專利名稱：細(xì)胞法產(chǎn)生葡糖二酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過重組基因表達(dá)來產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸。
背景技術(shù)：
包括應(yīng)用重組DNA技術(shù)在內(nèi)的代謝工程，已經(jīng)顯示出其為以下多種目的而優(yōu)化 細(xì)胞功能的潛力重組蛋白的生產(chǎn)、提高生產(chǎn)力的途徑工程以及新產(chǎn)品產(chǎn)生的新途徑設(shè) 計(jì)。新途徑被定義為在宿主物種中不存在的一系列轉(zhuǎn)化。已經(jīng)設(shè)計(jì)了新途徑并在大腸桿菌 (E. coli)中構(gòu)建，用于生產(chǎn) 1，3-丙二醇(C. E. Nakamura 和 G. M. Whited (2003). Curr. Opin. Biotechnol. 14 :454-459)、青蒿酸(Nature Biotech,21, pp796_802)和 1，2，4-丁三醇 (JACS，125，ppl2998-12999)。在這些方法中，每一個(gè)步驟均基于酶的可用性而設(shè)計(jì)，鑒定了 來自不同生物體的所招募的酶的活性，并且通過組裝這些酶促步驟而在大腸桿菌中構(gòu)建新 途徑。這些實(shí)例中的基本思想是將包括酶在內(nèi)的蛋白看作是可相互交換的部分，術(shù)語“合成 生物學(xué)，，已用于描述此概念(Nature 421，pll8 ；Nature Chemical Biology，3，pp521_525)。D-葡糖二酸可見于水果、蔬菜和哺乳動(dòng)物中，并已經(jīng)針對(duì)其降低膽固 醇(Z. Walaszek 等(1996) · Nutr. Res. 16 :673-681)和癌癥化療(J. Singh 和 K. P. Gupta(2003). Biomed Environ, ki. 16 :9_16)進(jìn)行了 研究。在最近的一篇報(bào)道中 (T. Werpy 禾口 G. Petersen (2004) · "Top Value Added Chemicals From Biomass,，，Vol. I，PNNL and NREL)，D-葡糖二酸被確認(rèn)為“來自生物質(zhì)的高附加值化學(xué)品”以及用于產(chǎn)生 新型尼龍和超支化聚酯的有希望的起始材料。D-葡糖二酸是含有4個(gè)手性碳的高度官能 化化合物，目前通過利用硝酸作為氧化劑對(duì)D-葡萄糖進(jìn)行化學(xué)氧化而產(chǎn)生，該過程是非 選擇性的并且昂貴(T. Werpy 和 G. PetersonOO(M). "Top Value Added Chemicals From Biomass,"Vol. I,PNNL and NREL)。利用酶的新型催化過程可帶來高產(chǎn)量和高選擇性?？?以通過模仿哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的D-葡糖二酸途徑而獲得產(chǎn)生葡糖二酸的生物學(xué)方法。但 是，這種途徑效率不高，其包含超過10個(gè)以D-葡萄糖為起始原料的轉(zhuǎn)化步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本文中描述了編碼糖醛酸脫氫酶之第一個(gè)Udh基因的克隆和表征。本文中進(jìn)一步 描述了通過將不同生物來源的“生物部分”相組合來建立細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)內(nèi)產(chǎn) 生D-葡糖醛酸或D-葡糖二酸的新途徑。第一種酶即肌醇-1-磷酸合酶anol/MIPS)，通過中間體葡萄糖-6-磷酸，由葡萄糖產(chǎn)生肌醇(Dean-Johnson和Henry，1989)。第二種酶 即肌醇加氧酶(MIOX)，使肌醇轉(zhuǎn)化成葡糖醛酸。這兩種酶在細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)內(nèi) 的共表達(dá)使得可以由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸。糖醛酸脫氫酶可以使葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸 (Bateman和Kosuge等，1970 ；Wagner和HoIlman，1976)。如本文所述，此第三種基因與INOl 和MIOX同時(shí)表達(dá)使得可以由葡萄糖產(chǎn)生葡糖二酸。出乎意料的是，重組表達(dá)糖醛酸脫氫酶 使該途徑的流量顯著增加，從而可以得到高產(chǎn)量的葡糖二酸。本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)編碼糖醛酸脫氫酶之基因并且重組表達(dá)編碼肌醇加 氧酶之基因的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，編碼糖醛酸脫氫酶的基因是細(xì)菌基因，例如丁香 假單胞菌(Pseudomonas syringae)基因或根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)基 因。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇加氧酶的基因是哺乳動(dòng)物基因，例如小鼠基因。在一些 實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還重組表達(dá)編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因。在一些實(shí)施方案中，編 碼肌醇-1-磷酸合酶的基因可以是真菌基因或酵母基因，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因。重組表達(dá)上述酶的細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是 細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合 酶的基因已經(jīng)密碼子優(yōu)化修飾，用于在細(xì)菌中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真菌細(xì) 胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因可以由質(zhì)粒表達(dá) 或者被整合到細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施方案中，通過細(xì)胞內(nèi)糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶 和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白質(zhì)工程或者通過使細(xì)胞內(nèi)萄糖二酸代謝途徑的組分突變， 從而使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中包括經(jīng)遺傳修飾的微生物，其包含 一種或多種編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶的重組核酸分子。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸的方法，其包括培養(yǎng)與本發(fā)明相關(guān)的細(xì) 胞以產(chǎn)生葡糖醛酸或葡糖二酸，以及從細(xì)胞中回收葡糖醛酸或葡糖二酸。在一些實(shí)施方案 中，所述產(chǎn)生葡糖醛酸或葡糖二酸的方法包括對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以使其重組表達(dá)糖醛酸 脫氫酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一種，培養(yǎng)所述細(xì)胞的群，以及從已經(jīng)遺 傳修飾以產(chǎn)生萄糖二酸的細(xì)胞的群中收集葡糖二酸。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞重組表達(dá)肌醇加氧酶并產(chǎn)生葡糖醛酸。在一些實(shí)施 方案中，所述細(xì)胞重組表達(dá)肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶并產(chǎn)生葡糖醛酸。在一些實(shí)施 方案中，所述細(xì)胞重組表達(dá)肌醇加氧酶和糖醛酸脫氫酶并產(chǎn)生葡糖二酸。在一些實(shí)施方案 中，所述細(xì)胞重組表達(dá)肌醇加氧酶、肌醇-1-磷酸合酶和糖醛酸脫氫酶并產(chǎn)生葡糖二酸。在一些實(shí)施方案中，編碼糖醛酸脫氫酶的重組表達(dá)基因是細(xì)菌基因，例如丁香假 單胞菌基因或者根瘤農(nóng)桿菌基因。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇加氧酶的重組表達(dá)基因是 哺乳動(dòng)物基因，例如小鼠基因。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇-1-磷酸合酶的重組表達(dá)基因 是真菌基因或酵母基因，例如釀酒酵母基因。在一些實(shí)施方案中，重組表達(dá)上述酶的細(xì)胞是 原核細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。編碼肌醇加氧酶 和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因可以經(jīng)密碼子優(yōu)化修飾，用于在細(xì)菌中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，重組表達(dá)上述酶的細(xì)胞是真核細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述 細(xì)胞是真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-ι-磷酸合酶的基因可以由質(zhì)粒表達(dá)或者被整合到所述細(xì)胞的基因組 中。可以通過細(xì)胞內(nèi)糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-ι-磷酸合酶的蛋白質(zhì)工程或 者通過使細(xì)胞內(nèi)萄糖二酸代謝途徑的組分突變而使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。本發(fā)明還提供了由上述細(xì)胞和方法產(chǎn)生的葡糖二酸。在一些實(shí)施方案中，葡糖二 酸由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生，其中在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾以使其重組表達(dá)糖醛 酸脫氫酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一種。在一些實(shí)施方案中，編碼糖醛 酸脫氫酶的基因是細(xì)菌基因，例如丁香假單胞菌基因或根瘤農(nóng)桿菌基因。在一些實(shí)施方案 中，編碼肌醇加氧酶的基因是哺乳動(dòng)物基因，例如小鼠基因。在一些實(shí)施方案中，編碼肌 醇-1-磷酸合酶的基因是真菌基因或酵母基因，例如釀酒酵母基因。在一些實(shí)施方案中，由原核細(xì)胞產(chǎn)生葡糖二酸。在一些實(shí)施方案中，所述原核細(xì)胞 是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸 合酶的基因經(jīng)密碼子優(yōu)化修飾，用于在細(xì)菌中表達(dá)。葡糖二酸還可以由真核細(xì)胞產(chǎn)生。在 某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為了產(chǎn)生葡糖二酸，編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基 因可以由質(zhì)粒表達(dá)或者整合到細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施方案中，通過細(xì)胞內(nèi)糖醛酸脫 氫酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白質(zhì)工程或者通過使細(xì)胞內(nèi)萄糖二酸代謝 途徑的組分突變而使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。本發(fā)明還包括分離的核酸分子，其包括(a)包含SEQ ID NO =USEQ ID NO 23或 SEQ ID NO :25的分離的核酸分子；(b)編碼包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO J4或SEQ ID NO J6序列之氨基酸序列的分離的核酸分子；(c)與(a)或(b)的全長序列反向互補(bǔ)的分離 的核酸分子；以及(d)與(a)-(c)中任一項(xiàng)具有至少95%的核苷酸一致性的分離的核酸分 子。本發(fā)明還包括包含上述核酸分子的重組表達(dá)載體，所述核酸分子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可操 作地連接。本發(fā)明還包括分離的糖醛酸脫氫酶多肽，其由本文中所述核酸分子編碼。在一 些實(shí)施方案中，分離的糖醛酸脫氫酶多肽與SEQ ID NO 2, SEQ ID NO : 或SEQ ID NO 26 具有至少95%的氨基酸一致性。本發(fā)明包括含有本文中所述重組表達(dá)載體的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞 是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或者動(dòng)物細(xì)胞。通過在允許多肽表達(dá) 的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞以及從培養(yǎng)基或細(xì)胞中回收所述多肽，可將重組表達(dá)糖醛酸脫氫酶 基因的細(xì)胞用于產(chǎn)生糖醛酸脫氫酶蛋白。本發(fā)明還包括分離的抗體，其與本文中所述的糖醛酸脫氫酶多肽選擇性地結(jié)合。 在一些實(shí)施方案中，所述抗體選擇性地結(jié)合與SEQ ID NO :2具有至少95%的氨基酸一致性 的多肽。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與由與SEQ ID NO :1具有至少95%核苷酸一致性的 核酸所編碼的多肽相結(jié)合。所述抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗 體或者其抗原結(jié)合片段。


圖1是表明所設(shè)計(jì)的在大腸桿菌中產(chǎn)生葡糖二酸的途徑的圖。PTS =磷酸烯醇式 丙酮酸依賴型磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)Jn0I(MIPS)=來自釀酒酵母的肌醇-1-磷酸合酶；磷酸酶 =SuhB,內(nèi)源性大腸桿菌酶(Matsuhisa 等· J. Bacteriol. (1995) 177 :200-205) ；MIOX =經(jīng)密碼子優(yōu)化的小鼠肌醇加氧酶；Udh = 丁香假單胞菌的糖醛酸脫氫酶；PEP =磷酸烯醇式丙 酮酸。圖2是表明在BL21 (DE3) (pRSFD_IN_MI)中產(chǎn)生葡糖醛酸的圖。將培養(yǎng)物在添加 了 10g/L葡萄糖和0. ImM IPTG的LB培養(yǎng)基中于30°C—式三份培養(yǎng)。數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次生物 學(xué)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。Δ =葡糖醛酸(左軸)；□=肌醇(左軸)； =葡萄糖(右 軸)。葡萄糖濃度以g/L計(jì)。圖3是顯示在BL21 (DE3)中表達(dá)之重組Inol、MIOX和Udh的體外活性的圖，所述 BL2KDE3)中帶有這三種基因。將培養(yǎng)物在添加了 10g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中于30°C培 養(yǎng)并用0.05mM IPTG誘導(dǎo)。MIOX活性表示為相對(duì)于背景計(jì)算的凈活力。數(shù)據(jù)是三次生物學(xué) 重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。Δ= Inol ；□= MIOX ； = Udh。圖4是小鼠MIOX基因與其經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)的合成物之間的 DNA序列比對(duì)。DNA序列比對(duì)利用Vector NTI軟件(Invitrogen，Carlsbad, CA)進(jìn)行。圖5是表明細(xì)菌中葡糖醛酸和葡糖二酸的分解代謝的圖。通過敲除uxaC基因阻 止了葡糖醛酸的消耗。uxaC基因敲除的細(xì)胞中糖醛酸脫氫酶的存在使得大腸桿菌能夠利用 葡糖醛酸生長。圖6是描述能夠?qū)碜远∠慵賳伟募俣║dh進(jìn)行酶促動(dòng)力學(xué)測(cè)定的圖。含有 由PSPT0_10530RF所表達(dá)之蛋白的大腸桿菌裂解物能夠利用NAD+作為輔助因子使葡糖醛 酸氧化。圖7是顯示來自大腸桿菌粗裂解物之不同來源的經(jīng)表達(dá)Udh基因的活性。 pTATudh2 =根瘤農(nóng)桿菌，pTPPudh =惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，pTPSudh = 丁香 假單胞菌?？招闹?無IPTG，實(shí)心柱=含0. ImM IPTG0圖8描述了葡糖二酸的LC-MS色譜圖。圖8a顯示從酶促反應(yīng)混合物中分離的葡 糖二酸。圖8b顯示葡糖二酸標(biāo)準(zhǔn)品。葡糖二酸用其質(zhì)量(m/z = 209、210、419、420和441) 表征，洗脫峰也與葡糖二酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量相對(duì)應(yīng)。圖9描述了對(duì)經(jīng)純化之Udh的SDS-PAGE分析。經(jīng)純化的Udh在變性條件下進(jìn)行 12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。泳道1，分子量標(biāo)記；泳道2和3，表達(dá)pETATu 之大腸桿菌BL21 (DE3)的粗提物和經(jīng)純化的根瘤農(nóng)桿菌Udh ；泳道4和5，表達(dá)pETPPu之大 腸桿菌BL21 (DE3)的粗提物和經(jīng)純化的惡臭假單胞菌Udh ；泳道6和7，表達(dá)pETPSu之大腸 桿菌BL21(DE3)的粗提物和經(jīng)純化的丁香假單胞菌Udh。經(jīng)純化的Udh以箭頭符號(hào)表示。圖10是描述pH值和溫度對(duì)來源于根瘤農(nóng)桿菌、惡臭假單胞菌和丁香假單胞菌之 Udh活性的影響的圖。圖IOa顯示了作為pH之函數(shù)的相對(duì)活性。圖IOb顯示了在所示溫度 下孵育30分鐘后的相對(duì)活性。圖IOc顯示了作為測(cè)試溫度之函數(shù)的相對(duì)活性。方塊+直 線根瘤農(nóng)桿菌Udh。圓+虛線惡臭假單胞菌Udh。三角形+點(diǎn)線丁香假單胞菌Udh。圖11提供了顯示udh基因在染色體上的座位及其相鄰基因的列表。圖Ila 丁 香假單胞菌番茄致病變種DC3000菌株；圖lib 惡臭假單胞菌KTM40 ；圖Ilc 根瘤農(nóng)桿菌 C58菌株。圖Ild是顯示其相鄰基因名稱的列表。這些座位和名稱參考NC_004578( 丁香假 單胞菌番茄致病變種DC3000菌株)、NC_002947 (惡臭假單胞菌KT2440)和NC_003063 (根 瘤農(nóng)桿菌C58菌株)的基因組序列。圖12顯示了序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。圖1 描述了來源于丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000菌株、惡臭假單胞菌KTM40和根瘤農(nóng)桿菌C58菌株之糖醛酸脫氫酶的序 列比對(duì)。對(duì)于比對(duì)而言，一致的、保守的和相似的氨基酸序列分別以黑色、深灰色和淺灰色 框來表示。一級(jí)序列基序以GxxfocxG和YxxxK表示。圖12b描述了來源于不同原核和真核 物種之糖醛酸脫氫酶同源物的系統(tǒng)進(jìn)化分析。系統(tǒng)進(jìn)化分析利用丁香假單胞菌番茄致病變 種DC3000菌株之PSPT0_1053的同源物進(jìn)行。糖醛酸脫氫酶以粗體表示。發(fā)明詳述本發(fā)明的一些方面涉及通過細(xì)胞內(nèi)重組基因表達(dá)來產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸的 方法及組合物。本文中描述了編碼糖醛酸脫氫酶之基因的克隆，所述酶可以使葡糖醛酸轉(zhuǎn) 化成葡糖二酸。還描述了所設(shè)計(jì)并實(shí)施的新途徑，其通過聯(lián)合重組表達(dá)糖醛酸脫氫酶、肌 醇-1-磷酸合酶和肌醇加氧酶，從而由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸。該新途徑代表了 一種產(chǎn)生葡糖二酸(從產(chǎn)生尼龍和聚酯到癌癥治療中均廣泛應(yīng)用的分子)的出乎意料高效 的新系統(tǒng)。本文中描述的用于在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸的新途徑涉及幾種酶組分。 第一種酶是肌醇-1-磷酸合酶anol/MIPS)，其由釀酒酵母的INOl基因編碼，通過中間產(chǎn)物 葡萄糖-6-磷酸由葡萄糖產(chǎn)生肌醇(Dean-Johnson和Henry，1989)。例如釀酒酵母序列具 有GenBank登錄號(hào)NC_001142 (GeneID =853288)。在酵母中，肌醇是膜磷脂組分，其衍生物 對(duì)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)十分重要。MIPS的底物葡萄糖-6-磷酸，在大腸桿菌中由于PTS系統(tǒng)進(jìn) 行葡萄糖運(yùn)輸而存在(Postma，Lengeler等，199 。第二種酶是肌醇加氧酶(MIOX)，其使 肌醇轉(zhuǎn)化成葡糖醛酸。該酶主要存在于哺乳動(dòng)物中，代表肌醇代謝的第一步(Charalampous 和Lyras, 1957)。例如小鼠序列具有GenBank登錄號(hào)NC_000081 (GeneID :56727)。這兩種 酶在細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)內(nèi)的共表達(dá)使得可以由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸。在產(chǎn)生葡糖二酸的新途徑中，第三步是使葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸，該步驟可以 由糖醛酸脫氫酶完成(Bateman Kosuge等，1970 ；Wagner和Hollman, 1976)。如實(shí)施例2 中所述，對(duì)編碼糖醛酸脫氫酶的基因進(jìn)行克隆和表征，以構(gòu)建該途徑。如實(shí)施例2中所示， 從丁香假單胞菌番茄致病變種DC300菌株、惡臭假單胞菌KTM40和根瘤農(nóng)桿菌C58菌株 中克隆了糖醛酸脫氫酶。丁香假單胞菌的udh基因序列儲(chǔ)存于GenBank中，其登錄號(hào)為 EU377538。丁香假單胞菌番茄致病變種DC300A udh的DNA和蛋白序列分別如SEQ ID N0: 1和2所示。根瘤農(nóng)桿菌和惡臭假單胞菌之相應(yīng)基因的登錄號(hào)分別為BK006462(DNA =SEQ ID NO 23 ；蛋白=SEQ ID NO :24)和 BK006380 (DNA :SEQ ID NO 25 ；蛋白:SEQ ID NO 26)。 糖醛酸脫氫酶的克隆使得可以利用本領(lǐng)域已知的同源性檢索標(biāo)準(zhǔn)方法(例如通過BLAST檢 索)對(duì)多個(gè)物種中的糖醛酸脫氫酶蛋白進(jìn)行鑒定。如本文中所述，在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)肌醇-1-磷酸合酶和肌酶加氧酶使得可以由葡萄 糖產(chǎn)生葡糖醛酸。當(dāng)表達(dá)這些酶的細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)糖醛酸脫氫酶時(shí)，其導(dǎo)致以出乎意料之 高效水平通過以下三步之途徑由葡萄糖產(chǎn)生葡糖二酸1)由葡萄糖產(chǎn)生肌醇；幻將肌醇轉(zhuǎn) 化成葡糖醛酸；和幻使葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸。本發(fā)明還包括一個(gè)兩步途徑，其省略了 上述第一步，由步驟2和3組成。在該特定的實(shí)施方案中，可以使用能夠產(chǎn)生葡萄糖的細(xì)胞 因而無需向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加葡萄糖。在一些實(shí)施方案中，向該細(xì)胞中提供葡萄糖聚合物， 例如玉米淀粉。本發(fā)明的一些方面涉及重組表達(dá)肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和糖醛酸脫氫酶中至少一種的細(xì)胞。本發(fā)明包括任何細(xì)胞類型，包括原核和真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中， 所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞或酵 母細(xì)胞，例如釀酒酵母細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠細(xì) 胞。應(yīng)當(dāng)理解，一些細(xì)胞可內(nèi)源表達(dá)與本發(fā)明相關(guān)的至少一種酶。在一些實(shí)施方案中，所述 細(xì)胞不內(nèi)源表達(dá)任何一種酶，而是重組表達(dá)一種、兩種或三種酶。在另一些實(shí)施方案中，所 述細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)一種酶并且重組表達(dá)另外一種或兩種酶。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞 內(nèi)源表達(dá)兩種酶并且重組表達(dá)另外一種或兩種酶。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)源表達(dá) 一種或多種酶并且還重組表達(dá)相同的一種或多種酶。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和糖醛酸脫氫酶的基因 表達(dá)于重組表達(dá)載體中。本文中所用的“載體”可以是通過限制性酶切和連接使一種或多 種期望序列能夠插入其中的很多核酸中的任何核酸，用于在不同的遺傳環(huán)境之間轉(zhuǎn)運(yùn)或者 在宿主細(xì)胞中表達(dá)。載體通常由DNA組成，盡管也可使用RNA載體。載體包括但不限于質(zhì) 粒、fosmid、噬菌粒、病毒基因組以及人工染色體?？寺≥d體是能夠自主復(fù)制或者被整合到宿主細(xì)胞基因組中的載體，其進(jìn)一步通過 一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)來表征。在所述位點(diǎn)，可以將載體以確定的方式切開，并將靶 序列插入其中，以使新的重組載體保留其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。對(duì)于質(zhì)粒來說，隨著宿 主細(xì)菌內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)的增加，靶序列可發(fā)生多次復(fù)制，或者靶序列在宿主通過有絲分裂進(jìn) 行復(fù)制前在每個(gè)宿主中僅復(fù)制一次。對(duì)于噬菌體來說，復(fù)制可以在裂解期主動(dòng)發(fā)生或者在 溶源期被動(dòng)發(fā)生。表達(dá)載體是可以通過限制性酶切和連接而將靶DNA序列插入其中的載體，其可與 調(diào)控序列可操作性地連接并可表達(dá)為RNA轉(zhuǎn)錄物。載體還可以包含適于對(duì)已經(jīng)或未經(jīng)載體 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行鑒定的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記序列。標(biāo)記包括例如編碼提高或降低對(duì)抗生 素或其他化合物敏感性之蛋白的基因、編碼其活性可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法來 檢測(cè)之酶(例如半乳糖苷酶、螢光素酶或堿性磷酸酶)的基因，以及視覺影響被轉(zhuǎn)化或 被轉(zhuǎn)染細(xì)胞、宿主、菌落或者噬菌斑之表型(例如綠色熒光蛋白)的基因。優(yōu)選的載體是能 夠自主復(fù)制并表達(dá)其所可操作連接的DNA片段中存在的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的那些載體。當(dāng)編碼序列和調(diào)控序列通過共價(jià)連接而使得編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄受調(diào)控序列 的影響或控制時(shí)，其在本文中稱為“可操作性地”連接。如果需要將編碼序列翻譯成功能性 蛋白，則當(dāng)5’調(diào)控序列中啟動(dòng)子的誘導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄并且當(dāng)兩個(gè)DNA序列間的連接并不會(huì) ⑴導(dǎo)致引入移碼突變，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)域指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾相應(yīng)RNA 轉(zhuǎn)錄子翻譯成蛋白質(zhì)的能力時(shí)，那么這兩個(gè)DNA序列稱為可操作性地連接。因此，如果啟動(dòng) 子區(qū)域能夠?qū)崿F(xiàn)DNA序列的轉(zhuǎn)錄并使得所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成靶蛋白或多肽，則啟動(dòng) 子區(qū)域即與編碼序列可操作性地連接。當(dāng)編碼本發(fā)明所要求保護(hù)的任何酶的核酸分子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，可使用多種轉(zhuǎn)錄 控制序列(例如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列)來指導(dǎo)其表達(dá)。所述啟動(dòng)子可以是天然啟動(dòng)子，即 內(nèi)源表達(dá)基因的啟動(dòng)子，其可正常調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子可以是 組成型的，即啟動(dòng)子不受調(diào)控而允許其相關(guān)基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄。也可以使用多種條件型啟動(dòng)子， 例如受到分子之存在或缺失調(diào)控的啟動(dòng)子?；虮磉_(dá)所需調(diào)控序列的精確性質(zhì)可因物種或細(xì)胞類型而不同，但一般來說將包括(如需要)分別參與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄序列和5’非翻譯序列，例如TATA框、 加帽序列、CAAT序列等。特別地，所述5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括啟動(dòng)子區(qū)域，其包含對(duì)所述 可操作性連接基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。根據(jù)需要，調(diào)控序列還可包含增強(qiáng)子序列 或上游活化序列。本發(fā)明的載體可任選地包含5’前導(dǎo)序列或信號(hào)序列。適宜載體的選擇 和設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判斷范圍內(nèi)。包含所有表達(dá)必需元件的表達(dá)載體是市售且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通過將異源DNA (RNA)導(dǎo)入細(xì)胞中來對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行遺 傳改造。該異源DNA (RNA)處于轉(zhuǎn)錄元件的可操作控制下，以允許其在宿主細(xì)胞中表達(dá)。實(shí) 施例部分描述了利用大腸桿菌產(chǎn)生葡糖二酸之新途徑的異源表達(dá)。葡糖二酸產(chǎn)生的新途徑 也可以表達(dá)于其他細(xì)菌細(xì)胞、古細(xì)菌細(xì)胞、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等中。在一些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的兩種或更多種核酸克隆到同一表達(dá)載體或質(zhì)粒 中。如實(shí)施例部分所述，在一些實(shí)施方案中，將INOl基因和MIOX基因克隆到同一質(zhì)粒(例 如pRSFD質(zhì)粒)中?？梢岳帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和技術(shù)，將編碼用于產(chǎn)生葡糖二酸之任何酶的一種或 多種核酸分子引入細(xì)胞中。例如，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方案例如轉(zhuǎn)化(包括化學(xué)轉(zhuǎn)化和電穿孔)、 轉(zhuǎn)導(dǎo)、粒子轟擊等將核酸分子引入。還可以通過將核酸分子整合到基因組中而實(shí)現(xiàn)編碼用 于產(chǎn)生葡糖二酸之酶的基因表達(dá)?？梢岳帽绢I(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將核酸分子整合到 細(xì)胞基因組DNA中。在一些實(shí)施方案中，與本發(fā)明相關(guān)的酶重組表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞中?？蓪⒈景l(fā)明的細(xì) 菌細(xì)胞在任何類型(豐富型或基礎(chǔ)型)和組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)施例1提供了一種實(shí)施 方案，其中發(fā)現(xiàn)添加了葡萄糖并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的豐富培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，BD Biosciences ； San Jose,CA)是最佳的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通過常規(guī)優(yōu)化允許使用其他類型 的培養(yǎng)基(包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。所選擇的培養(yǎng)基可以添加多種附加組分。 類似地，還可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的其他方面和生長條件進(jìn)行優(yōu)化。例如，可優(yōu)化之因 素的非限定性實(shí)例有PH值和溫度。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，用于培養(yǎng)細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可 以放置于本領(lǐng)域已知并使用的任何培養(yǎng)容器中。本發(fā)明的一些方面包括對(duì)細(xì)胞內(nèi)葡糖二酸的生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化的策略。葡糖二酸的經(jīng) 優(yōu)化生產(chǎn)是指采取優(yōu)化策略與未采取所述策略相比產(chǎn)生更多量的葡糖二酸。一種策略是通 過選擇合適的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)來優(yōu)化肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和/或糖醛 酸脫氫酸的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，其可以包括選擇和使用高拷貝數(shù)的質(zhì)粒、或者低 拷貝數(shù)或中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。還可以通過引入或消除某些結(jié)構(gòu)(例如莖環(huán)結(jié)構(gòu))來靶向轉(zhuǎn) 錄終止步驟，以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，利用之前為產(chǎn)生葡糖二酸已經(jīng)過優(yōu)化的細(xì)胞可以是有利的。 例如，在產(chǎn)生葡糖二酸之前使細(xì)胞內(nèi)葡糖二酸代謝途徑中的一種或多種組分突變可以是最 佳的，以使細(xì)胞不消耗所產(chǎn)生的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，可以通過隨機(jī)突變篩選或者通過 篩選已知的突變，對(duì)引起葡糖二酸產(chǎn)生增加的突變進(jìn)行篩選。在一些實(shí)施方案中，可以通過 對(duì)具有使葡糖二酸產(chǎn)生增加之片段的細(xì)胞或有機(jī)體進(jìn)行篩選，對(duì)其基因組片段進(jìn)行鳥槍法 克隆，來鑒定引起葡糖二酸產(chǎn)生增加的基因組區(qū)域。在某些情況下，可在同一細(xì)胞或有機(jī)體中將一個(gè)或多個(gè)突變進(jìn)行組合。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)化可能還需要在引入細(xì)胞前對(duì)編碼與本發(fā) 明相關(guān)之酶的基因進(jìn)行修飾，例如通過密碼子優(yōu)化用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)?？梢栽贑odon Usage Database因特網(wǎng)站點(diǎn)獲得多種有機(jī)體的密碼子使用偏好。例如，本發(fā)明包括為在大 腸桿菌中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成的小鼠MIOX基因。在一些實(shí)施方案中，可以利用蛋白質(zhì)工程對(duì)與本發(fā)明相關(guān)之一種或多種酶的表達(dá) 或活性進(jìn)行優(yōu)化。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)工程方法可以包括測(cè)定酶的三維(3D)結(jié)構(gòu)， 或者基于其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)而構(gòu)建出3D同源物模型?；?D模型，可以構(gòu)建酶中的突變 并將其導(dǎo)入細(xì)胞或有機(jī)體中，隨后可篩選葡糖二酸產(chǎn)生增加的細(xì)胞或有機(jī)體。在一些實(shí)施 方案中，可以通過操作與本發(fā)明相關(guān)酶在相同途徑中作用的酶來增加細(xì)胞內(nèi)葡糖二酸的產(chǎn) 生。例如，在一些實(shí)施方案中，增加作用于與本發(fā)明相關(guān)之酶上游的酶或其他因子的表達(dá)可 以是有利的。這可以通過使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法使上游因子過量表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及糖醛酸脫氫酶多肽、編碼這些多肽的基因、其功能性 修飾和變體以及其相關(guān)用途。可以通過常規(guī)技術(shù)鑒定本發(fā)明之糖醛酸脫氫酶核酸的同源基 因和等位基因。本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下與本文中所述的糖醛酸脫氫酶核酸雜交的核 酸。本文中所用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指本領(lǐng)域所熟知的參數(shù)。核酸雜交參數(shù)可以從記載所 述方法的參考文獻(xiàn)中找到，例如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al. ， eds. ， Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989 或 Current Protocols in Molecualr Biology, F. M. Ausubel, et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York。更具體地，本文中所用的嚴(yán)格條件是指 例如在雜交緩沖液(3. 5XSSC,0. 02% Ficoll,0. 02%聚乙烯吡咯烷酮，0. 02%牛血清白蛋 白，2. 5mM NaH2PO4 (pH7), 0. 5 % SDS, 2mM EDTA)中于 65°C 雜交。SSC 是 0. 15M 氯化鈉/0. 015M 檸檬酸鈉，PH7 ；SDS是十二烷基硫酸鈉；EDTA是乙二胺四乙酸。雜交后，在室溫下用2 X SSC 隨后在高達(dá)68°C下用0. 1-0. 5XSSC/0. IX SDS清洗轉(zhuǎn)移有DNA的膜。還可以使用在嚴(yán)格程度方面類似的其他條件或試劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些 條件，因此這里未將其列出。但是應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠控制這些條件，以使得可 以清楚鑒定本發(fā)明之糖醛酸脫氫酶核酸的同源基因和等位基因(例如，利用嚴(yán)格程度較低 的條件)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還熟悉篩選表達(dá)所述分子之細(xì)胞和文庫以及隨后將其常規(guī)分離， 然后分離相關(guān)核酸分子并測(cè)序的方法。一般來說，同源基因和等位基因通常與糖醛酸脫氫酶的核酸和多肽序列分別具有 至少75 %的核苷酸一致性和/或至少90 %的氨基酸一致性，在某些情形下，其具有至少 90%的核苷酸一致性和/或至少95%的氨基酸一致性，在另一些情形下，其具有至少95% 的核苷酸一致性和/或至少99%的氨基酸一致性?？梢岳肗CBI (Bethesda,Maryland)研 發(fā)的多種公眾可獲得的軟件工具計(jì)算同源性，所述工具可以在NCBI因特網(wǎng)站點(diǎn)上獲得。示 例性的工具包括BLAST軟件，其也可在NCBI因特網(wǎng)站點(diǎn)(www, ncbi. him, nih. rov)上獲得。 可以利用MacVector序列分析軟件(Oxford Molecular Group)進(jìn)行Pairewise和ClustalW 比對(duì)(BL0SUM30 matrix setting)以及Kyte-Doolittle親水性分析。本發(fā)明還包括上述 核酸的Watson-Crick互補(bǔ)序列。在篩選糖醛酸脫氫酶基因時(shí)，可以應(yīng)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，例如Southern印跡法、Northern印跡法以及擴(kuò)增方案，例如利用與所述序列雜交的引物進(jìn)行的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。本發(fā)明還包括簡(jiǎn)并核酸，其包含天然物質(zhì)中所存在密碼子的替代密碼子。例如，絲 氨酸殘基由密碼子TCA、AGT、TCC、TCG、TCT和AGC編碼，這六個(gè)密碼子中的每個(gè)在編碼絲氨 酸殘基的目的上是等效的。因此本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，任何編碼絲氨酸的三聯(lián)核 苷酸均可用于在體內(nèi)或者體外指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成體系，以將絲氨酸殘基加入至正在延伸的糖 醛酸脫氫酶多肽中。類似地，編碼其他氨基酸殘基的三聯(lián)核苷酸序列包括但不限于CCA、 CCC、CCG 和 CCT (脯氨酸密碼子)；CGA、CGC、CGG、CGT、AGA 和 AGG (精氨酸密碼子)；ACA、ACC、 ACG和ACT (蘇氨酸密碼子)；AAC和AAT (天門冬酰胺密碼子)；以及ATA、ATC和ATT (異亮 氨酸密碼子)。類似地，其他氨基酸殘基也可以由多種核苷酸序列編碼。因此，本發(fā)明包括 由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而使其密碼子序列不同于生物學(xué)分離之核酸的簡(jiǎn)并核酸。本發(fā)明還 包括對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化以使其與宿主細(xì)胞最佳的密碼子使用相適合。本發(fā)明還提供了經(jīng)修飾的核酸分子，其包括一種或多種核苷酸的添加、替代和缺 失。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些經(jīng)修飾的核酸分子和/或其所編碼的多肽保留了未經(jīng) 修飾之核酸分子和/或多肽的至少一種活性或功能，例如糖醛酸脫氫酶的酶活性。在某些 實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的核酸分子編碼經(jīng)修飾的多肽，優(yōu)選編碼本文中另外描述的具有 保守氨基酸替代的多肽。所述經(jīng)修飾的核酸分子與未經(jīng)修飾的核酸分子在結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)， 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的核酸分子與未經(jīng)修飾的核酸分子在結(jié)構(gòu)上高度關(guān) 聯(lián)，使得經(jīng)修飾的和未經(jīng)修飾的核酸分子能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的嚴(yán)格條件下雜交。例如，可制備編碼具有單個(gè)氨基酸變化之多肽的經(jīng)修飾的核酸分子。除對(duì)應(yīng)于本 文中所述遺傳密碼簡(jiǎn)并性的核苷酸變化之外，每個(gè)這些核酸分子都可以具有1個(gè)、2個(gè)或3 個(gè)核苷酸替代。同樣地，可以制備編碼具有2個(gè)氨基酸變化之多肽的經(jīng)修飾的核酸分子，其 具有例如2-6個(gè)核苷酸變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地預(yù)期大量類似這樣的經(jīng)修飾的核 酸分子，包括例如編碼氨基酸2和3、2和4、2和5、2和6等密碼子中核苷酸的替代。在上 述實(shí)施例中，每2個(gè)氨基酸的組合包含在一組經(jīng)修飾的核酸分子中，編碼氨基酸替代的所 有核苷酸替代亦是如此。還可以制備編碼具有附加替代(例如3個(gè)或更多)、添加或缺失 (例如通過引入終止密碼子或者剪切位點(diǎn))之多肽的附加核酸分子，而且本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員可以容易地預(yù)期其也包括于本發(fā)明中?？梢酝ㄟ^常規(guī)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述任一核酸分子或多肽 與本文中所公開之核酸和/或多肽的結(jié)構(gòu)關(guān)系或活性之保留進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供了由上述糖醛酸脫氫酶核酸所編碼的分離的多肽。所述多肽(例如 單獨(dú)或者作為融合蛋白)可用于在體內(nèi)或者體外將葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸。糖醛酸脫氫 酶多肽可以自生物樣品(包括組織或者細(xì)胞勻漿)分離，并且可以通過構(gòu)建適于表達(dá)系統(tǒng) 的表達(dá)載體、將所述表達(dá)載體引入表達(dá)系統(tǒng)以及分離重組表達(dá)的蛋白來重組表達(dá)于多種原 核或真核表達(dá)系統(tǒng)中。還可以利用肽合成的公認(rèn)方法化學(xué)合成多肽。本發(fā)明包括上述糖醛酸脫氫酶的變體。本文中所用糖醛酸脫氫酶的“變體”是包含 糖醛酸脫氫酶多肽之一級(jí)氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)修飾的多肽?？梢詫?duì)糖醛酸脫氫酶多肽 進(jìn)行產(chǎn)生糖醛酸脫氫酶變體的修飾，以便1)降低或消除糖醛酸脫氫酶多肽的活性；幻增強(qiáng) 糖醛酸脫氫酶多肽的特性，例如將葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸的能力或表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的 穩(wěn)定性或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性；3)為糖醛酸脫氫酶多肽提供新的活性或特性，例如添加抗原表位或者添加可檢測(cè)的部分；或者4)使糖醛酸脫氫酶分子與另一分子(例如酶 促底物)同等地或更好地結(jié)合。通常，對(duì)糖醛酸脫氫酶多肽的修飾通過針對(duì)修飾編碼糖醛 酸脫氫酶多肽的核酸進(jìn)行，其可以包括缺失、點(diǎn)突變、截短、氨基酸替代以及氨基酸或非氨 基酸部分的添加?；蛘撸梢灾苯訉?duì)多肽進(jìn)行修飾，例如通過剪切、添加連接物分子、添加可 檢測(cè)部分(例如生物素)、添加脂肪酸等。修飾還包括包含所有或部分糖醛酸脫氫酶氨基酸 序列的融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)序列變化對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象之影響的方 法，因此可根據(jù)已知方法“設(shè)計(jì)”糖醛酸脫氫酶多肽變體。所述方法的一個(gè)實(shí)例由Dahiyat 和Mayo描述于kience 278 :82_87，1997，通過該方法可以重新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)。該方法可以應(yīng) 用于已知蛋白質(zhì)，用于改變多肽序列的僅一部分。通過應(yīng)用Dahiyat和Mayo的計(jì)算方法， 可以提出糖醛酸脫氫酶多肽的特定變體并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，以確定該變體是否保留所期望的 構(gòu)象。一般來說，變體包括經(jīng)特異性修飾的糖醛酸脫氫酶多肽，以改變與所述多肽的期 望生理活性無關(guān)的性質(zhì)。例如，半胱氨酸殘基可被替代或缺失，以防止不期望的二硫鍵。類 似地，可以使某些氨基酸改變，從而通過消除表達(dá)系統(tǒng)中蛋白酶(例如存在KEX2蛋白酶活 性之酵母表達(dá)系統(tǒng)中的雙堿性氨基酸殘基)的蛋白水解作用來增強(qiáng)糖醛酸脫氫酶多肽的 表達(dá)。編碼糖醛酸脫氫酶多肽之核酸的突變優(yōu)選保留編碼序列的氨基酸讀碼框，并且優(yōu) 選在核酸中不產(chǎn)生可能雜交形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如發(fā)卡或環(huán)，其可對(duì)變體多肽的表達(dá)有不利 影響)的區(qū)域?？梢酝ㄟ^選擇氨基酸替代或者使編碼多肽之核酸的選定位點(diǎn)隨機(jī)突變來進(jìn)行突 變。隨后表達(dá)多肽變體并檢測(cè)其一種或多種活性，以確定哪個(gè)突變使多肽變體具有所期望 的特性?？梢詫?duì)變體(或非變體糖醛酸脫氫酶多肽)進(jìn)行進(jìn)一步突變，所述突變對(duì)多肽的氨 基酸序列是沉默的，但是提供用于在特定宿主中進(jìn)行翻譯的優(yōu)選密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員熟知使核酸在例如大腸桿菌中翻譯的優(yōu)選密碼子。還可以對(duì)糖醛酸脫氫酶基因或cDNA 克隆進(jìn)行其他突變，用于增強(qiáng)多肽的表達(dá)。如本文中所述，可以通過如下步驟對(duì)糖醛酸脫氫 酶多肽變體的活性進(jìn)行檢測(cè)將編碼糖醛酸脫氫酶多肽變體的基因克隆到細(xì)菌或哺乳動(dòng)物 表達(dá)載體中，將所述載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，表達(dá)所述變體糖醛酸脫氫酶多肽，以及檢 測(cè)所述糖醛酸脫氫酶多肽的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)糖醛酸脫氫酶多肽進(jìn)行保守性氨基酸替 代，以提供上述多肽的功能等效變體，例如所述變體保留糖醛酸脫氫酶多肽的功能。本文中 所用的“保守性氨基酸替代”指不會(huì)使發(fā)生氨基酸替代之蛋白的相對(duì)電荷或大小特性發(fā)生 改變的氨基酸替代。可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于改變多肽序列的方法制備變 體，例如可以從記載所述方法的參考文獻(xiàn)中找到，例如Molecular Cloning =A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al.，eds.，Second Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989 或 Current Protocols in Molecualr Biology，F(xiàn). M. Ausubel，et al. ,eds. ,John ffiley&Sons, Inc. ,New York。糖醛酸脫氫酶多 肽的示例性功能等效變體包括本文中所公開蛋白質(zhì)之氨基酸序列中的保守氨基酸替代。氨 基酸的保守替代包括發(fā)生在下列組內(nèi)氨基酸之間的替代(a)M，I，L，V ； (b)F，Y，W ； (c)K, R， H;(d)A，G;(e)S，T ;(f)Q，N;和(g)E，D。
一般來說，制備變體多肽時(shí)優(yōu)選并非所有的氨基酸都發(fā)生變化。如果已知特定的 氨基酸具有某功能，則不將此氨基酸替代，或者，進(jìn)行保守性氨基酸替代。制備變體多肽時(shí)， 優(yōu)選 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個(gè)殘基可發(fā)生變化。通常 優(yōu)選發(fā)生最少數(shù)量的替代。因此，產(chǎn)生變體多肽的一種方法是將所有其余的氨基酸替代為 特定的單個(gè)氨基酸，隨后測(cè)定該變體的活性，然后對(duì)具有最佳活性的所述多肽中的一種或 多種重復(fù)上述步驟。通常，通過改變編碼糖醛酸脫氫酶多肽的核酸來使糖醛酸脫氫酶多肽的氨基酸序 列發(fā)生保守性氨基酸替代，以產(chǎn)生糖醛酸脫氫酶多肽的功能等效變體。可以通過本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知的多種方法來進(jìn)行所述替代。例如，可以依照Kimkel的方法(Kimtel， Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 82 =488-492,1985)通過PCR介導(dǎo)性突變、定點(diǎn)突變或通過化學(xué) 合成編碼糖醛酸脫氫酶多肽的基因來進(jìn)行氨基酸替代。本文中所述的發(fā)明具有多種用途，其中一些在本文中另有描述。首先，本發(fā)明使得 可以分離糖醛酸脫氫酶蛋白分子?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種方法獲得分離 的糖醛酸脫氫酶分子。可以通過色譜法或免疫識(shí)別法從天然產(chǎn)生多肽的細(xì)胞中純化該多 肽?；蛘撸梢詫⒈磉_(dá)載體引入細(xì)胞以產(chǎn)生多肽。在另一種方法中，可以將mRNA轉(zhuǎn)錄子微 注射或通過其他方法引入細(xì)胞中，以產(chǎn)生所編碼多肽。還可以使用mRNA在無細(xì)胞的提取物 (例如網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物系統(tǒng))中翻譯以產(chǎn)生多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以容易地依照已知 方法分離糖醛酸脫氫酶多肽。所述方法包括但不限于免疫層析、HPLC、體積排阻色譜、離子 交換色譜和免疫吸附色譜?？梢岳帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法測(cè)定本發(fā)明之分子的表達(dá)。這些 方法包括但不限于直接的RNA擴(kuò)增、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA、實(shí)時(shí)RT_PCR、cDNA擴(kuò)增、雜交，以 及基于免疫學(xué)的測(cè)定方法，其包括但不限于免疫組化、抗體夾心捕獲法、ELISA和酶聯(lián)免疫 斑點(diǎn)測(cè)定(EliSpot測(cè)定)。例如，可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測(cè)方法測(cè)定本發(fā)明之核酸分子 在個(gè)體或組織中的存在水平，所述方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者利用標(biāo)記雜交探針進(jìn)行測(cè) 定。所述雜交方法包括但不限于微陣列技術(shù)。本發(fā)明還提供了糖醛酸脫氫酶(Udh)的抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與和 SEQ ID NO :2具有至少95%氨基酸一致性的多肽相結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與 由與SEQ ID NO :1具有至少95%核苷酸一致性的核酸分子所編碼的多肽相結(jié)合。在一些 實(shí)施方案中，所述抗體與和SEQ ID NO : 具有至少95%氨基酸一致性的多肽相結(jié)合。在 一些實(shí)施方案中，所述抗體與由與SEQ ID NO :23具有至少95%核苷酸一致性的核酸分子 所編碼的多肽相結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與和SEQID NO J6具有至少95%氨基酸一致性的多肽相結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述抗 體與由與SEQ ID NO :25具有至少95%核苷酸一致性的核酸分子所編碼的多肽相結(jié)合。本發(fā)明的抗體可以通過多種方法來制備，包括將蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、表達(dá)蛋白 質(zhì)或其片段等的細(xì)胞施用給動(dòng)物體以產(chǎn)生多克隆抗體。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生Udh單克隆 抗體的方法。單克隆抗體的產(chǎn)生依照本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)進(jìn)行。本領(lǐng)域中眾所周知， 僅抗體分子的一小部分(即互補(bǔ)位(paratope))參與了抗體與其抗原表位的結(jié)合(一般 參見 Clark，W. R.，1986，The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons，Inc.，New York，；Roitt，I.，1991，Essential Immunology,7th Ed.，BlackwellScientific Publications, Oxford)。例如pFc，和Fc區(qū)域是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的效應(yīng)器， 但并不參與抗原結(jié)合。已通過酶切去掉pFc’區(qū)域的抗體或者無pFc’區(qū)域的抗體被稱為 F(ab’)2片段，其保留了完整抗體的全部2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。類似地，已通過酶切去掉Fc區(qū) 域的抗體或者無Fc區(qū)域的抗體被稱為Fab片段，其保留了完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之一。 Fab片段由共價(jià)結(jié)合的抗體輕鏈和被稱為Fd的抗體重鏈之一部分組成。所述Fd片段是抗 體特異性的主要決定因素(單一的Fd片段可以與10個(gè)不同的輕鏈相關(guān)聯(lián)而不改變其抗體 特異性)而且Fd片段在分離時(shí)保留抗原表位結(jié)合能力。本領(lǐng)域眾所周知，抗體的抗原結(jié)合部分中存在直接與抗原表位相結(jié)合的補(bǔ)體決定 區(qū)(CDRs)和保留了互補(bǔ)位三級(jí)結(jié)構(gòu)的骨架區(qū)(FR)(—般參見Clark，1986 ；Roitt，1991)。 IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈中均存在4個(gè)骨架區(qū)(FRl至FR4)，其分別被3個(gè)補(bǔ) 體決定區(qū)(⑶Rl至⑶R3)所分隔開。⑶R，特別是⑶R3區(qū)，更特別地是重鏈⑶R3，主要負(fù)責(zé) 抗體特異性。本領(lǐng)域眾所周知，哺乳動(dòng)物抗體的非CDR區(qū)可被非特異性或異種特異性抗體的相 似區(qū)域取代，同時(shí)保留原始抗體的抗原表位特異性。這最明顯地表現(xiàn)在“人源化”抗體的開 發(fā)與利用中，所述抗體中非人CDR共價(jià)結(jié)合于人FR和/或Fc/pFc’區(qū)域，以產(chǎn)生功能性抗 體。例如參見美國專利 4，816，567,5, 225，539,5, 585，089,5, 693，762 和 5，859，205。還可 以通過對(duì)經(jīng)人免疫球蛋白重鏈和輕鏈位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因的小鼠進(jìn)行免疫來制備完全人單克隆抗 體。在將這些小鼠(例如 XenoMouse (Abgenix)、HuMab 小鼠(Medarex/GenPharm))免疫后， 可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。這些單克隆抗體具有人免疫球蛋白的氨基酸序 列，并因此在施用給人時(shí)不會(huì)激發(fā)人抗鼠的抗體(HAMA)應(yīng)答。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 清楚，本發(fā)明還提供了 F(ab，)2、Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗體，其中Fc和/或FR和/或 CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域被同源的人或非人序列所取代；嵌合F(ab’)2片段 抗體，其中!7C和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域被同源的人或非人 序列所取代；嵌合Fab片段抗體，其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域被 同源的人或非人序列所取代；以及嵌合Fd片段抗體，其中FR和/或CDRl和/或CDR2區(qū)域 被同源的人或非人序列所取代。本發(fā)明還包括所謂的單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域抗體和重鏈抗體。應(yīng)當(dāng)理解，編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇-1-磷酸合酶和肌醇加氧酶的基因可以從多 種來源獲得。在本文所述實(shí)施例部分所描述的實(shí)施方案中，肌醇-ι-磷酸合酶由釀酒酵母 基因(INOl)編碼，肌醇加氧酶由小鼠基因(MIOX)編碼，糖醛酸脫氫酶由丁香假單胞菌、惡 臭假單胞菌或根瘤農(nóng)桿菌基因(udh)編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，可以通過同源檢索 鑒定出這些酶在許多物種中的同源基因，例如通過NCBI因特網(wǎng)站點(diǎn)(www.ncbi.nlm.nih. gov)的蛋白質(zhì)BLAST檢索。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，編碼這些酶的基因可以從含有 所述給定酶之任何來源的DNA中PCR擴(kuò)增得到，例如利用退火引物。在某些實(shí)施方案中，所 述編碼給定酶的基因可以是合成的。獲得編碼本文中所述酶之基因的任何方法均適于構(gòu)建 本發(fā)明的途徑。
實(shí)施例實(shí)施例1 葡糖二酸的產(chǎn)生重組大腸桿菌中的生物合成途徑已經(jīng)在大腸桿菌中構(gòu)建了由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸的合成途徑(圖1)。編碼釀酒酵母肌醇-1-磷酸合酶(Inol)和小鼠肌醇加氧酶(MIOX)之基因的共表達(dá)使得通 過中間體肌醇而產(chǎn)生葡糖醛酸。在培養(yǎng)液中測(cè)定高達(dá)0.3g/L的葡糖醛酸濃度。MIOX的活 性是限速步驟，其導(dǎo)致肌醇和葡糖醛酸均作為終產(chǎn)物積累，其濃度大致相同。第三種酶即丁 香假單胞菌糖醛酸脫氫酶(Udh)的加入促使葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸。該重組酶的活性比 ^ol和MIOX的高出超過2個(gè)數(shù)量級(jí)并且增加了通過所述途徑的整體流量，使得觀察到葡糖 二酸的濃度超過了 lg/L。這代表了一種用于由生物質(zhì)生物產(chǎn)生葡糖二酸(一種“高附加值 化學(xué)品”)的新型微生物系統(tǒng)。材料與方法菌株、培養(yǎng)基和質(zhì)粒大腸桿菌菌株DHlOB[F-mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ801βοΖΔΜ15 Δ lacX74 recAl endAl araA 139 Δ (ara，leu) 7697 galU galK λ -rpsL (StrE) nupG]用于所 有的分子生物學(xué)操作。將 DHlOB 和 BL21 Star (DE3) [ΓοπιρΤ hsdSB (rB"mB0 gal dcm rnel31(DE3)]用作宿主用于產(chǎn)生有機(jī)酸。這兩種菌株的感受態(tài)細(xì)胞購自hvitrogen Corporation (Carlsbad, CA) 培養(yǎng)物在LB或M9培養(yǎng)基中繁殖。LB(Miller)培養(yǎng)基依照生 產(chǎn)商(BD Biosciences, San Jose, CA)的說明由脫水粉末制備。M9如前所述(32)制備，其由 1XM9 鹽(12. 8g/L Na2HPO4 ·7Η20,3δ/ KH2PO4,0. 5/L NaCl, lg/L NH4Cl)、2mM MgS04、0. ImM CaCl2和10g/L(l% )葡萄糖組成。向DHlOB中加入終濃度為105 μ g/mL的亮氨酸。當(dāng)需 要為質(zhì)粒保持提供選擇壓力時(shí)，加入終濃度為20μ g/mL的卡那霉素和終濃度為100μ g/mL 的氨芐青霉素。所有的分子生物學(xué)操作均依照標(biāo)準(zhǔn)做法(3 進(jìn)行。編碼肌醇-1-磷酸合酶(Inol， 也稱為MIPS)的INOl基因利用下述引物從釀酒酵母的基因組DNA制備物中經(jīng)PCR擴(kuò)增得 到正向-5，-GAATTCATGACAGAAGATAATATTGCTC-3‘ (SEQ ID NO 3)；反向-5，-AAGCTTCTACA ACAATCTCTCTTCG-3，(SEQ ID NO 4)。引物 5，端的 EcoRI 和 HindIII 限制性位點(diǎn)以下劃線 標(biāo)出。編碼肌醇加氧酶的小鼠MIOX基因是合成的，其在GeneBank登錄號(hào)為AF197127的基 礎(chǔ)上由DNA 2. O (Menlo Park, CA)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)。858個(gè)核苷酸 086個(gè)密碼子)序列的優(yōu)化由廠商進(jìn)行，其結(jié)果歸納如下19. 2%的核苷酸發(fā)生了變化，對(duì) 286個(gè)密碼子中的153個(gè)(53. 5% )有影響。在經(jīng)優(yōu)化的密碼子中，144個(gè)(94. 1% )僅在第 3個(gè)核苷酸的位置發(fā)生了變化。在密碼子中有3個(gè)密碼子的所有3個(gè)核苷酸均發(fā)生了變化。 經(jīng)合成的基因以質(zhì)粒ρJ2-MI0X接收?；虻?’端和3’端分別含有EcoRI和Hindi11限制性 位點(diǎn)。圖4顯示了小鼠MIOX基因與其經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)的合成物之間的序 列比對(duì)。兩個(gè)基因均亞克隆到IPTG誘導(dǎo)的質(zhì)粒PMMB206Q5)和pTrc99A(2)中，以證實(shí)其所 表達(dá)之酶的活性。所得到的質(zhì)粒命名為PMMB-INNOljjTrc-INOl、ρΜΜΒ-ΜΙ0Χ和ρ χ-ΜΙΟΧ。 為了共表達(dá)這兩個(gè)基因，使用包含兩個(gè)Τ7啟動(dòng)子的pRSFDuet-1載體(來自Novagen) (Gibbstown, NJ)。IN0S1基因通過EcoRI和HindIII位點(diǎn)亞克隆到第一位置，產(chǎn)生質(zhì)粒 pRSFD-IN。為了將MIOX基因引入到第二位置，在用EcoRI消化前利用Klenow酶將pJ2_MI0X 的HindIII位點(diǎn)進(jìn)行末端補(bǔ)平。在與MIOX基因片段連接前，首先將pRSFD-IN用B10I消化 并末端補(bǔ)平，隨后用與EcoRI相容的MfeI消化。所得到的質(zhì)粒命名為pRSFD-IN-MI。實(shí)施 例2中描述了編碼丁香假單胞菌糖醛酸脫氫酶之udh基因(GenBank登錄號(hào)EU377538)的 分離。將丁香假單胞菌udh基因亞克隆到pTrc99A中，以產(chǎn)生所述的pT1053G0)(下文中稱為 PiTrc-Udh)。MIPS (INOl)、MIOS和UDH活性的酶活測(cè)定IN01、MIOX和udh基因的功能性表達(dá)通過體外酶活測(cè)定進(jìn)行證實(shí)。首先用 100-200 μ L含有l(wèi)mg/mL溶菌酶的IOmM Tris-Cl (pH 8. 0)將l_2mL培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重 懸，以制備粗裂解物。通過交替利用液氮冷凍和30-40°C水浴融化的5個(gè)循環(huán)將細(xì)胞溶液裂 解。所得到的溶液以14，OOOrpm于4°C離心15分鐘，以去除不溶物。裂解物的全蛋白濃度 用 Bradford 法(11)測(cè)定。如前所述(1，6)測(cè)定了肌醇-1-磷酸合酶的活性。簡(jiǎn)而言之，將葡萄糖-6-磷酸 底物在由 50mM Tris-乙酸(pH 7. 5)、0. 8mM NAD+、14mM NH4Cl、5mM 疏基乙醇和 5mM 葡萄 糖-6-磷酸組成的反應(yīng)緩沖液中轉(zhuǎn)化成肌醇-1-磷酸。加入裂解物后開始反應(yīng)，并于37°C 孵育1小時(shí)。加入0.4倍體積的20%三氯乙酸使反應(yīng)終止。為了對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，通過 用等體積的0.2M NaIO4進(jìn)行氧化來除去肌醇-1-磷酸中的無機(jī)磷酸鹽。加入等體積的IM Na2SO3以去除多余的高碘酸鹽。設(shè)立沒有葡萄糖-6-磷酸和未加入高碘酸鹽的對(duì)照反應(yīng)。如前所述0，30，31)測(cè)定了肌醇加氧酶的活性。反應(yīng)緩沖液由50mM Tris-Cl (pH 8.0)、2mM L-半胱氨酸、ImM Fe (NH4) 2 (SO4) 2和60mM肌醇組成。將樣品在無底物的情況下 于30°C預(yù)孵育10分鐘，以活化MIOX酶。反應(yīng)于30°C預(yù)孵育1小時(shí)，隨后加入1/10體積的 30%三氯乙酸使反應(yīng)終止。所產(chǎn)生的葡糖二酸用苔黑酚試劑進(jìn)行定量(1 。該試劑由在 IOmL濃HCl (含有5. 4mg FeCl3)中的40mg苔黑酚組成。將1體積的樣品與2體積的苔黑 酚試劑混合并在沸水浴中孵育30分鐘。冷卻至室溫后，測(cè)量670nm下的吸光度以測(cè)定葡糖 二酸的濃度。設(shè)立無肌醇的對(duì)照反應(yīng)以表示背景。如前所述(35，40)，通過在340nm下監(jiān)測(cè)NADH輔助因子的產(chǎn)生，對(duì)糖醛酸脫氫酶 的活性進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)混合物含有IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH 8. 0)、2. 5mM葡糖醛酸、0. 9mM NAD+和如上所述制備的細(xì)菌裂解液。產(chǎn)酸的生長條件如“結(jié)果”部分所述，培養(yǎng)物在添加了 10g/L葡萄糖并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的LB培養(yǎng)基中 生長。在LB培養(yǎng)基中制備接種物，并將或2% (ν/ν)接種于含有50或IOOmL培養(yǎng)基的 250-mL帶擋板的燒瓶中。將培養(yǎng)物在30°C下以250rpm孵育，定期取樣，以測(cè)定培養(yǎng)基中的 細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度。有機(jī)酸的檢測(cè)和定量代謝物(包括葡糖醛酸和葡糖二酸)通過高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定量。對(duì)于 葡糖二酸的測(cè)定而言，如前所述( ，40)將樣品預(yù)處理，以使葡糖二酸與其他代謝物(包括 葡糖醛酸)分離。簡(jiǎn)而言之，將對(duì)葡糖二酸中存在的共面相鄰順式羥基基團(tuán)具有親和力的 硼酸親和凝膠(Affi-gel boronate gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) (28)與樣 品混合，并用SOmM磷酸鉀_20mM硼酸緩沖液(pH 7. 0)清洗。用0. IM鹽酸洗脫葡糖二酸。加 入10M NaOH中和洗脫液，隨后通過HPLC分析。利用配有Aminex HPX-87H柱(300mmX7. 8mm, Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)以及折光系數(shù)和二極管陣列檢測(cè)儀的Agilent 1100 系列設(shè)備在如下條件下進(jìn)行HPLC分析流動(dòng)相，水中的5mM硫酸；流速，0. 5mL/分鐘；注入 體積，50 μ L ；溫度，55V ；UV 波長，210nm。MM
重組hoi和MIOX活性的驗(yàn)證之前已報(bào)道利用釀酒酵母肌醇-1-磷酸合酶(Inol)通過大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生高濃 度的肌醇(1 。在高細(xì)胞密度下補(bǔ)料分批發(fā)酵M小時(shí)獲得了效價(jià)高達(dá)21g/L的產(chǎn)物。為 了確定搖瓶中^ol的情況，將相應(yīng)基因擴(kuò)增，插入相容性載體中，隨后亞克隆到高拷貝數(shù) 和中拷貝數(shù)質(zhì)粒中，用于在普通實(shí)驗(yàn)室菌株DHlOB中表達(dá)。質(zhì)粒pTrc-INOl含有經(jīng)修飾的 ColEl復(fù)制子，使其具有數(shù)百個(gè)拷貝數(shù)，而基于RSF1010復(fù)制子的pMMB_IN01具有數(shù)十個(gè)拷 貝數(shù)。對(duì)這兩個(gè)質(zhì)粒在單個(gè)菌株中利用相容性載體共表達(dá)INOl和MIOX基因的潛力進(jìn)行了 評(píng)估。分別含有pTrc-INOl和pMMB-INOl且于30°C孵育的培養(yǎng)物可測(cè)出;344nmol/hr/mg和 128nm0l/hr/mg的體外活性，表明酶成功表達(dá)(表1)。但是，僅在高拷貝數(shù)質(zhì)粒中的表達(dá)使 培養(yǎng)基中積累了可檢測(cè)量的0. 37g/L肌醇。活性還受到溫度的強(qiáng)烈影響，培養(yǎng)物在37°C生 長時(shí)檢測(cè)不到。還檢測(cè)了 M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的肌醇產(chǎn)量。假定在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)且以葡 萄糖作為唯一碳源可以使葡萄糖流量增加并進(jìn)而提高肌醇產(chǎn)量。但是，僅產(chǎn)生了一半數(shù)量 的肌醇，表明雖然葡萄糖流量實(shí)際上可確實(shí)更高，但是這種條件下表達(dá)的hoi酶不能有效 地與糖酵解作用競(jìng)爭(zhēng)底物。隨后的實(shí)驗(yàn)在添加了葡萄糖的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行。MIOX是主要來源于真核生物的蛋白質(zhì)，已對(duì)其在人、小鼠、大鼠和豬中的同源物進(jìn) 行了充分表征(3，4，30，31)。肌醇加氧酶(MIOX)已在大腸桿菌中進(jìn)行了功能性表達(dá)并純 化，用于對(duì)該酶的特性進(jìn)行表征；但是，據(jù)我們所知，還未將哺乳動(dòng)物MIOX用于完整的細(xì)胞 重組系統(tǒng)以產(chǎn)生葡糖醛酸。已發(fā)現(xiàn)小鼠肌醇加氧酶具有在大腸桿菌中表達(dá)的最有利特性 (3)并選擇其進(jìn)行研究。該基因的合成物購自DNA 2.0，其經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表 達(dá)。該基因還被亞克隆到用于評(píng)估DHlOB中hoi活性的高拷貝數(shù)載體和低拷貝數(shù)載體中。 由于MIOX來源于哺乳動(dòng)物，因此最初于37°C評(píng)估MIOX的活性。已知MIOX酶需要!^2+和半胱氨酸進(jìn)行體外活化⑷。如體外試驗(yàn)所測(cè)，向培養(yǎng)基 中加入這些化合物并不能促進(jìn)PTrc-MIOX中該酶的表達(dá)，反而使其活性降低(表2)。還測(cè) 定了培養(yǎng)基中的葡糖醛酸，盡管其濃度較低。所觀察到的酶活性下降與細(xì)胞密度的顯著降 低相符合，表明這些化合物對(duì)宿主具有毒性。之前曾報(bào)道(30，31)，高濃度的!^2+和半胱氨 酸會(huì)抑制MIOX的活性。雖然其胞外濃度設(shè)定于在體外試驗(yàn)中活化該酶的水平上，但是其相 應(yīng)的胞內(nèi)濃度是未知的。之前還曾報(bào)道，培養(yǎng)基中含有肌醇可以促進(jìn)大腸桿菌中MIOX的可 溶性表達(dá)C3)。本文中也觀察到了這種現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)當(dāng)不添加肌醇時(shí)該酶的活性明顯降低(表 2)。重組MIOX的一個(gè)突出特性是其明顯具有不穩(wěn)定性(3)。指數(shù)期(接種后6小時(shí))所 取樣品中觀察到了高活性，但是在靜止期(接種后對(duì)小時(shí))顯著下降(表幻。如在含有 空pTrc99A質(zhì)粒的對(duì)照樣品中所測(cè)，試驗(yàn)背景活性一般隨時(shí)間而增加。注意到該試驗(yàn)的背 景高是由苔黑酚試劑的非特異性造成的，已知所述苔黑酚試劑與其他生物化合物反應(yīng)，雖 然反應(yīng)程度較低。因此，該試驗(yàn)對(duì)于酶活性的精確定量并不可靠。但是，在有和沒有肌醇的 樣品之間所觀察到的差別以及早期和晚期時(shí)間點(diǎn)加入肌醇的樣品之間的差別足夠大，可以 認(rèn)為其趨勢(shì)是明顯的。在含有較低拷貝數(shù)ρΜΜΒ-ΜΙΟΧ構(gòu)建體的培養(yǎng)基中未觀察到體外酶活性或體內(nèi)葡 糖醛酸的產(chǎn)生，表明需要高表達(dá)水平以使MIOX的活性可檢測(cè)。由于INOl僅在30°C活躍表 達(dá)，因此還評(píng)估了在該溫度下高拷貝數(shù)質(zhì)粒中體內(nèi)MIOX的情況。培養(yǎng)M小時(shí)后產(chǎn)生了可 比較量的0. 4g/L的葡糖醛酸，48小時(shí)后效價(jià)加倍至0. 78g/L。
葡糖醛酸的產(chǎn)生由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸需要使INOl和MIOX在同一菌株中共表達(dá)。對(duì)相容性質(zhì) 粒pTrc99A和pMMB206均進(jìn)行了研究，預(yù)計(jì)可使用含有pTrc_IN01和MMB-MIOX或者含有 pMMB-INOl和pTrc-MIOX的雙重轉(zhuǎn)化菌株用于生產(chǎn)。但是，我們的結(jié)果表明，只有利用高拷 貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)兩個(gè)基因時(shí)才能達(dá)到適當(dāng)?shù)捏w外活性(通過培養(yǎng)基中每個(gè)目的產(chǎn)物的積 累情況而測(cè)定)。為了解決此問題，我們將兩種酶均引入了高拷貝數(shù)PRSFDuet載體中，其包 含一對(duì)多克隆位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均位于T7啟動(dòng)子之后。如前所述測(cè)定酶活性并通過SDS-PAGE 驗(yàn)證其表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。在該方法中，測(cè)定0. ImM濃度的IPTG是優(yōu)選的。宿主菌株也 由DHlOB變?yōu)锽L21 (DE3)，以使得能夠利用T7啟動(dòng)子表達(dá)。之前我們發(fā)現(xiàn)DHlOB不能利用 葡糖醛酸來生長(數(shù)據(jù)未顯示)。BL21(DE)3可以代謝葡糖醛酸，但是其消耗似乎受到分解 代謝物的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在過量的葡萄糖中培養(yǎng)菌株可阻止目的產(chǎn)物的消耗。含有pRSFD-IN-MI的BL21 (DE3)菌株能夠由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸，盡管其水平僅 為約270m g/L (圖2)。培養(yǎng)圖顯示，葡糖醛酸M小時(shí)后出現(xiàn)而且未檢測(cè)到中間產(chǎn)物，其濃 度在4天內(nèi)增加了 50%。但是48小時(shí)后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)了大量的肌醇。肌醇在培養(yǎng)基中持 續(xù)積累，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谄錆舛缺饶康慕K產(chǎn)物葡糖醛酸稍高。葡糖醛酸的終濃度為0. 27g/L，比 在上述DHlOB(PTrc-MIOx)系統(tǒng)中使肌醇直接轉(zhuǎn)化時(shí)所測(cè)濃度(0. 78g/L)要低。肌醇的積 累表明MIOX的活性是產(chǎn)生高濃度葡糖醛酸的限速因素。體外試驗(yàn)證實(shí)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中 Inol的活性顯著高于僅載體的對(duì)照，3天后僅有少許背景活性(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，1天 后MIOX的活性僅比背景稍高且隨后與背景難以區(qū)分。這與之前所歸納的顯示MIOX活性在 24小時(shí)后急劇下降的結(jié)果相一致。此外，該系統(tǒng)中MIOX的活性可能受到由hoi產(chǎn)生之肌 醇濃度的限制。雖然細(xì)胞外添加60mM(10.8g/L)肌醇并不意味著其胞內(nèi)濃度也如此高，但 是可以合理預(yù)期由hoi活性而產(chǎn)生的肌醇胞內(nèi)濃度很可能達(dá)不到相同的濃度。葡糖二酸的產(chǎn)生實(shí)施例2表明了編碼丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000之糖醛酸脫氫酶的基因 的克隆和表征GO)。發(fā)現(xiàn)udh基因能夠在大腸桿菌中充分表達(dá)，導(dǎo)致高的酶活性。為了產(chǎn) 生葡糖二酸，我們利用了之前所構(gòu)建的pTrc99A中含有udh基因的載體(其與pRSFD_IN_MI 相容)。將兩個(gè)載體引入BL21 (DE3)中以構(gòu)建帶有IN01、MI0X和udh的大腸桿菌菌株。在 幾種不同誘導(dǎo)條件下測(cè)量該菌株的生產(chǎn)力(表幻。出乎意料的是，盡管之前在含有前兩個(gè) 基因的系統(tǒng)中僅觀察到0. 27g/L的葡糖醛酸，卻產(chǎn)生了高達(dá)lg/L的葡糖二酸。在與之前用 于產(chǎn)生葡糖醛酸的相同條件下(表3，條件A)產(chǎn)生了 0. 72g/L的葡糖二酸。為了進(jìn)一步表 征該系統(tǒng)，每天培養(yǎng)后測(cè)定粗裂解物中的酶活性(圖幻。Udh活性是最高的，比^ol活性 高出超過2個(gè)數(shù)量級(jí)，比MIOX活性高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，Udh的高活性似乎提高了通過 葡糖二酸途徑的葡萄糖流量，使得葡糖二酸的效價(jià)相對(duì)較高。在這些樣品中，MIOX活性似 乎并不像之前觀察到的那樣隨時(shí)間而降低；但是其活性幅度依然相當(dāng)?shù)?。此外，此處第一個(gè) 數(shù)據(jù)點(diǎn)是1天后，之前顯示此時(shí)MIOX活性與指數(shù)生長期觀察到的活性相比已明顯降低(表 2)。培養(yǎng)3天后當(dāng)肌醇積累時(shí)未檢測(cè)到葡糖醛酸，證實(shí)了 MIOX催化的步驟是限速步驟。測(cè)試的3種誘導(dǎo)條件產(chǎn)生了濃度為0. 72至1. 13g/L的葡糖二酸。一般來說，誘導(dǎo) 水平越高(即IPTG濃度越高)，導(dǎo)致由葡萄糖到葡糖二酸的產(chǎn)率就越高，但產(chǎn)物濃度就越 低(比較例如表3中的條件A和B)。較高的誘導(dǎo)水平還導(dǎo)致葡萄糖消耗較少和細(xì)胞密度較低，表明存在與這3種酶的較高表達(dá)量相關(guān)的代謝負(fù)擔(dān)。但是，在葡萄糖消耗率較低的情況 下，相對(duì)于生物質(zhì)而言，有更多部分的葡萄糖流向生成葡糖二酸的方向。我們還觀察到較低 的通氣量(其由250-mL振蕩培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)物總體積由50mL增至IOOmL引起)導(dǎo)致葡糖二 酸效價(jià)降低一半而生長未受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。此效價(jià)降低很可能是由于MIOX這一限速 步驟酶利用分子氧作為共底物所致(12，38)。最后，檢測(cè)了 M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡糖二酸的產(chǎn) 量；但是，所產(chǎn)生的葡糖二酸量幾乎可以忽略。本文中描述了產(chǎn)生葡糖二酸之生物合成途徑的構(gòu)建，其中利用了 3種不同來源的 酶釀酒酵母Inol、小鼠MIOX和丁香假單胞菌Udh。一種內(nèi)源性磷酸酶也參與了該途徑。 已經(jīng)表明大腸桿菌的suhB基因產(chǎn)物在體外具有肌醇單磷酸酶活性，因而成為該內(nèi)源活性 的合適候選物0；3)。從熱力學(xué)角度來說，該途徑是具有吸引力的，因?yàn)楦鶕?jù)基團(tuán)貢獻(xiàn)理論 (21,24)評(píng)估并將分子氧看作最終氧化劑，所有3個(gè)步驟的標(biāo)準(zhǔn)自由能變化(AG)都是負(fù) 值葡萄糖到肌醇的步驟是-14. 3Kcal/mol ；肌醇到葡糖醛酸的步驟是_86. 8Kcal/mol ；葡 糖醛酸到葡糖二酸的步驟是-55. 9Kcal/moL·但是，如Khosla和Keasling所指出的(18)， 代謝工程不僅僅是單純地招募不同的酶。當(dāng)發(fā)生干擾(例如向宿主機(jī)體中引入新途徑)時(shí)， 其還涉及對(duì)代謝流量的整體優(yōu)化。在這種情況下，與質(zhì)粒保持和質(zhì)粒所編碼基因之表達(dá)相 關(guān)的代謝負(fù)擔(dān)問題也是特別令人感興趣的(9，10，17)。在我們的系統(tǒng)中，僅利用高拷貝數(shù)質(zhì) 粒在體內(nèi)產(chǎn)生了可檢測(cè)量的葡糖醛酸。第一個(gè)底物葡萄糖-6-磷酸不應(yīng)是中心代謝的限速 步驟，因?yàn)槭褂昧颂砑佑羞^量葡萄糖的LB培養(yǎng)基用于生長。因此，似乎需要高表達(dá)水平的 重組基因，以與快速而強(qiáng)烈的糖酵解途徑競(jìng)爭(zhēng)并將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖醛酸。M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中僅產(chǎn)生了少量的肌醇和未檢出量的有機(jī)酸，此結(jié)果表明當(dāng)葡萄糖是唯一的碳源和能量來 源時(shí)，幾乎所有的底物均進(jìn)入了內(nèi)源細(xì)胞代謝作用。該競(jìng)爭(zhēng)作用還可以解釋為什么在該過 程的前兩天，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度較高時(shí)，由葡萄糖到葡糖二酸的產(chǎn)率通常要高于后 期濃度較低時(shí)的(數(shù)據(jù)未顯示)。高M(jìn)IOX活性需要肌醇，表明^iol酶的生產(chǎn)力低可最終限 制M9培養(yǎng)基中有機(jī)酸的生成?；蛘撸琈IOX可在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中表達(dá)量很少。應(yīng)當(dāng)指出，之前 利用^iol進(jìn)行研究使得替代性化學(xué)限定培養(yǎng)基中肌醇產(chǎn)量很高，并且也使用了高拷貝數(shù) 質(zhì)粒進(jìn)行基因表達(dá)，但是這些實(shí)驗(yàn)是在數(shù)天大規(guī)模補(bǔ)料分批發(fā)酵中進(jìn)行的(1 。在開始葡 萄糖補(bǔ)料之前的初始批期間(約10小時(shí))，肌醇濃度小于lg/L。因此，有必要研究在分批 補(bǔ)料條件下進(jìn)行培養(yǎng)對(duì)我們的系統(tǒng)生產(chǎn)力的提高程度。質(zhì)粒拷貝數(shù)并不是與影響我們的合成系統(tǒng)性能之表達(dá)水平相關(guān)的唯一因素。如表 3所示，提高誘導(dǎo)物濃度以增加表達(dá)量導(dǎo)致產(chǎn)物濃度較低。IPTG濃度在0. 05mM以下不能促 進(jìn)葡糖二酸的產(chǎn)生，即使葡萄糖消耗率和生長速率由于代謝負(fù)擔(dān)降低而增強(qiáng)了(數(shù)據(jù)未顯 示)。大腸桿菌在37°C比在30°C生長得好，并且限速酶MIOX的活性應(yīng)該在37°C時(shí)更高。但 是，發(fā)酵于30°C進(jìn)行，因?yàn)閔oi在此較低溫度下僅功能性表達(dá)?？紤]到曾報(bào)道Udh具有異 常的熱力學(xué)不穩(wěn)定性(7，35)，因此低于30°C的溫度可能對(duì)其活性更有利。但是，我們觀察 到Udh的活性在30°C下比hoi或MIOX的活性高得多(圖3)，并且選擇30°C作為培養(yǎng)溫度 以使hoi的功能性表達(dá)最強(qiáng)。考慮該系統(tǒng)生產(chǎn)力的所有限制因素，應(yīng)當(dāng)檢查該途徑中中間產(chǎn)物的潛在抑制作 用。已報(bào)道豬腎MIOX在體外被D-葡糖二酸抑制但并不被D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸內(nèi)酯抑制(30，31)?？紤]到靜止期時(shí)MIOX的活性甚至在不存在葡糖二酸的情況下急劇降低(表 2)，因此MIOX活性低很可能是由于其自身不穩(wěn)定性而非中間產(chǎn)物的抑制作用(3)。還應(yīng)當(dāng) 指出，我們并沒有過量表達(dá)suhB基因或同源磷酸酶。然而，培養(yǎng)產(chǎn)物中未檢測(cè)到肌醇-1-磷 酸，而肌醇卻的確積聚了。因此，我們推斷磷酸酶活性并不限制通過該途徑的流量。大腸桿 菌還包含D-葡糖醛酸分解代謝途徑(16)。的確，已經(jīng)利用大腸桿菌以D-葡糖醛酸作為唯 一碳源用于生長的能力進(jìn)行了篩選，以鑒定糖醛酸脫氫酶的活性GO)。BL21(DE3)也可以 代謝D-葡糖醛酸。但是，兩種有機(jī)酸的消耗似乎均受到分解代謝的抑制，這阻止了在葡萄 糖存在下不期望的產(chǎn)物流失(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，D-葡糖二酸效價(jià)的理論限制值似乎由 酸的毒性和每個(gè)步驟的動(dòng)力學(xué)所決定。加入濃度高達(dá)10g/L的葡糖二酸鉀和葡糖醛酸鈉并 不會(huì)影響大腸桿菌的生長和葡萄糖的消耗(數(shù)據(jù)未顯示)，因此，通過致力于提高限速步驟 的動(dòng)力學(xué)來提高效價(jià)是有空間的。進(jìn)一步優(yōu)化以提高該合成途徑的葡萄糖流量需要招募不 同來源的更好的酶，對(duì)這些酶進(jìn)行改造并下調(diào)所述競(jìng)爭(zhēng)性途徑。表1.大腸桿菌中由高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pTrc)和中拷貝數(shù)質(zhì)粒(pMMB)表達(dá)之重組 INOl的活性。培養(yǎng)物在添加了 10g/L葡萄糖和0. ImM(用于pTrc-INOl)或l.OmM(用于 pMMB-INOl) IPTG的LB培養(yǎng)基中于30°C生長。從指數(shù)期中期所取產(chǎn)品的粗裂解物中測(cè)定其 體外活性，而將48小時(shí)后培養(yǎng)基中肌醇的濃度作為其體內(nèi)活性。所示數(shù)據(jù)表示來自單次試 驗(yàn)。N/D =未檢出。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞，其重組表達(dá)編碼糖醛酸脫氫酶的基因并且重組表達(dá)編碼肌醇加氧酶的基因。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是細(xì)菌基因。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae) S； 13^HiMHfilif (Pseudomonas purida)―因。
4.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是根瘤農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)基因。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述編碼肌醇加氧酶的基因是哺乳動(dòng)物基因。
6.權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述編碼肌醇加氧酶的基因是小鼠基因。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼肌醇-1-磷酸合酶的 基因。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因是酵母基因。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中所述編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因是釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)基因。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述編碼肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸 合酶的基因已經(jīng)密碼子優(yōu)化修飾，用于在細(xì)菌中表達(dá)。
14.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或 者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/或 肌醇-1-磷酸合酶的基因由質(zhì)粒表達(dá)。
17.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/或 肌醇-ι-磷酸合酶的基因被整合到所述細(xì)胞的基因組中。
18.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中通過所述細(xì)胞內(nèi)糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶 和/或肌醇-ι-磷酸合酶的蛋白質(zhì)工程使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。
19.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中通過使細(xì)胞內(nèi)萄糖二酸代謝途徑的組分突 變而使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。
20.一種產(chǎn)生葡糖二酸的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的細(xì)胞以產(chǎn)生葡糖 二酸。
21.權(quán)利要求20的方法，還包括從所述細(xì)胞回收葡糖二酸。
22.—種經(jīng)遺傳修飾的微生物，其包含編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸 合酶的一個(gè)或多個(gè)重組核酸分子。
23.—種產(chǎn)生葡糖二酸的方法，所述方法包括對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以使其重組表達(dá)糖 醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一種，培養(yǎng)所述細(xì)胞的群以及從已 經(jīng)遺傳修飾以產(chǎn)生萄糖二酸的該細(xì)胞群中收集葡糖二酸。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼糖醛酸脫氫酶的基因。
25.權(quán)利要求23或M的方法，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼肌醇加氧酶的基因。
26.權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼肌醇-1-磷酸合酶 的基因。
27.權(quán)利要求23至沈中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是細(xì)菌基因。
28.權(quán)利要求23至沈中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是丁香假單 胞菌基因或惡臭假單胞菌基因。
29.權(quán)利要求23至沈中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是根瘤農(nóng)桿 菌基因。
30.權(quán)利要求23至四中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼肌醇加氧酶的基因是哺乳動(dòng)物基因。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述編碼肌醇加氧酶的基因是小鼠基因。
32.權(quán)利要求23至31中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因是酵母基因。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因是釀酒酵母基因。
34.權(quán)利要求23至33中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
37.權(quán)利要求23至36中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼肌醇加氧酶和/或編碼肌 醇-1-磷酸合酶的基因已經(jīng)密碼子優(yōu)化修飾，用于在細(xì)菌中表達(dá)。
38.權(quán)利要求23至33中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或 哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
40.權(quán)利要求23至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/ 或肌醇-ι-磷酸合酶的基因由質(zhì)粒表達(dá)。
41.權(quán)利要求23至37中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和/ 或肌醇-ι-磷酸合酶的基因被整合到所述細(xì)胞的基因組中。
42.權(quán)利要求23至41中任一項(xiàng)的方法，其中通過所述細(xì)胞內(nèi)糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧 酶和/或肌醇-ι-磷酸合酶的蛋白質(zhì)工程使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。
43.權(quán)利要求23至42中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中通過使細(xì)胞內(nèi)萄糖二酸代謝途徑的組分突 變而使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。
44.由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的所述細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾 以使其重組表達(dá)糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶和肌醇-ι-磷酸合酶中的至少一種。
45.權(quán)利要求44的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼糖醛酸脫氫酶的基因。
46.權(quán)利要求44或45的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼肌醇加氧酶的基因。
47.權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)編碼肌醇-1-磷酸 合酶的基因。
48.權(quán)利要求44至47中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是細(xì)菌基因。
49.權(quán)利要求44至48中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是丁香 假單胞菌基因或惡臭假單胞菌基因。
50.權(quán)利要求44至48中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶的基因是根瘤 農(nóng)桿菌基因。
51.權(quán)利要求44至50中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼肌醇加氧酶的基因是哺乳動(dòng) 物基因。
52.權(quán)利要求51的葡糖二酸，其中所述編碼肌醇加氧酶的基因是小鼠基因。
53.權(quán)利要求44至52中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因是 酵母基因。
54.權(quán)利要求53的葡糖二酸，其中所述編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因是釀酒酵母基因。
55.權(quán)利要求44至M中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
56.權(quán)利要求55的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
57.權(quán)利要求56的葡糖二酸，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
58.權(quán)利要求44至57中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼肌醇加氧酶和/或編碼肌 醇-1-磷酸合酶的基因已經(jīng)密碼子優(yōu)化修飾，用于在細(xì)菌中表達(dá)。
59.權(quán)利要求44至M中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
60.權(quán)利要求59的葡糖二酸，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì) 胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
61.權(quán)利要求44至60中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶 和/或肌醇-ι-磷酸合酶的基因由質(zhì)粒表達(dá)。
62.權(quán)利要求44至60中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中所述編碼糖醛酸脫氫酶、肌醇加氧酶 和/或肌醇-ι-磷酸合酶的基因被整合到所述細(xì)胞的基因組中。
63.權(quán)利要求44至62中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中通過所述細(xì)胞內(nèi)糖醛酸脫氫酶、肌醇 加氧酶和/或肌醇-ι-磷酸合酶的蛋白質(zhì)工程使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。
64.權(quán)利要求44至63中任一項(xiàng)的葡糖二酸，其中通過使細(xì)胞內(nèi)萄糖二酸代謝途徑的組 分突變而使葡糖二酸的產(chǎn)生增加。
65.一種分離的核酸分子，其選自(a)包含SEQID NO =USEQ ID NO 23或SEQ ID NO 25的分離的核酸分子；(b)編碼包含SEQID NO 2,SEQ ID NO J4或SEQ ID NO J6序列之氨基酸序列的分離 的核酸分子；(c)與(a)或(b)的全長序列反向互補(bǔ)的分離的核酸分子；(d)與(a)-(c)中任一項(xiàng)具有至少95%的核苷酸一致性的分離的核酸分子。
66.一種包含權(quán)利要求65中所述核酸分子的重組表達(dá)載體，其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可操作 地連接。
67.一種分離的糖醛酸脫氫酶多肽，其由權(quán)利要求65的所述核酸分子編碼。
68.一種分離的糖醛酸脫氫酶多肽，其與SEQ ID NO :2具有至少95%的氨基酸一致性。
69.一種細(xì)胞，其含有權(quán)利要求66的重組表達(dá)載體。
70.權(quán)利要求69的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植 物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
71.—種產(chǎn)生糖醛酸脫氫酶的方法，包括在允許多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求69或 70所述的細(xì)胞。
72.權(quán)利要求71的方法，還包括從培養(yǎng)基或所述細(xì)胞中回收多肽。
73.一種分離的抗體，其與權(quán)利要求67所述的多肽選擇性結(jié)合。
74.一種分離的抗體，其與權(quán)利要求68所述的多肽選擇性結(jié)合。
75.權(quán)利要求73或74的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人 源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過重組表達(dá)肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和糖醛酸脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸。本發(fā)明還公開了對(duì)編碼糖醛酸脫氫酶之基因的克隆和表征。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102066552SQ200980120747
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月4日
發(fā)明者克麗斯塔拉·拉內(nèi)特·瓊斯·普拉瑟, 尹相活, 文泰石 申請(qǐng)人:麻省理工學(xué)院