專利名稱：含有細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及過繼免疫療法中高效的含有細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷(CIK)細(xì)胞的細(xì)胞 群以及該細(xì)胞群的制造方法等。本發(fā)明涉及的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (regulatory T cells； Treg細(xì)胞)的增殖被抑制，可用于早期和晚期癌癥以及包括造血細(xì)胞 和實(shí)體瘤在內(nèi)的各種細(xì)胞增殖性疾病的治療。
背景技術(shù)：
近年來，人們重新審視藥物療法和放射療法之類的給患者帶來嚴(yán)重肉體痛苦的 治療方法，開始越來越關(guān)注痛苦小的免疫療法。該療法包括例如過繼免疫療法，其對取 出至體外的免疫相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)使其細(xì)胞數(shù)目增加，和/或增強(qiáng)與治療效果相關(guān)的活 性后，再移植給患者。過繼免疫療法中作為效應(yīng)細(xì)胞而利用的細(xì)胞，已知有淋巴因子激活的殺 傷(lymphokine activated killer ； LAK)細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumour infiltrating lymphocyte ； TIL)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷(cytokine-induced killer ； CIK)細(xì)胞。LAK細(xì)胞是通過在白細(xì)胞介素(IL)_2存在下使淋巴細(xì)胞增殖而得到的細(xì)胞群， 具有能溶解腫瘤細(xì)胞但不溶解正常細(xì)胞的性質(zhì)。關(guān)于LAK細(xì)胞的制備，已開發(fā)出在培養(yǎng) 時(shí)使抗CD3抗體與IL-2共存的方法。TIL是浸潤到了腫瘤組織的T細(xì)胞，與LAK細(xì)胞相比，具有更顯著的腫瘤抗原 特異性。該細(xì)胞也可以在體外增殖并用于治療。但是，TIL必須摘取患者的腫瘤組織才 能獲得，因此采集操作繁雜，得到的細(xì)胞數(shù)也很少。CIK細(xì)胞可由末梢血單核細(xì)胞(PBMC)在干擾素(IFN)-Y、抗CD3抗體以及 IL-2的存在下進(jìn)行培養(yǎng)來制備。CIK細(xì)胞是作為含有CD3陽性、CD56陽性細(xì)胞的細(xì)胞 群而具有特征的PBMC中稀有細(xì)胞群，但在沒有靶細(xì)胞的存在下可以使該細(xì)胞群優(yōu)先增 殖。CIK細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮比LAK細(xì)胞更勝一籌的針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性(例如非 專利文獻(xiàn)1)。纖維連接蛋白是存在于動物血液、培養(yǎng)細(xì)胞表面、組織的細(xì)胞外基質(zhì)中的分子 量25萬的巨大糖蛋白，已知具有多種功能。其結(jié)構(gòu)域有7個(gè)(參照圖1)。而且，其氨 基酸序列中含有3種類似的序列，由上述各序列的重復(fù)構(gòu)成整體。3種類似的序列分別被 稱為I型、II型、III型。其中，III型由71 96個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，這些氨基酸殘基的 一致率為17 40%。利用DNA重組技術(shù)，制得多種纖維連接蛋白的片段，可期待其中有些具有抑制 癌轉(zhuǎn)移的作用(非專利文獻(xiàn)2)。此外，還報(bào)道具有肝素結(jié)合域的纖維連接蛋白片段具有 促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的功能(非專利文獻(xiàn)3)。針對移入由體外誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T cell ； CTL)或末梢血淋巴細(xì)胞 等在IL-2和抗CD3抗體的作用下經(jīng)放大培養(yǎng)得到的淋巴因子激活的細(xì)胞的免疫療法中， 如何在將體外誘導(dǎo)的抗原特異性CTL放大培養(yǎng)時(shí)維持細(xì)胞毒活性、如何能在體外高效地放大培養(yǎng)淋巴細(xì)胞等問題，探討了使用纖維連接蛋白或其片段所產(chǎn)生的效果(例如專利 文獻(xiàn)1 3)。以往技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1國際公開第03/016511號小冊子專利文獻(xiàn)2國際公開第03/080817號小冊子專利文獻(xiàn)3國際公開第2005/019450號小冊子非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 J.Immunol.，1994 年，Vol.153，pl687_1696非專利文獻(xiàn)2 J.Biochem.，1991 年，Vol.110，No.2，p284_291非專利文獻(xiàn)3 Nature Medicine，1996 年，Vol.2，No.8, p876_88
發(fā)明內(nèi)容
在CIK細(xì)胞的放大培養(yǎng)過程中，PBMC分化為多個(gè)性質(zhì)不同的細(xì)胞群，因此放 大后的細(xì)胞群中的CIK細(xì)胞比例必定不高。另一方面，在分化得到的細(xì)胞群中還含有具 有控制或抑制免疫的功能的細(xì)胞群。本發(fā)明的目的在于提供用于制造被稱為過繼免疫療 法的優(yōu)選細(xì)胞群的CIK細(xì)胞的、不必要的細(xì)胞群含量少的癌治療用細(xì)胞群的放大培養(yǎng)方法。下面，對本發(fā)明進(jìn)行概述。本發(fā)明的第1發(fā)明涉及含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制 造方法，其特征在于，包含如下工序，即在纖維連接蛋白片段的存在下，培養(yǎng)含有能分 化成細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群。第1發(fā)明的方式可提供在含有選自VLA-4 結(jié)合域、VLA-5結(jié)合域以及肝素結(jié)合域中的區(qū)域的纖維連接蛋白片段的存在下，實(shí)施培 養(yǎng)的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法。另外，作為第1發(fā)明中使用的纖維連接蛋白片段的優(yōu)選例子，可例舉含有選自 序列號1、2以及5中的氨基酸序列的纖維連接蛋白片段。此外，作為第1發(fā)明的優(yōu)選方 式，還提供在CD3配體、干擾素-Y以及白細(xì)胞介素_2的共存下實(shí)施纖維連接蛋白片段 存在下的培養(yǎng)的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法。作為CD3配體，只要能在本發(fā)明中 使用即可，沒有限制，優(yōu)選使用抗CD3抗體來實(shí)施。本發(fā)明的第2發(fā)明涉及用本發(fā)明第1發(fā)明的方法得到的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明的第3發(fā)明涉及含有本發(fā)明第2發(fā)明的細(xì)胞群為有效成分的藥品。本發(fā)明的第4發(fā)明涉及包含如下工序的疾病治療方法或預(yù)防方法，所述工序中 向?qū)ο蠼o予有效量的本發(fā)明第2發(fā)明的細(xì)胞群。另外，所述疾病只要是對本發(fā)明第2發(fā) 明的細(xì)胞群具有感受性的疾病即可。此外，第2發(fā)明的細(xì)胞群可以是來自身患需要治療 或預(yù)防的疾病且接受該細(xì)胞群給藥的對象(患者)的細(xì)胞群，根據(jù)情況也可以是來自對象 以外的供者的細(xì)胞群。 本發(fā)明的第5發(fā)明涉及用于藥品制造的第2發(fā)明的細(xì)胞群的使用。通過本發(fā)明的制造方法提供能大量放大培養(yǎng)富含具有高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞 的細(xì)胞群的制造方法。由該制造方法大量得到的高品質(zhì)細(xì)胞群在生物體內(nèi)發(fā)揮高效的治 療效果，因此對利用細(xì)胞醫(yī)療的疾病治療極其有用。


圖1是表示纖維連接蛋白的結(jié)構(gòu)域的示意圖。圖2是表示用放大培養(yǎng)得到的細(xì)胞群的表型。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過在纖維連接蛋白片段的存在下培養(yǎng)PBMC，在得到的細(xì)胞群中高比例含有在細(xì)胞表面表達(dá)CD3、CD56兩分子的細(xì)胞，從而完成了本發(fā)明。下面，具體說明本發(fā)明。(1)本發(fā)明中使用的纖維連接蛋白的片段本說明書中所述的纖維連接蛋白的片段可以是天然得到的片段(天然的纖維連 接蛋白經(jīng)酶解片段化后得到的片段等)或通過DNA重組技術(shù)得到的片段中的任一種。纖 維連接蛋白片段，例如可根據(jù)魯斯特( > 才^ 7-r 4 )E.等[J.Biol.Chem.，第256卷， 第14號，第7277 7281頁(1981)]中公開的內(nèi)容，由來自天然的物質(zhì)以實(shí)質(zhì)上為純物 質(zhì)的形態(tài)來制造。這里，本說明書中所述的實(shí)質(zhì)上純的纖維連接蛋白片段指本質(zhì)上不含 有天然情況下與纖維連接蛋白一起存在的其他蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，纖維連接蛋白片段可 以使用單一的分子種，也可以混合使用多個(gè)分子種。本發(fā)明中能使用的纖維連接蛋白片段及該片段的制備相關(guān)的有用信息可通過非 專利文獻(xiàn) 2 以及 Kornblihtt A.R.等[EMBO J.，第 4 卷，第 7 號，1755 1759 (1985)]、 Sekiguchi K.等[Biochemistry，第 25 卷，第 I7 號，4936 4M1 (1986)]等而得。另 夕卜，編碼纖維連接蛋白的核酸序列或纖維連接蛋白的氨基酸序列已在Genbank Accession No.NM_002026, NP_002017 中公開。本發(fā)明可優(yōu)選使用具有細(xì)胞粘附活性和/或肝素結(jié)合活性的纖維連接蛋白片 段。纖維連接蛋白中存在具有與細(xì)胞表面的整合蛋白結(jié)合的活性的區(qū)域。作為上述 區(qū)域，可例舉VLA(極晚抗原)-4、VLA-5結(jié)合域。在纖維連接蛋白的靠近C末端側(cè)的部位存在被稱為IIICS的區(qū)域。其中含有被 稱為CS-I的由25個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域，該區(qū)域?qū)LA-4表現(xiàn)出結(jié)合活性。CS_1 區(qū)域的氨基酸序列如序列表的序列號1所示。另外，在纖維連接蛋白中存在被稱為III型的重復(fù)序列，在從N末端側(cè)開始第10 個(gè)III型重復(fù)序列中存在與細(xì)胞結(jié)合的區(qū)域。第10個(gè)III型重復(fù)序列的氨基酸序列如序列 表的序列號2所示。上述序列中在與VLA-5的結(jié)合中起主要作用的序列為序列表的序列 號3所示的Arg-Gly-Asp-SerCRGDS)四氨基酸。由序列表的序列號4所示的氨基酸序列 組成的C-274是含有序列號2的氨基酸序列的多肽，是具有強(qiáng)的細(xì)胞粘附活性的重組纖維 連接蛋白片段。此外，纖維連接蛋白具有與肝素結(jié)合的活性。纖維連接蛋白的肝素結(jié)合域相當(dāng) 于上述III型重復(fù)序列的N末端側(cè)開始的第12 第14個(gè)。由序列表的序列號5所示的氨 基酸序列組成的H-271是由此肝素結(jié)合域組成的重組纖維連接蛋白片段。本發(fā)明除了可以使用單獨(dú)含有各區(qū)域的片段外，還可以使用上述區(qū)域中2個(gè)以上直接或介以合適的接頭結(jié)合而成的片段。上述片段中含有的來自纖維連接蛋白的區(qū) 域可以相同也可以不同。作為分子內(nèi)具有多個(gè)結(jié)合域的纖維連接蛋白的片段，可例舉 含有VLA-4結(jié)合域和肝素結(jié)合域的H-296 (序列表的序列號6表示的氨基酸序列)、含 有VLA-5結(jié)合域和肝素結(jié)合域的CH-271 (序列表的序列號7表示的氨基酸序列)、含有 VLA-4結(jié)合域、VLA-5結(jié)合域和肝素結(jié)合域的CH-296 (序列表的序列號8表示的氨基酸 序列)、含有VLA-4結(jié)合域和VLA-5結(jié)合域的OCSl (序列表的序列號9表示的氨基酸 序列)等多肽。上述各種多肽在非專利文獻(xiàn)2中有記載，可以根據(jù)其公開的內(nèi)容來制作。 寶生物工程株式會社以樂透露奈庫秦(^卜α才、夕f > ) (Retronectin 注冊商標(biāo))的名稱 出售 CH-296。作為本發(fā)明中使用的片段，只要能獲得本發(fā)明所希望的效果，也可以是與上述 例舉的含有天然纖維連接蛋白的氨基酸序列中的至少一部分的片段具有同等功能的、由 具有構(gòu)成該片段的多 肽的氨基酸序列經(jīng)1個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨 基酸序列的多肽構(gòu)成的片段。例如，使C-274或H-271缺失1個(gè)或2個(gè)III型重復(fù)序列 而得到的片段。關(guān)于細(xì)胞粘附活性，可以用公知的方法測定本發(fā)明中使用的片段(其細(xì)胞結(jié)合 域)與細(xì)胞的結(jié)合而獲得。例如，上述方法包括威廉姆斯(々4 U 7 f ^ )D.A.等的方 法[Nature，第352卷，第438 441頁(1991)]。該方法是測定細(xì)胞與培養(yǎng)板上固定化 的片段的結(jié)合的方法。關(guān)于肝素結(jié)合活性，可以用公知的方法測定本發(fā)明中使用的片段 (其肝素結(jié)合域)與肝素的結(jié)合來獲得。例如，將上述威廉姆斯D.A.等的方法中的細(xì)胞 換成肝素，例如使用標(biāo)記肝素，即可用同樣的方法評價(jià)片段與肝素的結(jié)合。從獲取、操作的容易性以及品質(zhì)均一性、病毒等混入的危險(xiǎn)性低的安全層面考 慮，本發(fā)明優(yōu)選使用重組纖維連接蛋白片段。本發(fā)明中使用的纖維連接蛋白片段的分子 量沒有特殊限制，優(yōu)選1 200kDa、進(jìn)一步優(yōu)選5 190kDa、更優(yōu)選10 180kDa。該 分子量例如可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定。(2)含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法下面，對本發(fā)明涉及的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法進(jìn)行具體說明。本發(fā) 明涉及富含CIK細(xì)胞、即以CD3陽性和CD56陽性為特征的細(xì)胞亞群的細(xì)胞群的制造方 法。本發(fā)明方法的特征在于，包含如下工序，即在上述纖維連接蛋白片段的存在下， 培養(yǎng)含有能分化為CIK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群。作為本發(fā)明制造方法中使用的含有能分化為CIK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群，可例舉 由末梢血、骨髓、臍帶血等得到的細(xì)胞群或從這些材料中分離得到的血細(xì)胞系細(xì)胞群。 本發(fā)明優(yōu)選使用PBMC。上述細(xì)胞群無論是從生物體采集的新鮮細(xì)胞群或冷凍保存過的 細(xì)胞群，均可用于本發(fā)明。本發(fā)明的制造方法中對纖維連接蛋白片段的濃度沒有特殊限制，但優(yōu)選例如為 0.001 500yg/mL、特別是0.01 500 μ g/mL。纖維連接蛋白片段除了在培養(yǎng)基中溶解 而共存外，還可以在合適的固相例如培養(yǎng)皿、燒瓶、袋子等細(xì)胞培養(yǎng)用器材(培養(yǎng)用容 器；包括開放體系和封閉體系的任一種)或珠子、膜、載玻片等細(xì)胞培養(yǎng)用載體上固定 化后使用。這些固相的材質(zhì)只要是可以在細(xì)胞培養(yǎng)中使用的材料即可，沒有特殊限制。 關(guān)于纖維連接蛋白的固定化量，根據(jù)將上述器材或載體供培養(yǎng)用時(shí)，按與將該成分在培養(yǎng)基中溶解使用時(shí)所需的濃度相同的比例進(jìn)行選擇，只要能得到所需效果，沒有特殊限 制。作為纖維連接蛋白片段在固相上的固定化方法，沒有特殊限制，例如可通過 使溶解于適當(dāng)緩沖液中的片段與固相接觸進(jìn)行固定化。另外，也可以用國際公開第 97/18318號小冊子以及國際公開第00/09168號小冊子中記載的方法來實(shí)施纖維連接蛋白 片段的固定化。本發(fā)明優(yōu)選的方式中，在CD3配體的存在下進(jìn)行纖維連接蛋白片段存在下的培 養(yǎng)。作為CD3配體，只要是具有CD3結(jié)合活性的物質(zhì)即可，沒有特殊限制，可例舉例如 抗CD3抗體，特別優(yōu)選抗CD3單克隆抗體，例如OKT3[J.Immunol.，第124卷，第6號， 2708 2713(1980)]。CD3配體在培養(yǎng)基中的濃度沒有特殊限制，例如在使用抗CD3單 克隆抗體的情況下，優(yōu)選例如0.001 500 μ g/mL、特別是0.01 100 μ g/mL。CD3抗 體也可以通過與纖維連接蛋白片段同樣的操作在細(xì)胞培養(yǎng)用器材或細(xì)胞培養(yǎng)用載體上固 定化后使用。若將纖維連接蛋白片段、CD3配體在固相上固定化，則培養(yǎng)結(jié)束后，只要將 細(xì)胞與固相分離即可容易地將上述成分與得到的細(xì)胞群分離，能防止上述成分混入細(xì)胞
群。 本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法中使用的培養(yǎng)基，沒有特殊限制， 可以使用淋巴細(xì)胞放大培養(yǎng)等中能使用的公知的培養(yǎng)基，例如可以適當(dāng)?shù)剡x擇使用市售 培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基除其原有的構(gòu)成成分外，還可以含有細(xì)胞因子類、適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)及 其他成分。通常，本發(fā)明使用含有IFN-Y、IL-2的培養(yǎng)基。IFN-Y在培養(yǎng)基中的濃度 沒有特殊限制，可以是50 10000U/mL，更優(yōu)選100 5000U/mL。IL_2在培養(yǎng)基中 的濃度也沒有特殊限制，可以是10 5000U/mL，優(yōu)選50 2000U/mL。此外，還可以 在培養(yǎng)基中添加IL-I α、IL-7、IL_12等細(xì)胞因子類。只要能獲得所需效果，該成分在 培養(yǎng)基中的濃度不受特殊限制。在培養(yǎng)基中可以添加血清或血漿進(jìn)行培養(yǎng)。它們在培養(yǎng)基中的添加量不受特殊 限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根據(jù)不同的培養(yǎng)階段而改變血清或血漿的用 量。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的來源，可 以是自己(意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞來源相同)或非自己(意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞的來源不 同)中的任一種，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添 加如人血清白蛋白之類經(jīng)分離純化的血清成分。本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造除了使用纖維連接蛋白片段外，使用上 述各種成分及培養(yǎng)基來實(shí)施。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)沒有特殊限制，例如 優(yōu)選 1 X 104cell/mL 1 X 108cells/mL、更優(yōu)選 1 X 105cell/mL 5 X 107cells/mL。另外，
培養(yǎng)條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的條件。例如，可在37°C、 5% CO2等條件下培養(yǎng)。還可以實(shí)施如下等操作間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加新鮮培養(yǎng)基來稀 釋細(xì)胞培養(yǎng)液，或更換培養(yǎng)基，或更換細(xì)胞培養(yǎng)用器材等。本發(fā)明的制造方法中可以使用例如培養(yǎng)皿、燒瓶、袋子、大型培養(yǎng)槽、生物反 應(yīng)器等細(xì)胞培養(yǎng)用器材(容器)。作為袋子，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)用CO2氣體透過性袋子。在 需要大量細(xì)胞的情況下，可以使用大型培養(yǎng)槽。培養(yǎng)可以在開放體系或封閉體系中的任一體系中實(shí)施，但優(yōu)選在封閉 體系中實(shí)施培養(yǎng)。本發(fā)明含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法中，對培養(yǎng)期沒有特殊限制，例如可 以實(shí)施總天數(shù)為4 30天、優(yōu)選6 25天的培養(yǎng)。在本發(fā)明的制造方法中，纖維連接 蛋白片段存在下的培養(yǎng)可以是培養(yǎng)期的整個(gè)期間，也可以是任意的一部分期間。即，只 要在細(xì)胞培養(yǎng)工序的一部分中包含纖維連接蛋白片段存在下的培養(yǎng)工序的培養(yǎng)即屬于本 發(fā)明。特別優(yōu)選整個(gè)培養(yǎng)期的至少初期階段在纖維連接蛋白片段的存在下實(shí)施培養(yǎng)，更 優(yōu)選在纖維連接蛋白片段的存在下開始培養(yǎng)。最好是將本發(fā)明的有效成分存在下的培養(yǎng) 在培養(yǎng)開始后至少實(shí)施1天以上、更優(yōu)選2天以上。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)使用CD3配體時(shí)，其使用 時(shí)期沒有特殊限制，例如在纖維連接蛋白片段使用時(shí)使CD3配體共存。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，僅在整個(gè)培養(yǎng)期的初期階段使用纖維連接蛋白片段 和CD3配體。在本發(fā)明中沒有特別限定，例如，從培養(yǎng)開始時(shí)到第7天為止，優(yōu)選從培 養(yǎng)開始時(shí)到第5天為止，在纖維連接蛋白片段和CD3配體的共同存在下實(shí)施培養(yǎng)，之后 在這兩種成分均不存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，制造含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群。此外，本發(fā)明的制造方法還可以包含如下工序，即從用上述方法得到的細(xì)胞群 中進(jìn)一步分離出CD3陽性、CD56陽性的細(xì)胞群。關(guān)于分離，例如可以用使用細(xì)胞分選 儀、磁珠、親和柱等的公知手段來進(jìn)行。如此分離得到的細(xì)胞群富含具有高細(xì)胞毒活性 的細(xì)胞，可期待其發(fā)揮更好的治療效果。(3)含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群本發(fā)明提供用上述本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法得到的含有CIK 細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群與用以往方法制得的含有CIK細(xì)胞的細(xì) 胞群相比，由于高比例地含有CD3陽性CD56陽性細(xì)胞，因此在生物體內(nèi)發(fā)揮更強(qiáng)的細(xì) 胞毒活性，達(dá)到很好的治療效果。此外，上述細(xì)胞群還具有如下優(yōu)點(diǎn)，即具有抑制細(xì)胞 性免疫作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells; Treg細(xì)胞)的含量低，因此非常利于在治 療上應(yīng)用。本發(fā)明還提供以含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群為有效成分的藥品(治療劑或預(yù)防劑)。 含有該細(xì)胞群的上述治療劑適用于免疫療法。免疫療法中，例如通過注射或點(diǎn)滴等的 靜脈、動脈、皮下、腹腔內(nèi)等給藥方法向患者給予適于患者治療的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞 群。本發(fā)明的治療劑對于例如癌癥、白血病、惡性腫瘤、肝炎或感染性疾病(例如流 感、結(jié)核、AIDS、MRSA感染癥、VRE感染癥、深層真菌癥)等對CIK細(xì)胞具有感受 性的疾病的治療非常有用，但本發(fā)明并不限于此。另外，該治療劑也可以在以預(yù)防骨髓 移植或放射線照射后的感染癥、緩減復(fù)發(fā)白血病癥狀為目的的供者淋巴細(xì)胞輸注等中應(yīng) 用。本發(fā)明的治療劑、預(yù)防劑可以根據(jù)制藥領(lǐng)域的公知方法來制備，例如以用本發(fā) 明的方法制得的細(xì)胞群為有效成分，與公知的適于非口服給藥的有機(jī)或無機(jī)的載體、賦 形劑、穩(wěn)定劑等混合，制成點(diǎn)滴劑、注射劑。另外，治療劑中本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞 的細(xì)胞群的含量、治療劑的給藥量、與該治療劑相關(guān)的各種條件可根據(jù)公知的免疫療 法來適當(dāng)?shù)貨Q定。例如，藥品中本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的含量，沒有特殊限 制，例如優(yōu)選1 X IO3 1 X IO11CelWmL,進(jìn)一步優(yōu)選1 X IO4 1 X 1010cells/mL,更優(yōu)選 lX105 2X109CellS/mL。另外，作為本發(fā)明藥品的給藥量，沒有特殊限制，例如成人每日優(yōu)選為IX IO6 IX IO12ceIls/天，進(jìn)一步優(yōu)選為IXlO7 Sxio11ceIis/天，更優(yōu)選為IX IO8 ZxiO11ceIls/天。此外，采用該治療劑的免疫療法可以與公知的通過給予藥 物的藥物治療或放射治療、外科手術(shù)治療并用。本發(fā)明的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法還可以進(jìn)一步包括在該細(xì)胞群中導(dǎo) 入外源基因的工序。另外，“外源基因”指向基因?qū)雽ο蟮腃IK細(xì)胞中人為導(dǎo)入的基 因，也包括來自與作為基因?qū)雽ο蟮募?xì)胞同種細(xì)胞的基因。外源基因的導(dǎo)入手段沒有特殊限制，可以從公知的基因?qū)敕椒ㄖ羞x擇使用適 當(dāng)?shù)姆椒??；驅(qū)牍ば蚩梢栽诒景l(fā)明制造方法中的任意時(shí)刻實(shí)施。從作業(yè)效率的觀點(diǎn) 出發(fā)，例如優(yōu)選與上述細(xì)胞群的制造同時(shí)或中途或在該工序后實(shí)施?？梢杂貌《据d體來 實(shí)施基因?qū)耄部梢圆皇褂貌《据d體。其方法的具體內(nèi)容已在眾多文獻(xiàn)中公開。上述病毒載體沒有特殊限制，通常使用基因?qū)敕椒ㄖ惺褂玫墓牟《据d 體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、猿猴病毒載 體、痘苗病毒載體或仙臺病毒載體等。特別優(yōu)選能將外源基因穩(wěn)定地整合到被導(dǎo)入的細(xì) 胞的染色體DNA中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體。作為上述病毒載體，優(yōu)選在感染的 細(xì)胞中無法自我復(fù)制的復(fù)制能力欠缺的載體。另外，在基因?qū)霑r(shí)，也可以使用樂透露 奈庫秦(注冊商標(biāo)，寶生物工程株式會社制)等能提高基因?qū)胄实奈镔|(zhì)。作為不使用病毒載體的基因?qū)敕椒?，可以采用使用核糖體、配體-聚賴氨酸 等載體的方法或磷酸鈣法、電穿孔法、基因槍法等。此時(shí)，整合在質(zhì)粒DNA、直鏈狀 DNA或RNA中的外源基因被導(dǎo)入。導(dǎo)入的外源基因沒有特殊限制，可以使用希望導(dǎo)入上述細(xì)胞的任意基因(例 如編碼酶、細(xì)胞因子類、受體類等蛋白質(zhì)的基因以及編碼反義核酸或siRNA(小干擾 RNA)、核酶的基因)。這些外源基因例如以在適宜啟動子的控制下表達(dá)的方式插入載體 或質(zhì)粒等中來使用。另外，載體中也可以存在增強(qiáng)序列或終止序列之類的控制序列。根據(jù)本法明的方法，可以通過導(dǎo)入與對癌癥等患者的治療中所用的藥物的耐性 相關(guān)的酶的編碼基因(例如多藥抗藥性基因)來賦予含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群以抗藥性。 若使用這樣的細(xì)胞群，則可以將免疫療法與藥物療法組合，因而可以得到更好的治療效 果。另一方面，與上述方式相反，通過導(dǎo)入賦予針對特定藥物感受性的基因(例如胸苷 激酶基因)也可以賦予含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群以針對該藥物的感受性。此時(shí)，通過給予 該藥物即可除去移植到生物體后的細(xì)胞。本發(fā)明還提供包括向?qū)ο蠼o予有效量的通過上述方法得到的含有CIK細(xì)胞的細(xì) 胞群的疾病治療方法或預(yù)防方法。本說明書中的對象表示例如為身患上述疾病的患者。本說明書中的有效量指給予上述含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群后能達(dá)到治療或預(yù)防效 果的該細(xì)胞群的量。具體的有效量因給藥形態(tài)、給藥方法、使用目的以及對象的年齡、 體重、癥狀等來適當(dāng)設(shè)定，并非定值。給藥方法沒有限制，例如可以與上述藥品同樣， 通過點(diǎn)滴或注射等來給藥。另外，本發(fā)明還提供用于藥品制造的含有CIK細(xì)胞的細(xì)胞群的使用。該藥品 的制造方法與上述藥品相同。此外，對給予該藥品的疾病沒有特殊限制，與上述藥品相 同。實(shí)施例
下面，結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。 實(shí)施例1使用了纖維連接蛋白片段CH-296的CIK細(xì)胞的放大培養(yǎng)(I)PBMC 的分離對知情同意的5位患者(腎癌2名、肺癌、肝癌和甲狀腺癌各1名)進(jìn)行成分 采血后，將含有PBMC的細(xì)胞組分在Ficoll上重疊離心，回收中間層的末梢血單核細(xì)胞 (PBMC)。(2)抗人CD3抗體和CH-296的固定化在T225燒瓶中添加含有最終濃度為5 μ g/mL的抗人CD3抗體和最終濃度為 15 μ g/mL的CH-296 (樂透露奈庫秦(注冊商標(biāo))，寶生物工程株式會社制)的磷酸緩沖 生理鹽水(PBS) 40mL或僅含有最終濃度為5 μ g/mL的抗人CD3抗體的PBS 40mL,然 后在4°C培養(yǎng)過夜。臨使用前從該培養(yǎng)器材吸引除去含有抗體、CH-296的PBS，然后用 PBS清洗2次，供各試驗(yàn)用。(3) CIK細(xì)胞的放大培養(yǎng)將實(shí)施例1-(2)中分離得到的PBMC 9 X IO8ceIls懸浮在含有0.2 %人血清白蛋 白、1000U/mL IFN- Y、300U/mL IL-2的60ml的GT-T503培養(yǎng)基(寶生物工程株式會社 制、以下記作“完全GT-T503培養(yǎng)基”)中，添加到實(shí)施例1_(2)中制作的4個(gè)抗CD3 抗體以及CH-296固定化T225燒瓶或4個(gè)抗CD3抗體固定化T225燒瓶中，在5% CO2 中在37°C下開始培養(yǎng)(培養(yǎng)第O天)。第1天(培養(yǎng)開始的次日)，向各燒瓶添加150mL的完全GT_^T503培養(yǎng)基，繼
續(xù)培養(yǎng)。第4天，將各燒瓶內(nèi)的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中全部收集，轉(zhuǎn)移到未固定化透氣性 培養(yǎng)袋CultiLife Eva (寶生物工程株式會社制)。此時(shí)，添加完全GT-T503培養(yǎng)基使每只 袋子為700mL，在5% CO2中在37°C下培養(yǎng)。第7天和第9天，向各袋子中添加完全GT-T503培養(yǎng)基400mL進(jìn)行繼代培養(yǎng)， 繼續(xù)培養(yǎng)至第14天。最終每只袋子的培養(yǎng)液為1500mL。計(jì)算培養(yǎng)最后一天的活細(xì)胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，算出放大培 養(yǎng)率。結(jié)果如表1所示。另外，用抗CD3抗體和CH-296刺激而增加的CIK細(xì)胞記為 R-CIKs,僅用抗CD3抗體刺激而增加的CIK細(xì)胞記為C-CIKs。表 權(quán)利要求
1.一種含有細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法，其特征在于，包括如下工 序在纖維連接蛋白片段的存在下，培養(yǎng)含有能分化為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的 細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，在含有選自VLA-4結(jié)合域、 VLA-5結(jié)合域以及肝素結(jié)合域中的區(qū)域的纖維連接蛋白片段的存在下，實(shí)施培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制造方法，其特征在于，在含有選自序列號1、2以及5的 氨基酸序列的纖維連接蛋白片段的存在下，實(shí)施培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，在CD3配體、干擾素-Y以及白 細(xì)胞介素-2的共同存在下，實(shí)施纖維連接蛋白片段存在下的培養(yǎng)。
5.—種含有細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群，其特征在于，通過權(quán)利要求1 4中任 一項(xiàng)所述的方法而得。
6.—種藥品，其特征在于，含有權(quán)利要求5所述的細(xì)胞群作為有效成分。
7.—種疾病的治療方法或預(yù)防方法，其特征在于，包括向?qū)ο蠼o予有效量的權(quán)利要 求5所述的細(xì)胞群的工序。
8.權(quán)利要求5所述細(xì)胞群在制備藥品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的制造方法，其中包括如下工序在纖維連接蛋白片段的存在下，培養(yǎng)含有能分化為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞群，其中含有通過上述方法而得的細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種藥品，其中含有上述細(xì)胞群作為有效成分。本發(fā)明還提供了所述細(xì)胞群在藥物制備上的應(yīng)用。
文檔編號C12N5/0783GK102027104SQ200980112912
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者于津浦, 任秀寶, 加藤郁之進(jìn), 安秀梅, 曹水, 李慧, 郝希山 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 寶生物工程株式會社