專利名稱：用于有機酸生產(chǎn)的改良的酵母菌株的制作方法
用于有機酸生產(chǎn)的改良的酵母菌株本發(fā)明涉及用酵母生產(chǎn)有機酸。更具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)有機酸的酵母并涉及 通過過量表達一種或多種己糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母生產(chǎn)有機酸的方法。
背景技術(shù)：
在食品和藥學(xué)工業(yè)中廣泛使用多種有機酸，并且有機酸作為化學(xué)工業(yè)的新結(jié)構(gòu)單 元材料引起越來越多的關(guān)注(Werpy，T.和 G. Petersen，iTop Value Added Chemicals From Biomass. 2004，US Department of Energy :Oak Ridge TN)。特別地，如果它們通過環(huán)境友 好的發(fā)酵策略產(chǎn)生的話，則它們提供了對石油衍生的并因此是有限的結(jié)構(gòu)單元材料的合理 的備選。此類有機酸的例子包括乳酸、檸檬酸、衣康酸和琥珀酸。用于此類方法的微生物包括細菌、絲狀真菌和酵母。但是，此類方法具有許多不利 之處，特別地導(dǎo)致所需的長發(fā)酵期間和由于與高濃度雜質(zhì)混合的低產(chǎn)物濃度而致的高的酸 純化成本。成本是決定此種方法是否能真正用于結(jié)構(gòu)單元生產(chǎn)的備選的至關(guān)重要的因素。因 此，人們尋找用微生物提高有機酸生產(chǎn)的生產(chǎn)性(productivity)的方法。增加生產(chǎn)性的一 個領(lǐng)域是增強生產(chǎn)菌株的強壯性。例如，具有低pH的培養(yǎng)基對于有機酸的生產(chǎn)是有利的，因為由此產(chǎn)生游離酸而非 陰離子形式，這通常降低純化成本。但是，此種生產(chǎn)環(huán)境對微生物產(chǎn)生了高的應(yīng)激培養(yǎng)基 是酸化的，從而細胞不得不積極地抵銷跨質(zhì)膜的增加的PH梯度。在低的外部pH時，有機酸 對細胞產(chǎn)生額外的應(yīng)激，因為它們通過質(zhì)膜擴散并酸化胞質(zhì)。假定有這種應(yīng)激，通過使用本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的話存在生產(chǎn)性的限制，因為微生物細胞最終將喪失生存力和代謝活性。抵銷這種效應(yīng)的一個可能性是分離更強壯的微生物菌株，即，在低pH能夠改善生 存力和代謝活性的菌株。已提出了用于此類選擇或分選策略的方法，例如US 20050112737 和 US 20070065899。事實上，用于增加生產(chǎn)性的許多方法依賴于假定生產(chǎn)環(huán)境(如酸應(yīng)激)限制了生 產(chǎn)性，如之前所述。用于菌株改進的另一主要關(guān)注涉及產(chǎn)物形成率本身，這是從參與產(chǎn)物形 成的酶活性被增強的意義上來說的。通常增強的酶活性的例子包括重要的代謝途徑如糖酵解，其通常提供用于生產(chǎn)有 機酸所需的中間體。但是，即使已知在酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，糖酵解流調(diào) 節(jié)的一個決定步驟是糖攝取，也就是將糖跨細胞膜轉(zhuǎn)運，從未考慮將該事實用來在微生物 中提高有機酸生產(chǎn)的生產(chǎn)性。本發(fā)明涉及通過提高己糖攝取來提高微生物的有機酸生產(chǎn)性。已經(jīng)顯示在釀酒酵母(S. cerevisiae)中通過過量表達己糖轉(zhuǎn)運蛋白能夠改 善 CO2 和乙醇生產(chǎn)(EP0785275, US6159725, Perez 等人，2005，Guillaume 等人，2007，和 Gutierrez-Lomeli 等人，2008)。但是，從未描述過己糖攝取對用微生物進行有機酸生產(chǎn)的影響。糖攝取可以是微生物生產(chǎn)有機酸、特別是在低pH生產(chǎn)有機酸的限制因子似乎是難以相信的，但是令人吃驚的是，在酵母菌株中過量表達己糖轉(zhuǎn)運蛋白可以如下所述改進 其有機酸生產(chǎn)性。在面包酵母中，至今已知20種基因編碼類似于葡萄糖(己糖)轉(zhuǎn)運蛋白或與己糖 攝取相關(guān)的蛋白質(zhì)(HXT1至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2)。已進行了許多不同的研究來確定 這些轉(zhuǎn)運蛋白各自的特征(親和性和能力(capacity))、以及構(gòu)建缺失了一種或多種HXT基 因和不同組合的菌株、和最終構(gòu)建組合了不同轉(zhuǎn)運蛋白的親和性和能力的嵌合蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供用過量表達至少一種己糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母生產(chǎn)有機酸 的方法。相對于不過量表達己糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母菌株，至少一種己糖轉(zhuǎn)運蛋白的過量表達 提高了有機酸的生產(chǎn)性。酵母菌株可能表達涉及目的有機酸生產(chǎn)的進一步的基因。在充分的培養(yǎng)基中通過 培養(yǎng)過量表達己糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母生產(chǎn)有機酸，從而在培養(yǎng)基中積聚目的有機酸并隨后通 過本領(lǐng)域已知的技術(shù)純化至所需的程度。此外，我們顯示通過己糖轉(zhuǎn)運蛋白過量表達決定的糖酵解流的增加不僅對微生物 生產(chǎn)性而且對生物質(zhì)累積可以具有積極的作用。相比背景酵母，所述現(xiàn)象可以是或多或少 明顯的。附圖簡述

圖1 在釀酒酵母GRF18U菌株中(過量)表達HXTl或HXT7基因。在用葡萄糖2% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。在上方圖 中，將生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)、HXT1轉(zhuǎn)化體(正方形、實線) 和HXT7轉(zhuǎn)化體(三角形、實線)。在下方圖中，對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(空心 符號)和乙醇生產(chǎn)(實心符號)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖2 在釀酒酵母CEN. Hi菌株中(過量)表達HXTl或HXT7基因。在用葡萄糖2% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。在左邊， 將生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)，HXT1 (正方形、實線)轉(zhuǎn)化體和 HXT7(三角形、實線)轉(zhuǎn)化體。在右邊，對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(空心符號)和 乙醇生產(chǎn)(實心符號)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖3 在釀酒酵母GRF18U(左圖)或CEN. PK(右圖)菌株中(過量)表達HXTl或 HXT7基因?qū)τ谝掖己蜕镔|(zhì)累積的影響給出了轉(zhuǎn)化體相對于對照菌株在圖1和2中描述的動力學(xué)的最大累積/生產(chǎn)計算 的生物質(zhì)累積和乙醇生產(chǎn)的增加(表示為百分率)。圖4. 1 在(過量)表達HXTl的GRF18U LpLDH轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生產(chǎn)(空心符號)。在用葡萄糖5% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)和HXTl (正 方形、實線)轉(zhuǎn)化體。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生產(chǎn)(C)和乳酸生產(chǎn)(d)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。
圖4. 2 在(過量)表達HXT7的GRF18U LpLDH轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生產(chǎn)(空心符號)。在用葡萄糖5% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)和HXT7 (三 角形、實線)轉(zhuǎn)化體。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生產(chǎn)(C)和乳酸生產(chǎn)(d)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖5. 1 在(過量)表達HXTl的CEN. PK LpLDH轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生產(chǎn)(實心符號)。在用葡萄糖5% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)，HXTl (正方 形、實線)轉(zhuǎn)化體。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生產(chǎn)(C)和乳酸生產(chǎn)(d)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖5. 2 在(過量)表達HXT7的CEN. PK LpLDH轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生產(chǎn)(實心符號)。在用葡萄糖5% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)，HXT7 (三角 形、實線)轉(zhuǎn)化體。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生產(chǎn)(C)和乳酸生產(chǎn)(d)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖6. 1 (過量)表達多拷貝質(zhì)粒中的HXTl基因和LpLDH基因的CEN. I3K釀酒酵母 菌株乙醇和乳酸生產(chǎn)(實心符號)。在用葡萄糖5% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)，和HXTl (正 方形、實線)轉(zhuǎn)化體。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生產(chǎn)(C)和乳酸生產(chǎn)(d)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖6.2 :(過量)表達多拷貝質(zhì)粒中的HXT7基因和LpLDH基因的CEN. I3K釀酒酵母 菌株乙醇和乳酸生產(chǎn)(實心符號)。在用葡萄糖5% (w/V)作為碳源的基本(YNB)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm)，對于對照(圓圈、虛線)，和HXT7 (三 角形、實線)轉(zhuǎn)化體。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生產(chǎn)(C)和乳酸生產(chǎn)(d)。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三個獨立克隆獨立測試至少兩次的平均值。圖7:在(過量)表達HXTl或HXT7基因的m850(釀酒酵母CEN.H(，pdc-，LpLDHa量表達)菌株中的乳酸生產(chǎn)。在250ml的四個帶擋板的搖瓶中于含有4.5g/l CaCO3、無氨基酸且無 (NH4)2SO4YNB、lg/l脲、5g/l乙醇、和以葡萄糖9% (w/V)作為碳源的基本培養(yǎng)基中實施生長動力學(xué)。a)將細胞的生長測定為光密度(0D 660nm,空心符號)，對于對照(圓圈、虛線)、 HXTl轉(zhuǎn)化體(正方形、實線)和HXT7轉(zhuǎn)化體(三角形、實線)。對于相應(yīng)的菌株，測定了葡萄糖消耗(b，空心符號)和乳酸生產(chǎn)(C，實心符號)。闡述實施方案的描述在一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備有機酸的方法，所述方法包括a.獲得具有增加的己糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的重組酵母；b.在包含己糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組酵母，從而形成有機酸，和c.分離有機酸。本發(fā)明因此涉及產(chǎn)生有機酸的方法，通過在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過量表達至 少一種與己糖攝取相關(guān)的基因的酵母菌株來產(chǎn)生有機酸?！霸诤线m的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌 株”的另一術(shù)語是“培養(yǎng)”酵母菌株。酵母可以在所選擇的條件下生長是指例如通過660nm 處的光密度測定的生物質(zhì)的量增加。在另一實施方案中，酵母菌株不在所選擇的條件下生 長是指生物質(zhì)不增加，但無論如何產(chǎn)生有機酸。己糖轉(zhuǎn)運活性的提高是指己糖跨過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運率提高。這可以通過過量表達至少 一種己糖轉(zhuǎn)運蛋白而實現(xiàn)。己糖轉(zhuǎn)運蛋白因此是能夠轉(zhuǎn)運己糖的蛋白質(zhì)。總己糖轉(zhuǎn)運蛋白 活性的增加能夠通過提高同源的己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達或通過導(dǎo)入同源的或異源的己 糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的更多拷貝而實現(xiàn)。己糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的提高也可以通過表達或過量表達 調(diào)節(jié)己糖轉(zhuǎn)運活性的基因來實現(xiàn)，優(yōu)選地所述基因刺激己糖轉(zhuǎn)運活性。應(yīng)當注意的是，提高 己糖轉(zhuǎn)運蛋白的能力而非提高其表達也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所生產(chǎn)的有機酸可以選自丙烯酸、乳酸、衣康酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、2，5-呋 喃二羧酸、3-羥基丙酸、天冬氨酸、檸檬酸、葡糖二酸、谷氨酸、丙二酸、丙酸、葡糖酸、曲酸、 香豆酸、抗壞血酸、己二酸、乙酰丙酸或任一其它所需要的有機酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，除了己糖轉(zhuǎn)運蛋白外，酵母菌株還過量表達 至少一種與生產(chǎn)有機酸相關(guān)的基因。例如，在一個實施方案中，酵母菌株表達己糖轉(zhuǎn)運蛋白 和異源的乳酸脫氫酶基因，以使得酵母細胞產(chǎn)生乳酸。酵母菌株可以包含有利于有機酸生 產(chǎn)的進一步的遺傳修飾。這些可以借助于基因重組技術(shù)或隨機誘變或本領(lǐng)域已知的其它技 術(shù)導(dǎo)入。例如，前述的用于生產(chǎn)乳酸的酵母菌株優(yōu)選地具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，甚至 更優(yōu)選的是敲除了任一丙酮酸脫羧酶活性。本發(fā)明中使用的用于生產(chǎn)有機酸的酵母菌株可以選自酵母的任一已知的屬和 種。酵母例如由 N. J.W.Kreger-van Rij, "The Yeasts, "Vol. 1 of Biology of Yeasts, Ch. 2，A. H. Rose 禾口 J. S. Harrison 編著，Academic Press, London, 1987 所述。在一個實 施方案中，酵母的屬可以是酵母屬(Saccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、 假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)Jii 巴利酵母屬(Debaromyces)、拿遜酵母屬(Nadsonia)、油脂酵母屬(Lipomyces)、球擬 酵母屬(Torulopsis)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、三角酵母屬(Trigonopsis)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、隱 求(Cryptococcus), ^.MM^M (Trichosporon) > ^Slgβ M (Aureobasidium) > 油脂酵母屬(Lipomyces)、法夫酵母屬(Phaffia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、耶氏酵母屬(Yarrowia)或許旺酵母屬(khwarmiomyces)等。優(yōu)選地，酵母選自酵母屬、接合酵 母屬或克魯維酵母屬。更優(yōu)選地，酵母是釀酒酵母、拜耳接合酵母(Z.bailii)或乳酸克 魯維酵母(K. lactis.)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，酵母是釀酒酵母菌株GRF18U、 W303IB、BY4742 (Eurc^carf 登錄號 Y10000)、CEN. PK 菌株 102-5B (MATa，ura3_52， his3-ll, leu2-3/112, TRP1, MAL2_8c， SUC2)禾口 113—1IC(MATa， ura3_52， his3_ll， TRP1, MAL2-8c, SUC2-Dr. P. Kotter, Institute of Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-University, Frankfurt, Germany)> CEN.PK RWB837(MATa pdcl::IoxP pdc5::IoxP pdc6: :loxP ura3-52) (van Maris 等人，2004)、CEN. PK RWB876 和 CEN. PK m850 (Liu 和 Lievense 2005)或者拜耳接合酵母ATCC 60483 ；或者乳酸克魯維酵母PM6-7A。酵母可以是單倍體或二倍體。在本發(fā)明的酵母菌株中欲過量表達的編碼己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的編碼區(qū)可以自任 意來源分離。在一個實施方案中，己糖轉(zhuǎn)運蛋白的編碼區(qū)分離自釀酒酵母。應(yīng)該指出的是， 如果編碼區(qū)編碼基本上同一于自生物體的細胞純化的相同蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列，則編碼區(qū) 是自該生物體“分離”的。優(yōu)選地，將編碼己糖轉(zhuǎn)運蛋白的編碼區(qū)以目的己糖轉(zhuǎn)運蛋白在酵母中產(chǎn)生并基本 上有功能的方式摻入酵母中。此種酵母在文中可以被稱為“功能性轉(zhuǎn)化的”。功能性己糖轉(zhuǎn)運蛋白有助于己糖的攝取。換句話說，己糖轉(zhuǎn)運蛋白刺激己糖跨質(zhì) 膜的轉(zhuǎn)運。一旦自生物體的核酸提取出(“分離了”)編碼區(qū)或通過化學(xué)手段合成了編碼區(qū)， 可以將其制備用于轉(zhuǎn)化入酵母并在酵母中表達。最小地，這涉及將編碼區(qū)插入載體和可操 作地連接至在該載體上存在的并在酵母中是有活性的啟動子?？梢允褂萌我惠d體(整合型 的、染色體的或游離型的)。可以使用在目的宿主中有活性的任一啟動子(同源的或異源的；組成型的、可誘 導(dǎo)的或阻抑型的)。此種插入可以涉及使用限制性核酸內(nèi)切酶來在可操作地連接至啟動子 是可能的所希望的位點處“打開”載體，然后將編碼區(qū)連接至所希望的位點。根據(jù)需要，在 插入載體前，可以制備編碼區(qū)用于目標生物體。這可以涉及改變在編碼區(qū)中使用的密碼子， 以更充分地匹配目標生物體的密碼子使用；改變編碼區(qū)中可能削弱編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄或翻譯或 者編碼區(qū)的mRNA轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性的序列；或者添加或去除編碼信號肽的部分(由編碼區(qū)編碼 的指導(dǎo)蛋白質(zhì)至特定的位置(例如細胞器、細胞膜或細胞器膜，或胞外分泌)的蛋白質(zhì)的區(qū) 域)，以及本領(lǐng)域已知的其它可能的制備等。不管編碼區(qū)是否被修飾，當編碼區(qū)插入載體，它可操作地連接至在酵母中有活性 的啟動子。啟動子如所知的那樣，是能夠指導(dǎo)鄰近的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的DNA序列。如已經(jīng)描述 的那樣，啟動子可以是組成型的、可誘導(dǎo)的或阻抑型的。組成型啟動子持續(xù)地指導(dǎo)鄰近的編 碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄?？烧T導(dǎo)的啟動子可以被添加至培養(yǎng)基的合適的誘導(dǎo)劑分子誘導(dǎo)，這取決于啟 動子的身份。阻抑型啟動子可以被添加至培養(yǎng)基的合適的阻抑劑分子阻抑，這取決于啟動 子的身份。在一個實施方案中，啟動子是組成型的。在一個進一步的實施方案中，組成型啟 動子是釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動子。包含可操作地連接至啟動子的編碼區(qū)的載體可以是質(zhì)粒、粘?；蚪湍溉斯と旧?體，以及本領(lǐng)域已知的其它適于在酵母中使用的載體等。除了可操作地連接至啟動子的編碼區(qū)外，載體可以還包含其它遺傳元件。例如，如果不期望將載體整合入酵母基因組，載體 可以包含復(fù)制起點，其允許載體傳遞至包含該載體(例如2 μ衍生的或ARS/CEN)的酵母的 子代細胞。如果期望將載體整合入酵母基因組，載體可以包含與酵母基因組中存在的序列 同源的序列，并且也可以包含促進整合的編碼區(qū)。為了確定哪些酵母細胞是經(jīng)轉(zhuǎn)化的，載體 可以包含選擇性標記或可篩選的標記，其賦予該酵母不同于未轉(zhuǎn)化的酵母的表型，例如它 在包含對未轉(zhuǎn)化的酵母致死的抗生素的培養(yǎng)基上存活或它代謝培養(yǎng)基的組分為未轉(zhuǎn)化的 酵母不代謝的產(chǎn)物，以及其它表型等。此外，載體可以包含其它遺傳元件，如限制性核酸內(nèi) 切酶位點和一般在載體中存在的其它元件。在其中編碼區(qū)可操作地連接至啟動子的載體制備后，可以用該載體轉(zhuǎn)化酵母 (即，可以將載體導(dǎo)入酵母群體的至少一個細胞)。酵母轉(zhuǎn)化的技術(shù)是已經(jīng)很好建立的，并 包括電穿孔、微射彈轟擊和LiAc/ssDNA/PEG法等。轉(zhuǎn)化的酵母細胞然后可以通過使用載體 上的可篩選的或選擇性標記檢測。應(yīng)注意的是，短語“轉(zhuǎn)化的酵母”具有與“重組酵母”實 質(zhì)上相同的含義。轉(zhuǎn)化的酵母可以是以轉(zhuǎn)化技術(shù)接受了載體的酵母或可以是此種酵母的后 代。如果己糖轉(zhuǎn)運蛋白是與宿主細胞同源的蛋白質(zhì)，即其是天然存在于宿主細胞中的 蛋白質(zhì)，宿主細胞中己糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達可以通過將天然的啟動子序列與在宿主細胞中有 功能的另一啟動子序列交換而調(diào)節(jié).該目的可以例如通過用包含靶基因的同源序列、適于宿主細胞的目的酵母啟動子 序列和選擇性標記的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細胞以允許定點重組而實現(xiàn)。應(yīng)發(fā)生定點重組 以可操作地連接(重組的)酵母啟動子序列和編碼己糖轉(zhuǎn)運蛋白的核苷酸序列。這導(dǎo)致己 糖轉(zhuǎn)運蛋白從(重組的)酵母啟動子序列而非天然的啟動子序列表達。所選擇的酵母啟動 子可以相對于天然的啟動子序列具有提高的啟動子活性，導(dǎo)致己糖轉(zhuǎn)運蛋白在宿主細胞中 的提高的表達。在已經(jīng)獲得重組酵母后，可以將酵母在培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？梢耘囵B(yǎng)酵母的培養(yǎng)基可 以是本領(lǐng)域已知的適用于該目的的任一培養(yǎng)基。培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的。在一 個實施方案中，可以在合適的容器中通過含水發(fā)酵實施培養(yǎng)。用于酵母發(fā)酵的一般容器的 例子包含搖瓶或生物反應(yīng)器。通過酵母的有機酸生產(chǎn)方法可以以恒化器、分批培養(yǎng)、或補料分批培養(yǎng)、或任一已 知的培養(yǎng)類型實施。在一個優(yōu)選的實施方案中，在低PH進行培養(yǎng)，以利于有機酸的純化。優(yōu)選地，培養(yǎng) 基的PH在培養(yǎng)開始或結(jié)束時或在這兩個時刻小于4，甚至更優(yōu)選地pH小于3，和甚至更優(yōu) 選地pH小于2. 5。培養(yǎng)基可以包含D-葡萄糖或其它糖類(糖)如己糖或戊糖。它還可以包含酵母 生長所需的任一其它組分。D-葡萄糖可以是但無需是酵母生長所需的組分，它可以僅是有 機酸生產(chǎn)的前體。優(yōu)選地，作為用于有機酸生產(chǎn)的前體的糖的濃度在培養(yǎng)開始時高并在結(jié) 束時低。優(yōu)選地，糖濃度在開始時大于70g/l，甚至更優(yōu)選地大于100g/l，甚至更優(yōu)選地大 于150g/l。優(yōu)選地，糖在培養(yǎng)期間完全地被消耗掉，從而在培養(yǎng)結(jié)束時優(yōu)選的濃度是小于 10g/l，優(yōu)選地小于5g/l，甚至更優(yōu)選地小于lg/1。培養(yǎng)基可以包含非D-葡萄糖的碳源，如蔗糖、果糖、乳糖、D-半乳糖或植物性物質(zhì)的水解產(chǎn)物等。在一個實施方案中，培養(yǎng)基也可以包含作為有機或無機分子的氮源。在一 個進一步的實施方案中，培養(yǎng)基也可以包含下列組分，如氨基酸；嘌呤；嘧啶；玉米漿；酵母 提取物；蛋白水解產(chǎn)物；水溶性維生素，如B族復(fù)合維生素；或無機鹽如氯化物、氫氯化物、 磷酸鹽，或Ca、Mg、Na、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Si的硫酸鹽，等等。也可以包括本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的在酵母培養(yǎng)或發(fā)酵中有用的其它組分。培養(yǎng)基可以是但無需是緩沖的。在發(fā)酵期間，D-葡萄糖通過許多步驟被酵母內(nèi)化并轉(zhuǎn)化成有機酸。所產(chǎn)生的有機 酸可以在酵母中收集或者可以通過分泌或者通過導(dǎo)致有機酸穿過質(zhì)膜轉(zhuǎn)運的其它途徑而 積聚在培養(yǎng)基中。基本培養(yǎng)基是本發(fā)明的用于有機酸生產(chǎn)的優(yōu)選培養(yǎng)基；特別優(yōu)選的培養(yǎng)基包含 D-葡萄糖和YNB。在培養(yǎng)進行了足夠長的時間來產(chǎn)生所需濃度的有機酸后，可以分離有機酸。在談 及有機酸時使用的“分離的”是指通過從酵母的或培養(yǎng)基的至少一種其它組分分離有機酸 而獲得的更大純度的狀態(tài)。優(yōu)選地，分離的有機酸是至少約90%純，更優(yōu)選地約95%純，甚 至更優(yōu)選地至少約99%純。在酵母從培養(yǎng)基分離后分離有機酸的第一步可以是通過化學(xué)或酶處理、用玻璃 珠處理、超聲處理、冷凍/熔化循環(huán)或其它已知的技術(shù)來裂解酵母?？梢詮慕湍噶呀馕锏?膜、蛋白質(zhì)和核酸級分通過合適的技術(shù)純化有機酸，如離心、過濾、微過濾、超濾、納膜過濾、 液-液提取、結(jié)晶、用核酸酶或蛋白酶的酶處理、或?qū)游龅?。分離積聚在培養(yǎng)基中的有機酸可以包括從培養(yǎng)基純化有機酸?？梢酝ㄟ^已知的技 術(shù)進行純化，如使用離子交換樹脂、活性碳、微過濾、超濾、納膜過濾、液-液提取、結(jié)晶、蒸 餾或?qū)游龅?。?yōu)選地酵母在培養(yǎng)步驟期間在培養(yǎng)基中積聚有機酸，優(yōu)選地有機酸的濃度是穩(wěn)定 的或允許增加。在本發(fā)明的一個實施方案中，在培養(yǎng)基中積聚大于10g/l有機酸。在一個更優(yōu)選 的實施方案中，積聚了大于30、50、70、90或110g/l有機酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，提高己糖轉(zhuǎn)運活性的基因選自己糖轉(zhuǎn)運蛋白 基因或編碼影響己糖轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)的基因。己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因優(yōu)選地分離自釀酒酵母。甚至更優(yōu)選地，欲在酵母中過量表達 的己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因選自 HXTl、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、 HXTl 1、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2。影響己糖轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)可以是調(diào)節(jié)子或葡萄糖傳感物或合適地表達己糖轉(zhuǎn)運蛋 白所需的基因。編碼影響己糖轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)的基因優(yōu)選地分離自釀酒酵母和甚至更優(yōu)選地 選自 SNF3、GSF2 和 RGT2。在本發(fā)明的另一實施方案中，己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因包含一個序列，所述序列與選自 SEQ ID NO 6或7的序列同一或相應(yīng)并具有選自SEQ ID NO 6或7的序列的功能特性，或包 含任一前述序列的功能等同變體。在本發(fā)明的另一實施方案中，除了第一己糖轉(zhuǎn)運蛋白之外，在酵母中還過量表達 第二己糖轉(zhuǎn)運蛋白。本發(fā)明提供了具有改進的有機酸生產(chǎn)率的重組酵母。為了構(gòu)建此種酵母，將至少一種DNA構(gòu)建體導(dǎo)入酵母，其中所述DNA構(gòu)建體包含編碼利于攝取己糖的蛋白質(zhì)的至少一 種基因，由此編碼利于攝取己糖的蛋白質(zhì)的基因功能性表達。優(yōu)選地，重組酵母包含至少一 種進一步的重組基因，所述進一步的重組基因編碼與目的有機酸生產(chǎn)有關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個實施方案是在培養(yǎng)基中積聚有機酸和過量表達至少一種己糖轉(zhuǎn)運 蛋白的酵母菌株。本發(fā)明的進一步的實施方案是通過重組酵母菌株來增加己糖攝取活性而改進有 機酸生產(chǎn)性的方法?；钚钥梢匀缜八鲈鰪姡貏e地通過過量表達一種或多種己糖轉(zhuǎn)運蛋 白。為了更好地解釋本發(fā)明，提供了下列定義?！疤寝D(zhuǎn)運蛋白”是指任一蛋白質(zhì)(如酶)，其能夠轉(zhuǎn)運糖如葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯 糖穿過質(zhì)膜。糖轉(zhuǎn)運蛋白可以是顯示該促進活性的12個跨膜結(jié)構(gòu)域超家族的成員。“己糖轉(zhuǎn)運蛋白，，是指任一蛋白質(zhì)(如酶)，其能夠轉(zhuǎn)運己糖如葡萄糖或果糖穿過 質(zhì)膜。己糖轉(zhuǎn)運蛋白可以是主要的易化超家族的成員。對于酵母中的釀酒酵母，目前已描 述了 20種己糖轉(zhuǎn)運蛋白和相關(guān)的蛋白質(zhì)，即HXTl至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2?！坝袡C酸”是具有酸性特性的有機化合物(即分子中含碳的一大類化學(xué)化合物的任 一成員)。最常見的有機酸是羧酸，其酸性與它們的羧基-COOH相關(guān)。通常地，與強的無機 酸相比較，有機酸是弱酸并且不完全解離。有機酸的例子是醋酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、抗 壞血酸、己二酸?！耙吧徒湍浮笔侵高@樣的酵母，當可遺傳的遺傳改變導(dǎo)入所述酵母基因組時，導(dǎo) 致產(chǎn)生突變酵母。重申的是，突變酵母菌株具有不同于其野生型菌株的基因型，因為在其基 因組已經(jīng)導(dǎo)入了在野生型酵母菌株的基因組中不存在的某些突變、缺失或插入。因此，野生 型酵母菌株缺乏突變酵母菌株的基因組中存在的改變。在一些情況下，突變酵母菌株可以 具有不同于野生型菌株的表型。突變酵母菌株可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，包括那些 涉及同源重組、定點誘變或隨機誘變的方法等。在某些情況下，突變酵母菌株可以通過涉及 自然選擇的方法恢復(fù)?！爸亟M酵母”是指這樣的酵母，其含有不天然存在于酵母中的核酸序列或含有內(nèi)源 核酸序列的一個額外拷貝或多個額外拷貝，其中通過人類的活動將所述核酸序列導(dǎo)入該酵 母或其祖先細胞。重組DNA技術(shù)是熟知的，如在Sambrook等人，Molecular Genetics =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,其提供了關(guān)于本令頁域已知的 多種技術(shù)的進一步的信息并在本文中討論。在該實施方案中，同源的和/或異源的基因的 編碼區(qū)分離自具有該基因的生物體。所述生物體可以是細菌、原核生物、真核生物、微生物、 真菌、植物或動物。包含編碼區(qū)的基因材料可以通過任一已知技術(shù)提取自生物體的細胞。此后，可以 通過任一合適的技術(shù)分離編碼區(qū)。在一個已知的技術(shù)中，編碼區(qū)通過首先制備基因組DNA 文庫或cDNA文庫，和其次在該基因組DNA文庫或cDNA文庫中如通過所選的與編碼區(qū)至少 部分同源的或認為與編碼區(qū)至少部分同源的經(jīng)標記核苷酸探針探測該文庫而鑒定編碼區(qū)， 確定編碼區(qū)的表達是否賦予包含該編碼區(qū)的文庫微生物可檢測的表型，或通過PCR擴增所 需的序列。也可以使用用來分離編碼區(qū)的其它已知技術(shù)。“碳源”是指有機化合物(例如，成分確定的碳源如葡萄糖等)或有機化合物的混合物(如酵母提取物)，其可以被微生物(如酵母)同化并用來制造新的細胞材料。有機化 合物的混合物可以是復(fù)合碳源，其中確切的組分和/或有機組分的量是未知的，或者是由 已知的有機化合物(如葡萄糖、果糖、麥芽糖等)以已知的量組成的成分確定的碳源。在某 些情況下，復(fù)合碳源也可作為復(fù)合氮源。復(fù)合碳源的例子包括淀粉、麥芽糖糊精、纖維素水 解產(chǎn)物和淀粉水解產(chǎn)物等，其已經(jīng)與酶組合以產(chǎn)生葡萄糖。成分確定的碳源優(yōu)選地是至少 約90Wt%純，更優(yōu)選地約95wt%純，和最優(yōu)選地約98wt%純。例如，如果葡萄糖是唯一碳 源，那么碳源將包含至少約90 %葡萄糖。如果葡萄糖和果糖是成分確定的碳源的組分，那么 至少約90%的碳源是葡萄糖和果糖。成分確定的碳源優(yōu)選地包含最小量的高級糖。“生物質(zhì)(biomass) ”是指從提供給細胞的營養(yǎng)物生物轉(zhuǎn)化而衍生的全部細胞內(nèi)容 物。“基本培養(yǎng)基”或“合成培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)微生物(如酵母)的培養(yǎng)基，其包含 氮源、鹽、痕量元素、維生素和碳源，它們都是定義的。碳源可以包含至少一種葡萄糖、蔗糖、 乳糖、麥芽糖、半乳糖或果糖等?；九囵B(yǎng)基包含非蛋白質(zhì)氮源。合成培養(yǎng)基不包含其組分 未定義的例如營養(yǎng)物源，如可以用在復(fù)合培養(yǎng)基中的玉米漿、酵母提取物或胨等?！霸谝后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)”是指在液體培養(yǎng)基中生長微生物和/或在液體培養(yǎng)基中微 生物產(chǎn)生的有機酸的持續(xù)積聚?！鞍l(fā)酵肉湯”是指當微生物(如酵母)在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時產(chǎn)生的肉湯。發(fā) 酵肉湯包含液體發(fā)酵培養(yǎng)基的任一未使用的組分和生物體發(fā)酵所得的任一代謝物或產(chǎn)物?！昂慊鳌笔侵冈试S連續(xù)培養(yǎng)微生物(如酵母)的設(shè)備，其中能夠獨立地控制特定 的生長率和細胞數(shù)。連續(xù)培養(yǎng)實質(zhì)上是恒容的流動系統(tǒng)，可以發(fā)生向其連續(xù)地添加培養(yǎng)基 和從其連續(xù)地取出任一溢流。一旦此種系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，則細胞數(shù)和營養(yǎng)物狀態(tài)保持恒 定，并且系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)。恒化器允許通過稀釋率和改變限制的營養(yǎng)物如碳源或氮源的濃度 控制群體密度和特定的生長率。本領(lǐng)域已知恒化器可以用于選擇微生物的突變體。當培養(yǎng)物在恒化器中生長時， 通過改變條件(如，降低接種菌株生長所必需的次級碳源的濃度等)，選擇群體中那些在改 變的條件下能夠生長得更快的微生物并舍棄在新的條件下不很好地發(fā)揮作用的微生物。通 常，此種選擇需要在恒化器培養(yǎng)的生長過程期間累進地增加或降低至少一種培養(yǎng)組分。“分批培養(yǎng)”是指微生物的密閉培養(yǎng)，其中生長是在一個固定體積的培養(yǎng)基中進 行，培養(yǎng)基由正在生長的生物體的作用而連續(xù)地改變直到它不再適于生長。在分批培養(yǎng)中， 除了在需氧培養(yǎng)中的分子氧外，微生物生長所需的所有營養(yǎng)物在開始培養(yǎng)前就存在于培養(yǎng) 基中。本領(lǐng)域已知分批培養(yǎng)(如搖瓶)中微生物的延長培養(yǎng)可以用來選擇在接種菌株不生 長或生長得差的條件下生長得相對較好的自發(fā)突變體?！把a料分批培養(yǎng)”是指隨著微生物的培養(yǎng)過程向培養(yǎng)容器或發(fā)酵桶中的培養(yǎng)基提 供一種或多種營養(yǎng)物的培養(yǎng)技術(shù)。與恒化器培養(yǎng)相反，在培養(yǎng)期間微生物被包含。在一些 情況下，將全部營養(yǎng)物逐漸地補料至發(fā)酵桶。時間條件、溫度條件、PH條件、需氧條件和某 些營養(yǎng)物補料至發(fā)酵桶的速率取決于所使用的具體菌株?！吧a(chǎn)性(productivity) ”是指從生產(chǎn)過程每單位時間衍生的產(chǎn)物的量。“選擇”是指將酵母置于利于具有一個特定基因型或多個特定基因型的細胞生長 的條件下。特定的基因型(通常是基因突變的結(jié)果)賦予所選擇的酵母在某些環(huán)境條件下的優(yōu)勢從而所選擇酵母的后代能夠生長和/或替代親本。術(shù)語“基因”是指編碼肽、多肽、蛋白質(zhì)或RNA分子的和在編碼序列側(cè)翼的參與調(diào) 節(jié)表達的染色體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、合成的DNA或其它DNA?！巴蛔儭笔侵负怂嵝蛄兄械娜我蛔兓蚋淖?。存在幾種類型的突變，包括點突變、移 碼突變和剪接突變。突變可以特異地或隨機地進行?！翱勺x框(0RF)”是指編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)的DNA或RNA的區(qū)域。術(shù)語“啟動子”或“啟動子區(qū)”是指DNA序列，其包括通過對RNA聚合酶和/或在 正確的位點起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子提供識別位點而控制產(chǎn)生信使RNA(mRNA)的元件?！百|(zhì)?！笔侵腑h(huán)狀的、染色體外的、自我復(fù)制的DNA部件。術(shù)語“基因組”包含染色體和在宿主細胞內(nèi)的質(zhì)粒這兩者?！拜d體”是小的DNA部件。載體像“分子運載體”那樣發(fā)揮作用，其攜帶目的DNA片 段進入宿主細胞?？梢詫⑼庠碊NA片段插入載體，它們可以含有或不含有目的調(diào)節(jié)序列和 編碼序列、能使得載體和插入其中的外源DNA片段復(fù)制的復(fù)制起點、允許選擇已攝入質(zhì)粒 DNA的細胞和其它特征的遺傳標志。載體可以是質(zhì)?；蚓€性DNA分子?！稗D(zhuǎn)錄”是指從DNA模板產(chǎn)生互補RNA的過程?！胺g，，是指從信使RNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)。術(shù)語“表達”是指轉(zhuǎn)錄基因以產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA和翻譯該mRNA以產(chǎn)生相應(yīng)的基因 產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白質(zhì)。
“過量表達”是指一個給定基因的表達水平大于野生型酵母中的表達水平。短語“功能性地連接”或“可操作地連接”是指啟動子或啟動子區(qū)與編碼序列或結(jié) 構(gòu)序列以編碼序列或結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄可以被啟動子或啟動子區(qū)指導(dǎo)的方向和距離連接?！爱愒碊NA”是指來自與接受細胞不同的來源的DNA。“同源DNA”是指來自與接受細胞相同的來源的DNA。實施例1 構(gòu)建(過量)表達HXTl或HXT7基因的釀酒酵母(GRF18U和CEN. PK)菌 株轉(zhuǎn)化體和對照菌株的細胞生長、葡萄糖消耗和乙醇生產(chǎn)。使用從GRF18U菌株提取的基因組DNA作為模板，PCR擴增釀酒酵母HXTl和HXT7基因。用于擴增的寡核苷酸如下5，HXTl (SEQ ID NO. 1)5' -AAA ATC ATG AAT TCA ACT CCC GAT CTA-3，Tm :58. 93，HXTl (SEQ ID NO. :2)5' -AGC TTG TTT AGT TTA TTT CCT GCTG AAA-3' Tm :59.35，HXT7 (SEQ ID NO. :3)5' -A AAA ATG TCA CAA GAC GCT GCT ATT GCA-3' Tm :62.43，HXT7 exit (SEQ ID NO. :4)5' -ATA TAT TAA AAA CGT ATT TAC TTT TCA AGT-3' Tm :54.23，HXT7 (SEQ ID NO. :5)5' -AGT GTC GAC AAA TAA TTT GGT GCT GAA CAT-3' Tm :61.0所有擴增使用下列程序
94。C5分鐘94°C15秒157.5°C30秒\ 30個循環(huán)Il0C1分鐘30秒JITQ7分鐘4°CS由于釀酒酵母HXT6和HXT7基因的編碼序列之間的高序列同源性，對后者以兩步 擴增。在第一步使用名為5，HXT7和3，HXT7exit的寡核苷酸，第二個寡核苷酸針對該基因 的外部區(qū)設(shè)計，其來自不同于HXT6基因相應(yīng)區(qū)域的區(qū)域。單一的擴增條帶隨后用作兩條寡 核苷酸5，HXT7和3，HXT7的模板，獲得了目的基因的唯一可讀框。將擴增片段分別亞克隆入大腸桿菌載體pSTBlue獲得了質(zhì)粒pSTBlueHXTl和 pSTBlueHXT7。將插入片段測序并得到了與保藏的釀酒酵母相應(yīng)的序列(HXT1，GeneID 856494，SEQ ID NO 6 ；禾口 HXT7, GeneID :851943, SEQ ID NO 7)相同的序列。這些編碼序列分別用于構(gòu)建整合型表達質(zhì)粒ρ022ΗΧΤ1和p022HXT7，使用了基礎(chǔ) 的釀酒酵母整合型表達質(zhì)粒pYX022(R&DSystems，Inc.，Wiesbaden, D)。對于質(zhì)粒ρ022ΗΧΤ1的構(gòu)建，將接受載體用EcoRI切割，鈍端化和去磷酸化，而插入 片段是從PSTBlueHXTl質(zhì)粒用Mlul/Rnll切下的片段。對于質(zhì)粒p022HXT7的構(gòu)建，將接受 載體和pSTBlueHXT7載體用EcoRI切割。DNA操作、大腸桿菌(NovabIue，Novagen)的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)使用下列標準方案 (Sambrook J. ^A Molecular Cloning :A Laboratory Manual，^!二片反，Cold Spring Harbor Laboratory, New York，1989)。如果沒有另外指出的話，其它分子生物學(xué)基本方案 也遵循該手冊實施。所有使用的限制性酶和修飾酶來自NEB(New England Biolabs,UK)或 來自 Roche Diagnostics。這兩種釀酒酵母菌株的轉(zhuǎn)化基本上按照LiAc/PEG/ss-DNA方案(Gietz. 2002)實 施。所獲得的整合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化受益于將它們在營養(yǎng)缺陷型標志HIS3中的線性化。將轉(zhuǎn) 化體置于選擇性基本培養(yǎng)基，并在30°C生長3-4天后獲得單菌落。為了檢查HXT過量表達的效果，將獨立的轉(zhuǎn)化體(用攜帶HXTl或HXT7基因 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體)和分別的對照在基本培養(yǎng)基(YNB，1. 34 % w/V YNB,來自Difco Laboratories, Detroit, MI#919-15,2% w/V葡萄糖，用尿嘧啶或者用尿嘧啶和亮氨酸補 充)中搖瓶培養(yǎng)。圖1和2分別在左邊顯示了在GRF18U和CEN. PK菌株的生長動力學(xué)期間 的細胞密度(0D 660nm)并且在右邊顯示了葡萄糖消耗和乙醇累積。葡萄糖消耗和乙醇累 積使用來自Megazyme的可商業(yè)獲得的酶試劑盒(目錄號分別為K_G LUHKL和Κ-ΕΤ0Η)按 照生產(chǎn)商的說明書來確定。在動力學(xué)期間，在所示的時間處(見圖1和2的“小時”)收集 樣品并確定所述參數(shù)。所進行的實驗清楚地顯示了在糖酵解啟動子控制下的己糖轉(zhuǎn)運蛋白的一個額外 拷貝的存在決定了糖的更快攝取(這一點能夠從圖Ib和2b空心符號所示的葡萄糖消耗曲線來說明)和更快且更高的乙醇生產(chǎn)(圖Ib和2b，實心符號)。引人注目地，所述的效果 在大于一種酵母背景中證實(圖1和2)。令人吃驚的是，如假設(shè)的那樣，盡管HXTl過量表 達達到了略微更高的效果，但更高的糖酵解流的效果似乎具有非常相似的獨立于過量表達 的己糖轉(zhuǎn)運蛋白的動力學(xué)。而且，非常有興趣強調(diào)的是，取決于酵母背景，更高的糖酵解流 的效果不同地分布于發(fā)酵產(chǎn)物或生物質(zhì)累積，如圖3所示，其中比較了兩種菌株。最后，值 得考慮的是，不僅乙醇生產(chǎn)和/或生物質(zhì)形成改善了，而且特異的生產(chǎn)性也改善了，換句話 說，需要達到更高的生產(chǎn)值的時間降低。實施例2 構(gòu)建表達來自植物乳桿菌(LactcAacillus ρlantarum)的異源LDH活 性和(過量)表達HXTl或ΗΧΤ7基因的釀酒酵母(GRF18U和CEN. PK)菌株轉(zhuǎn)化體和對照 菌株的細胞生長、葡萄糖消耗、乳酸和乙醇生產(chǎn)。已經(jīng)用ρ022ΗΧΤ1和ρ022ΗΧΤ7表達載體轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株(GRF18U和CEN. PK) 進一步用稱為YcplllbTLDH的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。通過將LDH基因插入基礎(chǔ)釀酒酵母著絲粒質(zhì)粒 Ycplaclll (LEU2標志物，ACX75457)中的拜耳接合酵母TPI啟動子控制下獲得所述質(zhì)粒。為 了獲得所述質(zhì)粒，將植物乳桿菌LDH基因事先PCR擴增并亞克隆入大腸桿菌載體pSTBlue， 得到 pSTplLDH 質(zhì)粒(Microb Cell Fact. 2006 年 1 月 30 日；5:4. Lactate production yield from engineered yeasts is dependent from the host background, the lactate dehydrogenase source and the lactate export. Branduardi P, Sauer M, De Gioia L, Zampella G, Valli M, Mattanovich D, Porro D.)。將大腸桿菌構(gòu)建體和基礎(chǔ)拜耳接合酵 母著絲粒表達質(zhì)粒pZ3bT (Branduardi等人，2004)用EcoRI切割，后者也被去磷酸化，以獲 得酵母表達載體pZ3bTLDH。來自所述質(zhì)粒的包含LDH編碼序列和酵母啟動子和終止子區(qū)的 表達盒用BamHI平端化/NaeI切割并插入Ycplaclll接受質(zhì)粒，用SmaI打開和去磷酸化， 得到Y(jié)cp 11 IbTLDH著絲粒表達質(zhì)粒，然后將其用于轉(zhuǎn)化上述酵母菌株。對于每一背景，對照 菌株是用單一的LDH基因和用于HXT (過量)表達的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的相應(yīng)的酵母菌株。兩種釀酒酵母菌株的轉(zhuǎn)化基本按照LiAc/PEG/ss-DNA方案(Technical Tips Online, http://tto. trends, com)實施。將轉(zhuǎn)化體置于選擇性基本培養(yǎng)基，并在30°C生長 3-4天后獲得單菌落。獨立的轉(zhuǎn)化體在基本培養(yǎng)基(YNB，1. w/V YNB，來自Difco Laboratories, Detroit，MI#919-15，5% w/V葡萄糖，圖4. 1-4. 2和5. 1-5. 2)中搖瓶培養(yǎng)。在兩種菌株中， LDH表達決定了轉(zhuǎn)化酵母將發(fā)酵丙酮酸為乙醇和乳酸共表達HXT基因決定了發(fā)酵產(chǎn)物累 積上的改進。在下圖中報告的實驗指共表達植物乳桿菌LDH和釀酒酵母HXTl或HXT7基因。 圖4和圖顯示不同克隆和構(gòu)建體達到的細胞密度(0D 660nm)，其中圖4和圖5b、c和d 分別顯示生長動力學(xué)期間葡萄糖消耗以及乙醇和乳酸生產(chǎn)(在所示的時間處收集樣品，見 圖中的“小時”)。葡萄糖消耗以及乙醇和乳酸生產(chǎn)使用來自Megazyme的可商業(yè)獲得的酶 試劑盒(目錄號分別為K-GLUHKL，K-ETOH和K-LATE)按照生產(chǎn)商的說明書確定。引人注目 地，也在這些實驗中增加的葡萄糖消耗流導(dǎo)致更快和更高地生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，在這種情況下， 天然產(chǎn)生的乙醇和所產(chǎn)生的乳酸受益于細菌LDH的異源產(chǎn)生。重要地是注意兩個途徑似乎 是競爭的，從而改變發(fā)酵方向的葡萄糖級分在乳酸和乙醇之間分步。實施例3 構(gòu)建表達來自植物乳桿菌的異源LDH活性和(過量)表達HXTl或HXT7 基因的釀酒酵母(CEN.PK)菌株；轉(zhuǎn)化體和對照菌株的細胞生長、葡萄糖消耗、乳酸和乙醇生產(chǎn)。在這個實施例中，將用多拷貝植物乳桿菌LDH轉(zhuǎn)化的CEN. PK菌株的乳酸和乙醇生 產(chǎn)與用HXTl或HXT7基因的一個額外的拷貝獲得的生產(chǎn)相比較。將細菌乳酸脫氫酶用EcoRI從前面提及的pSTpILDH中切下和插入類似切割 和去磷酸化的質(zhì)粒P^(212(基礎(chǔ)的釀酒酵母多拷貝表達質(zhì)粒p^(212，LEU2標志物，R&D Systems, Inc. , Wiesbaden, D)中，得到表達質(zhì)粒p2121pLDH。將源自酵母轉(zhuǎn)化的獨立轉(zhuǎn)化體 在基本培養(yǎng)基(YNB, 1. 34% w/V YNB，來自 Difco Laboratories, Detroit, MI#919-15,5% w/V葡萄糖)中搖瓶培養(yǎng)。圖6. 1和6. 2在左邊顯示在CEN. Hi轉(zhuǎn)化的菌株的生長動力學(xué)期間的細胞密度(0D 660nm)和葡萄糖消耗，在右邊顯示乙醇和乳酸累積。葡萄糖消耗以及乙醇和乳酸累積使用 來自Megazyme (目錄號分別為K-GLUHKL，K-ETOH和K-LATE)的可商業(yè)獲得的酶試劑盒，按 照生產(chǎn)商的說明書確定。在動力學(xué)期間，在所示的時間處(見圖6. 1和6. 2的“小時”)收集 樣品并確定所述參數(shù)。引人注目地，在表達一個額外的HXTl拷貝時乙醇和乳酸生產(chǎn)改善， 而在表達一個額外的HXT7拷貝時乳酸生產(chǎn)的提高對應(yīng)于乙醇生產(chǎn)的平行降低。而且，該最 后一個實施例是再一次明顯的生產(chǎn)性提高，因為達到乳酸生產(chǎn)的最高值早于對照菌株。最 后，關(guān)于使用著絲粒質(zhì)粒中表達的LDH進行的實驗，能夠注意到多拷貝質(zhì)粒表達的LDH的效 果顯著地更高效。實施例4:在(過量)表達HXTl或HXT7基因的m850(釀酒酵母CEN·PK，pdc-， LpLDH)菌株中的乳酸生產(chǎn)。轉(zhuǎn)化具有完全損壞的丙酮酸脫羧酶活性和攜帶在多拷貝酵母表達質(zhì)粒中的植物 乳桿菌LDH的光養(yǎng)CEN. 1 m850菌株，以表達HXTl或HXT7基因的一個額外的拷貝。為了獲 得所述轉(zhuǎn)化體，構(gòu)建了攜帶僅用作目標基因的營養(yǎng)缺陷型標志物和用于有效選擇轉(zhuǎn)化體的 顯性標志物的酵母整合型質(zhì)粒。該質(zhì)粒的骨架是基礎(chǔ)的釀酒酵母整合型表達質(zhì)粒P^(022， HIS3標志物(R&D Systems, Inc.，Wiesbaden, D)。所述質(zhì)粒用KpnI切割，鈍端化和去磷酸 化，并與衍生自質(zhì)粒pFA6KanMX4 (Wach等人，1994) Sphl/Mcl鈍端化的KanR盒連接，得到質(zhì) 粒p022KMX4。將所述質(zhì)粒EcoRI切割和去磷酸化或EcoRI切割、鈍端化和去磷酸化，并分別 與HXTl和HXT7序列連接，如實施例1中所述制備。將所得的質(zhì)粒分別稱為P022KMX4-1和 p022KMX4-7o然后將m850菌株用這兩種質(zhì)粒以及用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。然后測試獨立的轉(zhuǎn)化體的葡 萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)(m850菌株不能產(chǎn)生乙醇，因為損壞了所有的pdc活性，并且由于同樣 的原因，它們不能以葡萄糖作為碳源存活，但是它們可以在非發(fā)酵碳源如乙醇和甘油上存 活，其中所述非發(fā)酵碳源確實用于該菌株操作的所有時期)，如圖7所示。轉(zhuǎn)化體如下生長它們在含有1. 7g/l無氨基酸的酵母氮基(YNB)、10g/l乙醇和 10g/l甘油的瓊脂板上繁殖。使用兩種不同的液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)菌株預(yù)接種培養(yǎng)基，含 有 0. 31g/l CaCO3,1. 7g/l 無氨基酸和無(NH4)2SO4 的 YNB, 1. 5g/l 脲，10g/l 乙醇，和 0. 5g/ 1葡萄糖；以及發(fā)酵培養(yǎng)基，含有4. 5g/l CaCO3,1. 7g/l無氨基酸和無(NH4)2SO4的YNB，Ig/ 1脲，5g/l乙醇，和90g/l葡萄糖，如所述。于在250ml的四個帶擋板的搖瓶中進行分 批培養(yǎng)。從在瓊脂板上生長的新鮮培養(yǎng)物中收獲細胞，并以600nm(0D600)0. 3的光密度來 接種IOOml預(yù)接種培養(yǎng)基。24小時后收獲這些細胞并以600nm(0D600) 3. O的光密度來接種IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基。監(jiān)測分批培養(yǎng)約70小時。在所示的時間處收集樣品并測定OD 660nm(圖7a)，同時測試上清中的葡萄糖消 耗(圖7b)和乳酸生產(chǎn)(圖7c)。引人注目地，己糖轉(zhuǎn)運蛋白過量表達的效果導(dǎo)致更快的葡萄糖消耗(至少對于過 量表達一個額外HXTl基因拷貝的菌株)和隨后發(fā)生的更快的該菌株中可能的唯一發(fā)酵產(chǎn) 物乳酸的生產(chǎn)，導(dǎo)致提高的生產(chǎn)性。該實驗揭示了將之前在實驗菌株中顯示的應(yīng)用于已對 工業(yè)生產(chǎn)研發(fā)和優(yōu)化的菌株中的可能性。參考文獻Branduardi P, Valli M, Brambilla L, Sauer M, Alberghina L, Porro D. (2004) 酵母拜耳接合酵母用于異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)、分泌和用于代謝工程應(yīng)用的新宿主(The yeast Zygosaccharomyces bailii :a new host for heterologous protein production, secretion and for metabolic engineering applications)，F(xiàn)EMS Yeast Res. 4, 493-504。Gietz，R. D.和 R. A. Woods. (2002)通過 liac/ss 運載體 dna/peg 方法轉(zhuǎn)化酵母 (Transformation of yeast by the liac/ss carrier dna/peg method)， Methods in Enzymology 350 :87_96。PereziM. ,LuyteniK.，Michel，R.，Riou，C. ,BlondiniB. (2005)在酒發(fā)酵期間分析 釀酒酵母己糖載體表達低和高親和性Hxt轉(zhuǎn)運蛋白均表達(Analysis of Saccharomyces cerevisiae hexose carrier expression during wine fermentation :both low—and high-affinity Hxt transporters are expressed)，F(xiàn)EMS Yeast Research 5，351_3610Guillaume C，Delobel P, Sablayrolles JM，Blondin B. Q007)通過酒酵母釀 酒酵母的果糖利用的分子基礎(chǔ)突變的HXT3等位基因增強果糖發(fā)酵(Molecular basis of fructose utilization by the wine yeast Saccharomyces cerevisiae :a mutated HXT3allele enhances fructose fermentation)，Appl Environ Microbiol. 73，2432-9。Gutierrez-Lome1 M, Torres-Guzman JC, Gonzalez-Hernandez GA, Cira-Chavez LA, Pelayo-Ortiz C，Ramirez-Cordova Jde J.. (2008)，在酵母釀酒酵母中過量表達 ADHl 和HXTl基因改善蒸溜酒研究期間的發(fā)酵功效(Overexpression of ADHl and HXTl genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae improves the fermentative efficiency during tequila elaboration)，Antonie Van Leeuwenhoe k.93，363_710Wach A，Brachat A，Pohlmann R 和 Philippsen P (1994)，在釀酒酵母中的用于經(jīng) 典的或基于PCR的基因破壞的新異源組件(New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptiohs in Saccharomyces cerevisiae)，Yeast 10，1793_1808o
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)有機酸的方法，所述方法包括a)培養(yǎng)酵母菌株，所述酵母菌株i)過量表達至少一種糖轉(zhuǎn)運蛋白，和 )在培養(yǎng)基中積聚有機酸，以及b)純化有機酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法包括a.獲得具有增加的糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的重組酵母；b.在包含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組酵母，從而形成有機酸，和c.分離有機酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述糖轉(zhuǎn)運蛋白活性是己糖轉(zhuǎn)運蛋白活性，且所述 糖是己糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中重組酵母過量表達至少一種己糖轉(zhuǎn)運蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所產(chǎn)生的有機酸選自乳酸、衣康酸、琥 珀酸、檸檬酸、馬來酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中酵母菌株過量表達至少一種涉及有機 酸生產(chǎn)的進一步的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中酵母菌株是酵母屬(Saccharomyces)、 接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、或克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)的菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因選自HXT1、HXT2、 HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、 HXT17、GAL2、SNF3、和 RGT2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中積聚了大于10g/l有機酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中用于己糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因分離自釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0
11.酵母菌株，其在培養(yǎng)基中積聚有機酸和過量表達至少一種糖轉(zhuǎn)運蛋白，優(yōu)選地己糖 轉(zhuǎn)運蛋白。
12.改善有機酸生產(chǎn)性的方法，所述方法由重組酵母菌株通過提高糖攝取活性，優(yōu)選地 己糖轉(zhuǎn)運活性而實施。
13.改善生物質(zhì)生產(chǎn)的方法，所述方法通過提高糖攝取活性，優(yōu)選地己糖轉(zhuǎn)運活性而實施。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中己糖攝取活性的提高通過過量表達己糖轉(zhuǎn)運蛋白而 引起。
全文摘要
本發(fā)明涉及用過量表達至少一種糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母生產(chǎn)有機酸。酵母可以表達與目的有機酸生產(chǎn)相關(guān)的進一步的基因。有機酸通過在充分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過量表達糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母而產(chǎn)生、從而在培養(yǎng)基中積聚目的有機酸和隨后通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)純化至目的程度。
文檔編號C12P7/56GK102046775SQ200980119260
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者D·波羅, M·紹爾, P·布蘭多爾迪 申請人:米蘭-比科卡大學(xué)