專利名稱：木糖還原酶的改造和木糖醇脫氫酶與木酮糖激酶的過表達促進耐熱酵母菌多形漢遜酵母 ...的制作方法
技術領域：
本申請涉及通過發(fā)酵進行纖維素乙醇生產的領域，具體涉及包括木糖的來源的發(fā) 酵，更具體涉及用于通過木糖發(fā)酵進行乙醇生產的重組多形漢遜酵母(H. polymorpha)菌 株，且還更具體涉及過表達具有改變的NADPH親和力的突變多形漢遜酵母木糖還原酶、以 及內生的或重組的木糖脫氫酶和木酮糖激酶的多形漢遜酵母菌株，所述菌株通過在包含木 糖的培養(yǎng)基上發(fā)酵獲得提高的乙醇生產量。背景從木質纖維素生產乙醇是化石燃料的環(huán)境友好型的可選方案。由于大部分的木質 纖維素材料由木糖組成，有必要將木糖有效地發(fā)酵成乙醇使得工藝具有成本效益[1]。一些酵母菌、絲狀真菌和細菌能夠將木糖轉化成乙醇。首先，酵母菌和大部分其他 真菌使用優(yōu)先將NADPH作為輔酶的木糖還原酶EC 1. 1. 1. 21 (XR)將木糖還原成木糖醇。然 后，其用嚴格依賴NAD的木糖醇脫氫酶EC 1. 1. 1.9 (XDH)將木糖醇氧化成木酮糖[2]。輔 因子特異性的區(qū)別導致氧化還原失衡，該氧化還原失衡導致乙醇生產量減少和木糖醇堆積 [3，4，5，6，7，8]。已通過代謝改造減少木糖醇生產量，該代謝改造旨在優(yōu)化)(R和)(DH的表 達水平[9，10，11，12] JfXR的輔因子特異性從NADPH改變?yōu)镹ADH[13，13a]，或修飾宿主細 胞的氧化還原代謝[14，15，16]。在木糖發(fā)酵期間避開氧化還原失衡所使用的其他方法是基 于真菌或細菌木糖異構酶EC5. 3. 1.5 (XI)的表達，該木糖異構酶將木糖直接轉化成木酮糖 且不需要氧化還原輔因子[17，18]。木酮糖激酶EC 2.7. 1. 17 (XK)(木糖代謝中的第三酶)的另外的過表達已顯示提 高在攜帶XR-XDH-及XI的菌株中的需氧和厭氧木糖利用[12，19]，該木酮糖激酶將木酮糖 轉化成木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸進入戊糖磷酸途徑，且然后進入中間代謝。需要XK 的過表達以克服該酶天然低的表達水平[3，5]。過表達導致木糖更有效地轉化成乙醇[5，20] ο耐熱甲基營養(yǎng)酵母菌多形漢遜酵母能夠在提高的溫度下(45°C -48°C )進行乙 醇發(fā)酵[21，22，23]。多形漢遜酵母的這個性質使其成為用于有效的同時糖化和發(fā)酵過程 (SSF)中的有力候選者。SSF結合木質纖維素物質的酶水解與隨后在同一容器中釋放的糖 的發(fā)酵。開發(fā)使用多形漢遜酵母從纖維素物質中進行乙醇生產的實用性的主要優(yōu)勢是該 酵母菌具有(i)良好地開發(fā)的分子遺傳學方法和(ii)模型菌株CBS4732的整個基因組序 列的可用性[24，25]。3
概述本公開內容描述了重組多形漢遜酵母菌株的構建，該重組多形漢遜酵母菌株過表 達修飾的)(R(K341R N343D)和在Δ xyll背景上的天然)(DH和XK。示出了菌株的木糖消耗、 乙醇和木糖醇生產量與過表達天然XR、XDH和XK的菌株的木糖消耗、乙醇和木糖醇生產量 的對比，用于對比以證實當多形漢遜酵母菌株在包含木糖的培養(yǎng)基上生長時，改變的XR 酶的過表達提高乙醇產量。本文還公開了相關的重組核酸、突變酶和使用其在木糖上進行 乙醇發(fā)酵的方法。附圖描述

圖1，本公開內容使用的質粒的線性設計ρΧ1Μ-Ζ、ρΧ1Ν-Ζ、ρΧ1Μ-Ζ-Χ2、ρΧ1Ν-Ζ-Χ2 和 pGLG61/HpXYL3。表達盒 prGAP-XYLl-trAOX、prGAP-XYL2-trXYL2 和 prGAP_XYL3_trA0X 分別用白框、灰框和加點框示出。修飾型XYLl ORF用黑框示出。Zeocin抗性基因(Zeor) 和遺傳霉素抗性基因(APH)用陰影線指出，其被連接到編碼甘油醛磷酸脫氫酶(GAP)的受 損的組成型基因啟動子。作為自主復制序列的多形漢遜酵母LEU2基因和端粒區(qū)(TEL 188) [29]用交叉陰影線示出。復制起點ORI和氨芐青霉素抗性基因(bla)_以箭頭示出。限制 位點:P, PstI ；H, HindIII ；S, SacI ；Si, SalI ；B, BamHI ；Sell, SacII ；Xb, XbaI ；RI, EcoRI ； NdI，NdeI ；N, NotI。圖2，來自利用木糖的多個酵母菌的)(R輔因子結合位點序列與多形漢遜酵母XYLl 序列的比對。保守序列用粗體示出。加下劃線的氨基酸被改變(K —R和N —D)。圖3，在 48°C下通過 CBS4732 (A) ,XRn/XDH/XK (B)和 XRm/)(DH/XK (C)的木糖發(fā)酵的 對比。符號乙醇(■)、木糖醇(·)、生物質(▲)和木糖( )。圖4，表1示出了本公開內容中使用的菌株和質粒。圖5，表2示出了對比于對照菌株的本文描述的多形漢遜酵母轉化體的XR、)(DH、XK 活性、以及乙醇和木糖醇生產率。圖 6，表 3 示出了在 48°C 下通過 2Et-/2xPDCl 和 2Et_/2xPDCl/XRm/XDH 進行的木 糖發(fā)酵的對比。圖7，圖7A示出了編碼木糖還原酶的克隆的多形漢遜酵母xy 11基因的DNA序列， 起始密碼子和終止密碼子突出顯示。圖7B示出了克隆的多形漢遜酵母木糖還原酶蛋白質 的蛋白質序列，突變發(fā)生前的NADPH結合位點突出顯示。方法、菌株和結果詳述菌株和培養(yǎng)基于37°C下，在YPD(0.5%酵母提取物、蛋白胨、2%葡萄糖)或基本培養(yǎng) 基(無氨基酸的0.67% YNB、4%木糖或2%葡萄糖)上培養(yǎng)酵母菌株多形漢遜酵母 CBS4732 (leu2-2) [26]、Δ xyl 1 [22]和轉化體(表 1)。對于 CBS4732 菌株，將亮氨酸 GOmg L—1)補充到培養(yǎng)基中。為了在YPD上選擇酵母菌轉化體，加入130mg L^1-ISOmg L—1的zeocin 或 0. 5mg Γ-0. 6mg Γ1 的 G418。大腸桿菌 DH5a 菌株AM15、recAl、endAl、gyrA96、thi_l、hsdR17 mk+)、supE44、relAl、deoR、Δ (lacZYA-argF)U169)被用作質粒增殖的宿主。如前所述，于 37°C下，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株DH5ci [27]。轉化的大腸桿菌細胞被保持在包含IOOmg L—1的氨芐青霉素的培養(yǎng)基上。
分子牛物學技術應用了標準的克隆技術[27]。使用Wizard 基因組DNA純化試劑盒(!Iomega， Madison,WI,USA)將多形漢遜酵母的基因組DNA分離。根據(jù)制造商說明書使用限制性核酸 內切酶和 DNA 連接酶(Fermentas，Vilnius, Lithuania)。用 Wizard 和 SV 小量制備 DNA 純化系統(tǒng)(ftOmega，Madison, WI, USA)進行從大腸桿菌分離質粒。根據(jù)制造商說明書，用 高保真Platinum iTaq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)進行所關注的片段的 PCR-擴增。在GeneAmp PCR 系統(tǒng) 9700 熱循環(huán)儀(AppliedBiosystemsJoster City, CA,USA)中進行PCR。如前所述，進行通過電穿孔的酵母菌多形漢遜酵母的轉化[28]。質粒構津分別攜帶天然)(R和修飾型)(R的重組質粒pXIN-Z和pXIM-Z基于質粒 pUC57 (Fermentas, Vilnius, Lithuania)被構建。來自質粒pK08_GAPpr [22]具有HpGAP 啟動 子和HpAOX終止子的BamHIAacI片段被克隆到具有預先消除的限制位點NdeI和HindIII 的BamHI/&icI消化的質粒pUC57中。在制得的質粒中，位于HpGAP啟動子和HpAOX終止子 之間的限制位點NdeI和NotI被去除且產生唯一的HindIII位點。使用引物對HpXlfor (CCC AAG CTT ATG CAC ACG CAG ATT AGC AM MT CTTG)和 HpXlrev (CGC AAG CTT TTA GAT AAA GGT TGG AAT TTC GTTCCA GGT CC)從 CBS4732 的基因組 DNA 中將 XYLl 的 ORF 進行 PCR-擴 增，且將其克隆到HindiII位點中，以產生表達盒prGAP-XYLl-trAOX(所有的引物中的限 制位點都加下劃線)。通過重疊PCR進行)(R基因的修飾。引物對HpXlMfor (CAT CTT GGT CAT TCC AAG GTC CGA CCA AAAGGA GAG ACT G)禾口 HpXlMrev (CAG TCT CTC CTT TTGGTC GGA CCT TGG AAT GAC CAA GAT G)被用來產生制得的修飾XR中的K341 — R和N343 — D 取代(突變的不匹配堿基用黑體示出)。引物HpXlfor和HpXlrev被用于修飾型)(R基因的 克隆，如上關于天然基因所描述的。使用引物對Ko58(CGG GGT ACC TG CAG ATA ACT TCG TAT AGC ATAC)和 Ko59 (CGG GGT ACC TG CAG TAA TTC GCT TCG GAT AAC)將給予 zeocin 抗性的酵母菌選擇性標志物從質粒ρΡ αΒ (Invitrogen)中進行PCR-擴增，且將其克隆到 PstI線性化載體中而產生pXIN-Z或pXIM-Z (圖1)。使用相應的引物對Ll (CTC GGA TCC CAA TTA TCA TTA ATA ATC) /Ko 135 (CAG CAG AAG GAT TGT TCA TTT TGT TTC TAT ATT ATC)禾口 Ko134(GAT AAT ATA GAA ACA AAA TGA ACA ATC CTT CTG CTG) /Ko 133 (ACA GGA TCC ATC CAT GAG AAA CG)，將具有自身終止子和 HpGAP啟動子的多形漢遜酵母XYL2基因從CBS4732的基因組DNA中擴增。引物Ll和Kol33 被用于通過重疊PCR獲得含有用HpGAP啟動子驅動的具有自身終止子的XYL2基因的片段。 此片段被克隆到BamHI線性化質粒pXIN-ZipXIM-Z中，分別得到重組構建體ρΧ1Ν_Ζ_Χ2和 PX1M-Z-X2 (圖 1)。包含prGAP-XYL3-trA0X的表達盒被作為SacII限制片段從質粒pK08/GAP/HpXYL3 中獲得[23]，且被克隆到SacII線性化質粒pGLG61中[29]。制得的質粒被指定為pGLG61/ HpXYL3(圖1)。構建的質粒的準確性通過序列測定來證實。構建的質粒在表1中示出。生物化學方法在37°C下分光光度測定細胞提取物中的)(R活性。XR分析混合物包含=Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 0) lOOmM.NADPH 0. 15mM和木糖350mM。反應始于細胞提取物的加入[3]。為了 評價關于NADPH或NADH的KM，在四種不同的輔因子濃度20 μ M、50 μ M、100 μ M和150 μ M (每種重復三次)下測量)(R活性。
在37 °C下分光光度測定細胞提取物中的)(DH活性。)(DH分析混合物包含Tri s_HCl 緩沖液(pH 8. 8) IOOmM, MgCl2 1 OmM、NAD 3mM和木糖醇300mM。反應始于細胞提取物的加 入[幻。如前所述[30]，且具有一些修改，在37°C下分光光度測定細胞提取物中的XK活 性。XK分析混合物包含Tris-HCl緩沖液(pH 7. 8)50mM、MgCl2 5mM、NADH 0. 2mM、磷酸烯醇 丙酮酸 ImM、D-木酮糖 8. 5mM、乳酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 27) (Fluka, St. Louis, MO, USA) 10U、 丙酮酸激酶(EC 2. 7. 1. 40) (Fluka，St. Louis，M0，USA) 0. 05U 和 ATP 2mM。反應始于細胞提 取物的加入。對于XK分析，另一個沒有丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的空白被用來使多形漢遜 酵母中的)(DH活性的干擾最小化。所有的分析實驗重復至少兩次。分析轉化體細胞在富YPX培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、4%木糖)中生長2天， 且被接種到具有12%木糖的YNB培養(yǎng)基中。在48°C的溫度下于有限的通風(140轉XmirT1) 中進行發(fā)酵。使用基于乙醇氧化酶/過氧化物酶的酶試劑盒“Alcotest”測定培養(yǎng)基中的乙 醇濃度[31]。如前所述(Enzymatic determination of D—sorbitol and xylitol(D_ 山梨 糖醇和木糖醇的酶法測定)，R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany)，且具有稍微的修改， 酶法測定培養(yǎng)基中的木糖醇濃度。硝基四唑藍(Nitrotetrazolium Blue) (NTB) 12mM和吩 嗪硫酸甲酯15mM被用來分別代替碘硝基四唑氯化物和心肌黃酶。在570nm測量被還原的 NTB的吸光率。通過如前所述的化學方法分析來自礦物培養(yǎng)基中的發(fā)酵的木糖濃度[32]。實驗進行至少兩次。MMXR的改造為了促進木糖的乙醇發(fā)酵和減少木糖醇形成，多形漢遜酵母的)(R已經(jīng)受位點特 異性誘變，以降低其對NADPH的親和力。多形漢遜酵母)(R的輔因子結合位點的氨基酸序列 (序列ID號1)顯示與其他利用木糖的酵母菌的相應位點的嚴格同源性(圖幻。在本工 作中，發(fā)明人分別用精氨酸和天冬氨酸代替在氨基酸位置341和343的賴氨酸和天冬酰胺， 以獲得具有序列ID號2的輔因子結合位點的突變的多形漢遜酵母)(R蛋白質。這些代替 類似于那些用于細假絲酵母(Candida tenuis)中的)(R輔因子特異性的成功修飾而進行的 取代[33]。菌株構建
為了產生具有過表達的天然)(R或修飾型)(R的菌株，或為了產生具有同時過表達 的天然狀或修飾狀與》)H的菌株，將多形漢遜酵母Axyll [22]菌株分別用McI線性化質 粒pXIN-Z和pXIM-Z或ρΧ1Ν-Ζ-Χ2和ρΧ1Μ_Ζ_Χ2轉化。轉化體在補充zeocin的YPD培養(yǎng) 基上生長。通過使用相應的引物的PCR考查轉化體中表達盒的存在。為了表達XK，重組質 粒pGLG61/HpXYL3被轉化入過表達天然或修飾型)(R和)(DH的受體菌株多形漢遜酵母。在 增加濃度的G418的存在下，轉化體在YPD培養(yǎng)基上生長。允許轉化體生長的G418的最大 濃度是0. ^gXmr10能夠在選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落在用高達20轉化體Xmg-1DNA的 頻率孵育三天之后出現(xiàn)。通過在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-12代，然后轉移到具有G418的6選擇性培養(yǎng)基來使轉化體穩(wěn)定。通過PCR證明穩(wěn)定的轉化體的基因組DNA中由HpGAP啟動 子驅動的重組XYL3基因的存在。由于基于pGLG61的質粒啟動多個整合進入受體菌株的基 因組[四]，通過Southern雜交來考查構建的菌株，以選擇具有相同量的XK表達盒的重組菌 株。選擇負載3拷貝XK表達盒的菌株(數(shù)據(jù)未示出)。構建的酵母菌菌株在表1中示出。構津的菌株的牛物化學分析研究了構建的重組菌株的一種中的)(R(指定為XRm)生物化學性質。測量了 )(R(具 有輔因子NADPH和NADH兩者)JDH和XK的比活性以及天然)(R(XRn)和改造的XRm的親和 力(表2)。XRm特征在于使用木糖作為底物的NADPH的Km為152 μ Μ，這比天然)(R的NADPH 的ΚΜ(9μΜ)高17倍。對于NADH來說，改造的XRm的Km保持幾乎不變(112μΜ)。在XRm菌 株中具有NADPH的)(R的比活性與過表達天然)(R的菌株相比降低了 4. 8倍。在兩種菌株中 具有NADH的)(R的比活性保持不變。具有另外過表達的)(DH的菌株XfoiADH和XRmADH與 野生型菌株相比具有增加兩倍的》)H比活性。與CBS4732相比，菌株Xfoi/)(DH/XK和XRm/ XDH/XK中的XK過表達導致增加高達2. 4倍的XK比活性(表2)。木糖發(fā)酵對比在有限的通風下通過構建的菌株分批培養(yǎng)的木糖發(fā)酵。使用了包含木糖 (12% )和初始濃度2g(干重)XL—1生物質的礦物培養(yǎng)基。通過構建的菌株得到的乙醇和 木糖醇的生產量的結果在表2中示出。XRm菌株的乙醇生產率是9. 8mgX (LXh)―1，該生產 率比Xfoi和野生型菌株CBS4732的生產率分別高1. 5倍和1. 3倍。這些菌株的木糖醇生產 量變化不大。與XfoiADH和CBS4732相比，菌株XRmADH的乙醇生產率(18. 4mgX (LXh)-1) 分別增加了 1. 5倍和2. 4倍。與XRn/XDH和CBS4732菌株相比，菌株XRm/XDH具有減少 1. 3倍和2. 6倍的木糖醇生產量。與菌株XfoiADH/XK的乙醇生產率(13. 8mgX (LXh)"1) 和菌株CBS4732的乙醇生產率(7. 5mgX (LXh)―1)相比，菌株XRm/)(DH/XK的乙醇生產 率(54. 7mgX (LXhr1)高4倍和7. 4倍。菌株XRm/)(DH/XK的木糖醇生產量顯著地降到 0. 9mgX (LXh)、該木糖醇生產量比XfoiADH/XK的木糖醇生產量和對照菌株的木糖醇生 產量分別低4. 7倍和3倍。菌株Xfoi/)(DH/XK、XRm/)(DH/XK和CBS4732的代表性發(fā)酵概況在 圖3中示出。注意到，在發(fā)酵期間由多形漢遜酵母菌株消耗的木糖較低。在木糖發(fā)酵的初 始階段，產生的乙醇在發(fā)酵1-2天之后被再利用。多形漢遜酵母菌株中的XR突變體、XD和XK基因的表達，所述多形漢遜酵母菌株 在提高的溫度下(48°C )過表汰用于改講的木糖乙醇發(fā)酵的丙酮酸脫羧酶。為了改進木糖乙醇發(fā)酵，在具有提高水平的丙酮酸脫羧酶活性的重組多形漢遜酵 母菌株中過表達改造型的木糖還原酶(XR)和天然木糖醇脫氫酶O(DH)。前面已描述了初始 菌株的構建和生物化學特征[35，36]。為了產生具有同時過表達的修飾型)(R和)(DH的菌株，多形漢遜酵母菌株用kal線性化質粒PX1M-Z-X2轉化(圖1) [37]。轉化體在補充有zeocin (150mgX L—1) 的YPD培養(yǎng)基上生長。能夠在選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落在用高達40轉化體Xmg4DNA的 頻率孵育三天之后出現(xiàn)。通過在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-12代，然后轉移到具有zeocin 的選擇性培養(yǎng)基來使轉化體穩(wěn)定。使用用于在強組成型啟動子HpGAP控制下負載修飾的 XYLl基因的表達盒的引物Ll/HpXlrev，和使用用于在相同啟動子控制下負載XYL2基因的 表達盒的引物Ll/Kol33，通過PCR考查轉化體中表達盒的存在。在Dmytruk 0.等人的文章中描述了所使用的引物的序列以及XYLl基因的修飾[37]。考查了在有限的通風下和于48°C下通過構建的菌株分批培養(yǎng)的木糖發(fā)酵。使 用了包含木糖(12%)和初始濃度2g(干重)ΧΙ^生物質的礦物培養(yǎng)基。通過構建的 菌株的乙醇生產量的結果在表3中示出。2Et-/2xPDC 1 /XRm/XDH菌株的乙醇生產率是 0. IlgX (LXhr1)，這比初始菌株2Et"/2xPDC的生產率高2. 7倍。菌株2Et-/2xPDCl和 2Et-/2xPDCl/XRm/XDH的代表性發(fā)酵概況在圖5中示出。改造的)(R和天然)(DH的過表達明顯地中和了多形漢遜酵母構建的重組菌株中的 氧化還原失衡，導致在木糖發(fā)酵期間乙醇生產率的顯著提高。碰如前所述[6]，利用木糖的天然酵母菌僅在其)(R具有連接NADH的活性時顯示乙 醇發(fā)酵。多形漢遜酵母的狀屬于具有雙輔因子特異性的酶，但是NADPH是特別優(yōu)選的(> 10倍)。在這種情況下，我們關注于具有對于NADPH的增加的Km的)(R的改造。根據(jù)細假 絲酵母的狀基因的數(shù)據(jù)[33]，使用位點特異性誘變，在輔因子結合位點的框中的位置341 和343的賴氨酸和天冬酰胺殘基分別被精氨酸和天冬氨酸代替。在強組成型HpGAP啟動子 的控制下，在Axyll背景上過表達修飾型)(R基因。這導致對于NADPH的Km的顯著增加， 而對于NADH的Km保持幾乎不變。獲得的結果與報道的來自細假絲酵母的修飾型狀的特 征[33]具有良好一致性。構建的XRm菌株顯示與野生型菌株相比在乙醇生產率上的少量 增加，而天然XR的過表達不具有正效應。這些菌株的木糖醇生產量變化不大。需要強調， 突變的)(R顯示對NADPH的顯著降低的比活性，這導致XRm的乙醇生產率的增加。為了進一 步提高乙醇生產量，)(DH與修飾XR —起被表達。木糖利用途徑的初始兩階段的酶的過表達 導致乙醇生產率提高2. 4倍，且伴隨著木糖醇生產量降低2. 6倍。在先前的工作中，我們開發(fā)了共-過表達大腸桿菌XI和自身XK的多形漢遜酵母 菌株。該菌株特征為具有在木糖發(fā)酵期間顯著提高的乙醇生產量[23]。在本研究中，過表 達修飾的)(R以及)(DH和XK的構建的菌株XRmADH/XK特征為具有與野生型菌株相比顯著 增加的乙醇生產率(高達7.4倍)。重要地，通過該菌株得到的木糖醇生產量大量降低 0. 9mgX (LXh)-1)相比于通過野生型菌株得到的4. 2mgX (LXh)"1)。XDH的另外的過表達 和)(DH與XK —起的另外的過表達導致乙醇生產率的逐漸增加和同時木糖醇生產量的降低。 可假定，木糖利用的初始階段在多形漢遜酵母中的木糖乙醇發(fā)酵中是限制性的。在圖3中， 示出了 XRmADH/XK和Xfoi/)(DH/XK的發(fā)酵概況。在發(fā)酵期間，通過構建的多形漢遜酵母菌 株和野生型菌株兩者的木糖的消耗非常低(圖幻。這可表明在多形漢遜酵母中吸收木糖 效率非常低，且編碼推定的木糖轉運蛋白的相應的基因應該被克隆和過表達。此外，狀的 瓶頸下游不能被除外且需要進一步研究。發(fā)酵概況顯示合成乙醇的再利用。這種現(xiàn)象的原 因還不清楚。在另一個研究中，本發(fā)明人已分離出多形漢遜酵母2Et0H_突變體，該多形漢遜 酵母2Et0H_突變體特征在于顯著降低的合成乙醇的消耗(Ishchuk等人，未公開)。但是， 相應的突變的分子本質仍不清楚。本研究構建的多形漢遜酵母的重組菌株顯示在高溫木糖發(fā)酵期間顯著增加的乙 醇生產率。另一方面，來自木糖的乙醇生產量與目前最好的木糖發(fā)酵菌株相比仍非常低 [13a，17，34]。因此，需要進一步努力，以改進耐熱酵母菌多形漢遜酵母中的木糖乙醇發(fā)酵。結論CN 102046776 A說明書7/11 頁 在本工作中，在攜帶Axyl缺失的菌株中，突變形式的)(R(K341 — RN343 — D)與天 然)(DH和)(R —起的共-過表達導致在高溫木糖發(fā)酵期間乙醇生產率顯著增加(7. 4倍)，且 同時木糖醇生產量降低。整合到過表達多形漢遜酵母丙酮酸脫羧酶基因PDCl而缺少Axyl 缺失的多形漢遜酵母菌株的染色體中的相同的構建也使從木糖進行的乙醇發(fā)酵增加約三 倍。因此預期，還攜帶Axyl缺失的多形漢遜酵母菌株中的PDCl基因和突變的)(R基因的 過表達的組合將進一步提高從木糖得到的乙醇生產量。通過引用并入以下參考文獻中的每一個都在此引用，以提供對本文所公開的發(fā)明的更好理解， 且提供對將使得任一個本領域普通技術人員能夠制造和使用本文所描述的物質和過程的 技術、來源和物質的描述。因此，以下參考文獻中的每一個在此通過引用以其整體并入，如 果本文所提供的任何公開內容與并入的參考文獻沖突，在這樣的情況下，本文所公開的沖 突主題內容控制所引用的參考文獻。權利要求中的術語在參考文獻部分之后的權利要求中，術語“基因”是一個簡略的表達，其是指編碼 通過所命名的基因確定的酶的任何多核苷酸。除非在權利要求中另有明確說明，否則“基 因”可以但沒有必要包括非編碼序列。除非另有說明，多核苷酸可具有與所命名的基因相同 的一級結構，所命名的基因是在生物體的基因組中內生的，或是連接到其他多核苷酸元件 的所命名的基因的重組形式，或是所命名的基因的合成形式，或是突變形式，在該突變形式 中，所命名的基因中的各種元件已改變但基因仍編碼可操作形式的所確定的酶。術語“突變 的”是指在所命名的基因中的使其不同于內生形式的基因的任何改變。“天然的”是指當基 因存在于生物體的基因組中時的基因的內生結構。參考文獻1. 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1.一種重組多形漢遜酵母(H. polymorpha)菌株，所述菌株包括至少一種重組核酸，所 述重組核酸單一地或組合地包括至少一種編碼木糖醇脫氫酶的基因、至少一種編碼具有對 NAD(H)比對NADP(H)高的結合親和力的木糖還原酶的基因，和至少一種編碼木酮糖激酶的 基因，所述基因中的每一種被可操作地連接到至少一種在所述多形漢遜酵母菌株中過表達 所述基因的啟動子，且其中，與不含所述基因的親代多形漢遜酵母菌株相比，所述重組多形 漢遜酵母菌株在包含木糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵時產生更大量的乙醇。
2.如權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌株，其中所述重組核酸的所述基因中的每 一種被整合到多形漢遜酵母染色體中。
3.如權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌株，其中所述多形漢遜酵母菌株具有使至 少一種編碼木糖還原酶的天然基因不可操作的突變。
4.如權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌株，其中相對于所述親代多形漢遜酵母菌 株，所述多形漢遜酵母菌株中的所述基因中的每一種被過表達。
5.如權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌株，所述菌株還包括至少一種編碼丙酮酸 脫羧酶的序列，所述序列可操作地連接到在所述重組多形漢遜酵母菌株中過表達所述丙酮 酸脫羧酶的啟動子。
6.如權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌株，其中至少一種啟動子包括從多形漢遜 酵母獲得的HpGAP啟動子。
7.如權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌株，其中所述重組木糖還原酶基因是天然 多形漢遜酵母木糖還原酶基因的突變體。
8.如權利要求7所述的重組多形漢遜酵母菌株，其中所述木糖還原酶基因具有在所述 天然多形漢遜酵母木糖還原酶基因中將編碼位置341賴氨酸的第一密碼子變?yōu)榫幋a精氨 酸的密碼子的突變，以及將表達位置343天冬酰胺的第二密碼子變?yōu)榫幋a天冬氨酸的密碼 子的突變。
9.一種制造乙醇的方法，所述方法包括在使得重組多形漢遜酵母制造乙醇的條件下， 在包括木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1-8中任一項所述的重組多形漢遜酵母菌株。
10.一種重組核酸，所述重組核酸包括來自多形漢遜酵母的編碼木糖還原酶基因的序列。
11.如權利要求10所述的重組核酸，其中所述編碼木糖還原酶的序列編碼根據(jù)序列ID 號1的NADPH/NADH結合結構域。
12.如權利要求10所述的重組核酸，其中所述編碼木糖還原酶的序列編碼根據(jù)序列ID 號2的NADPH/NADH結合結構域。
13.如權利要求10所述的重組核酸，所述重組核酸根據(jù)序列ID號3。
14.如權利要求10所述的重組核酸，所述重組核酸編碼根據(jù)序列ID號4的蛋白質。
15.權利要求10所述的重組核酸，所述重組核酸編碼除了在根據(jù)序列ID號2的 NADPH/NADH結合結構域具有突變的根據(jù)序列ID號4的蛋白質。
全文摘要
公開了在高溫木糖發(fā)酵期間的具有顯著增加乙醇生產率且同時降低木糖醇生產量的重組體基因構建體和菌株。該構建體包括編碼木糖還原酶的多形漢遜酵母XYL1基因，所述木糖還原酶發(fā)生突變以降低酶對NADPH的親和力。在強組成型HpGAP啟動子控制下的修飾形式的XYL1基因在Δxyl1背景中被過表達。還構建了在Δxyl1背景中過表達突變酶和天然木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的重組多形漢遜酵母菌株。在高溫木糖發(fā)酵(48℃)期間評價了構建的菌株的木糖消耗、乙醇和木糖醇生產量。示出了與野生型菌株相比，重組菌株中的乙醇生產率顯著增加(高達7.4倍)。此外，通過重組菌株得到的木糖醇生產量大量減少0.9mg×(L×h)-1對通過野生型菌株得到的4.2mg×(L×h)-1。
文檔編號C12N1/19GK102046776SQ200980119950
公開日2011年5月4日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權日2008年5月30日
發(fā)明者奧萊納·迪米特拉克, A·希博尼 安德烈, 安德烈·Y·沃羅諾夫斯基, 康斯坦丁·迪米特拉克, 查爾斯·阿巴斯 申請人:阿徹丹尼爾斯米德蘭德公司