專利名稱：與具有c端元件的肽和蛋白相關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在廣義上涉及分子醫(yī)學領(lǐng)域，更具體而言，涉及細胞和組織穿透肽。
背景技術(shù)：
可內(nèi)化至細胞中的肽主要是指細胞穿透肽。主要有兩類這種肽疏水型和陽離 子型(Zorko and Langel，2005)。陽離子型肽通常用于將核酸、蛋白導(dǎo)入細胞中，其包括 原型的細胞穿透肽 Tat和 penetratin (Meade and Dowdy，2007 ； Derossietal., 1998)。皰疹 病毒蛋白VP22能夠進入細胞及離開細胞，并且能夠隨其攜帶負載(Elliott and O’ Hare, 1997； Brewis etal., 2003)。這些肽作為遞送載體的主要局限是它們是非選擇性的；它們 可進入所有細胞?？梢允褂脤σ环N細胞類型或組織特異性更高的可活化遞送體系。細胞穿透遞送載體在許多方面都很重要。首先，內(nèi)化可以改善靶向作用，這是 因為肽及其負載內(nèi)化至細胞可使得歸巢更有效(Christian et al.，2003 ； Laakkonen et al.， 2004 ； Weissleder at al.，1995)。第二，細胞穿透靶向元件可將負載帶進細胞質(zhì)中，這在 例如基于核酸遞送的療法中是至關(guān)重要的。第三，細胞穿透性質(zhì)與離開能力可以增加外 滲和組織擴散。對于將組合物遞送至細胞而言，組織穿透是嚴重限制因素。熒光素標記肽的 分布與以相同肽涂覆的氧化鐵顆粒的分布的比較結(jié)果顯示，所述顆粒保持在腫瘤血管近 處，而熒光肽則到達腫瘤的所有區(qū)域。經(jīng)常引述的腫瘤血管“滲漏”似乎不能在本質(zhì)上 緩解該問題。而且，抗血管生成治療可造成腫瘤血管的“正?；?Jain，2005)，由此 需要靶向血管未滲漏的腫瘤。因此，重要的是尋求能改善不同組合物到達血管外空間的 通道的新方法。已知大量蛋白可透過血管內(nèi)皮，包括血腦屏障。一個主要實例為運鐵蛋 白，它被運鐵蛋白受體攜帶通過血腦屏障。該體系已被用于將其他負載帶入腦中(Liet al., 2002 ； Fenart and Cecchelli, 2003)?？山閷?dǎo)組合物從循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)位至組織中的用于 內(nèi)皮轉(zhuǎn)胞吞的肽信號物是有用的。因此，需要新的治療策略，用于選擇性靶向不同細胞類型，用于將蛋白和肽內(nèi) 化至這些細胞中以及用于蛋白和肽的組織穿透。本發(fā)明通過提供可以被不同細胞類型選 擇性靶向及選擇性內(nèi)化并且/或者可穿透組織的肽而滿足該要求。本發(fā)明還提供了相關(guān) 的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
公開了 CendR元件以及包含CendR元件的蛋白和肽。還公開了如下CendR綴合 物其包含共價偶聯(lián)于或非共價締合于包含一個CendR元件的蛋白或肽的運載組合物。 還公開了如下CendR綴合物其包含共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所選擇的氨基 酸序列的蛋白或肽的運載組合物，其中所述氨基酸序列包含一個CendR元件。所述運載 組合物可以偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。還公開了可活化的CendR元件和包含可活化的CendR元件的蛋白和肽。還公開 了如下可活化的CendR綴合物其包含共價偶聯(lián)于或非共價締合于包含可活化的CendR 元件的蛋白或肽的運載組合物。還公開了如下可活化的CendR綴合物其包含共價偶聯(lián) 于或非共價締合于一種包含所選擇的氨基酸序列的蛋白或肽的運載組合物，其中所述氨 基酸序列包含可活化的CendR元件。所述運載組合物可以偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的 所述可活化CendR元件的N端側(cè)。還公開了通過這樣的方法制備的CendR綴合物，即該方法包括使一種運載組合 物共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶 聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。還公開了通過這樣的方法制備的 CendR綴合物，即該方法包括使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所 選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列包含C端元件，其中所述運載組合 物偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。還公開了通過這樣的方法制 備的CendR綴合物，即該方法包括(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透 組織，其中所述氨基酸序列包含C端元件，以及(b)使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共 價締合于包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所 述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。所述CendR綴合物可以包含所述蛋白或肽以及 所述偶聯(lián)或締合的運載組合物。還公開了通過這樣的方法制備的可活化的CendR元件，即該方法包括使一個封 閉基團共價偶聯(lián)于一個CendR元件，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述CendR元件的鍵是可 切割的。還公開了通過這樣的方法制備的可活化的CendR元件，即該方法包括使一個封 閉基團共價偶聯(lián)于一條氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含一個CendR元件，其中偶 聯(lián)所述封閉基團和所述CendR元件的鍵是可切割的。還公開了通過這樣的方法制備的可 活化的CendR元件，即該方法包括(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透 組織，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一個封閉基團共價偶聯(lián)于所述 CendR元件，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述CendR元件的鍵是可切割的。共價偶聯(lián)于所 述CendR元件的所述封閉基團可減少或阻止細胞內(nèi)化和/或組織穿透。與無封閉基團的 相同CendR元件相比，共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封閉基團可減少或阻止細胞內(nèi) 化和/或組織穿透。所述可活化的CendR元件可以包含所述選擇的氨基酸序列和所述封 閉基團。在所述蛋白或肽中存在所述CendR元件時，所述蛋白或肽可以內(nèi)化至細胞中/ 或穿透組織，但在所述蛋白或肽中不存在所述CendR元件時，所述蛋白或肽不內(nèi)化至細 胞中及/或穿透組織。在所述蛋白或肽中存在所述選擇的氨基酸序列時，所述蛋白或肽可以內(nèi)化至細胞中及/或穿透組織，但在所述蛋白或肽中不存在所述選擇的氨基酸時， 所述蛋白或肽不內(nèi)化至細胞中及/或穿透組織。所述CendR元件可以不與所述運載組合 物締合而內(nèi)化至細胞中并/或可以穿透組織。所述選擇的氨基酸序列可以不與所述運載 組合物締合而內(nèi)化至細胞中并/或可以穿透組織。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽 中僅有的功能性內(nèi)化元件，所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中僅有的功能性組織穿 透元件，或者所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中僅有的功能性內(nèi)化元件和功能性組 織穿透元件。所述選擇的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中僅有的功能性內(nèi)化元件，所 述選擇的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中僅有的功能性組織穿透元件，或者所述選擇 的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中僅有的功能性內(nèi)化元件和功能性組織穿透元件。所 述CendR元件可以是所述CendR綴合物中僅有的功能性內(nèi)化元件，所述CendR元件可 以是所述CendR綴合物中僅有的功能性組織穿透元件，或者所述CendR元件可以是所 述CendR綴合物中僅有的功能性內(nèi)化元件和功能性組織穿透元件。所述選擇的氨基酸序 列可以是所述CendR綴合物中僅有的功能性內(nèi)化元件，所述選擇的氨基酸序列可以是所 述CendR綴合物中僅有的功能性組織穿透元件，或者所述選擇的氨基酸序列可以是所述 CendR綴合物中僅有的功能性內(nèi)化元件和功能性組織穿透元件。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述CendR元件可以是蛋白酶 可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以為環(huán)形(圓形)或者可以含有環(huán)。所述CendR 元件可位于所述蛋白或肽的C末端。所述CendR元件可以包含末端羧基?？梢詫⒁粋€ 封閉基團偶聯(lián)于所述末端羧基。選擇偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基的鍵以便可被存 在于目的細胞附近的蛋白酶切割。所述封閉基團可以偶聯(lián)于所述CendR元件的C端氨基 酸。所述封閉基團可以偶聯(lián)于所述CendR元件C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基 酸。運載組合物可以共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所選擇的氨基酸序列的蛋 白或肽，其中所述氨基酸序列可以包含CendR元件。所述運載組合物可以偶聯(lián)或締合于 所述蛋白或肽，例如位于所述CendR元件的N端側(cè)。所述運載組合物可以為例如應(yīng)用 于治療或診斷的納米顆粒、分子或分子復(fù)合物?？梢酝ㄟ^CendR元件靶向的治療性運載 組合物包括但不限于納米顆粒、分子、分子復(fù)合物、抗血管生成劑、促血管生成劑、癌 癥化學治療劑、細胞毒劑、促細胞存活劑、細胞分化劑、神經(jīng)保護劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗 炎劑、抗關(guān)節(jié)炎劑、抗病毒劑或它們的結(jié)合。可以通過CendR元件靶向的診斷性運載組 合物包括但不限于納米顆粒、分子、分子復(fù)合物、MRI顯象劑、放射顯象劑、光學顯象 劑、分子標簽(例如生物素)、熒光團、表位標簽(例如，它可以用特異性分子測定來檢 測)或它們的結(jié)合。所述運載組合物可以包含歸巢序列。所述運載組合物可以選擇性地 歸巢于腫瘤或其他靶組織。所述運載組合物可以選擇性地歸巢于腫瘤或其他靶組織的血 管。還公開了形成CendR綴合物的方法，所述方法包括使一種運載組合物共價偶聯(lián) 于或非共價締合于包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所述 蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。還公開了形成CendR綴合物的方法，所述方法 包括使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所選擇的氨基酸序列的蛋白 或肽，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。還公開了形成CendR綴合物的方法，所述方法包 括(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包含 CendR元件，以及(b)使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所述選擇的 氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR 元件的N端側(cè)。所述CendR綴合物可以包含所述蛋白或肽以及所述偶聯(lián)或締合的運載組 合物。還公開了將運載組合物遞送至細胞的方法，所述方法包括將所述細胞暴露于一 種CendR綴合物，其中所述CendR元件包含共價偶聯(lián)于或非共價締合于一個CendR元件 的運載組合物，其中所述CendR綴合物然后可以進入所述細胞，從而將所述運載組合物 遞送至所述細胞。還公開了將運載組合物遞送至細胞的方法，所述方法包括將所述細胞 暴露于一種CendR綴合物，其中所述CendR元件包含一種共價偶聯(lián)于或非共價締合于一 種包含CendR元件的蛋白或肽的運載組合物，其中所述CendR綴合物然后可以進入所述 細胞，從而將所述運載組合物遞送至所述細胞。還公開了將運載組合物遞送至細胞的方 法，所述方法包括(a)將一個CendR元件偶聯(lián)于所述運載組合物，從而形成一種CendR 綴合物；以及(b)將所述細胞暴露于所述CendR綴合物，其中所述CendR綴合物然后可 以進入所述細胞，從而將所述運載組合物遞送至所述細胞。還公開了鑒定能內(nèi)化CendR元件的細胞的方法，所述方法包括(a)將一種細胞暴 露于一個CendR元件，以及(b)確定所述CendR元件是否被內(nèi)化。還公開了鑒定一種癌 細胞作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包括(a)將所述癌細胞暴露于一個 CendR元件，以及(b)確定所述CendR元件是否被所述癌細胞內(nèi)化，其中內(nèi)化的CendR 元件將所述癌細胞鑒定為基于CendR的療法的候選物。所述細胞可以在一個測定中。所 述CendR元件可以偶聯(lián)于一種蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。 所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述細胞之前活化。所述可活化的CendR元件可 以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是環(huán)形的。所述CendR元件可以 位于所述蛋白或肽的C末端。還公開了鑒定可以被CendR元件穿透的組織的方法，所述方法包括(a)將一種組 織暴露于一個CendR元件，以及(b)確定所述CendR元件是否穿透所述組織。還公開了 鑒定一種腫瘤作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包括(a)將來自所述腫 瘤的細胞暴露于一個CendR元件，以及(b)確定所述CendR元件是否被所述細胞內(nèi)化， 其中內(nèi)化的CendR元件將所述腫瘤鑒定為基于CendR的療法的候選物。還公開了鑒定一 種腫瘤作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包括(a)將所述腫瘤暴露于一 個CendR元件，以及(b)確定所述CendR元件是否穿透所述腫瘤，其中穿透的CendR元 件將所述腫瘤鑒定為基于CendR的療法的候選物。所述腫瘤可以在一個測定中。所述 CendR元件可以偶聯(lián)于蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可 活化的CendR元件可以在暴露于所述腫瘤之前活化。所述可活化的CendR元件可以是蛋 白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是環(huán)形的。所述CendR元件可以位于所 述蛋白或肽的C末端。還公開了產(chǎn)生可以在目的細胞附近被活化的可活化CendR元件的方法，所述 方法包括形成一個可活化的CendR元件，其中將一個封閉基團經(jīng)可切割鍵偶聯(lián)于一個CendR元件，其中所述可切割鍵可被存在于目的細胞附近的酶切割。所述細胞可以在受 試者中?？梢澡b定存在于目的細胞附近的酶?？梢栽谛纬伤隹苫罨腃endR元件之 前，鑒定存在于目的細胞附近的酶?？梢曰诖嬖谟谀康募毎浇拿高x擇所述可切割 鍵?？梢栽谛纬伤隹苫罨湃隒endR元件之前選擇所述可切割鍵。所述CendR元件 可以包含末端羧基，其中所述封閉基團偶聯(lián)于所述末端羧基。還公開了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一個封閉基團共價 偶聯(lián)于一個CendR元件，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述CendR元件的鍵是可切割的。還 公開了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一個封閉基團共價偶聯(lián)于一條 氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含一個CendR元件，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述 CendR元件的鍵是可切割的。還公開了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括 (a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包含一 個CendR元件，以及(b)使一個封閉基團共價偶聯(lián)于所述CendR元件，其中偶聯(lián)所述封 閉基團和所述CendR元件的鍵是可切割的。共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封閉基團 可減少或阻止細胞內(nèi)化和/或組織穿透。與無封閉基團的相同CendR元件相比，共價偶 聯(lián)于所述CendR元件的所述封閉基團可以減少或阻止細胞內(nèi)化和/或組織穿透。所述可 活化的CendR元件可以包含所述選擇的氨基酸序列和所述封閉基團。所述細胞可以在受 試者中?？梢澡b定存在于目的細胞附近的酶。可以在形成所述可活化CendR元件之前鑒 定存在于目的細胞附近的酶?？梢曰诖嬖谟谀康募毎浇拿高x擇所述可切割鍵?？?以在形成所述可活化CendR元件之前選擇所述可切割鍵。所述CendR元件可以包含末端 羧基，其中所述封閉基團偶聯(lián)于所述末端羧基。運載組合物可以共價偶聯(lián)于或非共價締 合于一種包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽。所述運載組合物可以偶聯(lián)或締合于所 述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。本文公開了一種形成CendR綴合物的方法，所述方法包括選擇一種氨基酸序列 用于內(nèi)化至細胞中，其中所述氨基酸序列包含C端元件；以及使一種運載組合物共價偶 聯(lián)于或非共價締合于一種包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述選擇的氨基 酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR綴合物包含所述蛋白或肽以及所述 偶聯(lián)或締合的運載組合物。公開了一種制備CendR綴合物的方法，包括(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化 至細胞中，其中所述氨基酸序列包含一個C端元件，(b)使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或 非共價締合于一種包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述選擇的氨基酸序列 位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR綴合物包含所述蛋白或肽以及所述偶聯(lián)或 締合的運載組合物。還公開了一種將運載組合物遞送至細胞的方法，所述方法包括(a)將一個 CendR元件偶聯(lián)于所述運載組合物，從而形成一種CendR綴合物；以及(b)將所述細胞 暴露于所述CendR綴合物，其中所述CendR綴合物然后可以進入所述細胞，從而將所述 運載組合物遞送至所述細胞。還公開了一種使運載組合物穿透組織的方法，所述方法包括(a)將一個CendR 元件偶聯(lián)于所述運載組合物，從而形成一種CendR綴合物；以及(b)將所述組織暴露于 所述CendR綴合物，其中所述CendR綴合物然后可以進入并離開所述組織中的細胞，從而使所述運載組合物穿透所述組織。又公開了一種將運載組合物遞送至細胞的方法，所述方法包括(a)將一個可活 化的CendR元件偶聯(lián)于所述運載組合物，從而形成一種CendR綴合物；以及(b)將所述 細胞暴露于所述CendR綴合物，于是切割劑可活化所述CendR綴合物的可活化CendR元 件，其中所述CendR綴合物然后可以進入所述細胞，從而將所述運載組合物遞送至所述 細胞。再公開了一種使運載組合物穿透組織的方法，所述方法包括(a)將一個可活化 的CendR元件偶聯(lián)于所述運載組合物，從而形成一種CendR綴合物；以及(b)將所述組 織暴露于所述CendR綴合物，于是切割劑可活化所述CendR綴合物的可活化CendR元 件，其中所述CendR綴合物然后可以進入和離開所述組織中的細胞，從而使所述運載組 合物穿透所述組織。還公開了一種鑒定可以內(nèi)化CendR元件的細胞的方法，所述方法包括(a)將一 種細胞暴露于一個CendR元件；以及(b)確定所述CendR元件是否被內(nèi)化。例如，所述 細胞可以在一個測定中。所述CendR元件可以偶聯(lián)于一種運載組合物，例如蛋白或肽， 從而形成CendR綴合物。還公開了一種鑒定可以內(nèi)化可活化的CendR元件的細胞的方法，所述方法包 括(a)將一種細胞暴露于一個可活化的CendR元件；(b)確定所述可活化的CendR元件 是否被內(nèi)化。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述細胞之前脫封閉，但不需要如 此。例如，這可以用于測試所述封閉劑的封閉能力。所述可活化的CendR元件還可以為 蛋白酶活化的CendR元件。還公開了一種鑒定癌細胞作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包 括(a)將所述癌細胞暴露于一個CendR元件；以及(b)確定所述CendR元件是否被所述 癌細胞內(nèi)化，其中內(nèi)化的CendR元件將所述癌細胞鑒定為基于CendR的療法的候選物。 例如，所述細胞可以在一個測定中，或者可以在受試者中。所述CendR元件可以偶聯(lián)于 一種運載組合物例如蛋白或肽，從而形成CendR綴合物。還公開了一種鑒定腫瘤作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包 括(a)將來自所述腫瘤的組織暴露于一個CendR元件；以及(b)確定所述CendR元 件是否通過所述組織或者被所述組織中的細胞內(nèi)化，其中通過的CendR元件或被內(nèi)化的 CendR元件將所述腫瘤鑒定為基于CendR的療法的候選物。還公開了一種產(chǎn)生可以在目的細胞附近活化的可活化CendR元件的方法，所 述方法包括形成一個可活化CendR元件，其中將一個封閉基團經(jīng)可切割鍵偶聯(lián)于一個 CendR元件，其中所述可切割鍵可被存在于目的細胞附近的酶切割。該方法還可以包括 在形成所述可活化CendR元件之前鑒定存在于目的細胞附近的酶。該方法還可以包括在 形成所述可活化CendR元件之前基于存在于目的細胞附近的酶選擇所述可切割鍵。還公開了一種形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括(a)選擇一種氨 基酸序列用于內(nèi)化至細胞中，其中所述氨基酸序列包含一個C端元件，其中所述C端元 件包含末端羧基，以及(b)使一個封閉基團共價偶聯(lián)于所述選擇的氨基酸序列的末端羧 基，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基的鍵是可切割的，其中所述可活化的CendR 元件包含所述選擇的氨基酸序列和所述封閉基團。該方法還可包括，在步驟(b)之前選擇可被存在于目的細胞附近的蛋白酶切割的、偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基的鍵。再公開了一種由這樣的方法制備的可活化的CendR元件，即該方法包括(a)選 擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中，其中所述氨基酸序列包含一個C端元件，其中所 述C端元件包含末端羧基，以及(b)使一個封閉基團共價偶聯(lián)于所述選擇的氨基酸序列的 末端羧基，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基的鍵是可切割的，其中所述可活化的 CendR元件包含所述選擇的氨基酸序列和所述封閉基團。該方法還可包括，在步驟(b) 之前選擇可被存在于目的細胞附近的蛋白酶切割的、偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基 的鍵。所公開的方法和組合物的其他優(yōu)點一部分將在下文的描述中闡明，一部分可以 從說明書中獲知，或者可通過實施所公開的方法和組合物而得知。所公開的方法和組合 物的優(yōu)點將通過所附權(quán)利要求書中具體指明的要素和組合實現(xiàn)和獲得。應(yīng)當理解的是， 上文的一般性描述和下文的具體描述都僅僅是示例性和解釋性的，并不是對本發(fā)明要求 保護范圍的限制。


附圖包含于本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，附圖闡述了所公開方法和組 合物的一些實施方案，它與文字描述一起用于解釋所公開方法和組合物的原理。圖1A、IB和IC示出了對內(nèi)化肽進行鑒定。圖IA 對于T7噬菌體展示，肽 的表達形式為主衣殼蛋白GPlO的C末端融合物。圖1B:在PPCl細胞上進行了 4個 不同文庫(CX7C、XI、RXXRXXX(SEQ ID NO 19)和 RXXR(A/P) PRXXX(SEQ ID NO 20))的3輪離體篩選，產(chǎn)生歸巢比展示7個連續(xù)甘氨酸殘基(G7)的對照噬菌體高 500-2,500倍的噬菌體庫。圖IC 對每個文庫隨機20個噬菌體克隆的測序表明主要存在 以C端精氨酸殘基結(jié)尾的肽，不管初始的文庫構(gòu)型和噬菌體與細胞相互作用中使用的溫 度如何。對于4°C相應(yīng)部分，這些序列從表的左上至右下對應(yīng)于SEQ ID NO: 52-61、 132、72-75、133、76、134、77-78、135-144 和 62-71。對于 37°C + 酸洗相應(yīng)部分，這 些序列從表的左上至右下對應(yīng)于SEQ ID No 82-91、102-111、145-154和92-101。圖2A和2B示出了展示C端精氨酸的T7噬菌體結(jié)合于PPCl細胞并被PPCl細 胞內(nèi)化。圖2A: T7噬菌體與前列腺癌細胞的結(jié)合依賴于C端精氨酸在所述噬菌體顆粒上 的展示。在4°C下將PPCl細胞與展示G7肽衍生物(上圖)或RPARPAR肽衍生物(SEQ ID NO 2)(下圖)的T7細菌噬菌體一起孵育，并通過噬菌斑檢測法定量測定結(jié)合的噬菌 體。結(jié)合表示為高于未結(jié)合的G7對照噬菌體的倍數(shù)。圖2B:展示C端精氨酸的噬菌 體被內(nèi)化至培養(yǎng)的PPCl細胞中(箭號核內(nèi)化；箭頭細胞質(zhì)內(nèi)化)。在37°C下將一 組T7噬菌體克隆與培養(yǎng)于膠原涂布的蓋玻片上的PPCl細胞一起孵育，以抗T7抗體染色 并通過共聚焦顯微術(shù)成像。圖 3 顯示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)-量子點(quantum dot, Q-dot)被 PPCl
細胞內(nèi)化。將培養(yǎng)于膠原涂布的蓋玻片上的PPCl前列腺癌細胞與以生物素標記的肽涂布 的鏈霉親和素量子點孵育，然后進行固定，用DAPI對細胞核復(fù)染并進行共聚焦成像。以 具有游離C端的RPARPAR肽(SEQ ID NO 2)涂布的Q_dot被強內(nèi)化(淺顏色點)(a)， 而以酰胺封閉的C端涂布的Q-dot不結(jié)合所述細胞或內(nèi)化(b)。插圖Q-dot的示意圖用于該研究的量子點具有約20nm的直徑，并且可以以每顆粒5-10個肽涂布。圖4顯示了胰蛋白酶可活化RPARPARA(SEQ ID NO 3)噬菌體與PPCl細胞的
結(jié)合。在37°C下將5X IO8個噬菌體顆粒與標明體積的2.5%胰蛋白酶一起孵育20分鐘， 隨后在4°C下將所述噬菌體與1 X IO6個PPCl細胞一起孵育3小時。結(jié)合表示為高于未 結(jié)合的G7對照噬菌體(其內(nèi)化不受胰蛋白酶處理的影響)的倍數(shù)。圖5顯示了 iRGD噬菌體和iRGD肽的腫瘤歸巢和內(nèi)化。a.iRGD肽歸巢于胰腫 瘤。將大約200yg熒胺標記的iRGD肽通過尾靜脈注入胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)小鼠，并 使之循環(huán)4.5小時。收集器官并在UV光下觀察(上圖)。下圖顯示出了相應(yīng)的亮視野 圖像。b.iRGD噬菌體廣泛地內(nèi)化至人腫瘤細胞中。在37°C下將展示iRGD肽(主圖) 或CG7C對照肽(右上窗口)的T7噬菌體與培養(yǎng)于I型膠原涂布的蓋玻片上的PPCl細胞 一起孵育2小時，以抗T7抗體和質(zhì)膜標記物染色，并通過共聚焦顯微鏡成像。觀察到 iRGD噬菌體(淺顏色點)廣泛地內(nèi)化至所述腫瘤細胞中，而所述對照噬菌體不是這樣。圖6顯示了具體的細胞內(nèi)遞送中的CendR。將包含潛在CendR基序的歸巢肽通 過結(jié)合于特定受體(例如整聯(lián)蛋白)帶至靶細胞表面，所述肽隨后被特定的細胞表面或細 胞周蛋白酶切割以暴露所述CendR基序(C端精氨酸)，被遞送至廣泛存在(ubiquitous)的 CendR受體，并被胞吞。具有暴露的CendR基序的肽直接與所述CendR受體相互作用， 并被內(nèi)化。所述CendR通路可以使得所有類型的診斷劑和治療劑(包括納米顆粒)高度 特異地進行細胞內(nèi)遞送。圖7顯示了針對蛋白酶活化的進入信號和離去信號的CendR篩選的示意圖。(A) 為進行蛋白酶解性進入篩選，CendR元件(RPARPAR，SEQID NO 2)被隨機六肽和C
端丙氨酸殘基掩蓋。細胞內(nèi)存在的噬菌體已被蛋白酶解處理，以暴露CendR元件。(B) 為了鑒定離去信號，構(gòu)建具有暴露的CendR元件的噬菌體文庫，所述暴露的CendR元件 之前連有隨機肽。噬菌體的默認通路是內(nèi)化，且僅其中隨機肽編碼離去信號的噬菌體在 細胞外。圖8A和8B顯示了 iRGD具有這樣的CendR元件，即它有C端K(賴氨酸)而 非C端R(精氨酸)，并且該CendR元件像其他有C端精氨酸的CendR —樣發(fā)揮作用。 iRGD包含CendR元件。圖8A 制備了截短形式的iRGD噬菌體并對其內(nèi)化至PPCl人 前列腺癌細胞的作用進行了測試。與天然iRGD噬菌體相比，攜帶CRGDKG(SEQ ID NO: 21)、CRGDK (SEQ ID NO 22)、CR(SEQ ID NO 163)的噬菌體具有更高的內(nèi) 化至PPCl細胞的能力。從左至右，序列為SEQ ID NO: 155、SEQID NO 4、SEQID NO: 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ IDNO 160、SEQ ID NO 21、 SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163。圖 8B 將PPCl細胞與或不與多種濃度的攜帶iRGD、CRGDK(SEQ ID NO 22)、CR(SEQ ID NO: 163)或RPAR (SEQ IDNO : 164)的UV失活噬菌體一起預(yù)孵育，隨后與活CRGDK 噬菌體或?qū)φ帐删w(NC5)—起進一步孵育。觀察到CRGDK(SEQ IDNO 22)噬菌體的 內(nèi)化被RPAR噬菌體以劑量依賴的方式抑制，表明CRGDK(SEQ IDNO : 22)發(fā)揮CendR 的作用。圖9顯示了 iRGD能夠擴散至腫瘤組織中。將iRGD噬菌體(a)及其對照KGD 噬菌體(b)注入至攜帶自發(fā)胰腺導(dǎo)管腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠，并使之循環(huán)15分鐘。然后將小鼠以含BSA的PBS灌注并收集腫瘤。將所述腫瘤的冰凍切片以抗T7噬菌體抗體、 抗CD31抗體和DAPI染色。觀察到iRGD噬菌體被形成胰腫瘤導(dǎo)管的腫瘤細胞廣泛地吸 收，而KGD噬菌體保持在一些血管內(nèi)部且在腫瘤導(dǎo)管中幾乎未觀察到信號，表明iRGD 噬菌體能夠外滲并擴散至腫瘤組織中。在圖9的2幅圖中都以亮色表示著染。圖IOA和IOB顯示了使用噬菌體展示鑒定CendR肽。將一組肽文庫(CX7C、 X7和RXXRXXX (SEQ ID NO 19))用于在源自PPOl同位異種移植腫瘤的細胞懸液上 進行離體篩選。(圖10A)在3輪篩選后，噬菌體庫對懸液中腫瘤細胞的結(jié)合比對照多甘 氨酸七肽(G7)噬菌體高500-1,300倍。(圖10B)在3輪噬菌體篩選后回收代表性肽序 列。以C端精氨酸結(jié)尾的肽占所有測序的噬菌體插入物的97%。對于4°C相應(yīng)部分，這 些序列從表的左上至右下對應(yīng)于SEQ ID NO 52-81。對于37°C +酸洗相應(yīng)部分，這 些序列從表的左上至右下對應(yīng)于SEQ ID NO: 82-111。圖1IA-IIC 顯示了 CendR 內(nèi)化的結(jié)構(gòu)特征。圖 IlA G6R 禾Π RPARPAR(SEQ
ID NO 2)噬菌體與PPC-I細胞的相互作用。在4°C下將細胞與噬菌體一起孵育以評估 表面結(jié)合(“被結(jié)合”)，或者在37°C下孵育后以低pH洗滌以評估噬菌體攝取(“被內(nèi) 化”)。RPARPAR(SEQ IDNO 2)-功能化的q-dot同時抑制了 RPARPAR噬菌體的結(jié) 合和內(nèi)化，而G7 q-dot無作用。G6R噬菌體未被內(nèi)化；它與PPOl細胞的結(jié)合被過量 RPARPAR (SEQ ID NO 2) q-dot阻斷。結(jié)合表示為展示多甘氨酸七肽(G7)的對照噬菌 體的倍數(shù)。圖IlB 在4°C下RPARPAR (SEQ ID NO 2)衍生噬菌體與PPC-1細胞的結(jié) 合。數(shù)據(jù)是4次獨立結(jié)合實驗的代表。除了第一序列和第九序列分別為SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO: 3外，所述序列從左至右對應(yīng)于SEQ IDNO 112-125。統(tǒng)計分析通過學 生t檢驗(Student，s t-test)進行(圖11A)。η = 3 ；誤差棒表示標準差(s.d.) ； 1個星 號，ρ <0.05; 2個星號，ρ <0.01。 比例尺20 μ m。 圖IlC (圖c_g)在37°C下與展 示肽的噬菌體(亮色點，c_e)或肽涂覆的q-dot(亮色點，f，g) —起孵育2小時的PPC-I 細胞的共聚焦顯微術(shù)RPARPAR (SEQ IDNO 2)T7(c)、G6RT7(d)、RPARPARA(SEQ ID NO 2) T7 (e)、RPARPAR (SEQ ID NO 2) q-dot (f)和 RPARPAR_NH2 (SEQ ID NO 2)q-dot(g)。在顯微照片中，箭頭指向表面結(jié)合的噬菌體和q-dot;箭號指向內(nèi)化的顆 粒。圖 12A 和 12A 顯示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)、RGERPPR (SEQID NO 27) 和RVTRPPR(SEQ ID NO 28)肽的細胞結(jié)合和攝取。圖12A 共享的通路。在4°C 下，展示所有3個串聯(lián)RXXR (SEQ ID NO: 25)肽的噬菌體都以類似的程度與所述PPOl 細胞結(jié)合。所述結(jié)合被細胞與RPARPAR (SEQ ID NO 2)-功能化的q_dot的預(yù)孵育抑 制。以七甘氨酸對照肽(G7)涂覆的Q-dot對所述噬菌體結(jié)合無作用。統(tǒng)計分析通過 學生t檢驗進行(c)。η = 3;誤差棒表示標準差(s.d.) ； 1個星號，ρ <0.05; 2個星 號，ρ < 0.01。圖12B(圖b_i)在存在IO9 pfu的以下噬菌體的條件下，培養(yǎng)1小時的 PPOl細胞中噬菌體免疫反應(yīng)性的共聚焦免疫熒光評估(亮色點)(b)RPARPAR(SEQ ID NO 2)、 (c) RGERPPR (SEQID NO 27)、 (d) RVTRPPR (SEQ ID NO 28)、 (e) 對照 G7、(f)存在 20 μ M 游離 RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽情況下的 RPARPAR (SEQ IDNO 2)噬菌體、(g)存在200 μ M游離RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽情況下的 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體、(h)存在 2mM 游離 RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽情況下的 RPARPAR(SEQ ID NO 2)噬菌體、(i)存在 200 μ M 游離 RPARPAR(SEQ ID
NO 2)肽情況下的RGERRPR(SEQ ID NO 27)噬菌體。卵形橢圓表示以DAPI復(fù)染的 核。比例尺20μιη。圖13 顯示了 PPOl 細胞對 RPARPAR (SEQ ID NO 2) q-dot 的內(nèi)化(淺色 點)肽修飾的效應(yīng)。將PPC-I細胞與以如下肽功能化的q-dot —起孵育2小時(a) RPARPAR (SEQ ID NO 2)、(b) RPARPARA (SEQID NO 3)、(c) RPARPAR-NH2 (SEQ ID NO: 2)、(d)D-rparpar、(e) D-rparpara 和(f) G7。將細胞以核染色劑 DAPI 染色并使
用共聚焦顯微鏡成像。比例尺50 μ m。圖14顯示了胰蛋白酶切割可增加RPARPARA (SEQ ID NO 3)噬菌體與PPOl
細胞的結(jié)合。在37°C下將109pfu的RPARPARA (SEQ IDNO 3)噬菌體以指定量的胰蛋 白酶處理，隨后在4°C下進行噬菌體結(jié)合測定。數(shù)據(jù)是4次獨立結(jié)合實驗的代表。圖15A-15D顯示了 CendR噬菌體可結(jié)合于許多類型的細胞。圖15A 在 4 °C下RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體與培養(yǎng)細胞的體外結(jié)合。圖15B 在4°C下 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體與小鼠器官原代細胞懸液的離體結(jié)合。圖15C和15D 靜脈注射的RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體在20分鐘的循環(huán)時間后的組織分布。圖 15C噬菌體通過滴定定量，組織結(jié)合表示為G7噬菌體的倍數(shù)。統(tǒng)計分析通過學生t 檢驗進行(C)。η = 3;誤差棒表示標準差(s.d.) ； 2個星號，ρ <0.01; 3個星號，ρ < 0.001ο 圖 15D (圖 d 和 e)以 RPARPAR (SEQ ID NO 2) (d)或 G7 (e)噬菌體靜脈注 射的小鼠的肺切片中T7噬菌體的免疫熒光定位(淺著色)。廣泛分布的免疫反應(yīng)性存在 于以RPARPAR (SEQ ID NO 2)注射的小鼠的肺中(d中的箭頭)，但不存在于以G7注 射的小鼠的肺中(血管中偶爾出現(xiàn)標記，e中的箭頭)。比例尺50μιη。圖16Α和16Β顯示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體與PPOl細胞結(jié)合以及 向PPC-I細胞內(nèi)化的動力學。圖16A :在4°C下，噬菌體與培養(yǎng)的PPC-I細胞懸液的結(jié) 合在20分鐘時達到平臺。對于時程研究，將培養(yǎng)PPC-I細胞的細胞懸液與IO9Pfu噬菌 體一起孵育，隨后在硅油墊(1.03g/ml)上通過離心將未結(jié)合的噬菌體與細胞一步分離， 并進行滴定。圖16B (圖b、c)在37°C下肝PPOl細胞對RPARPAR (SEQ IDNO 2) 功能化的q-dot的內(nèi)化。(b)在加入q-dot 15分鐘后，沿質(zhì)膜出現(xiàn)標記(淺色斑點)。 (C)在1小時時，大多數(shù)的q-dot被內(nèi)化。以活體細胞核染色劑Hoechst 342進行細胞核 染色。η = 3 ；誤差棒表示標準差(s.d.)。比例尺20 μ m。圖17A、17B 和 17C 顯示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體被 PPOl 細胞經(jīng)
非常規(guī)的通路內(nèi)化。圖17A 胞吞抑制劑對RPARPAR (SEQID NO 2)噬菌體內(nèi)化的影 響。在37°C下將噬菌體與PPC-I細胞一起在存在所示抑制劑的情況下孵育90分鐘，隨 后進行酸洗和滴定以定量測定內(nèi)化的噬菌體。通過ANOVA進行的統(tǒng)計分析顯示所述抑 制劑沒有一種顯著抑制內(nèi)化。η = 3 ；誤差棒表示標準差(s.d.)。圖17B :在存在IO9Pfo 的RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體的情況下孵育60分鐘并針對T7噬菌體和亞細胞 區(qū)室標記物(LAMP-1、小窩蛋白-l(caveolin-l)、鈣聯(lián)接蛋白(calnexin)、EEA-1)雙 染的PPC-I細胞的共聚焦成像。以DAPI進行細胞核染色。圖17C 在存在109pfo的 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體和10 μ g/ml霍亂毒素B亞基的情況下孵育180分鐘的 PPC-I細胞的共聚焦成像。噬菌體通過Alexa-546標記的二抗進行檢測，霍亂毒素亞基B以Alexa-488染料標記。共定位通過緊靠細胞核外側(cè)的亮點(箭號)表示。以DAPI進 行細胞核染色。比例尺10 μ m。圖18A-18C顯示了 NRP_1作為CendR受體的鑒定和確認。圖18A 蛋白與 RPARPAR(SEQ ID NO 2)肽相互作用的親和色譜。以200mM吡喃葡萄糖苷緩沖物提 取PPOl腫瘤組織并將所述提取物與RPARPAR (SEQ ID NO 2)涂覆的小珠孵育，然 后進行大量洗滌，并以2mM游離RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽洗脫。注意到被質(zhì)譜 鑒定為NRP-I的130kDa帶出現(xiàn)，其起始于洗脫物的第3級分。上圖-銀染凝膠，下 圖-抗NRP-I抗體的免疫印跡。圖18B RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體與以野生 型 NRP-I (NRP-I)、三重突變體 NS346A-E348A-T349ANRP_1(突變體 NRP-1)或親本 PCDNA3.1質(zhì)粒(載體)瞬時轉(zhuǎn)染的M21黑色素瘤細胞的結(jié)合，以及與非轉(zhuǎn)染的M21細 胞的結(jié)合。圖18C (C、d)，在37°C下與噬菌體一起孵育40分鐘(c)和3小時(d)的 PPC-I細胞中NRP-I和RPARPAR (SEQ ID NO 2)T7噬菌體的共聚焦免疫熒光圖像。 所述噬菌體和NRP-I大量地共定位，但似乎重疊不斷減少(C和d中的箭頭)并出現(xiàn)僅對 噬菌體陽性的結(jié)構(gòu)(箭號，d)。 (e)以NRP-I瞬時轉(zhuǎn)染的M21細胞中RPARPAR(SEQ ID NO 2)噬菌體和NRP-I的免疫染色和共聚焦成像。在37°C下將RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌體與在纖連蛋白涂布的蓋玻片上培養(yǎng)的細胞一起孵育3小時。僅表達NRP-I 的細胞結(jié)合并內(nèi)化所述噬菌體(箭號)，而陰性細胞(不可視)不結(jié)合和內(nèi)化所述噬菌 體。(f) RPARPARA(SEQ ID NO 3)噬菌體不內(nèi)化至NRP-I陽性M21細胞中。統(tǒng)計分 析以ANOVA進行(b) ； η = 3 ；誤差棒表示標準差(s.d.)。比例尺10 μ m。圖19A和19B顯示了展示RPARPAR (SEQ ID NO 2)和已知NRP-I配體肽的噬 菌體與PPC-I細胞的結(jié)合。圖19A 已知NRP-I配體可使得噬菌體結(jié)合于PPOl細胞。 展示已知與NRP-I的bl亞基相互作用的肽配體(a中的表)的噬菌體以與RPARPAR(SEQ ID NO 2)類似的程度結(jié)合所述細胞，而具有添加的C端丙氨酸(VEGF-C7-A)的 VEGF-C7是失活的。在該表中，序列從上至下對應(yīng)于SEQ IDNO 126-130。圖19B (圖 b-g)對在存在IO9Pfu的所示噬菌體的情況下培養(yǎng)1小時的PPC-I細胞中的噬菌體免疫 反應(yīng)性進行共聚焦免疫熒光評估。箭號，內(nèi)化的噬菌體；箭頭，質(zhì)膜關(guān)聯(lián)的噬菌體。以 DAPI進行細胞核染色。插圖0.5mM游離RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽(在加入噬菌 體前10分鐘加到細胞中)對所述噬菌體結(jié)合的競爭。比例尺20 μ m。圖20A-20C顯示了尿激酶依賴的CendR肽。圖20A uPA-可活化的CendR 肽(uCendR)的設(shè)計。uPA的共有切割位點SGRSA (SEQ IDNO 34的第5_9位氨基酸) (Ke, S.H.etal. (1997))與重疊CendR元件相組合。在完整的肽中，所述CendR元件由于 未在C端處暴露而無活性。uPA的切割導(dǎo)致所述CendR元件的C端暴露CuCendR-X)、 細胞結(jié)合和內(nèi)化。圖20B 展示uCendR肽和對應(yīng)于切割后產(chǎn)物(uCendR-X)的噬菌體與 PPC-I細胞的結(jié)合。在將所述噬菌體加入細胞之前，將噬菌體以50iu的uPA、25 μ g結(jié)晶 胰蛋白酶、50iu凝血酶或25 μ g的I型膠原酶處理。圖20C (圖c_e)與uPA-CendR-q-dot 一起孵育的PPC-I細胞的熒光顯微術(shù)。未處理的uCendR q_dot未內(nèi)化(C)，而uPA處理 可觸發(fā)q-dot的內(nèi)化(d，箭頭)。阿米洛利(Amiloride)抑制了攝取(e)。統(tǒng)計分析以 ANOVA進行(b) ； η = 3 ；誤差棒表示(s.d.) ； 3個星號，ρ <0.001。比例尺10 μ m。圖21顯示了 CendR的內(nèi)化通路。所鑒定的內(nèi)化基序(CendR基序)在位于蛋白C端時有活性。在C端之外的位置包含CendR基序的肽(隱性CendR肽)未內(nèi)化；然 而，它們對神經(jīng)氈蛋白-1的結(jié)合和它們的內(nèi)化可以通過蛋白酶解切割觸發(fā)。所述CendR 通路可導(dǎo)致生物納米顆粒和合成納米顆粒(細菌噬菌體和q-dot)的攝取。CendR通路還 可以涉及到細胞與其他生物劑(例如病毒和其他細胞)的相互作用。
具體實施例方式通過參考對下文中包括的具體實施方案和實施例的具體描述，以及參考附圖及 其上下文的描述，可以更容易地理解所公開的方法和組合物。在公開并描述本發(fā)明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法之前，應(yīng)當理 解，除非另外指出，否則它們不局限于具體的合成方法或具體的重組生物技術(shù)方法，或 者除非另外指出，否則它們不局限于具體的試劑，因為這些理所當然可以有變化。還應(yīng) 當理解，本文中使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方案的目的，不是意欲進行限制。A.定義除非上下文中另外明確指出，在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式 的“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對象。因此，例如，提及“一種藥物載 體”包括兩種或多種該載體的混合物，等等。本文中范圍可以表示為從“約” 一個具體的數(shù)值，和/或至“約”另一個具體 的數(shù)值。當表示為該范圍時，另一實施方案可包含從一個具體數(shù)值和/或至另一個具體 數(shù)值。類似地，當通過在前面使用“約”將數(shù)值表示為近似值時，應(yīng)當理解，該具體 的數(shù)值形成另一實施方案。還應(yīng)當進一步理解，每個范圍的端點在與另一個端點相關(guān)和 獨立于另一個端點時都是有意義的。還應(yīng)當理解，本文中公開了許多值，并且每個值除 該值本身外在本文中還被公開為“約”該具體值。例如，如果公開了值“10”，那么
“約10”也被公開。還應(yīng)理解，如本領(lǐng)域技術(shù)人員適當理解的，如果一個值被公開，那 么“小于或等于”該值、“大于或等于該值”以及這些值之間可能的范圍也被公開。例 如，如果公開了值“10”，那么“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公開。 還應(yīng)理解，在本申請通篇中，數(shù)據(jù)以多種不同形式提供，并且該數(shù)據(jù)表示終點和起點以 及這些數(shù)據(jù)點的任意組合的范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點“10”和具體數(shù)據(jù)點 15，那么應(yīng)理解，除10和15之間以外，還認為大于、大于或等于、小于、小于或等于以 及等于10和15都被公開。還應(yīng)理解，兩個具體單元之間任一單元也被公開。例如，如 果10和15被公開，那么11、12、13和14也被公開。在本說明書和隨附的權(quán)利要求書中，將會提到多個術(shù)語，這些術(shù)語將被定義具 有如下含義“任選的”或“任選地”是指后面描述的事件或情況可能發(fā)生，也可能不發(fā) 生，且該描述包括所述事件或情況發(fā)生以及不發(fā)生的情形。本申請全文中，參引了多份出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引證的方式全 文納入本申請，以更全面地描述本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的狀態(tài)?；谝匈噮⒖嘉墨I的句子 中所論述的包含在所述參考文獻中的素材，所公開的參考文獻還單獨地并具體地通過引 用的方式納入本文。應(yīng)理解，除非另外指出，所公開的方法和組合物不限于具體合成方法、具體分析技術(shù)或具體試劑，因此它們可以有變化。還應(yīng)理解，用于本文中的術(shù)語僅是為了描述 具體實施方案，而不是意欲進行限制。B.綜述本文公開了一種新的技術(shù)平臺，該平臺使得可以進行組合物的細胞內(nèi)遞送、離 開和組織穿透。所述遞送可以是全面遞送，也可以靶向目的細胞或組織，例如腫瘤。組 合物(包括納米顆粒、藥物、可檢測標記物和其他化合物)及它們的負載在靶細胞中的內(nèi) 化以及靶組織穿透可以提高靶向的效率，但之前還未實現(xiàn)細胞類型特異性內(nèi)化和組織類 型特異性穿透。另外，組合物穿透至血管外空間的能力是限制組合物的體內(nèi)靶向效率的 主要因素。已經(jīng)鑒定了一個簡單的肽基序，其C端元件為一個限定特征，該基序可示意 噬菌體和游離肽的高效細胞內(nèi)化(圖9是一個實例)。該內(nèi)化現(xiàn)象被命名為“C端規(guī)則” 或“CendR”。使C端元件暴露的蛋白酶解可作為觸發(fā)內(nèi)化信號的開關(guān)。多種組合物可 以通過該機制內(nèi)化。例如，歸巢肽介導(dǎo)的積聚可以通過暴露這樣的C端元件的細胞類型 特異性蛋白酶解而出現(xiàn)在靶位點，即該C端元件使得形成具有靶觸發(fā)內(nèi)化的高特異性歸 巢體系。所述CendR通路還可以用于使目的組合物離開細胞并分散至組織中。該C端元 件可以實現(xiàn)穿透血管壁(并且例如可以從靜脈注射分散至腫瘤組織中)的轉(zhuǎn)位，并且還可 以擴展至其他屏障，例如粘膜和血腦屏障。本文使用的“組織穿透”和“組織的穿透” 是指越過或穿過外層或第一層細胞或者穿過組織膜進入或穿過組織。這類的組織進入或 穿透(這還可以稱為外滲和組織穿透)可以具有細胞內(nèi)化和離開雙功能。在本申請全文 中，如果使用術(shù)語“組織穿透”，應(yīng)理解為這類穿透還可以擴展至全身存在的其他屏障 和膜，例如血腦屏障。與已知的細胞穿透肽不同，本申請公開的內(nèi)化元件是位置依賴的一它存在于 肽C端之外的其他位置時是無活性的。該潛伏肽可以通過例如合適的蛋白水解酶切割以 暴露例如C端精氨酸、賴氨酸或賴氨酸-甘氨酸而活化。在本申請全文中，使用術(shù)語
“CendR元件”或“C端元件”時，它是用于描述C端精氨酸、C端賴氨酸或C端賴 氨酸-甘氨酸對，在最后一種情況下甘氨酸位于C端最末位置。換句話說，在賴氨酸在 C末端的情況下，所述CendR元件以甘氨酸位于賴氨酸的C端側(cè)可以保持功能。然而， 為使賴氨酸殘基作為C端元件起作用，甘氨酸位于末端不是必需的，因此賴氨酸可以在 無甘氨酸下存在并仍有功能。然而，反之則不然，因為甘氨酸在不存在鄰接的賴氨酸的 情況下不能發(fā)揮C端元件的功能。精氨酸不需要賴氨酸或甘氨酸就可發(fā)揮C端元件的功 能，條件是它保持在C端最末位置。這類CendR元件可以被稱為1類CendR元件。術(shù)語“CendR元件”或“C端元件”還可以用于描述C端組氨酸和具有序列 X1X2X3X4的氨基酸序列，其中X1可以為R、K或H，其中X4可以為R、K、H或KG， 其中X2和X3可以彼此獨立地為任意氨基酸。這類CendR元件可以被稱為2類CendR元 件?？梢曰诰唧w目的選擇X2和X3氨基酸。例如，可以選擇X2和/或X3以形成蛋白 酶識別序列的全序列或其一部分。例如，這可用于具體表示對含有作為一種潛伏或隱性 CendR元件的CendR元件的肽的切割或使所述切割進行，所述潛伏或隱性CendR元件被 X4氨基酸之后的切割作用所活化。這類氨基酸選擇的實例顯示于表1和4中。例如， 還可以選擇Xp X2和X3氨基酸以將其他分子募集至細胞表面處的NRP-I分子。例如， 這可以應(yīng)用于調(diào)節(jié)CendR元件(及包含CendR元件的綴合物、蛋白和肽)的選擇性和內(nèi)化以及/或者組織穿透能力。任選地，還可以將一些氨基酸從X2和/或X3的使用中排 除。例如，根據(jù)需要，可以排除G和D同時分別用作X2和&。一些2類CendR元件 還可以描述為 R/K/HXXR/K/H (SEQ IDNO 50)禾口 R/K/HXXKG (SEQ ID NO 51)。CendR 元件的實例包括 XXR/K/H、XXR/K、XXR/H、XXK/H、XXR、 XXK、XXH、XXKG、RXXR/K/H、RXXR/K、RXXR/H、RXXK/H、RXXR、 RXXK、RXXH > RXXKG > KXXR/K/H、KXXR/K、KXXR/H、KXXK/H、KXXR、 KXXK、KXXH > KXXKG > HXXR/K/H、HXXR/K、HXXR/H、HXXK/H、HXXR、 HXXK、HXXH > HXXKG > R/K/HXXR、R/KXXR、R/HXXR、K/HXXR、RXXR、 KXXR、HXXR、R/K/HXXK、R/KXXK、R/HXXK、K/HXXK、RXXK、KXXK、 HXXK、R/K/HXXH、R/KXXH、R/HXXH、K/HXXH、RXXH> KXXH> HXXH> R/ K/HXXKG、R/KXXKG、R/HXXKG、K/HXXKG、RXXKG、KXXKG禾Π HXXKG。該可由蛋白酶控制的內(nèi)化體系可用于設(shè)計這樣的組合物，即這些組合物具有諸 如細胞類型特異性和/或組織類型特異性攝取的功能以及將所述組合物擴散至組織中的 能力。另外，該規(guī)則可涉及多種生物過程，包括病毒感染和吞噬。由于病毒天然地可以 利用所述CendR通路感染細胞，因而所述CendR肽和/或綴合物可以用于干擾病毒感染 的過程。在一個實例中，所述CendR肽可以用于納米醫(yī)學中。納米醫(yī)學的主要目標之一 是設(shè)計通過在診斷、監(jiān)測和治療疾病中發(fā)揮多種功能而超越簡單藥物的裝置?？梢詫⑿?技術(shù)應(yīng)用于解決多功能納米顆粒的醫(yī)學應(yīng)用中的一些主要問題。醫(yī)學納米技術(shù)的一個主 要目標是開發(fā)能夠監(jiān)測組織(包括細胞內(nèi)部)中疾病的納米裝置。這類裝置可以包括這 樣的納米顆粒，即該納米顆粒對細胞內(nèi)部進行取樣后返回以對結(jié)果進行報告。這需要離 開細胞的能力。但是，許多缺乏分泌信號序列的細胞質(zhì)蛋白也從細胞中分泌。以該方式 發(fā)揮功能的細胞蛋白的一個主要實例為堿性FGF(Backhaus etal.，2004)。VP22蛋白也以 非常規(guī)的方式從細胞離開。賦予納米顆粒針對非靶向細胞的離開信號可減少所述顆粒的 非特異性毒性。組織穿透噬菌體文庫可用于鑒定促進納米顆粒離開細胞的分子信號。1 .CendR元件及其用途本文公開了一種形成CendR綴合物的方法，所述方法包括選擇一種氨基酸序列 用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包含一個C端元件；以及使一 種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中 所述選擇的氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR綴合物包含所述蛋 白或肽以及所述偶聯(lián)或締合的運載組合物本文定義的C端元件為精氨酸、賴氨酸或賴氨酸_甘氨酸(對于1類CendR元 件)，或者組氨酸或具有序列X1X2X3X4的氨基酸序列，其中X1可以為R、K或H，其中 X4可以為R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此獨立地為任意氨基酸(對于2類CendR 元件)。本文使用的“選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中”是指選擇、鑒定、設(shè)計 或分類具有如下具體目的的氨基酸序列使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入細胞。 因此，例如，“選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中”不包括如下情況為了除使包 含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入細胞之外的某個目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入細胞的意圖的情形下，選擇一種氨基酸序列。“選擇一種 氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中”包括如下情況除了為了使包含所述氨基酸序列的蛋白 或肽進入細胞之外還為了獲得某個目的或能力而選擇一種氨基酸序列。因此，“選擇一 種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中”包括這樣的情況，即其他目標或目的的存在不改變至 少具有如下具體目的的氨基酸序列選擇使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入細胞。本文使用的“選擇一種氨基酸序列用于穿透組織”是指選擇、鑒定、設(shè)計或分 類具有如下具體目的的氨基酸序列使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入組織(即組 織穿透)。因此，例如，“選擇一種氨基酸序列用于穿透組織”不包括如下情況為了 除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入組織之外的某個目的或能力，以及在不存在使 包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入組織的意圖的情形下，選擇一種氨基酸序列?！斑x 擇一種氨基酸序列用于穿透組織”包括如下情況除了為了使包含所述氨基酸序列的蛋 白或肽進入組織之外還為了獲得某個目的或能力而選擇一種氨基酸序列。因此，“選擇 一種氨基酸序列用于穿透組織”包括這樣的情況，即其他目標或目的的存在不改變至少 具有如下具體目的的氨基酸序列選擇使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入組織。本文使用的“選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織”是指選 擇、鑒定、設(shè)計或分類具有如下具體目的的氨基酸序列使包含所述氨基酸序列的蛋白 或肽進入細胞和/或組織。因此，例如，“選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或 穿透組織”不包括如下情況為了除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入細胞和/或 組織之外的某個目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進入細胞 和/或組織的意圖的情形下，選擇一種氨基酸序列。“選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至 細胞中和/或穿透組織”包括如下情況除了為了時包含所述氨基酸序列的蛋白或肽進 入細胞和/或組織之外還為了獲得某個目的或能力而選擇一種氨基酸序列。因此，“選 擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞和/或穿透組織”包括這樣的情況，即其他目標或目的 的存在不改變至少具有如下具體目的的氨基酸序列選擇使包含所述氨基酸序列的蛋白 或肽進入細胞和/或組織。本文使用的“使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于”其他某物是指任 何這樣的作用，即該作用導(dǎo)致不共價偶聯(lián)于或非共價締合于所述其他某物的運載組合物 變成或獲得共價偶聯(lián)于或非共價締合于所述其他某物的狀態(tài)。例如，“使一種運載組合 物共價偶聯(lián)于或非共價締合于”另一運載組合物包括，將運載組合物共價偶聯(lián)于所述另 一運載組合物。再例如，“使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于”某物包括這 樣的運載組合物，即該運載組合物開始不存在，然后作為一種組合物的一部份被合成， 所述組合物包含所述運載組合物將偶聯(lián)或締合的所述某物。例如，使運載組合物(目的 氨基酸序列)共價偶聯(lián)于或非共價締合于所述包含C端元件的氨基酸序列包括，合成同時 包含目的氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的肽。然而，一般而言，“使一種運載 組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于”所述包含C端元件的氨基酸序列可以排除這樣的過 程，即天然地同時包含目的氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的蛋白或肽的合成。本文使用的“CendR元件”是指具有C端精氨酸、賴氨酸或賴氨酸-甘氨酸序 列的氨基酸序列(對于1類CendR元件)，或者C端組氨酸或具有序列X1X2X3X4的C端 氨基酸序列，其中X1可以為R、K或H，其中X4可以為R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此獨立地為任意氨基酸(對于2類CendR元件)。一些2類CendR元件還可以描 述為 R/K/HXXR/K/H (SEQ ID NO 50)禾口 R/K/HXXKG (SEQ ID NO 51)。還可以選 擇Xi、X2和X3氨基酸以將其他蛋白募集至細胞表面處的NRP-I分子。例如，這可以應(yīng) 用于調(diào)節(jié)CendR元件(及包含CendR元件的綴合物、蛋白和肽)的選擇性和內(nèi)化以及/或 者組織穿透能力。例如，CendR元件可以包含這樣的氨基酸序列的蛋白或肽，所述氨基 酸序列具有C端元件；包含由具有C端元件的氨基酸序列組成的蛋白或肽；或者由具有 C端元件的氨基酸序列組成。任選地，還可以排除一些氨基酸在X1X2X3X4形式的CendR 元件中用作&和/或X3。例如，根據(jù)需要，可以排除G和D同時分別用作X2和乂3。CendR 元件的實例包括 XXR/K/H、XXR/K、XXR/H、XXK/H、XXR、 XXK、XXH、XXKG、RXXR/K/H、RXXR/K、RXXR/H、RXXK/H、RXXR、 RXXK、RXXH > RXXKG > KXXR/K/H、KXXR/K、KXXR/H、KXXK/H、KXXR、 KXXK、KXXH > KXXKG > HXXR/K/H、HXXR/K、HXXR/H、HXXK/H、HXXR、 HXXK、HXXH > HXXKG > R/K/HXXR、R/KXXR、R/HXXR、K/HXXR、RXXR、 KXXR、HXXR、R/K/HXXK、R/KXXK、R/HXXK、K/HXXK、RXXK、KXXK、 HXXK、R/K/HXXH、R/KXXH、R/HXXH、K/HXXH、RXXH> KXXH> HXXH> R/ K/HXXKG、R/KXXKG、R/HXXKG、K/HXXKG、RXXKG、KXXKG禾Π HXXKG。可以內(nèi)化至細胞中的CendR元件可以稱為內(nèi)化CendR元件?？纱┩附M織的 CendR元件可以稱為穿透CendR元件?？蓛?nèi)化至細胞中并且可穿透組織的CendR元件可 以稱為內(nèi)化和穿透CendR元件。除非上下文明確另外指出，提及“CendR元件”時是指 這些情況的各單獨情況、它們的總合或任意組合。本文使用的“CendR綴合物”是指與包含含有CendR元件的氨基酸序列的蛋白 或肽締合的運載組合物，其中所述氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端。本文使用的“可活化的CendR元件”是指分子、部分、納米顆粒、化合物或其 他組合物共價偶聯(lián)于一個CendR元件(例如共價偶聯(lián)于C端元件的末端羧基)的CendR 元件，其中所述分子、部分、納米顆粒、化合物或其他組合物可阻斷所述CendR綴合物 的內(nèi)化和/或組織穿透，并且其中所述分子、部分、納米顆粒、化合物或其他組合物可 被除去(例如以暴露所述末端羧基)。例如，所述可活化的CendR元件可以位于所述肽的 C末端，并且可以阻止所述CendR元件內(nèi)化和/或穿透組織。共價偶聯(lián)于所述CendR元 件的所述分子、納米顆粒、部分、化合物或其他組合物可以稱為“封閉基團”。例如， 所述封閉基團可以偶聯(lián)于所述CendR元件的C端精氨酸或賴氨酸或者其他C端氨基酸的 末端羧基；偶聯(lián)于所述CendR元件的C端氨基酸；或者偶聯(lián)于除所述C端氨基酸之外的 CendR元件的氨基酸。所述封閉基團還可以偶聯(lián)或締合于CendR綴合物中除所述CendR 元件之外的部分，條件是它可以阻斷所述CendR元件內(nèi)化和/或穿透組織?？苫罨腃endR元件的細胞內(nèi)化以及/或者組織穿透可被阻斷。一般而言，將 同時阻斷可活化的CendR元件的細胞內(nèi)化和組織穿透。這類可活化的CendR元件可以 稱為可活化的內(nèi)化和穿透CendR元件。然而，一些可活化的CendR元件僅被阻斷組織 穿透，或者僅被阻斷細胞內(nèi)化。這類可活化的CendR元件可以稱為可活化的內(nèi)化CendR 元件(對于僅被阻斷細胞內(nèi)化的CendR元件)，或者稱為可活化的內(nèi)化和穿透CendR元 件(對于僅被阻斷組織穿透的CendR元件)。一般而言，可活化的內(nèi)化CendR元件應(yīng)為可活化的內(nèi)化CendR元件。與之類似，可活化的穿透CendR元件一般應(yīng)為可活化的穿透 CendR元件?？苫罨膬?nèi)化和穿透CendR元件應(yīng)為可活化的內(nèi)化和穿透CendR元件。 除去所述封閉基團后將使得所述CendR元件可內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織?！暗鞍酌缚苫罨腃endR元件”(或“蛋白酶活化的CendR元件”)是指這樣 的可活化CendR元件，即其中所述封閉基團經(jīng)肽鍵偶聯(lián)于所述CendR元件，并且其中所 述肽鍵可被蛋白酶切割。蛋白酶可活化的CendR元件中該肽鍵的切割使得所述CendR元 件能夠內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織。在一個實例中，所述封閉基團可以經(jīng)可切割鍵或 不穩(wěn)定鍵偶聯(lián)于所述CendR元件。例如，所述可切割鍵可以被酶或化合物切割?？苫罨?CendR元件中的切割或“不穩(wěn)定”鍵可使得所述CendR元件能夠內(nèi)化至細胞中和/或穿 透組織。這類切割或“不穩(wěn)定”可稱為所述CendR元件的活化。蛋白酶可活化的CendR 元件為一種形式的可活化CendR元件。根據(jù)具體目的可以選擇X1X2X3X4形式的CendR 元件的X2和X3氨基酸。例如，可以選擇X2和/或X3以形成蛋白酶識別序列的全序列 或部分序列。例如，這可用于具體表示含有作為一種潛伏或隱性CendR元件的CendR元 件的肽的切割或使所述切割進行，所述潛伏或隱含CendR元件被X4氨基酸之后的切割作 用所活化。這類氨基酸選擇的實例顯示于表1和4中。一類可用的CendR元件可以由 未封閉的CendR元件和可活化的CendR元件組成，該類CendR元件排除不可活化的封閉 CendR元件?？捎玫牡鞍酌赴ㄔ趬A性殘基(CendR元件的C端殘基可以是堿性殘基)的C端 側(cè)切割的酶以及識別它們的切割位點的C端側(cè)序列的酶(因此使得可自由選擇切割產(chǎn)物 的C端序列)?？捎玫牡鞍酌傅膶嵗ɡ纾z氨酸蛋白酶(包括例如纖溶酶和纖溶 酶原激活齊[J)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶(參見例如 Duckert et al., Prediction of proprotein convertase cleavage sites Protein engineering Design and Selection 17(1) 107-112 (2004)) > 弗林蛋 白酶(forin)和羧肽酶。絲氨酸蛋白酶可特別用于靶向癌細胞和腫瘤的CendR元件和 CendR綴合物。在堿性殘基的C端側(cè)切割的酶的實例包括Arg-C蛋白酶(它在精氨酸殘 基的 C 端側(cè)切害Ij ； Keil，Specificityof Proteolysis (Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York) (1992))、梭菌蛋白酶(它在精氨酸殘基的C端側(cè)切割；Keil，1992)、腸激酶 (它在序列-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO 131)后切割)、Xa 因子(它在 序列-Gly-Arg-后切害1J ； Fujikawa et al., Activation of bovine factor X (Stuart factor) conversion of factor Xa alpha to factor Xa beta, Proc.Natl.Acad.Sci.72 3359-3363 (1975))、 Lys-C (它在賴氨酸殘基的C端側(cè)切割；Keil，1992)、凝血酶(它在精氨酸殘基的C端側(cè) 切割；Keil，1992)、胰蛋白酶(它在精氨酸和賴氨酸殘基的C端側(cè)切割；Keil，1992)、 絲氨酸蛋白酶、前蛋白轉(zhuǎn)化酶(例如PCI、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7、PC8、 弗林蛋白酶、Pace、PACE4、位點 1 蛋白酶、SIP、SKI、NARC-U PCSKU PCSK2、 PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6、PCSK7、PCSK8 禾口 PCSK9)、纖溶酶和纖溶酶原激 活劑?？勺R別其切割位點C端側(cè)序列的酶的實例包括Asp-N內(nèi)肽酶(它切割天冬氨酸的 N端側(cè)；Keil，1992)和羧肽酶如羧肽酶A(它切割除脯氨酸、賴氨酸和精氨酸之外的C 端殘基)。蛋白酶的實例還記載于 Hook, proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing, RG Landes Company, Austin, Texas, USA(1998) ； Hooperetal.，Biochem.J.321 265-279(1997) ； Werb, Cell 91 439-442(1997) ； Wolfsberg etal., J.Cell Biol. 131 275-278(1995) ； Murakami and Etlinger, Biochem.Biophys.Res. Comm. 146 1249-1259(1987) ； Berg et al.，Biochem.J.307 313-326(1995) ； Smyth and Trapani, Immunology Today 16 202-206 (1995) ； Talanian et al.，J.Biol.Chem.272 9677-9682(1997)；以及 Thornberry et al.，J.Biol.Chem.272 17907-17911(1997)。表4.切割規(guī)則底物切割I(lǐng)----P4-P3-P2-P1-P1' -P2' -P3' -P4'-----如下的酶在出現(xiàn)各自切割位點的組合時可切割。
權(quán)利要求
1.一種形成CendR綴合物的方法，所述方法包括(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包 含一個CendR元件，(b)使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所述選擇的氨基酸序列 的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端 側(cè)，其中所述CendR綴合物包含所述蛋白或肽以及所述偶聯(lián)或締合的運載組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的蛋白或肽在步驟(a)所選擇的氨基酸序列存在 于所述蛋白或肽中時可以被內(nèi)化至細胞中，但當所選擇的氨基酸不存在于所述蛋白或肽 中時不能被內(nèi)化至細胞中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的蛋白或肽在步驟(a)所選擇的氨基酸序列存在 于所述蛋白或肽中時可以穿透組織，但當所選擇的氨基酸不存在于所述蛋白或肽中時不 能穿透組織。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的蛋白或肽在步驟(a)所選擇的氨基酸序列存在 于所述蛋白或肽中時可以被內(nèi)化至細胞中并可穿透組織，但當所選擇的氨基酸不存在于 所述蛋白或肽中時不能被內(nèi)化至細胞中也不能穿透組織。
5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)所選擇的氨基酸序列在不與步驟(b)的組合物締 合情況下可以被內(nèi)化至細胞中。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)所選擇的氨基酸序列在不與步驟(b)的組合物締 合情況下可以穿透細胞。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)所選擇的氨基酸序列在不與步驟(b)的組合物締 合情況下可以被內(nèi)化至細胞中并可穿透組織。
8.權(quán)利要求ι的方法，其中步驟ω所選擇的氨基酸序列是步驟(b)的蛋白或肽中僅 有的功能性內(nèi)化元件。
9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)所選擇的氨基酸序列是所述CendR綴合物中僅有 的功能性內(nèi)化元件。
10.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述CendR元件為可活化的CendR元件。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述可活化CendR元件為蛋白酶可活化的CendR元件。
12.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述蛋白或肽是環(huán)狀的。
13.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
14.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中步驟(b)的運載組合物是抗血管生成劑、促血 管生成劑、納米顆粒、癌癥化學治療劑、細胞毒劑、抗炎劑或抗關(guān)節(jié)炎劑。
15.權(quán)利要求1-14任一項的方法，其中步驟(b)的運載組合物包含歸巢序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述運載組合物選擇性地歸巢于腫瘤。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述運載組合物選擇性地歸巢于腫瘤血管。
18.權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化至細胞中。
19.權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中所述氨基酸序列被選擇以用于組織穿透。
20.權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化至細胞中和 組織穿透。
21.一種由包括如下步驟的方法制備的CendR綴合物(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包 含一個CendR元件，(b)使一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于一種包含所述選擇的氨基酸序列 的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端 側(cè)，其中所述CendR綴合物包含所述蛋白或肽以及所述偶聯(lián)或締合的運載組合物。
22.權(quán)利要求21的CendR綴合物，其中所述CendR元件為可活化的CendR元件。
23.權(quán)利要求22的CendR綴合物，其中所述可活化的CendR元件為蛋白酶可活化的 CendR元件。
24.權(quán)利要求21-23任一項的CendR綴合物，其中所述蛋白或肽是環(huán)狀的。
25.權(quán)利要求21的CendR綴合物，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
26.權(quán)利要求21-25任一項的CendR綴合物，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化 至細胞中。
27.權(quán)利要求21-25任一項的CendR綴合物，其中所述氨基酸序列被選擇以用于組織穿透。
28.權(quán)利要求21-25任一項的CendR綴合物，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化 至細胞中和組織穿透。
29.—種將運載組合物遞送至細胞中的方法，所述方法包括(a)將一個CendR元件偶聯(lián)于所述運載組合物，從而形成一種CendR綴合物；并且(b)將所述細胞暴露于所述CendR綴合物，其中所述CendR綴合物然后可以進入所 述細胞，從而將所述運載組合物遞送至所述細胞中。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述CendR元件為可活化的CendR元件。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述可活化的CendR元件為蛋白酶可活化的CendR元件。
32.權(quán)利要求29-31任一項的方法，其中所述蛋白或肽是環(huán)狀的。
33.權(quán)利要求30-32任一項的方法，其中在所述細胞暴露于所述CendR元件時，一種 切割劑活化所述CendR綴合物的可活化CendR元件。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
35.—種鑒定可以內(nèi)化CendR元件的細胞的方法，所述方法包括(a)將一種細胞暴露于一個CendR元件；(b)確定所述CendR元件是否被內(nèi)化。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述細胞在一個測定中。
37.權(quán)利要求35或36的方法，其中所述CendR元件偶聯(lián)于一種蛋白或肽。
38.權(quán)利要求35-37任一項的方法，其中所述CendR元件為可活化的CendR元件。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述可活化的CendR元件為蛋白酶可活化的CendR元件。
40.權(quán)利要求35-39任一項的方法，其中所述蛋白或肽是環(huán)狀的。
41.權(quán)利要求35-40任一項的方法，其中所述可活化的CendR元件在暴露于所述細胞之前被活化。
42.權(quán)利要求35-37任一項的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
43.權(quán)利要求38-41任一項的方法，其中所述可活化的CendR元件為蛋白酶可活化的 CendR元件。
44.一種鑒定癌細胞作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包括(a)將所述癌細胞暴露于一個CendR元件；(b)確定所述CendR元件是否被所述癌細胞內(nèi)化，其中內(nèi)化的CendR元件將所述癌 細胞鑒定為基于CendR的療法的候選物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述細胞在一個測定中。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述細胞在受試者中。
47.權(quán)利要求44-46任一項的方法，其中所述CendR元件偶聯(lián)于一種蛋白或肽。
48.權(quán)利要求44-47任一項的方法，其中所述CendR元件為可活化的CendR元件。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述可活化的CendR元件為蛋白酶可活化的CendR元件。
50.權(quán)利要求48-49任一項的方法，其中所述蛋白或肽是環(huán)狀的。
51.權(quán)利要求48-47任一項的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
52.一種產(chǎn)生可活化的CendR元件的方法，所述可活化的CendR元件在接近目的細胞 時可以被活化，所述方法包括形成一個可活化的CendR元件，其中一個封閉基團經(jīng)可切 割鍵偶聯(lián)于一個CendR元件，其中所述可切割鍵可被存在于目的細胞附近的酶切割。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述細胞在受試者中。
54.權(quán)利要求52或53的方法，還包括在形成所述可活化的CendR元件之前鑒定存在 于目的細胞附近的酶。
55.權(quán)利要求52-54任一項的方法，還包括在形成所述可活化的CendR元件之前，基 于存在于目的細胞附近的酶選擇所述可切割鍵。
56.一種形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包 含一個CendR元件，(b)使一個封閉基團共價偶聯(lián)于所述CendR元件，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述 CendR元件的鍵是可切割的，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封閉基團可減少或 阻止細胞內(nèi)化和/或組織穿透，其中所述可活化的CendR元件包含所述選擇的氨基酸序列和所述封閉基團。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述CendR元件包含末端羧基，其中所述封閉基團偶 聯(lián)于所述末端羧基。
58.權(quán)利要求57的方法，所述方法還包括，在步驟(b)之前選擇可被存在于目的細胞 附近的蛋白酶切割的、偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基的鍵。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述封閉基團偶聯(lián)于所述CendR元件的C端氨基酸。
60.權(quán)利要求56的方法，其中所述封閉基團偶聯(lián)于所述CendR元件的C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
61.權(quán)利要求56-60任一項的方法，其中一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價締合于 一種包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于所述蛋 白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。
62.權(quán)利要求56-61任一項的方法，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化至細胞中。
63.權(quán)利要求56-61任一項的方法，其中所述氨基酸序列被選擇用于組織穿透。
64.權(quán)利要求56-61任一項的方法，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化至細胞中 和組織穿透。
65.權(quán)利要求56-62任一項的方法，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封閉基團 可減少或阻止細胞內(nèi)化。
66.權(quán)利要求56-61或63任一項的方法，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封 閉基團可減少或阻止組織穿透。
67.權(quán)利要求56-61或64任一項的方法，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封 閉基團可減少或阻止細胞內(nèi)化和組織穿透。
68.一種由包括如下步驟的方法制備的可活化的CendR元件(a)選擇一種氨基酸序列用于內(nèi)化至細胞中和/或穿透組織，其中所述氨基酸序列包 含一個CendR元件，(b)使一個封閉基團共價偶聯(lián)于所述CendR元件，其中偶聯(lián)所述封閉基團和所述 CendR元件的鍵是可切割的，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封閉基團可減少或 阻止細胞內(nèi)化和/或組織穿透，其中所述可活化的CendR元件包含所述選擇的氨基酸序列和所述封閉基團。
69.權(quán)利要求68的CendR元件，其中所述CendR元件包含末端羧基，其中所述封閉 基團偶聯(lián)于所述末端羧基。
70.權(quán)利要求69的CendR元件，其中所述方法還包括，在步驟(b)之前選擇可被存 在于目的細胞附近的蛋白酶切割的、偶聯(lián)所述封閉基團和所述末端羧基的鍵。
71.權(quán)利要求68的CendR元件，其中所述封閉基團偶聯(lián)于所述CendR元件的C端氨 基酸。
72.權(quán)利要求68的CendR元件，其中所述封閉基團偶聯(lián)于所述CendR元件的C端氨 基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
73.權(quán)利要求68-72任一項的CendR元件，其中一種運載組合物共價偶聯(lián)于或非共價 締合于一種包含所述選擇的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述運載組合物偶聯(lián)或締合于 所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端側(cè)。
74.權(quán)利要求68-73任一項的CendR元件，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化至 細胞中。
75.權(quán)利要求68-73任一項的CendR元件，其中所述氨基酸序列被選擇以用于組織穿透。
76.權(quán)利要求68-73任一項的CendR元件，其中所述氨基酸序列被選擇以用于內(nèi)化至 細胞中和組織穿透。
77.權(quán)利要求68-74任一項的CendR元件，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的所述封 閉基團可減少或阻止細胞內(nèi)化。
78.權(quán)利要求68-73或75任一項的CendR元件，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的 所述封閉基團可減少或阻止組織穿透。
79.權(quán)利要求任一項68-73或76的CendR元件，其中共價偶聯(lián)于所述CendR元件的 所述封閉基團可減少或阻止細胞內(nèi)化和組織穿透。
80.一種鑒定可以被CendR元件穿透的組織的方法，所述方法包括(a)將一種組織暴露于一個CendR元件，并且(b)確定所述CendR元件是否穿透所述組織。
81.一種鑒定腫瘤作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包括(a)將所述腫瘤暴露于一個CendR元件，并且(b)確定所述CendR元件是否穿透所述腫瘤，其中穿透的CendR元件將所述腫瘤鑒 定為基于CendR的療法的候選物。
82.一種鑒定腫瘤作為基于CendR的療法的候選物的方法，所述方法包括(a)將來自所述腫瘤的細胞暴露于一個CendR元件，并且(b)確定所述CendR元件是否被所述細胞內(nèi)化，其中內(nèi)化的CendR元件將所述腫瘤 鑒定為基于CendR的療法的候選物。
全文摘要
公開了用于將分子靶向和內(nèi)化至目的細胞以及用于分子穿透目的組織的組合物和方法。所述組合物和方法是基于可被細胞選擇性地內(nèi)化以及/或者可穿透組織的肽序列。所公開的內(nèi)化和組織穿透可用于將治療試劑和可檢測試劑遞送至目的細胞和組織。
文檔編號C12P21/04GK102016058SQ200980114056
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日
發(fā)明者E·羅斯拉赫蒂, T·特薩魯, 菅原一樹 申請人:伯納姆醫(yī)學研究所