專利名稱：惡性黑色素瘤的分子診斷和分類的制作方法
惡性黑色素瘤的分子診斷和分類
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背景技術(shù)：
黑素瘤是美國第五大常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率的上升比任何其它癌癥都更為迅 速。目前約七十分之一的美國人預(yù)計在其一生中會患上黑素瘤。黑素瘤是一種黑素細胞 (色素細胞)的惡性腫瘤。盡管大多數(shù)黑素瘤在皮膚中出現(xiàn)，但是該癌癥也可在粘膜表面或 者神經(jīng)脊細胞遷移到的其它部位出現(xiàn)。沒有傳播超出其原發(fā)部位的黑素瘤是完全可以醫(yī)治 的，因為這些早期形式是未侵襲超出乳頭狀真皮的薄病變。對這些早期局限性黑素瘤的治 療是手術(shù)切除，其邊緣與原發(fā)性病變的細微分級成正比。一些傳播到區(qū)域淋巴結(jié)的黑素瘤 可通過廣泛切除原發(fā)瘤并摘除所涉及的區(qū)域淋巴結(jié)來治療。相比之下，更晚期形式的黑素 瘤由于轉(zhuǎn)移而具有高致死風險。當發(fā)生轉(zhuǎn)移時，癌細胞可通過淋巴結(jié)傳播到遠處部位，例如 肝、肺或腦。該疾病晚期患者的預(yù)后很差，平均存活6至10個月。
醫(yī)治早期形式黑素瘤的能力及其向不可醫(yī)治的轉(zhuǎn)移性形式的快速轉(zhuǎn)變，二者的結(jié) 合決定了需要用于該疾病早期檢測的更準確診斷方法以及用作疾病發(fā)展預(yù)后的更好標志 物，以提供更確定的醫(yī)學治療策略。使得基于精確診斷和預(yù)后來設(shè)計合適治療策略的問題 更加復(fù)雜的是，醫(yī)生發(fā)現(xiàn)黑素瘤經(jīng)常顯示出不可預(yù)知的臨床行為。例如，原發(fā)腫瘤的垂直厚 度是決定存活的最重要的預(yù)后因素之一，但是許多具有厚黑素瘤的患者不發(fā)生轉(zhuǎn)移，而一 小部分具有薄腫瘤的患者卻因該病而死。因此，需要改進的標志物來改進預(yù)后算法，用于新 診斷的黑素瘤患者。盡管研究了很多，但是尚沒有分子因子常規(guī)用于黑素瘤患者的診斷和 預(yù)后評價。這些生物標志物會提供早期黑素瘤檢測的新方法，并且會構(gòu)成黑素瘤風險評估 的靶標以及新藥開發(fā)的靶標。本發(fā)明的方法和組合物提供了這些針對黑素瘤患者的額外工 具。發(fā)明內(nèi)容
總體而言，本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)了檢測下列標志物在黑素瘤診斷或者提供其預(yù)后中 的特別用途NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白，pleckstrin homology domain interacting protein)、骨橋蛋白(osteopontin, SPP1)、WIF1、ARPC2、 GlP3/IFNa誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2相關(guān)蛋白Al、RGS1、纖連蛋白1 (FNl)和/或P0U5Fl/0ct3/4，其在黑素瘤細胞中差異性表達(上調(diào)或下調(diào))，并與黑素瘤發(fā)展相關(guān)。因 此，這些標志物可用于診斷性地區(qū)分黑素瘤和良性痣。它們也可用于預(yù)后，以確定總存活概 率、SLN狀況、無復(fù)發(fā)存活率以及疾病特定存活率。所述標志物可單獨或組合使用。在一個 實施方案中，Wnt-2、ARPC2、SPP1、RGS1和FNl用于五標志物診斷測定，以分辨良性痣與黑素 瘤。在另一個實施方案中，NC0A3和SPP1，以及NC0A3、SPPl和RGSl用于兩標志物或三標 志物預(yù)后測定，以確定總體存活概率、SLN狀況、無復(fù)發(fā)存活率以及疾病特定存活率。在又 一個實施方案中^1 ^2、？附(^3、1 31、3 1和1附2用于黑素瘤的六標志物診斷測定。 在另一個實施方案中，RGS1、NC0A3、SPP1和PHIP用于黑素瘤的四標志物預(yù)后測定。
本發(fā)明提供了包含用于檢測一種或多種標志物之試劑的診斷和預(yù)后試劑盒。本 發(fā)明還提供了鑒定能夠通過調(diào)節(jié)下列標志物預(yù)防或治療黑素瘤發(fā)展之化合物的方法，所 述標志物即NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白 (SPPl)、WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連 蛋白1或P0U5Fl/0ct3/4。最后，提供了治療方法，其中使用特異性結(jié)合下列一種或多種標 志物的siRNA分子治療黑素瘤，所述標志物即NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié) 構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα誘導(dǎo)蛋白、MIPl a ,Bfll/ Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 或 P0U5Fl/0ct3/4。
在第一個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤的方法，其如下進行將來 自對象的生物樣品與特異性結(jié)合選自以下的多肽標志物的一種或多種試劑相接觸NC0A3、 fet-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 或 P0U5F1/ 0ct3/4，或者與一種或多種特異性結(jié)合選自下列的核酸標志物的試劑相接觸NC0A3、 fet-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 或 P0U5F1/ 0ct3/4，然后測定一種或多種標志物是否在樣品中差異性表達，從而提供對黑素瘤的診斷。 在本實施方案的一個方面中，該方法包括測定樣品中兩種或更多種標志物是否差異性表 達，其中所述標志物獨立選擇。在該實施方案的另一個方面中，所述試劑可以抗體，其可 以是單克隆抗體。在該實施方案的另一個方面中，所述試劑可以是核酸，包括寡核苷酸或 RT-PCR引物組。在該實施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原發(fā)黑素瘤或轉(zhuǎn)移黑素瘤， 所述樣品可以是皮膚活檢。在該實施方案的另一些方面中，該診斷區(qū)分良性痣與惡性黑素 瘤。在該實施方案的一個具體方面中，所述標志物是Wnt-2。在一些形式中，測定的步驟可 使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在其它一些形式中，測定的步驟可 使用FISH或CGH進行。
在第二個實施方案中，本發(fā)明提供了一種提供對象中黑素瘤預(yù)后的方法，其如下 進行將來自對象的生物樣品與一種或多種特異性結(jié)合選自下列的多肽標志物的試劑相接 觸NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、 WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1或P0U5Fl/0ct3/4，或者與一種或多種特異性結(jié)合選自下列的核酸標志物的試劑相接 觸NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、 WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a ,Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 或5P0U5Fl/0ct3/4，然后測定樣品中標志物是否差異性表達，由此提供對黑素瘤的預(yù)后。在本 實施方案的一個方面中，該方法包括測定樣品中兩種或更多種標志物是否差異表達，其中 所述標志物獨立選擇。在該實施方案的另一個方面中，所述試劑可以抗體，其可以是單克隆 抗體。在該實施方案的另一個方面中，所述試劑可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物 組。在該實施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原發(fā)黑素瘤或轉(zhuǎn)移黑素瘤，所述樣品可 以是皮膚活檢。在該實施方案的另一些方面中，所述預(yù)后可以轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)、復(fù)發(fā)或死 亡。在該實施方案的一個具體方面中，標志物是NC0A3。在一些形式中，測定的步驟可使用 酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用 FISH或CGH進行。
在第三個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定預(yù)防或治療黑素瘤發(fā)展之化合物的方 法，其如下進行將化合物與含有表達下列標志物之細胞的樣品相接觸NC0A3、Wnt-2、 PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/ IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 或 P0U5Fl/0ct3/4，然 后測定該化合物對標志物的功能性作用，由此鑒定預(yù)防或治療黑素瘤的化合物。在本實施 方案的一些方面中，該方法包括測定化合物對兩種或更多種標志物的功能性作用，其中所 述標志物各自獨立選擇。在該實施方案的多個方面中，所述化合物可以是小分子、siRNA、核 酶或抗體，其可以是單克隆抗體。在該實施方案的一些方面中，所述黑素瘤是原發(fā)黑素瘤或 轉(zhuǎn)移黑素瘤。
在第四個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法，其 如下進行(a)將來自該對象的生物樣品與特異性結(jié)合多肽或核酸標志物的試劑相接觸， 所述標志物為Wnt-2、骨橋蛋白、ARPC2、RGSl和纖連蛋白1的標志物，然后測定所述標志物 是否在該對象中差異性表達，由此提供對黑素瘤的診斷或預(yù)后。在一些方面中，所述方法 還包括檢測多肽或核酸標志物，包括PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、 WIFl、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2相關(guān)蛋白 Al、或P0U5Fl/0ct3/4 的標志物。 在一些形式中，測定的步驟可以使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在 其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第五個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法，其 如下進行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合選自Wnt-2、骨橋蛋白、ARPC2、RGSl或 纖連蛋白1標志物的兩種或更多種多肽或核酸標志物的試劑相接觸，然后測定所述標志物 是否在該對象中差異性表達(其中所述標志物各自獨立選擇)，由此提供對黑素瘤的診斷 或預(yù)后。在該實施方案的一些方面中，所述試劑結(jié)合下列多肽標志物Wnt-2、骨橋蛋白、 ARPC2、RGS1和纖連蛋白1。在該實施方案的另一些方面中，所述試劑結(jié)合多肽標志物骨橋 蛋白、NC0A3和RGS1。在最后這一方面的多個形式中，所述方法還包括檢測Wnt-2、PHIP (普 列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα誘 導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl-2相關(guān)蛋白Al、纖連蛋白1或P0U5Fl/0ct3/4的多肽或核酸標 志物。在一些形式中，測定的步驟可以使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測 定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第六個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法，其 如下進行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合骨橋蛋白、NC0A3和RGSl多肽或核酸標志物的試劑相接觸，然后測定所述標志物是否在該對象中差異性表達，由此提供對黑素 瘤的診斷或預(yù)后。在該實施方案的一個方面中，所述方法還包括檢測多肽或核酸標志物，包 括^^-2、？!11 (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa誘 導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2相關(guān)蛋白Al、纖連蛋白1和P0U5Fl/0ct3/4的標志物。在一些 形式中，測定的步驟可使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在其它一些 形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第七個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法，其 如下進行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合兩種或更多種多肽或核酸標志物的試 劑相接觸，所述兩種或更多種標志物為骨橋蛋白、NC0A3或RGSl的標志物，其中標志物各自 獨立選擇，然后測定所述標志物是否在該對象中差異性表達，由此提供對黑素瘤的診斷或 預(yù)后。在該實施方案的一個方面中，所述試劑特異性結(jié)合骨橋蛋白和NC0A3的多肽或核酸 標志物。在一些形式中，測定的步驟可使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測 定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第八個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的試劑 盒。該試劑盒可包含第一容器和第二容器，所述第一容器包含特異性結(jié)合多肽或核酸標志 物的第一試劑，所述標志物可以是NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作 用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl-2 相關(guān) 蛋白A1、RGS1、纖連蛋白1或P0U5Fl/0ct3/4的標志物，所述第二容器包含特異性結(jié)合多肽 或核酸標志物的第二試劑，所述標志物可以是NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié) 構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα誘導(dǎo)蛋白、MIPl α ,Bfll/ Bcl-2相關(guān)蛋白Al、RGS1、纖連蛋白1或P0U5Fl/0ct3/4的標志物，其中第二試劑與第一試 劑結(jié)合不同的標志物。在該實施方案的一個具體方面中，第一試劑特異性結(jié)合NC0A3標志 物，第二試劑結(jié)合骨橋蛋白標志物。在該實施方案的另一個方面中，第一和第二試劑特異性 結(jié)合Wnt-2、骨橋蛋白、ARPC2、RGS1或纖連蛋白1的多肽或核酸標志物，其中第二試劑結(jié)合 與第一試劑結(jié)合不同的標志物。所述試劑盒還可含有用于使用酶免疫測定例如ELISA或免 疫組織化學測定進行檢測的其他試劑。在其他一些形式中，所述試劑盒還可含有另外的用 于使用FISH或CGH進行檢測的試劑。
在第九個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法，其 如下進行(a)向?qū)ο笫┯锰禺愋越Y(jié)合多肽或核酸標志物的試劑，所述標志物為NC0A3、 Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白、WIF1、ARPC2、G1P3/ IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 或者 P0U5Fl/0ct3/4 的標志物，然后測定所述標志物是否在該對象中差異性表達，由此提供對黑素瘤的診斷或 預(yù)后。在本實施方案的一些方面中，該方法包括測定兩種或更多種標志物是否在該樣品中 差異表達，其中所述標志物獨立選擇。在一些方面中，診斷或提供預(yù)后的方法包括用抗體試 劑進行體內(nèi)成像，所述抗體可以是單克隆抗體。也可使用其他成像劑例如適配體(aptamer) 和鏡像體(speiglmer)。
在第十個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤的方法，其如下進行(a) 將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合生物樣品中一種或多種選定標志物的一種或多種試 劑相接觸，其中所述標志物包括(i)Wnt-2、NC0A3、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl-2 相 關(guān)蛋白A1、RGS1、纖連蛋白1和P0U5Fl/0ct3/4的多肽或者(ii)編碼這些多肽的核酸；然后 (b)測定所述標志物是否在該樣品中過表達或低表達，由此提供對該對象中黑素瘤的診斷。 該方法也可包括下列步驟將標志物表達的升高與樣品中細胞的轉(zhuǎn)移性表型相關(guān)聯(lián)。在該 實施方案的多個方面中，所述試劑可以是抗體、核酸或RT-PCR引物組。在另一些方面中，樣 品是皮膚活檢。在該實施方案的另一個方面中，至少一種標志物選自Wnt-2、NC0A3、PHIP、 ARPC2、RGS1和纖連蛋白1的多肽或者編碼這些多肽的核酸。在另一些方面，所述診斷區(qū)分 良性痣與惡性黑素瘤。在一些形式中，測定的步驟可以使用酶免疫測定進行，例如ELISA或 免疫組織化學測定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第十一個實施方案中，本發(fā)明提供了提供對象中黑素瘤預(yù)后的方法，其如下進 行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合生物樣品中一種或多種選定標志物的一種或 多種試劑相接觸，其中所述標志物包括(i)Wnt-2、NC0A3、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu) 域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/ Bcl-2相關(guān)蛋白Al、RGS1、纖連蛋白1和P0U5Fl/0ct3/4的多肽或者(ii)編碼這些多肽的 核酸；以及(b)測定所述標志物是否在樣品中過表達或低表達，由此提供該對象中黑素瘤 的預(yù)后。在該實施方案的多個方面中，所述試劑可以是抗體、核酸或RT-PCR引物組。在另 一些方面中，樣品是皮膚活檢。在該實施方案的另一個方面中，至少一種標志物選自NC0A3、 骨橋蛋白和RGSl的多肽或者編碼這些多肽的核酸。在該實施方案的另一些方面中，所述一 種或多種所選標志物的表達升高與可包括轉(zhuǎn)移到區(qū)域淋巴結(jié)、復(fù)發(fā)和死亡的預(yù)后相關(guān)。在 一些形式中，測定的步驟可以使用酶兔疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在其 它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第十二個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法， 其通過下列方式進行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合樣品中不同選定標志物的 兩種或更多種試劑相接觸，其中所述標志物包括(i)Wnt-2、骨橋蛋白、ARPC2、RGSl和纖連 蛋白1的多肽或者(ii)編碼所述多肽的核酸，其中標志物各自獨立選擇，以及(b)測定所 選標志物是否在該樣品中過表達或者低表達，由此診斷對象中的黑素瘤或者提供其預(yù)后。 在該實施方案的一個方面中，所述試劑特異性結(jié)合多肽標志物Wnt-2、骨橋蛋白、ARPC2、 RGSl和纖連蛋白1或者編碼這些多肽的核酸標志物。在一些形式中，測定的步驟可以使用 酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用 FISH或CGH進行。
在第十三個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法， 其如下進行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合樣品中選定多肽或核酸標志物的試 劑相接觸，其中所述標志物為骨橋蛋白、NC0A3和RGS1，以及(b)測定所選標志物是否在該 樣品中過表達或低表達，由此診斷對象中的黑素瘤或者提供其預(yù)后。所述方法還可包括檢 測多肽或核酸標志物的步驟，包括Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋 白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、纖連蛋白1和P0U5Fl/0ct3/4的標志物。在一些形式中，測定的步驟可使用酶免疫測定 進行，例如ELISA或免疫組織化學測定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH 進行。8
在第十四個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的方法， 其如下進行(a)將來自對象的生物樣品與特異性結(jié)合樣品中不同選定標志物的兩種或更 多種試劑相接觸，其中所述標志物包括⑴骨橋蛋白、NC0A3和RGSl的多肽或者(ii)編碼 所述多肽的核酸；其中標志物各自獨立選擇；以及(b)測定所選標志物是否在該樣品中過 表達或者低表達，由此診斷對象中的黑素瘤或者提供其預(yù)后。在該實施方案的一個方面中， 所述試劑特異性結(jié)合骨橋蛋白和NC0A3的多肽標志物或者編碼骨橋蛋白和NC0A3的核酸 標志物。在一些形式中，測定的步驟可使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測 定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第十五個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷對象中黑素瘤或提供其預(yù)后的 試劑盒，其中所述試劑盒含有(a)特異性結(jié)合選自下列的多肽或核酸標志物的第一試 劑Wnt-2、NC0A3、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、 WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 和 P0U5Fl/0ct3/4 ；，和(b)特異性結(jié)合選自下列的多肽或核酸標志物的第二試劑Wnt-2、 NC0A3、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 和 P0U5F1/ 0ct3/4，其中第二試劑結(jié)合與第一試劑結(jié)合不同的標志物。在該實施方案的一個方面中，第 一試劑特異性結(jié)合包括^^-2、NC0A3、PHIP、ARPC2、RGSl或纖連蛋白1的多肽在內(nèi)的標志 物，或者第一試劑特異性結(jié)合包括NC0A3、骨橋蛋白和RGSl的多肽在內(nèi)的標志物。所述試劑 盒還可含有通過使用酶免疫測定例如ELISA或免疫組織化學測定進行檢測的其他試劑。在 其他一些形式中，所述試劑盒還可含有另外的用于使用FISH或CGH進行檢測的試劑。
在第十六個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤或者提供其預(yù)后的方 法，其如下進行(a)向?qū)ο笫┯锰禺愋越Y(jié)合對象中一種或多種選定標志物的一種或多種 試劑，所述標志物包括(i)Wnt-2、NC0A3、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋 白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白1和P0U5Fl/0ct3/4的多肽，或者(ii)編碼所述多肽的核酸，然后(b) 測定所述標志物是否在該對象中過表達或低表達，從而提供黑素瘤的診斷或預(yù)后。
在第十七個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定預(yù)防或治療黑素瘤發(fā)展的化合物的 方法，其如下進行(a)將化合物與樣品相接觸，所述樣品包含表達選自以下之標志物的細 胞Wnt-2、NC0A3、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、 WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 或 P0U5Fl/0ct3/4，和(b)測定該化合物對所述標志物的功能性作用，從而鑒定預(yù)防或治療黑 素瘤的化合物。在本實施方案的一個方面中，鑒定化合物的方法包括測定化合物對兩種或 更多種標志物的功能性作用，其中標志物各自獨立選擇。
在第十八個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤的方法，其如下進行將 來自對象的生物樣品與各自特異性結(jié)合生物樣品中至少一種選定標志物的試劑相接觸，所 述選定標志物包括(i)ARPC2、FNl、NC0A3、RGSl、骨橋蛋白(SPPl)和WNT2的多肽，或者 (ii)編碼所述多肽的核酸，其中每種標志物有至少一種試劑與其結(jié)合，以及(b)測定所選 標志物是否在該生物樣品中過表達或者低表達，由此提供對象中的黑素瘤診斷。在該實施 方案的一個方面中，所述試劑可以是抗體，其可以是單克隆抗體。在一些方面中，所述抗體可以是帶標記的。在該實施方案的另一個方面中，所述試劑可以是核酸，包括寡核苷酸或 RT-PCR引物組。在該實施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原發(fā)黑素瘤或轉(zhuǎn)移黑素瘤， 所述樣品可以是皮膚活檢。在該實施方案的另一些方面中，所述診斷區(qū)分良性痣與惡性黑 素瘤。在一些方面中，進行測定，其將所選標志物的表達提高與樣品中細胞的轉(zhuǎn)移性表型相 關(guān)聯(lián)。在一些形式中，測定的步驟可以使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免疫組織化學測 定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第十九實個施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷對象中黑素瘤的試劑盒，所述試 劑盒包含各與生物樣品中至少一種選定標志物特異性結(jié)合的試劑，所述選定標志物包括: ⑴ARPC2、FNU NC0A3、RGS1、骨橋蛋白(SPPl)和WNT2的多肽，或者(ii)編碼所述多肽的 核酸，其中每種標志物有至少一種試劑與其結(jié)合。在該實施方案的一個方面中，所述試劑可 以是抗體，其可以是單克隆抗體。在一些方面中，所述抗體可以是帶標記的。在該實施方案 的另一個方面中，所述試劑可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物組。所述試劑盒還可 含有用于使用酶免疫測定例如ELISA或免疫組織化學測定進行檢測的其他試劑。在其他一 些形式中，所述試劑盒還可含有用于使用FISH或CGH進行檢測的其他試劑。
在第二十個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷對象中黑素瘤的方法，所述方法包括 下列步驟(a)向?qū)ο笫┯酶髯蕴禺愋越Y(jié)合對象中至少一種選定標志物的試劑，所述選定 標志物包括(i)ARPC2、FNI、NCOA3、RGS1、骨橋蛋白(SPPl)和WNT2的多肽，或者(ii)編碼 所述多肽的核酸，其中每種標志物有至少一種試劑與其結(jié)合，以及(b)測定所選標志物是 否在該生物樣品中過表達或者低表達，由此提供黑素瘤的診斷。在該實施方案的一個方面 中，所述試劑可以是抗體，其可以是單克隆抗體。在該實施方案的另一個方面中，所述抗體 可以是帶標記的。
在第二十一個實施方案中，本發(fā)明提供了提供對象中黑素瘤預(yù)后的方法，其通過 下列方式進行(a)將來自對象的生物樣品與各自特異性結(jié)合生物樣品中至少一種選定標 志物的試劑相接觸，所述選定標志物包括(i)RGSl、NC0A3、骨橋蛋白(SPPl)和PHIP的多 肽，或(ii)編碼所述多肽的核酸，其中每種標志物有至少一種試劑與其結(jié)合，以及(b)測定 所選標志物是否在該生物樣品中過表達或低表達，由此提供對象中黑素瘤的診斷。在該實 施方案的一個方面中，所述試劑可以是抗體，其可以是單克隆抗體。在一些方面中，所述抗 體可以是帶標記的。在該實施方案的另一個方面中，所述試劑可以是核酸，包括寡核苷酸或 RT-PCR引物組。在該實施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原發(fā)黑素瘤或轉(zhuǎn)移黑素瘤， 所述樣品可以是皮膚活檢。在該實施方案的另一些方面中，所述預(yù)后可以是轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋 巴結(jié)、復(fù)發(fā)或死亡。在一些形式中，測定的步驟可以使用酶免疫測定進行，例如ELISA或免 疫組織化學測定。在其它一些形式中，測定的步驟可使用FISH或CGH進行。
在第二十二個實施方案中，本發(fā)明提供了提供對象中黑素瘤預(yù)后的試劑盒，所述 試劑盒包含各自與生物樣品中至少一種所選標志物特異性結(jié)合的試劑，所選標志物包括: (i)RGSl、NC0A3、骨橋蛋白(SPPl)和PHIP的多肽，或者(ii)編碼所述多肽的核酸，其中每 種標志物有至少一種試劑與其結(jié)合。在該實施方案的一個方面中，所述試劑可以抗體，其可 以是單克隆抗體。在一些方面中，所述抗體可以是帶標記的。在該實施方案的另一個方面 中，所述試劑可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物組。所述試劑盒還可含有用于使用 酶免疫測定例如ELISA或免疫組織化學測定進行檢測的其他試劑。在其他一些形式中，所述試劑盒還可含有用于使用FISH或CGH進行檢測的其他試劑。


圖1 原發(fā)黑素瘤的顯微照片，其顯示無NC0A3免疫染色(A圖)和強NC0A3免疫 染色(B圖)。
圖2 根據(jù)NC0A3表達水平的無復(fù)發(fā)存活(relapse free survival, RFS) (Α圖) 及疾病特定存活(disease specific survival, DSS) (B 圖)的 Kaplan-Meier 分析。
圖3 上圖，促結(jié)締組織增生性黑素瘤中的NC0A3免疫染色。注意紡錘狀細胞的棕 色染色。下圖，來自同一患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的NC0A3免疫染色。注意中央腫瘤細胞的彌 散性染色。
圖4 靶向小鼠NC0A3的核酶(Rz)及siRNA的抗轉(zhuǎn)移活性。將B16-F10黑素瘤細 胞靜脈注射進10只C57B1/6小鼠的組。在注射后第3和10天，靜脈注射陽離子脂質(zhì)編碼 對照載體序列的DNA復(fù)合物或者靶向小鼠NC0A3RNA不同位點的兩種核酶和siRNA。在第 25天處死小鼠，分析轉(zhuǎn)移肺腫瘤的個數(shù)。與僅有對照載體相比，所有四種構(gòu)建體都 顯示轉(zhuǎn)移腫瘤負荷顯著降低(P < 0. 05)。
圖5 用多種抗NC0A3或?qū)φ諛?gòu)建體處理的有腫瘤小鼠的肺重量。實驗細節(jié)與圖4 所述的相同。
圖6 靶向NC0A3的核酶397 (Rz)針對小鼠乳腺癌的抗轉(zhuǎn)移活性。將4T1乳腺癌 細胞靜脈注射到10只BALB/c小鼠的組。在注射的第3和10天，靜脈注射陽離子脂質(zhì)編 碼對照載體序列、Rz397、siRNA385以及在核酶(m_Rz397)或siRNA (m_siRNA385)中含單堿 基突變的突變體對照的DNA復(fù)合物。在第25天處死小鼠，分析轉(zhuǎn)移肺腫瘤的個數(shù)。Rz397 處理的小鼠具有比siRNA385、m-Rz397或者僅對照載體處理的小鼠明顯更少的肺腫瘤。
圖7 靶向NC0A3在體外抑制了腫瘤細胞侵襲。用僅載體或者表達靶向小鼠NC0A3 的Rzs397的載體或siRNA385轉(zhuǎn)染B16細胞，使用Boyden腔室測定在轉(zhuǎn)染后M小時測定 侵襲。
圖8 復(fù)合黑素細胞痣中Wnt-2免疫染色的低倍(40x，A圖)和高倍(100x，B圖) 顯微照片，顯示表皮內(nèi)痣巢中強烈染色，表皮下和真皮巢中染色減少。
圖9:原發(fā)黑素瘤Imm厚，克拉克IV級)中免疫染色的低倍0OX，A圖) 和高倍(100X，B圖)顯微照片，其顯示強染色的表皮內(nèi)黑素瘤簇侵入真皮中。
圖10 靶向小鼠Wnt-2的核酶(Mo_Wnt2-Rz879)的抗轉(zhuǎn)移活性。將B16-F10黑素 瘤細胞靜脈注射進10只C57B1/6小鼠中。在注射后第7天，靜脈注射陽離子脂質(zhì)編碼對 照載體序列或者靶向不同小鼠Wnt-2RNA的核酶的DNA復(fù)合物。在第25天處死小鼠，分析 轉(zhuǎn)移肺腫瘤的個數(shù)。與僅對照載體相比，抗Wnt-2核酶顯示轉(zhuǎn)移腫瘤負荷顯著降低 (P = 0. 0006)。
圖11 痣中出現(xiàn)的原發(fā)黑素瘤中Wnt-2免疫染色的低倍0Ox，A圖)和高倍(100x， B圖)顯微照片，顯示連接和真皮組分中黑素瘤(M)強染色，其下真皮先天性痣(N)中無染 色。
圖12 靶向小鼠PHIP的核酶(Rz)和siRNA的抗轉(zhuǎn)移活性。將B16-F10黑素瘤細 胞靜脈注射進10只C57B1/6小鼠中。在注射后第3和10天，靜脈注射陽離子脂質(zhì)編碼對照載體序列或者靶向小鼠PHIP RNA不同位點的三種核酶和siRNA的DNA復(fù)合物。在第 25天處死小鼠，分析轉(zhuǎn)移肺腫瘤的個數(shù)。與僅對照載體相比，兩種核酶(Rzl22和 Rz314)以及一種siRNA(siRNA72;3)構(gòu)建體顯示轉(zhuǎn)移腫瘤負荷顯著降低(P < 0. 05)。
圖13 靶向PHIP在體外抑制了腫瘤細胞侵襲。用表達靶向小鼠PHIP的Rzs314 或siRNA385的載體轉(zhuǎn)染B16細胞，使用Boyden腔室測定在轉(zhuǎn)染后M小時測定侵襲。與失 活突變體核酶(mRz314)相比，Rz314顯著抑制B16的侵襲，與幾種對照無活性siRNA相比， siRNA723顯著抑制B16的侵襲。
圖14 通過熒光原位雜交(FISH)確定黑素瘤中NC0A3基因的拷貝數(shù)。
圖15 使用全部五種標志物的組合標志物強度得分進行的多標志物測定的黑素 瘤診斷ROC曲線。
圖16 將標志物強度得分與頂部-底部差異相結(jié)合的用于訓(xùn)練組和驗證組的診斷 算法。對于算法中的每個診斷陳述，包含了訓(xùn)練組中正確和不正確觀察結(jié)果的數(shù)目。
圖 17A-E 良性痣中 ARPC2 (A 圖)、FN1 (B 圖),RGSl (C 圖),SPPl (D 圖)禾口 WNT2 (E 圖)免疫染色的代表性顯微照片。
圖 18A-E 黑素瘤中 ARPC2 (A 圖)、FN1 (B 圖),RGSl (C 圖),SPPl (D 圖)禾口 WNT2 (E 圖)免疫染色的代表性顯微照片。
圖19 使用單獨一個標志物(FNl)、三種標志物(FN1、ARPC2、SPP1)和全部五種標 志物的黑素瘤診斷中的ROC曲線。
圖20A-E 與痣相關(guān)而出現(xiàn)的黑素瘤中ARPC2 (A圖)、FNl (B圖)、RGSl (C圖)、 SPPl (D圖)和WNT2 (E圖)免疫染色的代表性顯微照片，其中M代表黑素瘤，N代表痣。
圖21A-E:由五種標志物每一種正確診斷的誤診黑素細胞贅生物的免疫染色。A) 具有起初被診斷為良性痣的0. 76mm厚、克拉克III級非潰爛黑素瘤的44歲女性中的ARPC2 染色；B)具有發(fā)育異常痣的四歲女性中的FNl染色，其最初診斷為0. 25mm、克拉克II級黑 素瘤；C)具有最初診斷為非典型性表皮內(nèi)黑素細胞增生的病變的第IV期轉(zhuǎn)移黑素瘤的31 歲女性中RGSl的染色；D)具有0. 8mm、克拉克4級非潰爛型促結(jié)締組織增生性黑素瘤的46 歲男性中的SPPl染色，其最初診斷為Spitz痣；E)具有0. 76mm、克拉克III級非潰爛型黑 素瘤的44歲女性中的WNT2染色，其最初診斷為良性痣。
圖22 用于六基因黑素瘤診斷測定的使用頂部-底部得分差異的診斷算法。
圖23 用于六基因黑素瘤診斷測定的使用染色強度得分和頂部-底部差異的診斷算法。
發(fā)明詳述
簡介
盡管研究得很多，但是尚沒有常規(guī)用于黑素瘤患者診斷和預(yù)后評價的分子標志 物。開發(fā)這些標志物的先決條件是了解黑素瘤細胞中差異表達的基因。
我們確定了 Wnt-2、NC0A3、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨 橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、 纖連蛋白1和P0U5Fl/0ct3/4在黑素瘤中顯示差異表達。
如下文詳細描述地，這些基因顯示獨特的表達模式，其是黑素瘤發(fā)展的不同方面 的特征，因此可用于診斷和預(yù)后該癌癥的不同階段。例如，我們的數(shù)據(jù)顯示，NC0A3是黑素瘤轉(zhuǎn)移到區(qū)域淋巴結(jié)、疾病復(fù)發(fā)和死亡的良好指示物，而Wnt-2可以作為良性痣相對于惡 性黑素瘤的診斷標志物。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，相比于良性痣，SPPl在黑素瘤中過表達。 我們的數(shù)據(jù)還顯示，NC0A3可用作會轉(zhuǎn)移到區(qū)域淋巴結(jié)的一部分促結(jié)締組織增生性黑素瘤 的預(yù)測物。這些結(jié)果顯示，本發(fā)明公開的標志物可單獨或組合用于為醫(yī)生提供更確定的診 斷和預(yù)后工具。
另外，這些基因編碼的蛋白質(zhì)在黑素瘤中差異表達。
因此，本發(fā)明提供了基于黑素瘤細胞中NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同 源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFN α誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、 Bfl l/Bcl-2相關(guān)蛋白Al、RGS1、纖連蛋白1和/或P0U5Fl/0ct3/4的差異表達來進行黑素瘤 診斷和預(yù)后評價的方法。所述標志物可單獨使用，或以兩種或更多種的組合使用，或者作為 標志物組使用。在一個實施方案中，基于々1 ^2、？附(^3、1 51、骨橋蛋白(SPPl)和WNT2 的差異表達的六標志物測定用于診斷黑素瘤。在另一個實施方案中，基于RGS1、NC0A3、骨 橋蛋白(SPPl)和PHIP的差異表達的四標志物測定用于提供黑素瘤的預(yù)后。本發(fā)明還提供 了用于黑素瘤診斷或預(yù)后的試劑盒，其包含一種或多種檢測所述標志物的試劑。本發(fā)明還 提供用于治療黑素瘤的治療性siRNA，其與一種或多種所述標志物的序列互補。
定義
黑素瘤是開始于黑素細胞(一種產(chǎn)生色素的細胞)中的一種癌癥。盡管常見于 皮膚，但是黑素瘤也可發(fā)生于眼睛，并罕見地發(fā)生于鼻部通道、口、咽粘膜、陰道及肛門粘膜 的膜中。美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)設(shè)計了一種根據(jù)病理標準和存活率將黑素瘤分為4 個階段(具有許多亞階段)的體系。黑素瘤可源于皮膚上的痣或良性痣，并通過由AJCC 分級體系所定義的階段發(fā)展。更多背景參見例如Harrison' s Principles oflnternal Medicine, Kasper 等，第 16 版，2005。
術(shù)語“標志物”表示與正常細胞相比，在癌細胞的細胞中表達、表面上表達或者被 癌細胞分泌的分子(通常為蛋白質(zhì)、核酸、糖或脂質(zhì))，其可用于診斷癌癥、提供預(yù)后。這些 標志物是差異表達的分子，例如相比于正常細胞，在黑素瘤或其他癌細胞中過表達或低表 達，例如，相比于正常細胞、痣或者原發(fā)癌癥(與轉(zhuǎn)移相比)1倍過表達/低表達、2倍過表達 /低表達、3倍過表達/低表達或更多。另外，標志物可以是癌細胞中不正確地合成的分子， 例如與正常細胞中表達的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。
標志物可單獨或與其他標志物組合使用，用于任何用途，例如黑素瘤的診斷或預(yù) 后，如本文所公開。
本文使用的“黑素瘤評價標志物”表示在黑素瘤細胞中差異表達的標志物，同樣地 表示多肽或者編碼多肽或多肽任何部分的核酸。
“生物樣品”包括組織(例如活檢和尸檢樣品)的切片，以及為組織學目的而取得 的冷凍切片。這些樣品包括皮膚樣品、粘膜表面樣品、血和血液級分或制品(例如血清、血 漿、血小板、紅血球等)、痰、淋巴和舌組織，培養(yǎng)細胞例如原代培養(yǎng)物、外植體和轉(zhuǎn)化細胞， 糞便、尿等。生物樣品通常得自真核生物，最優(yōu)選哺乳動物，例如靈長類如黑猩猩或人；牛； 狗；貓；嚙齒動物例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔。
“活檢”表示為診斷或預(yù)后評價而取出組織樣品的過程，也表示組織樣品本身。本 領(lǐng)域已知的任何活檢技術(shù)均可用于本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法。所應(yīng)用的活檢技術(shù)取決于待評價的組織類型(例如皮膚、粘膜表面等)，腫瘤的大小和類型(例如實體或懸浮，血液或腹 水)等因素。代表性活檢技術(shù)包括但不限于切除活檢、切取活檢、針吸活檢、手術(shù)活檢?！扒?除活檢”表示取出整個腫瘤塊及其周圍的少量正常組織邊緣?！扒腥』顧z”表示取出包含腫 瘤橫截直徑的組織楔塊。通過內(nèi)窺鏡或熒光鏡進行的診斷或預(yù)后可需要腫瘤塊的“空芯針 吸活檢”或者“細針穿刺活檢”，其通常含有來自腫瘤塊內(nèi)的細胞懸液?；顧z技術(shù)討論于例如 Harrison's Principles oflnternal Medicine,Kasper 等編輯，第 16 版，2005,第 70 章以 及整個第五部分。
術(shù)語“過表達”或“過表達的”可互換，表示與正常細胞、痣或原發(fā)癌相比，以可檢 測的更高水平轉(zhuǎn)錄或翻譯的蛋白質(zhì)或核酸(通常是在癌細胞中)。該術(shù)語包括與正常細胞 相比，由于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位(例如細胞器、細胞質(zhì)、細胞核、 細胞表面)以及RNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性而導(dǎo)致的過表達。可使用檢測mRNA(即RT_PCR、PCR、 雜交)或者蛋白質(zhì)(即ELISA、免疫組織化學技術(shù))的常規(guī)方法檢測過表達。過表達可以是 與正常細胞相比的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在某些情況 下，過表達是相比于正常細胞1倍、2倍、3倍、4倍或更高水平的轉(zhuǎn)錄或翻譯。過表達還可包 括與正常細胞中無表達相比，樣品細胞中的任何表達。
術(shù)語“低表達”或“低表達的”可互換，表示與正常細胞、痣或原發(fā)癌相比，以可檢 測的更低水平轉(zhuǎn)錄或翻譯的蛋白質(zhì)或核酸(通常是在癌細胞中)。該術(shù)語包括與正常細胞 相比，由于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位(例如細胞器、細胞質(zhì)、細胞核、 細胞表面)以及RNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性而導(dǎo)致的低表達。可使用檢測mRNA(即RTPCR、PCR、 雜交)或者蛋白質(zhì)(即ELISA、免疫組織化學技術(shù))的常規(guī)技術(shù)檢測低表達。低表達可以是 與正常細胞相比的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%等。在某些情況下， 低表達是相比于正常細胞1倍、2倍、3倍、4倍或更低水平的轉(zhuǎn)錄或翻譯。低表達還可包括 與正常細胞中任何表達相比，樣品細胞中無表達。
“治療性處理”和“癌癥治療”表示化學治療、激素治療、放射療法、免疫療法和生物 (靶向)治療。
本文中“治療有效量或劑量”或“足夠量或劑量”表示產(chǎn)生施用所要效果的劑量。 確切的劑量取決于治療目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用已知方法得知(參見例如Lieberman， Pharmaceutical Dosage Forms(1-3 卷，1992) ；Lloyd, The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ；Pickar, Dosage Calculations (1999)； 以 及 Remington :The Scienceand Practice of Pharmacy,第 20 片反，2003， Gennaro 編輯， Lippincott，Williams&Wilkins)。
在兩種或更多種核酸或多肽序列的情況下，術(shù)語“同一性”或百分比“同一性”表 示使用BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法采用如下所述缺省參數(shù)測定或者通過手工比對 和肉眼觀察(參見例如NCBI網(wǎng)頁http: //www, ncbi. ηlm. nih. rov/BLAST/,等等)時，相同 或者具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩種或更多種序列或子序列(即在比 較窗口或指定區(qū)域上以最高對應(yīng)性進行比較和比對時，在特定區(qū)域上約60%同一性，優(yōu)選 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更高同一性)。隨后，這些序列稱為具有“顯著同一性”。此定義也表示或者可應(yīng)用于測試 序列的互補序列。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有替換的那些。如下所述，優(yōu)選算法可補償缺口等。優(yōu)選地，同一性在長度至少約25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域 上存在，或者更優(yōu)選在長度為50-100個氨基酸或核苷酸長的區(qū)域上存在。
對于序列比較，通常將一個序列作為參考序列，用以比較測試序列。使用序列比較 算法時，將測試和參考序列輸入計算機，必要時指定子序列坐標，指定序列算法程序參數(shù)。 優(yōu)選地，可使用缺省程序參數(shù)，或者可指定其他參數(shù)。然后，根據(jù)序列參數(shù)，序列比較算法計 算測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性。
本文使用的“比較窗口，，包括對任何連續(xù)位置數(shù)的一個區(qū)段的提及，所述數(shù)目選自 20至600，通常約50至約200，更通常約100至約150，其中在兩個序列最佳比對后該序列可 與相同個數(shù)連續(xù)位置的參考序列比較。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域中公知的?？蛇M 行用于比較的序列最佳比對，例如通過Smith&Waterman，Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)的 局部同源算法，通過Needleman&Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比對算法，通 過 Pearson&Lipman，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA85 :2444(1988)的相似性檢索方法，通過這 些算法的計算機實施形式(GAP、BE STFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics軟件包 中，Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI),或者通過手工比對禾口肉目艮 觀察(參見例如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等編輯· 1987—2005， Wiley Interscience))。
適于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的優(yōu)選實例有BLAST和BLAST 2. 0 算法，其分別描述于 Altschul 等 Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul 等 J. Mol. Biol. 215 =403-410 (1990)。按照本文所述的參數(shù)，使用BLAST和BLAST 2. 0確定本 發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的百分比序列同一性。實施BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息 中心公開獲得(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中 長度W的短字節(jié)來鑒定高得分序列對(HSP)，其在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字節(jié)比對時 匹配或滿足某正值閾值得分Τ。T稱為鄰近字節(jié)得分閾值(Altschul等，見上文)。這些初 始鄰近字節(jié)名字用作引發(fā)檢索的種子，以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP。所述字節(jié)命中沿各 個序列雙向延伸，直到可提高累計比對得分。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(匹配殘基對的 獎分；總是> 0)和N(不匹配殘基的罰分；總是< 0)計算累計得分。對于氨基酸序列，使 用評分矩陣來計算累計得分。在下列情況時字節(jié)命中向各方向的延伸停止累計比對得分 比其最大實現(xiàn)值減少了數(shù)量X ；由于一個或多個負分殘基比對的積累，累計得分達到0或更 低；或者到達序列末端。BLAST算法參數(shù)的W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN 程序(對于核苷酸序列)缺省使用字長(W) 11，期望(E) 10，M = 5，N = -4以及比較兩條 鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序缺省使用字長3，期望(E) 10，以及BL0SUM62評分矩陣 (參見 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89 :10915(1989))比對(B)50，期望 (E) 10, M = 5, N = -4，以及比較兩條鏈。
“核酸”表示脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的多聚體，以及 其互補物。該術(shù)語涵蓋了含有已知核苷酸類似物或經(jīng)修飾主鏈殘基或鍵的核酸，它們?yōu)楹?成的、天然的以及非天然的，其具有與參照核酸相似的結(jié)合特性，并且其以與參照核苷酸相 似的方式代謝。這些類似物的實例包括而不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手 性甲基膦酸、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
"RNAi分子”或“SiRNA”表示形成雙鏈RNA的核酸，當siRNA與基因或靶基因在同一細胞中表達時，該雙鏈RNA具有降低或抑制所述基因或靶基因表達的能力。因此，“siRNA" 表示互補鏈形成的雙鏈RNA。SiRNA中雜交形成雙鏈分子的互補部分通常具有顯著或完 全的同一性。在一個實施方案中，SiRNA表示與靶基因具有顯著或完全同一性并形成雙鏈 siRNA的核酸。siRNA的序列可對應(yīng)于全長靶基因或者其子序列。通常，siRNA的長度為至 少約15-50核苷酸(例如，雙鏈siRNA中每個互補序列的長度為15-50個核苷酸，雙鏈siRNA 的長度為約15-50個堿基對，優(yōu)選約20-30個堿基核苷酸，優(yōu)選長度為約20-25個核苷酸， 例如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。
“反義”多核苷酸是與靶多核苷酸基本互補并能與所述靶多核苷酸特異性雜交的 多核苷酸。
核酶是能夠催化RNA的特異性切割的酶活性RNA分子。核酶分子的組成優(yōu)選包 含一個或多個與靶mRNA互補的序列，以及負責mRNA切割的公知催化序列或功能等同序列 (參見例如美國專利No. 5，093，M6，其通過引用以整體并入本文)。設(shè)計用于催化切割靶 mRNA轉(zhuǎn)錄本的核酶分子也可用于阻止對象靶mRNA的翻譯。
除非另外指明，否則特定核酸序列還暗示涵蓋其保守修飾的變體(例如簡并密 碼子替換)和互補序列，以及明確指出的序列。特別地，可通過產(chǎn)生這樣的序列來實現(xiàn)簡 并密碼子替換其中一個或多個所選(或全部)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧 次黃苷殘基所替換(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 :91-98 (1994))。術(shù)語核酸 與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。
特定核酸序列也暗示涵蓋“剪接變體”以及編碼癌抗原截短形式的核酸序列。類 似地，由核酸編碼的特定蛋白質(zhì)暗示涵蓋任何由該核酸的剪接變體或截短形式編碼的蛋白 質(zhì)。顧名思義，“剪接變體”是基因選擇性剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄之后，原始核酸轉(zhuǎn)錄本可發(fā)生 剪接，使得不同的(選擇性)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同多肽。產(chǎn)生剪接變體的機制可有所不 同，包括外顯子的選擇性剪接。通過通讀轉(zhuǎn)錄而來自于相同核酸的選擇性多肽也涵蓋在該 定義中。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物(包括剪接產(chǎn)物的重組形式)都包括在該定義中。核酸可以 是在5'端或3'端截短的。多肽可以是在N端或C端截短的。截短形式的核酸或多肽序 列可以是天然的或者重組產(chǎn)生的。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換，表示氨基酸殘基的多聚體。該術(shù) 語適用于這樣的氨基酸多聚體，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人工化學 模擬物，并且適用于天然氨基酸多聚體和非天然氨基酸多聚體。
術(shù)語“氨基酸”表示天然和合成的氨基酸，以及以與天然氨基酸相似的方式發(fā)揮作 用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼所編碼的氨基酸以及其后經(jīng) 修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物表示與天然 氨基酸具有相同的基本化學結(jié)構(gòu)(即與氫、羧基、氨基和R基團相連的α碳)的化合物，例 如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這些類似物具有經(jīng)修飾的R基團(例 如正亮氨酸)或者經(jīng)修飾的肽骨架，但是保留了與天然氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。氨基 酸模擬物表示具有與氨基酸一般化學結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但是以類似于天然氨基酸的方式發(fā) 揮功能的化合物。
氨基酸在本文中可由公知的三字母符號來表示，或者由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號表示。類似地，核苷酸可由其公認的單字母代碼表示。
“保守修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列。對于特定核酸序列，保守修飾變體 表示編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當核酸不編碼氨基酸序列時，表示 基本相同的序列。因為遺傳密碼的簡并性，任何給定蛋白質(zhì)都由很多功能上相同的核酸編 碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在密碼子指定為丙氨酸的每個 位置，密碼子可改變成任何相應(yīng)密碼子，而不改變所編碼的多肽。這些核酸變化是“沉默變 化”，是保守修飾變化的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每種可能的 沉默變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，核酸中的每個密碼子(除了 AUG和TGG之外，AUG通常 是唯一的蛋氨酸密碼子，TGG通過是唯一的色氨酸密碼子)可經(jīng)修飾而產(chǎn)生功能相同的分 子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變化包含在與表達產(chǎn)物相關(guān)的每個所述序列中，但是 不包含在與實際探針序列相關(guān)的序列中。
同氨基酸序列一樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列中改變、 添加或缺失所編碼序列中單個氨基酸或小百分比氨基酸的各個替換、缺失或添加是“保守 修飾變體”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸替換成化學相似的氨基酸。提供功能相似氨基酸的保 守替換表是本領(lǐng)域中公知的。這些保守修飾變體是多態(tài)性變體、種間同源物和本發(fā)明等位 基因之外的，并且不排除上述項。
下列八個組各含有彼此保守性替換的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天 冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5) 異亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(ν) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸 (W) ；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。參見例如Creighton， Proteins(1984)。
“標記”或“可檢測部分”是可通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其 他物理手段檢測的組合物。例如，可用的標記包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(例如 通常用于ELISA的)、生物素、洋地黃毒苷或半抗原以及可變成可檢測的蛋白質(zhì)，例如通過 將放射性標記摻入肽中或者用于檢測與所述肽特異性反應(yīng)的抗體。
術(shù)語“重組”在用于指代例如細胞或核酸、蛋白質(zhì)或載體時，表示該細胞、核酸、蛋 白質(zhì)或載體已通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)或者改變天然核酸或蛋白質(zhì)而進行修飾，或者表 示該細胞來源于如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達不在天然(非重組)形式該細 胞中發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達在其他情況下異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。
短語“嚴格雜交條件”表示探針通常在核酸的復(fù)雜混合物中會與其靶標子序列 雜交而不與其它序列雜交的條件。嚴格景件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境中是不同 的。較長的序列在更高的溫度下特異性雜交。對核酸雜交的廣泛指導(dǎo)可見于Tijssen， Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)。通常，嚴格條件選擇成比特定序列在確定離子強度pH下的熱解鏈溫度(Tm) 低約5-10°C。1是(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)與靶標互補的探針中有50%與 靶序列雜交的平衡狀態(tài)時的溫度(因為引物靶序列過量存在，因此在Tm時，50%的探針處 于平衡狀態(tài))。嚴格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性 雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選背景雜交10倍。示例性嚴格雜交條件如下50%甲酰胺、5 X SSC和1% SDS，在42°C下孵育，或者5XSSC、1% SDS，在65°C下孵育，用0. 2 X SSC 和0. SDS在65 °C下清洗。
如果所編碼的多肽具有顯著同一性，則在嚴格條件彼此不雜交的核酸仍然具有顯 著同一性。例如，這發(fā)生于使用遺傳密碼所允許的最高密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝的情況 下。在這些情況下，核酸通常在中等嚴格雜交條件下雜交。示例性“中等嚴格雜交條件”包 括在40%甲酰胺、IM NaClU% SDS的緩沖液中在37°C下雜交，在IXSSC中45°C下清洗。 陽性雜交是背景的至少兩倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解，可利用替代性雜交和清洗條件來 提供相似嚴格度的條件。確定雜交條件的其他指導(dǎo)在多個參考文獻中提供，例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等編輯，見上文。
對于PCR，低嚴格擴增通常使用約36°C的溫度，但退火溫度可根據(jù)引物長度為約 32°C至48°C不等。對于高嚴格度PCR擴增，約62 °C的溫度是典型的，但高嚴格度退火溫 度根據(jù)引物長度和特異性可為約50°C至約65°C。高嚴格和低嚴格擴增的典型循環(huán)條件包 括90°C -95°C下30秒-2分鐘的變性階段，持續(xù)30秒-2分鐘的退火階段，以及約72°C下 1-2分鐘的延伸階段。低嚴格和高嚴格擴增反應(yīng)的方案和指南例如由下列所提供，Irmis 等· (1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc. N. Y.)。
“抗體”表示包含特異性結(jié)合和識別抗原的來自免疫球蛋白基因或其片段的構(gòu)架 區(qū)的多肽。所識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及眾 多免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為Y、μ、α、δ或ε，其繼而 分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗體的抗原結(jié)合區(qū)是結(jié)合的特 異性和親和力中最關(guān)鍵的?？贵w可以是多克隆的或單克隆的，來自于血清、雜交瘤或是重組 克隆的，還可以是嵌合的、靈長類化的或人源化的。
示例性免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽 鏈組成，每一對具有一個“輕”鏈(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的N端 定義了約100至110個或更多氨基酸的可變區(qū)，其主要負責抗原識別。術(shù)語可變輕鏈 和可變重鏈(Vh)分別表示這些輕鏈和重鏈。
抗體例如以完整免疫球蛋白的形式存在，或者作為以多種肽酶消化所產(chǎn)生的 許多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區(qū)二硫鍵之下消化抗體，產(chǎn)生 F(ab)' 2——Fab的二聚體，其本身是通過二硫鍵與Vh-ChI連接的輕鏈。F(ab)' 2可在溫 和條件下還原，使得絞鏈區(qū)二硫鍵斷裂，從而將F(ab)' 2 二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab'單體。Fab' 單體基本上是Fab和一部分絞鏈區(qū)。(參見Fundamental Immunology (Paul編輯，第三版 1993)。盡管通過消化完整抗體而定義了許多抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，這些片 段可使用化學方式或使用重組DNA方法從頭合成。因此，本文使用的術(shù)語“抗體”也包括 通過修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，或者使用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(例如單 鏈Fv)，或者使用噬菌體展示文庫鑒定的抗體片段(參見例如McCafferty等Nature 348 552-554(1990))ο
在一個實施方案中，抗體與“效應(yīng)子”部分綴合。所述效應(yīng)子部分可以是許多分子， 包括標記部分例如放射性標記或熒光標記。
本領(lǐng)域技術(shù)人員參考本公開內(nèi)容會理解，本發(fā)明代表性標志物的氨基酸或核苷酸18序列可通過在線檢索獲得自任何合適來源。例如，下列氨基酸和核苷酸序列(其通過參考 并入本文)可使用Entrez搜索引擎獲得自NCBI網(wǎng)站。
NC0A3指人中類固醇受體共激活蛋白家族的一個成員。編碼NC0A3的代表性核酸 的登錄號包括NM_008679、BC092516和BC088343等等。代表性NC0A3蛋白的登錄號包括 CAI4214U CAC17693, CAB40662, AAH88343 和 NP_032705 等等。
Wnt-2指可結(jié)合細胞表面受體以激活細胞中信號通路的胞外蛋白質(zhì)家族的一個成 員。編碼Wnt-2的代表性核酸的登錄號包括NM_003391和NM_023653等等。代表性Wnt_2 蛋白的登錄號包括NP_004176、NP_078613和AAF30299等等。
PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)指最初鑒定為與胰島素受體底 物-iaRS-Ι)蛋白(其為胰島素受體酪氨酸激酶磷酸化的底物)上普列克底物蛋白同源 (PH)結(jié)構(gòu)域結(jié)合之蛋白的蛋白質(zhì)。參見例如Farhang-Fal lah，J.等J. Biol. Chem.，275 40492-40497(2000)。PHIP的代表性核酸和蛋白序列的登錄號包括AAH08909、NP060404、 XP999437 和 NM017934 等等。
骨橋蛋白或SPPl (分泌磷蛋白1)指磷酸化糖蛋白家族，其在骨礦物基質(zhì)中十分 豐富并且促進骨再生和重建。其也在其他組織中產(chǎn)生，在許多疾病的調(diào)控和發(fā)展中起作 用，如提高腫瘤細胞的侵襲和蛋白水解能力。骨橋蛋白的代表性蛋白序列的登錄號包括 AAA62729, AAA59974, CAA40091, AAC28619 和 NM_000582 等等。
WIF1、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、 纖連蛋白 1 (FNl)或 P0U5Fl/0ct3/4 的代表性序列如下=WIFl :NM_007191 ；ARPC2 NM_152862 和 NM_005731 ；GIP3aka IFI6 :NM_022872、NM_002038 和 NM_022873 ；Mip-I α aka CCL3 :NM_002983 ；Bfl-Iaka BCL2A1 :NM_004049 ；RGSl :NM_002922 ；FNl (纖連蛋白 1) NM_212475、NM_054034、NM_212476, NM_002026、NM_212474、NM_212478 和 NM_212482 ； P0U5F1 :NM_002701 和 NM_203289。
編碼NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白 (SPPl)、WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連 蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4的核酸或者其編碼多肽表示所有形式的核酸(例如基因、 前體mRNA、mRNA)或蛋白質(zhì)，其多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物(適用于核酸 或蛋白質(zhì))，其(1)與參考核酸所編碼的多肽或本文所述蛋白質(zhì)序列在優(yōu)選在至少約25、 50、100、200、500、1000或更多氨基酸的區(qū)域上具有高于約60%氨基酸序列同一性，65%、 70%、75%、80%、85%、90%、優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或 更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列；( 與針對包含參考氨基酸序列、其免疫原性片段 以及其保守修飾變體的免疫原產(chǎn)生的抗體(例如多克隆抗體)特異性結(jié)合；(3)在嚴格雜 交條件下與編碼參考氨基酸序列及其保守修飾變體的核酸特異性雜交；(4)具有與參考核 酸序列在優(yōu)選至少約25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的區(qū)域上有高于約95%、優(yōu) 選高于約96%、97%、98(%、99(%或更高核苷酸同一性的核酸序列。多核苷酸或多肽序列通 常來自哺乳動物，包括但不限于靈長類例如人；嚙齒動物例如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、馬、 綿羊或任何哺乳動物。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)包括天然或重組分子。這些抗原的截短形式 和選擇性剪接形式包括在該定義中。
短語“特異性(或選擇性)結(jié)合”在指代蛋白質(zhì)、核酸、抗體或小分子化合物時，表示由蛋白質(zhì)或核酸(經(jīng)常在蛋白質(zhì)或核酸以及其他生物物質(zhì)的異源群體中)的存在情況決 定的結(jié)合反應(yīng)，所述蛋白質(zhì)或核酸特別是NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域 相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白A1、RGS1、纖連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4。就抗體來說，在指定的免疫測定條 件下，指定抗體可以至少兩倍于背景地結(jié)合特定蛋白質(zhì)，更常見比背景高10至100倍。在這 些條件下與抗體的特異性結(jié)合需要針對特定蛋白質(zhì)進行了特異性選擇的抗體。例如，可對 多克隆抗體進行選擇，以僅獲得與所選抗原有特異性免疫反應(yīng)性而與其他蛋白質(zhì)則沒有的 多克隆抗體。這種選擇可以通過去除與其他分子交叉反應(yīng)的抗體來實現(xiàn)?？墒褂枚喾N免疫 測定形式來選擇與特定蛋白質(zhì)有特異性免疫反應(yīng)性的抗體。例如，通常使用固相ELISA免 疫測定來選擇與蛋白質(zhì)有特異性免疫反應(yīng)性的抗體(參見例如Harlow&Lane，Antibodies， A LaboratoryManual (1988)，其描述了可用于測定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定形式和條 件)。
對于測試調(diào)節(jié)標志物蛋白質(zhì)之化合物的測定，短語“功能作用”包括測定間接或 直接受標志物蛋白質(zhì)影響的參數(shù)，所述標志物蛋白質(zhì)例如NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底 物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa誘導(dǎo)蛋白、 MIPla、Bfll/Bcl-2相關(guān)蛋白A1、RGS1、纖連蛋白1 (FNl)或P0U5Fl/0ct3/4，例如化學或表 型作用，例如NC0A3翻譯活性的改變或者Wnt-2信號途徑活性的改變，以及這些蛋白質(zhì)對細 胞代謝和生長的下游作用。因此，功能作用包括配體結(jié)合活性、翻譯活化或抑制、細胞增殖 的能力、黑素瘤發(fā)展過程中細胞中的表達以及黑素瘤細胞的其他特征?！肮δ茏饔谩卑w 外、體內(nèi)和離體活性。
“測定功能作用”表示對提高或降低間接或直接受標志物影響之參數(shù)的化合物進 行測定，所述標志物質(zhì)例如NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋 白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4，例如測定物理和化學或表型作用。這些功 能性作用可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何手段來測定，例如光譜學特征的改變(例如熒 光、吸光度、折射率)；流體動力學(例如形狀)、色譜；或者蛋白質(zhì)的溶解特性；配體結(jié)合測 定，例如與抗體的結(jié)合；測量可誘導(dǎo)標志物或標志物的轉(zhuǎn)錄活化；測量酶活性的變化；增加 或減少細胞增殖、凋亡、細胞周期停滯的能力，測量細胞表面標志物的變化。測定化合物對 黑素瘤細胞發(fā)展的功能作用也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定進行，例如通過尾靜脈注 射黑素瘤細胞到小鼠中來測定黑素瘤轉(zhuǎn)移。這些功能作用可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許 多手段來評價，例如定量或定性測量形態(tài)特征變化的顯微術(shù)，測量黑素瘤細胞中所表達的 其他基因的RNA或蛋白水平的變化，測量RNA穩(wěn)定性，鑒定下游或報告基因表達(CAT、螢光 素酶、β -gal、GFP等)，例如通過化學發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)、抗體結(jié)合、可誘導(dǎo)標志物等等。
標志物的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”用于表示使用體外和體內(nèi)黑素瘤標志 物測定所鑒定的活化、抑制或調(diào)節(jié)性分子，所述標志物例如NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底 物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa誘導(dǎo)蛋白、 MIPl α、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或 P0U5Fl/0ct3/4。抑制劑是這 樣的化合物，其例如與黑素瘤標志物結(jié)合，部分或完全阻斷其活性，降低、阻止、延遲活化、 失活、失敏或下調(diào)其活性或表達，例如拮抗劑，所述標志物例如NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα誘導(dǎo) 蛋白、厘1卩1(1、8打1/8(31-2相關(guān)蛋白六1、1 51、纖連蛋白1 (FNl)或P0U5Fl/0ct3/4?！盎罨?劑”是這樣的化合物，其提高、啟動、活化、利于、提高活化、敏化、激動或上調(diào)黑素瘤標志物 活性，例如激動劑，所述標志物例如NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互 作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl-2 相 關(guān)蛋白Al、RGS1、纖連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4。抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑還包括黑 素瘤標志物的遺傳修飾形式，所述標志物例如NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié) 構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα誘導(dǎo)蛋白、MIPl α ,Bfll/ Bcl-2相關(guān)蛋白Al、RGSl、纖連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4，例如活性改變的形式，以及 天然和合成配體、拮抗劑、激動劑、抗體、肽、環(huán)肽、核酸、反義分子、核酶、RNAi分子、小有機 分子等。抑制劑和活化劑的此類測定包括如在體外、在細胞中或在細胞提取物中表達黑素 瘤標志物，例如NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白 (SPPl)、WIFl、ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連 蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4，應(yīng)用推定的調(diào)節(jié)劑化合物，然后測定對活性的功能作用，如 上所述。
將經(jīng)潛在活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的包含黑素瘤標志物的樣品或測定與無抑 制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對照樣品進行比較，以測定抑制的程度，所述標志物例如NC0A3、 fet-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或P0U5F1/ 0ct3/4。將對照樣品(未經(jīng)抑制劑處理)指定為100%的相對蛋白質(zhì)活性值。在活性值相 對于對照為約80%、優(yōu)選50%、更優(yōu)選25-0%時，實現(xiàn)了黑素瘤標志物例如NC0A3、Wnt_2、 PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/ IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或 P0U5F1/ 0ct3/4的抑制。在活性值相對于對照(未經(jīng)活化劑處理)為110%、更優(yōu)選150%、更優(yōu)選 200-500% (即對照的2-5倍高)、更優(yōu)選1000-3000%時，實現(xiàn)了黑素瘤標志物例如NC0A3、 Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或P0U5F1/ 0ct3/4的激活。
本文所用的術(shù)語“測試化合物”或“藥物候選”或“調(diào)節(jié)劑”或語法上的等同表述描 述了待測試直接或間接調(diào)節(jié)黑素瘤標志物之能力的任何天然或合成分子，例如蛋白質(zhì)、寡 肽(例如約5至約25個氨基酸長，優(yōu)選約10至20個或12至18個氨基酸長，優(yōu)選12、15 或18個氨基酸長)、小有機分子、多糖、肽、環(huán)肽、脂質(zhì)、脂肪酸、siRNA、多核苷酸、寡核苷酸 等，所述標志物例如NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋 蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a ,Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGSl、 纖連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4。測試化合物可以為測試化合物文庫的形式，例如提供 足夠多樣性程度的組合文庫或隨機文庫。測試化合物任選地與融合伴侶相連，例如靶向化 合物、挽救化合物、二聚化化合物、穩(wěn)定化化合物、可尋址化合物及其他功能性部分。通常如 下產(chǎn)生具有有用特性的新化學實體鑒定具有一些期望特性或活性(例如抑制活性)的測 試化合物(稱為“先導(dǎo)化合物”)來，產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的變體以及評價這些變體化合物的特性和活性。通常，這些分析使用高通量篩選方法(HTS)。
“小有機分子”指天然或合成的有機分子，其具有大于約50道爾頓且小于約2500 道爾頓的分子量，優(yōu)選小于約2000道爾頓，優(yōu)選在約100至約1000道爾頓之間，更優(yōu)選在 約200至約500道爾頓之間。
診斷和預(yù)后方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了診斷黑素瘤或者提供其預(yù)后的方法，其通過檢測在不同惡性階段的 黑素瘤細胞中差異表達之標志物的表達來實現(xiàn)。診斷包括測定患者或患者樣品中NC0A3、 fet-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或P0U5F1/ 0ct3/4多肽或核酸的表達水平，以及然后將該表達水平與基線值或范圍進行比較。通常， 基線值是未患黑素瘤的健康人中該多肽或核酸的代表性表達水平，如使用生物樣品例如皮 膚活檢所測量的。本發(fā)明的多核苷酸或核酸水平偏離基線范圍的變化(向上或向下)顯示 患者患有癌癥或者有發(fā)生癌癥的風險，這取決于所用的標志物。就NC0A3、Wnt-2、PHIP(普 列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、ARPC2、G1P3/IFNα誘導(dǎo)蛋白、 MIPla、Bfll/Bcl-2相關(guān)蛋白A1、RGS1、纖連蛋白1 (FNl)或P0U5Fl/0ct3/4來說，過表達與 黑素瘤的診斷相一致。就Wifl來說，低表達與黑素瘤的診斷一致。
本文使用的術(shù)語“提供預(yù)后”表示提供對黑素瘤可能的病程和結(jié)局的預(yù)測。所述 方法還可用于設(shè)計黑素瘤治療的合適療法，例如通過顯示黑素瘤是否仍處于良性階段或者 黑素瘤是否已發(fā)展到需要介入性治療的階段來實現(xiàn)。
測定中可使用抗體試劑，以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種免疫測定中的任意種 檢測患者樣品中NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋 白(SPPl)、WIFl、ARPC2、G1P3/IFNα 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖 連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4的表達水平。適用于檢測NC0A3的單克隆抗體試劑公開 于2008年3月4日提交的美國專利申請?zhí)?1/033663。此外，適用于檢測Wnt_2表達的單 克隆抗體試劑公開于2008年3月4日提交的美國專利申請?zhí)?1/033，641。這些參考文獻 通過引用并入本文用以全部目的。
免疫測定技術(shù)和方案通常描述于Price和Newman，“Principles andPractice of Immunoassay,，，第二版，Grove‘ s Dictionaries, 1997 ；禾口 Gosling, “Immunoassays :A Practical Approach，” Oxford Universityl^ress，2000?？墒褂枚喾N免疫測定技術(shù),包括 競爭性和非競爭性免疫測定。參見例如Self等Curr. Opin. Biotechnol.，7 :60-65 (1996)。 術(shù)語“免疫測定”涵蓋包括下列的方法，而不限于此酶兔疫測定(enzyme immunoassays, EIA)例如醇放大免疫測定技術(shù)(enzyme multiplied immunoassaytechnique, EMIT)、 Bl K nI Ρ IlJ ^ (enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA) > IgM Jfi # Μ 1 ELISAdgM antibody capture ELISA，MAC ELISA)，和微粒酶免疫測定(microparticle enzyme immunoassay, ME ΙΑ) ； it ψ (immunohistochemical, IHC) IlJ ^ ； ^； iW % IlJ ^ (capillary electrophoresis immunoassays, CEIA) ； tXM ft IlJ 定(radioimmunoassays, RIA)；免疫放身寸測定(immunoradiometricassays, IRMA)；焚 光偏振免疫測定(fluorescence polarizationimmunoassays, FPIA)；和化學發(fā)光測定 (chemiluminescence，CL)。如果需要，這些免疫測定可以是自動化的。免疫測定也可與合使用。參見例如khmalzing等Electrophoresis，18 :2184-93(1997)； Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.，699 =463-80(1997)。脂質(zhì)體免疫測定(例如流動注射 脂質(zhì)體免疫測定和脂質(zhì)體免疫傳感器)也適用于本發(fā)明。參見例如Rongen等J. Immunol. Methods, 204 :105-133 (1997)。另外，濁度測定適用于本發(fā)明方法，其中蛋白質(zhì)/抗體復(fù) 合物的形成導(dǎo)致光散射增加，其轉(zhuǎn)化為作為標志物濃度函數(shù)的峰值速率信號。濁度測定 可從 BeckmanCoulter (Brea，CA ；Kit#449430)購得，可使用 Behring 濁度分析儀(Fink 等 J. Clin. Chem. Clin. Biochem. ,27 :261-276(1989))進行。
可直接地或間接地檢測抗體與蛋白質(zhì)的特異性免疫結(jié)合。直接標記包括與抗體相 連的熒光或發(fā)光標簽、金屬、染料、放射性核素等。可使用碘-125 (125I)標記的抗體。使用 蛋白質(zhì)特異性化學發(fā)光抗體進行的化學發(fā)光測定適于靈敏的非放射性蛋白質(zhì)水平檢測。用 熒光團標記的抗體也是合適的。熒光團的實例包含但不限于DAPI、熒光素、H0echst33258、 R-藻青蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺(lissamine)。間 接標記包括本領(lǐng)域中公知的多種酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β-半 乳糖苷酶、尿素酶等?？墒褂美备^氧化物酶檢測系統(tǒng)，例如，使用發(fā)色底物四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)，其在過氧化氫存在下產(chǎn)生可在450nm檢測的可溶性產(chǎn)物?？墒褂脦в邪l(fā)色底物磷酸 對硝基苯基酯的堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)，例如，產(chǎn)生可容易地在405nm檢測的可溶性產(chǎn)物。類 似地，可使用帶有發(fā)色底物鄰硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的半乳糖苷酶檢 測系統(tǒng)，其產(chǎn)生可在410nm檢測的可溶性產(chǎn)物?？墒褂脦в欣缒蛩豞溴甲酚紫底物的尿 素酶檢測系統(tǒng)(Sigma Immunochemicals ；St. Louis, MO)。
可分析來自直接或間接標記的信號，例如使用分光光度計檢測來自發(fā)色底物的顏 色；使用輻射計數(shù)器檢測輻射，例如用Y粒子計數(shù)器檢測125I ；或者使用熒光計檢測某種波 長的光存在下的熒光。對于酶聯(lián)抗體的檢測，可使用分光光度計根據(jù)制造商說明進行定量 分析，例如EMAX微滴定板讀數(shù)器(Molecular Devices ；Menlo Park, CA)。如果需要，本發(fā) 明的測定可以自動化或者用機器人進行，可同時檢測來自多個樣品的信號。
所述抗體可固定于多種固體支持物上，例如磁或色譜基質(zhì)顆粒，測定平板的表面 (例如微滴定孔)，固體基底材料片或膜(例如塑料、尼龍、紙)等。可通過在固體支持物上 以陣列涂覆抗體或多種抗體來制備測定條。然后，可將該條浸入測試樣品，通過清洗和檢測 步驟進行快速處理，產(chǎn)生可測量信號，例如色斑。
或者，核酸結(jié)合分子例如探針、寡核苷酸、寡核苷酸陣列和引物可用于測定中，以 檢測患者樣品中的差異性RNA表達，例如RT-PCR。在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中已知的 標準方法使用RT-PCR。在另一個實施方案中，可使用PCR測定，例如可獲得自例如Applied Biosystems的Taqman 測定，以檢測核酸及其變體。在另一些實施方案中，qPCR和核酸 微陣列可用于檢測核酸。可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備結(jié)合所選癌癥生物標志物 的試劑，或者從以商品購買。
可使用常規(guī)方法例如Southern分析、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)實 現(xiàn)核酸的分析，或任何其他基于與標志物編碼序列一部分互補的核酸序列進行雜交 的方法(例如狹縫點雜交)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？捎玫腜CR擴增方法描述于例如 Ausubel等和hnis等，見上文。一般性核酸雜交方法描述于Anderson，“Nucleic Acid Hybridization, "BIOSScientific Publishers，1999。多個核酸序列(例如基因組 DNA、23mRNA或cDNA)的擴增或雜交也可由設(shè)置于微陣列中的mRNA或cDNA序列進行。微陣列方法 一般性地描述于 Hardiman, "Microarrays Methods andApplications :Nuts&Bolts,，，DNA Press, 2003 ；以及Baldi 等"DNAMicroarrays and Gene Expression :From Experiments to Data Analysisand Modeling,，，Cambridge University Press, 2002。
核酸標志物以及其變體的分析可使用本領(lǐng)域已知的方法進行，包括但不限于微陣 列、基于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的分析、序列分析、熒光原位雜交(FISH)、比較基因組雜交 (CGH)和電泳分析。基于PCR的分析的非限制性實例包括Taqman 等位基因區(qū)分測定，其 可獲得自AppliedBiosystems。序列分析的非限制性實例包括Maxam-Gilbert測序、Sanger 測序、毛細管陣列DNA測序、熱循環(huán)測序(Sears等Biotechniques, 13 :626-633 (1992))、 固相測序 Gimmerman 等 Methods Mol. Cell Biol.，3 :39-42 (1992))、使用質(zhì)譜的測序例 如基質(zhì)輔助激光解吸/離子時間飛行質(zhì)譜(MALDI-T0F/MS ；Fu等Nat. Biotechnol.，16 381-384(1998))以及通過雜交進行的測序。Chee 等 kience，274 :610-614(1996) ；Drmanac ^ Science, 260 :1649-1652(1993) ；Drmanac 等 Nat. Biotechnol.，16 :54-58 (1998)。電泳 分析的非限制性實例包括平板凝膠電泳，例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細管電泳 和變性梯度凝膠電泳。檢測核酸變體的其它方法包括例如來自Hiird Wave Technologies, Inc.的INVADER 測定、限制性片斷長度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸雜交、異雙鏈體遷移測定、單鏈構(gòu)象 多態(tài)性(single strand conformational polymorphism, SSCP)分析、單核苷酸引物延伸 (single-nucleotide primer extension, SNUPE)禾口焦憐酸測序(pyrosequencing)。
FISH和CGH是分析基因組DNA失衡遺傳變化的方法。簡單地說，標記(例如紅色 熒光標記)來自測試樣品(例如黑素瘤細胞)的基因組DNA，并與另一種顏色標記的(例 如綠色熒光標記)正常基因組DNA混合，將混合物與正常人的分裂中期涂片(metaphase spread)、組織制備物或其他參考標準品雜交。以綠色與紅色熒光比值的提高或降低，相對 于正常分裂中期染色體對黑素瘤樣品中染色體失衡的區(qū)域(拷貝數(shù)增加或減少)進行定 位或作圖。進行FISH或CGH的詳細方案是本領(lǐng)域中可獲得的，例如在下列中，Molecular Cytogenetics !Protocols and Applications, Yao-Shan Fan 編輯，Humana Press, 2002 ； Cancer Cytogenetics :Methodsand Protocols, John Swansbury 編■，Humana Press, 2003。
在進行FISH和CGH時，通過下列方式制備染色體樣品將細胞以單細胞懸液或組 織制備物的形式沉積于固體支持物(例如載玻片)上，并通過選擇提供細胞最佳空間分辨 率和最佳雜交效率的固定劑來進行固定。原位雜交通常需要下列基本步驟(1)固定待分 析的組織或生物學結(jié)構(gòu)；( 對所述生物學結(jié)構(gòu)進行預(yù)雜交處理，以提高靶標DNA的可接近 性，并減少非特異性結(jié)合；(3)將核酸混合物與生物學結(jié)構(gòu)或組織中的核酸雜交；(4)雜交 后清洗，以除去未在雜交中結(jié)合的核酸片段；和( 檢測雜交的核酸片段。在一些情況下， 需要對重復(fù)順序的雜交能力進行封閉。出于這些目的，可使用人基因組DNA作為封閉這些 雜交的試劑。對于雜交，以一種染料標記與染色體目的區(qū)域(例如本文公開的一種或多種 標志物)雜交的測試探針，以另一種染料標記與不同區(qū)域雜交的對照探針。與目的染色體 中穩(wěn)定部分(例如著絲粒區(qū))雜交的核酸常?？捎米鲗φ仗结?。使用這些對照，可以補償樣品之間雜交效率的差異。如果在單個雜交中使用多種測試標志物，則其每一種可用可分 別區(qū)分的標記來標記。
鑒于FISH和CGH方法的靈敏度，可使用多種測試樣品?？墒褂檬灠竦哪[瘤切 片，同樣可使用新鮮或冷凍的材料。其他類型的制備物包含來自于未培養(yǎng)的原發(fā)腫瘤的制 備物(參見例如 Kallioniemi，A.等 Cytogenet. Cell Genet. 60 190-193 (1992))。例如， 可使用來自腫瘤的血樣或者小活檢組織樣品。(參見例如Kallioniemi，Α.等Cytogenet. Cell Genet. 60 :190-193 (1992))。也可分析獲得自刺吸活檢的細胞或者體液(例如血、尿、 痰等)中的細胞。
本文所述測定中可使用了可檢測部分。可使用多種可檢測部分，標記的選擇 取決于所需的靈敏度，與抗體綴合的簡單與否，穩(wěn)定性要求以及可用的裝置和處理規(guī)定 (disposal provision) 0合適的可檢測部分包括但不限于放射性核素、熒光染料(例如熒 光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、Oregon Green 、羅丹明、得克薩斯紅、四羅丹明異硫氰酸酯 (tetrarhodimine isothioeynate, TRITC)、Cy3、Cy5 等)、熒光標記(例如綠色熒光蛋白 (GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關(guān)蛋白酶活化的自猝滅熒光化合物、酶(例如螢光素酶、辣 根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、洋地黃毒苷等。
可用的物理形式包括具有用于檢測多種不同標志物的多個離散的可尋址位置 的表面。這些形式包括微陣列和某些毛細管裝置。參見例如Ng等J. Cell Mol. Med. ,6 329-340(2002)；美國專利No. 6，019，944。在這些實施方案中，每個離散表面位置可包含抗 體，以固定用于在每個位置處檢測的一種或多種標志物?；蛘撸砻婵砂潭ㄓ谠摫砻骐x 散位置的一個或多個離散顆粒(例如微?；蚣{米顆粒)，其中所述微粒包含抗體以固定用 于檢測的一種或多種標志物。
分析可以多種物理形式進行。例如，微量滴定板或自動化的使用可利于大量測試 樣品的處理?；蛘?，可開發(fā)單樣品形式，以利于及時的診斷或預(yù)后。
或者，本發(fā)明的抗體或核酸探針可應(yīng)用到固定于顯微鏡用載玻片上的患者活檢切 片上?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的多種光學或熒光顯微方法觀察所得抗體染色或原位雜交圖案。
在一些實施方案中，可通過原位顯示一種或多種本文所公開的基因序列或 多肽的表達對患者的黑素瘤進行診斷或其他評價。顯示存活患者中分子(核酸、 多肽及其他生化物質(zhì))的存在或表達的本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，本文所述的基因 表達信息可用于多種顯示方法中。這些方法包括但不限于單光子發(fā)射計算機斷層 術(shù)(single-photon emission-computedtomography, SPECT)禾口正電子發(fā)身寸斷層術(shù) (positron-emittingtomography, PET)方法。參見例如 Vassaux 禾口 Groot-wassink, ‘‘In VivoNoninvasive Imaging for Gene Therapy,，，J. Biomedicine andBiotechnology, 2 92-101 (2003) ；Turner, J.，Smyth, P.，F(xiàn)allon, J. F.，Kennedy, J. L.，Potkin, S. G.，F(xiàn)IRST BIRN(2006). Imaging and genetics in schizophrenia. Neuroinformatics，出片反中。
PET和SPECT成像顯示器官和組織的化學功能，而其他成像技術(shù)例如X射線、CT 和MRI則顯示結(jié)構(gòu)。PET和SPECT成像可用于鑒定和監(jiān)測黑素瘤的發(fā)展。在一些情況下， 使用PET或SPECT成像使得可以在癥狀發(fā)作前數(shù)年檢測到疾病。使用用于標記和顯現(xiàn)多肽 及核苷酸的存在或表達的小分子已經(jīng)獲得了成功，例如在顯示阿爾茨海默病患者腦中蛋白 質(zhì)方面，例如 Herholz K 等 Mol Imaging Biol. ,6(4) :239-69(2004) ；Nordberg A, LancetNeurol.,3(9) :519-27(2004) ；Neuropsychol Rev.，Zakzanis KK 等 13(1) :1-18(2003)； Kung MP 等，BrainRes. , 1025(1-2) :98-105(2004)；和 Herholz K, Ann Nucl Med. , 17(2) 79-89(200 所述?？贵w和核酸探針也是可用的。
本文公開的差異表達基因或者它們所編碼的肽或其片段可用于PET和SPECT成像 應(yīng)用的情況中。在用適于PET或SPECT應(yīng)用的示蹤殘基修飾后，與核酸標志物或與那些轉(zhuǎn) 錄本所編碼任何多肽發(fā)生相互作用或結(jié)合的分子可用于顯示基因表達模式，并利于本文所 述的診斷和預(yù)后。類似地，如果所編碼的多肽編碼酶，則與酶催化產(chǎn)物相互作用的標記分子 可用于本文所述的體內(nèi)成像和診斷應(yīng)用。
組合物和試劑盒
本發(fā)明提供了用于實施本文所述測定的組合物和試劑盒，其使用對本發(fā)明多肽具 有特異性的抗體或者對本發(fā)明多核苷酸具有特異性的核酸。
用于實施本發(fā)明診斷測定的試劑盒通常在合適的容器裝置中包含探針(其包含 與本發(fā)明標志物多肽或多核苷酸特異性結(jié)合的抗體或核酸序列)以及用于檢測所述探針 存在情況的標記。該試劑盒可包含幾種抗體或編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列，例如第一 抗體和/或第二和/或第三和/或其他抗體，其識別NC0A3、Wnt-2、PHIP (普列克底物蛋白 同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α誘導(dǎo)蛋白、ΜΙΡΙα、 Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 I(FNl)或 P0U5Fl/0ct3/4。
試劑盒的容器裝置通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其他容 器，對本發(fā)明多肽之一具有特異性的第一抗體或者對本發(fā)明多核苷酸之一具有特異性的第 一核酸可置于和/或適當?shù)胤盅b于其中。在提供第二和/或第三和/或另外組分時，試劑 盒通常還會含有第二、第三和/或其他容器，其中可放置該組分?；蛘?，容器可含有多于一 種抗體或核酸試劑的混合物，每種試劑特異性結(jié)合本發(fā)明的不同標志物。本發(fā)明的試劑盒 通常還包括封裝含有抗體或核酸探針的裝置以用于銷售。這些容器可包括注塑和/或吹塑 塑料容器，所需的小瓶保存于其中。
所述試劑盒還可包含陽性和陰性對照，以及根據(jù)本發(fā)明方法使用其中所含試劑盒 組分的說明。
體內(nèi)成像
本發(fā)明的多種標志物還提供了用于體內(nèi)成像的試劑，例如黑素瘤向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移的成像使用檢測NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋 蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFN α 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖 連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4蛋白或核酸的帶標記試劑?？墒褂皿w內(nèi)成像技術(shù)，例如作 為手術(shù)切除的指導(dǎo)，或者用于檢測黑素瘤的遠處傳播。對于體內(nèi)成像目的而言，檢測NC0A3、 fet-2、PHIP (普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIFl、ARPC2、 GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白 A1、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或P0U5F1/ 0ct3/4存在情況的試劑(例如抗體)可用發(fā)射正電子的同位素(例如18F)進行標記，用于 正電子發(fā)射斷層術(shù)(PET)；用Y-射線同位素(例如99mTc)進行標記，用于單光子發(fā)射計 算機斷層術(shù)(SPECT)；用順磁性分子或納米顆粒(例如Gd3+螯合物或帶涂層的磁性納米顆 粒)進行標記，用于磁共振成象(MRI)；用近紅外熒光團所標記用于近紅外(近IR)成像； 用螢光素酶(螢火蟲、細菌或腔腸動物)或其他發(fā)光分子標記，用于生物發(fā)光成像；或者由全氟化碳填充的囊泡標記，用于超聲。
此外，這些試劑可包含熒光部分，例如熒光蛋白、肽或熒光染料分子。熒光染 料的常見類別包括但不限于咕噸類，例如羅丹明、對甲氨基酚和熒光素及其衍生物； bimanes ；香豆素及其衍生物例如傘形酮和氨甲基香豆素；芳香胺例如丹酰；方酸類染 料；苯并呋喃；熒光花青素類(FluorescentCyanines)；咔唑；二氰基亞甲基吡喃、聚甲 炔、oxabenzanthrane、咕噸、吡喃錫、carbosty 1、二萘嵌苯、吖啶酮、喹吖啶酮、紅熒烯、 蒽、蔻、菲、芘、丁二烯、1，2_ 二苯乙烯、鑭系金屬螯合物、稀土金屬螯合物以及這些染料的 衍生物。熒光染料例如在美國專利No. 4，452，720，美國專利No. 5，227，487和美國專利 No. 5，543, 295 中討論。
適用于實施本發(fā)明的其他熒光標記包括熒光素染料。典型的熒光素染料包括但 不限于5-羧基熒光素、熒光素-5-異硫氰酸酯和6-羧基熒光素；其他熒光素染料的實例 可見于例如美國專利No. 6，008，379，美國專利No. 5，750，409，美國專利No. 5，066，580和 美國專利No. 4，439，356。負荷部分C可包括羅丹明染料，例如四甲基羅丹明_6_異硫氰酸 酯、5-羧基四甲基羅丹明、5-羧基對甲氨基酚衍生物、四甲基和四乙基羅丹明、二苯基二甲 基和二苯基二乙基羅丹明、二萘基羅丹明、羅丹明101磺酰氯(以德克薩斯紅 的商品名銷 售)，以及其他羅丹明染料。其它羅丹明染料可見于例如美國專利No. 6，080, 852，美國專利 No. 6，025，505，美國專利No. 5，936，087，美國專利No. 5，750，409。負荷部分C可包括花青 素類染料，例如Cy3、Cy3B, Cy3. 5、Cy5, Cy5. 5、Cy7。也可使用磷光化合物包括卟啉、酞菁、 多芳香化合物例如芘、蒽和苊等等。
試劑(如抗體)可包含放射性部分，例如放射性同位素，如211At、mI、125I、9°Y、186Re、 188Re、153Sm、212Bi、32P、Lu 的放射性同位素等。
鑒定化合物的方法
可使用多種方法來鑒定預(yù)防或治療黑素瘤發(fā)展的化合物。通常，提供易于測量的 參數(shù)的測定適于在多孔板的孔中進行，以利于篩選如本文所述測試化合物文庫的成員。因 此，在一個實施方案中，可將合適數(shù)量的細胞鋪板于多孔板的孔中，可測定測試化合物對 NC0A3、fet-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、 ARPC2、GlP3/IFNa 誘導(dǎo)蛋白、MIPl a、Bfll/Bcl-2 相關(guān)蛋白 Al、RGS1、纖連蛋白 1 (FNl)或 P0U5Fl/0ct3/4表達的作用。
待測試化合物可以是任何小化合物或者大分子，例如蛋白質(zhì)、糖、核酸或脂類。通 常，測試化合物將是小化學分子和肽?；旧先魏位衔锞捎米鞅景l(fā)明此方面的測試 化合物，盡管最經(jīng)常使用可溶于水或有機(尤其是基于DMSO的)溶液的化合物。所述 測定設(shè)計成通過下述方式篩選大化學文庫使測定步驟自動化并將來自任何方便來源的 化合物提供給測定，其通常平行進行(例如，在機器人測定中以微滴定形式在微量滴定 板上進行)。應(yīng)了解，有許多化合物的供應(yīng)商，包括Sigma (St. Louis，MO)，Aldrich (St. Louis, M0), Sigma-Aldrich (St. Louis, M0), FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)等等。
在一個優(yōu)選實施方案中，使用高通量篩選方法，其包括提供含有大量潛在治療化 合物的組合化學文庫或肽文庫。然后，在一個或多個測定中篩選這些“組合化學文庫”或 “配體文庫”，如本發(fā)明所述，以鑒定顯示所需特征活性的文庫成員(特別是化學物種類或亞27類)。在這種情況下，篩選這些化合物降低NC0A3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域 相互作用蛋白)、骨橋蛋白(SPPl)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα 誘導(dǎo)蛋白、MIPl α、Bfll/Bcl_2 相關(guān)蛋白Al、RGSl、纖連蛋白I(FNl)或P0U5Fl/0ct3/4表達的能力。
組合化學文庫是由化學合成或生物合成、通過組合許多化學“構(gòu)建塊”(例如試 劑)而產(chǎn)生的許多不同的化合物。例如，對于給定的化合物長度(即多肽化合物中的氨基 酸數(shù))，通過以每種可能的形式組合一組化學構(gòu)建塊(氨基酸)而形成線性組合化學文庫， 例如多肽文庫。可通過這種化學構(gòu)建塊的組合混合來合成數(shù)百萬種化合物。
組合化學文庫的制備和篩選是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些組合化學文庫包 括但不限于肽文庫(參見例如美國專利5,010, 175，F(xiàn)urka, Int. J. Pept. Prot. Res. ,37 487-493(1991)以及 Houghton 等 Nature，；354 :84-88 (1991))。也可使用產(chǎn)生化學多樣性文 庫的其它化學品。這些化學品包括但不限于擬肽(例如PCT公開No. WO 91/19735)，編碼 的肽(例如PCT公開No. WO 93/20242)，隨機生物寡聚體(例如PCT公開No. WO 92/00091)， 苯并二氮革(例如美國專利No. 5，觀8，514)，多樣體類(diversomers)例如乙內(nèi)酰脲、苯二 氮革類和二肽(Hobbs 等 PNAS USA, 90 :6909-6913 (1993))，插烯多肽(Hagihara 等 J. Amer. Chem. Soc.，114 :6568 (1992))，具有葡萄糖骨架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等J. Amer. Chem. Soc.，114 :9217-9218 (1992))，小化合物文庫的類似有機合成(Chen 等 J. Amer. Chem. Soc.，116 J661 (1994))，寡氨基甲酸酯(Cho 等 Science, 261 :1303(1993))和 / 或肽基膦 酸酯(Campbell 等 J. Org. Chem.，59 :658(1994))，核酸文庫(參見 Ausubel，Berger and Sambrook,au supra)，肽核酸文庫(參見例如美國專利No. 5，539，083)，抗體文庫(參見例 如 Vaughn 等 NatureBiotechnology，14 (3) :309-314 (1996) and PCT/US96/10287)，碳水化 合物文庫(參見例如 1^&1^等^^61 ^，274 :1520-1522(1996)和美國專利 No. 5，593，853)， 小有機分子文庫(參見例如benzodiaz印ines，Baum C&EN, Jan 18，page 33(1993)；類異戊 二烯，美國專利No. 5，569，588 ；噻唑啉酮和metathiazanones，美國專利No. 5，549，974 ；吡 咯烷，美國專利Nos. 5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美國專利No. 5，506，337 ；苯并二氮萆,5，288，514等等)。
制備組合文庫的裝置是市售的(參見例如:357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, ΜΑ,433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，許多組合文庫本身是市售的(參見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc. , St. Louis, M0, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等寸乂 O
在本發(fā)明的高通量測定中，可以在一天篩選多達數(shù)千種不同調(diào)節(jié)劑或配體。尤其 是，可使用微量滴定板的每個孔進行針對所選潛在調(diào)節(jié)劑的單獨測定，或者，如果要觀察濃 度或孵育時間的作用時，可以每5-10個孔一種調(diào)節(jié)劑。因此，一個標準微量滴定板可測定 約96種調(diào)節(jié)劑。如果使用1536孔板，這一塊板可輕易地測定約100-約1500種不同的化 合物?？梢悦刻鞙y定許多塊板；使用本發(fā)明的集成系統(tǒng)可以進行多達約6000、20000、50000 或100000或更多種不同化合物的測定篩選。使用核酸抑制標志物蛋白表達的方法
可使用多種核酸(例如反義核酸、SiRNA或核酶)來抑制本發(fā)明標志物的功能。在位點特異性識別序列處切割mRNA的核酶可用于破壞靶標mRNA，尤其是通過使用錘頭狀核 酶。錘頭狀核酶在由與靶標mRNA形成互補堿基對的側(cè)翼區(qū)域所確定的位置切割mRNA。優(yōu) 選地，靶標mRNA具有下列的兩堿基序列5' -UG-3'。錘頭狀核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生是本領(lǐng)域 公知的。
基因靶向性核酶必須含有與靶標mRNA的兩個區(qū)域互補的雜交區(qū)，每個區(qū)域的長 度為至少5個，優(yōu)選6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續(xù)核苷酸。另外，核酶具有高度特異性的核糖核酸內(nèi)切酶活性，其自催化切割靶標有義mRNA。
對于反義、siRNA或核酶寡核苷酸，可使用硫代磷酸酯寡核苷酸。磷酸二酯鍵以及 雜環(huán)或糖的修飾可帶來效率的提高。硫代磷酸酯用于修飾磷酸二酯鍵。N3' -P5'氨基磷 酸酯鍵已被描述為使得寡核苷酸對核酸酶穩(wěn)定，并提高與RNA的結(jié)合。肽核酸(PNA)鍵是對 核糖和磷酸二酯主鏈的完全替換，并對核酸酶穩(wěn)定，增加與RNA的結(jié)合親和力，并且不被核 糖核酸酶H所切割。其基本結(jié)構(gòu)也可進行修飾，允許對其作為反義組分進行優(yōu)化。對于雜 環(huán)的修飾，已證明某些雜環(huán)修飾增強了反義作用，而不干擾核糖核酸酶H的活性。這些修飾 的一個實例為C-5噻唑修飾。最后，也可考慮糖的修飾。在細胞培養(yǎng)物和體內(nèi)，2' -0-丙 基和2'-甲氧基乙氧基核糖修飾使得寡核苷酸對核酸酶穩(wěn)定。
可通過直接轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)染并通過表達載體表達來將抑制性寡核苷酸遞送到細胞。 合適的表達載體包括哺乳動物表達載體和病毒載體，其中已克隆了具有合適調(diào)節(jié)序列的抑 制性寡核苷酸，所述調(diào)節(jié)序列包括啟動子，從而導(dǎo)致反義RNA在宿主細胞中表達。合適的啟 動子可以是組成型或發(fā)育特異性啟動子。轉(zhuǎn)染遞送可通過本領(lǐng)域中已知的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試 劑來實現(xiàn)(例如 Xtreme 轉(zhuǎn)染試劑，Roche, Alameda, CA ；Lipofectamine 制劑，Invitrogen, Carlsbad,CA)。由陽離子型脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的遞送以及直接遞送都是有效的。 另一種可能的遞送模式是使用抗體靶向至靶細胞的細胞表面標志物。
對于轉(zhuǎn)染，包含一個或多個核酸分子(有或沒有載體)的組合物可包含用于施用 給對象的遞送運載體，包括脂質(zhì)體，運載體和稀釋劑及其鹽，和/或可以可藥用制劑的形式 存在。遞送核酸分子的方法描述于例如Gilmore，等Curr Drug Delivery (2006) 3 147-5 以及Patil,^ AAPSJournal (2005) 7 :E61_E77，其均通過引用并入本文。siRNA分子的遞 送也描述于數(shù)個美國專利公開中，包括例如2006/0019912 ；2006/0014289 ；2005/0239687 ； 2005/0222064 ；和2004/0204377，其公開內(nèi)容均通過引用并入本文。核酸分子可通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的多種方法施用給細胞，所述方法包括但不限于包裝在脂質(zhì)體中、通過離 子電滲、通過電穿孔、或者通過摻入其他運載體中，包括可生物降解的聚合物、水凝膠、環(huán)糊 精。(參見例如 Gonzalez 等 1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074 ；Wang 等的國際 PCT 公開 No. WO 03/47518 和 WO 03/46185)，聚(乳酸-co-羥基乙酸)(PLGA)和 PLCA 微球 (參見例如美國專利No. 6，447，796和美國專利申請公開No. 2002/130430)，可生物降解納 米膠囊和生物粘附微球，或者通過蛋白質(zhì)載體(0' Hare和Normand，國際PCT公開No. WO 00/53722)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子也可與聚乙烯亞胺及其衍生物配制在 一起或相復(fù)合，例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞 胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。
可用于本發(fā)明的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑實例包括例如CellFectin，其為陽離子型脂 質(zhì)N，Ni，Nil, NIII-四甲基-N，Ni，Nil, NIII-四棕櫚基-y-精胺與二油?；字Ｒ掖及?DOPE)的 1 1. 5(M/M)脂質(zhì)體制劑(GIBCO BRL) ；Cytofectin GSV，其為陽離子 型脂質(zhì)與 DOPE 的 2 1(M/M)脂質(zhì)體制劑(Glen Research) ；DOTAP (N-[1-(2，3-二油 酰氧基)_N，N, N-三甲基-甲基硫酸銨)(Boehringer Manheim) ；Lipofectamine，其為 聚陽離子型脂質(zhì)DOSPA與中性脂質(zhì)DOPE的3 1 (M/M)脂質(zhì)體制劑(GIBCO BRL)；和 (5)siPORT(Ambion) ；HiPerfect(Qiagen) ；X-treme GENE(Roche) ；RNAicarrier(Epoch Biolabs)禾口 TransPass(New England Biolabs)。
在一些實施方案中，反義、SiRNA或核酶序列通過哺乳動物表達載體遞送至細 胞中。例如，適于siRNA表達的哺乳動物表達載體是市售的，例如，來自Ambion(例如 pSilencer vectors), Austin, TX ；Promega(例 如 GeneClip, siSTRIKE, SiLentGene), Madison, WI ；Invitrogen, Carlsbad, CA ；InvivoGen, San Diego, CA ； 禾口 Imgenex, San Diego, CA。通常，用于轉(zhuǎn)錄siRNA分子的表達載體具有TO啟動子。
在一些實施方案中，反義、siRNA或核酶序列通過病毒表達載體遞送至細胞。適 于遞送這些分子至細胞的病毒載體包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (包括慢病毒載體)。例如，開發(fā)用于遞送和表達siRNA寡核苷酸的病毒載體是市售的， 來自例如 GeneDetect，Bradenton, FL ；Ambion, Austin，TX ；Invitrogen, Carlsbad，CA ； OpenBioSystems, Huntsville，AL ；禾口 Imgenex，San Diego, CA0實施例
下列實施例為舉例說明而提供，而非對本發(fā)明作出限制。
實施例1 :NC0A3過表達與黑素瘤結(jié)局的相關(guān)性
使用含有來自具有確定組織學并隨訪的343名患者的原發(fā)黑素瘤的黑素瘤組織 微陣列(TMA)的免疫組織化學分析來評價NC0A3的表達。使用Cox回歸和Kaplan-Meier 分析來評估多個預(yù)后因素的存在與否對黑素瘤患者的無復(fù)發(fā)存活(RR5)和疾病特定存 活(DSS)的影響。使用logistic回歸分析來評估多個因素的存在與否對前哨淋巴結(jié) (sentinel lymph node, SLN)轉(zhuǎn)移的影響。
如下文我們的結(jié)果所證明的，NC0A3表達程度的提高對SLN轉(zhuǎn)移(p = 0. 013)和 SLN轉(zhuǎn)移的平均數(shù)(P = 0. 031)具有顯著預(yù)測性。Kaplan-Meier分析證明了 NC0A3過表達 與RFS(P = 0. 021) R DSS(P = 0. 030)降低之間的顯著相關(guān)性。logistic回歸分析顯示， NC0A3表達程度的提高是SLN狀態(tài)的獨立預(yù)測因素(P = 0.017)。多變量Cox回歸分析顯 示了 NC0A3表達對RFS (P = 0. 0095)和DSS (P = 0. 021)的獨立影響。NC0A3是預(yù)測DSS的 最強因素，要好于腫瘤厚度和潰爛。因此，這些結(jié)果將NC0A3鑒定為黑素瘤結(jié)局的新的獨立 標志物，其對SLN轉(zhuǎn)移、RFS和DSS有顯著影響。
黑素瘤TMA的表征和構(gòu)建
我們構(gòu)建了 343個原發(fā)黑素瘤的TMA，其隨訪至少兩年，有復(fù)發(fā)記錄，或者進行了 SLN活檢。表1中顯示人群的人口統(tǒng)計概要。在343名患者中，259名進行了 SLN活檢，因 此提供了有關(guān)SLN狀態(tài)的信息。接受SLN活檢的標準包括以下項黑素瘤厚度> 1.0mm，或 者在厚度1. Omm以下的黑素瘤中存在下列任意組織學因素Clark IV或V級，潰爛，涉及血 管，微衛(wèi)星，大范圍消退(覆蓋腫瘤直徑的50%以上)或者活檢不充分(部分活檢顯示黑素 瘤橫斷于底部)。該人群的平均隨訪是49個月，隨訪中值為45個月。如前所述，通過從石蠟塊取出1. Omm直徑的組織核心來構(gòu)建TMA(參見Kashani-Sabet M.等JClin Oncol, 22 617-623,2004 ；Kononen J.等 Nat Med 4:844-847,1998。
表1 患者人口統(tǒng)計學摘要人口統(tǒng)計學變量年齡(中值) 男性解剖學位置 頭頸 軀干四肢 組織學腫瘤類型淺表擴散型黑素瘤
結(jié)節(jié)型黑素瘤肢端黑素瘤 雀斑疾惡性黑素瘤個數(shù)(％,如果有的話) 53227 (66.2)60 (17.5) 137 (39.9) 146 (42.6)159 (46.4) 121 (35.3) 19 (5.5) 11 (3.2)促結(jié)締組織增生性黑素瘤9(2.6)未分類的黑素瘤 腫瘤厚度Tl (< 1.0 mm) T2 (1.01-2.0 mm) T3 (2.01-4.0 mm) T4 (> 4.0 mm)24 (7.0)22 (6.4) 110 (32.1) 97 (28.3) 114 (33.2)
免疫組織化學
對載玻片脫蠟，在二甲苯中再水化，然后在IOmM檸檬酸鹽緩沖液中微波處理。用 3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性，將載玻片依次與親和素和生物素封閉試劑一起孵 育。然后，將一抗(小鼠單克隆抗NC0A3IgG(Abeam #_abl4139))以1 10稀釋度加入，在 室溫下孵育60分鐘。將生物素化馬抗小鼠IgG抗體(Vector Laboratories,Burlingame, CA)作為用于放大的二抗，然后與ABC-HRP(Vector Laboratories) 一起孵育30分鐘，然后 是DAB/過氧化氫溶液(Sigma)。
免疫組織化學染餼的評價
對每個組織陣列核心染色最強的區(qū)域評分。使用下列標準對NC0A3蛋白質(zhì)的表達 進行分級未染色(0)，弱染色(1)，中等染色O)以及強染色(3)。由對病例身份不知情的 病理學家為陣列評分，由分離的獨立評分試驗重復(fù)每個得分。對于少數(shù)重復(fù)試驗中評分矛 盾的情況，確定一致得分。NC0A3染色的特異性對照包括乳腺癌、黑素瘤細胞系(L0X和FEM) 以及黑素瘤組織切片。陽性對照包括乳腺癌切片以及LOX和FEM細胞，而陰性對照包括扁31桃體組織和乳腺癌細胞系T47D。用于免疫組織化學的陰性對照包括使用磷酸鹽緩沖液替換 一抗，所有其他實驗條件保持不變。
統(tǒng)計學分析
用于評估多種預(yù)后因素對黑素瘤結(jié)局的重要性的統(tǒng)計方法之前已有描述。(參 見 Kashani-Sabet M.等 J Clin Oncol, 22 :617-623,2004 ；Kashani-Sabet M.等 J Clin Oncol, 20 :1826-1831,2002 ；Kashani—Sabet，Μ.等 Arch Dermatol, 137 :1169—1173，2001。 對于RFS和DSS，最初基于Kaplan-Meier分析中DSS預(yù)測值的最佳取舍值選擇高NC0A3得 分的定義(確定為2或3的得分)，在RFS和DSS的所有后續(xù)單變量和多變量分析中均一且 一致地使用相同的取舍值。使用Fisher精確檢驗以及單變量和多變量Cox回歸來評估高 NC0A3表達與RFS或DSS之間的相關(guān)性。對于SLN狀態(tài)，根據(jù)單變量logistic回歸分析的結(jié) 果，最佳取舍值確定為得分0和1或者2和3，所有后續(xù)檢驗SLN狀態(tài)的分析均一且一致地 使用相同的取舍值。使用卡方分析以及單變量和多變量logistic回歸來評估NC0A3表達與 SLN轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。使用方差分析(ANOVA)和定向Le檢驗評估NC0A3表達的提高與平 均SLN計數(shù)之間的相關(guān)性。除了此定向分析之外，所有報告的P值都是兩側(cè)的。除了 AJCC 分析的預(yù)后因素之外，數(shù)據(jù)集中還包括下列因素有絲分裂速率、腫瘤血管供應(yīng)、微衛(wèi)星存 在與否、血管涉及以及消退。臨床或病理屬性的編碼如前所述進行(參見Kashani-Sabet M.等 J Clin Oncol, 22 :617-623,2004)
MM
由于我們的cDNA微陣列結(jié)果表明NC0A3基因在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中與非相關(guān)原發(fā)腫 瘤相比差異表達，我們要在含有343個原發(fā)黑素瘤核心的TMA中在蛋白質(zhì)水平上檢查NC0A3 表達的預(yù)后影響。使用靶向人NC0A3的市售單克隆抗體(小鼠單克隆抗NC0A3IgG(AbCam#_ abl4139))分析NC0A3表達，由對患者結(jié)局不知情的觀察者評分。
所檢測的343個核心中，20個(8%，圖1A)沒有NC0A3表達，111個(32.4%,圖 1B)強表達(得分為幻。NC0A3的表達與黑素瘤的組織學亞型不顯著相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)， 可能的例外是促結(jié)締組織增生性黑素瘤，其中僅有一個原發(fā)腫瘤顯示強染色。另外，NC0A3 表達不與黑素瘤的幾種已知組織學預(yù)后因素相關(guān)聯(lián)，例如腫瘤厚度，潰爛，Clark分級，有絲 分裂速率，血管涉及，微衛(wèi)星或者腫瘤血管供應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
首先，我們通過單變量分析分析了 NC0A3表達與黑素瘤結(jié)局之間的相關(guān)性。高 NC0A3表達(確定為得分2或3)顯著增加黑素瘤復(fù)發(fā)的風險(52. 2%相對于35.9%，P =0. 010，F(xiàn)isher精確檢驗)，并且在用Kaplan-Meier分析時降低該人群中黑素瘤患者的 RFS (P = 0. 021，對數(shù)秩檢驗，圖2A)。高NC0A3表達與由于黑素瘤所致死亡的風險提高相關(guān) (31. 9%相對于18. 5%, P = O. 021，F(xiàn)isher精確檢驗)，并通過Kaplan-Meier分析與降低 的DSS相關(guān)(P = 0. 030，對數(shù)秩檢驗，圖2B)。
除了復(fù)發(fā)和死亡的風險之外，通過logistic回歸分析，NC0A3表達增加與陽性SLN 狀態(tài)(微轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)基底的一個度量)顯著相關(guān)(P = 0. 013)。NC0A3染色得分為 0的患者具有7. 的SLN陽性發(fā)生率，得分為1或2的患者增加至27. 4%，得分為3的患 者中是38. 3% (P = 0.036，卡方檢驗)。令人注意地，NC0A3表達水平也與SLN腫瘤負荷相 關(guān)，如通過所涉及的SLN平均個數(shù)所測量的。因此，NC0A3染色得分為0的患者中，所涉及 淋巴結(jié)的平均個數(shù)為0. 07。得分為1或2的患者中，增加到0. 47個淋巴結(jié)，得分為3的患者中為0. 57個淋巴結(jié)(P = 0. 0004AN0VA, P = O. 030Le定向檢驗)。
接下來，我們用多變量分析研究了 NC0A3表達對黑素瘤結(jié)局的影響。進行多變量 Cox回歸分析，包括NC0A3狀態(tài)和AJCC分級委員會針對黑素瘤所評價的六個臨床和組織學 預(yù)后因素(包括腫瘤厚度和潰爛)，目前用于皮膚黑素瘤AJCC分級分類的因素(參見Balch C. M 等 J ClinOncol,19 :3622-3634,2001 ；Balch C. M 等 J Clin Oncol, 19 :3635-3648, 2001)。該分析顯示，NC0A3狀態(tài)是RFS (表幻和DSS (表幻的獨立預(yù)測物。在DSS的Cox 回歸分析中，NC0A3作為決定存活的最強因素出現(xiàn)，勝過腫瘤厚度和潰爛。隨后，多變量 logistic回歸分析證明，在模型中包含六個其他預(yù)后因素時，NC0A3表達是SLN狀態(tài)的獨立 預(yù)測物(表4)。
最后，我們評估了在將數(shù)據(jù)組所包含(且可用于分析)的全部12種因素都輸入多 變量模型時，多種預(yù)后因素的預(yù)測值。除了前文提到的七種因素之外，該分析包括有絲分裂 速率、腫瘤血管供應(yīng)程度以及是否存在血管涉及、微衛(wèi)星和消退。當所有12種因素都包含 在多變量模型中時，NC0A3過表達仍然顯著預(yù)測了 DSS和SLN狀態(tài)(數(shù)據(jù)未顯示)。0179]表2.臨床、組織學和分子因素對黑素瘤人群RFS之影響的Cox回歸分析0180]預(yù)后因素風險比卡方 P倌(雙尾)0181]Clark分級2. 2216. 77 <.000050182]潰爛1. 9413. 86 . 00020183]NC0A3水平(2、3相比于1.696.72 . 00950184]0、1)0185]腫瘤厚度1. 275. 28 . 0220186]部位1. 393. 61 . 0570187]年齡1. 03 22 .640188]性別1. 04.04 .850189]表3.臨床、組織學和分子因素對黑素瘤人群DSS之影響的Cox回歸分析0190]預(yù)后因素風險比卡方 P倌(雙尾)0191]NC0A3 水平(2、3 相 1.91 529 .0210192]比于0、1)0193]腫瘤厚度1. 34 4.69 .0300194]潰爛1.65 4.89 .0270195]Clark分級1. 75 500 .0250196]部位1.09 1.65 . 200197]年齡1.41 2.27 . 130198]性別 1.00.0002 .990199]表4.臨床、組織學和分子因素對SLN轉(zhuǎn)移之影響的logistic回歸分析0200]預(yù)后因素越P倌(雙尾)0201]年齡下降12. 92.00030202]腫瘤厚度8. 10.00440203]Clark分級5. 14.0230204]NC0A3表達(3相比于 5.70.017
1、2相比于0)
性別1. 43.23
潰爛0. 79.37
部位0. 09.76
討論
這些結(jié)果顯示，原發(fā)皮膚黑素究I中NC0A3過表達與黑素瘤復(fù)發(fā)和疾病相關(guān)死亡顯著相關(guān)。在AJCC分級委員會分析的六個預(yù)后因素包含在多變量模型中時，NC0A3表達顯著預(yù)測了該人群的RFS和DSS。重要的是，在這些分析的每一個中，NC0A3表達都勝過腫瘤 厚度，并作為預(yù)測DSS的最強因素出現(xiàn)。自從修正的黑素瘤AJCC分級分類公開以來(參 見Balch C.M等J Clin Oncol，19 :3635_3648，2001)，在AJCC分級委員會分析的六種因素 包含在多變量模型中時，很少有分子預(yù)后因素顯示為具有獨立的預(yù)后意義，所以突出了將 NC0A3表達與黑素瘤相關(guān)結(jié)局相關(guān)聯(lián)這一發(fā)現(xiàn)的潛在重要性。
另外，在模型中包含全部12個可用的預(yù)后因素時，NC0A3狀態(tài)仍提供了有關(guān)DSS和 SLN狀態(tài)的獨立預(yù)后信息。此分析包括例如有絲分裂速率和血管涉及的因素，其已在多個 分析中顯示出比潰爛更有用。(參見Kashani-Sabet M.等J Clin Oncol, 20 :1826-1831, 2002 ；Azzola M. F.等 Cancer，97 :1488_1498，2003。綜上，這些結(jié)果證明了 NC0A3 作為黑素 瘤結(jié)局的新的獨立分子標志物的用途，其對黑素瘤的重要結(jié)局測量有顯著影響。
令人感興趣的是，過表達NC0A3的基因表達譜研究中所檢測的轉(zhuǎn)移主要是淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移，表明了 NC0A3表達對黑素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在重要性。而不僅僅是高NC0A3表達與 SLN轉(zhuǎn)移風險顯著增加相關(guān)。
與NC0A3表達和SLN狀態(tài)之間強相關(guān)一致的是，觀察到高NC0A3表達很少在該分 析中包含的促結(jié)締組織增生性黑素瘤小亞類中見到。我們也對前哨淋巴結(jié)活檢為陽性的促 結(jié)締組織增生性黑素瘤患者進行了免疫組織化學分析。分析證明，原發(fā)腫瘤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移都是陽性(圖3)。這表明，NC0A3免疫染色在鑒定發(fā)生前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的促結(jié)締組織增 生性黑素瘤病例中的用途。
由于在該數(shù)據(jù)組中大部分患者進行了 SLN活檢，本發(fā)明所報告結(jié)果中的一部分有 可能由于選擇偏好而失真。對于在薄(< 1. Omm)和厚(> 4. Omm)腫瘤以及特定組織學亞 型(例如促結(jié)締組織增生性黑素瘤)的情況下選擇患者進行SLN活檢，仍然有爭議。因此， 推薦進行SLN活檢所用的選擇標準可能對報告結(jié)局數(shù)據(jù)有影響。因而，NC0A3過表達的重 要性可能與進行SLN活檢的患者最為相關(guān)。
最后，由于其在激素敏感性和激素非依賴性惡性腫瘤中的重要性，這些結(jié)果揭示 了 NC0A3作為癌癥預(yù)后標志物的廣泛意義。
總之，我們的結(jié)果顯示，NC0A3過表達與復(fù)發(fā)風險增加以及黑素瘤相關(guān)存活降低之 間顯著相關(guān)。另外，它們顯示NC0A3表達是黑素瘤結(jié)局幾種度量的獨立預(yù)測物，包括DSS、 RFS和SLN狀態(tài)，表明NC0A3是原發(fā)皮膚黑素瘤的新的預(yù)后標志物。
^MM 2 抑泡丨NC0A3在小薩,It型中抑泡丨了H素瘤轉(zhuǎn)牛發(fā)展
本實施例顯示，NC0A3基因的表達對于黑素瘤轉(zhuǎn)移性表型的維持來說是重要的。我 們使用全身性非病毒核酶(Kashani-Sabet，20(^)和基于siRNA的基因遞送來靶向NC0A3 基因。將靶向小鼠NC0A3的錘頭狀核酶和siRNA克隆到我們的表達質(zhì)粒中，在腫瘤接種后第3天和第10天用對照或NC0A3抑制載體處理帶有腫瘤的小鼠。肺中轉(zhuǎn)移腫瘤負荷的分 析(由肺腫瘤的個數(shù)所顯示)顯示，與載體對照相比，用抗NC0A3核酶或siRNA處理的動物 負荷顯著減少(圖4)。肺重量分析(轉(zhuǎn)移腫瘤負荷的另一個度量)顯示Rz397是唯一顯著 抑制C57B1/6肺重量的構(gòu)建體(圖幻。這些研究清楚地證明，基因表達譜分析在鑒定黑素 瘤發(fā)展的功能性以及分子標志物中的用途。此外，它們顯示，由cDNA微陣列分析所鑒定的 標志物可作為轉(zhuǎn)移性黑素瘤治療的靶標。
有趣的是，靶向核苷酸的抗NC0A3核酶397的全身性施用還抑制了 BALB/c小鼠中 4T1小鼠乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移性發(fā)展。在4T1模型中，核酶在抗腫瘤作用方面優(yōu)于靶向NC0A3 相同區(qū)域的siRNA以及載體對照和突變體、失活核酶和siRNA對照。這些結(jié)果表明了 NC0A3 打靶在轉(zhuǎn)移乳腺癌和黑素瘤治療中的潛在治療性用途。
最后，體外將Rz397或siRNA385瞬時轉(zhuǎn)染進B16黑素瘤細胞，這減少了腫瘤細胞 向matrigel的侵襲，提示了 NC0A3打靶抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機制(圖7)。
^MM 3 黑素瘤發(fā)展中ffnt-2的差異表汰
我們在40個良性痣和376個原發(fā)黑素瘤的組織微陣列測試組中以及34個與痣相 關(guān)出現(xiàn)的原發(fā)黑素瘤組織切片的驗證組中進行了 WNT-2表達的免疫組織化學分析。良性痣 顯示，痣交界區(qū)中Wnt-2強染色，痣基部幾乎完全沒有表達。相反，原發(fā)黑素瘤顯示更均一 的染色模式，染色在垂直生長界面上沒有明顯變化。原發(fā)黑素瘤基部的Wnt-2免疫染色顯 著高于痣基部。與痣相關(guān)出現(xiàn)的黑素瘤的Wnt-2表達匹配成對分析顯示，所有病例中痣交 界區(qū)中Wnt-2染色均顯著高于同一個痣的基部。另外，在所有病例中原發(fā)黑素瘤的Wnt-2 得分均顯著高于痣基部的匹配對照。這些在下文給出的結(jié)果證實了 WNT通路活化在黑素瘤 發(fā)展中的重要性，顯示W(wǎng)nt-2為黑素瘤的新的生物標志物。
構(gòu)建兩個數(shù)據(jù)組用于本研究中進行的分析(i)測試組，由138個良性痣和376個 原發(fā)黑素瘤的組織微陣列組成，和(ii)驗證組，34個在痣中產(chǎn)生的原發(fā)黑素瘤的組織切 片。痣陣列中包括的138個痣中，40個有一部分表皮包括在核心中，以允許準確分析痣交界 區(qū)相對于痣基部的Wnt-2染色。所研究的微陣列中40個痣的組成如下5個后天混合痣，9 個先天混合痣，7個后天真皮內(nèi)痣，17個先天真皮內(nèi)痣，1個后天發(fā)育異常痣和1個交界痣。 黑素瘤微陣列中所包括的原發(fā)黑素瘤的組織學亞型如下176個淺表擴散型黑素瘤，132個 結(jié)節(jié)性黑素瘤，14個雀斑痣惡性黑素瘤，22個肢端黑素瘤，10個促結(jié)締組織增生性黑素瘤 以及22個未分類黑素瘤。在驗證組中，我們制備了來自34個在痣中產(chǎn)生的原發(fā)黑素瘤病 例的組織切片。34個病例中，觀個具有含交界和真皮組分的痣，而31個具有真皮痣和侵入 的黑素瘤。下列是痣和黑素瘤的組織學亞型概述22個先天性痣，8個后天痣，1個發(fā)育異 常痣，19個淺表散布型黑素瘤，7個結(jié)節(jié)性黑素瘤和5個未分類黑素瘤。
組織陣列
組織微陣列如前所述使用Beecher陣列裝置取1. Omm直徑的組織核心來制備(參 見Kononen，J.等 Nat Med，1998，4:844-847 ；Kashani-SabetM.等J Clin Oncol,2004, 22 617-623)。塊構(gòu)建之后，使用組織切片機切成5μπι切片，置于裝置的載玻片上。制備平均 約40個組織/陣列的總共16個黑素瘤陣列以及總共4個痣陣列。黑素瘤陣列包含總共 673個組織核心(150個患者的具有副本核心的457個原發(fā)黑素瘤)。痣陣列包含總共138個組織核心。組織微陣列上的457個原發(fā)黑素瘤中，376個可認為有Wnt-2染色。
免疫組織化學
染色前，將載玻片在60°C下烘30分鐘，脫蠟，通過在二甲苯中漂洗再水化。然后， 將載玻片在IOmM檸檬酸鹽緩沖液中微波處理。用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶活 性。用PBS清洗后，將載玻片在室溫下與正常兔血清一起孵育30分鐘，以減少非特異性背 景染色，然后用PBS清洗。然后，將一抗(山羊多克隆抗Wnt-2 IgG(Biovision))以1 5 稀釋度加入，在4°C下過夜孵育。將生物素化山羊抗兔IgG抗體(VectorLaboratories， Burlingame, CA)作為用于放大的二抗，然后與 ABC-HRP (Vector Laboratories) 一起孵育 30分鐘，然后是DAB/過氧化氫溶液(Sigma)。用蘇木精復(fù)染載玻片，用permoimt封片。對 于組織陣列載玻片和常規(guī)切片，使用相同的Wnt-2免疫組織化學染色方案。
免疫組織化學染餼的評價
對每個組織陣列核心和組織切片染色最強的區(qū)域評分。使用下列標準對Wnt-2蛋 白質(zhì)的表達進行分級未染色(0)，弱染色(1+)，中等染色以及強染色(3+)。將沒有 侵襲性黑素瘤或痣的樣品或者不可判斷的樣品排除在分析之外。由對病例身份不知情的病 理學家為陣列和切片評分，評分獨立進行兩次，對于矛盾的評分確定一致的得分。Wnt-2染 色的特異性對照包括乳腺癌、黑素瘤細胞系(L0X和FEM)以及黑素瘤組織切片。
統(tǒng)計學分析
用于評估多個預(yù)后因素對黑素瘤相關(guān)結(jié)局的重要性的統(tǒng)計方法如下在組織微陣 列中，使用二項符號檢驗和威爾科克森配對符號秩檢驗來檢驗痣交界區(qū)和痣基部Wnt-2免 疫染色的潛在差異。使用Marm-Whitney檢驗來檢驗痣基部和黑素瘤基部Wnt_2免疫染色 之間的潛在差異。在痣中產(chǎn)生的原發(fā)黑素瘤的組織切片中，使用二項符號檢驗和威爾科克 森配對符號秩檢驗來檢驗痣交界區(qū)和痣基部Wnt-2免疫染色的潛在差異。使用二項符號檢 驗和威爾科克森配對符號秩檢驗來檢驗痣基部和黑素瘤基部Wnt-2免疫染色的潛在差異。 報告的全部P值為兩側(cè)的(two-sided)。
MM
由于我們的cDNA微陣列結(jié)果顯示W(wǎng)nt通路在黑素瘤中與痣相比差異表達，我們試 圖檢測更大的獨立黑素細胞腫瘤群體中Wnt-2的差異表達。為此，我們構(gòu)建了含有138個 黑素細胞痣和376個原發(fā)黑素瘤的組織微陣列的測試組，以及34個含有已有痣的原發(fā)黑素 瘤的組織切片的驗證組。使用靶向人Wnt-2的市售單克隆抗體分析Wnt-2的表達。在優(yōu)化 Wnt-2免疫組織化學染色的過程中，我們發(fā)現(xiàn)了良性痣中Wnt-2的有趣染色模式。良性痣顯 示，痣交界區(qū)中Wnt-2強染色，痣基部幾乎完全沒有表達(圖8)。
由于這一發(fā)現(xiàn)，我們將我們對痣組織微陣列中Wnt-2表達的分析限于含有一部分 表皮的那些痣核心，使得可以對痣交界區(qū)和痣基部的免疫染色進行比較。這將有效的痣陣 列組減少到40個病例。在40個所檢測病例的每一個中，痣交界區(qū)中Wnt-2免疫染色都高 于匹配的基部，該發(fā)現(xiàn)具有高度顯著性(P < 0.00005，二項符號檢驗)。在將陣列中存在的 痣分為兩個最常見的組織學亞型(即真皮內(nèi)黑素細胞痣和復(fù)合黑素細胞痣)時，痣基部的 Wnt-2免疫染色缺失仍然是顯著的(P < 0. 001，二項符號檢驗)。
接下來，我們研究了含有376個原發(fā)黑素瘤核心的組織陣列中的Wnt-2免疫染色。 與痣不同，原發(fā)黑素瘤顯示更均勻的染色模式，在整個垂直生長面上沒有染色減少(圖9)。所分析的絕大多數(shù)原發(fā)黑素瘤顯示一定程度的Wnt-2表達，僅有8例缺乏染色(3. 8% )。此 外，在不同黑素瘤組織學亞型之間存在均一的Wnt-2表達強度(表幻。Wnt-2表達與幾種 公知黑素瘤預(yù)后標志物之間沒有顯著相關(guān)性，包括腫瘤厚度，潰爛，Clark分級，有絲分裂速 率，微衛(wèi)星和血管涉及(數(shù)據(jù)未顯示)。
表5.原發(fā)黑素瘤的不同組織學亞型的Wnt-2表達程度
組織學亞型Wnt-2得分病例數(shù)(％)0123SSM7/176 (4.0)45/176 (25.6)92/176 (52.3)32/176 (18.2)NM5/132 (3.8)28/132 (21.2)60/132 (45.5)39/132 (29.5)LMM0/145/14 (35.7)7/14 (50)2/14 (14.3)AM1/22 (4.5)7/22 (31.8)11/22 (50)3/22 (13.6)DM0/105/10 (50)3/10 (30)2/10 (20)NOC1/22(4.5)10/22 (45.5)8/22 (36.4)3/22 (13.6)
縮寫SSM，淺表擴散型黑素瘤；匪，結(jié)節(jié)性黑素瘤；LMM，雀斑痣惡性黑素瘤；AM，肢 端黑素瘤；DM，促結(jié)締組織增生性黑素瘤；N0C，未分類黑素瘤。
然后，我們比較了原發(fā)黑素和痣中觀察到的Wnt-2免疫染色。鑒于痣中的Wnt_2 表達模式，我們比較了痣基部與黑素瘤基部所觀察到的Wnt-2得分。黑素瘤基部的平均得 分(1. 88)顯著高于痣基部的平均得分(0. 57，P < 0. 00005，非配對T檢驗)。
為了進一步研究組織微陣列中所觀察到的痣和原發(fā)黑素瘤之間的差異性Wnt-2 表達，我們推理出，評價潛在差異的最佳情況是之前已有痣的黑素瘤病例，對于它們來說許 多可能的干擾因素(年齡、性別、解剖學位置以及可能不相關(guān)的痣和黑素瘤的組織學亞型 等等)被自動對照，由此產(chǎn)生實際的配對分析。因此，我們收集了 34個與痣相關(guān)的原發(fā)黑 素瘤病例的驗證組，在5 μ m組織切片上進行Wnt-2的免疫組織化學染色。
首先，我們分析了痣交界區(qū)相對于痣基部的Wnt-2表達。在34個病例中，觀個在 切片中具有交界區(qū)和痣基部。在觀個病例的每一個中，痣交界區(qū)中Wnt-2免疫染色都高于 匹配的基部，該發(fā)現(xiàn)具在高度顯著性(P < 0. 00005，二項符號檢驗和威爾科克森配對符號 秩檢驗)。通過分析高和低Wnt-2得分的病例百分比證實了痣基部Wnt-2的表達顯著降低。 因此，90. 6%的交界區(qū)得分為2或3，而94. 1 %的痣基部得分為0或1 (表6)。有趣的是，所 有痣的交界區(qū)都沒有不染色(得分0)，所檢測的痣基部中沒有強染色(得分幻，進一步說 明了該二分法。
表6.痣交界區(qū)與痣基部Wnt-2免疫染色程度
ffnt-2得分 病交界區(qū)痣基部
(表現(xiàn)出得分的％病例)
0/1+9. 4%94. 1%37
2/3+90. 6%5. 9%
最后，我們比較了黑素瘤基部和所染色樣品中其相關(guān)痣基部的Wnt-2表達模式。 34個病例中，31個具有痣基部和黑素瘤基部用于比較。在四個病例中，黑素瘤基部的 Wnt-2免疫染色顯著高于其匹配的痣基部(如圖11所示)，兩個病例顯示W(wǎng)nt-2得分相同 (P < 0. 00005，二項符號檢驗和威爾科克森配對符號秩檢驗)。痣基部的Wnt-2表達在任 何情況下均不高于黑素瘤。該現(xiàn)象再一次反映在痣和黑素瘤內(nèi)的Wnt-2染色強度之中。因 此，100%的黑素瘤具有大于0的Wnt-2得分，相比之下痣為32. 4% (表7)。沒有黑素瘤缺 乏Wnt-2表達(得分為0)，沒有痣顯示基部的強染色(得分為3)。
表7.黑素瘤基部與痣基部的Wnt-2免疫染色
ffnt-2得分黑素瘤基部 痣基部
0(表現(xiàn)出得分的％病例) 0%67.6%
> 0(表現(xiàn)出得分的％病例)100%32.4%
我們還對另外三組人群進行了 Wnt-2免疫染色，(i)發(fā)育異常痣，(ii) Spitz痣，和 (iii)誤診的黑素細胞贅生物。我們的分析顯示，在痣群體中觀察到的差異性Wnt-2表達可 特別地擴展到發(fā)育異常痣(P < 0. 05)和Spitz痣(ρ = 0. 004)，它們是其為因在組織病理 學水平上難以與黑素瘤區(qū)分而著名的痣亞型。在這些病例的每一個中，痣交界區(qū)中Wnt-2 免疫染色均高于痣基部，兩者都是統(tǒng)計學上顯著的。最后，我們分析了 7個其中不明確黑素 細胞贅生物病例，其基于隨后的疾病復(fù)發(fā)(5個病例中痣的診斷被證明是不正確的)或者 專家病理學復(fù)查O個病例中推翻了對黑素瘤的診斷)是誤診的。在7個病例里的6個中， Wnt-2免疫染色的模式指出了最后的正確診斷，包括最初誤診為痣的全部5個病例。這些結(jié) 果顯示，由于其能夠正確診斷這些病例中的85.7%，ffnt-2免疫染色能輔助不明確黑素細 胞腫瘤的診斷。
在本研究中，我們提供了 Wnt-2在黑素瘤發(fā)展中在蛋白質(zhì)水平上差異表達的令人 信服的證據(jù)。我們的結(jié)果清楚地顯示，在組織微陣列分析以及配對分析(其中每個黑素瘤 與其之前已有的痣配對)中，Wnt-2在黑素瘤中與黑素細胞痣相比差異表達。在后一分析 中，發(fā)現(xiàn)僅有黑素瘤在其基部高表達Wnt-2，僅有痣顯示在其基部缺乏Wnt-2表達。
另外，在黑素細胞痣中觀察到Wnt-2表達的有趣模式。在所研究的每個病例中，痣 基部Wnt-2的表達均明顯低于交界區(qū)。此外，在陣列研究和痣中出現(xiàn)的黑素瘤的分析中，很 大比例(55%)的所檢測痣的基部缺乏Wnt-2免疫染色。
ffnt-2染色模式在痣中與黑素瘤相比的顯著差異顯示了 Wnt_2免疫染色在不明 確黑素細胞腫瘤的分子診斷中的用途。來自痣和黑素瘤組織陣列的結(jié)果顯示了高Wnt-2 染色在黑素瘤診斷中98%的特異性，其具有70%的特異性。我們的數(shù)據(jù)根據(jù)Wnt-2表達 水平區(qū)分了痣和黑素瘤。基部染色強烈(得分2或3+)的黑素細胞病變非?？赡苁呛谒?瘤(99.6%)?；匡@示較少染色(得分0或1)的病變當時30%是黑素瘤，得到了所觀察 到的靈敏度。但是，隨后將分析這些病變的交界區(qū)，在幾乎每個病例中痣都顯示較深部分 中染色減少，而黑素瘤顯示在交界區(qū)和較深區(qū)域之間染色均勻。迄今為止，盡管已分析了 腫瘤細胞增殖的標志物(例如Ki-67 ；參見Smolle，J.等Am J Dermatopathol，1989，11 301-307 ；Rieger,E.等JCutan Pathol,1993,20 :229-236 ；Kaleem，Z.等Mod Pathol,2000,13 =217-222)在此差異診斷困境中的作用，但尚沒有標志物顯示出臨床上可用的在痣和黑 素瘤之間的強表達差異。
對Wnt-2觀察到的免疫染色減少已經(jīng)在其他一些標志物中觀察到，包括S100A6、 Melan-A 和 HMB-45(參見 Fullen，D. R.等 JCutan Pathol,2001, 28 :393-399 ；Busam, K. J.等 Am J Surg Pathol, 1998, 22 :976-982 ；Kucher, C.等 Am J Dermatopathol，2004， 26 =452-457) 0但是，這些標志物通常不用于區(qū)分痣和原發(fā)黑素瘤。另外，在一些此類研究 中，真皮內(nèi)痣是所檢測的主要痣類型。真皮內(nèi)痣已知在其基部發(fā)生顯著的成熟。在我們的 研究中，在分為痣亞型時，在可能不具有相同成熟模式的真皮內(nèi)痣、混合痣(一般地)以及 后天混合痔、發(fā)育異常和Spitz痣的基部，Wnt-2免疫染色均顯著下調(diào)。這顯示了 Wnt-2作 為黑素瘤分子診斷標志物的更廣泛用途。
本發(fā)明所述的cDNA微陣列結(jié)果也允許在黑素瘤中區(qū)分診斷與預(yù)后標志物?；?表達譜分析顯示，獨特的基因表達特征表征了從痣過渡到原發(fā)黑素瘤以及從原發(fā)黑素瘤到 轉(zhuǎn)移性黑素瘤。(參見 Haqq C.等 Proc NatlAcad Sci USA，2005，102 :6092-6097)。因此， 在痣向黑素瘤過渡中差異表達的標志物可作為最有用的診斷標志物，而在原發(fā)到轉(zhuǎn)移過渡 中鑒定的標志物可作為最有用的預(yù)后標志物。這得到了 Wnt-2免疫染色結(jié)果的支持，該結(jié) 果表明其作為診斷標志物最有用，而不是預(yù)后標志物。盡管痣和黑素瘤之間的Wnt-2免疫 染色有顯著差異，但是Wnt-2表達與幾種已知黑素瘤預(yù)后標志物卻沒有顯著相關(guān)性。
為了分析Wnt-2打靶對轉(zhuǎn)移發(fā)展的潛在治療益處，我們分析了全身性遞送靶向小 鼠Wnt-2的錘頭狀核酸酶對B16黑素瘤的抗腫瘤效力。將B16細胞靜脈注射進C57B1/6小 鼠，在腫瘤細胞注射后第7天用對照空載體或表達抗Wnt-2核酶的質(zhì)粒載體處理小鼠。由 處死后轉(zhuǎn)移肺腫瘤的數(shù)目評定轉(zhuǎn)移負荷。如圖10所示，抗Wnt-2核酶表達構(gòu)建體的單次注 射導(dǎo)致了對大的(> 2mm)血管發(fā)生依賴性肺腫瘤的顯著抑制。這些研究支持了 Wnt-2打 靶在抑制轉(zhuǎn)移發(fā)展中的作用。
綜上，這些結(jié)果顯示了 Wnt-2對黑素細胞轉(zhuǎn)化的重要性。盡管WNT通路活化似乎 發(fā)生在黑素瘤發(fā)展的早期，但是來自體外和體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)都表明，Wnt-2表達是黑素瘤細 胞持續(xù)存活和增殖所需的?；诳贵w和siRNA的Wnt-2打靶在體外導(dǎo)致了幾種黑素瘤細胞 系的凋亡誘導(dǎo)，在體內(nèi)導(dǎo)致了異種移植物的顯著抑制。我們實驗室進行的初步研究也顯示， 小鼠模型中黑素瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)展需要Wnt-2表達(參見上文圖10)。因此，這些結(jié)果提示了 Wnt-2打靶用作黑素瘤合理治療性策略的潛在治療用途。本文所用的免疫染色測定可有助 于鑒定適用于采用特異性Wnt-2抑制劑靶向治療方法的患者人群。
總之，我們的研究證明了黑素瘤與痣中WNT通路的差異表達，證實了之前從黑素 細胞贅生物基因表達譜分析中獲得的結(jié)果。另外，它們證實了 WNT-2活化在黑素瘤發(fā)展中 的重要性。最后，它們教導(dǎo)了 Wnt-2作為黑素瘤新生物標志物以及作為治療潛在靶標的用 途。
實施例4 =PHIP在黑素瘤中的作用
我們評價了 PHIP(普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白)基因在黑素瘤的侵 襲和轉(zhuǎn)移表型中的作用。我們設(shè)計了小鼠PHIP的幾種核酶和siRNA抑制劑，將其克隆進 表達質(zhì)粒。在腫瘤細胞接種后第3天和第10天注射時，將靶向PHIP的基于質(zhì)粒的核酶和 siRNA全身性遞送進帶有轉(zhuǎn)移B16黑素瘤的C57B1/6小鼠導(dǎo)致了轉(zhuǎn)移發(fā)展的顯著抑制(如轉(zhuǎn)移肺腫瘤個數(shù)所顯示的)。另外，我們研究了 PHIP貢獻于黑素瘤發(fā)展的機制(圖12)。我 們用表達如上所述活性核酶或siRNA或者對照、無活性核酶或siRNA的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染B16 細胞，檢測這些轉(zhuǎn)染細胞對matrigel測定的侵襲。這些結(jié)果顯示，抗PHIP siRNA和核酶顯 著抑制了侵襲(圖13)。綜上，這些結(jié)果鑒定了 PHIP在黑素瘤中的新的促侵襲和轉(zhuǎn)移表型， 顯示PHIP可作為黑素瘤轉(zhuǎn)移治療的合理靶標。
實施例5 骨橋蛋白在黑素瘤中的作用
我們還研究了骨橋蛋白表達在黑素瘤中的預(yù)后作用。我們在含有接受前哨淋巴結(jié) 活檢、隨訪兩年或者有復(fù)發(fā)記錄的350個原發(fā)黑素瘤樣品的組織微陣列中評估了 OPN免疫 染色。OPN表達記錄為0 (缺乏)、1 (弱)、2 (中等)和3 (強)。根據(jù)單變量分析，OPN表達 提高與SLN轉(zhuǎn)移風險提高相關(guān)聯(lián)(如logistic回歸所確定的)，并與無復(fù)發(fā)存活(RFS)和 總存活(OS)的降低相關(guān)聯(lián)(如Kaplan-Meier分析所確定)。根據(jù)包含6種其他已知黑素 瘤預(yù)后標志物的多變量logistic回歸分析，0ΡΝ(定義為得分為0，相對于1、2和3)表達增 加是SLN轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測物。根據(jù)多變量Cox回歸分析，高OPN表達(定義為得分0禾口 1， 相對于2和幻是無復(fù)發(fā)存活和總存活降低的獨立預(yù)測物(參見下文表8和9)。根據(jù)其在 預(yù)測SLN狀態(tài)、RFS和OS中的作用，這些結(jié)果將OPN鑒定為黑素瘤預(yù)后的新的獨立標志物。
表8、臨床、 且織學和分子因素對SLN轉(zhuǎn)移之影響的logistic回歸分析
預(yù)后因素卡方P值
年齡降低15. 35< .001
腫瘤厚度10. 70.001
OPN表達(1，2，3，相對于0)7. 60.006
Clark分級1. 82.18
性別1. 81.18
部位0. 80.37
潰爛0. 43.51
表9臨床、經(jīng)i織學和分子因素對黑素揭■人群0之S影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素風險比卡方P值
OPN水平(2，3，相對于0，1)1. 606. 37 .012
Clark分級1. 685. 84.016
潰爛1. 555. 77.016
腫瘤厚度1. 295. 03.025
部位1. 443. 53.06
年齡1. 061. 29.26
性別1. 065.10.75
實施例6 黑;素瘤中NC0A3 frtI拷貝數(shù)
我們還通過熒光原位雜交(FISH)確定了黑素瘤中NC0A3的拷貝數(shù)。我們開發(fā)了檢測NC0A3表達的FISH測定，分析了 4個顯示NC0A3過表達的黑素瘤病例。使用FISH對 這些病例的分析顯示，每一個病例都具有高拷貝數(shù)的NC0A3基因(圖14)。這是第一次證 明，黑素瘤中存在高拷貝數(shù)的NC0A3基因。
實施例7 黑素瘤中的RGSl表達
在301名患者的組織微陣列中研究RGSl表達對黑素瘤結(jié)局的預(yù)后影響。使用存 檔的原發(fā)黑素瘤樣品的免疫組織化學分析確定RGSl表達，由對患者結(jié)局不知情的病理學 家根據(jù)染色強度以四級標準(0- 進行評分。
高RGSl表達與腫瘤厚度增加相關(guān)。在RGSl得分為0的腫瘤中，平均腫瘤厚度為 2. 2mm，在得分大于0的腫瘤中其增至4. 09mm(P < 0. 00005，t檢驗)。另外，RGSl表達的提 高與腫瘤血管供應(yīng)提高相關(guān)(P = 0. 045)。根據(jù)單變量logistic回歸分析，RGSl表達提高 與SLN狀態(tài)顯著相關(guān)(P = 0. 04，卡方統(tǒng)計4. 12)。如陽性SLN平均個數(shù)所確定地，RGSl表 達提高也與SLN負荷增加相關(guān)。因此，RGSl得分為0的患者中，SLN陽性平均個數(shù)為0. 118， 在得分為1或2的病例中增至0. 415，在得分為3的病例中為0. 723 (P = 0. 0055，AN0VA)。 根據(jù)Kaplan-Meier分析，相比于低RGSl表達(得分0或1)的病例，高RGSl表達(定義為 得分2或幻與明顯惡化的疾病特定存活(DSQ相關(guān)聯(lián)(P = 0. 018，對數(shù)秩檢驗)。
多變量Cox回歸分析顯示，RGSl可作為黑素瘤相關(guān)結(jié)局的有效獨立預(yù)測物，如無 復(fù)發(fā)存活(表10)、總存活(表11)和疾病特定存活(表1 分析所確定。根據(jù)分步Cox回 歸，Clark分級、潰爛和RGSl表達保持對RFS的有效預(yù)測性。根據(jù)分步Cox回歸，Clark分 級、潰爛、部位和RGSl表達保持對OS的有效預(yù)測性。根據(jù)分步Cox回歸，厚度和RGSl表達 保持對DSS的有效預(yù)測性。納入12種組織學或臨床預(yù)后因素后，根據(jù)分步Cox回歸分析， RGSl表達是RFS(P = 0. 04)、0S(P = 0. 036)和DSS(P = 0. 01)的獨立預(yù)測物。這些結(jié)果 將RGSl確立為新的黑素瘤獨立預(yù)后因素。
表10多種因素對黑素瘤人群無復(fù)發(fā)存活(RFS)之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素風險比卡方P值
Clark分級1. 9722. 9< ·00005
潰爛2. 0114. 2.0002
RGS 水平(0,1,2,3)1.30 6.65.0099
部位1. 292. 01.16
年齡.941. 25.26
性別1. 221. 12.29
腫瘤厚度1. 12.87.35
表11、多種因素對黑素瘤人群中總體存活之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素風險比卡方P值
Clark分級1. 435. 25.022
潰爛1. 726. 98.0083
RGS 水平(0,1,2,3)1.34 6.63.01
部位1. 493. 71.054
年齡1. 06.98.32
腫瘤厚度1. 242. 69.10
性別1. 311. 54.22
表12、多種因素對黑素瘤人群疾病特定存活之影響的Cox回歸分]
預(yù)后因素風險比卡方P值
RGS 水平(0,1,2,3)1.43 7.09 .0077
Clark 水平
潰爛
腫瘤厚度1.52 5. 47 . 019 1. 54 3. 30 . 069 1. 29 2. 74 . 098
部位
性別
年齡1. 29 1. 22 . 27 1.23 .71 .4098 .05 .82
實施例8 用于預(yù)后的兩標志物和三標志物測定
我們分析了組合標志物表達對黑素瘤結(jié)局的影響。首先，我們檢查了 NC0A3和 SPPl標志物表達可用的309個原發(fā)黑素瘤樣品中的SLN陽性。將NC0A3和SPPl的表達根據(jù) logistic回歸建立的最佳取舍值分為高或低。高NC0A3表達定義為得分2和3，而高SPPl表 達定義為得分大于0。在兩種標志物均為低得分的病例中，SLN陽性率當時為0%;在低SPPl 和高NC0A3的病例中其增加至12. 5%，低NC0A3和高SPPl的病例中為26. 7%，兩種標志物 均為高得分的病例中為37.0%。標志物表達對SLN狀態(tài)的增量影響是高度顯著的(雙尾 P值為0. 0007)。另外，過表達標志物數(shù)目的增加顯著預(yù)測了 SLN狀態(tài)，如單變量logistic 回歸分析所確定(卡方統(tǒng)計14. 7，P = 0. 0001)。分析高表達標志物個數(shù)(0、1或2、的單 變量logistic回歸分析顯示，標志物過表達的增加對SLN狀態(tài)有顯著影響(P = 0. 0004)。 接下來，我們研究了組合標志物表達對SLN腫瘤負荷的影響，如陽性SLN平均個數(shù)所確定。 在兩種標志物均為低得分的病例中，陽性SLN的平均個數(shù)是0 ；在低SPPl和高NC0A3的病 例中增加至0. 25%，低NC0A3和高SPPl的病例中為0. 38，兩種標志物均為高得分的病例中 為0. 63。標志物表達對SLN腫瘤負荷的增量影響也是顯著的(非定向Kruskal-Wallis檢 驗0. 01 ；Le定向顯著性檢驗0. 0066)。
接下來，研究組合標志物表達對該人群中黑素瘤無復(fù)發(fā)存活(RR5)的影響。在兩 種標志物均為低得分的病例中，平均RFS是0. 45年；在低SPPl和高NC0A3的病例中增加至 0. 50，在低NC0A3和高SPPl的病例中為0. 55，兩種標志物均為高得分的病例中為0. 56 (Le 定向顯著性檢驗，0.0091)。另外，過表達標志物數(shù)的增加有效預(yù)測了 RFS，如單變量Cox回 歸分析所確定(P = 0.017)。類似地，在組合標志物數(shù)據(jù)時，對總體存活(OS)也有影響。 在兩種標志物均為低得分的病例中，平均OS是0. 47年；在低SPPl和高NC0A3的病例中 增加至0. 51，在低NC0A3和高SPPl的病例中為0. 55，在兩種標志物均為高得分的病例中 為0. 57 (Le定向顯著性檢驗，0. 018)。最后，在將標志物表達得分組合后，對疾病特定存活 (DSS)有影響。因此，在兩種標志物均為低得分的病例中，平均DSS是0. 47年；在低SPPl和 高NC0A3的病例中增加至0. 52，在低NC0A3和高SPPl的病例中為0. 52，在兩種標志物均為 高得分的病例中為0. 60$值0. 04,AN0VA,Le定向顯著性檢驗，0. 0069)。另外，過表達標志 物數(shù)的增加有效預(yù)測了 DSS，如單變量Cox回歸分析所確定(P = 0.013)。
最后，使用多變量分析對組合標志物表達得分的影響進行分析。使用logistic回 歸對組合標志物表達數(shù)據(jù)對SLN狀態(tài)的影響進行分析。該分析顯示，組合NC0A3/SPP1狀態(tài) 是決定SLN狀態(tài)的第一因素，優(yōu)于常規(guī)組織學標志物(下文表13)。根據(jù)分步回歸分析，僅 有組合NC0A3/SPP1狀態(tài)(P = 0. 0013)、腫瘤厚度(P = 0. 0016)和血管涉及(P = 0. 039) 有效預(yù)測了 SLN狀態(tài)。
在使用多種標志物時，用于這些標志物的試劑可同時或依次(或兩者皆有)應(yīng)用42和檢測。在使用多種標志物時，測定標志物表達量的步驟可同時、依次進行，或兩者皆有。
表13、多種因素對黑素瘤人群SLN狀態(tài)之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素卡方P值(雙.
組合NC0A3/SPP1水平9. 08.0026
血管涉及6. 05.014
腫瘤厚度3. 95.047
Clark分級2. 89.089
消退2. 71.10
微衛(wèi)星1. 38.24
潰爛.36.55
有絲分裂速率.34.56
腫瘤血管供應(yīng) 0024.96
使用多變量Cox回歸研究了組合標志物表達得分對RFS的影響。通過分步回歸分 析，組合 NC0A3/SPP1 狀態(tài)(P = · 02) ,Clark 分級(P = · 0002)、潰爛(P < · 00005)、有絲分 裂速率(P = . 0003)和微衛(wèi)星(P < . 00005)顯著預(yù)測了 SLN狀態(tài)。
最后，還使用多變量Cox回歸研究了組合標志物表達得分對DSS的影響。此分析 顯示，當模型中包含9種組織學因素時，組合NC0A3/SPP1狀態(tài)是決定DSS的獨立因素(下 文表14)。通過分步Cox回歸分析，微衛(wèi)星(P = 0. 0001)、有絲分裂速率(P = 0. 0002)、潰 爛(P = 0. 0066)和組合NC0A3/SPP1狀態(tài)(P = 0. 029)仍是DSS的顯著預(yù)測物。這些結(jié) 果確立了組合標志物表達得分之預(yù)后影響的顯著性，并且證明了多標志物預(yù)后測定由于其 對SLN狀態(tài)、RFS和DSS的獨立影響而用于黑素瘤的效用。還在三標志物測定中將RGSl與 NC0A3/SPP1 一起測定，初步結(jié)果顯示了對DSS的顯著影響(表15)。
表14、多種因素對黑素瘤人群DSS之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素風險比卡方P值(
微衛(wèi)星3. 7714. 2 0002
有絲分裂速率1. 895. 68.017
組合NC0A3/SPP1水平1. 694. 32.038
Clark分級1. 692. 80.09
血管涉及1. 25.60.44
消退.442. 35.44
潰爛1. 22.45.50
腫瘤厚度1. 10.36.55
腫瘤血管供應(yīng)1. 18.33.57
表15、多種因素對黑素瘤人群DSS之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素風險比卡方 P值(雙尾)
組合NC0A3/SPP1/RGS1 水平 3. 33 7.48 . 0062
SLN 狀態(tài)1.80 3.93 . 047
腫瘤厚度1.50 3.34 . 068
Clark 分級1. 41 2. 24 . 13
潰爛1. 22.38.54
性別1. 14.20.66
年齡1. 04.17.68
部位.96.02.88
實施例9 區(qū)分良性痣和惡性黑色素瘤的多標志物測定
簡介
本實施例證明了免疫組織化學分析可用于驗證在RNA水平上所觀察到的基因表 達差異以及測試痣和黑素瘤的鑒別診斷中該分析的診斷值。
方法
研究患者構(gòu)建由699個黑素細胞贅生物構(gòu)成的幾個數(shù)據(jù)組用以本研究中所進行 的分析訓(xùn)練組，由119個良性痣和421個原發(fā)黑素瘤的組織微陣列(tissue macroarray, TMA)組成，四個驗證組38個在痣中產(chǎn)生的黑素瘤的組織切片(得到75個可評估的黑素細 胞腫瘤)；39個發(fā)育異常痣；21個Spitz痣；以及M個最初誤診的黑素細胞贅生物。所研 究的TMA中119個訓(xùn)練組痣的組成如下31個先天真皮內(nèi)痣；四個后天真皮內(nèi)痣；21個后 天發(fā)育異常痣；18個先天混合痣；15個后天混合痣；4個交界痣；以及1個未分類痣。訓(xùn)練 TMA中所包含的421個原發(fā)黑素瘤的組織學亞型如下202個淺表擴散型黑素瘤；135個結(jié) 節(jié)性黑素瘤；23個肢端黑素瘤；18個雀斑痣惡性黑素瘤；16個促結(jié)締組織增生性黑素瘤； 和27個未分類黑素瘤。在含有與痣相關(guān)產(chǎn)生的原發(fā)黑素瘤的組織組中，痣和黑素瘤組織學 亞型的概述如下22個先天痣；8個后天痣；3個后天發(fā)育異常痣；1個后天混合痣；1個后 天真皮內(nèi)痣；1個先天發(fā)育異常痣；1個先天混合痣；1個先天真皮內(nèi)痣；23個淺表擴散型黑 素瘤；7個結(jié)節(jié)性黑素瘤；和7個未分類黑素瘤。
組織陣列根據(jù)Kononen J,等 Nat Med, 1998,4 :844-7 和 Kashani-Sabet M，等 J Clin Oncol, 2004, 22 :617-23所述方法產(chǎn)生組織微陣列。制備總共16個黑素瘤陣列以及 總共4個痣陣列，平均約40個組織/陣列。黑素瘤陣列包含總共673個組織核心(150個 患者的具有副本核心的457個原發(fā)黑素瘤)。痣陣列包含總共138個組織核心。
免疫組織化學染色前，將載玻片在60°C下烘30分鐘，脫蠟，通過在二甲苯中漂洗 再水化。然后，將載玻片在IOmM檸檬酸鹽緩沖液中微波處理。用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過 氧化物酶活性。就WNT2來說，用PBS清洗后，將載玻片在室溫下與正常兔血清一起孵育30 分鐘，以減少非特異性背景染色，然后用PBS清洗。就FNl來說，載玻片依次與親和素和生 物素封閉試劑一起孵育。然后加入一抗[山羊多克隆抗WNT2IgG(Bi0Visi0n，l 5稀釋)； 兔多克隆抗SPPlIgG(Abcam，l 200稀釋)；兔多克隆抗FNlIgG(Dako，1 400稀釋)；兔 多克隆抗 ARPC2IgG (Upstate，1 50 稀釋)；和雞抗 RGSl IgG (GeneTex, 1 100 稀釋用 于TMA，1 50稀釋用于組織切片)]，在4°C下孵育過夜。將生物素化山羊抗兔、抗雞或兔 抗山羊IgG抗體(Vector Laboratories, Burlingame, CA)作為用于放大的二抗，然后與 ABC-HRP (Vector Laboratories) 一起孵育30分鐘，然后是DAB/過氧化氫溶液(Sigma)。用 蘇木精復(fù)染載玻片，用permoimt封片。除另有注明，否則對于組織陣列載玻片和常規(guī)切片 均使用相同的Wnt-2免疫組織化學染色方案。
免疫組織化學染餼的評價對每個組織陣列核心和組織切片最強染餼的區(qū)域進行 評分。使用下列標準在細胞強度上對標志物蛋白的表達進行分級未染色(0)，弱染色(1)，中等染色O)以及強染色C3)。在贅生物表皮與真皮之間的交界(交界區(qū)或“頂部”)以及其 基部(“底部”)對標志物表達強度進行評分。就腫瘤而言，“頂部”和“底部”位置分別表示 垂直生長(侵襲性)腫瘤的頂部以及腫瘤侵入的最深區(qū)域。就相關(guān)的痣而言，鑒定并記錄了 三種標準類型的痣(參見例如 Sagebiel R. W.，J InvestDermatol, 1993 ； 100 :322S_325S， 用以分類)。在先天模式的痣中，頂部記錄于交界區(qū)和/或乳頭狀真皮區(qū)，底部在網(wǎng)狀真皮 中所鑒定的最深的痣處。在后天模式的痣中，頂部記錄于交界區(qū)和/或乳頭狀真皮區(qū)，底部 在乳頭狀真皮中所鑒定的最深的痣處。類似地，在發(fā)育異常痣中，前體痣附近的側(cè)向生長是 發(fā)育異常的隨機異型(atypia)和結(jié)構(gòu)改變的特征，頂部記錄于交界區(qū)，底部在乳頭狀真皮 和/或網(wǎng)狀真皮中所鑒定的最深的痣處。將沒有黑素瘤或痣的樣品排除在該分析之外。由 于染色不足或者缺少結(jié)構(gòu)特征而無法判斷的樣品作為缺失觀測值處理。由對病變身份不 知情的病理學家為陣列和切片評分，評分獨立進行兩次，對于所有標志物的矛盾評分確定 一致的得分。多個抗體的特異性外部陽性對照如下乳腺癌(WNT2、SPP1)；黑素瘤細胞系 LOX 和 FEM(WNT2、ARPC2、SPP1)；黑素瘤組織切片(WNT2、Fm、ARPC2、RGSl、SPPl)；正常腎臟 (FNl)；胸腺(RGSl)和非霍奇金淋巴瘤(RGSl)。用于免疫組織化學的技術(shù)陰性對照包括使 用磷酸鹽緩沖液替換一抗，所有其他實驗條件保持相同。
統(tǒng)計學分析用單變量logistic回歸評估每個標志物強度(黑素細胞贅生物的 基部)的診斷效力。用多變量logistic回歸評估全部五種標志物的組合強度的診斷效力。 對于多標志物測定，使用接受者工作特性(receiver operating characteristics, ROC)曲 線分析診斷效力，計算ROC曲線下面積。使用Fisher精確檢驗計算并分析特異性和靈敏度 分數(shù)。對每個標志物使用Marm-Whitney檢驗來檢驗痣基部和黑素瘤基部中標志物免疫染 色強度之間的差異。還對每種標志物使用Marm-Whitney檢驗來檢驗病變交界區(qū)與病變基 部標志物免疫染色強度之間的差異。所報告的全部P值為兩側(cè)的。
為了評估標志物表達得分的可靠性，對訓(xùn)練組中的每個病例，將WNT2強度得分與 平均密度測量強度(來自定量圖像分析)進行比較。首先，鑒定了與0-3標志物表達分級 最密切對應(yīng)的四個平均密度測量強度連續(xù)范圍。然后，將WNT2標志物表達得分與其平均密 度測量強度(在兩者都可用時)的一致性定義為病變百分比，其中標志物表達強度和平均 密度測量強度在診斷上是等同的。定義相似的WNT2的百分比一致性，并計算“頂部-底部” 表達得分的差異。
基于來自訓(xùn)練組中540個病變的數(shù)據(jù)，從MDMS (Surprise，AZ)獲得診斷算法。這 些算法首先證實了具有發(fā)育異?；騍pitz樣特征的病變?yōu)榘l(fā)育異常或Spitz痣，然后將所 有未確認的病變診斷為不同類型的良性痣或黑素瘤。對于“頂部-底部”差異得分本身以 及與表達得分強度組合的“頂部-底物”差異得分，獨立獲得不同的診斷算法。圖2中顯示 涵蓋這些算法中每一個的最終診斷算法。該最終診斷算法應(yīng)用于所有四個驗證組的病變。
結(jié)果
接下來，我們證實了之前我們的研究中所鑒定的一些對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的差異性蛋白質(zhì) 表達，并在更大的獨立黑素細胞贅生物人群中檢驗了黑素瘤多標志物診斷測定的應(yīng)用。為 此，我們收集了 699個黑素細胞腫瘤的組織組，其包括540個原發(fā)黑素瘤和黑素細胞痣的 TMA的訓(xùn)練組，以及與痣/黑素瘤鑒別診斷相關(guān)的四個包含159個黑素細胞贅生物組織切 片的驗證組。首先，使用靶向上述蛋白的市售抗體在訓(xùn)練組中分析五種所選標志物(ARC2、FN1、RGS1、SPP1和WNT2)的表達。按照四級等級對每個標志物的染色強度進行評分。
在優(yōu)化標志物免疫組織化學染色的過程中，觀察到良性痣中的有趣染色模式。良 性痣顯示，在痣的交界區(qū)中系統(tǒng)性地較強染色，而在痣基部缺乏表達。相反，在比較病變交 界區(qū)和基部時，在黑素瘤的侵入部分中標志物的表達更均勻。因而，我們針對每個黑素細胞 贅生物的交界區(qū)(“頂部”)和基部(“底部”)的表達強度為TMA評分，其中在陣列上展示 的樣品核心上病變的取向清楚可見.
首先，使用應(yīng)用于每個病變基部的四級強度等級，對五種標志物中每一種診斷黑 素瘤與痣的能力逐一進行評價。鑒定了劃分每個標志物四級等級的最好方法(表16中顯 示)。最好的等級劃分法定義為使得所得與單變量logistic回歸分析相關(guān)的卡方值最大 化。根據(jù)其診斷靈敏度和特異性分數(shù)，還評定了每種最佳劃分的標志物區(qū)分痣和黑素瘤的 能力。與痣相比，五種分子標志物中每一種均顯示在黑素瘤中顯著過表達(表16)。
進行幾種分析以檢驗標志物的組合是否可使用其能力來診斷黑素瘤。特別地，我 們檢驗了僅著眼于底部表達強度得分的分析、著眼于病變交界區(qū)與基部之間表達差異的分 析(“頂部-底部”分析)以及涵蓋兩種數(shù)據(jù)類型的第三個分析。
首先，我們對所組合的五種標志物進行了檢查每個病變基部所賦值的表達強度得 分的分析。通過多元logistic回歸將最佳劃分的標志物表達得分組合，將惡性概率賦給每 個有完整數(shù)據(jù)可用的病變。然后，在最佳分離點劃分所賦值的概率，得到93. 6%的特異性和 75.8%的靈敏度(P < 0.00005，F(xiàn)isher精確檢驗)。另外，對于此多標志物分析，構(gòu)建接收 者工作特性(ROC)曲線，在圖1中顯示，相關(guān)的曲線下面積(AUC)為0.9105。
出于說明性目的，我們對每種標志物以及3種標志物組合分別重復(fù)該分析。單標 志物(例如FNl)分析顯示最小AUC為0. 5622，其在包含另兩種標志物(ARPC2和SPP1)時 增加到中等水平0. 7036，在模型中包含全部五種標志物時，達到最高值A(chǔ)UC 0. 9105。
然后，我們僅利用全部五種標志物的“頂部-底部”標志物表達差異進行分析。病 變交界區(qū)相對于基部的標志物表達的分析顯示，與黑素瘤相比，痣一致地缺乏五種標志物 中每一種的表達，黑素瘤中標志物免疫染色則均勻得多。在用Marm Whitney檢驗進行分 析時，這一痣與黑素瘤之間顯著不同的“頂部-底部”標志物表達模式在五種標志物每一種 中均如此(數(shù)據(jù)未顯示)，每種標志物的特異性和靈敏度顯示于表17。事實上，就WNT2這 一種標志物來說，在所分析的144個病變中痣和黑素瘤之間“頂部-底部”差異得分的兩個 分布完美分離。因此，所分析的每個痣從交界區(qū)到基部失去表達，而每個黑素瘤從交界區(qū) 到基部具有均一的表達。在WNT2的情形中痣與黑素瘤的這種完美區(qū)分使得不可能另外依 賴logistic回歸作為我們唯一的分析工具。面對這些理想?yún)^(qū)分，logistic回歸預(yù)測方法 不能產(chǎn)生回歸系數(shù)的極大似然估計。因此，為了分析標志物表達模式的診斷有效性，在組合 全部五種標志物時，獲得了由14個區(qū)分標準組成的診斷算法。前四個標準著眼于證實(或 證偽)具有發(fā)育異常特征的病變是否確實是發(fā)育異常痣。其余十個標準著眼于上述Marm Whitney檢驗所確定為方向一致的非發(fā)育異常病變垂直表達得分的差異。將此診斷算法應(yīng) 用于訓(xùn)練組中540個病變，產(chǎn)生84. 6%的特異性和98. 7%的靈敏度(P < 0. 00005,Fisher 精確檢驗)。
為了闡明表達得分以及“頂部-底部”差異的可靠性，進行了定量成像分析。對訓(xùn) 練組中WNT2染色的病變進行數(shù)字掃描，對每個病變計算平均密度測量強度。使用診斷黑素瘤的相應(yīng)取舍值，以相同診斷的病變百分比計算，標志物強度等級與平均密度測量強度之 間的一致性為90. 3% (P < 0. 00005，Mann Whitney檢驗)。我們還評價了 “頂部-底部” 表達得分差異的一致性，觀察到標志物強度得分與平均密度測量分析之間98. 4%的一致性 (P < 0. 00005,Mann Whitney檢驗)。平均密度測量強度得分單獨的logistic回歸分析再 現(xiàn)了標志物強度得分所鑒定的WNT2診斷精確性(P < 0. 00005)。另外，WNT2平均密度測量 強度得分的“頂部-底部”分析顯示了 97. 的特異性，96. 6%的靈敏度，再現(xiàn)了由標志物 表達得分發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。
最后，我們研究了使用標志物表達得分和“頂部-底部”差異的多標志物測定在診 斷黑素瘤中的效用。同樣，由于WNT2的垂直表達得分的完美分離，我們無法使用logistic 回歸。因此，使用來自表達強度得分以及病變交界區(qū)相對于基部差異表達的兩種數(shù)據(jù)獲得 算法(顯示于圖2)，以區(qū)分痣和黑素瘤。有趣的是，在檢查痣中的標志物表達時，訓(xùn)練組中 所包含的全部21個發(fā)育異常痣僅基于其ARPC2和FNl表達強度得分就可鑒定。因此，開發(fā) 了不同的算法來證實所有具有發(fā)育異常特征的痣事實上是發(fā)育異常的。這一證實算法含有 四個基于ARPC2和FNl表達強度的區(qū)分標準。然后，將針對發(fā)育異常痣的算法與基于“頂 部-底部”差異以及標志物表達得分的算法相組合。將這種最終診斷算法應(yīng)用于訓(xùn)練組，在 黑素瘤診斷中實現(xiàn)94. 9%的特異性和90. 6%的靈敏度(P < 0. 00005, Fisher精確檢驗)。 僅使用此診斷算法進行其他分析。
為了驗證在訓(xùn)練組中開發(fā)的多標志物測定，我們在與痣和黑素瘤之間組織學區(qū)別 有更高相關(guān)性的四個不同驗證組中研究了五種標志物的表達強度和模式。在TMA中，我們 意在收集一大群黑素細胞贅生物，用于驗證來自cDNA微陣列分析的標志物差異表達，以及 研究我們多標志物測定的效用。但是，某些痣亞型并沒有鑒別診斷的困境，某些黑素瘤亞型 并非從之前存在的痣產(chǎn)生。
為了證實我們來自訓(xùn)練組的結(jié)果，評價潛在表達差異的最佳情形是與已有的痣相 關(guān)產(chǎn)生的黑素瘤病例，其中許多潛在干擾因素(年齡、性別、解剖學位置以及可能無關(guān)的痣 和黑素瘤組織學亞型等等)被自動對照。因此，我們收集了與痣相關(guān)的38個原發(fā)黑素瘤病 例的驗證組，得到75個可評價的黑素細胞贅生物。另外，我們收集了另外兩個與該組織學 鑒別診斷直接相關(guān)的驗證組21個Spitz痣的病例；和39個發(fā)育異常痣的病例。在痣相對 于黑素瘤的組織學鑒別診斷中，它們是兩種最常出現(xiàn)問題的痣亞型。最后，我們研究了 M 個之前誤診病變的數(shù)據(jù)組中的標志物表達，包括6個最初診斷為黑素瘤而其隨后通過一致 皮膚病理學復(fù)查診斷為痣的病變，以及18個最初診斷為痣而隨后局部復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移從而 被回溯診斷為黑素瘤的病變。在所有驗證組中，考慮到痣交界區(qū)相對于痣基部處標志物表 達的重要性，我們使用5 μ M組織切片上的免疫組織化學分析研究了標志物表達。
禾Ij用采用了標志物表達得分強度以及“頂部-底部”表達得分差異的算法，多標志 物測定在75個由痣產(chǎn)生的黑素瘤中診斷黑素瘤時實現(xiàn)了 94. 7%的特異性和97. 3%的靈敏 度。另外，從TMA上發(fā)育異常痣的分析中開發(fā)的算法精確鑒定了 94.9% (37/39)的發(fā)育異常 痣切片和95. 2% (20/21)的Spitz痣。最后，多標志物測定正確診斷了 18/24(75. 0% )之 前誤診的病變。將黑素細胞腫瘤的多個訓(xùn)練組和驗證組合并后，多標志物測定產(chǎn)生95. 1% 的特異性和90. 5%的靈敏度(P < 0. 00005，F(xiàn)isher精確檢驗)。在多個數(shù)據(jù)組中使用多種 診斷算法的多標志物測定的靈敏度、特異性和AUC的比較顯示于表18。
討論
本實施例公開了由最近的cDNA微陣列分析提出的使用五種生物標志物區(qū)分黑素 瘤和良性痣的多標志物分子測定。在該分析中，無監(jiān)督譜系聚類分析在少量新獲得的黑素 細胞贅生物中根據(jù)基因表達譜正確區(qū)分了痣和黑素瘤，展示了在黑素瘤和痣中差異表達的 一大組基因(參見 HaqqC.等 Proc Natl Acad Sci USA, 2005 ； 102 :6092-7) 在本實施例 中，我們驗證了五種該分析所建議基因的差異表達，測試了多標志物測定診斷黑素瘤和痣 的效用。此多標志物免疫組織化學測定在由含有大量痣和原發(fā)黑素瘤的TMA構(gòu)成的訓(xùn)練組 中顯示了 94. 9%的特異性和90. 6%的靈敏度?；谠摲治?，隨后在與痣與黑素瘤的鑒別診 斷直接相關(guān)的四個不同驗證組中進行多標志物診斷測定，并且能夠精確診斷高百分比的痣 中產(chǎn)生的黑素瘤、Spitz和發(fā)育異常痣，以及之前誤診的黑素細胞贅生物。在組合數(shù)據(jù)組中， 多標志物測定在黑素瘤診斷中產(chǎn)生了 95. 的特異性和90. 5%的靈敏度。
我們的結(jié)果證明，由ARPC2、FNU RGSU SPPl和WNT2蛋白表達水平構(gòu)成的多標志 物測定可用于痣與黑素瘤的鑒別診斷，這是病理學中最困難的任務(wù)之一。我們的研究是迄 今為止最大規(guī)模的對黑素瘤診斷中分子標志物應(yīng)用的分析，并且獨一無二地利用了痣和黑 素瘤的組織學異質(zhì)性所要求的綜合組織組。該多標志物測定糾正了四分之三的曾得到錯誤 病理診斷的病例，包括最初誤診為痣的黑素瘤，其中病變的臨床行為引發(fā)了對之前病理學 報告的復(fù)查。因此，本文所述多標志物測定可用于輔助黑素瘤的組織學診斷，從而為負責不 明確黑素細胞贅生物患者的病理學家及其他臨床醫(yī)師提供重要的新信息。
本發(fā)明的一個重要優(yōu)點是可避免黑素瘤診斷的錯誤。這些錯誤導(dǎo)致許多患者接受 不適當?shù)闹委?。此外，黑素瘤誤診是美國癌癥醫(yī)療差錯索賠中第二常見的原因，僅次于乳腺 癌診斷中的錯誤。(參見 iTroxel D. B.，Am JSurg Pathol，2003 ;27 :1278-83)。誤診為黑 素瘤的患者始終擔憂復(fù)發(fā)，并且不能獲得人壽保險，而誤診為痣的患者則被剝奪了針對其 惡性腫瘤的適當治療，可能包括前哨淋巴結(jié)活檢和全身性輔助治療。我們的結(jié)果證明，所述 多標志物測定可逆轉(zhuǎn)(并且因此可能防止)高百分比的由黑素細胞贅生物常規(guī)組織學分析 導(dǎo)致的錯誤。
cDNA微陣列分析所提出的標志物差異表達在痣的免疫組織化學分析中是不均勻 的，痣交界區(qū)經(jīng)常以高于痣基部的水平表達所述標志物。這與大多數(shù)黑素瘤正好相反，黑素 瘤在標志物表達的“頂部-底部”分析中顯示均一性。因而，蛋白的表達模式是痣和黑素瘤 之間的有效鑒別因素，一般說來，優(yōu)于絕對轉(zhuǎn)錄本表達得分。盡管我們的結(jié)果證實了首先由 轉(zhuǎn)錄組分析鑒定的基因差異表達，但它們還通過證明黑素細胞贅生物基部所存在的最高基 因表達差異細化了該分析所獲得的信息。
我們選擇免疫組織化學而不是其它可能更定量的測定(例如定量PCR)來驗證 cDNA微陣列結(jié)果的原因之一是，免疫組織化學能提供所研究病變的基因表達原位分析。我 們的結(jié)果描述了可開發(fā)為痣和黑素瘤組織病理學分析輔助的分子測定的效用。
盡管免疫組織化學分析本身的特點是半定量的，但是我們使用定量成像分析評估 了觀察者標志物強度得分的可靠性。我們發(fā)現(xiàn)，觀察者標志物強度得分與定量分析所確定 的平均密度測量強度之間的診斷準確度有高一致性(> 90% )，在“頂部-底部”表達得分 差異中有更高的一致性(98%)。鑒于僅著眼于病變交界區(qū)相對于基部的得分的診斷算法 在訓(xùn)練組中產(chǎn)生84. 6%的特異性和98. 7%的靈敏度，我們的結(jié)果表明了這些標志物的分析可在臨床背景下應(yīng)用于黑素細胞贅生物診斷的潛在便利性。
盡管少數(shù)其它標志物也觀察到免疫染色的垂直減少，包括S100A6、Melan-A和 HMB-45，但是這些標志物在痣和原發(fā)黑素瘤的辨別中沒有價值，因為它們在痣和黑素瘤中 沒有差異表達(參見 Busam K. J.，等 Am JSurg Pathol. 1998,22 :976-82 ；Fullen D. R.，等 J Cutan Pathol, 2001 ；28 393-9 ；Kucher C.，等 Am J Dermatopathol，2004 ;26 :452-7 ； HaqqC.等Proc Natl Acad Sci USA 2005 ； 102 :6092-7)。另外，在一些此類研究中，真皮內(nèi) 痣是所檢測的主要痣類型。真皮內(nèi)痣已知在其基部發(fā)生顯著的“成熟”。在我們的研究中， 在真皮內(nèi)痣、混合痣以及Spitz和發(fā)育異常痣的基部觀察到標志物免疫染色的下調(diào)。這表 明了此多標志物測定作為黑素瘤分子診斷標志物的更加廣泛的用途。
在本實施例中，我們描述了能以高精確度診斷黑素細胞贅生物的多標志物免疫組 織化學測定，因此有助于解決這一困難的病理鑒別診斷。
表16、僅使用單標志物表達得分辨別黑素瘤與痣
標志物最佳分級劃分卡方 P-倌
ARPC2 0 禾口 1、2 禾口 324.2 <.00005
FNl 0 禾口 1、2 禾口 34.75 . 0294
RGSl 0、1、2 和 38.98 . 0027
SPPl 0、1 和 2、311.1 . 0009
WNT2 0、1、2、3(整個分級)86.6 <.00005
表17、對于每種標志物使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)中病變交界區(qū)和病變基部(“頂部-底部”) 得分的黑素瘤診斷準確度
標志物特異性(％ )靈敏度(％ ) P-倌
(Fisher 確切檢驗)
ARPC2 59. 796. 1< . 00005
FNl23. 398. 9. 0101
SPPl 61. 5 99. 0 < . 00005
RGSl 33. 3 99. 0 < . 00005
WNT2 100 100 < . 00005
表18、在多個組織組中并使用不同的診斷算法，多標志物測定的黑素瘤診斷的靈 敏度、特異性和AUC的比較*
數(shù)據(jù)組診斷算法特異件靈敏度AUC
(%)(%)
訓(xùn)練僅標志物強度93. 675. 8 9105
訓(xùn)練僅垂直表達84. 698. 7 9165
訓(xùn)練組合表達得分94. 990. 6 9277
訓(xùn)練和逢H 正組合表達得分95. 190. 5 9275
女每個分析的P值< .00005 (Fisher確切檢驗)
實施例10 針對黑素瘤的六基因診斷標志物測定
我們在698個患者的合并數(shù)據(jù)組中評價了六基因測定在黑素瘤和痣的鑒別診斷 中的效用，所述數(shù)據(jù)組包含538個患者的訓(xùn)練組(119個痣和419個黑素瘤)和160個患49者的驗證組。使用免疫組織化學分析評價六種基因(ARPC2、FN1、NC0A3、RGS1、骨橋蛋白 (SPPl)和WNT2)的表達。通過logistic回歸分析，六基因測定(在僅通過標志物表達得 分分析時)顯示77. 9%的靈敏度和92%的特異性，ROC下的AUC為0.914。開發(fā)了診斷算 法用于研究六標志物的頂部-底部得分在黑素瘤診斷中的效用(圖22)。僅用該頂部-底 部分析(其中標志物表達在痣中均勻喪失，而在黑素瘤中保持此垂直表達)顯示了 96.4% 的靈敏度和82. 8%的特異性。最后，開發(fā)了涵蓋標志物強度得分以及頂部-底部差異的診 斷算法(圖23)。此診斷算法應(yīng)用于訓(xùn)練組病變產(chǎn)生了 92%的靈敏度和94. 的特異性。 最后，將該相同診斷算法應(yīng)用于四個驗證組，在由痣產(chǎn)生的黑素瘤中顯示了 97. 4%的靈敏 度和94. 7%的特異性，正確地鑒定了 37/39(95% )的發(fā)育異常痣，20/21 (95% ) Spitz痣和 18/24(75%)之前誤診的腫瘤。在合并數(shù)據(jù)組中，該多標志物測定顯示了 92. 2%的靈敏度 和94. 6%的特異性。這些結(jié)果證明了該六標志物測定在黑素瘤和痣的診斷中的效用。
實施例11 用于黑素瘤的四基因預(yù)后測定
我們研究了當合并全部四種標志物的表達水平時RGS1、NC0A3、骨橋蛋白(SPPl) 和PHIP的預(yù)后影響。我們針對標志物可用的TMA上412個原發(fā)皮膚黑素瘤病例開發(fā)了預(yù) 后指標，其反映過表達(定義為高于該標志物的取舍點)的標志物數(shù)目。首先，通過單變量 分析來分析多標志物陽性對以下三種重要結(jié)局參數(shù)的影響前哨淋巴結(jié)狀態(tài)(SLN狀態(tài))、 無復(fù)發(fā)存活(RR5)和疾病特定存活(DSS)。根據(jù)單變量分析，過表達標志物個數(shù)的提高有 效預(yù)測了 SLN 狀態(tài)(P = 0. 002，logistic 回歸)、RFS(P < 0. 0001，Cox 回歸)禾口 DSS(P < 0. 0001，Cox 回歸)。
接下來，通過多變量分析對多標志物的預(yù)后影響進行了分析，其中利用AJCC黑素 瘤委員會分析所包含的六個因素。通過多變量分析，在納入這些因素時，多標志物測定是 SLN狀態(tài)(表19)、RFS (表20)和DSS (表21)的獨立預(yù)測物。在DSS的分析中，多標志物 測定以預(yù)測DSS的第一因素出現(xiàn)。即使納入SLN狀態(tài)后，多標志物指標仍保持有效預(yù)測性 (表22)。另外，根據(jù)Kaplan-Meier分析，標志物陽性的提高有效預(yù)測了 RFS(P < 0. 0001) 和DSS(P < 0. 0001)。這些結(jié)果證明了多標志物測定的強大預(yù)后影響。
表19、多種因素對黑素瘤人群SLN狀態(tài)之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素 卡方風險比P值
年齡 19.600. 65< .0001
多標志物表達水平8. 351. 33 0039
腫瘤厚度 6. 891. 68 0087
Clark 分級 1. 631. 36.20
性別 1.491. 46.22
潰爛 .771. 32.38
部位 .00061. 01.98
表20、多種因素對黑素瘤人群RFS之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素 卡方風險比P值
Clark 分級 25. 151. 81<.0001
多標志物表達水平15.521. 19.0001
潰爛 13. 201. 79.0003
部位3. 53 1. 34 . 06
腫瘤厚度1.18 1. 11 . 28
年齡.300. 97 . 59
性別0 1. 00 . 999
表21.、多種因素對黑素瘤人群DSS之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素卡方風險比P值
多標志物表達水平14. 181. 24 0002
Clark分級8. 161. 55.0043
潰爛4. 231. 52.04
腫瘤厚度3. 891. 29.049
部位2. 661. 40.10
性別.011. 02.92
年齡.010.99.93
表22.、多種因素對黑素瘤人群DSS之影響的Cox回歸分析
預(yù)后因素卡方風險比P值
多標志物表達水平8. 251. 31.004
腫瘤厚度6. 581. 62.01
SLN狀態(tài)2. 691. 55.10
潰爛1. 881. 45.17
Clark水平1. 251. 24.26
性別0. 201. 13.66
年齡0. 151. 03.70
部位0. 091. 08.77
應(yīng)該理解，本文所述實施例和實施方案僅用于說明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會根據(jù)它們想到多種修改或改變，這些修改和改變將包含在本申請的精神和范圍之內(nèi)，以及本 發(fā)明所附特征和權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文引用的所有公開、專利和專利申請通過引用并 入本文用于所有目的。
權(quán)利要求
1.診斷對象中黑素瘤的方法，所述方法包括下列步驟(a)使來自該對象的生物樣品與試劑相接觸，每種試劑與生物樣品中至少一種選定標 志物特異性結(jié)合，所述選定標志物包括(i)ARPC2、FNl、NC0A3、RGSl、SPPl和WNT2的多肽， 或者(ii)編碼所述多肽的核酸，其中每種標志物至少有一種試劑與其結(jié)合；和(b)測定是否有任何選定標志物在該樣品中過表達或低表達；從而提供對該對象中黑 素瘤的診斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體是帶標記的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述測定是使用選自免疫組織化學測定和ELISA的酶 免疫測定進行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是RTPCR引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品是皮膚活檢。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述測定步驟包括將所述標志物的表達提高與樣品中 細胞的轉(zhuǎn)移性表型相關(guān)聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述診斷將良性痣與惡性黑素瘤區(qū)分開來。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述測定步驟包括使用FISH或CGH。
11.用于診斷對象中黑素瘤的試劑盒，所述試劑盒包含試劑，每種試劑與生物樣品中至 少一種選定標志物特異性結(jié)合，所述選定標志物包括i)ARPC2、FNU NC0A3、RGSU SPPl和 WNT2的多肽，或者ii)編碼所述多肽的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述試劑是抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述抗體是帶標記的。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其還包含其他試劑，其用于使用選自免疫組織化學測 定和ELISA的酶免疫測定進行的檢測。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其還包含其他試劑，其用于使用FISH或CGH進行的檢測。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述試劑是核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述試劑是RTPCR引物。
18.診斷對象中黑素瘤的方法，所述方法包括下列步驟(a)向該對象施用試劑，每種試劑與該對象中至少一種選定標志物特異性結(jié)合，所述選 定標志物包括(i)ARPC2、FNl、NC0A3、RGSl、SPPl和WNT 2的多肽，或者(ii)編碼所述多肽 的核酸，其中每種標志物至少有一種試劑與其結(jié)合；和(b)測定所述標志物是否在該對象中過表達或低表達；從而提供對黑素瘤的診斷。
19.提供對象中黑素瘤預(yù)后的方法，所述方法包括下列步驟(a)使來自該對象的生物樣品與試劑相接觸，每種試劑與該生物樣品中至少一種選定 標志物特異性結(jié)合，所述選定標志物包括(i)RGSl、NC0A3、SPPl和PHIP的多肽，或者(ii) 編碼所述多肽的核酸，其中每種標志物至少有一種試劑與其結(jié)合；和(b)測定所述選定標志物是否在該樣品中過表達或低表達；從而提供該對象中黑素瘤 的預(yù)后。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述試劑是抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述抗體是帶標記的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述測定是使用選自免疫組織化學測定和ELISA的 酶免疫測定進行的。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述試劑是核酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述試劑是RTPCR引物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述測定是使用FISH或CGH進行的。
26.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中至少一種選定標志物的表達提高與選自以下的預(yù)后 相關(guān)轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)、復(fù)發(fā)和死亡。
27.用于提供對象中黑素瘤預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含試劑，每種試劑與生物樣品 中至少一種選定標志物特異性結(jié)合，所述選定標志物包括i)RGSl、NC0A3、SPPl和PHIP的 多肽，或者ii)編碼所述多肽的核酸，其中每種標志物至少有一種試劑與其結(jié)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述試劑是抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀的試劑盒，其中所述抗體是帶標記的。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其還包含其他試劑，其用于使用選自免疫組織化學測 定和ELISA的酶免疫測定進行的檢測。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述試劑是核酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述試劑是RTPCR引物。
33.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其還包含其他試劑，其用于使用FISH或CGH進行的檢
全文摘要
本發(fā)明提供了使用在黑素瘤細胞中過表達的分子標志物來診斷黑素瘤和提供黑素瘤預(yù)后的方法。本發(fā)明提供了用于診斷和預(yù)后的試劑盒。本發(fā)明還提供了鑒定可用于治療或預(yù)防黑素瘤及黑素瘤發(fā)展的化合物的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102037361SQ200980116158
公開日2011年4月27日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者克里斯托弗·哈克, 穆罕默德·卡沙尼-薩比特 申請人:加利福尼亞大學董事會