專利名稱：新的突變羥基苯基丙酮酸雙加氧酶，dna序列和耐受hppd抑制劑除草劑的植物分離的制作方法
新的突變羥基苯基丙酮酸雙加氧酶，DNA序列和耐受HPPD 抑制劑除草劑的植物分離 本發(fā)明涉及編碼突變的羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) (HPPD)的核酸序列、包含該序列作為編碼序列的嵌合基因以及其在獲得耐受 HPPD抑制劑除草劑的植物中的用途。羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD ；EC 1. 13. 11. 27)是一種酶，其催化酪氨酸降解 產(chǎn)物-對羥基苯基丙酮酸(HPP)轉化為植物中生育酚和質(zhì)體醌的前體-尿黑酸(HG)的反 m (Crouch 1卩等，1997;卩1"行狀等，2004)。生育酚起到膜相關抗氧化劑的作用。質(zhì)體醌 首先是PSII和細胞色素b6/f復合物之間的電子載體，然后是參與類胡蘿卜素生物合成的 八氫番茄紅素去飽和酶的氧化還原輔因子。大多數(shù)植物通過預苯氨酸(arrogenate)合成酪氨酸(Abou-Zeid等1995 ；Bonner 等，1995 ；Byng 等，1981 ；Connely 和 Conn 1986 ；Gaines 等，1982)。在這些植物中，HPP 僅 來自于酪氨酸降解。另一方面，在如酵母釀酒酵母(Sacharomycescerevisiae)或細菌大 腸桿菌(Escherichia coli)等生物體中，HPP是酪氨酸前體，由預苯酸脫氫酶(此后稱為 PDH)的作用合成，該酶將預苯酸轉化為HPP (Lingens等，1967 ；Sampathkumar和Morrisson 1982)。因此在這些生物體中，HPP的產(chǎn)生直接與芳香族氨基酸的生物合成途徑(莽草酸途 徑)而非酪氨酸降解途徑相關。抑制HPPD導致光合作用的解偶聯(lián)、輔助捕光色素缺乏，最重要的是，由于缺乏通 常由類胡蘿卜素提供的光保護作用，紫外線輻射和活性氧中間體導致葉綠素破壞(Norris 等1995)。對光合作用活性組織進行光漂白會導致生長抑制和植物死亡。一些抑制HPPD和與所述酶特異性結合以抑制HPP轉化為尿黑酸的分子已證實是 非常有效的選擇性除草劑。市場上最易買到的HPPD抑制劑除草劑屬于以下四個化學家族之一1)三酮類，例如，磺草酮(sulcotrione)(即2-[2_氯_4-(甲磺?；?苯甲酰 基]-1，3-環(huán)己二酮)、甲基磺草酮(mesotrione)(即2_[4_(甲磺?；?_2_硝基苯甲酰 基]-1，3-環(huán)己二酮)、特波三酮(tembotrione)(即2_[2_氯_4_(甲磺?；?-3-[ (2，2， 2-三-氟乙氧基)甲基]苯甲?；鵠-1，3-環(huán)己二酮)；2) 二酮腈(diketonitrile)類，例如，2_氰基_3_環(huán)丙基(2_甲磺?；鵢4_三 氟甲基苯基)-丙烷-1，3- 二酮和2-氰基-1- [4-(甲磺?；?-2-三氟甲基苯基]-3- (1-甲 基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮；3)異噁唑類，例如，異噁氟草(isoxaflutole)(即5_環(huán)丙基_4_異噁唑基[2_(甲 磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮)。在植物中，異噁氟草在DKN中快速代謝，后者是一 種表現(xiàn)出HPPD抑制劑性質(zhì)的二酮腈化合物；以及4)吡唑特(pyrazolinate)類，例如，苯吡唑草酮(topramezone)(即[3_(4，5_ 二 氫-3-異噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羥基-1-甲基-IH-吡唑-4-基)甲 酮)和吡拉塞佛托(pyrasulfotole) (5-羥基-1，3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三 氟甲基苯基)甲酮)。
這些HPPD抑制除草劑可用于表現(xiàn)出代謝耐受性的作物如玉米(Zeamays)中的 草和/或闊葉雜草，這些除草劑在其中可快速降解(Schulz等，1993 ；Mitchell等，2001 ； Garcia等，2000 ；Pallett等，2001)。為了拓展這些HPPD抑制除草劑的范圍，已作出努力 以賦予植物，尤其是不具有或具有未充分發(fā)揮的代謝耐受性的植物對它們的農(nóng)業(yè)水平耐受性。
除試圖繞過HPPD介導的尿黑酸產(chǎn)生(US 6，812，010)夕卜，已進行了該敏感酶的過 表達以在植物中產(chǎn)生大量對除草劑充足的靶酶(W096/38567)。HPPD的過表達引起了對異 噁氟草(IFT)的二酮腈衍生物(DKN)更好的萌發(fā)前耐受性，但該耐受性不足以作為萌發(fā)后 處理的耐受性(Matringe等，2005)。另一種策略是對HPPD進行突變以獲得相對突變前的天然HPPD對HPPD抑制劑敏 感性較低的靶酶，而同時保留其催化HPPD轉化為尿黑酸的性質(zhì)。該策略已成功應用于生產(chǎn)耐受兩種屬于二酮腈家族的HPPD抑制除草劑(W0 99/24585) 2-氰基-3-環(huán)丙基-1- (2-甲磺?；?4-三氟甲苯基)-丙烷-1，3- 二酮和 2_氰基-l-[4-甲磺?；?2-三氟甲苯基]-3-(l-甲基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮的植物 (ΕΡ496630)。鑒定 Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Il、特別是 Gly336Trp (突變氨基酸的位 置根據(jù)SEQ ID NO 2的假單胞菌(PseUdomonas)HPPD標出)是引起對二酮腈除草劑萌發(fā)前 處理耐受性增強但并不造成酶活性改變的突變。最近，已證實將假單胞菌HPPD基因?qū)霟煵莺痛蠖沟馁|(zhì)體基因組遠比核轉化有 效，賦予對異噁氟草的萌發(fā)后使用相同的耐受性(Dufourmantel等，2007)。在WO 04/024928中，發(fā)明人設法通過增強HPP前體進入植物細胞的流量來增強植 物細胞中異戊烯苯醌的生物合成(例如，質(zhì)體醌和生育酚的合成)。這通過過表達PDH酶將 所述前體的合成與“莽草酸”途徑進行連接而完成。他們還注意到，用編碼PDH酶的基因轉 化植物有可能增強所述植物對HPPD抑制劑的耐受性。盡管對二酮腈除草劑表現(xiàn)出耐受性的植物的開發(fā)已經(jīng)獲得了這些成功，仍然有必 要開發(fā)和/或改進對HPPD抑制劑的耐受性系統(tǒng)，特別是對屬于三酮類(例如，磺草酮、甲基 磺草酮和特波三酮)和吡唑特類(例如，苯吡唑草酮和吡拉塞佛托)的HPPD抑制劑。因此，本發(fā)明涉及新的突變HPPD酶，其保留催化對羥基苯基丙酮酸(HPP)轉化為 尿黑酸的性質(zhì)，且對HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，其特征在于它們在SEQ ID NO :2所示假單胞菌HPPD的第336位(天然HPPD中為氨基酸甘氨酸)包含一個選自 以下突變的突變Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、 Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu 和 Gly336Asp。在一個具體的實施方式中，SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD在第336位的突變 選自以下突變Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val，條件是突變的HPPD不是雙重突變體Gly334Ala_Gly336Arg (位置根據(jù)SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD給出)。在一個更具體的實施方式中，SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD在第336位的突變 選自以下突變Gly336His、Gly336Met、Gly336Cys 和 Gly336Phe。在另一個具體的實施方式中，HPPD酶來自植物，特別是來自擬南芥(Arabidopsis thai iana), SEQ ID NO :4所示擬南芥HPPD的氨基酸序列在第422位(即SEQ ID NO :2的假
5單胞菌HPPD的第336位)的甘氨酸包含一個選自以下突變的突變Gly336Arg、Gly336His、 Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu 和 Gly336Asp。在一個更具體的實施方式中，SEQ ID NO 4所示擬南芥HPPD在第422位(即SEQ ID NO 2的假單胞菌HPPD的第336位)的突變選自以下突變Gly336His、Gly336Asn、 Gly336Cys和Gly336Val，且突變的HPPD來自植物，特別是來自擬南芥。應注意，SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336位是SEQ ID NO 4所示擬南芥HPPD的第422位。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的突變HPPD對異噁唑類、二酮腈類、三酮類、吡 唑特類的HPPD抑制劑除草劑的敏感性低于原始的未突變HPPD。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的突變HPPD對選自以下的HPPD抑制劑除草 劑的敏感性低于原始的未突變HPPD 異噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、磺草酮、吡拉塞佛 托、苯吡唑草酮、2-氰基-3-環(huán)丙基-l-(2-S02CH3-4-CF3苯基)-丙烷-1，3- 二酮和2-氰 基-3-環(huán)丙基-1-(2-S02CH3-4-2, 3C12 苯基)丙烷-1，3- 二酮。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明的突變HPPD對以下HPPD抑制劑的敏感性低 于原始的未突變HPPD 三酮類(稱為三酮HPPD抑制劑)，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草 酮，特別是特波三酮，或吡唑特類(稱為吡唑特HPPD抑制劑)，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明的突變HPPD對選自特波三酮、磺草酮和甲基 磺草酮，特別是特波三酮的三酮HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD。在另一個具體的實施方式中，除SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336位的氨 基酸甘氨酸上的第一突變外，本發(fā)明的突變HPPD還包含第二突變。在一個更具體的實施方式中，第二突變氨基酸選自以下SEQ ID NO 2所示假單胞 菌 HPPD 序列的氨基酸Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334 和 Asn337。本發(fā)明還提供突變的HPPD酶，其保留催化對羥基苯基丙酮酸(HPP)轉化為尿黑酸 的性質(zhì)，且對以下HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD 三酮類，如特波三酮、磺草 酮和甲基磺草酮，或吡唑特類，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于它們在SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD第336位的氨基酸甘氨酸包含突變，以及提供使用這樣的酶使植物對 這些HPPD抑制劑具有耐受性，即，將三酮類或吡唑特類除草劑施用于表達這樣突變體酶的 植物的，而植物通過在其基因組中包含編碼在SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336位 突變的某些HPPD酶的基因而對這樣的三酮類或吡唑特類HPPD抑制劑具有耐受性的過程。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，突變的HPPD酶對三酮類如特波三酮、磺草酮 和甲基磺草酮的HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，突變根據(jù)選自以下突變 的突變，發(fā)生在SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336位Gly336Arg、Gly336Asp、 Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，突變的HPPD酶對三酮類如特波三酮、磺草酮和 甲基磺草酮的HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，突變根據(jù)選自以下突變的突 變，發(fā)生在 SEQ ID NO 2 所示假單胞菌 HPPD 的第 336 位Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336CySo現(xiàn)有技術已對若干HPPD及其初級序列進行了描述，特別是以下HPPD 如假單胞菌等細菌(Ruetschi 等，Eur. J. Biochem.，205，459-466，1992，W096/38567)、如擬南芥(W0 96/38567，Genebank AF047834)、胡蘿卜(W0 96/38567，Genebank 87257)、燕麥(Avena sativa)(W0 02/046387)、小麥(W0 02/046387)、臂形草(Brachiaria platyphylla) (W0 02/046387)、蒺藜草(Cenchrusechinatus) (W0 02/046387)、剛性黑麥草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、葦狀羊茅(Festuca arundinacea) (W0 02/046387)、大狗尾草 (Setariafaberi) (W0 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)和高粱 (W002/046387)等植物、球孢子菌(Coccicoides) (Genebank C0ITRP)或如小鼠或豬等哺乳 動物的。顯示的參考文獻中公開的相應序列通過引用納入本文。通過比對這些已知序列，采用本領域的慣例手段，例如，Thompson, J. D.等描述的 方法(CLUSTAL W:“通過序列加權、位點特異性空位罰分和加權矩陣選擇來提高漸進的多 序列比對的敏感性”(improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. )Nucleic Acids Research, 22 ；4673-4680，1994)，進入這些通過互 聯(lián)網(wǎng)可獲得的序列比對的計算機程序，技術人員能夠確定與參比序列的序列同源性并找到 關鍵氨基酸或確定共有區(qū)域。以本發(fā)明為例，參比序列是假單胞菌序列，除非特別說明，對具體氨基酸位置的定 義和說明所有均根據(jù)SEQ ID NO :2所示初級假單胞菌HPPD序列作出。附

圖1顯示現(xiàn)有技 術中描述的若干HPPD序列的比對；這些序列的比對以假單胞菌HPPD序列作為參比序列， 包括以下 HPPD 序列阿維鏈霉菌(Str印tomycesavermitilis) (Genebank SAV 11864)、胡 蘿卜(Daucus carota) (Genebank DCU87257)、擬南芥(Genebank AF047834)、玉米、大麥 (Hordeum vulgare) (GenebankHVAJ693)、小麥葉枯病菌(Mycosphaerella graminicola) (Genebank AF038152)、粗球孢子菌(Coccicoides immitis) (Genebank C0ITRP)和小鼠 (Musmusculus) (Genebank MU54HD)。該圖提供假單胞菌序列的氨基酸編號，還有這些序列 共有的氨基酸，其中這些氨基酸由星號表示。根據(jù)這樣的比對，從假單胞菌氨基酸的位置和 性質(zhì)的定義不難鑒定另一個HPPD序列中的相應氨基酸的位置。圖1顯示可通過比對不同 植物、哺乳動物和細菌來源的序列做到這點，表明技術人員熟知的該比對方法通用于任何 其它序列。專利申請WO 97/49816中也描述了不同HPPD序列的比對。在W099/24585中，對假單胞菌HPPD單體三級結構的分析顯示HPPD的C末端部分 存在，其是酶的活性位點所在，通過保證酶穩(wěn)定性及其寡聚化(假單胞菌HPPD是四聚體，植 物HPPD是二聚體)的連接肽與其N末端部分連接。該結構由研究晶體X光衍射的常規(guī)方 法獲得。連接肽可能確定酶C末端部分的N末端，其中以假單胞菌為例，所述連接肽位于第 145位和第157位的氨基酸之間(參見圖1)。在附圖1所示的序列比對中顯示的所有序列 中均會注意到假單胞菌序列中位于第161位和第162位的兩個氨基酸(D = Aspl61, H = Hisl62)。根據(jù)假單胞菌HPPD，由此可能確定連接肽位于氨基酸Aspl61上游約5到15個氨 基酸之間。根據(jù)本發(fā)明，應理解“突變的HPPD”為HPPD初級序列的至少一個氨基酸被另一個 氨基酸取代。表述“突變氨基酸”以下用于表示被另一個氨基酸取代的氨基酸，從而表示蛋 白質(zhì)初級序列中的突變位點。根據(jù)本發(fā)明，突變發(fā)生在SEQ ID NO 2所示假單胞菌序列第336位的氨基酸甘氨酸上，其幾乎是所有已鑒定的HPPD序列共有的。在至今已知的240個HPPD序列中，有238 個在第336位包含甘氨酸，僅有聚球菌屬(Synechococcussp. )JA-3-3Ab (Acc-No Q2JX04) 和聚球菌屬JA-2-3B' a(2-13) (Acc-No Q2JPN8)的HPPD序列在該位置上是丙氨酸。Gly336 是發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)HPPD序列的共有序列“Gly-Phe-Gly-X-Gly-Asn-Phe”的一部分，其中在各 種來源的HPPD中，X可以是20種氨基酸中的任何一種，這可能通過序列比對方法鑒定任何 來源HPPD中的Gly336而沒有任何困難。作為例子，假單胞菌序列的Gly336是SEQ ID NO :4所示擬南芥序列的Gly422 (見 圖1)，但本文提到的Gly是SEQ ID NO :2所示假單胞菌序列的參比位置第336位的Gly (除 非特別說明)，即使本發(fā)明的突變可發(fā)生在任何有用的HPPD酶中而并非必然在假單胞菌 HPPD 中。HPPD的酶活性可通過任何方法測定，從而能測定HPP或O2底物量的減少、或測 定任何來源于酶反應的產(chǎn)物即尿黑酸或CO2的積累。特別是，HPPD活性可通過Garcia等 (1997)或Garcia等(1999)中描述的方法測定，二者通過引用納入本文。根據(jù)本發(fā)明，三酮類的HPPD抑制劑(或三酮HPPD抑制劑)指具有三酮骨架的HPPD 抑制劑。這樣的三酮HPPD抑制劑的一個例子是磺草酮(即2-[2_氯-4-(甲磺?；?苯甲 酰基]-1，3-環(huán)己二酮)、甲基磺草酮(即2- [4-(甲磺?；?-2-硝基苯甲酰基]-1，3-環(huán)己 二酮)和特波三酮(即2-[2_氯-4-(甲磺酰基)-3-[2，2，2_三-氟乙氧基甲基]苯甲酰 基]-1，3-環(huán)己二酮)。根據(jù)本發(fā)明，吡唑特類的HPPD抑制劑(或吡唑特HPPD抑制劑)指具有吡唑基的 HPPD抑制劑。這樣的吡唑特HPPD抑制劑的一個例子是苯吡唑草酮(即[3-(4，5_二氫-3-異 噁唑基)-2_甲基-4-(甲磺?；?苯基](5-羥基-1-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮)和吡 拉塞佛托[(5-羥基-1，3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三氟甲苯基)甲酮)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，除Gly336的突變外，HPPD在第二氨基酸位置也發(fā) 生了突變。該第二突變的存在可進一步增強對與第一突變賦予耐受性的同一 HPPD抑制劑 除草劑的耐受性，或可賦予對另一 HPPD抑制劑除草劑的耐受性。WO 99/24585描述了這些 突變賦予對HPPD抑制劑特別是對二酮腈類和異噁唑類的耐受性的例子。在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，第二突變的氨基酸選自以下SEQID NO :2所 示假單胞菌序列的參比氨基酸Pro215、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337，以及假單胞菌 序列中的Gly298(最后這個氨基酸在其它HPPD中沒有對應物，見圖1)。在本發(fā)明的一個實施方式中，第二突變的氨基酸是SEQ ID NO :2所示假單胞菌序 列的Pro215，該突變特別是Pro215Leu。本發(fā)明也涉及一種核酸序列，特別是分離的DNA，其編碼如上所述的突變的HPPD。本發(fā)明也涉及一種編碼突變的HPPD酶的核酸序列，其中突變的HPPD酶保留催化 對羥基苯基丙酮酸(HPP)轉化為尿黑酸的性質(zhì)，且對以下HPPD抑制劑的敏感性低于原始的 未突變HPPD 三酮類，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特類，如吡拉塞佛托和苯 吡唑草酮，其特征在于其在SEQ IDNO 2所示假單胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸包含 突變。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明的核酸序列編碼突變的HPPD酶，其對三酮 類的HPPD抑制劑如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的敏感性低于原始的未突變HPPD，且其中HPPD根據(jù)選自以下的突變，在SEQ ID NO :2所示假單胞菌HPPD的第336位發(fā)生突 變:Gly336Arg, Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、 Gly336Asn、Gly336Cys和 Gly336VaL·在一個更為具體的實施方式中，本發(fā)明的核酸序列編碼突變的HPPD酶，其對三酮 類的HPPD抑制劑如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的敏感性低于原始的未突變HPPD，且其 中HPPD根據(jù)選自以下的突變，在SEQ ID NO :2所示假單胞菌HPPD的第336位發(fā)生突變 Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336Cys。根據(jù)本發(fā)明，“核酸序列”應理解為DNA或RNA型的核苷酸序列，優(yōu)選DNA型，特別 是雙鏈，無論是天然或合成來源，特別是其中編碼本發(fā)明突變HPPD的密碼子已根據(jù)要在其 中表達的宿主生物體進行了優(yōu)化(例如，通過采用相比原始宿主在該宿主生物體或該宿主 生物體所屬組的密碼子使用表中更優(yōu)選或最優(yōu)選的密碼子進行密碼子取代)，這些優(yōu)化方 法為本領域技術人員所熟知。本文使用的“分離的DNA ”指非天然產(chǎn)生或不再存在于其原始存在的天然環(huán)境中的 DNA，例如，嵌合基因中與其它調(diào)控元件相關的DNA編碼序列、轉移到另一個宿主細胞如植 物細胞中的DNA、或相比任何已知天然產(chǎn)生的DNA具有不同核苷酸序列的人工合成的DNA。編碼根據(jù)本發(fā)明將發(fā)生突變的原始未突變HPPD的序列可來自任何來源。其特 別可來自細菌來源。有利例子是假單胞菌屬的細菌，例如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，(Synechocystis) MWMi^ (cyanobacteria) 。Μ ；!5歹自 植物來源，特別是來自雙子葉植物、傘狀花科植物或單子葉植物。有利例子是植物，如煙草、 擬南芥、胡蘿卜、玉米、小麥、大麥、燕麥、小麥、臂形草、蒺藜草、剛性黑麥草、葦狀羊茅、大狗 尾草、牛筋草和高粱。之前引用的參考文獻中描述了所述編碼序列以及分離和克隆所述編 碼序列的方法，這些參考文獻的內(nèi)容通過引用納入本文。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所述HPPD來自細菌來源，特別是來自假單胞菌 屬，更特別的是來自熒光假單胞菌，或來自植物來源，特別是來自擬南芥。為本發(fā)明目的而突變的HPPD可為任何天然產(chǎn)生的HPPD，或其任何活性片段或其 任何變體，其中一些氨基酸(1-10個氨基酸)為克隆目的而被取代、添加或缺失，以形成轉 運肽融合等，其保留HPPD活性，即催化對羥基苯基丙酮酸轉化為尿黑酸的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，所述HPPD可為嵌合HPPD。術語“嵌合HPPD”是表示包含來自各種 HPPD的元件的HPPD。專利申請WO 99/24586中特別描述了這樣的嵌合HPPD。所述突變可發(fā)生在編碼原始的未突變HPPD的核酸序列中，可采用任何適當?shù)氖?段在所述序列中以對應于用于取代的氨基酸的密碼子取代編碼突變氨基酸的密碼子，其中 所述密碼子在文獻中有廣泛描述，且為本領域技術人員熟知。若干分子生物學方法可用于獲得該突變。—種制備本發(fā)明突變核酸序列和相應蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法，包括在編碼一個或多個 預先選擇的氨基酸的密碼子上實施定點突變，包括SEQ ID NO: 2所示假單胞菌HPPD序列 的參比位置Gly336的密碼子。獲得這些定點突變的方法為本領域技術人員熟知，在文獻中 有廣泛描述(特別是在《定點突變一種實用方法》(Directed Mutagenesis =A Practical Approach)，1991,Μ. J. McPHERSON編，IRL出版社)，或為可能運用商業(yè)試劑盒的方法(例如 法瑪西亞公司(PHARMACIA)的U. S. Ε.突變試劑盒)。定點突變后，通過采用適當?shù)暮Y選輔助方法，選擇包含對HPPD抑制劑具有較低敏感性的突變HPPD的細胞是有用的。一種易于 實施的篩選方法是測定完全抑制原始的未突變HPPD且對表達該未突變HPPD的細胞致死的 HPPD抑制劑的劑量，并對突變細胞施加該預定劑量，然后分離耐受該致死劑量的突變細胞， 接著分離并克隆編碼該突變HPPD的基因?；诒景l(fā)明一個具體的實施方式和廣泛流行的 解決方法，即對三酮或吡唑特HPPD抑制劑具有較低敏感性的HPPD，可如上所述進行篩選， 采用三酮或吡唑特HPPD抑制劑，特別是選自特波三酮、甲基磺草酮、吡拉塞佛托、苯吡唑草 酮和磺草酮的HPPD抑制劑。基于本發(fā)明的另一個實施方式，即除SEQ ID NO :2所示假單胞菌HPPD序列的第 336位的參比氨基酸上的第一突變外，在第二氨基酸上又發(fā)生突變的HPPD，可通過與第一 突變同時或相繼進行定點突變獲得第二突變。作為上述定點突變的替代方法，可采用與適當篩選輔助方法相關的隨機突變方法 (如EMS或輻射處理)獲得第二突變。這樣的突變方法為本領域技術人員熟知，在文獻中有 充分描述(特別是Sambrook等，1989)?？扇缟纤鰧嵤┖Y選方法。本文中通用的術語“包含”某個序列X的DNA或蛋白質(zhì)指至少包括或包含序列X的 DNA或蛋白質(zhì)，以使其它核苷酸或氨基酸序列可包括于5'(或N末端)和/或3'(或C 末端)端，例如，選擇性標記蛋白質(zhì)(的核苷酸序列)、轉運肽(的核苷酸序列)和/或5' 前導序列或3'尾隨序列。類似地，本申請全文和權利要求書中使用的術語“包含”應理解 為意指包括所述的整數(shù)或步驟或一組整數(shù)或步驟，而不排除任何其它整數(shù)或步驟或其它組 整數(shù)或步驟。因此本發(fā)明也涉及一種制備編碼本發(fā)明突變HPPD的核酸序列的方法，所述方法 如上定義。本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明突變HPPD的核酸作為標記基因或可能賦予植物對HPPD 抑制劑除草劑耐受性的編碼序列在轉化植物方法中的用途，以及HPPD抑制劑在包含編碼 本發(fā)明突變HPPD的核酸序列的植物上的用途。在本發(fā)明的一個實施方式中，在這樣的用途 中，HPPD抑制劑為三酮類或吡唑特類，優(yōu)選特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。當然應理解， 該序列也可與其它(另一)基因標記和/或編碼一個或多個具有有用農(nóng)業(yè)性質(zhì)的蛋白質(zhì)的 序列結合使用。在編碼賦予轉化植物有用農(nóng)藝性質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因中有編碼賦予對某些除草劑 耐受性、賦予對某些昆蟲耐受性、賦予對某些疾病耐受性等的蛋白質(zhì)的DNA序列。專利申 請TO91/02071和W095/06128特別描述了這樣的基因。在編碼賦予轉化植物細胞和植物 對某些除草劑耐受性的DNA序列中有賦予對草丁膦除草劑耐受性的bar基因、編碼賦予 對具有EPSPS靶的除草劑如草甘膦及其鹽的耐受性的合適EPSPS的基因(US 4，535，060、 US4, 769，061、US 5，094，945、US 4，940，835、US 5，188，642、US 4，971，908、US5，145,783、 US 5, 310, 667,US 5, 312, 910,US 5, 627, 06UUS 5，633，435)、編碼草甘膦氧化還原酶的基 因(US 5，463，175)。在編碼賦予對具有EPSPS靶的除草劑耐受性的合適EPSPS的DNA序列中，特別有 編碼植物EPSPS，特別是玉米EPSPS的基因，其具有102和106兩個突變，在專利申請FR 2736926中有描述，此后稱為EPSPS雙突變體，或編碼從農(nóng)桿菌分離的EPSPS的基因，由美國 專利5，633，435的序列ID No. 2和序列ID No. 3描述，此后稱為CP4。
在編碼EPSPS、更特別是編碼以上基因的DNA序列的情況中，編碼這些酶的序列之 前最好存在編碼轉運肽的序列，特別是美國專利5，510，471或5，633，448描述的編碼“優(yōu)化 轉運肽”的序列。在編碼賦予對昆蟲耐受性的新性質(zhì)的感興趣蛋白質(zhì)的DNA序列中，更特別有文獻 中廣泛描述且為本領域技術人員熟知的Bt蛋白質(zhì)。還有從細菌如發(fā)光桿菌(W0 97/17432 和TO 98/08932)中提取的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及一種嵌合基因(或表達盒)，在5’和/或3’位置，至少在5’位置 包含編碼序列以及異源調(diào)控元件，它們能夠在宿主生物體特別是植物細胞或植物中發(fā)揮作 用，其中編碼序列包含至少一個如前定義的編碼突變HPPD的核酸序列。因此本發(fā)明涉及一種嵌合基因(或表達盒)，在5’和/或3’位置，至少在5’位置 包含編碼序列以及異源調(diào)控元件，它們能夠在宿主生物體特別是植物細胞或植物中發(fā)揮作 用，其中編碼序列包含至少一個如前定義的核酸序列。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種如前所述的嵌合基因，其中宿主生物 體選自細菌、酵母、畢赤酵母(Pichia)、真菌、桿狀病毒、植物細胞和植物。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種如前所述的嵌合基因，其中該嵌合 基因在編碼突變HPPD核酸序列的5’位置包含編碼植物轉運肽的核酸序列，其中該序列位 于啟動子區(qū)域和編碼突變HPPD的序列之間，以允許轉運肽/突變HPPD融合蛋白的表達。作為植物細胞和植物中的啟動子調(diào)控序列，可使用植物中天然表達的基因的任何 啟動子序列，特別是特別在植物葉子中表達的啟動子，例如，細菌、病毒或植物來源的“組成 型”啟動子，或“光依賴型”啟動子，如植物核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亞基基 因的啟動子，或任何合適的已知可使用的啟動子。在植物來源的啟動子中，可提到如專利申 請EP 0507698所述的組蛋白啟動子，或水稻肌動蛋白啟動子(US 5，641，876)。在植物病 毒基因的啟動子中，有花椰菜花葉病毒(CAMV 19S或35S)的啟動子，或環(huán)病毒啟動子(AU 689311)。也可使用植物特定區(qū)域或組織的特異性調(diào)控啟動子序列，如種子特異性啟動子 (Datla，R.等，1997)，特別是napin啟動子(EP 255378)、菜豆蛋白(phaseolin)啟動子、麥 谷蛋白(glutenin)啟動子、向日葵蛋白(helianthinin)啟動子(TO 92/17580)、白蛋白啟 動子(W0 98/45460)、油質(zhì)蛋白(oleosin)啟動子(W0 98/45461)、SATl 啟動子或 SAT3 啟 動子(PCT/US98/06978)。誘導型啟動子也宜選自苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA還原酶(HMG)、幾丁質(zhì) 酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制劑(PI)、PRl家族基因、胭脂堿合成酶(nos)和VspB啟動子(US 5670349，表3)、HMG2啟動子(US 5670349)、蘋果β -半乳糖苷酶(ABGl)啟動子或蘋果氨 基環(huán)丙烷羧酸合成酶(ACC合成酶)啟動子(W0 98/45445)。根據(jù)本發(fā)明，可聯(lián)用啟動子與位于啟動子和編碼序列之間的其它調(diào)控序列，如轉 錄激活劑(“增強子”)，例如專利申請WO 87/07644描述的煙草花葉病毒(TMV)的翻譯激 活劑，或Carrington和Freed 1990描述的煙草蝕紋病毒(TEV)，例如，或內(nèi)含子，如玉米的 adhl內(nèi)含子或水稻肌動蛋白的內(nèi)含子1。作為調(diào)控終止子或多聚腺苷酸化序列，可使用細菌來源的任何相應序列，如例如 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos終止子，病毒來源的相應序列，如CaMV35S終止子，或植物來源的相應序列，如例如專利申請EP 0633317描述的組蛋白終止子。“宿主生物體”應理解為可為產(chǎn)生突變HPPD而將本發(fā)明嵌合基因引入其中的 任何單細胞或多細胞生物。這些生物，特別是細菌例如大腸桿菌、酵母特別是釀酒酵母 屬(Saccharomyces)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬、真菌特別是曲霉 (Aspergi 1 Ius)、桿狀病毒或優(yōu)選植物細胞和植物。根據(jù)本發(fā)明，“植物細胞”應理解為來自或發(fā)現(xiàn)于植物的任何細胞，其能夠形成以 下或為其一部分未分化組織如愈傷組織、分化組織如胚胎、植物的組成部分、植物或種子。根據(jù)本發(fā)明，“植物”應理解為能夠進行光合作用的任何分化的多細胞生物，特 別是單子葉或雙子葉生物，更特別地為用于或非用于動物或人營養(yǎng)的栽培植物，如玉米、 小麥、蕓苔屬(Brassica)植物如甘藍型油菜(Brassicanapus)或芥菜型油菜(Brassica jimcea)、大豆、水稻、甘蔗、甜菜根、煙草、棉花、蔬菜植物如黃瓜、韭菜、胡蘿卜、番茄、萵苣、 胡椒、甜瓜、西瓜等。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及植物的轉化。在植物中天然表達的基因的任何啟 動子序列，或在植物中天然表達的基因的任何雜合或組合的啟動子元件，包括農(nóng)桿菌或植 物病毒啟動子，或適合控制除草劑耐受性基因轉錄的任何啟動子均可用作本發(fā)明植物中的 啟動子調(diào)控序列。以上描述了這樣合適的啟動子的例子。根據(jù)本發(fā)明，也可能聯(lián)用啟動子調(diào)控序列與其它位于啟動子和編碼序列之間的調(diào) 控序列，如內(nèi)含子序列，或轉錄激活劑(增強子)。以上描述了這樣合適的調(diào)控序列的例子。細菌來源的任何相應序列，如根癌農(nóng)桿菌的nos終止子，或植物來源的任何相應 序列，如專利申請EP 0 633 317描述的組蛋白終止子，均可用作轉錄終止(和多聚腺苷酸 化)調(diào)控元件。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，在編碼突變HPPD的核酸序列的5’采用編碼轉 運肽的核酸序列，其中該轉運肽序列位于啟動子區(qū)域和編碼突變HPPD的序列之間，以允許 轉運肽/突變HPPD融合蛋白的表達，其中所述突變HPPD如前所述。轉運肽可能引導突變 的HPPD進入質(zhì)體，更具體說是葉綠體，突變HPPD進入質(zhì)體時在轉運肽和突變HPPD之間切 割融合蛋白。所述轉運肽可為單個肽，如EPSPS轉運肽(美國專利5，188，642描述的)或植 物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亞基(RuBisCO ssu)的轉運肽，適當時包括成熟RuBisCO ssu 的N末端部分的幾個氨基酸(EP 189 707)，或可為若干轉運肽的融合如包含與具有質(zhì)體位 置的成熟蛋白質(zhì)N末端序列的一部分融合的第一植物轉運肽的轉運肽，其中該部分又與如 專利EP 508 909描述的第二植物轉運肽融合，更具體地說，包含與玉米RuBisCO ssu N末 端的22個氨基酸融合的向日葵RuBisCO ssu的轉運肽的優(yōu)化轉運肽又與專利EP 508 909 描述其編碼序列的玉米RuBisCO ssu的轉運肽融合。本發(fā)明也涉及所述轉運肽/突變HPPD融合蛋白和編碼這樣融合蛋白的核酸或植 物可表達的嵌合基因，其中該融合蛋白的兩個元件如上所述。本發(fā)明也涉及轉化宿主生物體的克隆和/或表達載體，該載體包含至少一個如上 所述的嵌合基因。除以上嵌合基因外，該載體還包含至少一個復制起點。該載體可為通過引 入本發(fā)明嵌合基因已被轉化的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒。這樣的轉化載體依賴于轉化的宿 主生物體，為本領域技術人員熟知，在文獻中有廣泛描述。使用的轉化載體特別是轉化植物 細胞或植物的載體可為病毒，可用于轉化發(fā)育的植物，還包含其本身的復制和表達元件。根據(jù)本發(fā)明，轉化植物細胞或植物的載體優(yōu)選為質(zhì)粒，如卸甲的(disarmed)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒。本發(fā)明也涉及所述宿主生物體，特別是植物細胞或植物，其是轉化的，且包含如上 定義的含有編碼突變HPPD序列的嵌合基因，以及本發(fā)明的植物用于田地生產(chǎn)作物并收獲 植物產(chǎn)品例如大豆或玉米谷物的用途，其中在一個實施方式中，所述用途包括將HPPD抑制 劑除草劑用于這樣的植物以控制雜草。在本發(fā)明的一個實施方式中，在這樣的使用中，所述 HPPD抑制劑為三酮類或吡唑特類，優(yōu)選特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特別是特波三酮。因此，本發(fā)明涉及一種宿主生物體，特別是植物細胞或植物，其特征在于包含至少 一個如上所述的嵌合基因，或至少一個如上所述的核酸序列。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼突變HPPD酶的核酸序列，其中突變的HPPD酶保留催化對羥基苯基丙酮酸 (HPP)轉化為尿黑酸的性質(zhì)，且對HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，其特征在 于其在SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336位(天然HPPD中為氨基酸甘氨酸)包 含選自以下的突變Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys 和Gly336Val，條件是突變的HPPD不是雙重突變體Gly334Ala_Gly336Arg (位置根據(jù)SEQ IDNO 2所示假單胞菌HPPD給出)。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼如上所述的突變HPPD的核酸序列，其中SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的 第336位的突變選自以下突變Gly336His、Gly336Met、Gly336Cys和Gly336Phe,特別是 Gly336His0在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼突變HPPD的核酸序列，其中突變的HPPD保留催化對羥基苯基丙酮酸(HPP) 轉化為尿黑酸的性質(zhì)，且對HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，其中所述HPPD酶 來自植物，特別是來自擬南芥，并且在SEQ ID NO :4所示擬南芥HPPD的氨基酸序列第422 位(即SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的氨基酸序列的第336位)的甘氨酸上包含一個 選自以下的突變Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、 Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu 和 Gly336Asp。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336 位的突變選自以下突變Gly336His、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val，所述突變HPPD是 植物來源，特別是擬南芥。應注意，SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336位是SEQ ID NO 4所示擬南芥HPPD的第422位。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含至 少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中本發(fā)明的突變HPPD對異噁唑類、二酮腈類、三 酮類或吡唑特類的HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中所述突變HPPD對選自以下的HPPD抑制劑的 敏感性低于原始的未突變HPPD 異噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、磺草酮、吡拉塞佛托、苯 吡唑草酮、2-氰基-3-環(huán)丙基-1- (2-S02CH3-4-CF3苯基)-丙烷_1，3- 二酮和2-氰基-3-環(huán) 丙基-1-(2-S02CH3-4-2, 3C12 苯基)丙烷-1，3- 二酮。
在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中所述突變HPPD對選自以下的HPPD抑制劑的 敏感性低于原始的未突變HPPD 三酮類，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，特別是特波三 酮，或吡唑特類，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含至 少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中所述突變HPPD對選自特波三酮、磺草酮或甲基 磺草酮，特別是特波三酮的三酮HPPD抑制劑的敏感性較低。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中除SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的第336 位氨基酸甘氨酸上的第一突變外，本發(fā)明的突變HPPD還包含第二突變。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼上述突變HPPD的核酸序列，其中所述第二突變氨基酸選自以下氨基酸SEQ ID NO 2 所示假單胞菌 HPPD 序列的 Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334 和 Asn337。本發(fā)明還涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含至少一個編碼突變HPPD酶 的核酸序列，其中突變的HPPD酶保留催化對羥基苯基丙酮酸(HPP)轉化為尿黑酸的性質(zhì)， 且對選自以下HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD 三酮類，如特波三酮、磺草酮 和甲基磺草酮，或吡唑特類，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于SEQ ID N0:2所示假 單胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸包含突變。在一個更具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個編碼突變HPPD酶的核酸序列，其中突變的HPPD酶對三酮類或吡唑特類的HPPD 抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，根據(jù)選自以下的突變，HPPD在SEQ ID NO :2所 示假單胞菌 HPPD 的第 336 位發(fā)生突變:Gly336Arg, Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、 Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及一種植物細胞或植物，其特征在于包含 至少一個上述核酸序列，還有在植物中發(fā)揮作用的基因，從而允許PDH(預苯酸脫氫酶)酶 過表達。本發(fā)明也涉及包含轉化細胞的植物，特別是從轉化細胞再生的植物。再生可通 過適當?shù)姆椒ǐ@得，例如以上參考文獻所述，其中所述方法依賴于物種的性質(zhì)?？梢?以下專利和專利申請，特別是關于轉化植物細胞和植物再生的方法us 4，459，355、US 4，536，475、US 5，464，763、US 5，177，010、US 5，187，073、EP 267，159、EP 604 662、EP 672 752、US 4，945，050、US 5，036，006、US 5，100，792、US 5，371，014、US 5，478，744、US 5, 179, 022,US 5, 565, 346,US 5, 484, 956,US 5, 508, 468,US 5, 538, 877,US 5, 554, 798,US 5, 489, 520,US 5, 510, 318,US 5, 204, 253,US 5, 405, 765,EP 442 174,EP 486 233,EP 486 234、EP 539 563、EP 674 725、WO 91/02071和 WO 95/06128。本發(fā)明也涉及轉化植物或其部分，其通過栽培和/或雜交以上再生植物得到，還 涉及轉化植物的種子。本發(fā)明也涉及從本發(fā)明的植物、其部分或種子獲得的終產(chǎn)物如粗碾谷物或油。根據(jù)本發(fā)明可獲得的轉化植物可為單子葉型，如谷物、甘蔗、水稻和玉米，或為雙 子葉型，如煙草、大豆、蕓苔屬植物如油菜、棉花、甜菜根、三葉草等。
本發(fā)明涉及轉化宿主生物體特別是植物細胞或植物的方法，所述方法將上述至少 一個核酸序列或一個嵌合基因整合入這樣的生物體中，其中可通過任何適當?shù)囊阎侄潍@ 得轉化，所述手段在專門的文獻中有充足描述，特別是在本發(fā)明引用的參考文獻中，更具體 地說是采用本發(fā)明的載體。一系列方法包括用DNA序列附著的粒子轟擊細胞、原生質(zhì)體或組織。另一系列方 法包括采用插入到根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的嵌合基因作為轉移入植物 的手段?？刹捎闷渌椒?，如微注射或電穿孔或用PEG引導沉淀。技術人員可選擇任何適 當?shù)姆椒ㄞD化所選宿主生物體，特別是植物細胞或植物。例如，大豆轉化的技術在通過引用 納入本文的EP1186666的實施例1_3中有廣泛描述。對于水稻，可進行農(nóng)桿菌介導的轉化 (Hiei等，1994，和Hiei等，1997，通過引用納入本文)、電穿孔(美國專利5，641，664和美 國專禾Ij 5，679，558，通過引用納入本文)或轟擊(Christou等，1991，通過引用納入本文)。 通過引用納入本文的WO 92/09696中描述了單子葉植物特別是水稻轉化的合適技術。對于 棉花，已描述了農(nóng)桿菌介導的轉化(Gould J. H.和Magallanes-Cedeno Μ.，1998和Zapata C.，1999，通過引用納入本文)、聚凝胺(polybrene)和/或處理介導的轉化(Sawahel W. A.， 2001，通過引用納入本文)。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，突變的HPPD靶向葉綠體?？赏ㄟ^整合上述編碼 轉運肽/突變HPPD融合蛋白的核酸序列來進行?；蛘?，可采用轉化葉綠體基因組將突變的HPPD直接在葉綠體中表達。一個合適的 方法包括用DNA包被的粒子轟擊樹葉部分，并通過同源重組整合編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的引入 基因。合適的載體和選擇系統(tǒng)為本領域技術人員已知?？捎糜谶@種整合入煙草品系葉綠體 基因組的手段和方法的一個例子在WO 06/108830中給出，其內(nèi)容通過引用納入本文。在采 用葉綠體基因組轉化將多肽直接靶向入葉綠體時，通常不需要轉運肽序列。本發(fā)明也涉及獲得耐受HPPD抑制劑的植物的方法，其特征在于所述植物用上述 嵌合基因進行轉化。因此，本發(fā)明也涉及一種獲得耐受HPPD抑制劑的植物的方法，其特征在于所述植 物用在5'且任選地在3'位置包含編碼序列以及異源調(diào)控元件的嵌合基因進行轉化，所 述編碼序列以及異源調(diào)控元件能夠在宿主生物體中發(fā)揮作用，其特征在于所述編碼序列包 含至少一個如上所述的核酸序列。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，在該方法中，所述HPPD抑制劑是三酮或吡唑特 除草劑，優(yōu)選特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特別是特波三酮。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及獲得上述耐受HPPD抑制劑的植物的方法，其特 征在于所述植物還同時或相繼用在該植物中發(fā)揮作用從而允許PDH(預苯酸脫氫酶)酶過 表達的基因進行轉化。本發(fā)明也涉及借助HPPD抑制劑特別是上述除草劑為植物特別是作物選擇性除草 的方法，該方法的特征在于在作物播種前、作物萌發(fā)前或作物萌發(fā)后施用將該除草劑施用 于根據(jù)本發(fā)明進行轉化的植物。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，在該方法中，所述HPPD抑制劑是三酮或吡唑特 除草劑，優(yōu)選特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特別是特波三酮。本發(fā)明也涉及在包含如本專利申請之前所述的轉化種子的區(qū)域或田地里控制雜草的方法，該方法包括對所述田地區(qū)域施用對所述雜草有毒劑量的HPPD抑制劑除草劑，而 不顯著影響包含如本專利申請之前所述的核酸序列或嵌合基因的種子或植物。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，在該方法中，所述HPPD抑制劑是三酮或吡唑特 除草劑，優(yōu)選特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特別是特波三酮。本發(fā)明也涉及一種栽培用本發(fā)明嵌合基因轉化的植物的方法，該方法包括將包含 本發(fā)明嵌合基因的種子種植在適合栽培所述植物的田地區(qū)域里，如果存在雜草，將對雜草 有毒劑量的、以上述HPPD為靶標的除草劑施用于所述田地的所述區(qū)域，而不顯著影響所述 轉化種子或所述轉化植物，然后在栽培植物或植物部分達到所需成熟階段時收獲所述栽培 植物或植物部分，適當時從收獲的植物中分離種子。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，在該方法中，所述HPPD抑制劑是三酮或吡唑特 除草劑，優(yōu)選特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特別是特波三酮。在以上方法中，可根據(jù)本發(fā)明，在作物播種前、作物萌發(fā)前或作物萌發(fā)后施用以所 述HPPD為靶標的除草劑。本發(fā)明也涉及一種獲得油，特別是大豆油或粗碾谷物的過程，包括在田地里種植 表達本發(fā)明突變HPPD的作物，特別是大豆作物，任選用HPPD抑制劑除草劑處理這樣的作 物，收獲谷物，碾磨谷物以制備粗碾谷物并提取油。包含本發(fā)明嵌合基因的整個、破碎或碾 碎的植物種子或谷物也是本發(fā)明的一部分。因此，本發(fā)明涉及獲得油或粗碾谷物的方法，包括種植上述的轉化植物，任選地用 HPPD抑制劑除草劑處理這樣的植物，收獲谷物，碾磨谷物以制備粗碾谷物并提取油。在具體的實施方式中，本發(fā)明的以上方法包括選自以下的HPPD抑制劑除草劑 異噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、吡拉塞佛托、磺草酮、苯吡唑草酮、2_氰基-3-環(huán)丙 基-l-(2-S02CH3-4-CF3 苯基)_ 丙烷-1,3- 二酮和 2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-S02CH3-4_2， 3C12苯基)丙烷-1，3-二酮。在其它具體的實施方式中，本發(fā)明的以上方法包括選自以下的HPPD抑制劑除草 劑三酮類，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特類，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮， 特別選自特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，更特別地為特波三酮。在本發(fā)明的含義中，“除草劑”應理解為本身具有除草劑活性的物質(zhì)或與改變其功 效的添加劑如例如增強其活性(增效劑)或限制其活性(安全劑)的試劑結合的物質(zhì)。當 然應理解，就其在實踐中的應用來說，以上除草劑以本身已知的方式與農(nóng)業(yè)化學中慣常使 用的配方佐劑結合。在根據(jù)本發(fā)明轉化的植物包含一個或多個其它對其它除草劑耐受性的基因(如 例如，編碼賦予植物對草甘膦除草劑耐受性的突變或未突變EPSPS的基因，或賦予對草丁 膦除草劑耐受性的pat或bar基因)時，或在轉化植物對另一個除草劑具有天然敏感性(如 磺酰脲耐受性)時，本發(fā)明的方法可包括結合所述除草劑或除草劑的組合，例如草甘膦和/ 或草丁膦和/或磺酰脲除草劑，同時或按順序交錯施用HPPD抑制劑。本發(fā)明也涉及基于對上述HPPD抑制劑除草劑的選擇，編碼本發(fā)明突變HPPD的嵌 合基因作為某種植物轉化期間標記基因的用途。本發(fā)明也涉及獲得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制劑的植物的方法，其特征在于所 述植物用在植物中表達HPPD的嵌合基因進行轉化，所述HPPD在SEQ ID NO :2所示假單胞
16菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基酸甘氨酸發(fā)生突變。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及所述獲得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制 劑的植物的方法，其特征在于所述HPPD突變選自Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、 Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及所述獲得耐受選自特波三酮、甲基磺草 酮和磺草酮的三酮HPPD抑制劑的植物的方法。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及所述獲得耐受三酮或吡唑特HPPD抑 制劑的植物的方法，其特征在于所述植物還同時或相繼用在該植物中發(fā)揮作用從而允許 PDH(預苯酸脫氫酶)酶過表達的基因進行轉化。本發(fā)明也涉及在控制區(qū)域或田地中雜草的方法，該方法包括在該區(qū)域或田地種植 根據(jù)上述方法獲得的耐受三酮或吡唑特HPPD抑制劑的轉化植物或來源于其的轉化種子， 施用對雜草有毒劑量的所述三酮或吡唑特HPPD抑制劑，而不顯著影響所述轉化種子或所 述轉化植物。本發(fā)明也涉及獲得油或粗碾谷物的方法，包括種植根據(jù)上述方法獲得的耐受三 酮或吡唑特HPPD抑制劑的轉化植物或來源于這樣植物的轉化種子，任選用三酮或吡唑特 HPPD抑制劑處理這樣的植物或種子，收獲谷物，碾磨谷物以制備粗碾谷物并提取油。本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基 酸甘氨酸發(fā)生突變的HPPD以使植物耐受三酮或吡唑特HPPD抑制劑的用途。本發(fā)明也涉及上述突變HPPD的用途，其特征在于所述HPPD突變選自Gly336Arg、 Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、 Gly336Cys 和 Gly336VaL·本發(fā)明也涉及上述突變HPPD的用途，其特征在于所述HPPD抑制劑是選自特波三 酮、甲基磺草酮或磺草酮的三酮HPPD抑制劑。本發(fā)明也涉及宿主生物體，特別是植物細胞或植物，其包含含有編碼本發(fā)明突變 HPPD的序列的嵌合基因，還包含在該宿主生物體中發(fā)揮作用從而允許預苯酸脫氫酶(本文 縮寫為PDH)過表達的基因。在表述“在植物中發(fā)揮作用從而允許PDH酶過表達的基因”中，術語“PDH”應解釋 為表現(xiàn)出將預苯酸轉化為HPP的PDH活性的任何天然或突變的PDH酶。特別地，所述PDH 酶可來源于任何類型的生物?？赏ㄟ^任何可能測定預苯酸底物量的減少或測定來自酶反應 的產(chǎn)物即HPP或輔因子NADH或NADPH之一的積累的方法鑒定具有PDH活性的酶。具體地 說，可通過實施例4中描述的方法測定PDH活性。文獻中描述了很多編碼PDH酶的基因，其序列可在網(wǎng)址http://VWW. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/進行鑒定。特別熟知的是編碼以下的PDH酶的基因如Marmhaupt等 (1989)中所述的釀酒酵母(登錄號S46037)、桿狀菌屬(Bacillus)細菌特別是如Hermer等 (1986)中所述的枯草桿菌(B. subtilis)(登錄號P20692)、埃希氏菌屬(Escherichia)細 菌特別是如Hudson等(1984)中所述的大腸桿菌(登錄號KMECTD)、歐文氏菌屬(Erwinia) 的細菌特別是如Xia等(1992)中所述的草生歐文氏菌(E. herbicola)(登錄號S29934)。本發(fā)明還涉及獲得耐受HPPD抑制劑的宿主生物體特別是植物細胞或植物的方 法，通過在這樣的生物體中整合入上述至少一個核酸序列或一個嵌合基因，再同時或相繼
17用在該宿主生物體中發(fā)揮作用從而允許PDH(預苯酸脫氫酶)酶過表達的基因?qū)ζ溥M行轉 化。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及獲得宿主生物體特別是植物細胞或植物的 方法，其對三酮或吡唑特HPPD抑制劑，特別是特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮具有耐受性?？捎糜讷@得用允許HPPD酶過表達的基因和允許PDH酶過表達的基因二者轉化的 宿主生物體特別是植物細胞或植物的手段和方法在W004/024928中有廣泛描述，其內(nèi)容通 過引用納入本文。本說明書中引用的任何在前出版物(或來源于其的信息)或任何已知事項不是也 不應看作承認、認可或是任何形式的暗示該在前出版物(或信息)或已知事項形成本發(fā)明 領域公知常識的一部分。附1 阿維鏈霉菌、胡蘿卜、擬南芥、玉米、大麥、小麥葉枯病菌、粗球孢子菌、小鼠 和熒光假單胞菌的HPPD序列比對。氨基酸根據(jù)假單胞菌序列編號，星號表示這些序列共有
的氨基酉2。
序列表
SEQIDNO1 編碼熒光假單胞菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO2 熒光假單胞菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO3 編碼擬南芥HPPD的核酸序列
SEQIDNO4 擬南芥HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO5 編碼小鼠HPPD的核酸序列
SEQIDNO6 小鼠HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO7 編碼粗球孢子菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO8 粗球孢子菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO9 編碼小麥葉枯病菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO10小麥葉枯病菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO11編碼大麥HPPD的核酸序列
SEQIDNO12大麥HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO13編碼玉米HPPD的核酸序列
SEQIDNO14玉米HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO15編碼胡蘿卜HPPD的核酸序列
SEQIDNO16胡蘿卜HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO17編碼阿維鏈霉菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO18阿維鏈霉菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO19引物序列kerfiOOl
SEQIDNO20引物序列kerfi002
SEQIDNO21引物序列kerfi003
SEQIDNO22引物序列kerfi004
SEQIDNO23引物序列kerfi007
SEQIDNO24 引物序列kerfi008
SEQIDNO25引物序列kerf iO 11
SEQIDNO26引物序列kerfi012
SEQIDNO27引物序列kerf iO 14
SEQIDNO28引物序列kerf iO 16
SEQIDNO29引物序列kerf iO 19
SEQIDNO30引物序列kerfi020
SEQIDNO31引物序列kerfi015
SEQIDNO32引物序列kerf iO 18
實施例在以下實施例的輔助下將會更好的理解本發(fā)明的各方面。以下在這些實施例中描 述的所有方法和操作通過舉例的方式給出，對應于從可達到相同或相似結果的不同方法中 作出的選擇。該選擇對結果的質(zhì)量沒有影響，因此技術人員可使用任何合適的方法以達到 相同或相似的結果。DNA片段操作的大多數(shù)方法在《現(xiàn)代分子生物學實驗技術》(“Current Protocols inMolecular Biology “)，第 1 卷和第 2 卷，Ausubel F. M.等，格林出版公 司(GreenePublishing Associates)禾口 WI 公司(Wiley Interscience) (1989)、《分子克 隆〉〉(Molecular cloning), Τ. Maniatis, Ε. F. Fritsch, J. Sambrook, 1982 或 SambrookJ.禾口 Russell D.，2001，《分子克隆實驗手冊》(Molecular Cloning :a laboratorymanual)(第 三版)中有描述。實施例1 突變HPPD的制備概述首先將擬南芥AtHPPD編碼序列(1335bp)(Genebank AF047834 ；W096/38567)克隆 入表達載體pQE-30 (QIAGEN)的限制性位點BamHI和HindIII之間。首先將熒光假單胞菌PfHPPD 編碼序列(1174bp) (Ruetschi 等，Eur. J. Biochem.， 205,459-466,1992，WO 96/38567)克隆入提供起始密碼子的表達載體pKK233_2 (法瑪西亞 公司)獨特的NcoI位點。載體pQE-30-AtHPPD和pKK233-2_PfHPPD用于PCR介導的NcoI限制性位點和編 碼N末端His6-標簽的序列連接于AtHPPD和PfHPPD的5，端，以及XbaI限制性位點連接 于 AtHPPD 禾口 PfHPPD 的 3’ 段。從瓊脂糖凝膠中分離AtHPPD基因的PCR產(chǎn)物，用限制酶NcoI和XbaI切割， 用MinElute PCR純化試劑盒(恰根公司(Qiagen))純化，克隆入用相同限制酶切割的 pSE420(RI)NX 載體。對于PfHPPD基因，從瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物，克隆入pCR 2. 1- TOPO 載 體。用限制酶NcoI和XbaI將其從該載體上切離，從瓊脂糖凝膠中分離，并克隆入用相同限 制酶切割的pSE420(RI)NX載體。然后對pSE420 (RI)NX-AtHPPD和-PfHPPD 二者進行PCR介導的定點突變，以在兩 個基因的相應位點改變指定的密碼子。所述密碼子分別在WTPfHPPD中編碼Gly336和在WT AtHPPD 中編碼 Gly422。采用焦磷酸測序(Pyrosequencing )技術分析編碼序列中的突變密碼子。
PCR介導的編碼N末端His6-標簽的序列與NcoI和XbaI限制性位點的連接在96孔PCR板的24孔上分別進行各基因(AtHPPD和PfHPPD)的PCR反應。由 于該反應的正向和反向引物在大小上有18 (AtHPPD)和22bp (PfHPPD)的差異，因此實施 40. 90C -64. 5°C的退火溫度梯度，各孔置于該范圍內(nèi)的另一個退火溫度下。在引物與單鏈 模板進行第一次退火時，在新鏈中產(chǎn)生了 5'突出端，直到合成出其互補鏈，由第一引物的 5'區(qū)域形成的該突出端成為模板的一部分。由此編碼序列在兩端延伸，在兩端引入編碼N 末端His6-標簽的序列和限制性位點。該反應混合物包含500ng pQE-30-AtHPPD (IyL來自質(zhì)粒大量抽提)或Iyg pKK233-2-PfHPPD DNA (0. 75 μ L 來自質(zhì)粒大量抽提)、用于 AtHPPD 的 kerf iOOl 和 kerf i002 分別1 μ 1、或用于PfHPPD的kerf i003和kerf i004分別1 μ 1 (所有引物溶液均具有 IOpmol* μ Γ1的濃度)、25 μ 1 HotStarTaq Master Mix (恰根公司)和分子生物學級超純 水(HyPure Molecular Biology Grade Water)至終體積 50 μ L。PCR 程序設置如下1.95°C15 分鐘2. 94"C 30 #40. 9°C-60. 4°C 30 秒72°C3 分鐘步驟2重復20次。3. 72 °C 10 分鐘
權利要求
1.突變的羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)，其保留催化對羥基苯基丙酮酸(HPP)轉化 為尿黑酸的性質(zhì)，且對HPPD抑制劑的敏感性低于原始的未突變HPPD，其特征在于其在SEQ ID NO 2所示假單胞菌HPPD的氨基酸序列第336位的氨基酸甘氨酸上包含選自下組的突 變Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336Cys。
2.如權利要求1所述的突變HPPD，其特征在于，所述突變HPPD包含第二突變。
3.如權利要求2所述的突變HPPD，其特征在于，所述第二突變氨基酸選自以下氨基酸 SEQ ID NO :2所示假單胞菌HPPD序列的Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337。
4.編碼如權利要求1-3中任一項所述的突變HPPD的核酸序列。
5.在5’和任選在3’位置包含編碼序列以及異源調(diào)控元件的嵌合基因，其能在宿主生 物體中發(fā)揮作用，其特征在于所述編碼序列包含至少一個如權利要求4所述的核酸序列。
6.如權利要求5所述的嵌合基因，其特征在于，其在編碼突變HPPD的核酸序列的5’位 置包含編碼植物轉運肽的核酸序列，其中該序列位于啟動子區(qū)域和編碼突變HPPD的序列 之間，從而允許轉運肽/突變HPPD融合蛋白的表達。
7.轉運肽/突變HPPD融合蛋白，其中所述突變HPPD如權利要求1_3中任一項定義。
8.用于轉化宿主生物體的克隆和/或表達載體，其特征在于其包含至少一個如權利要 求5-6中任一項所述的嵌合基因。
9.植物細胞，其特征在于其包含至少一個如權利要求4所述的核酸序列或如權利要求 5-6中任一項所述的嵌合基因。
10.如權利要求9所述的植物細胞，其特征在于，其還包含在植物中發(fā)揮作用從而允許 PDH(預苯酸脫氫酶)酶過表達的基因。
11.轉化植物，其特征在于其包含如權利要求9或10所述的轉化植物細胞。
12.轉化種子，其特征在于其包含權利要求9或10所述的轉化植物細胞，且其來源于如 權利要求11所述的轉化植物。
13.獲得耐受HPPD抑制劑的植物的方法，其特征在于用如權利要求5-6中任一項所述 的嵌合基因轉化所述植物。
14.如權利要求13所述的獲得耐受HPPD抑制劑的植物的方法，其特征在于，用在該植 物中發(fā)揮作用從而允許PDH(預苯酸脫氫酶)酶過表達的第二基因同時或相繼進一步轉化 所述植物。
15.在包含如權利要求12所述轉化種子或如權利要求11所述植物的區(qū)域或田地中控 制雜草的方法，該方法包括對所述區(qū)域或田地施用對所述雜草有毒劑量的HPPD抑制劑除 草劑，而不顯著影響包含如權利要求4所述核酸序列或權利要求5-6中任一項所述嵌合基 因的種子或植物。
16.獲得油或粗碾谷物的方法，包括種植如權利要求11所述的轉化植物，任選用HPPD 抑制劑除草劑處理該植物，收獲谷物，碾磨谷物以制備粗碾谷物并任選提取油。
17.如權利要求13-16中任一項所述的方法，其中HPPD抑制劑是三酮HPPD抑制劑。
18.如權利要求17所述的方法，其中HPPD抑制劑選自特波三酮、甲基磺草酮和磺草 酮，特別是特波三酮。
19.在SEQID NO :2所示假單胞菌HPPD的氨基酸序列第336位的氨基酸甘氨酸上發(fā)生 突變的HPPD在賦予植物耐受三酮HPPD抑制劑中的應用，其特征在于所述HPPD突變選自Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336Cys。
20.如權利要求19所述突變HPPD的應用，其特征在于，所述HPPD抑制劑選自特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼突變的羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)的核酸序列、包含該序列作為編碼序列的嵌合基因以及其在獲得耐受HPPD抑制劑除草劑的植物中的應用。
文檔編號C12N5/10GK101998993SQ200980113723
公開日2011年3月30日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權日2008年4月14日
發(fā)明者A·薩利安德, B·蘭伯, K·菲希爾, M·布什 申請人:拜耳生物科學股份有限公司;拜爾農(nóng)科股份公司