專利名稱:用于產(chǎn)生小毛囊和新生乳頭的方法及其用于體外測(cè)試和體內(nèi)植入的用途的制作方法
用于產(chǎn)生小毛囊和新生乳頭的方法及其用于體外測(cè)試和體內(nèi)植入的用途
本發(fā)明涉及通過(guò)在超低吸附性培養(yǎng)容器中將新生乳頭(de novo papillae)與另一毛 囊細(xì)胞群共培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生小毛囊(microfollicle)的方法。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生新生乳頭的 方法,所述新生乳頭可用于產(chǎn)生小毛囊的方法中。本發(fā)明的目標(biāo)還有由前述方法所產(chǎn)生 的小毛囊和新生乳頭。所述小毛囊和/或新生乳頭可用作治療毛發(fā)減少狀況的植入物, 以及用于對(duì)物質(zhì)的毛發(fā)調(diào)節(jié)作用或毒性作用進(jìn)行體外測(cè)試。
由于毛發(fā)在人類非語(yǔ)言交流中具有重要作用,因此當(dāng)毛發(fā)生長(zhǎng)減少時(shí),個(gè)體常 常需要幫助。終極的治療方法當(dāng)然是恢復(fù)或再生新的、健康的、循環(huán)的毛囊。直到不久 以前,藥物都不能為這些患者提供任何有效的治療。在20世紀(jì)晚期,有一些藥物上市, 它們確實(shí)刺激了毛發(fā)生長(zhǎng),盡管程度不高且并不一致。實(shí)例有米諾地爾、非那雄胺和拉 坦前列素。毛囊發(fā)育與循環(huán)的協(xié)調(diào)需要復(fù)雜的時(shí)間控制和眾多基因表達(dá)的改變,這很可 能使得簡(jiǎn)單的藥物方法無(wú)法治療晚期脫發(fā)。因此,其效果無(wú)法達(dá)到在脫發(fā)的頭皮上產(chǎn)生 新毛囊的最終目的。通過(guò)利用已知怎樣形成毛囊的細(xì)胞類型,基于細(xì)胞的療法會(huì)比單純 的分子方法更早地在臨床上實(shí)現(xiàn)。
基于毛囊細(xì)胞之療法的一種方法需要取出少量毛囊,從其中分離出有活性的和 /或誘導(dǎo)性的細(xì)胞,然后離體擴(kuò)增這些細(xì)胞同時(shí)保持其產(chǎn)生新毛囊的特殊能力。顯然, 在能夠開(kāi)發(fā)出針對(duì)脫發(fā)的任何類型細(xì)胞療法之前,保持真皮囊細(xì)胞(dermal follicular cell) 的誘導(dǎo)能力和毛囊上皮細(xì)胞活性的細(xì)胞培養(yǎng)條件是必需的。早期研究顯示,真皮細(xì)胞的 誘導(dǎo)特性在體外隨時(shí)間而衰退,因此研究集中于保持毛囊細(xì)胞在培養(yǎng)物中的生發(fā)能力。 許多最新進(jìn)展是由于完整毛囊及其細(xì)胞組分的培養(yǎng)方法的進(jìn)步。在培養(yǎng)物中培養(yǎng)的人毛 囊細(xì)胞包括囊乳頭成纖維細(xì)胞(follicular papilla fibroblast)、外毛根鞘(outer root sheath, ORS)角質(zhì)形成細(xì)胞和來(lái)自毛基質(zhì)(hair matrix)的生發(fā)性上皮細(xì)胞(ToWn等,J.Invest. Dermatology 104(1), 86-88,1995)。
當(dāng)前生物工程的努力目標(biāo)是從已經(jīng)在確定組織培養(yǎng)條件下增殖的分離細(xì)胞開(kāi) 始,產(chǎn)生或重構(gòu)完全組織化的功能性器官系統(tǒng)。人們?cè)缇驼J(rèn)識(shí)到毛囊具有很強(qiáng)的再生能 力,因?yàn)樗趥€(gè)體一生中不斷循環(huán)并再生其下半部分。真皮毛乳頭和結(jié)締組織鞘成纖維 細(xì)胞在性質(zhì)上與干細(xì)胞類似,具有特異性的毛發(fā)生長(zhǎng)誘導(dǎo)特性。毛囊在其生長(zhǎng)周期中利 用活性上皮干細(xì)胞與強(qiáng)誘導(dǎo)性的真皮細(xì)胞之間的相互作用來(lái)進(jìn)行自我更新。從毛囊的上 皮和間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)重構(gòu)完整的毛囊是可能的。
針對(duì)脫發(fā)的任何類型細(xì)胞療法所要解決的主要挑戰(zhàn)包括毛囊形成的效率和細(xì)胞 類型的選擇,Stenn 和 Cotsarelis,Curr.Opinion Biotech. 16, 493-497,2005 對(duì)其進(jìn)行了總結(jié)。就毛囊生物工程而言,可從有或沒(méi)有活性細(xì)胞(來(lái)自毛囊或其他上皮來(lái)源)的分離毛 囊的真皮部分開(kāi)始。將在培養(yǎng)物中擴(kuò)增解離細(xì)胞的數(shù)量,然后將真皮細(xì)胞單獨(dú)或與活性 上皮細(xì)胞一起重新植入脫發(fā)的頭皮。之前的研究已表明,從正確放置的誘導(dǎo)真皮細(xì)胞開(kāi) 始,會(huì)導(dǎo)致新毛囊的形成。此外,從解離或聚集的生發(fā)性上皮和真皮細(xì)胞的組合開(kāi)始, 這也已被證實(shí)是產(chǎn)生新毛囊的有效方法。
基于細(xì)胞的脫發(fā)治療方法的首次嘗試很可能是使用自體組織來(lái)進(jìn)行毛囊生物工 程,以避免供體細(xì)胞的免疫排斥作用。但是,基于毛囊是不表達(dá)I類MHC (主要組織相 容性復(fù)合體)抗原的免疫赦免位點(diǎn)的理念,能夠開(kāi)發(fā)異源(異體)毛囊組織用于組織移植 的誘人可能性是存在的。雖然如此,這類方法的安全性測(cè)試和法規(guī)障礙會(huì)需要大量的財(cái) 力資源。
毛囊生物工程的另一可能方法涉及在體外實(shí)際形成作為小器官的毛囊,然后將 新形成的毛囊移植回脫發(fā)頭皮。從DE 101 62 814 B4中已知,可通過(guò)提供假真皮或假真皮 制備物以及假乳頭(含有在合適的載體上或合適的基質(zhì)中形成的培養(yǎng)的真皮乳頭細(xì)胞)或 假乳頭前體(含有在能原位形成基質(zhì)的合適基質(zhì)形成介質(zhì)上培養(yǎng)的真皮乳頭細(xì)胞)并將所 述假乳頭或假乳頭前體引入所述假真皮或假真皮制備物中來(lái)產(chǎn)生皮膚和毛發(fā)等同物。這 類方法會(huì)需要復(fù)雜得多的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(包括三維基質(zhì),可能含有合適的生長(zhǎng)因子),以 使真皮和表皮細(xì)胞向正常毛囊的三維結(jié)構(gòu)分化。特別地,乳頭結(jié)構(gòu)只能通過(guò)在所述假真 皮中形成空腔(如通過(guò)穿孔或穿刺)并將所述假乳頭(其塑形成使其大小與PD中形成的 空腔相對(duì)應(yīng))置于其中來(lái)獲得。該方法缺乏在近似生理乳頭結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的自發(fā)排列和直 接的細(xì)胞接觸。
最近顯示了用于產(chǎn)生源于毛囊或其含有乳頭的真皮部分的多能干細(xì)胞或其后代 群的另一方法。WO 2005/071063 Al的方法包括在多能干細(xì)胞非貼壁生長(zhǎng)和增殖條件下 培養(yǎng)所述毛囊或含有乳頭的真皮部分。通過(guò)該方法并不得到真皮乳頭,而是得到直接用 于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)或再生皮膚的分離的多能干細(xì)胞。但是,該文獻(xiàn)中也認(rèn)識(shí) 到,形成了一定量的貼壁細(xì)胞,這被WO 2005/113747 A2所證實(shí),其公開(kāi)了通過(guò)在立體 條件下培養(yǎng)而產(chǎn)生來(lái)自于至少兩種多能成體干細(xì)胞類型的多細(xì)胞聚集物的方法。目前, 所述類器官體僅限于從外分泌腺組織收集的上述干細(xì)胞。
因此,構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問(wèn)題是避免現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)以及提供產(chǎn)生重 建的毛囊和乳頭的方法,它們可自由排列且容易成為生理DP的大小和形狀。本發(fā)明所解 決的另一問(wèn)題是找到毛發(fā)等同物或皮膚替代物,它們將適于用作體外模型,更特別地用 于測(cè)試和/或評(píng)估活性物質(zhì),最特別適用于毛囊。
本發(fā)明通過(guò)提供用于產(chǎn)生哺乳動(dòng)物小毛囊的方法來(lái)解決所述問(wèn)題,所述方法包 括以下步驟
(a)提供至少一個(gè)新生乳頭,
(b)提供至少一種其他細(xì)胞群,其選自成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞, 以及
(c)將新生乳頭與所述至少一種其他細(xì)胞群在非貼壁培養(yǎng)條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。
術(shù)語(yǔ)“新生乳頭”或“新乳頭”在本文中可互換使用,表示哺乳動(dòng)物真皮毛乳 頭成纖維細(xì)胞(dermal hair papilla fibroblast, DPF)的細(xì)胞聚集物,所述DPF具有分離后 毛囊的生理真皮乳頭(dermal papilla,DP)的至少一半大小和近似形狀。新生乳頭可包含 包被層,其含有一種或多種不同的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(優(yōu)選膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或 層粘連蛋白)。這種包被層可由形成新生乳頭的DPF本身產(chǎn)生,或者可以在新生乳頭根 據(jù)產(chǎn)生小毛囊之方法的步驟(c)進(jìn)行共培養(yǎng)之前的任何階段加入。
術(shù)語(yǔ)“小毛囊”和“新毛囊”在本文中可互換使用,指不完整的哺乳動(dòng)物毛5囊結(jié)構(gòu),其由真皮細(xì)胞支架構(gòu)成,但缺少其他細(xì)胞類型(如肌細(xì)胞、神經(jīng)、血管等),使 其尺寸小于天然毛囊。本發(fā)明的小毛囊由新生乳頭構(gòu)成,所述新生乳頭被選自成纖維細(xì) 胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞的至少一種其他細(xì)胞群的細(xì)胞穩(wěn)定覆蓋或定殖。所述 成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞不必來(lái)源于哺乳動(dòng)物毛囊,而是可以來(lái)源于 其他哺乳動(dòng)物組織。優(yōu)選地,本發(fā)明的小毛囊由新生乳頭構(gòu)成,所述新生乳頭被至少一 種其他細(xì)胞群的細(xì)胞穩(wěn)定覆蓋或定殖,所述細(xì)胞群來(lái)自和/或可來(lái)自哺乳動(dòng)物毛囊,例 如選自結(jié)締組織鞘成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞。所述小毛囊的三維形式 模擬生理哺乳動(dòng)物毛囊的三維外觀。特別地,所述小毛囊可以是三維成形的、任選地在 空間區(qū)分開(kāi)的重建新生乳頭,所述新生乳頭的表面上具有毛囊樣結(jié)構(gòu),包括類似于毛發(fā) 形態(tài)發(fā)生最早階段的那些,并包含真皮乳頭細(xì)胞。
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生毛囊的含有多個(gè)步驟的方法。
這些步驟包括提供新生乳頭。根據(jù)本發(fā)明,要提供的新生乳頭可通過(guò)任何合適 方法產(chǎn)生,優(yōu)選使用按照根據(jù)本發(fā)明下文所述產(chǎn)生新生乳頭的方法之一所產(chǎn)生的新生乳 頭。
所述步驟還包括提供其他細(xì)胞群。所述其他細(xì)胞群可來(lái)自哺乳動(dòng)物毛囊,優(yōu)選 來(lái)自與DP制備所用相同的毛囊,并在非貼壁培養(yǎng)容器中將所述新生乳頭與至少一種其 他細(xì)胞群共培養(yǎng)??砂凑沾_定的方法從哺乳動(dòng)物毛囊中分離至少四種不同細(xì)胞群,即 DPF> 結(jié)締組織鞘成纖維細(xì)胞(fibroblast ofthe connective tissue sheath,CTSF)、角質(zhì)形成 細(xì)胞(keratinocyte,KC)和黑素細(xì)胞(melanocyte,MC),在標(biāo)準(zhǔn)條件下分別培養(yǎng),然后 進(jìn)行繁殖。也可以從這些分離物形成具有長(zhǎng)期生存力的細(xì)胞培養(yǎng)物并使用,例如用于篩 選方法。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是,所述其他細(xì)胞群選自成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì) 胞和黑素細(xì)胞。所述成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞不必來(lái)源于哺乳動(dòng)物毛 囊,而是可來(lái)源于其他哺乳動(dòng)物組織。所述成纖維細(xì)胞優(yōu)選源于結(jié)締組織鞘。
優(yōu)選地,所述至少一種其他細(xì)胞群來(lái)自和/或可來(lái)自哺乳動(dòng)物毛囊,其選自結(jié) 締組織鞘成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案是,所述新生乳頭至少與角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行共培 養(yǎng)。補(bǔ)充了角質(zhì)形成細(xì)胞以用于基本的小毛囊再生。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案是,向 乳頭培養(yǎng)物同時(shí)提供角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞。添加黑素細(xì)胞對(duì)研究毛發(fā)色素沉著或以 后植入期望的發(fā)色特別有用。也可向下文所述用于產(chǎn)生新生乳頭之方法的非貼壁細(xì)胞培 養(yǎng)容器(如超低貼壁培養(yǎng)瓶)中加入其他分別擴(kuò)增的細(xì)胞組分,其中所述培養(yǎng)瓶中已產(chǎn)生 了新乳頭。將角質(zhì)形成細(xì)胞或者角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素細(xì)胞的混合物以特定混合比加入到 包被的新乳頭中,并以合適培養(yǎng)基在非貼壁培養(yǎng)容器中孵育數(shù)天。KC MC的優(yōu)選比例 為2 1、5 1、10 1或20 1。共培養(yǎng)持續(xù)至少12小時(shí),優(yōu)選1天至5周,更優(yōu) 選2天至3周,最優(yōu)選1周或大概2天。為了形成更好模擬毛囊結(jié)構(gòu)和功能的多層新生 毛囊,其可通過(guò)用CTSF包被所產(chǎn)生的新毛囊一段確定時(shí)間(選自12小時(shí)至10天,優(yōu)選 1至5天,最優(yōu)選大概2天)來(lái)獲得。在這些條件下,所述細(xì)胞混合物發(fā)育成囊狀結(jié)構(gòu), 形成毛囊的典型特征,如毛干的發(fā)育。從形成大致的毛干開(kāi)始,所述器官樣結(jié)構(gòu)被稱作 小毛囊。
在用于產(chǎn)生小毛囊的本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,
(a)提供新生乳頭;
(b)將新生乳頭與KC、MC或者KC和MC的混合物以預(yù)定比例接觸,并在非貼壁培養(yǎng)容器中共培養(yǎng)預(yù)定長(zhǎng)度的時(shí)間;
(b’)任選地,重復(fù)步驟(b),優(yōu)選地,其中使用與第一輪所用不同細(xì)胞類型的 細(xì)胞進(jìn)行接觸和共培養(yǎng);
(c)任選地,在步驟(d)之前和/或同時(shí),可用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(優(yōu)選膠原蛋白 IV)包被步驟(b)或(b’ )的被覆蓋新生乳頭;
(d)在非貼壁培養(yǎng)容器中將步驟(b)、(b’)或(C)的被覆蓋新生乳頭與CTSF 共培養(yǎng)預(yù)定長(zhǎng)度的時(shí)間。
本發(fā)明還涉及提供用于產(chǎn)生新生乳頭的方法,其包括如下步驟
(a)提供來(lái)自至少一個(gè)哺乳動(dòng)物毛囊的至少一個(gè)真皮乳頭(DP),
(b)通過(guò)將所述DP機(jī)械固定在細(xì)胞培養(yǎng)容器表面上而從所述DP中分離真皮毛 乳頭成纖維細(xì)胞(DPF),其中基底層有孔以允許所述DPF遷移出來(lái),
(c)在無(wú)膠原蛋白包被的單層培養(yǎng)中擴(kuò)增分離出的DPF,其中所述DPF至少傳代 一次,
(d)將所擴(kuò)增的DPF濃縮成顯示出生理DP的大小和形狀的細(xì)胞聚集物,其中將 所述DPF以每個(gè)容器表面1,000到100,000個(gè)DPF/cm2的細(xì)胞濃度在非貼壁培養(yǎng)容器中進(jìn) 行分化,或者將所擴(kuò)增的DPF濃縮至少48小時(shí),以及
(e)用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(優(yōu)選膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白)包被新 生乳頭。
本發(fā)明還涉及提供用于產(chǎn)生新生乳頭的方法,其包括如下步驟
(a)提供來(lái)自至少一個(gè)哺乳動(dòng)物毛囊的至少一個(gè)真皮乳頭(DP),
(b)通過(guò)將所述DP機(jī)械固定在細(xì)胞培養(yǎng)容器表面上而從所述DP中分離真皮毛 乳頭成纖維細(xì)胞(DPF),其中基底層有孔以允許所述DPF遷移出來(lái),
(c)在無(wú)膠原蛋白包被的單層培養(yǎng)中擴(kuò)增所分離的DPF,其中所述DPF至少傳代 一次,
(d)將所擴(kuò)增的DPF濃縮成顯示出生理DP的大小和形狀的細(xì)胞聚集物,其中將 所述DPF以每個(gè)容器表面1,000到100,000個(gè)DPF/cm2的細(xì)胞濃度在非貼壁培養(yǎng)容器中進(jìn) 行分化,并且其中將所擴(kuò)增的DPF濃縮至少48小時(shí);
(e)任選地,用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(優(yōu)選膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋 白)包被新生乳頭。
特別地,正是所分離DPF的擴(kuò)增和生理施用形式代表了現(xiàn)有技術(shù)將這些細(xì)胞用 于毛發(fā)生長(zhǎng)誘導(dǎo)的限制因素。需要多個(gè)增殖周期才能達(dá)到所需的細(xì)胞數(shù)量,這期間單層 培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞(特別是真皮乳頭成纖維細(xì)胞)喪失其誘導(dǎo)能力,經(jīng)驗(yàn)顯示是在5-8 個(gè)增殖周期后。這樣處理的細(xì)胞去分化并表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物,但不再能用于產(chǎn)生毛囊。
出乎意料地,本發(fā)明人證實(shí),在本發(fā)明的特定培養(yǎng)條件下(其中在細(xì)胞培養(yǎng)之 后擴(kuò)增的DPF以確定的濃度轉(zhuǎn)移到特殊非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)容器中),細(xì)胞在數(shù)天到數(shù)周后達(dá) 到分化和穩(wěn)定水平或重新獲得其毛發(fā)生長(zhǎng)誘導(dǎo)能力。除了重新獲得誘導(dǎo)特性以外,出乎意料地發(fā)現(xiàn),作為活躍的細(xì)胞間接觸和信號(hào)分子交換的結(jié)果,所述細(xì)胞隨后形成細(xì)胞聚 集物并分化。在這些特定條件下,分離之后這樣處理的細(xì)胞在濃縮成與毛囊中真皮乳頭 生理形狀大致對(duì)應(yīng)的大小和形狀。為此,所用細(xì)胞/培養(yǎng)容器表面的比例至關(guān)重要。
在步驟(a)之前,毛囊取自作為患者或供體的哺乳動(dòng)物。特別是從人、嚙齒動(dòng) 物、豬、犬科動(dòng)物、猴、羊、貓或狗(優(yōu)選人)中收集樣品?;旧蟽?yōu)選通過(guò)皮膚活檢 收集組織樣品,特別是從患病位置附近所選取的。在本發(fā)明中,毛囊樣品優(yōu)選從頭發(fā)、 胡須、眉毛、陰毛或其他體毛中提取。毛囊的提取根據(jù)醫(yī)療管理規(guī)范進(jìn)行??杉兓?樣品以除去干擾物質(zhì)。
步驟(a)中來(lái)自毛囊的DP的提供以及DPF的分離按照從之前標(biāo)準(zhǔn)流程新開(kāi)發(fā)的 形式來(lái)進(jìn)行。使用小片皮膚活檢,將表皮從下層的真皮和脂肪組織上切下,例如使用解 剖刀。將所述脂肪組織稍加壓迫(例如使用鑷子),以便于在解剖顯微鏡下容易地制備其 中的毛球。將這樣分離的毛囊固定在毛干上(例如再次用鑷子),將結(jié)締組織鞘小心地 沿徑向分離(例如用另外一把鑷子),從而將所述毛球外翻而暴露DPF和帶有毛基質(zhì)的毛 干。通過(guò)這種方法,將毛球的近端部分與結(jié)締組織鞘成纖維細(xì)胞和真皮乳頭一起容易地 與毛囊的其余部分分開(kāi),比如通過(guò)使用針或插管。此外,任選地制備毛干(其包含同樣 需要的毛基質(zhì)角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞)用于進(jìn)一步培養(yǎng)。
之后在步驟(b)中,將分離的真皮乳頭轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)容器中,并機(jī)械固定在 容器表面上。優(yōu)選地,通過(guò)使用針尖或解剖刀使分離的真皮乳頭機(jī)械停止在培養(yǎng)容器底 部來(lái)獲得DPF,而不對(duì)其進(jìn)行酶促分離。優(yōu)選每個(gè)培養(yǎng)容器孵育1至8個(gè)DP。特別地, 例如,將2至4個(gè)DP轉(zhuǎn)移到例如6孔或12孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中,并固定在板底。結(jié)果, 基底層稍有穿孔,但大致保留了乳頭形態(tài),并且DPF可從真皮乳頭中遷移出來(lái)并增殖。
在步驟(c)中DPF的培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中不使用膠原蛋白包被來(lái)實(shí)現(xiàn),所述標(biāo) 準(zhǔn)培養(yǎng)基優(yōu)選含有減量的胎牛血清(FCS)(例如10%,而不是常規(guī)的20% FCS)且額外補(bǔ) 充抗生素(如IX青霉素/鏈霉素)。分離之后,第一次培養(yǎng)基更換優(yōu)選最早在1周、 最晚2周后進(jìn)行。一旦細(xì)胞從DP中長(zhǎng)出,就根據(jù)細(xì)胞密度每周1到2次更換培養(yǎng)基。 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80%會(huì)合時(shí),使其從板底脫離(例如通過(guò)在室溫下使用胰蛋白酶/EDTA) 并傳代到其他培養(yǎng)容器(如T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶)中。在培養(yǎng)過(guò)程中,可進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞以 直接用于實(shí)驗(yàn),或?qū)⑵淅鋬鲈谝旱袀溆?。盡管傳代數(shù)不受限制,因此如果有存活力的 話就可將細(xì)胞擴(kuò)增至任意高的密度,但是優(yōu)選將所述DPF傳代至少兩次,更優(yōu)選至少五 次,最優(yōu)選少于九次。對(duì)高通量方法,優(yōu)選傳代八次。因此,在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施 方案中,通過(guò)濃縮非誘導(dǎo)性DPF來(lái)實(shí)施所述方法。意想不到的發(fā)現(xiàn)是,這種缺乏誘導(dǎo)特 性的DPF仍可用于組織工程。
接下來(lái)是步驟(d)的濃縮階段,其中在含有培養(yǎng)基的非貼壁培養(yǎng)容器中培養(yǎng)所 分離、增殖的DPF,所述培養(yǎng)基包含確定的組分,即標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。在這一系統(tǒng)中,特殊 的容器表面或容器表面(特別是底面)的特殊涂層減弱了細(xì)胞附著,或者甚至阻止細(xì)胞附 著到表面上。優(yōu)選地,非貼壁培養(yǎng)容器由玻璃、聚苯乙烯和/或用抗貼壁涂層處理的表 面制成。更優(yōu)選地,對(duì)容器應(yīng)用PTFE或聚HEMA包被的表面。本發(fā)明范圍內(nèi)特別優(yōu)選 使用超低附著培養(yǎng)容器,例如由Coming、Inc.> USA分銷的那些。這種非貼壁容器和涂 層為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知,且易于購(gòu)買或加工。8
自由接觸的結(jié)果是,細(xì)胞聚集成確定的大小,在數(shù)天后形成大小和形狀與原始 乳頭相似的聚集物。優(yōu)選將擴(kuò)增的DPF濃縮至少48小時(shí)、2至5天,更優(yōu)選2至3天,最 優(yōu)選大概2天;并任選地進(jìn)一步培養(yǎng)3至15天,優(yōu)選5至10天或2至21天。同樣,所形 成濃縮物的大小和形狀取決于取出皮膚活檢的區(qū)域。從胡須、體毛、眉毛、陰毛或頭發(fā) 取出并經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的DPF形成不同大小的細(xì)胞聚集物,這又進(jìn)而決定了相應(yīng)毛發(fā)的形狀、 大小和長(zhǎng)度。更重要的是接種到瓶中的起始細(xì)胞數(shù),它必須與容器表面為合適的比例。 在所述方法的另一實(shí)施方案中,步驟(d)中每個(gè)容器表面的細(xì)胞濃度為2,000至50,000個(gè) DPF/cm2,優(yōu)選 3,000 至 20,000 個(gè) DPF/cm2,更優(yōu)選 5,000 至 10,000 個(gè) DPF/cm2,最優(yōu)選 大概 6,666 個(gè) DPF/cm2。
在這一階段,自身產(chǎn)生的基質(zhì)已經(jīng)在濃縮物周圍形成。為了加快這一進(jìn)程并以 靶向方式對(duì)其施加影響,此時(shí)向培養(yǎng)基中加入生理基質(zhì)組分以形成模擬真皮乳頭特性的 囊。在后續(xù)步驟(e)中,用由細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的組合物包被這樣獲得的新生乳頭。制備該 組合物以模擬生理組合物。優(yōu)選地,它可由膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白組 成。特別優(yōu)選的是,所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白是重量份2-6 0.5-2 0.5-2的膠原蛋白IV、 纖連蛋白和層粘連蛋白的混合物,優(yōu)選重量份大致為4 1 1.15。但是,并不排除前述 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白也可單獨(dú)使用或以不同體積百分比使用,或與其他基質(zhì)組合。在本發(fā)明 的另一實(shí)施方案中,所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白還含有其他膠原蛋白(例如1、IOAU 18A1)、 糖胺聚糖和/或蛋白聚糖,優(yōu)選硫酸乙酰肝素、核心蛋白聚糖(decorin)、硫酸角質(zhì)素、 雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、多功能蛋白聚糖(versican)、基 底膜蛋白聚糖(perlecan)、CD44v3和/或多配體蛋白聚糖(syndecan)。此外,將新乳頭 的這一包被過(guò)程在盡可能低貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如超低附著性細(xì)胞培養(yǎng)容器)中進(jìn) 行。所述包被過(guò)程進(jìn)行1至5天,優(yōu)選1至2天。
本發(fā)明還涉及通過(guò)可根據(jù)本發(fā)明方法獲得的新生乳頭和毛囊。合適時(shí),本說(shuō)明 書關(guān)于產(chǎn)生新乳頭和小毛囊之方法的前述教導(dǎo)均認(rèn)為是有效且適用的,而不受限于所述 生產(chǎn)方法的產(chǎn)品。
本發(fā)明的新生乳頭和/或小毛囊都可用于生產(chǎn)皮膚等同物。優(yōu)選地,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 方法例如通過(guò)使用Matriderm (Dr.Suwelack Skin & Health Care AG)構(gòu)建所述皮膚等同物,并且小毛囊的插入位點(diǎn)用雙光子激光以規(guī)律間距切出,或用打孔機(jī)預(yù)穿孔得到。因此, 含有本發(fā)明新生乳頭和/或小毛囊的皮膚等同物是本發(fā)明的另一目的。除了重建的真皮 乳頭之外,它們還含有可由自身形成表皮結(jié)構(gòu)或周皮結(jié)構(gòu)的一層或多層角質(zhì)形成細(xì)胞, 并任選地含有一層或多層可應(yīng)用于真皮乳頭結(jié)構(gòu)上方的黑素細(xì)胞。
本發(fā)明的新生乳頭和/或小毛囊也可用作植入物。因此,本發(fā)明的另一目的是 植入物,其含有有效量的本發(fā)明新生乳頭和/或本發(fā)明小毛囊作為活性成分,任選與可 藥用輔劑一起使用。
相似地,本發(fā)明的皮膚等同物可用作移植物。本發(fā)明的另一目的是提供移植 物,其含有有效量的本發(fā)明皮膚等同物作為活性成分,任選與可藥用輔劑一起使用。
術(shù)語(yǔ)“有效量”表示對(duì)疾病或病理狀況分別具有預(yù)防或治療相關(guān)作用的植入物 或移植物的量。預(yù)防作用在單個(gè)代表滲入之后阻止疾病的發(fā)病或甚至病原體的感染,從 而嚴(yán)重削弱了所述病原體的后續(xù)增殖或甚至使其完全失活。治療相關(guān)作用在一定程度上減輕疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀,或者使引起所述疾病或病理狀況或與其相關(guān)的一個(gè)或多個(gè) 生理或生化參數(shù)部分或完全恢復(fù)正常。為實(shí)現(xiàn)想要的緩解毛發(fā)量減少癥狀的預(yù)防或治療 作用,所施用植入物或移植物的相應(yīng)量要足夠高。應(yīng)當(dāng)理解的是,任何哺乳動(dòng)物的具體 劑量水平、給藥頻率和給藥周期將取決于多種因素,包括所用具體組分的活性、年齡、 體重、總體健康狀況、性別、施用時(shí)間、施用途徑、藥物組合和具體療法的嚴(yán)重程度。 使用眾所周知的手段和方法,確切的量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員作為常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
使用藥物工程常見(jiàn)的固體或液體載體、溶劑和/或添加劑以及常用輔劑,以合 適的量(其取決于預(yù)期的施用方式)以已知方式生產(chǎn)本發(fā)明的植入物或移植物。這些可 藥用賦形劑包含鹽、緩沖劑、填充劑、螯合劑、抗氧化劑、溶劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、包 衣劑、添加劑、防腐劑和助懸劑。在本發(fā)明的含義中,“輔劑”表示在同時(shí)、同期或依 次施用時(shí)允許、強(qiáng)化或改變由植入或移植引起的特定機(jī)體應(yīng)答的每種物質(zhì)。與活性成分 組合以產(chǎn)生單一劑型的賦形劑材料的量根據(jù)所治療的宿主和具體施用方式而變化。
根據(jù)引入的方式,植入物或移植物可分別按照多種方法制造。制劑中治療活性 成分的濃度可為約0,1到100Wt%不等。它們可單獨(dú)施用或與其他治療組合施用。
本發(fā)明還教導(dǎo)用于毛發(fā)量減少狀況的預(yù)防或治療處理的本發(fā)明新生乳頭、小毛 囊和/或皮膚等同物。本發(fā)明方法的前述產(chǎn)品優(yōu)選用于治療性處理。治療相關(guān)作用在一 定程度上減輕毛發(fā)量減少的一種或多種癥狀,或者使引起所述病理狀況或與其相關(guān)的一 個(gè)或多個(gè)生理參數(shù)部分或完全恢復(fù)正常。倘若將本發(fā)明方法的產(chǎn)品以不同間隔施用,例 如為了加強(qiáng)增殖應(yīng)答并根除所述狀況的癥狀,則將監(jiān)測(cè)認(rèn)為是一種治療方法。可使用相 同的產(chǎn)品或不同的產(chǎn)品。在本發(fā)明的含義中,如果受試者具有開(kāi)始掉發(fā)的任何先決條件 如家族因素、遺傳缺陷或以前患過(guò)疾病,那么預(yù)防性處理是可取的。
本發(fā)明所涉及的毛發(fā)量減少的病理狀況可由脫發(fā)(例如雄激素性脫發(fā)、斑禿 等)、遺傳性禿頂、瘢痕、燒傷、放射治療、化學(xué)治療、疾病相關(guān)性脫發(fā)、意外傷害、毛 囊損傷、手術(shù)創(chuàng)傷、切口傷或皮膚移植的接受部位創(chuàng)傷所致。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的新生乳頭、小毛囊和/或皮膚等同物用于分別產(chǎn)生植入 物或移植物的用途,所述植入物或移植物用于毛發(fā)量減少狀況的預(yù)防或治療性處理。可 施用所述植入物或移植物來(lái)提前預(yù)防哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類個(gè)體)開(kāi)始脫發(fā)及其引發(fā)的結(jié) 果,或者治療正在產(chǎn)生和持續(xù)的癥狀。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供用于治療毛發(fā)量減少狀況的方法,其中在需要這種治 療時(shí)將本發(fā)明的新生乳頭、小毛囊和/或皮膚等同物引入哺乳動(dòng)物的皮膚中。所述小 器官樣毛囊(特別是自體/異體人毛囊前體)用于以誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)為目的的移植,而皮 膚替代物確實(shí)使皮膚(優(yōu)選頭皮)再生。將所述小器官樣毛囊引入預(yù)先脫毛并小型化 的受影響皮膚區(qū)域毛囊(峽部,isthmus)的開(kāi)口中。優(yōu)選地,注射所述新生乳頭和小 毛囊,更優(yōu)選利用大約150 μ m大小的特殊構(gòu)造裝置。還優(yōu)選的是,將所有組分以自體 形式使用,并在GLP/GMP條件下進(jìn)行處理。所述新生乳頭、小毛囊或毛囊區(qū)室(hair follicle compartment)刺激新發(fā)生的毛發(fā)生長(zhǎng),例如在遺傳性脫發(fā)、瘢痕(燒傷)、疾 病相關(guān)性脫發(fā)、化療/放射誘導(dǎo)脫發(fā)和本說(shuō)明書中已描述的相似情況下。通過(guò)微介質(zhì) (micro-medium)促進(jìn)小毛囊成熟成為具有長(zhǎng)期生存力的毛囊,即永久性的遠(yuǎn)端毛囊。
本發(fā)明還涉及將前述產(chǎn)品用于對(duì)發(fā)揮毛發(fā)調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)進(jìn)行直接的藥理學(xué)和美容學(xué)體外測(cè)試。所述毛發(fā)調(diào)節(jié)作用特別地選自毛發(fā)生長(zhǎng)、毛發(fā)形狀、毛發(fā)結(jié)構(gòu)、毛發(fā) 顏色和毛發(fā)色素沉著。優(yōu)選分析調(diào)節(jié)毛發(fā)生長(zhǎng)的效果,在脫發(fā)的情況下(如由脫發(fā)引起 的)以促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)為目的,以及在不期望的毛發(fā)過(guò)度生長(zhǎng)的情況下(如由多毛癥和/或 女性多毛癥或女性胡須生長(zhǎng)或不想要的體毛引起的)以抑制毛發(fā)生長(zhǎng)為目的。特別地, 高通量方法的使用使得制藥業(yè)和化妝品業(yè)能夠有效測(cè)試現(xiàn)有物質(zhì)或新物質(zhì)的潛在毛發(fā)生 長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用。所述物質(zhì)包括藥物制劑、化妝品制劑、化合物、聚合化合物、生長(zhǎng)因子、 細(xì)胞產(chǎn)物、活細(xì)胞和/或生物分子。此外,在向小毛囊中加入黑素細(xì)胞(即形成色素的 細(xì)胞)時(shí),可研究物質(zhì)對(duì)所形成毛干的色素沉著和/或著色的作用。類似地,也可測(cè)試 所述物質(zhì)對(duì)毛發(fā)形狀和毛發(fā)結(jié)構(gòu)的作用,例如形成卷曲等。
可評(píng)估或測(cè)量下述終點(diǎn)以獲得物質(zhì)在改善毛發(fā)結(jié)構(gòu)和影響毛發(fā)生長(zhǎng)方面之效力 的信息分析毛干形成、毛干的長(zhǎng)度生長(zhǎng)和特征、毛發(fā)陣列分析、真皮乳頭的體積和結(jié) 構(gòu)、增殖測(cè)定(例如K67表達(dá)、BrdU摻入等)、凋亡測(cè)定(例如TUNEL、酶分析、膜 聯(lián)蛋白測(cè)定等)、差異性標(biāo)志物測(cè)定(例如免疫組化、原位雜交、RT-PCR等)、測(cè)定作 為DPF標(biāo)志物的堿性磷酸酶、分析某些毛發(fā)特異性蛋白(毛發(fā)特異性角蛋白等),分析 細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子和所有類型(例如由真皮乳頭形成)的信使物質(zhì)(例如通 過(guò)BioPlex、ELISA等),和/或?qū)︼@示出表現(xiàn)增強(qiáng)的基質(zhì)蛋白、生長(zhǎng)因子(例如MSP、 HGF> CTGF等)、轉(zhuǎn)錄因子、wnt途徑中的分子(例如DKKl、BMP2-4等)、白介素 (例如IL-6等)和/或趨化因子/趨化因子受體(例如CXCR等)以及顯示出表現(xiàn)降低 的凋亡誘導(dǎo)分子和/或增殖刺激分子進(jìn)行的蛋白質(zhì)組或表達(dá)分析。對(duì)毛發(fā)色素沉著的影 響可以通過(guò)黑素細(xì)胞的排列/遷移、黑色素顆粒的形成/分布和酪氨酸酶的活性和/或?qū)?參與黑色素合成的基因表達(dá)進(jìn)行的芯片分析來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的其他實(shí)施方案、修改和變 化對(duì)閱讀本說(shuō)明書的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是明顯的,并可將其加以實(shí)施而不偏離本發(fā)明的范 圍。
此外,本發(fā)明的新生乳頭或小毛囊可以分別使用,或者與帶有毛囊的皮膚等同 物的形成相結(jié)合,用于在醫(yī)藥業(yè)、制藥業(yè)和美容業(yè)中對(duì)物質(zhì)進(jìn)行體外藥理學(xué)和毒理學(xué)測(cè) 試。在必須對(duì)其物質(zhì)和產(chǎn)品進(jìn)行毒性作用測(cè)試的情況下,這種用途(例如以高通量方法 進(jìn)行操作)對(duì)制藥業(yè)、化工業(yè)和化妝品業(yè)特別有意義。新的法律條文要求用合適的體外 測(cè)試方法代替以前的動(dòng)物測(cè)試。因此,小毛囊自身以及整合有小毛囊的人造皮膚替代系 統(tǒng)可用作毒理學(xué)研究(包括刺激、遺傳毒效應(yīng)等)的理想篩選系統(tǒng)。本發(fā)明的模型結(jié)構(gòu)可 完全替代動(dòng)物測(cè)試并代替不那么合適的現(xiàn)有體外模型,因?yàn)楸灸P褪狗治鰪?fù)雜生理學(xué)過(guò) 程成為可能??赏ㄟ^(guò)在生物反應(yīng)器中將所述模型結(jié)構(gòu)與目標(biāo)物質(zhì)接觸來(lái)進(jìn)行這種測(cè)試。 在物質(zhì)特異性孵育期(尤其是3分鐘到4小時(shí))之后,將所述模型用培養(yǎng)基進(jìn)行清洗,其 后通過(guò)本說(shuō)明書之前示例性性描述的合適分析方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明還教導(dǎo)了用于篩選調(diào)節(jié)毛發(fā)特性之物質(zhì)的方法,其包括下述步驟提供 本發(fā)明的新生乳頭、毛囊和/或皮膚等同物的樣品,將相應(yīng)樣品分成多個(gè)部分,將至少 一個(gè)部分與待篩選物質(zhì)進(jìn)行孵育,以及比較該部分樣品中與另一部分未與所述物質(zhì)孵育 的樣品中的毛發(fā)特性參數(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō),本發(fā)明方法使得可以通過(guò)本發(fā)明模型來(lái)鑒定和分 析對(duì)毛發(fā)產(chǎn)生影響的物質(zhì)。將所述樣品(應(yīng)當(dāng)理解為含有一定數(shù)量的本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)品)分 成多個(gè)部分。至少提供兩個(gè)亞組;一組用于篩選,同時(shí)另一組作為陰性對(duì)照。優(yōu)選地,篩選部分的數(shù)量大于對(duì)照部分的數(shù)量。通常,將多個(gè)部分用于高通量篩選。本發(fā)明方 法中的待篩選物質(zhì)不受任何限制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述物質(zhì)選自核酸(包 括RNAi、核酶、適配體、抗體、肽、糖類、聚合物、分子量在50至1,OOODa之間的小分 子,以及蛋白質(zhì),優(yōu)選抗體、細(xì)胞因子和脂籠蛋白。這些物質(zhì)通??梢晕膸?kù)形式獲得。 優(yōu)選在每部分樣品中孵育一種化合物。但是,也可以通過(guò)在一個(gè)部分中孵育至少兩種物 質(zhì)來(lái)研究物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。另一受試亞組是在無(wú)所述物質(zhì)的情況下同時(shí)進(jìn)行孵育。孵育 方法取決于多種參數(shù),例如細(xì)胞類型和檢測(cè)靈敏度,所述參數(shù)的優(yōu)化遵照本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的常規(guī)流程進(jìn)行。本發(fā)明意義上的有效物質(zhì)的鑒定是間接進(jìn)行的,優(yōu)選通過(guò)測(cè)定 表達(dá)模式和/或細(xì)胞生存力的改變來(lái)進(jìn)行。所述測(cè)定在特定時(shí)刻進(jìn)行,并且與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始 時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度和陰性對(duì)照相關(guān)聯(lián)。合適的測(cè)試為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知,或者可按照常規(guī) 容易地進(jìn)行設(shè)計(jì)。
此外,本發(fā)明可以試劑盒的方式實(shí)施,所述試劑盒含有根據(jù)本發(fā)明的新生乳 頭、小毛囊、皮膚等同物、植入物和/或移植物,其特別是用于分別實(shí)施治療毛發(fā)量減 少狀況或篩選物質(zhì)的本發(fā)明方法。本發(fā)明的試劑盒可包括這樣的物品,其含有如何實(shí)施 本發(fā)明方法的文字說(shuō)明或向使用者指出該文字說(shuō)明所在。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié),可參考上 文關(guān)于本發(fā)明治療方法和篩選方法的陳述,其也適用于本發(fā)明的試劑盒。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)第一次提供了用于產(chǎn)生新生乳頭和小毛囊的方法,所述方法 通過(guò)三維培養(yǎng)以及細(xì)胞濃度與培養(yǎng)容器表面的特定比例將擴(kuò)增的DPF濃縮成生理性細(xì)胞 聚集物。如同從生成毛干之小毛囊的形成中所見(jiàn)到以及通過(guò)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析所得 到的,所述DPF在特定濃縮之后重新表現(xiàn)出其原始的誘導(dǎo)特性。由于本發(fā)明過(guò)程中可重 建細(xì)胞的誘導(dǎo)特性,所以擴(kuò)增細(xì)胞的代數(shù)并不重要。因此,在非貼壁培養(yǎng)容器中進(jìn)行三 維培養(yǎng)時(shí),有利的是可以使用恒定且大量的起始細(xì)胞并以可再現(xiàn)的方式進(jìn)行培養(yǎng)基的受 控補(bǔ)給。與用于普通分化實(shí)驗(yàn)的其他3D培養(yǎng)方法(如微團(tuán)、小塊培養(yǎng)或懸滴法)相比, 本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞不會(huì)被迫使進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞接觸,而是能夠獨(dú)立地結(jié)合而形成 細(xì)胞聚集物以及(對(duì)于DPF而言)乳頭樣濃縮物。
提供由所述生產(chǎn)方法所定義的新生乳頭、小毛囊和皮膚等同物產(chǎn)生了分別用于 毛發(fā)量減少狀況的預(yù)防或治療性處理的植入物或移植物。本發(fā)明產(chǎn)品具有許多優(yōu)點(diǎn)。毛 囊等同物和皮膚替代物比分離的毛囊更為標(biāo)準(zhǔn)化。它們降低了對(duì)毛囊的需求,而且比任 何已有模型更接近于體內(nèi)情況。本發(fā)明的復(fù)雜三維模型模仿體內(nèi)毛囊的結(jié)構(gòu)和組織學(xué)組 成,使得在活性物質(zhì)效力和相容性方面提供了具有高水平相關(guān)性的信息。本發(fā)明的所有 產(chǎn)品的其他特征還有高穩(wěn)定性、低制造費(fèi)用、便于操作,并可在任何時(shí)間提供。這些特 性構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)化流程中可再現(xiàn)操作的基礎(chǔ),以及與其匹配效應(yīng)分子之間可靠安全的相互作 用的基礎(chǔ)。它們的應(yīng)用是有前途的新方法,可用于直接且即時(shí)導(dǎo)致癥狀減輕的廣譜療 法。
本發(fā)明的產(chǎn)品適合于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和化妝品領(lǐng)域的多種應(yīng)用,如用于開(kāi)發(fā)化妝 品,或用于發(fā)現(xiàn)通過(guò)影響毛發(fā)色素沉著、毛發(fā)生長(zhǎng)、毛發(fā)結(jié)構(gòu)等而對(duì)毛囊具有生物效應(yīng) 的活性物質(zhì),這可通過(guò)體外測(cè)試系統(tǒng)或篩選方法進(jìn)行,由此提供與體內(nèi)情況相關(guān)的物質(zhì) 對(duì)毛囊細(xì)胞之作用的信息。因此,所述產(chǎn)品的提供對(duì)大規(guī)模篩選測(cè)試特別有益。它們均 可應(yīng)用于適于高通量的篩選方法,以鑒定用于毛發(fā)的生長(zhǎng)促進(jìn)或生長(zhǎng)抑制的活性物質(zhì),12以及用于物質(zhì)和化學(xué)品的毒理學(xué)測(cè)試。本發(fā)明的產(chǎn)生方法及其產(chǎn)生的篩選方法可以簡(jiǎn)單 快捷的方式實(shí)施。此外,可以高成本效益地生產(chǎn)合適的試劑盒。
應(yīng)當(dāng)理解的是,本發(fā)明不受本文中所述的特定方法、產(chǎn)品、試劑盒或用途的限 制,因?yàn)樗鼈儺?dāng)然是可以改變的。還應(yīng)當(dāng)理解的是,本文中所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述特 定實(shí)施方案,而并非想要限制本發(fā)明的范圍,該范圍僅由所附權(quán)利要求所定義。如本文 (包括所附的權(quán)利要求)中所用的,無(wú)數(shù)量詞修飾的均可包含復(fù)數(shù)含義,除非上下文中明 確指出相反的含義。因此,例如提到“容器”時(shí)包括一個(gè)或多個(gè)容器,它們可以為相同 或不同的大小、形狀或組成,提到“方法”時(shí)包括涉及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的等同 步驟和方法,等等。除非另有定義,否則本文中所用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。
盡管與本文中所描述的那些相似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā) 明,還是在下文中描述了合適的實(shí)施例。提供下述實(shí)施例作為示例而非作為限制。在所 述實(shí)施例中,使用無(wú)污染活性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑和緩沖劑(只要有可能)。
附圖
圖1顯示
A)取自面部提升手術(shù)的供體皮膚的鉆取活檢。虛線表示用于進(jìn)一步毛囊分離的 真皮皮下邊界切割線。
B)通過(guò)新技術(shù)解離“截?cái)嗟摹焙徒怆x的毛囊(突出顯示的方框)將結(jié)締組織 鞘沿毛干徑向拉出,對(duì)毛干進(jìn)行純分離,其一側(cè)為外根鞘和內(nèi)根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素 細(xì)胞,另一側(cè)為真皮乳頭和結(jié)締組織鞘。
C)帶有其成纖維細(xì)胞和鄰近的真皮乳頭的解離的結(jié)締組織鞘,其可被準(zhǔn)確地切 下(突出顯示的方框)。
D)電子顯微鏡術(shù)顯示的解離的真皮乳頭。
E)真皮乳頭成纖維細(xì)胞從輕微受損并固定的真皮乳頭中長(zhǎng)出,其囊結(jié)構(gòu)幾乎是 完整的。
F)在未包被75cm2培養(yǎng)瓶中第三次傳代培養(yǎng)的真皮乳頭成纖維細(xì)胞。
G)在超低附著性75cm2瓶中形成真皮乳頭樣濃縮物的真皮乳頭成纖維細(xì)胞。
H)6孔低附著板中待加工成具有細(xì)胞外基質(zhì)組分之新乳頭的真皮乳頭成纖維細(xì) 胞濃縮物的放大圖。
圖2顯示
A)帶有細(xì)胞外基質(zhì)及其周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的新乳頭(白色箭頭),已將其加到超 低附著板上形成多細(xì)胞濃縮物。
B)在超低附著培養(yǎng)物中M小時(shí)后囊結(jié)構(gòu)形成的最初跡象。
C) 1周后的新毛囊形成。原始毛干的形成清晰可見(jiàn)。
D)由DIC光學(xué)顯微術(shù)顯示的新毛囊形成,展示了培養(yǎng)1周后的完整真皮乳頭結(jié) 構(gòu)。
E)插入到皮膚等同物中的新毛囊,其顯示出確定的毛囊樣結(jié)構(gòu)。突出顯示的方 框顯示了向下生長(zhǎng)的毛囊。使用倒置顯微鏡可看到囊/皮膚等同物的近端部分。
F)新毛囊在皮膚等同物中的進(jìn)一步培養(yǎng),其證實(shí)了毛囊的明確錨著和繼續(xù)生長(zhǎng)。
圖3顯示
不同發(fā)育和形成階段中的使用來(lái)自哺乳動(dòng)物毛囊以外來(lái)源的KC和MC產(chǎn)生的新 毛囊
A)階段1 :被黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞所包圍的新毛囊(未添加外源細(xì)胞外基 質(zhì)蛋白),其已添加到超低附著板上形成早期多細(xì)胞濃縮物。
B)階段2 在超低附著培養(yǎng)物中M小時(shí)后囊結(jié)構(gòu)形成的最初跡象(注意在頂端 的突起)。附著的細(xì)胞粘附在新乳頭上并且采取扁平的形狀。
C)階段3 在毛囊樣鞘發(fā)育1周后新毛囊形成開(kāi)始。
D)階段4:在新毛囊中,清晰可見(jiàn)的初始毛干形成開(kāi)始可見(jiàn)。
圖4顯示
兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的功能性新毛囊形成
A)濃縮48小時(shí)之后;以及
B)濃縮7天之后;在第7天,細(xì)胞聚集更加致密,并且自身來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì) 的形成開(kāi)始可見(jiàn)。實(shí)施例
實(shí)施例1 分離并培養(yǎng)人毛囊真皮乳頭成纖維細(xì)胞(DPF)、結(jié)締組織鞘成纖維細(xì) 胞(CTSF)、角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)和黑素細(xì)胞(MC)
在對(duì)來(lái)自大量面部提升手術(shù)的人頭皮樣品進(jìn)行顯微解剖后獲得了單個(gè)毛囊, 所述樣品按照法規(guī)要求獲取。為了分離基質(zhì)KC和MC、CTSF和真皮乳頭成纖維細(xì)胞 (DPF),使用解剖刀將皮膚于在真皮-皮下界面處切開(kāi),在解剖顯微鏡下用鑷子將處于生 長(zhǎng)階段(生長(zhǎng)期)的毛囊拔出。
與已有描述的分離技術(shù)(例如Miigerl 等,Methods Exp.Dermat.ll, 381-385, 2002)相反,所需細(xì)胞群的純凈組分通過(guò)對(duì)所分離毛囊上部的結(jié)締組織進(jìn)行縱切獲得。 通過(guò)在一端固定毛干,可用鑷子將CTS從毛基質(zhì)中朝向下方近端部分(lower proximal portion)沿徑向拔出。利用該技術(shù)可自動(dòng)暴露DP細(xì)胞,避免了損傷和細(xì)胞類型的混雜。 因此,可將所述CTS和真皮乳頭以及包含KC和MC細(xì)胞的毛基質(zhì)明顯地分開(kāi),并且容易 用解剖刀加以剝離。
通過(guò)用針將其固定于培養(yǎng)板上,將DP和CTS分離物分別培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中(每孔2-4個(gè))。為了使其迅速生長(zhǎng)但仍同時(shí)保持成纖維細(xì)胞的囊狀形態(tài)及微環(huán)境,將 薄膜輕微劃破以松散細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。用外加10%胎牛血清(FCS)的DMEM+(Gibco/ lnvitrogen)浸沒(méi)細(xì)胞,直至1_2周之后基于供體改變觀察到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。然后,將細(xì) 胞轉(zhuǎn)移于25cm2培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)一周,再進(jìn)一步傳代到75cm2培養(yǎng)瓶中。在達(dá)到亞會(huì)合 (sub-confluence)后,將第3代分到3個(gè)75cm2瓶中,獲得1.5-2百萬(wàn)個(gè)DPF或CTSF。
通過(guò)胰酶消化(0.05%胰蛋白酶和0.53mM EDTA)將KC和無(wú)黑色素的毛囊MC 從剩余發(fā)干及附著的毛基質(zhì)中遷移出來(lái),通過(guò)差異性胰酶消化分離,并按照ToWn等, J.Invest.Dermatology 104(1), 86-88,1995 中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例2 :形成新乳頭14
將優(yōu)化計(jì)數(shù)的500,000個(gè)DPF接種于含有DMEM+的75cm2超低附著培養(yǎng)瓶(Coming)中,使其形成細(xì)胞聚集物。靜置48小時(shí)后,這些細(xì)胞聚集物形成天然人毛囊真 皮乳頭的大小。然后將聚集物轉(zhuǎn)移到6孔超低附著板中,并向孔中加入層粘連蛋白(終濃 度11.5 μ g/ml)、纖連蛋白(終濃度10 μ g/ml)和膠原IV (終濃度40 μ g/ml)的混合物。 培養(yǎng)M-48小時(shí)后,內(nèi)源ECM分泌物與加入的蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的基質(zhì)包裹,新乳頭已形 成。為了促進(jìn)更快的ECM積累和分化,可以任選地向培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)因子,即肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子(30ng/ml)和/或結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(20ng/ml)。這些新乳頭已經(jīng)準(zhǔn)備好植入 體內(nèi)的皮膚以發(fā)生毛發(fā)誘導(dǎo)特性。
實(shí)施例3:形成新毛囊
向超低吸附培養(yǎng)瓶(6孔,Coring)中的新乳頭加入250,000個(gè)KC和MC (10 1),并將DMEM+培養(yǎng)基更換成確定的角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco)。 1周后,有覆蓋的新乳頭形成毛囊樣結(jié)構(gòu)。上述新毛囊已經(jīng)可以用于測(cè)試。為了制作更 好地模擬毛囊結(jié)構(gòu)和功能的多層新毛囊,其可通過(guò)在具有DMEM+10% FCS的超低附著 板中用膠原蛋白IV (60 μ g/ml)和CTSF (200,000個(gè)細(xì)胞)的混合物包被所產(chǎn)生的新毛囊2 天并且其后每3天更換一次培養(yǎng)基而獲得。
實(shí)施例4 利用新毛囊生成皮膚替代物
使用前人描述的方法(Toma等,Stem Cells 23,727-37、2005)分離幼年人包皮 成纖維細(xì)胞,并在DMEM+10% FCS中進(jìn)行培養(yǎng)。將250,000個(gè)真皮成纖維細(xì)胞(還使 用了 DPF或CTSF,但由于處理的原因優(yōu)選包皮成纖維細(xì)胞)與纖維蛋白原溶液(Sigma, 3mg/ml)相混合,并加入 2.0% (ν/ν)抑肽酶(20 μ g/ml)和 2.5% (ν/ν)凝血酶 1.25U/ ml。將所述冷卻溶液加入到tnmswell培養(yǎng)室中,避免氣泡。將溫度調(diào)節(jié)至室溫2-3分鐘 后,將30-40個(gè)新毛囊輕輕加入到溶液中,在37°C下在10分鐘中聚合成凝膠。將所形成 的基質(zhì)用DMEM+培養(yǎng)基浸泡48小時(shí)。
從得自面部提升手術(shù)或包皮的皮膚活檢樣品中分離真皮角質(zhì)形成細(xì)胞 (Barrandon 和 Green,Proc Natl.Acad.Sd.82、5390-4、1985)。簡(jiǎn)單地說(shuō),將下層的脂肪組織和真皮切下,并用胰蛋白酶/EDTA溶液(PAA)于4°C消化過(guò)夜。使用細(xì)胞刮刀收集 KC,在經(jīng)過(guò)70 μ m細(xì)胞濾器(Becton Dickinson)后將上述細(xì)胞接種到膠原蛋白I包被的培 養(yǎng)瓶中。一周兩次更換確定的角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco),當(dāng)達(dá)到60-80%會(huì)合 時(shí)對(duì)KC進(jìn)行傳代或收集。
在基質(zhì)的頂部加入KC O50,000)并使其貼壁M小時(shí)。通過(guò)更換確定的角質(zhì)形成 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco)來(lái)清除過(guò)量的細(xì)胞,在達(dá)到會(huì)合后,將tnmswell小室提升至氣 液界面以使KC分化。
還測(cè)試了用細(xì)胞系(即KC的HaCat和成纖維細(xì)胞的PK27)產(chǎn)生相似的皮膚 模型,因?yàn)樗鼈兏菀着囵B(yǎng)和減少供體改變。將它們培養(yǎng)在含有5%胎牛血清(FCS, Gibco)的 DMEM+(Gibco)中。
實(shí)施例5 形成含有不來(lái)自哺乳動(dòng)物毛囊之細(xì)胞的新毛囊
使用如下文所獲得的KC和MC按如實(shí)施例3所述產(chǎn)生新毛囊。
人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)
使用前人所述的方法(Toma等,Stem Cells 23、727-37、2005 ; Barrandon 和Green, Proc Natl Acad Sci. 1985、82: 5390-4)從包皮環(huán)割手術(shù)中分離人包皮成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說(shuō),去除下層的脂肪組織和真皮,將剩余表皮在中性蛋白酶溶 液(4mg/ml,Sigma)中4°C消化過(guò)夜。然后,使用細(xì)胞刮刀收集角質(zhì)形成細(xì)胞,在經(jīng)過(guò) 70 μ m的細(xì)胞濾器(Becton Dickinson)后將上述細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。所有角質(zhì)形成細(xì)胞 均培養(yǎng)在膠原蛋白I包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和確定的角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco)中。 一周兩次更換培養(yǎng)基,當(dāng)達(dá)到60-80%會(huì)合時(shí),對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行傳代或收集。將成纖 維細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM+10% FCS中。
人表皮黑素細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)
從1管人成體表皮黑素細(xì)胞(購(gòu)自CellMade)開(kāi)始,根據(jù)廠商說(shuō)明書完成細(xì)胞培養(yǎng)步驟。簡(jiǎn)單地說(shuō),向T75培養(yǎng)瓶中加入15ml黑素細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。通過(guò)將管下半部 分置于37°C水浴中1分鐘而使細(xì)胞迅速解凍。將細(xì)胞重懸于含有黑素細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的 T-75培養(yǎng)瓶中。將T-75培養(yǎng)瓶置于37°C、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中。每2_3天更換一 次黑素細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。當(dāng)達(dá)到80%會(huì)合時(shí),將細(xì)胞傳代。
所產(chǎn)生的新毛囊示于圖3,其顯示了使用來(lái)自非哺乳動(dòng)物毛囊來(lái)源的KC和MC 產(chǎn)生的新毛囊的不同發(fā)育階段。在階段1中,新乳頭(未添加外源細(xì)胞外基質(zhì)蛋白)被黑 素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞所包圍,將其加入超低附著培養(yǎng)板中以形成早期多細(xì)胞聚集物。 已經(jīng)產(chǎn)生了松散的聚集物。在階段2中,已可在超低附著培養(yǎng)物中觀察到形成囊結(jié)構(gòu)的 最初跡象。當(dāng)已經(jīng)在聚集物頂部形成突起時(shí),附著的細(xì)胞粘附在新乳頭上并采取扁平的 形狀。在大約1周后,所述新毛囊開(kāi)始形成含有毛囊樣鞘的發(fā)育過(guò)程。在已形成的新毛 囊中,開(kāi)始可以看到清晰可見(jiàn)的原始毛干。
實(shí)施例5:使用Agilent人類全基因組寡核苷酸微陣列(單色)對(duì)來(lái)自細(xì)胞樣品 的不同人源真皮乳頭進(jìn)行基因表達(dá)分析
l.SuperAmp RNA 擴(kuò)增
如前文所述產(chǎn)生兩個(gè)獨(dú)立的天然真皮乳頭、1 X IO3個(gè)單層培養(yǎng)的真皮乳頭成纖 維細(xì)胞、48小時(shí)后重濃縮的真皮乳頭成纖維細(xì)胞和14天后重濃縮的真皮乳頭成纖維細(xì) 胞。將所述四種人細(xì)胞樣品用SuperAmp 裂解緩沖液進(jìn)行裂解。
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生哺乳動(dòng)物小毛囊的方法,其包括以下步驟(a)提供至少一個(gè)新生乳頭,(b)提供選自成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞的至少一種其他細(xì)胞群,以及(c)在非貼壁培養(yǎng)條件下將所述新生乳頭與所述至少一種其他細(xì)胞群進(jìn)行共培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中所述至少一種其他細(xì)胞群來(lái)源于和/或可來(lái)源于哺乳 動(dòng)物毛囊,其選自結(jié)締組織鞘成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和/或黑素細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法,其中步驟(a)的新生乳頭包被有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,優(yōu) 選膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中所述新生乳頭根據(jù)權(quán)利要求6至10中 任一項(xiàng)的方法之一來(lái)產(chǎn)生。
5.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的方法所產(chǎn)生的小毛囊。
6.產(chǎn)生可用于權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)之方法的新生乳頭的方法,其包括以下步驟(a)提供來(lái)自至少一個(gè)哺乳動(dòng)物毛囊的至少一個(gè)真皮乳頭(DP),(b)通過(guò)將所述DP機(jī)械固定在細(xì)胞培養(yǎng)容器表面上而從所述DP中分離真皮毛乳頭 成纖維細(xì)胞(DPF),其中所述基底層有孔以允許所述DPF遷移出來(lái),(C)在無(wú)膠原蛋白包被的單層培養(yǎng)中擴(kuò)增所分離的DPF,其中所述DPF至少傳代一次,(d)將擴(kuò)增的DPF濃縮成顯示生理DP大小和形狀的細(xì)胞聚集物,其中將所述DPF以 每容器表面1000到100,000個(gè)DPF/cm2的細(xì)胞濃度在非貼壁培養(yǎng)容器中進(jìn)行分化,以及(e)用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包被所述新生乳頭,優(yōu)選用膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或?qū)诱?連蛋白進(jìn)行包被。
7.產(chǎn)生可用于權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)之方法的新生乳頭的方法,其包括以下步驟(a)提供來(lái)自至少一個(gè)哺乳動(dòng)物毛囊的至少一個(gè)真皮乳頭(DP),(b)通過(guò)將所述DP機(jī)械固定在細(xì)胞培養(yǎng)容器表面上而從所述DP中分離真皮毛乳頭 成纖維細(xì)胞(DPF),其中所述基底層有孔以允許所述DPF遷移出來(lái),(C)在無(wú)膠原蛋白包被的單層培養(yǎng)中擴(kuò)增所分離的DPF,其中所述DPF至少傳代一次,(d)將擴(kuò)增的DPF濃縮成顯示生理DP大小和形狀的細(xì)胞聚集物,其中將所述DPF以 每容器表面1,000到100,000個(gè)DPF/cm2的細(xì)胞濃度在非貼壁培養(yǎng)容器中進(jìn)行分化,其中 將所擴(kuò)增的細(xì)胞濃縮至少48小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中將所擴(kuò)增的DPF濃縮2至21天或3至15天。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法,其還包括以下步驟(e)用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包被所述新生乳頭,優(yōu)選用膠原蛋白IV、纖連蛋白和/或?qū)诱?連蛋白進(jìn)行包被。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)的方法,其中在步驟(d)中對(duì)非誘導(dǎo)性DPF進(jìn)行濃縮。
11.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)的方法所產(chǎn)生的新生乳頭。
12.皮膚等同物,其含有根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊或根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭。
13.植入物,其含有根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊和/或根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭作為 活性成分,其任選地還包含可藥用輔劑。
14.移植物,其含有有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求12的皮膚等同物作為活性成分,其任選 與可藥用輔劑一起使用。
15.根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊、根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭和/或根據(jù)權(quán)利要求12 的皮膚等同物,其用于預(yù)防或治療性處理毛發(fā)量減少的狀況。
16.試劑盒,其含有根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊、根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭、根據(jù)權(quán) 利要求12的皮膚等同物、根據(jù)權(quán)利要求12的植入物和/或根據(jù)權(quán)利要求14的移植物。
17.根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊、根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭和/或根據(jù)權(quán)利要求12 的皮膚等同物用于對(duì)物質(zhì)的毛發(fā)調(diào)節(jié)作用進(jìn)行體外測(cè)試的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊、根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭和/或根據(jù)權(quán)利要求12 的皮膚等同物用于對(duì)物質(zhì)的毒性作用進(jìn)行體外測(cè)試的用途。
19.用于治療毛發(fā)量減少狀況的方法,其中將根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊、根據(jù)權(quán)利要 求11的新生乳頭和/或根據(jù)權(quán)利要求12的皮膚等同物引入需要這種治療的哺乳動(dòng)物的皮 膚中。
20.用于對(duì)調(diào)節(jié)毛發(fā)特性的物質(zhì)進(jìn)行高通量篩選的方法,其包括以下步驟-提供根據(jù)權(quán)利要求11的新生乳頭、根據(jù)權(quán)利要求5的小毛囊和/或根據(jù)權(quán)利要求 12的皮膚等同物的樣品,-將所述各個(gè)樣品分成份,-將至少一份與待篩選物質(zhì)一起孵育,以及-將該份的毛發(fā)特性參數(shù)與未與所述物質(zhì)一起孵育的另一份樣品進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生小毛囊的方法,其包括以下步驟a)提供新生乳頭,b)提供選自成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的其他細(xì)胞群,以及將所述新生乳頭與至少一種其他細(xì)胞群在非貼壁培養(yǎng)容器中共培養(yǎng)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生新生乳頭(可用于所述產(chǎn)生小毛囊的方法中)的方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102027106SQ200980116851
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者格爾德·林德納, 羅蘭·勞斯特爾 申請(qǐng)人:柏林工業(yè)大學(xué)