專利名稱：表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于構(gòu)建轉(zhuǎn)化的厭氧微生物的表達(dá)載體和構(gòu)建所述表達(dá)載體的方法， 所述厭氧微生物用作治療缺氧疾病的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。此外，本發(fā)明涉及包含由所述表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化的厭氧微生物的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體、含有所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物組合物和含有所述基因轉(zhuǎn)運(yùn) 體的缺氧疾病治療劑。
背景技術(shù)：
在遺傳改造的領(lǐng)域中，噬菌體、動(dòng)物病毒或植物病毒、質(zhì)粒等被廣泛用作轉(zhuǎn)化微 生物的表達(dá)載體。作為被轉(zhuǎn)化并使得表達(dá)基因產(chǎn)物的靶蛋白的轉(zhuǎn)化體微生物，大腸桿菌 (E. coli)、酵母等是被廣泛使用的。這些轉(zhuǎn)化的微生物是以表達(dá)靶蛋白為目的，并且所述微 生物自身的利用未被考慮過。近些年來，關(guān)于轉(zhuǎn)化的微生物自身的利用，治療惡性腫瘤的方法已經(jīng)引起 了注意，其中將轉(zhuǎn)化的厭氧細(xì)菌用作基因轉(zhuǎn)運(yùn)體；例如，已經(jīng)提出了使用轉(zhuǎn)化的梭菌 (Clostridium)將基因轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤位置的方法(參見例如專利公布1至3)，此外，已經(jīng)提出 將轉(zhuǎn)化的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)應(yīng)用于治療實(shí)體瘤(參見例如非專利公 布1和2)。此外，關(guān)于作為用于治療實(shí)體瘤的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌 (Bifidobacterium)，已有報(bào)道被轉(zhuǎn)化以表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(下文稱為⑶)的長雙歧桿菌可 以預(yù)期在酶-前藥療法中具有應(yīng)用(參見例如專利公布4和非專利公布3和4)。CD是將 5-氟胞嘧啶(下文稱為5-FC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU的酶，5-氟胞嘧啶是具有抗腫瘤活性的5-氟尿 嘧啶(下文稱為5-FU)的前藥(前體)。這樣的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的構(gòu)建需要表達(dá)載體。但是，因?yàn)樵谶z傳改造領(lǐng)域中常規(guī)用于 轉(zhuǎn)化大腸桿菌的大腸桿菌來源的質(zhì)粒載體不能天然地在除了大腸桿菌的細(xì)菌中復(fù)制，所以 在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的構(gòu)建中必須修飾質(zhì)粒載體，以便其能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中復(fù)制。在以上公布中，也報(bào)道了用于構(gòu)建用于治療惡性腫瘤的這些轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的表達(dá) 載體，并且專利公布1至3報(bào)道了在大腸桿菌和梭菌兩者中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒PNTR500F、 PCD540FT 等。此外，專利公布4報(bào)道了在大腸桿菌和雙歧桿菌兩者中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒 pBLES100-S-eCD和用于構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pBLES100_S_eCD的穿梭質(zhì)粒pBLESlOO。此外，還已經(jīng)報(bào)道了穿梭質(zhì)粒pAVOOl-HU-e⑶，其可以以大于100倍的穿梭質(zhì)粒 pBLES100-S-e⑶的效率的高效率轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌(參見例如專利公布5)。此外，已經(jīng)報(bào)道了穿梭質(zhì)粒pAV001-HU-eCD_M968，其是穿梭質(zhì)粒pAV001-HU_eCD 的質(zhì)粒單核苷酸變體，其中插入穿梭質(zhì)粒PAVOOl中的靶基因的DNA已被部分改變(參見例 如專利公布6)。此外，例如，已經(jīng)報(bào)道了在大腸桿菌和雙歧桿菌兩者中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒pDG7、 在大腸桿菌和梭菌兩者中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒PEBM3和pECM2、在大腸桿菌和乳酸桿菌(Lactobacillus)兩者中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒pLP825等(參見例如非專利公布5)。如上文所述，已經(jīng)報(bào)道了用于構(gòu)建除了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體的各種質(zhì)粒載體，它們 都是在大腸桿菌和除了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體細(xì)菌兩者中復(fù)制的穿梭載體，并且沒有已知的能 夠僅在非大腸桿菌轉(zhuǎn)化體細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體。引用列表專利文獻(xiàn)[專利公布1]美國專利第64167M號(hào)[專利公布2]美國專利第665觀49號(hào)[專利公布3]美國提前公開第2003/0103952號(hào)[專利公布 4] JP，A，2002-97144[專利公布 5]W0 2006-57289[專利公布 6]W0 2007_136107非專利文獻(xiàn)[非專利公布 1]Yazawa et al，，Cancer Gene Ther. ,7,269-274(2000)[非專利公布 2] Yazawa et al.，Breast Cancer Res. Treat.，66，165-170(2001)[ # 專禾Ij ,k ^ 3]Nakamura et al. , Biosci. Biotechnol. Biochem. ,66, 2362-2366(2002)[ # 專禾Ij ,k ^ 4]Fujimori et al. , Curr. Opin. Drug Discov. Devel. ,5, 200-203(2002)[非 專禾丨J 公布 5]Alessandra Argnani et al. , Microbiology. ； 142 109-114(1996)發(fā)明_既述技術(shù)問題在利用轉(zhuǎn)化體基因轉(zhuǎn)運(yùn)體治療缺氧環(huán)境中的疾病(下文稱為缺氧疾病)的方法 中，例如實(shí)體瘤或缺血性疾病，所使用的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體需要非致病的專性厭氧菌，其僅在缺氧 狀態(tài)中的疾病組織中存活和增殖，并且不在非缺氧狀態(tài)中的正常組織中存活或增殖。此外，非常重要的是基因轉(zhuǎn)運(yùn)體中的轉(zhuǎn)化基因不會(huì)被橫向轉(zhuǎn)移到除了所述基因轉(zhuǎn) 運(yùn)體的致病細(xì)菌、需氧細(xì)菌或兼性厭氧菌，并且即使所述轉(zhuǎn)化基因被橫向轉(zhuǎn)移，其不會(huì)在該 細(xì)菌中復(fù)制。因?yàn)檫@點(diǎn)，用于構(gòu)建轉(zhuǎn)化體基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)載體期望地僅在所述轉(zhuǎn)化體中 復(fù)制并且不在除了所述轉(zhuǎn)化體的細(xì)菌中復(fù)制，特別是不在致病或需氧細(xì)菌或兼性厭氧菌中 復(fù)制。至今報(bào)道的大部分表達(dá)載體是在轉(zhuǎn)化體細(xì)菌和例如大腸桿菌的除了所述轉(zhuǎn)化體 細(xì)菌的細(xì)菌兩者中復(fù)制的穿梭載體，并且它們不是僅在非大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中復(fù)制的表達(dá)載 體。本發(fā)明的目的是提供這樣的表達(dá)載體，其僅在非大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中復(fù)制，但是不 在除了所述轉(zhuǎn)化體的細(xì)菌中復(fù)制，特別是，不在致病或者需氧細(xì)菌或兼性厭氧菌中復(fù)制，例 如大腸桿菌。此外，本發(fā)明的另一目的是提供由表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的厭氧微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn) 體、含有所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物組合物和含有轉(zhuǎn)化體細(xì)菌的用于治療缺氧疾病的試劑。
問題解決方法本發(fā)明人之前在具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白中選擇 了表達(dá)CD的基因作為靶基因；然后構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pBLESlOO-S-eCD作為質(zhì)粒載體，所述靶 基因被插入所述質(zhì)粒載體，其中攜帶表達(dá)CD的基因的大腸桿菌的質(zhì)粒和長雙歧桿菌來源 的質(zhì)粒被融合。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道通過使用以上來重組長雙歧桿菌105A而生成的長 雙歧桿菌105A/pBLES100-S-e⑶作為用于治療惡性腫瘤的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體是有前途的(專利公 布4)。為了進(jìn)一步改進(jìn)融合質(zhì)粒，本發(fā)明人已報(bào)道了長雙歧桿菌105A/ pAV001-HU-eCD-M968及其構(gòu)建方法，其中作為質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒單核苷酸變體的 質(zhì)粒pAVOOl-HU-e⑶-M968是通過部分地改變插入的靶基因的DNA而產(chǎn)生的，并且使用以上 來重組長雙歧桿菌105A (專利公布6)。因?yàn)樗羞@些質(zhì)粒都是在雙歧桿菌和大腸桿菌兩者中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，所以當(dāng)它 們以任何原因被橫向轉(zhuǎn)移到大腸桿菌時(shí)，它們?cè)诖竽c桿菌中復(fù)制。本發(fā)明人為了解決以上問題已進(jìn)行了深入的研究，并且通過從以上質(zhì)粒 pAV001-HU-eCD-M968中移除pUC ori而構(gòu)建了質(zhì)粒pBifiCD，pUC ori是含有大腸桿菌復(fù) 制起點(diǎn)的片段。已經(jīng)證實(shí)大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(Takara Bio Inc.)未被使用本發(fā)明 的質(zhì)粒pBifiCD通過熱休克所轉(zhuǎn)化，并且沒有橫向轉(zhuǎn)移的可能性。用本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌表現(xiàn)出良好的CD表達(dá)活性，并且當(dāng)其與前藥5-FC聯(lián) 合使用時(shí)表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制作用，這表明其作為用于實(shí)體瘤的出色的治療劑是有 前途的，所述用本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌例如長雙歧桿菌105-A/pBifiCD(技術(shù)與評(píng)價(jià)專 禾U微生物 呆藏國立研究所(National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms D印ositary) (NPMD)，〒292-0818日本千葉縣木更津市眾f 鎌足 2-5-8，保藏日期2008年2月19日，登錄號(hào)NITE BP-491)，其是重組長雙歧桿菌105-A，所 述前藥5-FC由所述⑶轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)5-FU。出人意料的是，還發(fā)現(xiàn)這些重組雙歧桿菌具有高質(zhì)粒保留穩(wěn)定性，此外，因?yàn)樗鼈?不含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，所以即使發(fā)生了向大腸桿菌的橫向轉(zhuǎn)移，它們?cè)诖竽c桿菌中的 復(fù)制也是不可能的。因此，該重組細(xì)菌作為非常安全和高質(zhì)量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體是有前途的。因此，本發(fā)明涉及<1>表達(dá)載體，其是在厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒載體，所述表達(dá)載體不含有在 大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元，<2>如<1>所述的表達(dá)載體，其中所述厭氧微生物是除了大腸桿菌的腸細(xì)菌，<3>如<2>所述的表達(dá)載體，其中所述除了大腸桿菌的腸細(xì)菌是選自以下的腸細(xì) 菌雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌(Sti^ptococcus)和梭菌，<4>如<1>至<3>中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包含(1)在除了大 腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元和( 蛋白表達(dá)單元，其包括編碼具有靶 活性的蛋白的DNA和包含在所述厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段，<5>如<4>所述的表達(dá)載體，其中所述在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能 的質(zhì)粒復(fù)制單元是在選自以下的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元雙歧桿菌、乳酸 桿菌、腸球菌、鏈球菌和梭菌，
<6>如<5>所述的表達(dá)載體，其中所述在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能 的質(zhì)粒復(fù)制單元是在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元，<7>如<6>所述的表達(dá)載體，其中所述在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元是 包含OriV區(qū)和R印B基因的pTB6 rep單元，<8>如<7>所述的表達(dá)載體，其中編碼所述包含OriV區(qū)和R印B基因的pTB6r印單 元的基因是由來自SEQ ID NO :4的第1796至第3391核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其 單核苷酸多態(tài)性，<9>如<4>至<8>中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述在厭氧微生物中發(fā)揮功能的 啟動(dòng)子和終止子是在選自以下的細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子雙歧桿菌、乳酸桿菌、 腸球菌、鏈球菌和梭菌，<10>如<9>所述的表達(dá)載體，其中所述在厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止 子是在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子，<11>如<10>所述的表達(dá)載體，其中所述在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止 子是編碼在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的組蛋白樣DNA-結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子，<12>如<11>所述的表達(dá)載體，其中所述編碼在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的組蛋白樣 DNA-結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子是編碼雙歧桿菌來源的組蛋白樣DNA-結(jié)合蛋白的 基因的啟動(dòng)子和終止子，<13>如<12>所述的表達(dá)載體，其中所述編碼編碼組蛋白樣DNA-結(jié)合蛋白的基因 的啟動(dòng)子和終止子的基因是由分別來自SEQ ID NO 4的第7至第367和第1676至第1789 核苷酸的核苷酸序列所示的DNA，或其單核苷酸多態(tài)性，<14>如<4>至<13>所述的表達(dá)載體，其中所述具有靶活性的蛋白是對(duì)缺氧環(huán)境中 的疾病具有治療活性的蛋白，<15>如<14>所述的表達(dá)載體，其中所述對(duì)缺氧環(huán)境中的疾病具有治療活性的蛋 白是(a)具有抗腫瘤活性的蛋白，或(b)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性 的蛋白，<16>如<15>所述的表達(dá)載體，其中所述對(duì)缺氧環(huán)境中的疾病具有治療活性的蛋 白是具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白，<17〉如<16>所述的表達(dá)載體，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物 質(zhì)的活性的蛋白選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶，<18>如<17〉所述的表達(dá)載體，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物 質(zhì)的活性的蛋白是胞嘧啶脫氨酶，<19>如<18>所述的表達(dá)載體，其中編碼胞嘧啶脫氨酶的基因是由來自SEQ ID NO 4的第395至第1675核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其單核苷酸多態(tài)性，<20>如<4>至<29>中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其還包含(3)選擇標(biāo)記活性基因單 元，其中所述選擇標(biāo)記活性選自抗藥性、營養(yǎng)缺陷型和培養(yǎng)基選擇性，<21>如<20>所述的表達(dá)載體，其中所述選擇標(biāo)記活性是選自以下的抗藥性壯觀 霉素抗性、氨芐西林抗性、四環(huán)素抗性、新霉素抗性和卡那霉素抗性，<22>如<21>所述的表達(dá)載體，其中所述選擇標(biāo)記活性是壯觀霉素抗性，<23>如<22>所述的表達(dá)載體，其中編碼表現(xiàn)選擇標(biāo)記活性的蛋白的DNA是編碼壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(adenyltransferase)的DNA，<24>如<23>所述的表達(dá)載體，其中包含編碼壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的DNA及其 啟動(dòng)子序列的DNA是由來自SEQ ID NO :4的第3398至第4476核苷酸的核苷酸序列所示的 DNA或其單核苷酸多態(tài)性，以及<25>如<24>所述的表達(dá)載體，其包含由SEQ ID NO :4(pBifiCD)的核苷酸序列所 示的DNA序列。此外，本發(fā)明涉及<26>構(gòu)建表達(dá)載體的過程，所述過程包括產(chǎn)生包含以下的穿梭質(zhì)粒(1)在除了 大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元和( 蛋白表達(dá)單元，其包含編碼具有 靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段， 并且所述穿梭質(zhì)粒在大腸桿菌和除了大腸桿菌的宿主細(xì)菌兩者中復(fù)制，并且從所述穿梭質(zhì)粒移除在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元。此外，本發(fā)明涉及<27>基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其包含由<1>至<25>中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧微生 物，<28>如<27>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述厭氧微生物是除了大腸桿菌的腸細(xì)菌，<29>如<28>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述除了大腸桿菌的腸細(xì)菌選自雙歧桿菌、 乳酸桿菌、腸球菌、鏈球菌和梭菌，<30>如<29>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述除了大腸桿菌的腸細(xì)菌是雙歧桿菌，<31>如<30>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述雙歧桿菌選自青春雙歧桿菌 (Bifidobacterium adolescentis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animal is)、嬰 JL 雙 歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、 AM 長雙歧桿菌(Bifidobacterium pseudolongum)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum),<32>如<30>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述雙歧桿菌是長雙歧桿菌，<33>如<27>至<32>中任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中它能夠在缺氧環(huán)境中的腫 瘤組織中生長，并且能夠表達(dá)對(duì)缺氧環(huán)境中的疾病具有治療活性的蛋白，<34>如<33>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中它能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長，并 且所述對(duì)缺氧環(huán)境中的疾病具有治療活性的蛋白是(a)具有抗腫瘤活性的蛋白或(b)具有 將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白，<35>如<34>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中它能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長，并 且所述對(duì)缺氧環(huán)境中的疾病具有治療活性的蛋白是具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤 物質(zhì)的活性的蛋白，<36>如<35>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤 物質(zhì)的活性的蛋白選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶，<37>如<36>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤 物質(zhì)的活性的蛋白是胞嘧啶脫氨酶，以及<38>如<37>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)體是長雙歧桿菌105-Α/pBifi⑶(技術(shù)與評(píng)價(jià)專利微生物保藏國立研究所(NPMD)登錄號(hào)NITE BP-491)。此外，本發(fā)明涉及<39>藥物組合物，其包含<27>至<38>中任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，<40>藥物組合物，其包含<34>至<38>中任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體和通過蛋白被 轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的抗腫瘤物質(zhì)前體的組合，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠表達(dá)所述蛋白并且所述 蛋白具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性，以及<41>如<40>所述的藥物組合物，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤 物質(zhì)的活性的蛋白是胞嘧啶脫氨酶，并且所述抗腫瘤物質(zhì)前體是5-氟胞嘧啶。此外，本發(fā)明涉及<42>用于實(shí)體瘤的治療劑，其包含<34>至<38>中任一項(xiàng)所述的足以表達(dá)有效治 療劑量的具有抗腫瘤活性的蛋白的量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，<43>用于實(shí)體瘤的治療劑，其包含以下的組合<34>至<38>中任一項(xiàng)所述的足以 表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛行е委焺┝康目鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白和可以被轉(zhuǎn) 變?yōu)橛行е委焺┝康目鼓[瘤物質(zhì)的量的抗腫瘤物質(zhì)前體，所述抗腫瘤物質(zhì)前體被所述基因 轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠表達(dá)的蛋白所轉(zhuǎn)變，以及<44>如<43>所述的實(shí)體瘤治療劑，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[ 瘤物質(zhì)的活性的蛋白是胞嘧啶脫氨酶，并且所述抗腫瘤物質(zhì)前體是5-氟胞嘧啶。在本申請(qǐng)中，編碼(a)具有抗腫瘤活性的蛋白的DNA或編碼(b)具有將抗腫瘤物 質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的DNA下文可以稱為“編碼靶蛋白的DNA”。發(fā)明的有利效果本發(fā)明的表達(dá)載體不包含在除了轉(zhuǎn)化體細(xì)菌的細(xì)菌中，特別是在大腸桿菌中發(fā)揮 功能的復(fù)制起點(diǎn)，并且它是非常安全的載體，不存在在除了所述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的細(xì)菌中復(fù)制 的可能性，特別是不在致病或需氧或兼性厭氧細(xì)菌中復(fù)制，例如大腸桿菌。使用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體具有高質(zhì)粒保留穩(wěn)定性；并且如上文所 述，即使所述載體被橫向轉(zhuǎn)移到除了所述轉(zhuǎn)化體的細(xì)菌，特別是轉(zhuǎn)移到致病或者需氧或兼 性厭氧細(xì)菌，例如大腸桿菌，也不存在在這些其他細(xì)菌中復(fù)制的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明的基因 轉(zhuǎn)運(yùn)體作為高度安全的、高質(zhì)量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體是有前途的。附圖簡述[

圖1]展示構(gòu)建選擇標(biāo)記質(zhì)粒(pSPCM-pUCori)的步驟的圖(步驟1)。[圖2]展示構(gòu)建選擇標(biāo)記活性蛋白質(zhì)粒(pHU-eCDm-SPCM-pUCori)的步驟的圖 (步驟2)。[圖3]展示構(gòu)建穿梭質(zhì)粒(ρ⑶穿梭(ρ⑶shuttle))的步驟的圖(步驟3)。[圖4]展示構(gòu)建質(zhì)粒“pBifi⑶”的步驟的圖(步驟4)。[圖5]展示長雙歧桿菌Re_105A/pBifi⑶克隆菌株的抗腫瘤效果的圖。實(shí)施方案描述本發(fā)明的表達(dá)載體是這樣的質(zhì)粒載體，其在厭氧細(xì)菌中并且特別是除了大腸桿菌 的腸細(xì)菌中發(fā)揮功能，例如雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、鏈球菌或梭菌，并且本發(fā)明的表達(dá) 載體是不含有在除了轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的細(xì)菌中，特別是大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元的 表達(dá)載體。更具體地，本發(fā)明的表達(dá)載體是例如包含以下的表達(dá)載體(1)在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元，和( 蛋白表達(dá)單元，其包含編碼具有靶活性 的蛋白的DNA和包含在所述厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段，并且所 述表達(dá)載體不含有在除了所述轉(zhuǎn)化體細(xì)菌的細(xì)菌中，特別是在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元。至今已報(bào)道的大部分質(zhì)粒載體是通過將大腸桿菌來源的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化體細(xì)菌來源 的質(zhì)粒融合而構(gòu)建的，這是因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)染技術(shù)的積累信息和轉(zhuǎn)染的確保。它們是在大腸桿 菌和轉(zhuǎn)化體細(xì)菌兩者中發(fā)揮功能的穿梭載體，并且不是僅在非大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體細(xì)菌中發(fā) 揮功能的表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體特征在于，例如，其基本上由以下組成(1)在除了大腸桿菌的 厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元和O)蛋白表達(dá)單元，其基本上由編碼具有靶活性 的蛋白的DNA和包含在所述厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段組成。并 且所述表達(dá)載體不含有在除了所述轉(zhuǎn)化體細(xì)菌的細(xì)菌中，特別是在大腸桿菌中發(fā)揮功能的 質(zhì)粒復(fù)制單元。在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的本發(fā)明的表達(dá)載體的質(zhì)粒復(fù)制單元 可以是任何質(zhì)粒復(fù)制單元，只要其在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能，例如在諸如 雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、鏈球菌或梭菌的腸細(xì)菌中發(fā)揮功能，并且只要其在除了轉(zhuǎn)化 體細(xì)菌的厭氧微生物中不發(fā)揮功能；在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的本發(fā)明的 表達(dá)載體的質(zhì)粒復(fù)制單元的實(shí)例包括在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù) 制單元，例如，在雙歧桿菌中發(fā)揮功能。具體實(shí)例包括基本上由在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的 OriV區(qū)和R印B基因組成的pTB6 rep單元，或其單核苷酸多態(tài)性。更多具體實(shí)例包括由來 自SEQ ID NO 4的第1796至第3391核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其單核苷酸多態(tài) 性。此外，本發(fā)明的表達(dá)載體的蛋白表達(dá)單元的啟動(dòng)子和終止子可以是任何啟動(dòng)子和 終止子，只要它們?cè)趨捬跷⑸镏邪l(fā)揮功能，例如，在諸如雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、鏈 球菌或梭菌的腸細(xì)菌中發(fā)揮功能；本發(fā)明的表達(dá)載體的蛋白表達(dá)單元的啟動(dòng)子和終止子的 實(shí)例包括編碼在厭氧微生物中發(fā)揮功能的組蛋白樣DNA-結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止 子，例如，編碼雙歧桿菌來源的組蛋白樣DNA-結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子DNA，或其 單核苷酸多態(tài)性。具體實(shí)例包括由分別來自SEQ ID NO 4的第7至第367和第1676至第 1786核苷酸的核苷酸序列所示的DNA，或其單核苷酸多態(tài)性。此外，本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含C3)選擇標(biāo)記活性基因單元。本發(fā)明的表達(dá) 載體所具有的選擇標(biāo)記活性不是特殊限定的，只要其能夠選擇由本發(fā)明的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的 厭氧微生物；本發(fā)明的表達(dá)載體所具有的選擇標(biāo)記活性的實(shí)例包括抗藥性標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷 型，所述抗藥性標(biāo)記例如壯觀霉素抗性、氨芐西林抗性、四環(huán)素抗性、新霉素抗性或卡那霉 素抗性，并且壯觀霉素抗性是優(yōu)選的。選擇標(biāo)記活性基因單元的實(shí)例包括，例如含有編碼表現(xiàn)壯觀霉素抗性活性的蛋 白的DNA或其單核苷酸變體的DNA及其啟動(dòng)子序列；例如，編碼糞腸球菌(Enterococcus faecalis)來源的壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(下文稱為AAD9盒)的DNA或其單核苷酸多態(tài) 性。具體實(shí)例包括由來自SEQ ID NO :4的第3398至第4476核苷酸的核苷酸序列所示的 DNA或其單核苷酸多態(tài)性。
本發(fā)明涉及的“單核苷酸變體”表示單核苷酸多態(tài)性，其中至少一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸 已被改變(下文稱為SNP)，并且不僅包括在僅一個(gè)位點(diǎn)的SNP還包括在許多位點(diǎn)的SNP。例如當(dāng)本發(fā)明的缺氧疾病的治療劑被用作惡性腫瘤的治療劑時(shí)，被并入本發(fā)明的 表達(dá)載體的蛋白表達(dá)單元的基因可以是任何基因，只要其表達(dá)具有抗腫瘤活性的蛋白或具 有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白，并且只要其不是例如巨大DNA(至 少約101Λ)的抑制轉(zhuǎn)化的DNA或?qū)τ诮邮荏w細(xì)胞有毒的DNA。由所述基因表達(dá)的具有抗腫瘤活性的蛋白包括，例如細(xì)胞因子，細(xì)胞因子的具 體實(shí)例包括干擾素(IFN)-a、β和Y，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介 素(IL)-I α、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15 和 18、腫瘤壞死因子(TNF) - α、淋巴毒素 (LT)-β、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑 制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T-細(xì)胞活化共刺激因子Β7 (CD80)和Β7-2 (CD86)、 KIT配體和制瘤素Μ。此外，實(shí)例包括血管發(fā)生抑制物質(zhì)，例如內(nèi)皮抑制素、血管抑制素 (angiostatin)禾口三環(huán)(kringle) 1、2、3、4 和 5。這些蛋白的序列對(duì)于不同生物是已知的，并且本發(fā)明中使用的編碼具有抗腫瘤活 性的蛋白的DNA可以通過利用例如基于所述序列信息的PCR方法的已知技術(shù)來獲得。此外，具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的實(shí)例包括胞嘧 啶脫氨酶(下文稱為CD)，其是將5-氟胞嘧啶(下文稱為5-FC)轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性物質(zhì) 5-氟尿嘧啶(下文稱為5-FU)的酶；硝基還原酶，其是將5-氮雜環(huán)丙基-2，4-二硝基苯甲 酰胺(下文稱為CB1940轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性烷化劑的酶；1型單純皰疹病毒胸苷激酶(下 文稱為HSV1-TK)，其是將更昔洛韋轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性代謝產(chǎn)物的酶；以及β-葡糖醛酸糖 苷酶，其是將葡糖醛酸化的抗腫瘤活性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性物質(zhì)的酶。優(yōu)選的實(shí)例包括 ⑶，其是將5-FC轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU的酶。編碼CD的DNA可以是，例如，質(zhì)粒pAdex 1 CSCD(Riken Gene Bank RDB No. 1591)， 其含有編碼大腸桿菌來源的CD的DNA，或分離自質(zhì)粒pMK116的DNA，其類似地含有編碼大 JSff^^iJIW CD 白勺 DNA (D. A. Mead et al. ，Protein Engineering 1 :67_74 (1986))。編碼大腸桿菌來源的⑶的DNA的實(shí)例包括由SEQ ID NO 4的第395至第1675核 苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其單核苷酸多態(tài)性。此外，當(dāng)本發(fā)明的缺氧疾病的治療劑被用作缺血性疾病的治療劑時(shí)，具有血管生 成促進(jìn)活性的蛋白可以被用作并入本發(fā)明的表達(dá)載體的蛋白表達(dá)單元的基因，所述血管生 成促進(jìn)活性對(duì)于治療缺血性疾病是有用的。具體實(shí)例包括成纖維細(xì)胞生長因子2 (FGF2)、內(nèi) 皮細(xì)胞生長因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)。類似地，這些蛋白的序列對(duì)于不同生物是已知的，并且本發(fā)明中使用的編碼具有 血管生成促進(jìn)活性的蛋白的DNA可以通過利用例如基于所述序列信息的PCR方法的已知技 術(shù)來獲得。本發(fā)明的載體包括任何載體，只要其是包含以下的質(zhì)粒，例如，在除了大腸桿菌的 厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元；蛋白表達(dá)單元，其包含編碼具有靶活性的蛋白的 DNA和含有在所述厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段；以及選擇標(biāo)記活 性基因單元。并且只要當(dāng)所述質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入?yún)捬跷⑸飼r(shí)能在所述厭氧微生物中發(fā)揮功 能。以及只要所述質(zhì)粒不含有在除了所述轉(zhuǎn)化體細(xì)菌的細(xì)菌中，特別是在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元。實(shí)例包括通過以下方法構(gòu)建的質(zhì)粒將包含編碼具有靶活性的給定蛋白的DNA 和包含在厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段的蛋白表達(dá)單元并入以 下穿梭質(zhì)粒，并且移除在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元pBLES100 (專利公布4)、 ρ A VO 01 (專利公布 5)、pBRASTAlOl (Tanaka et al.，2005，Biosci. Biotechnol. Biochem.， 69 (2) :422-425)、pDG7、pEBM3、pECM2、pLP825等(非專利公布5)，以上在公布中已有報(bào)道。本發(fā)明的載體的其他實(shí)例包括通過將被并入質(zhì)粒的蛋白表達(dá)單元與另一給定的 蛋白表達(dá)單元重組并且還移除了在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元而構(gòu)建的那些，所 述被并入的質(zhì)粒例如PNTR500F、pCDMOFT等(專利公布1至3)、pBLES100-S-eCD (專利公 布 4)、pAV001-HU-eCD (專利公布 5)、pAV001-HU-eCD_M968 (專利公布 6)等。本發(fā)明的表達(dá)載體的具體實(shí)例包括，例如這樣的載體，其具有作為在除了大腸桿 菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元的PTB6 rep單元，其包含在雙歧桿菌中發(fā)揮功 能的R印B基因和OriV區(qū)，和作為含有在厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA 片段的編碼雙歧桿菌來源的組蛋白樣DNA-結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子；和作為編 碼具有靶活性的蛋白的DNA的編碼將5-FC轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU的⑶酶的DNA ；以及作為選擇標(biāo)記 活性基因單元的編碼糞腸球菌來源的壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的DNA(AAD9盒)，。更多具體實(shí)例包括pBifi⑶，其由SEQ ID NO 4的核苷酸序列所示。本發(fā)明的載體可以通過例如以下的方法構(gòu)建。例如，本發(fā)明的載體可以通過以下構(gòu)建(1)構(gòu)建質(zhì)粒，其包含例如pUC ori的大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和例如AAD9盒的選擇 標(biāo)記活性基因單元(下文稱為選擇標(biāo)記質(zhì)粒)(下文稱為步驟1)，(2)制備選擇標(biāo)記質(zhì)粒的線性質(zhì)粒，將其與例如編碼雙歧桿菌來源的組蛋白樣 DNA-結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子的啟動(dòng)子和終止子以及(a)具有抗腫瘤活性的蛋 白或(b)例如包含CD的片段的具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白 (下文稱為蛋白表達(dá)單元)連接，以構(gòu)建具有選擇標(biāo)記活性基因單元和蛋白表達(dá)單元的質(zhì) 粒(下文稱為選擇標(biāo)記活性蛋白質(zhì)粒)(下文稱為步驟2)，(3)制備該選擇標(biāo)記活性蛋白質(zhì)粒的線性質(zhì)粒，將其與例如包含在雙歧桿菌中發(fā) 揮功能的R印B基因和OriV區(qū)的pTB6 rep單元的DNA片段的在除了大腸桿菌的厭氧微生物 中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元(下文稱為質(zhì)粒復(fù)制單元)連接，以構(gòu)建具有大腸桿菌復(fù)制起 點(diǎn)和選擇標(biāo)記活性基因單元、蛋白表達(dá)單元和質(zhì)粒復(fù)制單元的質(zhì)粒(下文稱為穿梭質(zhì)粒) (下文稱為步驟3)，并且(4)從該穿梭質(zhì)粒移除大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(下文稱為步驟4)。每個(gè)步驟的操作可以按照文獻(xiàn)中描述的已知方法實(shí)施。載體也可以通過將蛋白表達(dá)單元通過標(biāo)準(zhǔn)方法并入上文提及的不同穿梭質(zhì)粒，然 后通過標(biāo)準(zhǔn)方法類似地移除在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元而構(gòu)建，所述穿梭質(zhì)粒 例如穿梭質(zhì)粒 pBLESlOO (專利公布 4)、pAV001 (專利公布 5)、pBRASTA101 (Tanaka et al.， 2005，Biosci. Biotechnol. Biochem. ,69(2) :422-425)、pDG7、pEBM3、pECM2、pLP825 等(非 專利公布幻、PNTR500F、ρ⑶MOFT等(專利公布1至幻，所述蛋白表達(dá)單元包含編碼具有 靶活性的給定蛋白的DNA和含有在厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段。
此外，以與上文本發(fā)明的質(zhì)粒pBifiCD相同的方式，其中含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn) 的片段的PUC ori從質(zhì)粒pAVOOl-HU-e⑶-M968(專利公布6)被移除，本發(fā)明的載體也可以 通過將在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元從質(zhì)粒PNTR500F、ρ⑶MOFT (專利公布1至 3)、pBLES100-S-eCD (專利公布4)、pAV001-HU_eCD (專利公布5)等移除來構(gòu)建。此外，本發(fā)明的載體也可以通過將被并入質(zhì)粒pNTR500F、p⑶MOFT (專利公布1至 3)、pBLES100-S-eCD (專利公布 4)、pAV001-HU_eCD (專利公布 5)、pAV001-HU-eCD_M968 (專 利公布6)等的蛋白表達(dá)單元與另一給定蛋白表達(dá)單元重組，然后從其中移除在大腸桿菌 中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元來構(gòu)建。本發(fā)明的用于治療缺氧疾病的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體可以通過轉(zhuǎn)化給定厭氧微生物來構(gòu)建， 所述給定厭氧微生物按照已知遺傳改造方法使用本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因?yàn)橥ㄟ^本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧微生物是在用于治療例如實(shí)體瘤的缺氧 疾病的試劑中使用，所以該厭氧微生物必須是是專性厭氧且非致病的；可以使用例如梭菌 或沙門氏菌(Salmonella)的致病細(xì)菌，如果它們成為非致病的，并且可以使用例如乳酸桿 菌的兼性厭氧菌，如果它已突變?yōu)閷Ｐ詤捬醯?。?yōu)選的實(shí)例包括非致病厭氧細(xì)菌；非致病腸細(xì)菌是更優(yōu)選的，并且在它們中雙歧 桿菌是最優(yōu)選的。雙歧桿菌的實(shí)例包括青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿 菌、假長雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長雙歧桿菌，并且長雙歧桿菌是最優(yōu)選的。這些細(xì)菌是商業(yè)上可獲得的或容易地從保藏機(jī)構(gòu)獲得的。例如，長雙歧桿 菌ATCC-15707、雙歧雙歧桿菌ATCC-11863、嬰兒雙歧桿菌ATCC-15697等可以容易地從 ATCC(美國模式培養(yǎng)物保藏中心(The American Type Culture Collection))獲得。每種細(xì)菌的菌株不是特殊限定的，并且長雙歧桿菌的菌株的實(shí)例包括長雙歧桿菌 105-A菌株、長雙歧桿菌aE-194b菌株、長雙歧桿菌bs_601菌株和長雙歧桿菌M101-2菌株， 并且在它們中長雙歧桿菌105-A菌株是優(yōu)選的。短雙歧桿菌的菌株的實(shí)例包括短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JCM1192)、短雙歧桿菌aS_l 菌株和短雙歧桿菌I-53-8W菌株，并且在它們中短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和短雙歧桿菌aS-Ι菌 株是優(yōu)選的。嬰兒雙歧桿菌的菌株的實(shí)例包括嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JCM1222)和嬰兒雙歧 桿菌1-10-5菌株，并且在它們中嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和嬰兒雙歧桿菌1-10-5菌株是優(yōu) 選的。此外，乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactentis)的菌株的實(shí)例包括乳雙歧桿菌 標(biāo)準(zhǔn)菌株(JCMl220)。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體是包含通過本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧微生物的基因轉(zhuǎn) 運(yùn)體，并且不是特殊限定的，只要其能夠在缺氧環(huán)境中的組織中生長并且能表達(dá)具有靶活 性的蛋白，此外，具有很小的或沒有被橫向轉(zhuǎn)移到除了所述轉(zhuǎn)化體的細(xì)菌，特別是橫向轉(zhuǎn)移 到致病或需氧或兼性厭氧微生物的可能性。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的優(yōu)選的實(shí)例包括這樣的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其能夠在缺氧環(huán) 境中的腫瘤組織中生長，并且能夠表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活 性的蛋白。更優(yōu)選的實(shí)例包括包含能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長的并且能夠表達(dá)將5-FC轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU的CD酶的雙歧桿菌的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。特別優(yōu)選的實(shí)例包括通過 pBifiCD轉(zhuǎn)化的長雙歧桿菌105-A菌株(長雙歧桿菌105_A/pBifiCD ；NPMD參考號(hào)NITE ABP-491)，其在2008年2月19日保藏于獨(dú)立行政法人技術(shù)與評(píng)價(jià)專利微生物保藏國立研 究所(Incorporated Administrative Agency National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary(NPMD)) ( T 292-0818 H^^pBfH-^^ 津市如f ^鎌足2-5-8)，登錄號(hào)為NITE ΒΡ-491。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體可以按照商業(yè)實(shí)驗(yàn)教科書中描述的方法來構(gòu)建，例如Gene Manual (基因手冊(cè))(Kodansha) ,Gene Manipulation Experimental Method (基因操作實(shí) 驗(yàn)方法)，Ed.作者 Yasuyuki Takagi (Kodansha), Molecular Cloning (分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ,Molecular Cloning 2nd Edition (分子克隆第 2 片反)， Cold Spring Harbor Laboratory (1989)或Methods in Enzymol.(酶學(xué)方法)，194 (1991)。本發(fā)明的藥物組合物不是特殊限定的，只要其含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。此外，本 發(fā)明的缺氧疾病的治療劑不是特殊限定的，只要其含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。此外，本發(fā)明的用于缺氧疾病的藥物組合物或治療劑可以含有兩種或更種的本發(fā) 明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。此外，本發(fā)明的用于缺氧疾病的藥物組合物或治療劑可以與含有除了本發(fā)明的基 因轉(zhuǎn)運(yùn)體的表現(xiàn)出缺氧疾病治療效果的化合物的用于缺氧疾病藥物組合物或治療劑聯(lián)合 使用。此外，本發(fā)明的用于缺氧疾病的藥物組合物或治療劑可以含有除了本發(fā)明的基因 轉(zhuǎn)運(yùn)體的其他組分，只要本發(fā)明的效果不受影響。這些其他組分的實(shí)例包括藥學(xué)上可接受 的支持物、賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的藥物組合物或缺氧疾病治療劑的劑型不是特殊限定的，并且其實(shí)例包括 含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的液體試劑或固體制劑。液體試劑可以通過純化本發(fā)明的基因轉(zhuǎn) 運(yùn)體的厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)液，按照要求向其添加適當(dāng)?shù)纳睇}水、液體替換品或醫(yī)藥添加劑， 并用其填裝安瓿、小瓶等而產(chǎn)生。固體制劑可以通過向液體試劑添加合適的保護(hù)劑，用其填 裝安瓿、小瓶等，并且然后凍干或L-干燥而產(chǎn)生，或通過向液體試劑添加合適的保護(hù)劑，將 其凍干或L-干燥，并且然后用其填裝安瓿、小瓶等而產(chǎn)生。對(duì)于本發(fā)明藥物組合物或缺氧 疾病治療劑的給藥方法，口服給藥和腸胃外給藥兩者都是可以的，但腸胃外給藥是優(yōu)選的， 例如可以進(jìn)行靜脈內(nèi)注射、皮下注射、局部輸注或腦室內(nèi)給藥，并且靜脈內(nèi)注射是最優(yōu)選 的。本發(fā)明的藥物組合物或缺氧疾病治療劑的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的劑量不是特殊限定的，只 要其對(duì)于在疾病位置生長和表達(dá)有效治療劑量的活性蛋白是足夠的量。但是，從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn) 和降低副作用的目的而言，劑量優(yōu)選地在能獲得所需的治療效果的范圍內(nèi)盡可能地小。本發(fā)明的用于缺氧疾病的藥物組合物或治療劑中的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的劑量根據(jù)疾病 的嚴(yán)重程度和患者的體重、年齡或性別適當(dāng)選擇，并且可以根據(jù)改善程度適當(dāng)增加或減少。例如，當(dāng)將本發(fā)明的缺氧疾病治療劑用作實(shí)體瘤治療劑時(shí)，根據(jù)厭氧微生物自身 表現(xiàn)出的抗腫瘤活性、具有所使用的厭氧微生物產(chǎn)生的抗腫瘤活性的蛋白的類型、轉(zhuǎn)變自 抗腫瘤物質(zhì)前體的抗腫瘤物質(zhì)的有效治療劑量、所使用的厭氧微生物產(chǎn)生的活性蛋白的量 等來適當(dāng)?shù)卮_定劑量。
具體地，在靜脈內(nèi)給藥的情況下，因?yàn)榻档屠缬捎诖罅考?xì)菌的栓塞風(fēng)險(xiǎn)是特別 必需的，所以優(yōu)選使用以盡可能低的濃度的注射，將注射分為多次注射或用適當(dāng)?shù)囊后w代 替品稀釋注射并且通過連續(xù)輸注給藥。例如，在成人的情況下，將每天IO6Cfu至IO12Cfu每 千克體重的本發(fā)明的厭氧微生物的細(xì)胞分為1至多次、視情況連續(xù)或間隔地進(jìn)行給藥，并 且持續(xù)1天至多天。更具體地，每成人直接給予ImL至IOOOmL含有104cfu/mL至101(lcfu/ mL的本發(fā)明的厭氧微生物細(xì)胞的制劑，或用適當(dāng)?shù)囊后w代替品稀釋，分為每天一次至多次 進(jìn)行給藥，并且持續(xù)1天至連續(xù)幾天。此外，在涉及直接對(duì)疾病組織直接給藥的局部給藥的情況下，因?yàn)樾枰?xì)菌細(xì)胞 在整個(gè)疾病組織中盡可能多地建群和增殖，所以在疾病組織的多個(gè)位置給予高濃度注射是 可取得。例如，在成人的情況下，每天一次或多次給予IO6Cfu至IO12Cfu每千克體重的本發(fā) 明的厭氧微生物的細(xì)胞，視情況連續(xù)或間隔地進(jìn)行給藥，并且按照需要持續(xù)1天至多天。更 具體地，每成人直接地給予ImL至IOOOmL含有104cfu/mL至101(lCfu/mL的本發(fā)明的厭氧微 生物的細(xì)胞的制劑直接地，優(yōu)選每天一次至多次，并且按照需要連續(xù)地持續(xù)1天至幾天。當(dāng)在治療期間觀察到疾病組織中的細(xì)菌已消失，則首先暫停治療，然后以如以上 相似的方式給予細(xì)菌。當(dāng)本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體或缺氧疾病治療劑是厭氧細(xì)菌，其中插入了能夠表達(dá)具有 將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的基因時(shí)，將含有作為活性組分的基因 轉(zhuǎn)運(yùn)體的本發(fā)明的藥物組合物或用于實(shí)體瘤的治療劑與一定量的可以通過所述基因轉(zhuǎn)運(yùn) 體表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橛行Я康目鼓[瘤物質(zhì)的抗腫瘤物質(zhì)前體聯(lián)合使用。該抗腫瘤物質(zhì)前體 可以作為活性組分包含在含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物組合物或用于實(shí)體瘤的治療劑 中，但是其優(yōu)選用作含有抗腫瘤物質(zhì)前體的藥物組合物，該含有抗腫瘤物質(zhì)前體的藥物組 合物與含有作為活性組分的本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物組合物或用于實(shí)體瘤的治療劑組合。用于本發(fā)明的抗腫瘤物質(zhì)前體不是特殊限定的，只要其在前體(前藥)狀態(tài)時(shí)對(duì) 于正常組織具有較少的副作用的抗腫瘤物質(zhì)前體，并且在轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)后對(duì)于作為治 療靶標(biāo)的實(shí)體瘤具有高治療效果。實(shí)例包括5-FC，其是5-FU的前藥；CB1945，其被轉(zhuǎn)變?yōu)?抗腫瘤活性烷化劑；更昔洛韋，其被轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性代謝產(chǎn)物；以及葡糖醛酸化的抗腫 瘤活物質(zhì)。以這種方式，當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物或用于實(shí)體瘤的治療劑與抗腫瘤物質(zhì)前體 聯(lián)合使用時(shí)，給予本發(fā)明的藥物組合物或用于實(shí)體瘤的治療劑的方法可以與給予含有抗腫 瘤物質(zhì)前體的藥物組合物的方法相同或不同，并且這些給藥可以同時(shí)或在分別的時(shí)間進(jìn) 行；含有抗腫瘤物質(zhì)前體的藥物組合物的給藥優(yōu)選地在給予本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤 治療劑后，允許足夠的時(shí)間以使本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體在腫瘤細(xì)胞上生長之后進(jìn)行。此外，當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物或用于實(shí)體瘤的治療劑與抗腫瘤物質(zhì)前體聯(lián)合使 用時(shí)，因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)運(yùn)體僅在缺氧環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞組織中建群和增殖，并且在那里局部地 產(chǎn)生活性蛋白，所以與使用普通抗腫瘤物質(zhì)前體治療實(shí)體瘤的方法相比，可以顯著地抑制 副作用，并且可以將抗腫瘤物質(zhì)前體的劑量設(shè)定在寬范圍內(nèi)。含有抗腫瘤物質(zhì)前體的藥物組合物的形式不是特殊限定的，并且其可以是任何普 通口服制劑，例如粉劑、片劑或膠囊劑；或腸胃外制劑，例如栓劑或注射劑。這樣的藥物組合物可以通過普通藥物方法生產(chǎn)。抗腫瘤物質(zhì)前體的劑量可以根據(jù)聯(lián)合使用的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體在腫瘤組織中的生長速 率和抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的效率適當(dāng)進(jìn)行選擇。以與基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的劑量相同 的方式，抗腫瘤物質(zhì)前體的劑量可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和患者的體重、年齡或性別視情 況進(jìn)行選擇，并且可以根據(jù)改善的程度視情況增加或減少。例如，在實(shí)際治療中，劑量根據(jù)使用的抗腫瘤物質(zhì)前體和轉(zhuǎn)變的抗腫瘤物質(zhì)的類 型、轉(zhuǎn)變自抗腫瘤物質(zhì)前體的抗腫瘤物質(zhì)的有效治療劑量、具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)?抗腫瘤物質(zhì)的活性的厭氧微生物所產(chǎn)生的活性蛋白的類型以及使用的厭氧微生物所產(chǎn)生 的活性蛋白的量等來適當(dāng)設(shè)定。具體地，例如，當(dāng)將含有作為活性組分的長雙歧桿菌105-A/pBif iCD (NITE BP-491)的藥物組合物和含有作為活性組分的抗腫瘤物質(zhì)前體5-FC的藥物組合物聯(lián)合給 藥時(shí)，所述長雙歧桿菌105-A/pBifiCD具有被引入其中的CD基因并且是本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn) 體，在確認(rèn)細(xì)菌已經(jīng)在腫瘤組織中建群和增殖，并且細(xì)菌已經(jīng)從血液和正常組織消失后，以 Img/天至IOOmg/天每成人千克體重、每天一次或多次、在治療期間連續(xù)給予5-FC。給藥方 法優(yōu)選為口服給藥，但是可以進(jìn)行例如靜脈內(nèi)給藥或肝門給藥的腸胃外給藥。本發(fā)明涉及的“X和Y的組合”包括X和Y在不同配置(configuration)的情況以 及X和Y在相同配置的情況(例如含有X和Y的配置)。當(dāng)X和Y在不同配置時(shí)，X和Y可 以各自另外含有另一組分。本發(fā)明的用于缺氧疾病的藥物組合物或治療劑可以應(yīng)用于缺氧環(huán)境中的疾病， 并且優(yōu)選地應(yīng)用于不同類型的實(shí)體癌。實(shí)體癌的實(shí)例包括大腸癌、腦瘤、頭頸癌、乳腺癌、 肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、胰島細(xì)胞癌、絨毛膜癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞 癌、腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、惡性類 癌瘤、皮膚癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、維爾姆斯腫瘤(Wilm’ S tumor)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、黑色素瘤和鱗癌。此外，在缺氧環(huán)境中的其他疾病的實(shí)例包括缺血性疾病，例如心肌梗死或閉塞性 動(dòng)脈硬化，以及下肢缺血性疾病，例如伯格病(Buerger’ s disease)。實(shí)施例結(jié)合參考實(shí)施例和實(shí)施例，本發(fā)明在下文更具體地進(jìn)行解釋，但是本發(fā)明的技術(shù) 范圍不局限于這些實(shí)施例。〈參考實(shí)施例1>DNA模板的制備將在每個(gè)實(shí)施例中用作模板的質(zhì)粒DNA的濃度使用0. IXTE調(diào)整至IOpg/微升并 且貯存在-30°C的冷凍柜中直到使用。用作模板的每個(gè)質(zhì)粒DNA顯示在下文表1中。[表1]表1質(zhì)粒組分和這些組分在新質(zhì)粒中的作用
權(quán)利要求
1.在厭氧微生物中發(fā)揮功能的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體不含有在大腸桿菌中發(fā)揮功能 的質(zhì)粒復(fù)制單元。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，包含(1)在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能 的質(zhì)粒復(fù)制單元，和( 蛋白表達(dá)單元，其包含編碼具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述 厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中所述在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮 功能的質(zhì)粒復(fù)制單元是在選自以下的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元雙歧桿 菌(Bifidobacterium)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌 (Streptococcus)禾口梭菌(Clostridium)。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其中所述在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能 的質(zhì)粒復(fù)制單元是在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其中所述在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元是 包含OriV區(qū)和R印B基因的pTB6 rep單元。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其中編碼包含OriV區(qū)和R印B基因的pTB6r印單元 的基因是由SEQ ID NO :4的第1796至第3391核苷酸的核苷酸序列所示的DNA或其單核苷 酸多態(tài)性。
7.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中所述具有靶活性的蛋白是(a)具有抗腫瘤活性 的蛋白，或(b)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其中所述具有靶活性的蛋白是具有將抗腫瘤物質(zhì)前 體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì) 的活性的蛋白選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和β -葡糖醛酸糖苷酶。
10.如權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，其中所述具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物 質(zhì)的活性的蛋白是胞嘧啶脫氨酶。
11.如權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體，包含SEQID N0:4(pBifi⑶)的核苷酸序列所示 的DNA序列。
12.構(gòu)建在厭氧微生物中發(fā)揮功能的表達(dá)載體的方法，所述方法包括產(chǎn)生包含以下的穿梭質(zhì)粒(1)在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制 單元，和( 蛋白表達(dá)單元，其包含編碼具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厭氧微生物 中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段，所述穿梭質(zhì)粒在大腸桿菌和除了大腸桿菌的宿 主細(xì)菌兩者中復(fù)制，以及從所述穿梭質(zhì)粒移除在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元。
13.基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，包含用權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧 微生物。
14.如權(quán)利要求13所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述厭氧微生物選自雙歧桿菌 (Bifidobacterium)> 乳酸桿菌(Lactobacillus)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌 (Streptococcus)禾口梭菌(Clostridium)。
15.如權(quán)利要求14所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述厭氧微生物是雙歧桿菌。
16.如權(quán)利要求15所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述雙歧桿菌選自青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、嬰兒雙 歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、 假長雙歧桿菌(Bifidobacterium pseudolongum)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)ο
17.如權(quán)利要求16所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述雙歧桿菌是長雙歧桿菌。
18.如權(quán)利要求13所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中它能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長， 并且能夠表達(dá)(a)具有抗腫瘤活性的蛋白，或(b)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物 質(zhì)的活性的蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中它能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長， 并且能夠表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白。
20.如權(quán)利要求19所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)體是長雙歧桿菌105-A/ pBifiCD(技術(shù)與評(píng)價(jià)專利微生物保藏國立研究所(National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary) H陸號(hào) NITE BP-491)。
21.用于實(shí)體瘤治療劑的藥物組合物或治療劑，包含權(quán)利要求13至20中任一權(quán)利要求 所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。
全文摘要
通過將大腸桿菌來源的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化體來源的質(zhì)粒融合而構(gòu)建的常規(guī)穿梭載體在大腸桿菌和所述轉(zhuǎn)化體細(xì)菌兩者中發(fā)揮功能，并且不存在僅在非大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。本發(fā)明提供了質(zhì)粒表達(dá)載體，其包含(1)在除了大腸桿菌的厭氧微生物中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制單元，和(2)蛋白表達(dá)單元，其形成自編碼具有靶活性的蛋白的DNA和含有在所述厭氧微生物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子與終止子的DNA片段。本發(fā)明的表達(dá)載體能夠僅在轉(zhuǎn)化體中復(fù)制，這消除了所述轉(zhuǎn)化體基因在其他致病或需氧細(xì)菌中復(fù)制的風(fēng)險(xiǎn)，提供了用于治療應(yīng)用的非常安全和可靠的載體和基因轉(zhuǎn)運(yùn)體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102046791SQ20098012058
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日
發(fā)明者嶋谷-柴田裕子, 清水瞳, 米倉弘美 申請(qǐng)人:阿內(nèi)羅藥物科學(xué)株式會(huì)社