)中關(guān)鍵要素之間相互關(guān)系的信息，即可了解和靶向高度個(gè)體化癌癥之間的共同點(diǎn)。復(fù)雜輸入的整合該系統(tǒng)方法包括選取盡可能多的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的分子特征以及現(xiàn)象信息作為輸入，并使用圖形模式將其整合成一套網(wǎng)絡(luò)。隨著越多的輸入被整合，該網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)也被完善從而可以產(chǎn)生有關(guān)該系統(tǒng)如何運(yùn)作的假設(shè)(或者對(duì)于癌癥來說，它是如何出錯(cuò)的)。然后，可通過進(jìn)行一系列系統(tǒng)性干擾并測(cè)量對(duì)該網(wǎng)絡(luò)的影響(以及對(duì)表型特征如生長、侵襲、對(duì)治療的響應(yīng)等)來動(dòng)態(tài)地驗(yàn)證這些假設(shè)。這樣便可以修正這些假設(shè)，然后再進(jìn)一步測(cè)試和完善。針對(duì)系統(tǒng)的更完整的分子“快照”是有可能的，這種高含量的知識(shí)可以轉(zhuǎn)化為新的診斷和治療工具，從而完善對(duì)癌癥的病理性診斷。針對(duì)癌癥的系統(tǒng)方法需要新技術(shù)使用目前可用的一套技術(shù)，真正系統(tǒng)水平的癌癥評(píng)估是不可能實(shí)現(xiàn)的。然而，我們小組已處于正在被整合入系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的分子和納米技術(shù)興起的前沿。本文所述的微流體成像細(xì)胞分析(MIC)技術(shù)的開發(fā)和驗(yàn)證將有利于對(duì)癌癥細(xì)胞和組織的新型病理檢查，主要是，其整合了系統(tǒng)水平的診斷方法。PI3K/Akt涂徑是癌癥中的重要靶標(biāo)PI3K47是一種促進(jìn)多種生物學(xué)功能(包括細(xì)胞增殖、存活和運(yùn)動(dòng))48_51的脂質(zhì)激酶。PI3K信號(hào)途徑調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如增殖、生長、凋亡和細(xì)胞骨架重排。PI3K信號(hào)途徑常常在多數(shù)人類癌癥類型中失調(diào)52’53，往往與ERK途徑相結(jié)合54_56。PI3K-AKT-mTOR途徑57_61(和RAS/ERK途徑62’63)可基于癌基因的活化和抑癌基因的缺失(其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中常見64_66)而失調(diào)。很大一部分癌細(xì)胞類型包含PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑——腫瘤抑制基因PTEN的變化7_9，這導(dǎo)致PI3K途徑的組成型活化。PI3K的上游——表皮生長因子受體(EGFR)常常過表達(dá)39’64’68_71，這常常與其組成型活化的EGFRvIII變體(及其它變體)有關(guān)71_75，常常導(dǎo)致PI3K和Ras/ERK信號(hào)傳導(dǎo)的失調(diào)62。PI3K和RAS/ERK途徑與其它信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)聯(lián)系很多，從而將與其它細(xì)胞表面活動(dòng)、應(yīng)激活化途徑和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)有關(guān)的信號(hào)進(jìn)行整合。很明顯，PI3K和ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)分子是重要的治療靶標(biāo)。通過流式細(xì)胞分析講行信號(hào)傳導(dǎo)分析流式細(xì)胞分析76,可以追蹤和分析個(gè)體癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)事件。流式細(xì)胞分析獨(dú)特的定量個(gè)體細(xì)胞之多重性質(zhì)的能力可提供異質(zhì)混合物中每個(gè)細(xì)胞的信息。細(xì)胞通常被固定和透化從而使各種試劑進(jìn)入。使用綴合有熒光團(tuán)的抗體檢測(cè)具有目的信號(hào)分子的細(xì)胞，所述抗體對(duì)識(shí)別所述蛋白質(zhì)是特異性的。流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)的單細(xì)胞分辨率和多參數(shù)性質(zhì)可產(chǎn)生用于區(qū)分腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的特征。因?yàn)榧?xì)胞必須經(jīng)過分離才能用于檢測(cè)，所以流式細(xì)胞分析主要用于研究血液系統(tǒng)癌癥8°’81。來自實(shí)體瘤的貼附腫瘤細(xì)胞在進(jìn)行流式細(xì)胞分析測(cè)量之前必須被分離或剝離。這樣，細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有可能被干擾，并且有可能得到錯(cuò)誤讀數(shù)。流式細(xì)胞分析最大的局限性是需要大量的細(xì)胞樣品(IO6數(shù)量級(jí))，這使其無法與穿刺活檢和其它微創(chuàng)活檢采樣技術(shù)相結(jié)合。M^mtMMmmp“芯片實(shí)驗(yàn)室”因?yàn)榫哂性S多內(nèi)在優(yōu)勢(shì)包括節(jié)省樣品、精確的流體傳送、可擴(kuò)展性和數(shù)字可控性，微流體系統(tǒng)成為處理腫瘤樣品的理想平臺(tái)82_87?？梢栽谖⒘黧w設(shè)備中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞測(cè)定72’88_97?？梢詫⒍鄠€(gè)培養(yǎng)室整合到單個(gè)芯片中，從而允許高保真度的多參數(shù)分析。與基于微孔板的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)不同，微流體芯片提供了三維的培養(yǎng)環(huán)境，其更好地模擬了體內(nèi)微環(huán)境。受控的單向流體流動(dòng)提高了生物測(cè)定的保真度。此領(lǐng)域的一些研究者包括斯坦福的StevenQuake博士、加州大學(xué)伯克利分校的LukeLee博士、威斯康星大學(xué)Madison分校的DavidBeebe博士。Quake博士使用微流體生物反應(yīng)器進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的長期培養(yǎng)72以及在單細(xì)胞水平監(jiān)測(cè)極少量細(xì)菌群98。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞98_1(12和酵母的微流體細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備已在UCB開發(fā)并且現(xiàn)已成為商業(yè)產(chǎn)品。Beebe博士已通過利用微觀所特有的擴(kuò)散-限制混合和其它現(xiàn)象在芯片上獲得了一些令人感興趣的細(xì)胞微環(huán)境96’103'1(14。此研究領(lǐng)域得到了很好的發(fā)展和表征，現(xiàn)正進(jìn)入一個(gè)時(shí)期，即可以可靠地利用“芯片實(shí)驗(yàn)室”設(shè)備以在其它停滯的或異常復(fù)雜的研究領(lǐng)域中加快急需的進(jìn)展，但只有當(dāng)經(jīng)濟(jì)和基于解決方案的主動(dòng)性驅(qū)動(dòng)時(shí)。創(chuàng)新的技術(shù)平臺(tái)微流體成像細(xì)胞分析本發(fā)明一些實(shí)施方案的MIC技術(shù)可以以極高的精確度和數(shù)據(jù)保真度進(jìn)行定量的和多參數(shù)的免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)。我們對(duì)一些應(yīng)用的目標(biāo)是檢測(cè)出一系列與造成癌癥惡性轉(zhuǎn)化之癌癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的生物標(biāo)志物。所得到的分子標(biāo)志物可有助于更好地進(jìn)行癌癥診斷和實(shí)施靶向治療。該MIC平臺(tái)整合了三個(gè)功能模塊，包括(i)用于支持原發(fā)性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)的基于PDMS的微流體細(xì)胞陣列芯片；(ii)用于進(jìn)行細(xì)胞接種/培養(yǎng)和ICC的半自動(dòng)化移液器或機(jī)器人移液器；以及(iii)相關(guān)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(熒光顯微鏡)外加用于可擴(kuò)展高含量分析的先進(jìn)軟件，其非常適合于臨床癌癥應(yīng)用。已建立了一系列操作步驟，用于同時(shí)測(cè)量PI3K-Akt_mTOR和RAS-RAF-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑中6種生物標(biāo)志物(EGFR、EGFRvIII、PTEN>pAKT、pS6和pERK)的表達(dá)/磷酸化水平。對(duì)來自原發(fā)性腫瘤組織的異質(zhì)細(xì)胞群進(jìn)行多參數(shù)信號(hào)傳導(dǎo)分析現(xiàn)在是可能的。我們還顯示了MIC技術(shù)追蹤暴露于外源性刺激(例如藥物和生長因子)之癌細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)事件的動(dòng)態(tài)變化的能力。我們還應(yīng)用MIC技術(shù)檢測(cè)超過一個(gè)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)事件，例如，PI3K-AKT-mTOR和RAS-RAF-MAPK途徑之間的交流和包括m_TOR、IRS1和pAKT的反饋相互作用。MIC技術(shù)的某些方面總結(jié)如下1.可講行體外分子診斷。MIC技術(shù)可以將微流體的優(yōu)勢(shì)(即，節(jié)省樣品、快速、可擴(kuò)展性、自動(dòng)化和可重復(fù)性)運(yùn)用到一套解決方案中，從而有助于臨床病理學(xué)家在分子水平對(duì)個(gè)體癌癥進(jìn)行確鑿的表征。我們正在倡導(dǎo)患者癌細(xì)胞中單細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分析的概念。2.顯著節(jié)約樣品。在生物學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)室中常用的用于蛋白質(zhì)定量的技術(shù)(如Western印跡和流式細(xì)胞術(shù))對(duì)于單次測(cè)量至少需要IO4個(gè)細(xì)胞。MIC技術(shù)可以僅使用200個(gè)細(xì)胞在少于1.0μL培養(yǎng)基中定量4種信號(hào)分子。相比于Western印跡和流式細(xì)胞術(shù)，在MIC技術(shù)中抗體的消耗量顯著減少。MIC技術(shù)中節(jié)省樣品更好地允許其分析數(shù)量有限的不能使用Western印跡、流式細(xì)胞分析、ICC和免疫組織化學(xué)分析的珍貴的病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)樣品。MIC數(shù)據(jù)的單細(xì)胞分辨率和多參數(shù)性質(zhì)明確區(qū)分了癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物，從而解決了細(xì)胞和腫瘤的異質(zhì)性問題，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了同類技術(shù)的表現(xiàn)。3.操作節(jié)省成本以及使用簡便。進(jìn)行半自動(dòng)化MIC測(cè)量的成本可以相當(dāng)?shù)?。我們的制造策略可以降低MIC芯片的成本，由于其高附加值，因此在市場(chǎng)上極具競(jìng)爭(zhēng)力。為實(shí)現(xiàn)更高的通量，可以以較低的成本投入獲得適當(dāng)?shù)淖詣?dòng)液體處理方案。熒光細(xì)胞分析圖像可利用大部分配有合適的CCD相機(jī)和標(biāo)準(zhǔn)濾鏡套件的熒光顯微鏡獲得。4.附加的細(xì)胞分詵能力。特有的芯片制造策略可允許功能性表面方便地整合到MIC芯片的基底上。例如，鏈霉親和素涂層或DNA陣列可被引入MIC芯片上以允許特異性針對(duì)癌細(xì)胞表面標(biāo)志物的經(jīng)生物素化和DNA綁定的抗體的固定，從而實(shí)現(xiàn)芯片上細(xì)胞捕獲功能?？赏ㄟ^首先進(jìn)行芯片上細(xì)胞分選，然后對(duì)一系列生物標(biāo)志物進(jìn)行MIC信號(hào)傳導(dǎo)分析，來對(duì)癌細(xì)胞亞群的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行。5.大規(guī)模整合。MIC技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型(包括但不限于癌細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞)可在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，其通過對(duì)細(xì)胞處理和制備步驟進(jìn)行整合和自動(dòng)化從而允許多個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)或者平行或者一式兩份地進(jìn)行。MIC技術(shù)可以得到可重復(fù)的高含量數(shù)據(jù)和定量分析，其可應(yīng)用于大規(guī)模的藥物篩選。實(shí)施例研究和結(jié)果微流體成像細(xì)胞分析(MIC)技術(shù)將微流體細(xì)胞陣列88’89與機(jī)器人移液器(用于進(jìn)行樣品制備和免疫細(xì)胞化學(xué))和自動(dòng)熒光顯微鏡(用于圖像采集和分析)整合在一起。已使用MIC技術(shù)對(duì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中多種蛋白質(zhì)檢測(cè)進(jìn)行定量和可重復(fù)的免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)，而其只使用少量的生物樣品。使用多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系以及經(jīng)遺傳改變的和原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞驗(yàn)證MIC技術(shù)。與PI3K-AKT_mTOR和RAS-RAF-MAPK途徑均相關(guān)的6種信號(hào)蛋白(包括受體酪氨酸激酶(EGFR和EGFRvIII)、磷酸酶(PTEN)和磷酸化蛋白(pAkt、pS6和pERK))的表達(dá)/磷酸化水平可在單細(xì)胞精確度下平行定量。值得注意的是，在暴露于外源性刺激(例如生長因子和激酶抑制劑)之后，這些蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化可以被動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，這提供了更好地了解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞如何響應(yīng)藥物治療組合的有力工具。同時(shí)，Wu博士的研究小組一直在研究受PTEN控制的腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。PTEN是第二最易缺失的人腫瘤抑制基因"_13’19’2°。還發(fā)現(xiàn)PTEN突變是引起三種常染色體顯性遺傳腫瘤易感綜合癥的原因。Wu博士的實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了用于途徑分析的多個(gè)同源細(xì)胞系以及體內(nèi)腫瘤模型，用于了解小鼠中PTEN控制腫瘤發(fā)生的分子和遺傳機(jī)制22’1(|η°9，Mischel博士的臨床病理學(xué)專業(yè)知識(shí)將MIC技術(shù)應(yīng)用到臨床。半自動(dòng)化的MIC技術(shù)MIC技術(shù)的實(shí)施方案(圖22)具有基于PDMS的微流體細(xì)胞陣列芯片、用于進(jìn)行細(xì)胞接種/培養(yǎng)和免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)的半自動(dòng)移液器、用于圖像采集和分析的自動(dòng)熒光顯微鏡和相關(guān)軟件。所述細(xì)胞陣列芯片采用軟光刻技術(shù)、隨后使用未固化的PDMS膜通過O2等離子體鍵合或直接附著而構(gòu)建。典型的細(xì)胞陣列芯片可容納24個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室(尺寸為7000μιη(長)ΧΙΟΟΟμιη(寬)Χ80μιη(高)，總?cè)莘e為560nL)。根據(jù)細(xì)胞類型，約200至2000個(gè)細(xì)胞可容納在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室中。在培養(yǎng)室的兩端各具有一個(gè)入口和出口通道，其可將培養(yǎng)基和試劑運(yùn)送給培養(yǎng)的細(xì)胞。所述半自動(dòng)化移液器直接插入所述入口，樣品/溶液的體積和流速受到精確地?cái)?shù)字控制。在我們的“概念驗(yàn)證”研究中，測(cè)試遺傳學(xué)和生物化學(xué)定義的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(包括親代U87細(xì)胞和信號(hào)蛋白過表達(dá)的經(jīng)遺傳修飾的U87細(xì)胞(U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87_EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN))以及原發(fā)性腫瘤組織來驗(yàn)證MIC技術(shù)的該實(shí)施方案。在實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞陣列芯片置于潮濕的培養(yǎng)箱中(5%C02，37°C)。PDMS是氣體可透過的，可以在培養(yǎng)箱環(huán)境和培養(yǎng)室中細(xì)胞培養(yǎng)基之間快速交換氣體。圖22討論了微細(xì)胞成像細(xì)胞分析儀(MIC)技術(shù)的概念概述(a)從患者獲取的分散的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞被引入微流體細(xì)胞陣列芯片通過MIC技術(shù)進(jìn)行多參數(shù)分析。(b)使用半自動(dòng)化移液裝置進(jìn)行細(xì)胞接種/培養(yǎng)和ICC。(c)芯片上ICC處理的樣品被裝入熒光顯微鏡用于圖像采集接著使用圖像細(xì)胞分析程序進(jìn)行分析(Metamorph，MolecularDevicesInc.)以單細(xì)胞分辨率定量信號(hào)蛋白質(zhì)的表達(dá)。芯片上細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化和細(xì)胞生長的定量根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，我們使用細(xì)胞陣列芯片來確定最佳表面涂層，以及最佳的細(xì)胞供給時(shí)間表，以維持芯片培養(yǎng)的細(xì)胞。玻璃/PDMS基底上的聚-L-賴氨酸(PLL)涂層對(duì)于培養(yǎng)親代和經(jīng)遺傳修飾的U87細(xì)胞系來說是最佳的。為了維持從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織中分離的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，我們開發(fā)了在玻璃/PDMS表面上用Matrigel進(jìn)行逐層(layer-by-layer)包被的方法。此外，我們證實(shí)在1236小時(shí)的供給周期可以使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖至少10天。生存力測(cè)定(例如，來自Iiwitrogen的CalceinAM或MitoTrackerRed)顯示了此設(shè)備中細(xì)胞的生存力。GBM的生長速率通過在不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)來定量。雖然細(xì)胞增殖的抑制作用已在其它微流體細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備中有所報(bào)道1(13，但此細(xì)胞陣列芯片中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長速率與在常規(guī)培養(yǎng)皿中觀察到的11(1相當(dāng)。此外，我們還開發(fā)了多種將新近分離/釋放的細(xì)胞固定到細(xì)胞陣列芯片基底上的直接附著方法。我們可以放入一層組織粘附蛋白(CellTak)以固定懸液中的細(xì)胞，使得能夠?qū)π陆蛛x的細(xì)胞進(jìn)行MIC測(cè)量(見圖26和28)。我們還將鏈霉親和素和DNA涂層引入我們的細(xì)胞陣列芯片基底上，由此生物素化和經(jīng)DNA綴合的捕獲劑(例如抗體)可固定于表面上從而有利于基于芯片的細(xì)胞分選。圖26顯示了使用MIC技術(shù)平行進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)分析。使用4種單獨(dú)的細(xì)胞系(左，即U87(綠色)、U87-EGFR(藍(lán)色)、U87-PTEN(黃色)和U87-EFGR/PTEN(粉色))以及它們的混合物(右)平行檢測(cè)和定量四種信號(hào)分子(包括EGFR、PTEN、pAKT和pS6)。在兩種不同的條件(即細(xì)胞在MIC芯片上鋪展前(下)和后(上))下進(jìn)行MIC測(cè)量。獲得單獨(dú)細(xì)胞系和細(xì)胞混合物的5種顏色免疫染色(即DAPI、抗EGFR抗體(Cy7)、抗PTEN抗體(TRITC)、抗ρAKT抗體(Cy5)和抗pS6抗體(FITC))的重疊顯微圖像(中)。在成像細(xì)胞術(shù)分析后，使用3維(3D)散點(diǎn)圖來顯示此多參數(shù)分析的能力——所述四種不同類型的細(xì)胞在空間上被分為四個(gè)不同的群體。細(xì)胞混合物的測(cè)量重現(xiàn)(右)了單獨(dú)測(cè)量所得的結(jié)果(左)。圖28顯示了使用3維散點(diǎn)圖的兩個(gè)不同視角來表明在MIC芯片中分析的腦腫瘤細(xì)胞樣品的細(xì)胞異質(zhì)性。在此圖中可鑒定出三種類型的細(xì)胞——藍(lán)色圓圈(正常神經(jīng)元細(xì)胞)、紅色圓圈(單損傷的腦癌細(xì)胞)和綠色圓圈(雙損傷的腦癌細(xì)胞)。使用過表達(dá)和缺失細(xì)胞進(jìn)行基于芯片的免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)的定量分析—般地，ICC使用各種熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體來識(shí)別細(xì)胞中特異性蛋白質(zhì)分子。由于抗體試劑很昂貴，因此在常規(guī)宏觀水平上進(jìn)行參數(shù)測(cè)定的優(yōu)化(試劑濃度、操作步驟等)是不切實(shí)際的。因此，ICC方法只能檢測(cè)細(xì)胞中靶蛋白質(zhì)的存在/缺失，并且在ICC處理的樣品中熒光信號(hào)并不反映靶蛋白質(zhì)的絕對(duì)量。所述MIC技術(shù)的建立基于完全優(yōu)化的操作步驟，其確保ICC的可靠性和可重復(fù)性。為了實(shí)現(xiàn)廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)/磷酸化水平測(cè)量的精確性，我們對(duì)每種抗體進(jìn)行了ICC操作步驟的系統(tǒng)性優(yōu)化。使用相應(yīng)的低/高表達(dá)細(xì)胞系系統(tǒng)分別為U87與U87-EGFR、U87與U87_EGFRvIII、U87與U87-PTEN、經(jīng)曲西立濱(Triciribine)處理的U87_EGFRvIII與EGFRvIII以及經(jīng)雷帕霉素處理的U87與U87-EGFRvIII)測(cè)試了與PI3K-AKT_mTOR途徑相關(guān)的5種目的信號(hào)蛋白(即EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT和pS6)。我們能夠測(cè)試多種ICC試劑以及用于細(xì)胞固定、膜透化和抗體染色的條件，以及用于控制試劑/溶液體積和所應(yīng)用流速的半自動(dòng)化移液器的操作參數(shù)。優(yōu)化的條件使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞和0.3%TritonX-100進(jìn)行細(xì)胞膜透化。將高度特異性抗體(抗EGFR抗體(BDPharmigen)、抗EGFRvIII抗體(Dako)、抗PTEN抗體(Cascade)、抗ρAKT抗體(CellSignaling)和抗pS6抗體(CellSignaling))的每一個(gè)與不同的熒光團(tuán)(分別在750nm(Cy7)、647nm(Cy5)、555nm(TRITC)、647nm(Cy5)和488nm(FITC)發(fā)射熒光)綴合?；陬愃频姆椒ǎ覀兡軌蚴褂酶魇芸刂频募?xì)胞系優(yōu)化針對(duì)pERK(RAS-RAF-MAPK途徑中的一個(gè)信號(hào)結(jié)點(diǎn))的MIC操作步驟(數(shù)據(jù)未顯示)。將包含經(jīng)ICC處理之細(xì)胞的MIC芯片安裝于用于圖像采集的熒光顯微鏡(NikonTE2000S)上。對(duì)顯微鏡和CCD相機(jī)(Photomatrix，CascadeII)的操作參數(shù)(即圖像曝光時(shí)間和EM增益)也進(jìn)行了優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)熒光圖像的最佳信噪比。使用MetaMorph程序(MolecularDevices)來定量個(gè)體細(xì)胞中的特異性熒光信號(hào)并產(chǎn)生細(xì)胞分析直方圖。在每組測(cè)量中，在圖像分析后得到了一對(duì)分別針對(duì)低表達(dá)和高表達(dá)細(xì)胞樣品的直方圖。微調(diào)MIC條件和成像參數(shù)的目的是實(shí)現(xiàn)兩個(gè)直方圖的最大分離。好的分離對(duì)于定量多個(gè)信號(hào)蛋白來說至關(guān)重要。圖23顯示了對(duì)經(jīng)FITC標(biāo)記的pS6抗體濃度的微調(diào)過程，以獲得在U87-EGFRvIII細(xì)胞(具有持續(xù)的高水平pS6)和經(jīng)雷帕霉素處理的U87細(xì)胞(具有低水平的pS6，其由于雷帕霉素抑制mTOR所致)中定量pS6磷酸化的最佳動(dòng)態(tài)范圍。我們發(fā)現(xiàn)，在4.5μg/mL的抗pS6抗體濃度給出了pS6陽性和陰性細(xì)胞之間熒光信號(hào)最佳對(duì)比。每個(gè)ICC實(shí)驗(yàn)只使用700nL的pS6抗體溶液(約2.5ng抗體)，這表明與常規(guī)的使用顯微鏡蓋玻片的ICC方法相比，至少節(jié)省了兩個(gè)數(shù)量級(jí)的樣品。此外，信號(hào)分子的定量具有高度可重復(fù)性。除了pS6定量以外，通過類似的優(yōu)化方法，也獲得了用于其它信號(hào)蛋白(包括EGFRvIII、EGFR、PTEN禾ΠpAKT)的最佳ICC操作步驟。圖23顯示了對(duì)用于可定量之ICC的經(jīng)FITC標(biāo)記的pS6抗體濃度的優(yōu)化。a)在不同抗pS6抗體濃度(即O、0.045、0.45和4.5μg/ml)存在下獲得的U87_EGFRvIII(pS6+)和經(jīng)雷帕霉素出理之U87(pS6-)的顯微圖像。b)使用MetaMorph進(jìn)行細(xì)胞分析圖像分析，顯示出4.5μg/mL的抗體濃度給出了pS6陽性和陰性細(xì)胞之間的最好分離。C)細(xì)胞鋪展表面積平均值和背景消減改善了直方圖的峰分離并減少了帶寬(寬度)。圖24概述了使用最優(yōu)的ICC條件和操作參數(shù)，在個(gè)體細(xì)胞中檢測(cè)EGFRvIII、EGFR、PTEN、ρAKT和pS6的動(dòng)態(tài)范圍。這些結(jié)果已通過使用同樣細(xì)胞樣品的Western印跡測(cè)量所驗(yàn)證。通過應(yīng)用(i)細(xì)胞鋪展表面積平均值(排除細(xì)胞大小的差異)和Gi)背景消減，每對(duì)直方圖之間的分離得到改善，并且每個(gè)直方圖的帶寬也尖銳了，這反映出MIC技術(shù)顯著改進(jìn)的動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度。圖24顯示了在最優(yōu)的ICC條件下，MIC技術(shù)用于EGFRvIII、EGFR、PTEN、pAKT和pS6單細(xì)胞分析的動(dòng)態(tài)范圍。a)在對(duì)照細(xì)胞系中檢測(cè)5種信號(hào)蛋白的Western印跡數(shù)據(jù)，b)經(jīng)ICC處理之細(xì)胞的熒光顯微圖像，c)在個(gè)體細(xì)胞中定量5種信號(hào)蛋白的動(dòng)態(tài)范圍的改善。細(xì)胞鋪展面積平均值和背景消減提高了用于定量的動(dòng)態(tài)范圍。確定遺傳損傷的主要挑戰(zhàn)之一是測(cè)量某特定腫瘤抑制基因的雜合性缺失(LOH)，這是因?yàn)?i)組織中的內(nèi)部信號(hào)相對(duì)較低，以及(ii)周圍的正常組織表達(dá)正常水平的腫瘤抑制基因，其產(chǎn)生了顯著的背景信號(hào)。PTEN是在人類癌癥中發(fā)現(xiàn)的第二易于缺失的腫瘤抑制基因，并且PTEN負(fù)調(diào)節(jié)PI3K-AKT_mTOR途徑。為了測(cè)試使用MIC技術(shù)在原代細(xì)胞(其中PTEN基因表達(dá)水平為2、1或0)中定量PTEN表達(dá)的可行性，使用T2組小鼠同源細(xì)胞系，包括(i)PTENES細(xì)胞系(即ρ8(+/")和CaPS(-/"))以及(ii)MEF細(xì)胞系(即PTEN1——(+/+)和ΡΤΕΝΔ—(-/-))。如圖25所示，MIC技術(shù)得到2對(duì)直方圖，這表明MIC技術(shù)能夠在各樣品組(即ρ8(+/-)與CaPS(-/-)和PTEN1?！猯oxp(+/+)與ΡΤΕΝΔ—(-/-))中區(qū)分雜合性(LOH)和全PTEN缺失。使用同批細(xì)胞樣品，通過MIC技術(shù)獲得的結(jié)果與Western印跡技術(shù)測(cè)得的結(jié)果相一致。MIC測(cè)量的每組測(cè)量只消耗2000個(gè)細(xì)胞，而需要IO6個(gè)細(xì)胞才能獲得可靠的信號(hào)。還可利用MIC技術(shù)檢測(cè)PTEN的下游信號(hào)節(jié)點(diǎn)——ρAKT,結(jié)果表明PTEN負(fù)調(diào)控PI3K-AKT_mTOR途徑。圖25顯示了對(duì)兩組小鼠同源細(xì)胞系(包括(i)PTENES細(xì)胞系，即p8(+/-)和CaP8(-/")，以及(ii)MEF細(xì)胞系，即PTEN1——(+/+)和ΡΤΕΝΔ—(-/-))中PTEN表達(dá)和ρΑΚΤ磷酸化的定量。分別使用106和2000個(gè)細(xì)胞平行進(jìn)行Western印跡和MIC測(cè)量。MIC技術(shù)能夠區(qū)分雜合性丟失(LOH，p8(+/-)與CaPS(-/-))和完全PTEN缺失(PTEN1oxp7loxp(+/+)與ΡΤΕΝΔ1—(-/-))。通過MIC技術(shù)獲得的結(jié)果與Western印跡觀察到的結(jié)果相一致。還利用MIC技術(shù)檢測(cè)PTEN的下游信號(hào)節(jié)點(diǎn)——ρΑΚΤ,結(jié)果表明PTEN負(fù)調(diào)控PI3K-AKT_mTOR途徑。在由四種細(xì)胞類型組成的細(xì)胞混合物中平行檢測(cè)四種信號(hào)分子MIC技術(shù)能夠平行檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞中的若干信號(hào)分子，從而可以獲取組織樣品中的細(xì)胞異質(zhì)性。為了證明這一點(diǎn)，我們使用個(gè)體細(xì)胞系(即U87、U87-EGFR、U87-PTEN和U87-EGFR/PTEN)和人工細(xì)胞混合物(包含1111的所述四種細(xì)胞系)進(jìn)行(圖26)四種信號(hào)分子(即EGFR、ΡΤΕΝ、ρΑΚΤ和pS6)的平行檢測(cè)。在兩種不同的條件(即細(xì)胞鋪展前后)下進(jìn)行MIC測(cè)量，以比較細(xì)胞形態(tài)如何影響信號(hào)傳導(dǎo)分析。將獨(dú)立開發(fā)的ICC條件相結(jié)合，從而用含有經(jīng)Cy7標(biāo)記的抗EFGR抗體、經(jīng)Cy5標(biāo)記的抗ρΑΚΤ抗體、經(jīng)TRITC標(biāo)記的抗PTEN抗體和經(jīng)FITC標(biāo)記的抗pS6抗體的抗體混合物處理微芯片種經(jīng)多聚甲醛固定并用去垢劑透化的細(xì)胞混合物，其產(chǎn)生多色染色(DAPI、抗EGFR抗體(Cy7)、抗PTEN抗體(TRITC)、抗ρΑΚΤ抗體(Cy5)和抗pS6抗體(FITC)。合并從不同熒光通道采集的圖像以顯示四種信號(hào)分子的共定位。通過進(jìn)行細(xì)胞分析圖像分析，獲得了個(gè)體細(xì)胞中EGFR、ΡΤΕΝ、ρΑΚΤ和pS6的水平。通過多參數(shù)分析，3維(3D)散點(diǎn)圖(X、Y和Z軸分別代表EGFR、PTEN和pS6)區(qū)分了不同的細(xì)胞類型。如圖26所示，4種不同類型的細(xì)胞幾乎完全被分為四個(gè)不同的群體。同時(shí)，我們還測(cè)試了一種溫和的細(xì)胞剝離方法在37°C使用TryPELExpress(Invitrogen)處理15分鐘，以對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件影響盡可能小的方式從培養(yǎng)瓶收獲細(xì)胞。使用這種處理方法，將新近剝離的細(xì)胞固定于用粘附基質(zhì)(Cell-Tak)包被的微流體通道上。隨后的MIC測(cè)量顯示，粘附的“圓細(xì)胞”與完全鋪展形態(tài)的穩(wěn)定細(xì)胞所觀察到的信號(hào)傳導(dǎo)模式非常類似。這種溫和的細(xì)胞剝離方法被應(yīng)用于分離手術(shù)切除的腦腫瘤組織，以對(duì)原代細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)模式的影響盡可能小。使用MIC技術(shù)對(duì)雷帕霉素進(jìn)行單細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)研究ICC方法常用來檢測(cè)細(xì)胞中靶蛋白質(zhì)的存在/缺失，但由于數(shù)據(jù)重復(fù)性差，它不適于蛋白質(zhì)表達(dá)/磷酸化的定量?；谏衔乃龅腗IC技術(shù)進(jìn)行定量的能力，我們?cè)噲D將MIC技術(shù)應(yīng)用于雷帕霉素的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。雷帕霉素是一種靶向mTOR的強(qiáng)效抑制劑，mTOR是PI3K信號(hào)途徑的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子。雷帕霉素對(duì)mTOR的抑制作用可通過監(jiān)測(cè)下游信號(hào)分子pS6的激活來定量。使用MIC技術(shù)在個(gè)體細(xì)胞中對(duì)由雷帕霉素引起的pS6水平的下調(diào)進(jìn)行定量(圖27)。在這種情形中，將U87細(xì)胞培養(yǎng)在微流體細(xì)胞陣列芯片中，其中將含有不同濃度(即0、0.2、0.5、2.0、5.0和20nM)雷帕霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基引入不同組的細(xì)胞培養(yǎng)室。所得到的由數(shù)千個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)組成的直方圖確實(shí)反映出劑量依賴性的抑制作用?？赏ㄟ^繪制平均pS6水平與對(duì)應(yīng)的雷帕霉素濃度來獲得劑量依賴曲線，得到2.69nM的IC5tl值。該IC5tl由基于Western印跡的定量方法得以驗(yàn)證(Ι.ΟηΜ)，其中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)需要IO6個(gè)細(xì)胞。圖27顯示了用不同濃度雷帕霉素處理的個(gè)體細(xì)胞中pS6表達(dá)水平的定量。a)將U87細(xì)胞培養(yǎng)在微流體細(xì)胞陣列芯片中，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中含有0、0.2、0.5、2.0、5.0、20nM的雷帕霉素。b)利用MIC技術(shù)對(duì)個(gè)體細(xì)胞中由雷帕霉素引起的pS6水平下調(diào)進(jìn)行定量。對(duì)應(yīng)于不同劑量雷帕霉素的六個(gè)直方圖反映了雷帕霉素抑制作用的不同水平，C)通過繪制pS6水平與對(duì)應(yīng)的雷帕霉素濃度可以獲得劑量依賴曲線。從該劑量依賴曲線可以推導(dǎo)出IC5tl值(2.69nM)。利用MIC技術(shù)測(cè)得的IC5tl由Western印跡得以驗(yàn)證，其每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)需要IO6個(gè)細(xì)胞。所得到的劑量依賴曲線得出IC5tl值為Ι.ΟηΜ。使用腦腫瘤組織進(jìn)行MIC技術(shù)的臨床驗(yàn)證使用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行的MIC技術(shù)的成功展示鼓勵(lì)我們?cè)谂R床環(huán)境下測(cè)試MIC體外分子診斷技術(shù)。我們能夠?qū)⑽覀兊氖状悟?yàn)證研究與現(xiàn)有的關(guān)注于腦腫瘤靶向治療的臨床試驗(yàn)相結(jié)合。所招募和測(cè)試的是加州大學(xué)洛杉磯分校醫(yī)學(xué)院的一組臨床上良好表征的腦癌患者。腦腫瘤常含有高比例的癌細(xì)胞，因此是驗(yàn)證MIC技術(shù)的非常好的模型系統(tǒng)。到目前為止，我們能夠在MIC芯片上進(jìn)行定量/多參數(shù)的ICC來測(cè)量手術(shù)切除的七例腦腫瘤(即不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤)中的分子標(biāo)志物(即，EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT和pS6)。為了確保對(duì)細(xì)胞盡可能低的干擾，我們的聯(lián)合小組開發(fā)并建立了一種溫和且快速的腫瘤分離操作步驟(在37°C使用TryPELExpress處理15分鐘)來處理新近分離的腫瘤組織。如圖28所示，從小兒腦腫瘤組織中鑒定出三個(gè)細(xì)胞亞群，這反映出腫瘤的內(nèi)在組織異質(zhì)性以及不同細(xì)胞類型的特征。對(duì)于接受靶向藥物(例如，雷帕霉素)治療的患者，觀察到他們的腫瘤細(xì)胞中pS6磷酸化水平顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明治療引起信號(hào)傳導(dǎo)抑制。目前，MIC芯片涉及對(duì)人前列腺癌和膀胱癌，以及白血病細(xì)胞系和其它患者樣品的進(jìn)一步驗(yàn)證。自動(dòng)化樣品制備/免疫染色——在微流體細(xì)胞陣列芯片與機(jī)器人移液系統(tǒng)之間創(chuàng)建用戶友好型界面，從而在緊密相關(guān)的微環(huán)境中進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分析原來的MIC平臺(tái)使用人工操作的半自動(dòng)化移液器來依序進(jìn)行樣品制備和ICC。所述移液器通過數(shù)字化控制流速和體積，但其余的操作/過程事實(shí)上均是手動(dòng)操作的。一般地，人的參與會(huì)引起操作者差異和誤差，因此，為了應(yīng)用于高通量和/或多步驟的研究，半自動(dòng)化的MIC平臺(tái)需要升級(jí)。已開發(fā)了在微流體細(xì)胞陣列芯片與機(jī)器人移液器之間的用戶友好型界面(圖28A-28B)。我們的目標(biāo)是建立從最初的細(xì)胞加載和培養(yǎng)(包括培養(yǎng)基更換)到免疫染色的全自動(dòng)化操作，從而可以進(jìn)行復(fù)雜的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)/測(cè)定以用于高通量信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析。用于自動(dòng)化樣品制備和染色的機(jī)器人移液器的設(shè)計(jì)所述用戶友好型界面的機(jī)械方面包括兩個(gè)定制設(shè)計(jì)的組件即芯片支架(圖29A-29B)和移液器吸頭陣列(圖29A-照片和29E-示意圖)。機(jī)器人移液系統(tǒng)(NanodropII，Innovadyne)被設(shè)計(jì)用于處理96、384和/或1536孔板。為了符合這些標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)造，該芯片支架被設(shè)計(jì)成具有與孔板相同的形狀(footprint)，從而使得可以直接與機(jī)器人系統(tǒng)(和其它孔板系統(tǒng))對(duì)接。目前，一個(gè)芯片支架可以容納4個(gè)微流體細(xì)胞培養(yǎng)芯片，每個(gè)微流體芯片具有3040個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室。細(xì)胞培養(yǎng)室每個(gè)入口和出口孔的位置都相應(yīng)于1536孔板中的孔位置。因此，原來為處理1536孔板所開發(fā)的程序可進(jìn)行簡單地優(yōu)化并用于在MIC芯片上進(jìn)行樣品制備和ICC。圖29顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，以自動(dòng)化方式進(jìn)行大規(guī)模信號(hào)分析的機(jī)器人移液系統(tǒng)。a)設(shè)計(jì)用于在孔板模式中處理樣品和試劑的機(jī)器人移液系統(tǒng)。b)與孔板形狀一致的定制設(shè)計(jì)的芯片支架，其允許機(jī)器人系統(tǒng)與細(xì)胞陣列芯片之間方便而準(zhǔn)確地對(duì)接。c)定制的模具，用于制備具有固定的標(biāo)準(zhǔn)芯片高度的芯片。d)具有30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室的細(xì)胞陣列芯片。e)配有四對(duì)移液器的芯片的截面圖，f)示意圖，說明一對(duì)移液器吸頭如何在微流體細(xì)胞培養(yǎng)室中用來分配和抽取樣品/溶液。圖30顯示在MIC芯片12中分析的12例腦腫瘤樣品的3維散點(diǎn)圖，其表明個(gè)體腫瘤樣品具有顯著不同的細(xì)胞異質(zhì)性。圖31顯示使用等級(jí)聚類法用于分析和定量給定患者樣品中的細(xì)胞異質(zhì)性。芯片支架和對(duì)齊系統(tǒng)的設(shè)計(jì)芯片支架是關(guān)鍵組件，其可以根據(jù)機(jī)器人移液系統(tǒng)的坐標(biāo)系統(tǒng)確保微流體芯片的精確位置和取向。移液吸頭精確地與細(xì)胞培養(yǎng)室入口和出口對(duì)齊。對(duì)芯片的機(jī)械壓力和鉗夾機(jī)制的組合確保了芯片方便和一致的定位，并容許組裝中的細(xì)微差異。機(jī)器人移液系統(tǒng)具有8個(gè)獨(dú)立控制的移液器吸頭，每個(gè)都能夠以5nL精確度分配和抽取液體樣品。為了整合MIC芯片與機(jī)器人移液系統(tǒng)，我們將8個(gè)吸頭分成用于處理四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室的4對(duì)(圖29E)。在每對(duì)吸頭中，一個(gè)負(fù)責(zé)分配流體，另一個(gè)用于收集“廢”液。我們的設(shè)計(jì)利用了基于PDMS之微流體芯片的彈性，從而在每個(gè)移液器吸頭和微流體芯片的入口之間實(shí)現(xiàn)液體密封，以消除微流體培養(yǎng)室中難以攻克的氣泡問題。吸頭的直徑約為1.0mm，PDMS的孔徑約為400μm，因而允許定位錯(cuò)誤的合理容忍度。圖29F示意一對(duì)吸頭如何同時(shí)處理微流體細(xì)胞培養(yǎng)室中的樣品/溶液加載和排除。左邊的吸頭從試劑槽中吸取新的培養(yǎng)基或試劑，然后密封于入口孔上部的PDMS芯片的頂部。液體被注入通道，并從出口推出。此廢液被第二個(gè)吸頭抽出。半自動(dòng)化的移液方法需要約20分鐘完成芯片上定期的細(xì)胞培養(yǎng)基更換，與此不同的是，通過機(jī)器人系統(tǒng)完成同樣的過程可少于10分鐘。設(shè)計(jì)并構(gòu)建了特殊的模具(圖29C)用于大量生產(chǎn)尺寸一致的芯片，因?yàn)樾酒穸葘?duì)于液體密封的形成來說是不可或缺的。用戶友好型控制界面除了界面的機(jī)械方面以外，還有重要的軟件組件。我們已開發(fā)了非常靈活的程序界面來執(zhí)行通用的“操作步驟/菜單”(細(xì)胞加載、培養(yǎng)基更換、ICC等)，其由XML文件中設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)化步驟組成。每個(gè)操作步驟具體化為試劑位置、分配體積、分配速度等。用戶只需選擇“菜單”來自動(dòng)執(zhí)行。該軟件允許具體規(guī)定哪些芯片(以及每個(gè)芯片哪些行)應(yīng)加載新的培養(yǎng)基和試劑，以用于更復(fù)雜的涉及不同細(xì)胞類型或不同處理的研究。基于從20例腦腫瘤患者中獲得的組織樣品進(jìn)行的臨床驗(yàn)證所招募和測(cè)試的是加州大學(xué)洛杉磯分校醫(yī)學(xué)院的一組臨床上良好表征的腦癌患者。腦腫瘤常含有高比例的癌細(xì)胞，因此是驗(yàn)證MIC技術(shù)的非常好的模型系統(tǒng)。到目前為止，我們能夠在MIC芯片上進(jìn)行定量/多參數(shù)的ICC來測(cè)量手術(shù)切除的七例腦腫瘤(即不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤)中的分子標(biāo)志物(即，EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT和pS6)。為了確保對(duì)細(xì)胞盡可能低的干擾，我們的聯(lián)合小組開發(fā)并建立了一種溫和且快速的腫瘤分離操作步驟(在37°C使用TryPELExpress處理15分鐘)來處理新近分離的腫瘤組織。使用三維對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖來使每個(gè)單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)和磷酸化水平可視化。每個(gè)患者都有不同的點(diǎn)分布和聚類，這反映出腫瘤的內(nèi)在組織異質(zhì)性以及不同細(xì)胞類型的特征。圖30顯示了從12例腦腫瘤患者中獲得的結(jié)果。雙參數(shù)點(diǎn)圖已被用來顯示上游蛋白PTEN和EGFR與下游蛋白pAKT和pS6的關(guān)系。PTEN、EGFR、pAKT和pS6之高表達(dá)和低表達(dá)的閾值通過所有患者的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)獲得。我們還可以得到每個(gè)亞群中細(xì)胞的百分比。等級(jí)聚類分析同時(shí)顯示了所述4種蛋白的表達(dá)水平，以及每個(gè)亞群細(xì)胞的相似性。實(shí)施例開發(fā)用于對(duì)腦腫瘤和腦腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分子分析的基于微流體的成像細(xì)胞分析(MIC)數(shù)據(jù)顯示，包含添加有表皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子之無血清培養(yǎng)基的體外神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)培養(yǎng)系統(tǒng)當(dāng)用于培養(yǎng)人原發(fā)性腫瘤分離物時(shí)，富集并維持了引發(fā)腫瘤的/致瘤細(xì)胞群(稱為“腦腫瘤干細(xì)胞”(braintumorstemcells，BTSC))這些細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞基因(Nakano等)，具有非表面附著生長的特性以及形成稱為“神經(jīng)球”的特征性球形聚集體。與其依賴于附著的“非干細(xì)胞”對(duì)應(yīng)物(其在包含基于血清之培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中富集)不同的是，這些推測(cè)的BTSC滿足癌癥干細(xì)胞生物學(xué)特性的大部分原則，它們自我更新，能夠多潛能分化，以及當(dāng)異種移植時(shí)可形成腫瘤(其可再現(xiàn)其來源之親本腫瘤的許多方面)。最近的數(shù)據(jù)表明，長時(shí)間傳代的患者BTSC細(xì)胞系的生長和能力可模擬患者腫瘤的臨床進(jìn)程，因此，該體外模型可作為獨(dú)立的預(yù)后因素(Laks寸乂OBTSC理論(源自正常神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的A、B和C型神經(jīng)祖細(xì)胞)的另一組成部分是，這些BTSC可能比其它腦腫瘤細(xì)胞的子代更加靜息且更少有絲分裂活動(dòng)，而最靜息的細(xì)胞保留了大部分“干細(xì)胞樣”特征，分裂快速的細(xì)胞具有更有限的祖細(xì)胞能力。這已被假定為這些細(xì)胞具有“化療抗性”的原因之一，僅僅因?yàn)橹钡教禺愋韵魅跫?xì)胞信號(hào)途徑的已知靶向分子的藥物類別出現(xiàn)，臨床上最常用的化療方式才能靶向具有高度有絲分裂活性的細(xì)胞。作為基于微流體的成像細(xì)胞分析(MIC)之概念驗(yàn)證的目的信號(hào)途徑是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑，因?yàn)樗氖д{(diào)涉及腦腫瘤的發(fā)生與腦癌干細(xì)胞的演變和維持。在單細(xì)胞分辨率下同步進(jìn)行多節(jié)點(diǎn)(pS6、PTEN、pAkt和EGFR)分析允許研究原發(fā)性腫瘤中的每個(gè)細(xì)胞、培養(yǎng)的腦腫瘤干細(xì)胞和非干細(xì)胞的子代中的這些組分。該MIC系統(tǒng)通過比較患者的腦腫瘤樣品以及他們的非BTSC和BTSC富集的子代(體外第一次傳代)鑒定出有價(jià)值的途徑內(nèi)和途徑間差異并鑒定出個(gè)體化BTSC分子“標(biāo)志物”，其揭示了驚人的途徑相似性用以區(qū)分干細(xì)胞(NS，“神經(jīng)球”)和非干細(xì)胞(SC，“血清細(xì)胞”)。盡管其意義還不明確，但觀察到的最引人注意的量變是在單細(xì)胞水平上NS樣品中EGFR和pS6的表達(dá)較之SC樣品要低(圖32)。源自MIC的對(duì)化療敏感和化療抗性現(xiàn)象的分析得到一些數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可以基于針對(duì)化療的途徑響應(yīng)來進(jìn)一步詳細(xì)表征BTSC。例如，在患者的BTSC細(xì)胞系中出現(xiàn)至少2種新的化療現(xiàn)象，并且這與親本腫瘤的世界衛(wèi)生組織(WHO)臨床診斷無關(guān)。第一個(gè)是雷帕霉素誘導(dǎo)的化療激活，其是由于在單細(xì)胞水平活化的pAkt解除了mTOR的反饋抑制所致(圖33A)。最近加州大學(xué)洛杉磯分校的雷帕霉素對(duì)GBM的一期臨床試驗(yàn)顯示，這一現(xiàn)象在半數(shù)的臨床患者中發(fā)生。此外，在多種BTSC細(xì)胞系的測(cè)試中，對(duì)化療響應(yīng)的新預(yù)測(cè)模型顯示，EGFR的信號(hào)傳導(dǎo)是通過Akt實(shí)現(xiàn)的。對(duì)該模型的預(yù)測(cè)最初來自于觀察到在預(yù)處理樣品中當(dāng)EGFR表達(dá)與pAkt顯著相關(guān)時(shí)，EGFR阻斷消除了這種處理后的相關(guān)性，并且可以在單細(xì)胞水平減少活化的Akt的表達(dá)量(圖33B)。這兩個(gè)現(xiàn)象中的Akt活化的提示使人們對(duì)BTSC生物群落特別關(guān)注，因?yàn)锳kt信號(hào)被認(rèn)為對(duì)于維持干細(xì)胞的惡性表型是非常重要的。這項(xiàng)發(fā)明通過各實(shí)施方案已進(jìn)行了詳細(xì)描述，通過上述內(nèi)容，在不脫離廣義含義的本發(fā)明的前提下可進(jìn)行改動(dòng)和修改，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，權(quán)利要求所限定的內(nèi)容旨在涵蓋落入本發(fā)明真正精神范圍內(nèi)的所有這些改動(dòng)和修改。參考文獻(xiàn)——發(fā)明詳述部分1.Kleihues,P.&Ohgaki,H.Phenotypevsgenotypeintheevolutionofastrocyticbraintumors.Toxicologicpathology28，164-170(2000).2.vonDeimling,A.etal.Subsetsofglioblastomamultiformedefinedbymoleculargeneticanalysis.Brainpathology(Zurich,Switzerland)3,19—26(1993).3.Lang,F.F.,Miller,D.C.,Koslow,M.&Newcomb,E.W.Pathwaysleadingtoglioblastomamultiformeamolecularanalysisofgeneticalterationsin65astrocytictumors.Journalofneurosurgery81,427-436(1994).4.Kleihues，P.&Ohgaki,H.Primaryandsecondaryglioblastomasfromconcepttoclinicaldiagnosis.Neuro-oncology1，44—51(1999).5.Louis,D.N.，Holland,E.C.&Cairncross，J.G.Gliomaclassificationamolecularreappraisal.TheAmericanjournalofpathology159,779-786(2001).6.Rich,J.N.etal.PhaseIItrialofgefitinibinrecurrentglioblastoma.JClinOncol22,133-142(2004).7.Barber,T.D.,Vogelstein,B.,Kinzler,K.W.&Velculescu，V.E.SomaticmutationsofEGFRincolorectalcancersandglioblastomas.TheNewEnglandjournalofmedicine351，2883(2004).8.Marie,Y.etal.EGFRtyrosinekinasedomainmutationsinhumangliomas.Neurology64，1444-1445(2005).9.Rich,J.N.,Rasheed,B.K.&Yan,H.EGFRmutationsandsensitivitytogefitinib.TheNewEnglandjournalofmedicine351，1260-1261；authorreply1260-1261(2004).10.Smith,J.S.etal.PTENmutation,EGFRamplification,andoutcomeinpatientswithanaplasticastrocytomaandglioblastomamultiforme.JournaloftheNationalCancerInstitute93，1246-1256(2001).ll.Aldape，K.D.etal.ImmunohistochemicaldetectionofEGFRvIIIinhighmalignancygradeastrocytomasandevaluationofprognosticsignificance.Journalofneuropathologyandexperimentalneurology63,700-707(2004).12.Ekstrand,A.J.etal.Genesforepidermalgrowthfactorreceptor,transforminggrowthfactoralpha，andepidermalgrowthfactorandtheirexpressioninhumangliomasinvivo.Cancerresearch51，2164-2172(1991).13.Frederick,L.，Wang，X.Y.，EleyiG.&James，C.D.Diversityandfrequencyofepidermalgrowthfactorreceptormutationsinhumanglioblastomas.Cancerresearch60，1383-1387(2000).14.SugawaN.，EkstrandA.J.，James，C.D.&Collins，V.P.Identicalsplicingofaberrantepidermalgrowthfactorreceptortranscriptsfromamplifiedrearrangedgenesinhumanglioblastonas.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica87，8602-8606(1990).15.Wong,A.J.etal.Structuralalterationsoftheepidermalgrowthfactorreceptorgeneinhumangliomas.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica89，2965-2969(1992).16.Batra，S.K.etal.Epidermalgrowthfactorligand-independent，unregulated,cell-transformingpotentialofanaturallyoccurringhumanmutantEGFRvIIIgene.CellGrowthDiffer6，1251-1259(1995).17.ChoeG.etal.Analysisofthephosphatidylinositol3'-kinasesignalingpathwayinglioblastomapatientsinvivo.Cancerresearch63，2742-2746(2003).18.Huang,H.S.etal.Theenhancedtumorigenicactivityofamutantepidermalgrowthfactorreceptorcommoninhumancancersismediatedbythresholdlevelsofconstitutivetyrosinephosphorylationandunattenuatedsignaling.TheJournalofbiologicalchemistry272，2927-2935(1997).19.Li，B.etal.Mutantepidermalgrowthfactorreceptordisplaysincreasedsignalingthroughthephosphatidylinositol-3kinase/AKTpathwayandpromotesradioresistanceincellsofastrocyticorigin.Oncogene23，4594-4602(2004).20.Sordella，R.，Bell，D.W.，Haber，D.A.&Settlemmi，J.Gefitinib-sensitizingEGFRmutationsinlungcanceractivateanti-apoptoticpathways.Science305，1163-1167(2004).21.Weinstein,I.B.Cancer.Addictiontooncogenes—theAchilleshealofcancer.Science297，63-64(2002).22.Ermoian,R.P.etal.DysregulationofPTENandproteinkinaseBisassociatedwithgliomahistologyandpatientsurvival.ClinCancerRes8，1100-1106(2002).23.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或3維散點(diǎn)圖或直方圖。20.根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種細(xì)胞培養(yǎng)物包括癌細(xì)胞。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述癌細(xì)胞是哺乳動(dòng)物膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞選自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和經(jīng)遺傳修飾的U87細(xì)胞(U87-PTEN、U87-EGFR、U87_EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN)。23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述乳腺癌細(xì)胞選自MDA453(ErbB2+)、MDA361(ErbB2+)、BT474(ErbB2++)、SKBr3(ErbB2++)禾口JIMTl(ErbB2++，PTEN-)。24.根據(jù)權(quán)利要求13至23中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)培養(yǎng)室的容積為2pL2.4μL。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述容積約為150nL。26.確定細(xì)胞類型的至少一種目標(biāo)特征的方法，其包括i)將基本純的所述細(xì)胞類型培養(yǎng)物加載到權(quán)利要求1所述系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)室中；以及ii)在適當(dāng)?shù)臈l件下測(cè)定所述培養(yǎng)物，以測(cè)定所述細(xì)胞類型的至少一種目標(biāo)特征。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物被測(cè)定。28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的方法，其中所述目標(biāo)特征選自EGFRvIII、PTEN、mTOR、葡萄糖攝入和FDG攝入。29.根據(jù)權(quán)利要求26、27或28的方法，其中測(cè)定多種特征。全文摘要微流體系統(tǒng)具有包括多個(gè)移液器的移液系統(tǒng)、靠近所述移液系統(tǒng)放置的微流體芯片、靠近所述微流體芯片放置的光學(xué)成像檢測(cè)系統(tǒng)以及與所述光學(xué)成像檢測(cè)系統(tǒng)連接的圖像處理系統(tǒng)。所述微流體芯片具有由微流體芯片之主體限定的多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室與由微流體芯片限定的輸入通道和輸出通道呈流體連通。所述移液系統(tǒng)被構(gòu)建并安置成以下至少一種當(dāng)微流體系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，通過多個(gè)移液器將流體注入多個(gè)輸入通道中，或者通過多個(gè)移液器從多個(gè)輸出通道抽取流體。文檔編號(hào)C12M3/00GK102015998SQ200980112189公開日2011年4月13日申請(qǐng)日期2009年2月2日優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日發(fā)明者保羅·S·米舍爾,克里斯蒂安·貝倫布魯赫,大衛(wèi)·A·內(nèi)桑森,孫晶,曾憲榮,肖恩·M·薩爾卡里亞,邁克爾·D·馬斯特曼-史密斯,邁克爾·萬達(dá)姆,黃亭漪,龜井謙一郎申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)