專利名稱：屈曲病毒蛋白共有序列、編碼該屈曲病毒蛋白共有序列的核酸分子和組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于個(gè)體預(yù)防性地和/或治療性地免疫屈曲病毒的疫苗和方法。
背景技術(shù)：
本申請要求美國臨時(shí)申請第61/042，661號的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時(shí)申請以引用的 方式并入本文。免疫療法指調(diào)節(jié)人體免疫應(yīng)答以達(dá)到理想的治療效果。免疫治療劑指當(dāng)施用于個(gè) 體時(shí)調(diào)節(jié)個(gè)體免疫系統(tǒng)的那些組合物，所述調(diào)節(jié)足以最終減輕與不期望的免疫應(yīng)答相關(guān)的 癥狀或足以最終通過增加期望的免疫應(yīng)答而緩解癥狀。在一些情況下，免疫療法是接種方 案的一部分，其中給個(gè)體施用疫苗使個(gè)體暴露于免疫原(在此類情況下個(gè)體對該免疫原產(chǎn) 生免疫應(yīng)答)，免疫治療劑增加免疫應(yīng)答和/或選擇性增強(qiáng)預(yù)期治療或預(yù)防特定病癥、感染 或疾病的免疫應(yīng)答的一部分(例如細(xì)胞免疫部分或體液免疫部分)。可通過遞送調(diào)節(jié)人體免疫應(yīng)答而誘發(fā)改進(jìn)的免疫應(yīng)答的制劑來完善疫苗方案。 在 一些接種方案中，其中給個(gè)體施用疫苗使個(gè)體暴露于免疫原(個(gè)體對該免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng) 答)，提供增加免疫應(yīng)答和/或選擇性增強(qiáng)預(yù)期治療或預(yù)防特定病癥、感染或疾病的免疫應(yīng) 答的一部分(例如細(xì)胞免疫部分或體液免疫部分)的制劑。疫苗可用于使個(gè)體免疫靶抗原，所述靶抗原為例如變應(yīng)原、病原體抗原或與人類 疾病有關(guān)的細(xì)胞相關(guān)的抗原。與人類疾病有關(guān)的細(xì)胞相關(guān)的抗原包括癌癥相關(guān)腫瘤抗原和 與自身免疫疾病有關(guān)的細(xì)胞相關(guān)的抗原。在設(shè)計(jì)此類疫苗時(shí)，已發(fā)現(xiàn)在受接種個(gè)體的細(xì)胞中產(chǎn)生靶抗原的疫苗有效誘發(fā)免 疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫部分。特別地，減毒活疫苗、利用無毒載體的重組疫苗以及DNA疫苗各自 使得在受接種個(gè)體的細(xì)胞中產(chǎn)生抗原，從而形成免疫系統(tǒng)細(xì)胞免疫部分的誘發(fā)。另一方面， 盡管死疫苗或滅活疫苗以及僅包含蛋白的亞單位疫苗確實(shí)誘發(fā)有效的體液應(yīng)答，但它們不 誘發(fā)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答通常是對病原體感染提供保護(hù)和對治療病原體感染、癌癥或自身免 疫疾病提供有效免疫介導(dǎo)療法所必要的。因此，通常優(yōu)選的是在受接種個(gè)體的細(xì)胞中產(chǎn)生 靶抗原的疫苗，例如減毒活疫苗、利用無毒載體的重組疫苗和DNA疫苗。屈曲病毒(CHIKV)是一種熱帶非洲和亞洲本土的α病毒，該病毒在那里通過感 染的蚊子(通常是伊蚊屬[1])叮咬而傳播至人類。屈曲熱是由CHIKV引起的疾病，在 1952-1953期間首次在東非以流行病形式被發(fā)現(xiàn)[2]。CHIKV對人類的感染可以引起以發(fā) 熱、頭痛、皮疹、不適、惡心、嘔吐、肌痛、嚴(yán)重關(guān)節(jié)痛和偶發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)(例如急性四肢無 力)為表征的綜合征。它還伴有致命的出血性病癥。其他癥狀包括肌肉疼痛和眼窩后疼痛。 屈曲疾病很少致命，但是伴有顯著的發(fā)病率。屈曲病具有大約1-2周的潛伏期。認(rèn)為詞語 “屈曲”源于當(dāng)?shù)胤窖詫κ馨殡S該疾病的嚴(yán)重關(guān)節(jié)疼痛折磨的患者扭曲姿勢的描述[1-3]。因?yàn)榍哂锌僧a(chǎn)生突然令人衰弱的疾病的流行潛能，因此對發(fā)展中國家來說屈 曲是潛在的威脅，并且基于其持續(xù)蔓延以及由于在新興的流行區(qū)沖突地帶的士兵部署而造成的相當(dāng)多的軍事威脅，屈曲對發(fā)達(dá)國家也是潛在的威脅。CHIKV感染對經(jīng)濟(jì)有顯著影響，因?yàn)樵摳腥镜陌Y狀使雇員無能力工作，導(dǎo)致流行病區(qū)停工，影響當(dāng)?shù)厣虡I(yè)。這種經(jīng)濟(jì)影響對 數(shù)周或數(shù)月不能工作的個(gè)體家庭成員是最大的。由于使人衰弱的感染后遺癥，特定抗病毒 治療方法的缺乏和預(yù)防該疾病的任何目前可用疫苗的缺乏是管理或控制新CHIKV爆發(fā)的 主要障礙。CHIKV通過感染的蚊子叮咬而傳播。蚊子在吸食CHIKV感染個(gè)體時(shí)被感染。猴子 和可能的其他野生動(dòng)物也可能被感染，但是它們作為CHIKV儲庫的作用還沒有文獻(xiàn)記載。 感染的蚊子則可以在它們叮咬時(shí)將病毒傳播給其他人。埃及伊蚊(黃熱蚊)在家用容器中 繁殖并且在白天侵犯性地叮咬人類，是人類CHIKV的主要載體。白紋伊蚊(亞洲虎蚊)也 可以在亞洲人類傳播中起作用，在非洲已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種林居蚊類被病毒感染[11-17]。因?yàn)?CHIK熱流行病通過人類_蚊子-人類傳播來維持，流行病周期類似于登革熱和城市黃熱病 的流行病周期。最近已經(jīng)報(bào)道了印度洋和印度的幾個(gè)島嶼的CHIK熱的大規(guī)模爆發(fā)。自2004年末以來，屈曲病毒在世界各地(主要在印度洋島嶼)以大規(guī)模爆發(fā)形式 再現(xiàn)。在2006年初，在冬季較低傳播期之后并隨著南半球夏季的到來，留尼旺島遭受了爆 炸性的爆發(fā)。報(bào)道估計(jì)266，000居民(共有770，000人口)感染CHIKV，并且248份死亡證 明書將CHIKV作為可能的死亡病因[10，12]。文獻(xiàn)記載了孕婦宮內(nèi)感染和垂直傳播的證據(jù) [12，13，17]。序列分析揭示了地理上集群的病毒譜系的存在?；诓糠諩l序列的種系發(fā) 育分析揭示了三個(gè)不同的CHIKV種群的存在一個(gè)是西非分離株，另一個(gè)包括亞洲分離株， 以及一個(gè)再分為東非、中非和南非分離株[15，17]。2006年，在從已知發(fā)病區(qū)返回歐洲、加拿大、加勒比(馬丁尼克島)和南美(法屬 圭亞那)的旅行者中也已經(jīng)報(bào)道了 CHIK熱病例[5-9]。2005-2006期間，在疾病控制中心 (美國)從CHIK熱流行病或地方病的已知區(qū)域到達(dá)美國的旅行者中根據(jù)血清學(xué)和病毒學(xué)診 斷出了 12例CHIK熱[10]的病例。這些感染已經(jīng)引起公共健康危機(jī)并引起了全世界研究者的關(guān)注。重要的是，大部 分屈曲病毒感染在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)完全消退。然而，已經(jīng)有文獻(xiàn)記載了 CHIKV誘發(fā)的持續(xù)數(shù) 年的關(guān)節(jié)痛病例，并進(jìn)而發(fā)展成為慢性關(guān)節(jié)問題。感染在較長時(shí)間之后消退的事實(shí)證明，免 疫系統(tǒng)最終可以集合起來控制該感染。而且，這種清理表型證明在T細(xì)胞應(yīng)答清理中的作 用。早期研究屈曲疫苗，諸如福爾馬林滅活疫苗、吐溫醚滅活病毒疫苗和減毒活疫苗的嘗試 取得了一定成功，然而，這些嘗試由于各種原因而沒有繼續(xù)下去[3]。而且，據(jù)報(bào)道所有這些 疫苗僅產(chǎn)生血清學(xué)應(yīng)答，而沒有誘發(fā)有用的細(xì)胞免疫。最近在印度洋和留尼旺島的流行病頻發(fā)表明一種新的載體可能攜帶病毒，因?yàn)樵?那里沒有發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊。事實(shí)上，相關(guān)的亞洲虎蚊(白紋伊蚊)可能是罪魁禍?zhǔn)?，已?jīng)在世 界衛(wèi)生界引起對CHIK病毒大范圍流行可能的擔(dān)憂。因此，應(yīng)該采取步驟來研究控制CHIKV的方法。不幸的是，目前沒有針對屈曲病 毒的特定的治療方法，目前也沒有可用的疫苗。最近的研究表明，被膜E1-A226V突變直 接導(dǎo)致白紋伊蚊CHIKV感染性顯著增加，并且進(jìn)一步證實(shí)單個(gè)氨基酸取代可以影響載體特 異性。該發(fā)現(xiàn)提供了該突變病毒如何在缺乏典型昆蟲載體的區(qū)域引起流行病的合理解釋 [18]。還沒有研究出針對屈曲熱的特定疫苗或特定抗病毒治療方法。減毒活疫苗試驗(yàn)曾在 2000年進(jìn)行，但是該項(xiàng)目的資金來源被中斷，并且目前沒有可用的疫苗。但是，有文獻(xiàn)詳細(xì)記載了與該先前疫苗相關(guān)的幾個(gè)不良事件，因此，必須開發(fā)新的疫苗策略[3，5]。2005-2007屈曲熱爆發(fā)的巨大規(guī)模凸顯出對安全有效的CHIKV疫苗的需求[6]。人 們?nèi)匀恍枰煞乐箓€(gè)體受CHIKV感染的疫苗。人們?nèi)匀恍枰行е委熁加蠧HIKV感染的個(gè)體的治療方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV 蛋白El的共有序列或其免疫原性共有片段。本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV 蛋白E2的共有序列或其免疫原性片段。本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV 蛋白衣殼的共有序列或其免疫原性共有片段。本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼嵌合基 因，所述嵌合基因包含CHIKV蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3的共有序列或它們的 同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列，這些序列編 碼誘發(fā)對CHIKV蛋白El、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基 酸序列。本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼 CHIKV蛋白El的共有序列或其免疫原性共有片段。本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼 CHIKV蛋白E2的共有序列或其免疫原性共有片段。本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼 CHIKV蛋白衣殼的共有序列或其免疫原性共有片段。本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼 嵌合基因，所述嵌合基因包含CHIKV蛋白El、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3的共有序列或 它們的同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列，這些 序列編碼誘發(fā)對CHIKV蛋白El、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自的免疫應(yīng)答的免疫原 性氨基酸序列。本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對CHIKV免疫應(yīng)答的方法，該方法包括為所述個(gè)體施用 包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV蛋白El的共有序列或其免 疫原性共有片段。本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對CHIKV免疫應(yīng)答的方法，其包括為所述個(gè)體施用包含 分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV蛋白E2的共有序列或其免疫原 性共有片段。本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對CHIKV免疫應(yīng)答的方法，其包括為所述個(gè)體施用包含 分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV蛋白衣殼的共有序列或其免疫 原性共有片段。 本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對CHIKV免疫應(yīng)答的方法，其包括為所述個(gè)體施用包含 分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼CHIKV蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV 蛋白E3的共有序列或它們的同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列，這些序列編碼誘發(fā)對CHIKV蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自 的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基酸序列。本發(fā)明還涉及重組疫苗，所述重組疫苗包含編碼CHIKV蛋白衣殼、CHIKV蛋白E1、 CHIKV蛋白E2的共有序列或它們的免疫原性共有片段的核苷酸序列，或者編碼CHIKV蛋白 E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3的共有序列或它們的同源序列或它們的免疫原性共有片 段或它們的免疫原性共有片段的同源序列的分離的核酸分子，所述序列編碼誘發(fā)對CHIKV 蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基酸序列，并且本發(fā) 明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對CHIKV的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向個(gè)體施用所述重組疫苗。附圖簡述

圖1 ㈧將IgE-前導(dǎo)CHIKV融合基因克隆到pVaxl載體中的策略示意圖。(B) 瓊脂糖凝膠照片，顯示用Kpnl和Notl雙酶切反應(yīng)所標(biāo)示的CHIKV質(zhì)粒(被膜El、E2和衣 殼)的線性特異性條帶(泳道4)，所述雙酶切反應(yīng)分別產(chǎn)生1403bp、1355bp和869bp的大 小。圖2 =CHIKV構(gòu)建體的表征。(A)顯示合成構(gòu)建體的S35標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)譯?？乖?CHIKV-El、CHIKV-E2和CHIKV-衣殼被轉(zhuǎn)譯并分別使用特異性E1、E2和衣殼抗體免疫沉淀并 經(jīng)12% SDS凝膠電泳，然后進(jìn)行放射顯影分析?？乖娪驹谄漕A(yù)測的分子量下進(jìn)行，證實(shí)了 表達(dá)。(B) BHK-21細(xì)胞中CHIKV-El和CHIKV-衣殼構(gòu)建體的蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)。轉(zhuǎn)染后兩天，制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞溶胞產(chǎn)物并且在小鼠中培養(yǎng)的多克隆CHIKV-El抗 血清進(jìn)行的免疫印跡顯示52kDa El蛋白和36kDa衣殼蛋白的表達(dá)。圖3 抗體ELISA。(A)、(B)和(C) C57BL/6 小鼠如所示用 25 μ g pVaxl 載體或CHIKV 質(zhì)粒免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。收集血清并對CHIKV-El、CHIKV-E2或CHIKV-衣 殼的總IgG制備量進(jìn)行分析。血清在用2 μ g/ml各CHIKV肽涂布的96孔板上在37°C下培 養(yǎng)lh，并使用抗小鼠IgG-HRP檢測抗體。值代表兩個(gè)復(fù)孔的平均值(士S. D.)。圖4:通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISpot)測量的干擾素-Y對被膜El的應(yīng)答。
C57BL/6小鼠用25 μ g pVaxl載體或pCHIKV-El免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。(A) 收獲脾細(xì)胞并在RlO (陰性對照)或10 μ g/ml四個(gè)肽庫之一存在下培養(yǎng)過夜，所述肽庫由 跨El蛋白長度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。對CHIKV-El的應(yīng)答顯示為堆疊組平均應(yīng) 答。(B)收獲脾細(xì)胞并在RlO (陰性對照)或10 μ g/ml十八個(gè)肽庫之一存在下培養(yǎng)過夜，所 述肽庫由跨基質(zhì)El蛋白長度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。斑點(diǎn)形成單位(SFU)通過自 動(dòng)化ELISpot讀取分析儀定量，將原始值標(biāo)準(zhǔn)化為SFU/百萬脾細(xì)胞。值代表三個(gè)復(fù)孔的平 均值。圖5 通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISpot)測量的干擾素-Y對CHIKV被膜E2的應(yīng)答。 C57BL/6小鼠用25 μ g pVaxl載體或pCHIKV_E2免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。(A) 收獲脾細(xì)胞并在RlO(陰性對照)或10μ g/ml四個(gè)肽庫之一存在下培養(yǎng)過夜，所述肽庫由 跨E2蛋白長度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。對CHIKV-E2的應(yīng)答顯示為堆疊組平均應(yīng) 答。(B)收獲脾細(xì)胞并在RlO (陰性對照)或10 μ g/ml十八個(gè)肽庫之一存在下培養(yǎng)過夜，所 述肽庫由跨基質(zhì)E2蛋白長度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。斑點(diǎn)形成單位(SFU)通過自 動(dòng)化ELISpot讀取分析儀定量，將原始值標(biāo)準(zhǔn)化為SFU/百萬脾細(xì)胞。值代表三個(gè)復(fù)孔的平 均值。
圖6 通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISpot)測量的干擾素-Y對CHIKV-衣殼的應(yīng)答。C57BL/6小鼠用25 μ g pVaxl載體或pCHIKV-衣殼免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。 (A)收獲脾細(xì)胞并在RlO (陰性對照)或10 μ g/ml四個(gè)肽庫之一存在下培養(yǎng)過夜，所述肽庫 由跨衣殼蛋白長度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。對CHIKV-衣殼的應(yīng)答顯示為堆疊組平 均應(yīng)答。(B)收獲脾細(xì)胞并在RlO (陰性對照)或10 μ g/ml十八個(gè)肽庫之一存在下培養(yǎng)過 夜，所述肽庫由跨基質(zhì)衣殼蛋白長度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。斑點(diǎn)形成單位(SFU) 通過自動(dòng)化ELISpot讀取分析儀定量，將原始值標(biāo)準(zhǔn)化為SFU/百萬脾細(xì)胞。值代表三個(gè)復(fù) 孔的平均值。圖7是顯示患者和健康個(gè)體(首次實(shí)驗(yàn)的)血清的屈曲病毒的中和抗體滴度的 圖，所述滴度使用實(shí)施例2所述分析方法測量。優(yōu)選的具體實(shí)施方案 如本文所使用，“免疫原性共有片段”意指CHIKV共有蛋白的片段，該CHIKV共有蛋 白的片段包括足以對兩種或多種CHIKV菌株提供交叉防護(hù)的共有序列，所述交叉防護(hù)在使 用相應(yīng)的天然序列時(shí)沒有出現(xiàn)。片段長度一般是10個(gè)或更多個(gè)氨基酸。一些優(yōu)選的CHIKV El長度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至 少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至 少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至 少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至 少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至 少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至 少285、至少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至 少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至 少375、至少380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415、至少 420、至少425或至少430。一些優(yōu)選的CHIKV El長度是15或更小、20或更小、25或更小、 30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70 或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110 或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更 小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、 185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220 或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更 小、260或更小、265或更小、270或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、 295或更小、300或更小、305或更小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或 更小、335或更小、340或更小、345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、 370或更小、375或更小、380或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415 或更小、420或更小、425或更小、430或更小、或者435或更小。一些優(yōu)選的CHIKV E2長度 是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、 至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、 至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至 少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至 少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至少285、至 少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至 少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至少375、至少 380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415或至少420。一些 優(yōu)選的CHIKV E2長度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、 45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85 或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、 125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160 或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更 小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、 235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、260或更小、265或更小、270 或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、295或更小、300或更小、305或更 小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或更小、335或更小、340或更小、 345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、370或更小、375或更小、380 或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415或更小、422或更小。一些優(yōu) 選的CHIKV衣殼長度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少 45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、 至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至 少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至 少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少 235、至少240、至少245、至少250或至少255。一些優(yōu)選的CHIKV衣殼長度是15或更小、 20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60 或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100 或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更 小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、 175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210 或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更 小、250或更小、255或更小、或者260或更小。如本段所使用，對優(yōu)選片段大小的提及旨在 指至少和小于之間范圍的所有排列組合，例如范圍可以是以“至少”大小所列的任何數(shù)值到 以“小于t”大小所列的任何數(shù)值，以提供一系列大小，例如20-400、20-30、40-100，等等。 本文使用的術(shù)語“基因構(gòu)建體”指包含編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列 的DNA或RNA分子。編碼序列包括可操作連接于調(diào)控元件的起始信號和終止信號，所述調(diào) 控元件包括能夠指導(dǎo)被施用核酸分子的個(gè)體細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號。本文使用的術(shù)語“可表達(dá)形式”指含有可操作連接于編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白 的編碼序列的必要調(diào)控元件的基因構(gòu)建體，使得當(dāng)存在于個(gè)體細(xì)胞中時(shí)，所述編碼序列被 表達(dá)。本文使用的短語“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”指核酸分子與另一核酸分子雜交 但不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境下有所不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。一般而言，嚴(yán)格條件被選擇為在確定的離子強(qiáng)度和PH下 比特定序列的熱力學(xué)熔點(diǎn)(Tm)低約5°C。Tm是平衡時(shí)與靶序列互補(bǔ)的探針的50%與靶序 列雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)。由于靶序列一般是過量存在的，所 以在Tm下，平衡時(shí)探針的50%被占據(jù)。通常，嚴(yán)格條件是下述條件即，其中在pH 7.0至 8. 3下，鹽濃度小于約1. OM鈉離子、通常約0. 01至1. OM鈉離子(或其他鹽)，并且溫度對 于短的探針、引物或寡核苷酸(例如10至50個(gè)核苷酸)而言是至少約30°C且對于較長探 針、引物或寡核苷酸而言是至少約60°C。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺) 來實(shí)現(xiàn)。 本文使用的“同源”指兩個(gè)核酸序列之間或兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同源性。足 夠同源以使得免疫原性功能的兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)氨基酸序列是“同源的”。核苷酸和氨基 酸的序列同源性可以使用FASTA、BLAST和空位BLAST (Altschul等，Nuc. Acids Res.，1997， 25，3389，該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)和PAUP*4. OblO軟件(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)來確定?！跋嗨瓢俜直取庇?PAUP*4. OblO 軟件 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)來計(jì)算。共有序列的平均相似性 與系統(tǒng)進(jìn)化樹中所有序列進(jìn)行對比計(jì)算。簡而言之，代表基本局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool)的 BLAST 算法適合確定序列相似性(Altschul 等，J. Mol. Biol.，1990，215，403-410，該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)。進(jìn)行BLAST分析的軟件 可通過美國國家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。該算法 包括首先通過確定查詢序列中的長度W的短字來確定高得分序列對(HSP)，該查詢序列與 數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時(shí)匹配或滿足某一正值閾值分?jǐn)?shù)T。T被稱為相鄰字分?jǐn)?shù) 閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字的匹配用作啟動(dòng)尋找含有它們的HSP的檢索的 種子。字匹配沿每個(gè)序列兩個(gè)方向延伸至盡可能使累積比對分?jǐn)?shù)可以增加。下述情況下每 個(gè)方向的字匹配延伸停止1)累積比對分?jǐn)?shù)從其最大實(shí)現(xiàn)值減少數(shù)量X ;2)由于一個(gè)或多 個(gè)負(fù)得分殘基比對的累積，累積分?jǐn)?shù)到達(dá)零或以下；或3)到達(dá)任一序列的末端。Blast算法 參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。Blast程序使用下述作為默認(rèn)值字長(W)為11， BL0SUM62 得分矩陣(參見 Henikoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992，89，10915-10919， 該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)比對(B)為50，期望值(E)為10，M = 5，N = 4，和 雙鏈對比。BLAST 算法(Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993，90，5873-5787，該文獻(xiàn) 的全文以引用的方式并入本文)和空位BLAST進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。BLAST 算法提供的相似性的一個(gè)量度是最小總和概率(P(N))，其指示兩個(gè)核苷酸序列之間偶然發(fā) 生匹配的概率。例如，如果測試核酸與其他核酸對比中的最小總和概率小于約1、優(yōu)選小于 約0. 1、更優(yōu)選小于約0. 01且最優(yōu)選小于約0. 001，則認(rèn)為核酸與另一核酸相似。在一些實(shí)施方案中，提供了可以用于免疫個(gè)體的CHIKV的DNA疫苗。該疫苗包括 體內(nèi)體液免疫性和細(xì)胞免疫性兩者。根據(jù)一些實(shí)施方案，為了開發(fā)有能力誘發(fā)對屈曲病毒(CHIKV)的交叉反應(yīng)性免疫 應(yīng)答的免疫原，我們設(shè)計(jì)了針對CHIKV病毒被膜El、E2和核心蛋白衣殼的共有構(gòu)建體。對 于這些構(gòu)建體，從1952年至2006年分離的導(dǎo)致人類感染和死亡的屈曲病毒中選擇21個(gè)序 列。所選擇的每個(gè)基因的DNA序列來自S27菌株(首次分離株)和各個(gè)國家的菌株(包括 留尼旺島爆發(fā)分離株)，以避免抽樣偏差。對DNA序列進(jìn)行比對，為合成序列選擇各個(gè)位置最常見的核苷酸。推導(dǎo)的氨基酸序列用于指導(dǎo)引入比對空位，以便它們被引入到保持閱讀框的密碼子之間。共有序列產(chǎn)生之后，IgE前導(dǎo)序列被加至N末端以增強(qiáng)表達(dá)和分泌，構(gòu)建 體通過密碼子優(yōu)化并用更強(qiáng)序列(GCCGCCACC)(圖IA-SEQ ID NO 18)替換現(xiàn)有Kozak序列 來優(yōu)化。為了分析，將多聚組氨酸標(biāo)簽加至El和衣殼的C末端以證實(shí)表達(dá)。然后在根據(jù)之 前對于分析、表達(dá)和免疫原性研究[21]所述的細(xì)菌和純化環(huán)境下制備這些構(gòu)建體。圖IB 示出了編碼被膜El、E2和衣殼DNA的構(gòu)建體的瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)另一實(shí)施方案，我們設(shè)計(jì)了針對CHIKV病毒被膜E1、E2和E3各自的嵌合共有 構(gòu)建體。對于這些構(gòu)建體，制備E1、E2和E3各自的共有序列，并將各共有序列彼此連接，優(yōu) 選使用編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的序列。此外，將IgE前導(dǎo)序列加至N末端以增強(qiáng)表達(dá)和分泌。在優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建體包括與IgE前導(dǎo)序列連接的CHIKV編碼序列。然而，在 一些實(shí)施方案中，CHIKV編碼序列不與IgE前導(dǎo)序列連接，但是可任選地連接不同的前導(dǎo)序 列。SEQ ID NO 1指編碼與IgE前導(dǎo)序列連接的CHIKV-El共有蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO 2指編碼與IgE前導(dǎo)序列連接的CHIKV-E2共有蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO 3指編碼與IgE前導(dǎo)序列連接的CHIKV-衣殼共有蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO 4指對應(yīng)于SEQ ID NO 1的編碼CHIKV-E1共有蛋白但是沒有IgE前 導(dǎo)序列的編碼序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 5指對應(yīng)于SEQ ID NO :2的編碼CHIKV-E2共有蛋白但是沒有IgE前 導(dǎo)序列的編碼序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 6指對應(yīng)于SEQ ID NO 13的編碼CHIKV-衣殼共有蛋白但是沒有IgE 前導(dǎo)序列的編碼序列的核苷酸序列。SEQ ID NO :7指SEQ ID NO :1編碼的氨基酸序列，是帶有IgE前導(dǎo)序列的CHIKV-E1
共有蛋白。SEQ ID NO :8指SEQ ID NO :2編碼的氨基酸序列，是帶有IgE前導(dǎo)序列的CHIKV-E2
共有蛋白。SEQ ID NO :9指SEQ ID NO :3編碼的氨基酸序列，是帶有IgE前導(dǎo)序列的CHIKV-衣
殼共有蛋白。SEQ ID N0:10指SEQ ID NO :4編碼的氨基酸序列，是沒有IgE前導(dǎo)序列的 CHIKV-El共有蛋白。SEQ ID N0:11指SEQ ID NO :5編碼的氨基酸序列，是沒有IgE前導(dǎo)序列的 CHIKV-E2共有蛋白。SEQ ID N0:12指SEQ ID NO :6編碼的氨基酸序列，是沒有IgE前導(dǎo)序列的 CHIKV-衣殼共有蛋白。SEQ ID NO 13指編碼共有Env的核苷酸序列，所述共有Env是Kozak序列-IgE前 導(dǎo)序列-CHIKV-E3編碼序列-切割位點(diǎn)-CHIKV-E2編碼序列-切割位點(diǎn)-CHIKV-El編碼序 列-終止信號-終止信號。SEQ ID NO 14指SEQ ID NO 13編碼的氨基酸序列，是共有Env蛋白序列，即IgE 前導(dǎo)序列-CHIKV-E3-切割位點(diǎn)-CHIKV-E2-切割位點(diǎn)-CHIKV-El編碼序列。SEQ ID NO 15指對應(yīng)于SEQ ID NO 13的編碼共有Env但是沒有IgE前導(dǎo)序列的核苷酸序列，即CHIKV-E3編碼序列-切割位點(diǎn)-CHIKV-E2編碼序列-切割位點(diǎn)-CHIKV-El 編碼序列_終止信號_終止信號。SEQ ID NO 16指SEQ ID NO 15編碼的氨基酸序列，是沒有IgE前導(dǎo)序列的共有 Env蛋白序列，即CHIKV-E3-切割位點(diǎn)-CHIKV-E2-切割位點(diǎn)-CHIKV-El編碼序列。SEQ ID NO 17指IgE前導(dǎo)序列的氨基酸序列。SEQ ID NO 18 指優(yōu)選的 Kozak 序列。當(dāng)編碼共有蛋白的核酸分子被個(gè)體細(xì)胞攝取時(shí)，編碼共有蛋白的核苷酸序列在細(xì) 胞中表達(dá)，由此將蛋白遞送給個(gè)體。本發(fā)明的多個(gè)方面提供了遞送質(zhì)粒上共有蛋白編碼序 列或者作為重組疫苗的一部分和作為減毒疫苗的一部分的共有蛋白編碼序列的方法。根據(jù)本發(fā)明一些方面，提供了針對病原體或異常的疾病相關(guān)細(xì)胞而預(yù)防性和/或 治療性免疫個(gè)體的組合物和方法。疫苗可以是任何類型的疫苗，例如減毒活疫苗、重組疫苗 或核酸疫苗或DNA疫苗。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含一種、兩種或所有三種共有蛋白。在一些實(shí)施方案 中，疫苗包含同一核酸分子上兩種共有蛋白的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含兩種 不同核酸分子上兩種共有蛋白的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含同一核酸分子上 三種共有蛋白的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含三種共有蛋白的編碼序列，其中兩 種共有蛋白的編碼序列在同一核酸分子上而第三種共有蛋白的編碼序列在第二種核酸分 子上。例如，一種核酸分子包含El和E2的編碼序列并且包含衣殼的編碼序列；或者一種核 酸分子包含El和衣殼的編碼序列并且包含E2的編碼序列，或者一種核酸分子包含E2和衣 殼的編碼序列并且包含El的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含三種共有蛋白的編碼 序列，其中有三種不同的核酸分子，并且每種核酸分子包含不同的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，包括IgE前導(dǎo)序列的共有El的編碼序列是SEQ ID NO :1。在 一些實(shí)施方案中，無IgE前導(dǎo)序列的共有El的編碼序列是SEQ ID NO :4。在一些實(shí)施方案 中，含有IgE前導(dǎo)序列的共有El蛋白是SEQ ID NO :7或其片段。在一些實(shí)施方案中，共有 El蛋白是SEQ ID N0:10或其片段。在一些實(shí)施方案中，含有IgE前導(dǎo)序列的共有El蛋白 80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :7。在一些實(shí)施方案中，無IgE前導(dǎo)序列的 共有El蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :10。在一些實(shí)施方案中，包 括IgE前導(dǎo)序列的共有E2的編碼序列是SEQ ID NO :2。在一些實(shí)施方案中，無IgE前導(dǎo)序 列的共有E2的編碼序列是SEQ ID NO :5。在一些實(shí)施方案中，含有IgE前導(dǎo)序列的共有E2 蛋白是SEQ ID NO :8或其片段。在一些實(shí)施方案中，共有E2蛋白是SEQ ID N0:11或其片 段。在一些實(shí)施方案中，含有IgE前導(dǎo)序列的共有E2蛋白80%、90%、95%、98%或99%同 源于SEQ ID NO :7。在一些實(shí)施方案中，無IgE前導(dǎo)序列的共有El蛋白80%、90%、95%、 98%或99%同源于SEQ ID NO :11。在一些實(shí)施方案中，包括IgE前導(dǎo)序列的共有衣殼的編 碼序列是SEQ ID NO :3。在一些實(shí)施方案中，無IgE前導(dǎo)序列的共有El的編碼序列是SEQ ID NO :6。在一些實(shí)施方案中，含有IgE前導(dǎo)序列的共有El蛋白是SEQ ID NO :9或其片段。 在一些實(shí)施方案中，共有El蛋白是SEQ ID N0:12或其片段。在一些實(shí)施方案中，含有IgE 前導(dǎo)序列的共有El蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :9。在一些實(shí)施方 案中，無IgE前導(dǎo)序列的共有El蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :12。 多種基因可以在單一核酸分子上或在多種核酸分子上。例如，一種核酸分子包含El和E2的編碼序列并且包含衣殼的編碼序列；或者一種核酸分子包含El和衣殼的編碼序 列并且包含E2的編碼序列，或者一種核酸分子包含E2和衣殼的編碼序列并且包含El的編 碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含三種共有蛋白的編碼序列，其中存在三種不同的核酸 分子并且每種核酸分子包含不同的編碼序列。疫苗可以包含E1、E2和衣殼的兩種或多種共 有序列的組合。 在一些實(shí)施方案中，疫苗包含共有CHIKV Env,共有CHIKV Env包含連接在一起作 為單一嵌合基因的E1、E2和E3。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體共有序列通過編碼蛋白酶切割位 點(diǎn)的序列彼此連接。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含El、E2和E3各自的片段，使得嵌合 基因在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包 含SEQ ID NO :13或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和 E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少85%同源于SEQ ID NO: 13的 核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3各自 的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少90%同源于SEQ ID N0:13的核酸序 列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3各自的免疫 應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少95%同源于SEQ ID NO :13的核酸序列或其 片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。 在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少98%同源于SEQ ID NO: 13或的核酸序列其片段，該 片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些 實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少99%同源于SEQ ID NO: 13的核酸序列或其片段，該片段包 含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方 案中，嵌合基因包含SEQ ID NO :15或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表 達(dá)形成對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少85%同源 于SEQ ID NO :15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成 對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少90%同源于SEQ ID NO 15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、 E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少95%同源于SEQ ID NO: 15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3 各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少98%同源于SEQ ID NO: 15的核 酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3各自的 免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少99%同源于SEQ ID N0:15的核酸序列 或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對E1、E2和E3各自的免疫應(yīng) 答。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含共有CHIKV Env，其編碼連接在一起的El、E2和E3 的共有氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體共有序列通過編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的序列彼 此連接。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因編碼El、E2和E3各自的片段，其中由此編碼的氨基 酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，共有 蛋白CHIKV Env包含SEQ ID NO :14或其片段，該片段包含足夠序列，其中由此編碼的氨基 酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，CHIKV Erw共有蛋白包含至少85%同源于SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對E1、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中， CHIKV Env共有蛋白包含至少90%同源于SEQ ID NO :14的氨基酸序列或其片段，其中由此 編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方 案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少95%同源于SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其片段，其 中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些 實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少98%同源于SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其 片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。 在一些實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少99%同源于SEQ ID N0:14的氨基酸序列 或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免疫應(yīng) 答。在一些實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少85%同源于SEQ ID NO: 16的氨基酸 序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各自的免 疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少90%同源于SEQ ID N0:16的 氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、E2和E3各 自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少95%同源于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對E1、E2和 E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少98%同源于SEQ ID NO 16的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對El、 E2和E3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少99%同源于 SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā) 針對El、E2和E3各自的免疫應(yīng)答。核酸分子可以使用幾種已知技術(shù)中的任何一種來遞送，所述已知技術(shù)包括DNA注 射(還稱為DNA接種)、重組載體(例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組牛痘病
) oDNA 疫苗描述于美國專利號 5，593，972，5，739，118，5，817，637，5，830，876， 5，962，428，5，981，505，5，580，859，5，703，055，5，676，594 和其中引用的優(yōu)先申請，這些文
獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。除了那些申請中描述的遞送方案以外，遞送DNA的可選方法 還描述于美國專利號4，945，050和5，036，006，這兩個(gè)文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。施用途徑包括但不限于肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼內(nèi)和口服以及局部、經(jīng)皮、通過吸入或栓劑或至粘膜組織(例如通過灌洗至陰道、直腸、尿道、口腔 和舌下組織)。優(yōu)選的施用途徑包括至粘膜組織、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下注射。基因構(gòu)建 體可以通過包括但不限于下述的工具施用傳統(tǒng)注射器、無針頭注射裝置或“微彈轟擊基因 槍”。另一施用途徑涉及使用電穿孔來遞送基因構(gòu)建體，描述于美國專利號5，273，525， 5，439，440,5，702，359,5，810，762,5，993，434,6，014，584,6，055，453,6，068，650, 6，110，161,6，120，493,6，135，990,6，181，964,6，216，034,6，233，482,6，241，701, 6，347，247,6，418，341,6，451，002,6，516，223,6，567，694,6，569，149,6，610，044, 6，654，636,6, 678，556,6, 697，669,6, 763，264,6, 778，853,6, 865，416,6, 939，862 和 6，958，060，這些文獻(xiàn)據(jù)此以引用的方式并入。優(yōu)選用于促進(jìn)DNA疫苗遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法的實(shí)例包括描述于下述文獻(xiàn)中的那些Draghia-Akli等的美國專利號7，245，963，Smith等提交的美國專利公布 2005/0052630，這兩個(gè)文獻(xiàn)的內(nèi)容全文據(jù)此以引用的方式并入。還優(yōu)選的是在2007年10 月17日提交的共同待審和共同擁有的美國專利申請序號11/874072中提供的促進(jìn)DNA疫 苗遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法，該美國專利申請根據(jù)35 USC 119(e)要求2006年10 月17日提交的美國臨時(shí)申請序號60/852，149和2007年10月10日提交的美國臨時(shí)申請 序號60/978，982的權(quán)益，所有申請的全文據(jù)此以引用的方式并入。下面是使用電穿孔技術(shù)的實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例，并且在上述專利參考文獻(xiàn)中更詳 細(xì)地討論電穿孔裝置可被配置為向所需的哺乳動(dòng)物組織遞送能量脈沖，該能量脈沖產(chǎn)生 類似于使用者預(yù)設(shè)電流輸入的恒定電流。電穿孔裝置包括電穿孔組件和電極部件或手柄部 件。電穿孔組件可包括并并入電穿孔裝置的各種元件的一種或多種，包括控制器、電流波 形發(fā)生器、阻抗測試儀、波形記錄儀、輸入元件、狀態(tài)報(bào)告元件、通訊端口、記憶組件、電源和 電源開關(guān)。電穿孔組件能夠作為電穿孔裝置的一個(gè)元件起作用，其他元件是與所述電穿孔 組件聯(lián)通的分開元件(或組件)。在一些實(shí)施方案中，電穿孔組件能夠起到電穿孔裝置中不 止一個(gè)元件的作用，其還可以與電穿孔裝置中與所述電穿孔組件分開的其他元件聯(lián)通。使 用電穿孔技術(shù)遞送疫苗不受作為一個(gè)機(jī)電裝置或機(jī)械裝置的部分而存在的電穿孔裝置的 元件所限制，因?yàn)樗鲈軌蚱鸬揭粋€(gè)裝置或起到與分開元件彼此聯(lián)通的作用。電穿孔 組件能夠遞送在所需組織中產(chǎn)生恒定電流的能量脈沖，并且包括反饋機(jī)制。電極部件包括 具有空間排列的多個(gè)電極的電極陣列，其中電極部件接收來自電穿孔組件的能量脈沖并通 過電極將其遞送至所需的組織。多個(gè)電極的至少一個(gè)在能量脈沖遞送中是中性的并且測量 所需組織中的阻抗并且將阻抗聯(lián)通至電穿孔組件。反饋機(jī)制可以接收測量的阻抗并且可以 調(diào)節(jié)電穿孔組件遞送的能量脈沖以保持恒定電流。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)電極可以以分散模式遞送能量脈沖。在一些實(shí)施方案中， 多個(gè)電極可以通過以編程順序控制電極來以分散模式遞送能量脈沖，所述編程順序由使用 者輸入至電穿孔組件。在一些實(shí)施方案中，編程順序包括順序遞送的多個(gè)脈沖，其中所述多 個(gè)脈沖的每一個(gè)脈沖由至少兩個(gè)活性電極(帶有一個(gè)測量阻抗的中性電極)遞送，并且其 中所述多個(gè)脈沖的下一個(gè)脈沖由至少兩個(gè)活性電極(帶有一個(gè)測量阻抗的中性電極)的不 同的一個(gè)遞送。在一些實(shí)施方案中，反饋機(jī)制通過硬件或軟件進(jìn)行。優(yōu)選地，反饋機(jī)制通過模擬閉 環(huán)電路進(jìn)行。優(yōu)選地，該反饋每隔50 y s、20 y s、10 y s或1 y s發(fā)生，但是優(yōu)選為實(shí)時(shí)反饋 或即時(shí)反饋(即，通過采用現(xiàn)有技術(shù)測定響應(yīng)時(shí)間確定為基本上是即時(shí)的)。在一些實(shí)施方 案中，中性電極測量所需組織中的阻抗并將阻抗聯(lián)通至反饋機(jī)制，并且反饋機(jī)制響應(yīng)阻抗 并調(diào)節(jié)能量脈沖以保持恒定電流為類似于預(yù)設(shè)電流的值。在一些實(shí)施方案中，反饋機(jī)制在 能量脈沖遞送過程中連續(xù)并即時(shí)保持恒定電流。當(dāng)被細(xì)胞攝取時(shí)，基因構(gòu)建體可以作為功能性染色體外分子保持存在于細(xì)胞中。 DNA可以以質(zhì)粒形式被引入細(xì)胞，DNA在細(xì)胞中短暫存在。可選地，RNA可以被施用至細(xì)胞。 還考慮提供作為線性微型染色體的基因構(gòu)建體，包括著絲粒、端粒和復(fù)制起點(diǎn)?；驑?gòu)建體 可以構(gòu)成被施用于受試者的減毒活微生物或重組微生物載體中遺傳物質(zhì)的部分?；驑?gòu)建 體可以是重組病毒疫苗的基因組的部分，其中遺傳物質(zhì)保持在染色體外?；驑?gòu)建體包括 核酸分子基因表達(dá)所必要的調(diào)控元件。所述元件包括啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子和多聚腺苷酸化信號。此外，增強(qiáng)子通常是編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的基因表達(dá)所 需要的。必要的是，這些元件與編碼所需蛋白的序列可操作連接，并且所述調(diào)控元件在它們 被施用的個(gè)體中是可操作的。一般認(rèn)為起始密碼子和終止密碼子是編碼所需蛋白的核苷酸序列的部分。然而， 必要的是，這些元件在基因構(gòu)建體被施用的個(gè)體中是功能性的。起始密碼子和終止密碼子 必須與編碼序列在框內(nèi)。所使用的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號必須在個(gè)體細(xì)胞內(nèi)是功能性的?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明、特別是產(chǎn)生人類基因疫苗的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于來自 猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人類免疫缺陷病毒(MV)(例如BIV 長末端重復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子)、莫洛尼病毒、ALV(禽白血病病毒)、巨細(xì)胞病毒(CMV)(例 如CMV立即早期啟動(dòng)子)、EB病毒(EBV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)的啟動(dòng)子以及來自人類基因 的啟動(dòng)子，所述人類基因例如人類肌動(dòng)蛋白、人類肌球蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸和 人類金屬硫蛋白?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明、特別是產(chǎn)生人類基因疫苗的多聚腺苷酸化信號的實(shí)例包括但 不限于SV40多聚腺苷酸化信號、小牛生長激素多聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信號和LTR多聚 腺苷酸化信號。特別地，使用在PCEP4質(zhì)粒(Invitrogen,San Diego Calif.)中稱為SV40 多聚腺苷酸化信號的SV40多聚腺苷酸化信號。除了 DNA表達(dá)所需的調(diào)控元件，DNA分子中還可以包括其他元件。此類其他元件 包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以選自下述組，包括但不限于人類肌動(dòng)蛋白、人類肌球蛋白、人類血 紅素、人類肌肉肌酸和病毒增強(qiáng)子(例如來自CMV、RSV和EBV的那些)。基因構(gòu)建體可以具有哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)以在染色體外保持構(gòu)建體并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn) 生多個(gè)構(gòu)建體拷貝。來自 Invitrogen(San Diego, Calif.)的質(zhì)粒 pVAXl、pCEP4 和 pREP4 含有EB病毒復(fù)制起點(diǎn)和核抗原EBNA-1編碼區(qū)，其產(chǎn)生高拷貝的無整合游離型復(fù)制。在有關(guān)免疫應(yīng)用的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，遞送的核酸分子包括編碼共有蛋白的核 苷酸序列并且另外包括進(jìn)一步增強(qiáng)對此類靶蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白基因。此類基因的實(shí)例 是編碼其他細(xì)胞因子和淋巴因子的那些基因，所述細(xì)胞因子和淋巴因子例如a-干擾素、
干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、 11-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-28，其包括信號序列缺失并任選包括來自IgE信號肽 的 IL-15。用于本方法的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種下述蛋白和/或編碼此類蛋白 的核酸分子，如在對應(yīng)于美國
發(fā)明者D·B·韋納, K·穆圖瑪尼 申請人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會