專利名稱：纖維素或者木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維素或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理，例如在糖化、發(fā)酵和乙醇回收 之前的預(yù)處理。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是一術(shù)語，指的是一包括纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的植物材 料。這三種細胞壁組分具有不同的量，這取決于植物種類、養(yǎng)分有效性和氣候條件。纖維素 是植物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)組分，聚合度范圍為500至20000。纖維素分子是線性的、無支鏈 3，1_4連接葡萄糖聚合物，具有在內(nèi)部或相互之間形成氫鍵的強烈傾向。纖維素分子束聚 集以形成微纖維，微纖維中高度有序(結(jié)晶的)區(qū)和較少有序(無定形的)區(qū)相間。微纖 維再組成纖維，并最終組成纖維素纖維。由于其纖維結(jié)構(gòu)和強氫鍵，纖維素具有非常高的強 度，不溶于大多數(shù)溶劑。半纖維素是雜多糖，其由各種形成植物細胞壁的非纖維質(zhì)多糖組分的單體所形 成。大多數(shù)的一般單體是葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖(己糖)、木糖、海藻糖和阿拉伯 糖(戊糖)，還包括葡萄糖和半乳糖的糖醛酸(Eaton和Hale，1993b)。大多數(shù)的半纖維素 的聚合度大約在50-300，大大低于纖維素。半纖維素可以分為三個主要族，木聚糖、甘露聚 糖和半乳糖體，以其骨干聚合物命名。木質(zhì)素是一種具有非常高分子量的三維大分子。木質(zhì)素是無定形的、長的交聯(lián) 生物聚合物。木質(zhì)素通過三個單體丙苯單元的聚合而合成芥子醇、P"香豆醇和松柏醇 (Boer jan等，2003)。木質(zhì)素通過與纖維素微纖維結(jié)合在一起而提供強度和硬度。其性質(zhì) 上疏水，影響植物細胞壁的膨脹性能，使血管系統(tǒng)的水消耗最小化，并且能提供抗酶催促解 性。纖維素類生物質(zhì)是一術(shù)語，指的是主要包括纖維素的生物質(zhì)。例如包括紙、廢棄棉 紡織品或者棉花加工廢棄物。木質(zhì)纖維素在生物技術(shù)和遺傳工程的UN FAO Glossary中被定義為“木質(zhì)素、半纖 維素和纖維素的組合，形成植物細胞壁的結(jié)構(gòu)架構(gòu)”。參見FAOResearch and Technology Paper No. 7, accessed 7April 2008 網(wǎng) 土ih ;http://www. fao. org/D0CREP/004/Y2775E/ Y2775E00.HTIvno已有與包含生物質(zhì)的木質(zhì)素的量相關(guān)的從纖維素生物質(zhì)到木質(zhì)纖維素生 物質(zhì)的組成的圖譜(以及纖維素、半纖維素和其他組分的比例)。這包括從“纖維素”生物 質(zhì)中的非常低的含量(例如小于重量百分比木質(zhì)素)至木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中的相對高 的含量(例如木頭中30%重量百分比的木質(zhì)素)的范圍。通常木質(zhì)纖維素生物質(zhì)含有高 于4%的木質(zhì)素，即低于4%的木質(zhì)素生物質(zhì)在性質(zhì)上主要被認(rèn)為是“纖維素”，超過7%其 性質(zhì)更多的是在“木質(zhì)纖維素”范圍。對木質(zhì)纖維素進行糖化(糖類的水解)和發(fā)酵獲得的乙醇產(chǎn)物具有相當(dāng)高的商 業(yè)價值。糖化時木質(zhì)素、其它酚類化合物、果膠、半纖維素組分的提取也是有價值的，以提 高作為動物飼料的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的價值(Pu等，2008 ；Ragauskas等，2006 ；Rogers等，2007 ；Sun 等，2007 ；ffyman, 2002)。已經(jīng)存在這各種對生物質(zhì)進行預(yù)處理的方法。通常的處理如下生物預(yù)處理生物預(yù)處理使用真菌進行微生物脫木質(zhì)化(Dorado等，2001 ； Gutierrez等，2001 ；Helmy和El_Meligi，2002)，典型的為使用白腐菌，例如變色栓菌和黃 孢平革菌。然而，真菌降解是一個緩慢過程，大多數(shù)真菌進攻的不僅是木質(zhì)素，還有纖維素， 因此導(dǎo)致隨后可使用的總糖的消耗。物理預(yù)處理物理預(yù)處理可以分為兩大類機械的(磨碎)和非機械的(例如高壓 蒸煮、高能輻射和熱解)。機械預(yù)處理過程中，物理力(例如剪切或壓碎)將木質(zhì)纖維素變 細為更細粒料。這些物理力能降低纖維素結(jié)晶度、微粒大小和聚合度并提高體積密度。這 些結(jié)構(gòu)改變獲得一種能更易于隨后處理的材料，但是機械處理耗能且耗時，因此其本身不 實用。非機械物理預(yù)處理方法也可以提高可消化性，但是具有類似的缺陷。物理化學(xué)預(yù)處理蒸汽爆發(fā)，氨纖維爆炸(AFEX)和二氧化硫催化蒸汽爆炸是物理 化學(xué)預(yù)處理的例子。蒸汽爆炸中濕木質(zhì)纖維素被加熱至高溫(大約250°C )，快速釋放壓力， 導(dǎo)致粒徑降低。高溫結(jié)合一些化學(xué)處理能從半纖維素中產(chǎn)生乙酸，因此存在一些生物質(zhì)的 自水解(Nigam，2002)。這些改變能使得隨后處理更易于操作，但是劇烈條件也產(chǎn)生了降解 產(chǎn)物，這些降解產(chǎn)物能抑制水解和發(fā)酵。這些產(chǎn)物可以通過用水清洗而移除，但是這也移除 了水溶性的半纖維素，這在一些情況下是不期望的。因此，這些方法具有缺陷?；瘜W(xué)預(yù)處理許多化學(xué)處理被用來改變生物質(zhì)細胞壁的結(jié)構(gòu)，以使糖類組分更易 于糖化。例如包括使用石灰水或氫氧化鈉、氨水、稀酸、氧化劑和溶劑抽提劑，在這些所有的 預(yù)處理方法中，生物物質(zhì)的本身性質(zhì)影響方法的總效率。化學(xué)預(yù)處理還可能產(chǎn)生抑制劑，這 對后續(xù)糖化和發(fā)酵步驟產(chǎn)生負面影響。因此，需要替代的預(yù)處理方法。本說明書中所列舉或討論的明顯在先公布文獻不可以就被視為承認(rèn)那些文獻是 現(xiàn)有技術(shù)或公知常識的一部分。

發(fā)明內(nèi)容
我們發(fā)現(xiàn)褐腐(BR)朽木菌的機理(先前背景中未研究過)可以用作生物“預(yù)處 理”(參見圖1)，例如在可控條件下(批量生物質(zhì)接種、糖化、發(fā)酵)對木質(zhì)纖維素或纖維素 原料(例如軟木、谷類稿桿、巨草(giant grasses)、廢紙、廢棉紡織品或者棉處理廢棄物) 提供增強的糖化以及糖類和木質(zhì)素的利用。術(shù)語“褐腐”也用在植物病理學(xué)領(lǐng)域，指的是一種成熟或者熟成水果上的一種腐 爛。這種類型腐爛的病原生物與普遍的導(dǎo)致木材和相關(guān)的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)褐腐的擔(dān)子菌 類真菌不同且屬于不同的真菌系，其中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是本發(fā)明的課題。本發(fā)明的第一方面提供了木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌在預(yù)處理木質(zhì)纖維素或纖維 素生物質(zhì)的方法中的用途，以從生物質(zhì)中利用糖類或木質(zhì)素。例如，可以在進一步的加工中 使用在褐腐真菌預(yù)處理后剩下的木質(zhì)素，以生產(chǎn)具有顯著經(jīng)濟意義的化學(xué)產(chǎn)品，或者燃燒 以為乙醇生產(chǎn)過程制造能量(Pu等，2008 ；Ragauskas等，2006)。本發(fā)明第二方面提供了一種預(yù)處理木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)的方法以利用生 物質(zhì)中的糖類或木質(zhì)素，方法包括對木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)接種木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌，以及在促進木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌生長的條件下培養(yǎng)所述接種過的生物質(zhì)。因此， 接種過的生物質(zhì)可以在溫度2-45°C或50°C、優(yōu)選為5-40°C或10_35°C、以及木材水份含量 高于纖維飽和點但是細胞腔孔隙不飽和的條件下培養(yǎng)。相關(guān)的水份含量取決于生物質(zhì)類 型例如，理想的熱帶硬木和谷類稿桿之間的差異非常大。對應(yīng)于上述標(biāo)準(zhǔn)的典型的相關(guān)含 水量是基于烘干在25-150%之間，例如在軟木中為大約50%。含水量以及可用的氧都是褐 腐真菌生長的關(guān)鍵因素，因為它們都是絕對耗氧微生物。生物質(zhì)的含水量可以通過自然風(fēng) 干燥、人工干燥、添加水例如通過噴霧或者添加液體真菌培養(yǎng)液來進行控制。含水量通常通 過重量分析測定，通過一些電導(dǎo)率或電阻率儀器能測量不高于大約40-50%的含水量，高于 這個范圍將變得不準(zhǔn)確。木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌引起植物細胞壁的纖維素和半纖維素組分的快速的大 量的解聚，以及有限的，但是明顯的，木質(zhì)素組分的改性，通常在褐腐過程的早期通過脫甲 氧基進行(NilSSOn，1988)。對纖維素的作用的機理被認(rèn)為是通過羥基自由基或者可能是 由芬頓體系所產(chǎn)生的等效的金屬-氧進行的，草酸也參與而在通過褐腐真菌進行的纖維素 解聚中起了重要作用(k0enigS，1974)。值得注意的是即使最小量的纖維素酶也太大而不 能在細胞壁的S3和S2層穿透木材孔，即使是在晚期的腐朽過程(Green和Highley，1997 ； Srebotnik和Messner，1991)。因此，推測褐腐木質(zhì)纖維素降解真菌的菌絲釋放低分子量的 高擴散的介質(zhì)，以引起觀察到的細胞壁聚合物的先于隨后的酶攻擊(導(dǎo)致由這一酶作用的 產(chǎn)物微生物的同化)的早期解聚。過氧化氫(或相關(guān)的化學(xué)試劑)及其與木材中二價鐵的 反應(yīng)已經(jīng)被提出作為一種可能機理，通過該機理，在纖維素鏈的一些葡萄糖吡喃糖環(huán)中引 起氧化斷裂的瞬態(tài)自由基可以由褐腐真菌所產(chǎn)生(Green和Highley，1997)。這樣的試劑將 破壞微晶結(jié)構(gòu)，使得纖維素酶隨后能在S3層和內(nèi)腔之間的接口處起作用。BRF降低了他們的直接環(huán)境的pH，這被認(rèn)為促進了一些非酶系統(tǒng)活性，這些非酶 系統(tǒng)被推測認(rèn)為具有和纖維素酶活性一樣的活性(Goodell，2003a)。細胞壁的全纖維素組 分的非常快的解聚導(dǎo)致腐朽木材的強度的快速降低(Eaton和Hale，1993b)。在一個實施方式中，進行培養(yǎng)以便本質(zhì)上只發(fā)生褐腐真菌腐爛機理的非常早的階 段(解聚)，本質(zhì)上不進行同化階段。通過以這種方式進行培養(yǎng)，認(rèn)為提高了糖類和木質(zhì) 素組分的可獲得性，而不被褐腐真菌通過隨后的同化而降低糖類的量。因此，例如，在木質(zhì) 纖維素降解褐腐生長的條件下的培養(yǎng)可以在生物質(zhì)中的葡萄糖實質(zhì)上消耗發(fā)生前終止，例 如，在小于 50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或者4天后，優(yōu)選的在大約10-25天，溫度為大約10-25°C，且最佳的含水量。這在下文中繼 續(xù)討論。預(yù)處理被認(rèn)為改進了糖類以及木質(zhì)素的易獲得性(例如，從改善堿溶解度來看)。 可以認(rèn)為褐腐攻擊的早期階段，如以上實施方式中，木質(zhì)素更易獲得。通過木質(zhì)纖維素降解褐腐(BR)意味著腐爛，其主要通過全纖維素的大量解聚而 吸收植物細胞壁的糖類組分(Nilsson，1988)。暴露在褐腐中的木材變得更易溶解于氫氧化 鈉的稀溶液中(Nilsson，1988)。當(dāng)含水量超過纖維飽和點(基于烘干大約30%含水量)， 但是細胞腔空隙不飽和，而且溫度在5-40°C、優(yōu)選為10-35°C時(取決于物種)，在木材中開 始褐腐腐爛(Goodell，2003a)。褐腐通常由擔(dān)子菌類真菌引起，但是其他真菌也可能具有褐腐腐爛性質(zhì)。
褐腐真菌主要在植物細胞腔內(nèi)生長。褐腐真菌明顯偏愛降解軟木木材，盡管有許 多它們對硬木木材和其他木質(zhì)纖維素生物質(zhì)起作用的例子。由于能引起木質(zhì)素降解，褐腐型真菌能容易的從下列本領(lǐng)域所熟悉的公認(rèn)性質(zhì)中 被識別出。通常擔(dān)子菌門的一員。通過消耗生物質(zhì)的糖類組分和在降解循環(huán)結(jié)束時遺留木質(zhì)素樣材料作為殘留 物，能引起木材中大量質(zhì)量損失(典型的在軟木中，同樣也在其他木質(zhì)纖維素材料中) (Goodell, 2003a ；Green 和 Highley，1997)。降解模式的微形態(tài)表明距真菌菌絲一定距離的木質(zhì)纖維素材料的細胞壁發(fā)生了 大量的解聚_腐爛不局限于菌絲(Eaton和Hale，1993b)。木材的褐腐降解過程中，發(fā)生了顏色變黑，從淺褐色/奶油色至褐色/深褐色，并 且干燥時，木材樣品以典型的立方體裂解模式破碎(Goodel 1，2003a)。結(jié)合使用根據(jù)上述的觀察、質(zhì)量損失評估、腐爛木材的強度性質(zhì)、化學(xué)分析和顯微 鏡技術(shù)可以容易的檢驗一未知菌絲的是否具有作為一木質(zhì)纖維素(木材)降解褐腐真菌的 性質(zhì)。木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌的例子包括如下(Desch和Dinwoodie，1996 ；Eaton和 Hale,1993b ；Goodell,2003a ；Green 和 Highley，1997 ；Nilsson,1988)鮭色泊氏孔菌(Postiaplacenta)，密粘褶菌(Gleophyllum trabeum)，籬邊粘褶 菌(Gleophyllum s印arium)，豹皮香菇(Lentinus 1 印ideus)，凹痕粉孢革菌(Coniophora puteana), Coniophora arida, Coniophora eremophila Tyromycespalustris, zP
菌(Serpula lacrymans),棟迷孑L 菌(Daedalea quercina),狹擔(dān)薄孑L 菌(Antrodia serialis),波狀薄孑L菌(Antrodia sinuosa),威蘭薄孑L菌(Antrodia vaillantii),黃薄 孑L菌(Antrodia xantha), Meruliporia incrassate,耳狀網(wǎng)裙菌(Paxillus panuoides)， Amyloporia xantha，樣錄Ij管菌(Piptoporusbetulinus)，獲|菌(ffolfiporia cocous)。在木材腐爛中最常見的為鮭色泊氏孔菌(Postia placenta)，密粘 裙菌(Gleophyllum trabeum),凹痕粉孢革菌(Coniophora puteana),干朽菌 (Serpulalacrymans)。本發(fā)明中所使用的優(yōu)選的BR真菌，特別是與軟木相關(guān)的，包括凹痕粉孢革菌 (Coniophora puteana)禾口 娃色泊氏孑L 菌(Postia placenta)。樣剝管菌(Piptoporus betulinus)是被認(rèn)為可以用于樺木的BR真菌的一個例子?？梢允褂肂R真菌的混合物，這 對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。有幾種可能的不同“系統(tǒng)”，用于為木片或其它形式的木材，例如原木、木盤等，提 供接種物，例如真菌菌絲/孢子在水介質(zhì)中的懸浮液，通過噴霧或傾注以及攪拌/混合施 用；一種固體/半固體“小球”的接種物(例如，移植小麥/大麥等谷粒與木片“干式混合”; 在水介質(zhì)中的孢子懸浮液)；一種褐腐感染的木片。我們認(rèn)為對生物質(zhì)例如軟木的BR預(yù)處理能提供商業(yè)優(yōu)勢。據(jù)估計BR預(yù)處理能促 進從軟木和其他纖維素或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中高的糖釋放，或者可選擇的使得處理鏈中的 其它步驟成本更低/能耗小。在一“組合”方法中，BR預(yù)處理可以結(jié)合使用其他形式的預(yù)處 理，例如生物質(zhì)的研磨、蒸汽爆炸或者酸解。能量節(jié)約(且降低了溫室效應(yīng)氣體排放)、降低 了處理時間、或者增加了乙醇產(chǎn)量中的至少一種改進是BR預(yù)處理的一個直接結(jié)果。優(yōu)選的
6軟木是輻射松和歐洲赤松。預(yù)處理后，通常使用1)酶或2)稀酸或3) —些其它糖化步驟對生物質(zhì)進行糖化處 理。然后通常將糖溶液發(fā)酵成乙醇。不同的是同時進行糖化和發(fā)酵，兩個步驟在“一個容 器”中進行。然后分離廢水/殘留物。BR預(yù)處理被認(rèn)為能導(dǎo)致木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)的解聚，消耗非常少的能量或 材料，因此，與現(xiàn)有的物理和化學(xué)預(yù)處理方法相比，在下游的糖化處理中所使用的能量和/ 或處理化學(xué)藥品的量方面具有潛在的相當(dāng)優(yōu)勢。由于較溫和的反應(yīng)條件，纖維素的酶糖化相對于稀酸水解具有潛在優(yōu)勢。目前通 過酶方法生產(chǎn)乙醇的最大花費是酶的成本。US DOE進行的研究專注于改進所使用的酶以 及大量和以降低的價格生產(chǎn)酶。假設(shè)US DOE預(yù)測的酶的價格與它們現(xiàn)有價值相比顯著降 低，糖化中的預(yù)處理步驟預(yù)計花費為從木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的總生產(chǎn)成本的大約20%。這 僅次于生物質(zhì)本身的花費(成本的大約35%)。而使用BR預(yù)處理能降低后續(xù)的糖化步驟 的花費。BR預(yù)處理可以在乙醇生產(chǎn)裝置上進行，作為他們的操作的一部分，或者，可選擇 的，在靠近生物質(zhì)采伐位置的“現(xiàn)場”進行。后者中，通過在運送至乙醇工廠前在靠近生物質(zhì) 采伐位置處的能量致密化和降低含水量，“分散式”方法能潛在的節(jié)約運輸能量?！艾F(xiàn)場”BR 的使用不期望能引起任何與BR微生物的“逃脫”相關(guān)的問題，因為這些微生物通常自然的 存在于環(huán)境中(盡管含量太低且易變而不能用在本發(fā)明中)。木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)優(yōu)選為軟木，例如松木或杉木，但指的是包含植物生 物質(zhì)的任何纖維素。這一軟木生物質(zhì)可以通過許多方式獲得，例如，特定的長成的生物質(zhì) 莊稼，林業(yè)生產(chǎn)的殘余物，木材加工處理的副產(chǎn)品，廢紙或包裝材料或者培植樹木的“廢棄 物”。木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)可以是例如硬木、芒草、竹子、谷類蒿稈、玉米、大米或者 小麥廢棄物、油棕廢棄物、甘蔗渣、廢棄包裝材料例如硬紙板、任何纖維素廢棄物、紡織品和 紙。如上文所述，在木質(zhì)纖維素降解褐腐生長的條件下的培養(yǎng)可以例如，在小于50、 40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或者 4 天后終 止，優(yōu)選的在大約10-25天，溫度為大約10-25°C、且最佳的含水量，或者在生物質(zhì)中的葡萄 糖實質(zhì)上消耗發(fā)生前終止。培養(yǎng)可以例如被開始下一階段的處理如糖化所終止，或者通過 降低或提高溫度終止，例如通過使用流經(jīng)生物質(zhì)堆的蒸汽管或者冷水管；或者通過提高或 (更典型的)降低含水量來終止培養(yǎng)。需要培養(yǎng)的時間長短取決于例如培養(yǎng)中的溫度和濕 度，以及基板、基板的物理形態(tài)和存在的BR真菌的類型。培養(yǎng)需要的時間長短可以使用一 監(jiān)視系統(tǒng)來分析生物質(zhì)的聚合度降低和生物質(zhì)的質(zhì)量損失來決定，監(jiān)視系統(tǒng)例如為凝膠滲 透色譜。這些有利于糖化作用的參數(shù)特征值(對特定生物質(zhì)類型的試驗所建立)和/或從 木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)中釋放的木質(zhì)素或其他組分可以用于過程監(jiān)視?？蛇x擇的與期 望的糖化作用或其他效果相關(guān)的BR處理監(jiān)視參數(shù)例如為糖的化學(xué)分析、pH監(jiān)視或光譜分 析。操作可以利用圖或表設(shè)置在不同條件下特定的基板和BR真菌的期望的腐爛過程，結(jié)合 評估本地條件即溫度、濕度、基板狀態(tài)等來管理BR過程或通過基于先前所用的試驗例如監(jiān) 視系統(tǒng)或先前的對預(yù)處理過的生物質(zhì)的后續(xù)處理結(jié)果進行經(jīng)驗預(yù)測。可以使用類似于實施 例1中所使用的方法。
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BR預(yù)處理可以有利于對相對大的木片(大約IOx 5x 30mm)進行。這將降低生物 質(zhì)所需要的機械處理量并因此減少所需要的能量。我們認(rèn)為褐腐預(yù)處理可以用于相當(dāng)大范 圍的木片，還可以用于“整”木，例如可鋸木邊料、木質(zhì)紙漿“卷”等。褐腐預(yù)處理還可以應(yīng) 用于其他種類的纖維素和木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，例如谷物秸稈、竹材、芒草、紙“廢棄物”等，這 些都具有不同的用于處理的最佳尺寸等，一些不需要破碎。作為一個實施例，期望的BR “早期”可以為直至當(dāng)質(zhì)量損耗小于材料的烘干質(zhì)量 的5、10、15%。實施例1中圖表明在15天，質(zhì)量損耗大約7%，并且從此成線性變化，此時 糖化試驗中的葡萄糖釋放為最大(“穩(wěn)定”)水平。超過這一時間(在我們選擇的條件下)， 質(zhì)量損耗增加，但是葡萄糖產(chǎn)量開始下降。這兩個參數(shù)質(zhì)量損耗和葡萄糖產(chǎn)量可以用作衡 量BR預(yù)處理過程已經(jīng)至其最佳水平。本文所弓I用的任何公開文獻在此都通過弓I用引入本文。


本發(fā)明現(xiàn)在結(jié)合所附的非限制性的附圖和實施方式進行闡述。圖1 生物質(zhì)至乙醇的處理步驟；圖2 暴露在褐腐真菌凹痕粉孢革菌下的歐洲赤松邊材塊的基于烘干重量的質(zhì)量 損失。所有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；圖3 暴露在褐腐真菌鮭色泊氏孔菌下的歐洲赤松邊材塊的基于烘干重量的質(zhì)量 損失。所有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；圖4 從糖化實驗中獲得的葡萄糖的兩個獨立試驗，葡萄糖產(chǎn)量為歐洲赤松在暴 露在褐腐真菌凹痕粉孢革菌下后的烘干重量(ODW)的百分比。所有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn) 誤差表示；圖5 從糖化實驗中獲得的葡萄糖占歐洲赤松在暴露在褐腐真菌鮭色泊氏孔菌下 后的烘干重量(ODW)的百分比。所有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；圖6 輻射松邊材塊在暴露在一系列木材移植真菌之后獲得的葡萄糖。釋放的葡 萄糖以生物質(zhì)的總烘干重量(ODW)的百分比顯示。n = 3(每個包括8個均勻的木塊)。所 有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；圖7 從磨碎的生物質(zhì)材料中測得的暴露過的輻射松的木材ρΗ，η = 3 (每個包括 8個均勻的木塊)。所有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；圖8 與未暴露的木塊相比，在暴露在兩種褐腐真菌后磨碎8個輻射松小塊所需要 的能量的差異。所有結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
具體實施例方式實施例1 使用褐腐真菌在對軟木(歐洲赤松)生物質(zhì)進行糖化前進行預(yù)處理的 糖產(chǎn)量的優(yōu)化這里我們檢驗歐洲赤松(Pinus sylvestris) 一段時間內(nèi)的由BR真菌引起的降解 度以及褐腐腐爛過程的早期階段對從松木產(chǎn)生葡萄糖的效果。選擇兩種典型的BR真菌來 分析鮭色泊氏孔菌和凹痕粉孢革菌。這些真菌被用在純培養(yǎng)真菌腐爛測試中以檢測木材 的烘干質(zhì)量損失程度作為降解度的測量。
從大約150mm直徑的風(fēng)干松木原木上橫切下松木邊材塊(大約5x 30x 10mm)。對 這些木塊進行標(biāo)記、稱重并通過伽馬輻照滅菌。在這個實施例中鮭色泊氏孔菌和凹痕粉孢革菌都使用純真菌培養(yǎng)，并在2%的麥 芽瓊脂培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。真菌培養(yǎng)在接種前生長10-14天，或者直至菌絲生長接近培養(yǎng)皿的 邊緣。先將不銹鋼襯墊放置在菌絲頂部，然后放入松木邊材塊，從而將滅菌的松木邊材 塊加入到真菌培養(yǎng)皿中。在可控室溫25°C以及75%的RH(相對濕度)下培養(yǎng)直至3周。從培養(yǎng)皿中取出松木邊材塊后，對一些木塊進行稱重，烘干后，再稱重，以確定質(zhì) 量損失。剩下的木塊被磨碎，并對材料根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NREL實驗室方法進行糖化測試(Brown和 Torget，1996 ；Hames 等，2005)。在 JASCO 系統(tǒng) HPLC 的 BioRad Aminex HPX-87P 柱上進行 糖分析。圖2和圖3中所示的質(zhì)量損失數(shù)據(jù)表明15天后相對低的質(zhì)量損失，即大約5%。 松木邊材的質(zhì)量損失在大約7天暴露后顯示出線性。圖4和圖5所示是從暴露在褐腐真菌鮭色泊氏孔菌和凹痕粉孢革菌下不同時間的 歐洲赤松邊材樣品中釋放的葡萄糖的數(shù)量，并以生物質(zhì)的總烘干重量(ODW)的比例表示。 這些值是全部的葡萄糖值，并表示存在于木材的半纖維素組分中的任何葡萄糖。這一實施 例表明松木邊材的BR預(yù)處理能提供幾乎四倍的釋放的葡萄糖的量的增加(圖4)表明從非 預(yù)處理的松木中釋放的葡萄糖的顯著改善。這與現(xiàn)有使用的物理化學(xué)預(yù)處理技術(shù)相比具有 優(yōu)勢(Ewanick 等，2007 ；Frederick 等，2008)。實施例2 褐腐真菌在預(yù)處理后獨特的提供從松木(輻射松)的改善的葡萄糖糖
化產(chǎn)量這里，我們表明在松木邊材在褐腐真菌下的受限制的暴露后，在酶糖化后的葡萄 糖產(chǎn)量顯著增加。結(jié)果闡明了使用褐腐真菌作為生物預(yù)處理用于生物燃料的生產(chǎn)的潛能， 并且我們表明與現(xiàn)有的預(yù)處理技術(shù)相比，這將大大的降低能源和化學(xué)品輸入以釋放可發(fā)酵 的糖類。為了確定觀察到的葡萄糖產(chǎn)量的增加由BR真菌特定的引起的，我們研究將另一 軟木生物質(zhì)(輻射松)暴露在六種不同的真菌下凹痕粉孢革菌(Coniophora puteana) (褐腐)、鮭色泊氏孔菌(Postia placenta)(褐腐)、變色栓菌(白腐)、球毛殼菌(軟腐)、 綠色木霉(霉)和一種毛霉菌(霉)。這兩種霉菌用于代表能在木材中生長但不有效降解 木材基板的微生物。其他真菌在合適的條件下能有效降解木材。通過橫切風(fēng)干木塊，測量5x IOx 25mm的輻射木邊材，并通過伽馬輻照滅菌，然后 進行木材的真菌暴露。接種前，真菌培養(yǎng)物在4%的麥芽瓊脂中生長不超過28天。滅菌的 木塊無菌放置到無菌不銹鋼環(huán)的頂部的固體媒介上，以避免直接接觸瓊脂。真菌和木塊在 22 °C的可控室溫下培養(yǎng)直至35天。糖化根據(jù)基于修改后的Selig等的方法(Selig等，2008)進行，區(qū)別是60FPU/g烘 干纖維素酶生物質(zhì)(Celluclast 1. 5L, Sigma, UK)和64pNP⑶/g烘干β -葡糖苷酶生物質(zhì) (Novozyme 188，Sigma, UK)。在 50°C下培養(yǎng) 168 小時。通過 HPLC 在 Agilent 1200 系列 HPLC配合BioRad aminex HPX-87P柱上用水做流動相分析釋放的葡萄糖。木材的糖化外，還測量木材的pH。生物質(zhì)被磨碎并篩選為粒徑在180-850 μ m之間。IOOmgODW的這一物質(zhì)被添加到沸騰的去離子水中，并培養(yǎng)20分鐘。接著，移除樣品，并 在用WTW Inolab的pH計測量之前冷卻。圖6所示結(jié)果表明用兩種BR真菌的處理增強了葡萄糖從酶糖化中的釋放(大約 3倍)。暴露在霉真菌和軟腐真菌下的木材對酶糖化的葡萄糖釋放沒有效果。圖7所示是木材的pH值在暴露在兩個BR真菌C. puteana和P. placenta后與未 暴露的對照相比從PH5迅速下降至大約pH3至3. 5，非木材腐爛-真菌T. versicolor也顯 示出下降，但是下降速度低于BR真菌。這與文獻報道的關(guān)于BR和白腐真菌之間的區(qū)別以及 他們的不同的腐爛機理一致(Goodell，2003b)。BR真菌產(chǎn)生草酸，通過芬頓反應(yīng)表明這促 進了在BR腐爛木材中觀察到的非酶解聚，而這已知能產(chǎn)生羥基自由基(通過H2O2和Fe(Il) 的反應(yīng))(Espejo和Agosin，1991)。我們推測纖維素分子的這一解聚是部分的或完全的導(dǎo) 致暴露在BR真菌下后所觀察到的葡萄糖糖化產(chǎn)量增加的原因。細胞壁中糖類的解聚引起 木材強度的顯著降低(Eaton和Hale，1993a)，我們還觀察到與未暴露的木材相比，暴露的 木材破碎所需要的能量也降低(圖8)。由于BR預(yù)處理使用了溫和條件，另外的優(yōu)勢是木質(zhì)纖維素乙醇產(chǎn)品不含有或 者降低了發(fā)酵抑制劑的含量，發(fā)酵抑制劑通常由更劇烈的預(yù)處理產(chǎn)生。我們通過用釀酒 酵母對通過葡萄糖溶液進行乙醇發(fā)酵而證實了這一點，其中葡萄糖溶液是通過對輻射 松(P. radiata)進行酶糖化而獲得的，輻射松被暴露在C. puteana下(20天)和暴露在 P. placenta下(25天)預(yù)處理過。所有的發(fā)酵在0. 5% (w/v)葡萄糖濃度、還有1 % (w/v)的酵母提取物和2% (w/v) 的蛋白胨、最終體積15ml的條件下進行，在30°C下培養(yǎng)24小時。用HPLC在裝備有BioRad aminex HPX-87H柱的Jasco Systems HPLC上對乙醇和葡萄糖進行分析。使用無對雙尾t 檢驗(unpaired two-tailed Student' s t-test)評估發(fā)酵數(shù)據(jù)。零假設(shè)表明沒有顯著差 異。當(dāng)ρ <0.05時，零假設(shè)不成立。用BR預(yù)處理過的松木獲得的糖溶液與單獨的葡萄糖對照(乙醇/葡萄糖=0. 42) 相比，沒有觀察到乙醇產(chǎn)量的顯著差異，表明通過BR預(yù)處理沒有產(chǎn)生發(fā)酵抑制劑。實施例3-褐腐真菌處理的進一步優(yōu)化BR處理方法的進一步優(yōu)化可以通過下列方法獲得“組合”方法_將BR預(yù)處理與其他已知的增強效率的預(yù)處理方法(例如蒸汽爆炸， 稀酸)結(jié)合使用。粒度-BR預(yù)處理能有利于對相對大的木片進行(大約IOx 5x 30mm)。這將降低生 物質(zhì)所需要的機械處理量并因此減少所需要的能量。我們認(rèn)為褐腐預(yù)處理可以用于相當(dāng)大 范圍的木片，還可以用于“整”木，例如可鋸木邊料、木質(zhì)紙漿“卷”等。褐腐預(yù)處理還可以 應(yīng)用于其他種類的纖維素和木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，例如谷物秸稈、竹材、芒草、紙“廢棄物”等， 這些都具有不同的用于處理的最佳尺寸等，一些不需要破碎。參考文獻Boerjan, W.等，2003. 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1權(quán)利要求
1.一種木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌用在木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理方法中的用途，以從生物質(zhì)中利用糖類或木質(zhì)素。
2.—種預(yù)處理木質(zhì)纖維素或纖維素生物質(zhì)以從生物質(zhì)中利用糖類或木質(zhì)素的方法，該方法包括對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)接種木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌，并在促進木質(zhì)纖維素降解褐 腐生長的條件下培養(yǎng)所述被接種過的生物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述在木質(zhì)纖維素降解褐腐生長的條件下的培 養(yǎng)在小于 50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或 者4天后終止，或者在生物質(zhì)中的葡萄糖消耗發(fā)生前終止。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途或根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中預(yù)處理是用于任 何形式的纖維素或半纖維素水解/糖化的預(yù)處理；或者是用于稀酸水解或蒸汽爆炸的預(yù)處 理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途或方法，其中預(yù)處理是用于酶糖化、發(fā)酵以及乙醇回收 或加工和/或木質(zhì)素加工的預(yù)處理。
6.前述權(quán)利要求中任一所述的用途或方法，其中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是軟木。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途或方法，其中軟木是松木邊材。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途或方法，其中軟木源自于輻射松或歐洲赤松樹種。
9.前述權(quán)利要求中任一所述的用途或方法，其中木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌是或包括凹 痕粉孢革菌或鮭色泊氏孔菌。
10.權(quán)利要求6-8中任一所述的用途或方法，其中木材為平均體積為0.1-1cm3的木片 的形式，優(yōu)選為平均體積為0. 2-0. 5cm3的木片的形式。
全文摘要
一種預(yù)處理木質(zhì)纖維素和纖維素生物質(zhì)的方法，以從生物質(zhì)中利用糖類或木質(zhì)素，該方法包括用木質(zhì)纖維素降解褐腐真菌接種木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以及在促進木質(zhì)纖維素降解褐腐生長的條件下培養(yǎng)接種過的生物質(zhì)的步驟。在促進木質(zhì)纖維素降解褐腐生長的條件下的培養(yǎng)在少于50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或者4天后終止，或者在生物質(zhì)中的葡萄糖消耗前終止。
文檔編號C12P19/02GK101998995SQ200980112793
公開日2011年3月30日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者理查德·詹姆斯·墨菲, 麥克·杰森·雷 申請人:帝國創(chuàng)新有限公司