專(zhuān)利名稱(chēng)：可縮放的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器和細(xì)胞培養(yǎng)方法
可縮放的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器和細(xì)胞培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可縮放的毛細(xì)管(空心纖維)膜生物反應(yīng)器及其用途，其用于培養(yǎng)和 維持細(xì)胞和/或微生物，以利用這些細(xì)胞的代謝，用于以提高的方法靈活性生產(chǎn)生物產(chǎn)物 或生物轉(zhuǎn)化。背景技術(shù)：
毛細(xì)管膜或空心纖維反應(yīng)器(HFRs)已被廣泛用于上游和下游過(guò)濾和純化方法； 在廢水處理中作為固定了微生物或酶的生物反應(yīng)器；和作為細(xì)胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)HFR設(shè)計(jì)使用軸流，其中分開(kāi)的流體流通過(guò)膜兩側(cè)的膜表面 (Chresand et al，1987)。通過(guò)增加包括在圓柱狀歧管內(nèi)的空心纖維束中的膜數(shù)來(lái)增加這 些模塊，由此增加活躍的膜表面積。物質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)膜表面通過(guò)擴(kuò)散從一側(cè)流體流向另一 側(cè)流體流交換。此導(dǎo)致跨纖維束的軸向和輔向營(yíng)養(yǎng)物梯度，其會(huì)產(chǎn)生不均一性，不利地影響 細(xì)胞生長(zhǎng)，生物過(guò)程穩(wěn)定性和產(chǎn)力。這些不均一性隨著HFR尺寸增大而增加。已將細(xì)胞培養(yǎng)HFR中的交叉流(正切)和死端(流通)過(guò)濾用于改善2個(gè)分開(kāi)的 流體流之間的物質(zhì)交換，其中物質(zhì)通過(guò)對(duì)流而非擴(kuò)散運(yùn)輸穿過(guò)膜表面。這2種流體傳送手 段已被分別用于灌流(US4，804，628)和固定的(TO2007004170A2)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。各情況 中觀(guān)察到增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)物遞送到細(xì)胞和從細(xì)胞培養(yǎng)空間移出代謝廢物和/或生物目的產(chǎn)物。 然而，仍觀(guān)察到空心纖維束內(nèi)的軸向梯度和不均一性，及限制HFR設(shè)計(jì)的規(guī)模。起初開(kāi)發(fā)橫向流模塊用于過(guò)濾，滲透物蒸發(fā)和廢水處理過(guò)程，以限制軸向梯度和 不均一性，允許沿膜表面良好限定的流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)料流和滲流，由此控制濃度極化和優(yōu)化 基于濃度的跨膜推進(jìn)力(Futselaar，199 。這些模塊中，毛細(xì)管膜的位置與進(jìn)料流方向垂 直。膜的規(guī)則設(shè)置防止了流錯(cuò)誤分配，而橫向定向顯著增加了質(zhì)量轉(zhuǎn)移系數(shù)(Futselaar， 1993)。此膜的均勻的2-D分布允許了改善的可縮放性，且已有幾種設(shè)計(jì)的描述Ghang et al 2003, Smart et al 1998, Vladisavljevic 1999)。各情況中固定了通過(guò)膜的流道，以相同方向取向的全部膜被歧入單個(gè)流體入口和出口通道(圖IA C)。US 5，516，691描述了改良的橫向流模塊，其中膜以3-D設(shè)置分布(圖1D)，其被用 作用于培養(yǎng)和維持細(xì)胞及使用它們的代謝(代謝產(chǎn)物)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備。此生物反應(yīng)器設(shè) 計(jì)涵蓋以下原理通過(guò)交叉流和/或死端過(guò)濾改善質(zhì)量轉(zhuǎn)移，和通過(guò)其3-D纖維網(wǎng)絡(luò)改善底 物和代謝物交換和可控性，由此促進(jìn)貫穿細(xì)胞培養(yǎng)空間的連貫的流體傳送和導(dǎo)致改善的代 謝和細(xì)胞活力。此3-D設(shè)置還促進(jìn)至少3個(gè)獨(dú)立的膜系統(tǒng)，各包括多個(gè)膜。第一膜系統(tǒng)用 于培養(yǎng)基流入，第二膜系統(tǒng)用于供給O2或移出CO2，第三膜系統(tǒng)用于培養(yǎng)基流出。將膜系統(tǒng) 和外部歧管之間的內(nèi)部空間用作細(xì)胞培養(yǎng)空間。此設(shè)計(jì)首次將多維纖維設(shè)置應(yīng)用于細(xì)胞培 養(yǎng)，且給出概念，組織培養(yǎng)作為合成的器官或肝輔助裝置，其中未考慮可縮放性。此外，以相 同方向取向的各膜層被歧入單個(gè)流體入口和出口通道(圖1D)。發(fā)明概述本發(fā)明第一方面提供了可縮放的生物反應(yīng)器，其包括
至少1個(gè)包括歧管和空心纖維膜裝置的盒體； 上頂板；和 下頂板，其中盒體是模塊化部件，其適于彼此配合及與頂板配合，以限定內(nèi)部毛細(xì)管外培 養(yǎng)空間(ECS)，且其中空心纖維膜裝置包括分離的入口和出口。優(yōu)選入口和出口經(jīng)空心纖維膜成流體連通。盒體優(yōu)選包括入口和出口儲(chǔ)液池，所 述入口和出口儲(chǔ)液池與(各)歧管成流體連通。歧管優(yōu)選位于膜的各端，且各儲(chǔ)液池與相 應(yīng)入口或出口成流體連通。各盒體優(yōu)選僅包括分離的入口和出口，所述分離的入口和出口與儲(chǔ)液池成流體連 通，即未通過(guò)盒體與ECS成流體連通?？招睦w維膜可設(shè)置在基本上平行的膜排中。各盒體優(yōu)選包括1個(gè)或多個(gè)所述排。當(dāng)各盒體包括多于1個(gè)所述層(排)時(shí)，空心纖維膜各層優(yōu)選在水平或豎直方向 上與其上和/或其下層垂直設(shè)置。空心纖維膜各層更優(yōu)選相對(duì)于其上和/或其下的膜層偏 移。生物反應(yīng)器優(yōu)選包括2個(gè)或多個(gè)盒體。各盒體可針對(duì)每個(gè)功能包括1個(gè)空心纖維 膜層(排)。頂板優(yōu)選包括向ECS的開(kāi)口(孔)，從而流體可導(dǎo)入，排出和/或使通過(guò)ECS自由 流動(dòng)。頂板可適于包括至少1個(gè)配件或孔，其使探頭或傳感器插入到ECS隔間，從而可監(jiān)控 和/或控制ECS內(nèi)的流體組成。各開(kāi)口(孔)優(yōu)選是可閉合的。與ECS成流體連通的此類(lèi) 孔優(yōu)選僅位于頂板中/上，且非盒體中。本發(fā)明第二方面提供了盒體，所述盒體包括適于接收空心纖維膜裝置的歧管，所 述盒體還包括各空心纖維膜裝置的分離的入口和出口，且其中所述盒體適于與另一盒體接 合和/或與上和下頂板接合，以限定內(nèi)部ECS。本發(fā)明第三方面提供了用于生物反應(yīng)器的成套工具，其包括 歧管，其適于接收空心纖維膜裝置；和 上和下頂板。成套工具優(yōu)選包括適于接收或包括歧管的盒體，所述盒體適于與另一盒體配合和 /或與上和下頂板配合。成套工具還可包括至少1個(gè)空心纖維膜，所述空心纖維膜任選安裝 在歧管內(nèi)。空心纖維膜優(yōu)選為軸向延伸的空心管，形狀如同飲水吸管?？招睦w維膜優(yōu)選選擇 性可滲透，且可為陶瓷膜。歧管可包括在框架中，所述框架包括2個(gè)(或多個(gè))相對(duì)的歧管，所述歧管適于接 收空心纖維膜，歧管彼此連接以形成框架。各歧管可包括適于接收空心纖維膜的孔。各盒 體優(yōu)選包括(入口或出口)儲(chǔ)液池，其與歧管(孔)和入口或出口成流體連通，還與儲(chǔ)液池 成流體連通。儲(chǔ)液池可通過(guò)框架與端板配合形成。盒體，框架，歧管，端板和頂板可由不銹鋼或任何適宜形式的聚合物/塑料構(gòu)成。本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)生物反應(yīng)器的各部件(例如，盒體，歧管，框架和/或空心纖維膜) 的描述適用于本發(fā)明的全部方面。
本發(fā)明第四方面提供了利用細(xì)胞和/或微生物代謝的方法，所述方法包括利用本 發(fā)明的生物反應(yīng)器的步驟。所述方法可包括將細(xì)胞和/或微生物接種到上述生物反應(yīng)器的ECS中。優(yōu)選地， 細(xì)胞和/或微生物被固定于空心纖維膜外表面，和/或細(xì)胞和/或微生物被懸浮于ECS中。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，ECS可含氣體和/或液體。細(xì)胞可選自哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞系，微生物可選自細(xì)菌，酵母和真菌。哺乳動(dòng)物 和昆蟲(chóng)細(xì)胞系優(yōu)選，但不限于，貼壁依賴(lài)型細(xì)胞系，和微生物優(yōu)選非絲狀微生物。貼壁依賴(lài)性細(xì)胞系一般選自正常二倍體細(xì)胞系，例如人胚胎肺細(xì)胞系，人包皮細(xì) 胞系，人胚胎腎細(xì)胞系，雞、兔、小鼠和大鼠的胚胎成纖維細(xì)胞系，黑猩猩肝成纖維細(xì)胞系， 大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系，貓肺成纖維細(xì)胞系和次代猴腎細(xì)胞系；原代細(xì)胞系，例如猴、狗和兔 腎細(xì)胞系，小鼠巨噬細(xì)胞系，大鼠胰腺細(xì)胞系，大鼠肝細(xì)胞系，雞胚胎成纖維細(xì)胞系，大鼠垂 體細(xì)胞系和羊水細(xì)胞系；建立的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，例如小鼠成纖維細(xì)胞系，正常大鼠腎細(xì)胞 系，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢和肺細(xì)胞系，幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系，黑猩猩胚胎肺細(xì)胞系，非洲綠猴腎細(xì)胞系， 小鼠L細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞系，小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，轉(zhuǎn)化的狗腎細(xì)胞系，肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的大 鼠腎和小鼠成纖維細(xì)胞系，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，人骨肉瘤細(xì)胞系，小獵犬腎細(xì)胞系，KB細(xì) 胞系，恒河猴腎細(xì)胞系，McCoy細(xì)胞系，人甲狀腺癌細(xì)胞系，人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系，大鼠肌肉 衍生的成纖維細(xì)胞系和兔角膜細(xì)胞系。微生物一般選自正常的或轉(zhuǎn)化的枯草桿菌，念珠菌屬，大腸桿菌，漢森酵母屬，乳 酸克魯維酵母，乳球菌屬，乳桿菌屬，葡萄球菌屬，畢赤酵母屬。釀酒酵母，粟酒裂殖酵母和 解脂耶氏酵母。所述方法可包括由標(biāo)準(zhǔn)交叉流操作或由死端操作通過(guò)空心纖維膜裝置的入口系 統(tǒng)的流體流。所述方法可包括控制器，所述控制器用于調(diào)節(jié)通過(guò)空心纖維膜的流體傳送?？刂?器優(yōu)選為特定集成的控制器，其可為壓力控制器。所述方法優(yōu)選包括供給和/或移出物質(zhì)，所述物質(zhì)包括營(yíng)養(yǎng)物，氣體，例如氧和二 氧化碳，緩沖劑(酸性或堿性溶液)，激素，調(diào)控生長(zhǎng)或改變代謝的化合物，耗竭的培養(yǎng)基， 代謝廢物，目的產(chǎn)物，和熱交換物質(zhì)。所述物質(zhì)可經(jīng)盒體的入口或出口系統(tǒng)(即通過(guò)空心纖 維膜)和/或通過(guò)上和下頂板中的開(kāi)口(孔)被供給到細(xì)胞和/或微生物。所述方法可包括通過(guò)ECS的流體流，且所述流體流還可再循環(huán)，或可通過(guò)死端模 式再循環(huán)。通過(guò)ECS的流體流可在壓力下操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，通過(guò)ECS的流體 流優(yōu)選由自下頂板到上頂板或從上頂板到下頂板的橫向流實(shí)現(xiàn)。本文通過(guò)引用包括下列參考文獻(xiàn)1. Chresand J. J. , Gillier R. J. and Dale B. Ε. (1987) Optimisation fibre spacing in a hollow fibre bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 32 :983-982.2. Cracauer, R. F.，Walker R. D.，and Gruenberg M. (1998)Hollow fiber cell culture device and method of operation. US 4,804, 628.3. Fraser, S. J. , Edwards, W. and Leukes, W. D. (2007)Production of secondary metabolites and recombinant proteins. Synexa Life Sciences(PTY. ) LTD. W02007004170A2
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以下將參照非限制性附圖詳述本發(fā)明，所述詳述僅旨在舉例。圖1顯示各種現(xiàn)有技術(shù)裝置。圖2顯示本發(fā)明的完整的可縮放的生物反應(yīng)器的㈧斷面圖，⑶俯視圖或仰視 圖和(C，D)透視圖。圖3顯示本發(fā)明的可縮放的生物反應(yīng)器的立體圖。圖4顯示方法例的示意圖。圖5顯示實(shí)施例1中使用的生物反應(yīng)器裝置。圖6顯示實(shí)施例1的CH0-K1方法數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述本設(shè)計(jì)中，模塊增加和處理靈活性原理被編入毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)膜的2-D和3-D設(shè)計(jì)。 可縮放的膜生物反應(yīng)器設(shè)備(圖2和幻包括2個(gè)頂板(1)和固定在2個(gè)頂板之間的至少 1個(gè)盒體(5)，有效限定毛細(xì)管外空間(ECS)，及將其從位于空心纖維膜內(nèi)的毛細(xì)管內(nèi)空間 (ICS)區(qū)分開(kāi)。圖2顯示完整的細(xì)胞培養(yǎng)模塊，顯示2個(gè)頂板(1)固定了例如7個(gè)獨(dú)立的盒 體(5)。上和/或下頂板可包括中央透明觀(guān)察板O)，其可使在操作期間觀(guān)察模塊內(nèi)情況。 各頂板還可包括至少1個(gè)ECS孔(3，4)，其發(fā)揮到ECS的入口 /出口的作用；和至少1個(gè)配 件或孔，其允許通過(guò)例如PH配件09)或DO探頭(30)將探頭或傳感器插入到ECS隔間。使 用0型環(huán)，墊圈或通過(guò)其他手段(8)將各盒體( 與相鄰盒體( 和/或頂板(1)密封。盒 體和頂板封件通過(guò)例如位于層疊的設(shè)備4個(gè)角的4個(gè)桿或釘(6)擠壓在一起，及固定。更 大的生物反應(yīng)器可需要更多釘，以輔助擠壓。各盒體(圖幻包括內(nèi)框架(7)，其中使用樹(shù)脂，環(huán)氧樹(shù)脂或通過(guò)其他手段固定至少 4層毛細(xì)管膜(9)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，毛細(xì)管膜是陶瓷，給框架提供剛性，及提供對(duì)用聚合 物膜時(shí)常觀(guān)察到的結(jié)構(gòu)變形的耐力。但是，應(yīng)注意，此設(shè)計(jì)不限于任何特定尺寸，化學(xué)性質(zhì) 或技術(shù)特征的毛細(xì)管。在優(yōu)選實(shí)施方式中，各層包括類(lèi)似類(lèi)型的膜，但不同層可包括具有不 同化學(xué)或技術(shù)性質(zhì)的膜，包括，但不限于，制造材料，孔尺寸和分布，涂層，選擇性和/或?qū)?電性。
2-D膜陣列(9)確保通過(guò)膜在反應(yīng)器內(nèi)的所有位置均勻供給和移出物質(zhì)，由此最 小化生物反應(yīng)器內(nèi)的軸向梯度和不均一性。通過(guò)在壓力下操作模塊，細(xì)胞培養(yǎng)流體中可達(dá) 到更高濃度的溶解的營(yíng)養(yǎng)物或氣體。自1個(gè)膜系統(tǒng)(層或排)到ECS(細(xì)胞培養(yǎng)空間)、并 通過(guò)第二膜系統(tǒng)出的營(yíng)養(yǎng)物死端流可用于在膜表面濃縮和固定細(xì)胞，及確保營(yíng)養(yǎng)物改善的 質(zhì)量轉(zhuǎn)移和均勻遞送到生物膜內(nèi)全部固定的細(xì)胞。已將細(xì)胞濃度和生物膜形成與細(xì)胞-細(xì) 胞通信，細(xì)胞-活力和增強(qiáng)的產(chǎn)力相關(guān)聯(lián)。歧管中的孔(10，11，12，13)排內(nèi)接收膜的各連續(xù)層，各層與其上和其下膜層以垂 直取向。而且，相同取向的各連續(xù)膜層可偏移，從而當(dāng)從上觀(guān)察時(shí)，膜交錯(cuò)形成連續(xù)的雙軸 膜網(wǎng)絡(luò)(9)，通過(guò)溝流限制流體錯(cuò)誤分配和ECS內(nèi)細(xì)胞的重力下沉淀。通過(guò)包括在框架(7)上的流體分配歧管將各膜層與其他膜層有效間隔。膜層內(nèi)的 各毛細(xì)管膜的開(kāi)放端開(kāi)向且被獨(dú)立的流體分配室(儲(chǔ)液池)(14,1 包括。單個(gè)盒體(5)內(nèi) 的不同膜層和流體分配室(14,1 通過(guò)0型環(huán)，墊圈或通過(guò)其他手段(19)彼此密封。4個(gè) 獨(dú)立的端板(18)均與框架(7)對(duì)齊和密封，且通過(guò)至少2個(gè)螺絲或釘00)固定，以限定流 體分配室(儲(chǔ)液池)。各膜層在各相對(duì)的流體分配室中有ICS入口(21，23，25，27)或ICS 出口 02，24，26, 28)，它們能使分開(kāi)的和內(nèi)含的流體流通過(guò)各膜層。在優(yōu)選實(shí)施方式中，使用至少1個(gè)膜層將營(yíng)養(yǎng)物溶液供給到ECS內(nèi)的細(xì)胞，而使用 至少1個(gè)層移出含目的產(chǎn)物和/或代謝廢物的耗竭的培養(yǎng)基?？墒褂酶鄬印ひ允褂脷怏w可滲透膜給培養(yǎng)空間充氧；·以通過(guò)調(diào)節(jié)(X)2濃度，導(dǎo)入酸性或堿性溶液來(lái)緩沖培養(yǎng)空間，或使用選擇性可滲 透膜從培養(yǎng)空間清除有機(jī)酸； 用于受控的供給調(diào)控生長(zhǎng)或改變代謝的化合物，用于增強(qiáng)的處理穩(wěn)定性和控 制。包括，但不限于，特定的營(yíng)養(yǎng)料，生長(zhǎng)期抑制劑或誘導(dǎo)物分子；或 作為熱交換器維持反應(yīng)器在恒定溫度。細(xì)胞培養(yǎng)空間可通過(guò)位于頂板的入口或出口用營(yíng)養(yǎng)物溶液排放，清除或再循環(huán)。模塊組件提供自相同設(shè)計(jì)的規(guī)模的增加的靈活性，其中只要用包括至少1個(gè)膜插 入件的生物反應(yīng)器優(yōu)化所述方法，可根據(jù)需要，將更多膜插入件疊在另一膜插入件上部，從 而有效線(xiàn)性增加膜表面積和反應(yīng)器體積。就給定方法而言，自不同膜插入件的膜層可一起 歧化，以輔助流體傳送和/或到/從模塊內(nèi)全部膜插入件的移出的均勻分配。在優(yōu)選實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器設(shè)備豎直取向，膜網(wǎng)絡(luò)水平取向(圖2，截面A-A)。 此例中，位于基部頂板(1)的ECS孔(4)用于將細(xì)胞接種物和/或流體導(dǎo)入ECS，而使氣體 或耗竭的培養(yǎng)基通過(guò)位于頂部頂板的ECS孔C3)出。用此方法，整個(gè)ECS可被裝填流體，防 止氣塞。這對(duì)于用于監(jiān)控ECS內(nèi)的處理情況的任何探頭(包括，但不限于pH探頭09)或 DO探頭(30))的有效操作是必要的。橫向通過(guò)膜網(wǎng)絡(luò)的流體流可使用標(biāo)準(zhǔn)交叉流操作條件 通過(guò)ECS再循環(huán)(見(jiàn)圖1，現(xiàn)有技術(shù))，或ECS出口( 可閉合，且流體流以死端模式操作。 可使用任意流模式將細(xì)胞固定在包括在盒體(5)內(nèi)的膜層中的至少1個(gè)空心纖維外表面。 通過(guò)對(duì)ECS內(nèi)的流體施加壓力來(lái)輔助，從而使液體通過(guò)選擇性可滲透毛細(xì)管膜(9)壁滲透 到ICS中，且通過(guò)至少1個(gè)ICS出孔(22,24,26,28)出，而接種物保持在ECS側(cè)的膜表面。長(zhǎng)時(shí)間操作過(guò)程中，可使用位于基部頂板的ECS孔(4)從ECS清除可蓄積在ECS 內(nèi)的和在重力作用下沉淀的細(xì)胞碎片或物質(zhì)。
接種后，將ECS孔(3，4)兩端密封，在ECS內(nèi)有效包括細(xì)胞培養(yǎng)空間。例如(圖2， 3和4)，營(yíng)養(yǎng)物溶液通過(guò)第一膜層或系統(tǒng)(A)的ICS，從膜層ICS入口 進(jìn)入，填充入口 流體分配室(入口儲(chǔ)液池)，膜層中的全部毛細(xì)管腔，出口(14)處的流體分配室(出口儲(chǔ) 液池)，并通過(guò)相同膜層的ICS出口 02)出。操作期間此膜層的ICS出口 02)閉鎖，培養(yǎng) 基遞送以死端模式操作。從此第一膜層(a)中的全部毛細(xì)管ICS過(guò)濾新鮮的營(yíng)養(yǎng)物溶液， 穿過(guò)膜壁進(jìn)入生物反應(yīng)器ECS，在那里新鮮的營(yíng)養(yǎng)物可被細(xì)胞代謝。在壓力下，耗竭的培養(yǎng) 基/滲透物通過(guò)濾過(guò)毛細(xì)管壁進(jìn)入第二膜層的ICS而出ECS，及通過(guò)第二膜層的ICS出口 (28)出膜層ICS。在滲透物收集管中收集耗竭的培養(yǎng)基/滲透物。用此方法，將新鮮的營(yíng) 養(yǎng)物連續(xù)供給到固定的細(xì)胞/生物膜，同時(shí)從細(xì)胞培養(yǎng)空間連續(xù)移出可不利地影響細(xì)胞生 長(zhǎng)的代謝廢物。此外，依賴(lài)于目的產(chǎn)物的分子特征和第二膜層內(nèi)毛細(xì)管膜的物理特征，分泌 的產(chǎn)物可連續(xù)產(chǎn)生和隨著滲透物從生物反應(yīng)器移出，由此保持生物質(zhì)和防止細(xì)胞生長(zhǎng)被毒 性代謝物抑制，產(chǎn)物形成的負(fù)反饋控制和/或不穩(wěn)定的產(chǎn)物的酶解。連續(xù)操作下，細(xì)胞培養(yǎng)方法可需要其他營(yíng)養(yǎng)物，例如用于高密度細(xì)胞生長(zhǎng)的增加 的溶解氧(DO)。第二膜層腔可充氣(B)，在那里，從第二膜層的ICS入口 (XT)供給濕潤(rùn)的 氣體，從入口(入口儲(chǔ)液池)進(jìn)入流體分配室，流過(guò)膜層中全部毛細(xì)管的ICS，從出口(出口 儲(chǔ)液池)進(jìn)入流體分配室，隨著滲透物從相同膜層的ICS出口 08)出。溶解的氧可從ICS 穿過(guò)膜壁向ECS(b)擴(kuò)散，在那里，其可被固定的細(xì)胞/生物膜代謝?？赏ㄟ^(guò)集成的處理控 制器，使用DO探頭調(diào)節(jié)充氧速度，例如通過(guò)調(diào)節(jié)濕潤(rùn)的氣體流中的O2水平。第三膜層(C)可用于通過(guò)酸性或堿性溶液，二氧化碳(CO2)或碳酸氫鹽的控制的 供給來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)流體PH。這些溶質(zhì)或溶解的代謝物可從第三膜層的ICS入口 03)供 給，從ICS入口進(jìn)入流體分配室(入口儲(chǔ)液池)，通過(guò)膜層中的全部毛細(xì)管腔，從出口(出口 儲(chǔ)液池)進(jìn)入流體分配室，從相同膜層的ICS出口 04)出?？蓮腎CS穿過(guò)膜壁(c)將緩沖 化合物供給到ECS。緩沖化合物穿過(guò)膜壁從ICS到ECS內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)流體的遞送速度可通 過(guò)集成的處理控制器，使用PH探頭控制。例如用于調(diào)節(jié)流體穿過(guò)膜壁遞送到ECS的集成的 壓力控制器。可使用第四膜層供給特定生長(zhǎng)調(diào)控因子或影響細(xì)胞代謝和/或目的化合物生產(chǎn) 的其他化合物(D)。這些化合物可昂貴或不穩(wěn)定?？蓪⑺龌衔镌趬毫ο峦ㄟ^(guò)第四膜層 的ICS入口 0 供給(D)到細(xì)胞培養(yǎng)空間，進(jìn)入入口流體傳送室(入口儲(chǔ)液池)，通過(guò)第 四膜層中的毛細(xì)管腔，從出口(出口儲(chǔ)液池)進(jìn)入流體傳送室，通過(guò)相同膜系統(tǒng)的ICS出口 (26)出。特定代謝物(d)穿過(guò)膜壁，從ICS到ECS內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)流體的遞送速度可使用處 理特定集成的控制策略控制。例如用于調(diào)節(jié)流體穿過(guò)膜壁遞送到ECS的集成的壓力控制器。應(yīng)注意，膜系統(tǒng)(層)數(shù)，遞送到細(xì)胞培養(yǎng)空間的物質(zhì)的組成和順序可不同，但改 善的質(zhì)量轉(zhuǎn)移，獨(dú)立的流體傳送和集成的處理控制器的原理保持相同。從不同膜系統(tǒng)的ICS 遞送到ECS的全部化合物通過(guò)對(duì)流在ECS內(nèi)和通過(guò)固定的細(xì)胞層/生物膜運(yùn)輸。隨著這些 物質(zhì)通過(guò)固定的細(xì)胞層/生物膜，它們被細(xì)胞代謝，導(dǎo)致自我調(diào)控穿過(guò)生物膜建立的梯度。 在集成的處理中完全控制這些梯度的性質(zhì)，及允許可用于在連續(xù)的處理中調(diào)節(jié)形態(tài)分化和 生長(zhǎng)期相關(guān)代謝的連貫的處理?xiàng)l件，其規(guī)模由所用膜插入件的數(shù)量和尺寸限定。實(shí)施例固定在有單個(gè)盒體的可縮放的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的ECS內(nèi)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞的培養(yǎng)CHO細(xì)胞常規(guī)用于生物和醫(yī)學(xué)研究，包括毒性篩選，營(yíng)養(yǎng)和基因表達(dá)。CHO細(xì)胞是 用于重組蛋白治療劑生產(chǎn)的最常用的哺乳動(dòng)物宿主。CHO-Kl是貼壁依賴(lài)性細(xì)胞系，其在適宜細(xì)胞培養(yǎng)表面一般生長(zhǎng)為單層，且在我們 的實(shí)驗(yàn)室，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中常規(guī)生長(zhǎng)至細(xì)胞密度約1 X IO5細(xì)胞/cm2表面積。染色和培養(yǎng)條件在T-75瓶中，使用30ml補(bǔ)充了 5% (ν/ν)胎牛血清(FBS)和1% (ν/ν)青霉素/ 鏈霉素的含2mM谷氨酰胺的DMEM-F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)貼壁的CHO-Kl細(xì)胞。細(xì)胞每 3 4天傳代。使用含80ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基的T-150瓶進(jìn)行培養(yǎng)物擴(kuò)展。全部培養(yǎng)在CO2-溫 育器中于37°C進(jìn)行。說(shuō)道接種，將細(xì)胞懸浮于15 20ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。此例中，將約2. 5X IO7細(xì)胞 用作接種物。反應(yīng)器裝置使用包括被頂板固定的單個(gè)盒體的一次性的生物反應(yīng)器模塊進(jìn)行CHO-Kl培養(yǎng)。 生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)提供了在119cm3的工作體積(ECS體積)中，用于貼壁的細(xì)胞生長(zhǎng)的519cm2 的總毛細(xì)管表面積。生物反應(yīng)器和輔助裝置示意于圖5，且其包括集成于頂板之一的pH探 頭和溶解氧探頭，以監(jiān)控ECS內(nèi)的處理情況。此例中，盒體內(nèi)的4個(gè)陶瓷膜層均包括相同化 學(xué)組成、但不同孔尺寸的膜，從而各膜層在操作過(guò)程中輔助不同功能，如下所述。層1 :1400nm陶瓷毛細(xì)管-通過(guò)腔用充氣移出耗竭的營(yíng)養(yǎng)物層2 :40nm陶瓷毛細(xì)管-通過(guò)腔供給100%氧層3 1400nm陶瓷毛細(xì)管-通過(guò)腔供給營(yíng)養(yǎng)物溶液層4 :40nm陶瓷毛細(xì)管-通過(guò)腔供給100%氧使用5%二氧化碳/壓縮氣體氣動(dòng)供給生長(zhǎng)培養(yǎng)基，從而自培養(yǎng)基供給管的營(yíng)養(yǎng) 物流通過(guò)位于層3的全部膜的腔(ICQ。操作之前，通過(guò)從培養(yǎng)基供給管填充培養(yǎng)基，通過(guò) 層3ICS并進(jìn)入填充收集管來(lái)從網(wǎng)和膜腔置換氣體。操作期間夾閉層3的ICS出口，且以死 端模式操作培養(yǎng)基供給，從而使?fàn)I養(yǎng)物從ICS通過(guò)毛細(xì)管膜壁及進(jìn)入ECS或細(xì)胞生長(zhǎng)隔間。 從ECS置換耗竭的培養(yǎng)基，及經(jīng)膜層1移出。類(lèi)似的，通過(guò)位于層2和4的毛細(xì)管膜ICS供給100%氧。以大于或等于培養(yǎng)基供 給壓力的壓力供給氧，依賴(lài)于細(xì)胞生長(zhǎng)隔間內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的氧攝取要求。無(wú)氣泡充氧主要是 擴(kuò)散性的，且被通過(guò)ICS表面的氣流促進(jìn)。通過(guò)還用于維持比流速的流控制閥維持反壓。終層具有兩個(gè)功能第一，自增濕管的壓縮氣流通過(guò)層1的ICS進(jìn)入收集管，然后 其通過(guò)流控制閥釋放。流控制閥維持氣流于比流速，且還提供操作要求的反壓；第二，操作 期間從ECS移出耗竭的培養(yǎng)基，穿過(guò)毛細(xì)管壁及以等于培養(yǎng)基供給速度的速度進(jìn)入層1的 ICS。將進(jìn)入層1膜腔的滲透物隨著通過(guò)此層的氣流排入收集管。滲透物可采樣或經(jīng)采樣 孔從收集管移出。滅菌將有網(wǎng)和無(wú)菌連接件的一次性的生物反應(yīng)器模塊用Y-照射。將培養(yǎng)基供給管，填充管，增濕管，滲透物收集管和接種管(各有網(wǎng)和無(wú)菌連接件)在接種之前，經(jīng)獨(dú)立地高 壓滅菌，并無(wú)菌連接到經(jīng)Y-照射的生物反應(yīng)器模塊。接種接種之前，將無(wú)菌生物反應(yīng)器裝置和生長(zhǎng)培養(yǎng)基于37°C預(yù)溫育。將生長(zhǎng)培養(yǎng)基用 5%二氧化碳/氣體噴射和平衡至pH7. 2。將2. 5 X IO7CHO-Kl細(xì)胞直接接種到生物反應(yīng)器ECS內(nèi)。通過(guò)用補(bǔ)充了 10% (ν/ ν)胎牛血清(FBS)和1 % (ν/ν)青霉素/鏈霉素的含2mM谷氨酰胺的DMEM-F12生長(zhǎng)培養(yǎng) 基填充ECS來(lái)將細(xì)胞固定于毛細(xì)管膜外表面。在穿過(guò)膜壁壓力下將進(jìn)入ECS的自接種管的 培養(yǎng)基流導(dǎo)入毛細(xì)管腔(ICS)，導(dǎo)向填充管，然后在操作前再循環(huán)到培養(yǎng)基供給管內(nèi)。操作使用補(bǔ)充了 10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)和(ν/ν)青霉素/鏈霉素的含2mM谷 氨酰胺的DMEM-F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基(用5%二氧化碳/氣體平衡至pH7. 2)于37°C培養(yǎng)細(xì)胞。接種后，用通過(guò)膜層1的ICS的恒定空氣流量和壓力(40kPa)及用通過(guò)膜層2和 4的恒定100%氧流量和壓力(50 70kPa)操作生物反應(yīng)器。每隔一段時(shí)間調(diào)節(jié)氧壓力， 以支持增加的氧遞送和維持ECS內(nèi)的DO濃度(10 30% )，用于增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)和活力。 氧壓力不得低于施加到培養(yǎng)基供給管的壓力，防止耗竭的培養(yǎng)基流進(jìn)入這些膜層。隨著CHO細(xì)胞生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物耗竭、且由于通過(guò)細(xì)胞代謝產(chǎn)生廢物產(chǎn)物而ECS內(nèi)的培 養(yǎng)基PH(細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境)改變。從ECS移出耗竭的培養(yǎng)基，及將新鮮的培養(yǎng)基置換進(jìn)膜層 1的ICS中，所述新鮮的培養(yǎng)基從膜層3的ICS被供給到ECS。將耗竭的培養(yǎng)基從膜層1的 ICS置換，并隨著流過(guò)膜層1的ICS的氣體轉(zhuǎn)移到收集管。通過(guò)施加到培養(yǎng)基供給管的氣 動(dòng)壓力(> 40kPa)和施加到膜層1的ICS的恒定壓力(=40kPa)之間的壓力差調(diào)節(jié)供給 新鮮的培養(yǎng)基和從ECS移出耗竭的培養(yǎng)基的速度。調(diào)節(jié)流速至超過(guò)生長(zhǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物需要 (1 IOml/小時(shí))。操作期間，監(jiān)控ECS內(nèi)的pH，且當(dāng)培養(yǎng)基供給速度不能緩沖細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)，每隔 一段時(shí)間向培養(yǎng)基供給摻入小體積碳酸氫鹽，以補(bǔ)償以高細(xì)胞密度增加的廢物蓄積。用此 方法，將ECS的pH維持在pH6. 8以上。連續(xù)操作生物反應(yīng)器，且細(xì)胞維持11天的時(shí)間，然后拆開(kāi)膜模塊，及使用臺(tái)盼藍(lán) 對(duì)CHO-Kl計(jì)數(shù)。每天從收集管采樣耗竭的培養(yǎng)基，用于底物分析。結(jié)果與討論連續(xù)操作CHO-Kl細(xì)胞培養(yǎng)11天。如圖6的底物分析顯示，培養(yǎng)期間，在全部時(shí)間， 營(yíng)養(yǎng)物供給超過(guò)需求。接種后，細(xì)胞的葡萄糖攝取速度低，表明生長(zhǎng)有1 2天的延遲期。 第2天后，觀(guān)察到葡萄糖攝取速度從0. Img/小時(shí)增加，在第4天達(dá)到最大值12mg/小時(shí)，之 后葡萄糖攝取速度下降并穩(wěn)定在培養(yǎng)殘余的約8mg/小時(shí)。表明在第4天得到最大細(xì)胞產(chǎn)率。乳酸鹽生產(chǎn)遵循與葡萄糖攝取速度類(lèi)似的趨勢(shì)，細(xì)胞將葡萄糖代謝為乳酸鹽的水 平保持低于攝取速度，直到第9天，在該時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞應(yīng)激于低培養(yǎng)基pH，其降至pH6. 8以 下。當(dāng)細(xì)胞代謝明顯不再適于生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)停止，及測(cè)定總細(xì)胞產(chǎn)率。得到1. 5 X IO8細(xì)胞的總細(xì)胞產(chǎn)率。這些細(xì)胞中，1. 5 X IO7細(xì)胞松散粘連或懸浮于 ECS，而胰蛋白酶消化后收獲1. 3X IO8貼壁的細(xì)胞。
此實(shí)驗(yàn)中，得到2. 5X IO5細(xì)胞/cm2的貼壁的細(xì)胞密度，良好比肩于Syzmanski等 人報(bào)道的T175瓶(1. 7 X IO5細(xì)胞/cm2)和HYPER瓶O. 2 X IO5細(xì)胞/cm2)培養(yǎng)中的最大CHO 細(xì)胞密度O008)。參考文獻(xiàn)1. Szymanski, S. L, Huff, K. W, Patel, A. D. ,Murray, J. R, Feasby, J. , Sharma, B. V., Denise Young, D. K. , Strulovici, B. , Peltier, R. R. , Johnson, E. N. and Rush, A. (2008) Automated application of a novel high yield, high performance tissue culture flask. JALA vol. 13(3) :136-144.
權(quán)利要求
1.可縮放的生物反應(yīng)器，其包括 至少1個(gè)盒體，所述盒體包括歧管和空心纖維膜裝置； 上頂板；和 下頂板， 其中所述盒體是模塊化部件，其適于彼此配合、和與所述頂板配合，以限定內(nèi)部毛細(xì) 管外培養(yǎng)空間(ECS)，且 其中所述空心纖維膜裝置包括分離的入口和出口。
2.權(quán)利要求1的可縮放的生物反應(yīng)器，其中各空心纖維膜裝置包括入口和出口儲(chǔ)液 池，所述入口和出口儲(chǔ)液池位于在所述膜各端的歧管處，各儲(chǔ)液池與相應(yīng)入口或出口成流 體連通。
3.權(quán)利要求1或2的可縮放的生物反應(yīng)器，其中所述空心纖維膜設(shè)置在基本上平行的 膜層(排)中。
4.權(quán)利要求3的可縮放的生物反應(yīng)器，其中各盒體包括1個(gè)或多個(gè)所述層(排)。
5.權(quán)利要求3的可縮放的生物反應(yīng)器，其中，當(dāng)各盒體包括多于1個(gè)層(排)時(shí)，空心 纖維膜各層在水平或豎直方向上與其上和/或其下層垂直設(shè)置。
6.權(quán)利要求3的可縮放的生物反應(yīng)器，其中空心纖維膜各排相對(duì)于其上和/或其下的 膜排偏移。
7.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的可縮放的生物反應(yīng)器，其中各盒體針對(duì)每個(gè)功能包括1個(gè) 空心纖維膜層(排)。
8.盒體，其包括適于接收空心纖維膜裝置的歧管， 所述盒體包括用于各空心纖維膜裝置的分離的入口和出口，且 其中所述盒體適于 ■與另一盒體接合，和/或 ■與上和下頂板接合， 以限定內(nèi)部ECS。
9.用于生物反應(yīng)器的成套工具，其包括 歧管，其適于接收空心纖維膜裝置、和 上和下頂板。
10.權(quán)利要求9的成套工具，其包括適于接收所述歧管的盒體，所述盒體適于 眷與另一盒體配合，和/或眷與所述上和下頂板配合。
11.權(quán)利要求10的成套工具，其包括至少1個(gè)空心纖維膜，所述空心纖維膜可安裝或不 安裝在所述歧管內(nèi)。
12.權(quán)利要求10的成套工具，其中所述盒體包括適于接收所述空心纖維膜的2個(gè)相對(duì) 的歧管，所述歧管通過(guò)側(cè)向支撐件彼此連接，以形成框架。
13.利用細(xì)胞和/或微生物代謝的方法，所述方法包括利用權(quán)利要求1的生物反應(yīng)器的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法包括將所述細(xì)胞和/或微生物接種到所述生 物反應(yīng)器的所述ECS中。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中， 所述細(xì)胞和/或微生物被固定于所述空心纖維膜的外表面，和/或 眷所述細(xì)胞和/或微生物被懸浮于所述ECS中。
16.權(quán)利要求13 15中任一項(xiàng)的方法，包括由標(biāo)準(zhǔn)交叉流操作或由死端操作通過(guò)所述 空心纖維膜裝置的入口系統(tǒng)的流體流。
17.權(quán)利要求13 16中任一項(xiàng)的方法，包括控制器，所述控制器用于調(diào)節(jié)通過(guò)所述空 心纖維膜的流體傳送。
18.權(quán)利要求13 17中任一項(xiàng)的方法，包括供給和/或移出物質(zhì)，所述物質(zhì)包括營(yíng)養(yǎng) 物、氣體，例如氧和二氧化碳、緩沖劑(酸性或堿性溶液)、激素、調(diào)控生長(zhǎng)或改變代謝的化 合物、耗竭的培養(yǎng)基、代謝廢物、目的產(chǎn)物和熱交換物質(zhì)，其中所述物質(zhì)眷經(jīng)所述盒體的入口或出口系統(tǒng)、和/或 通過(guò)所述上和下頂板中的開(kāi)口(孔) 被供給到所述生物反應(yīng)器中。
19.權(quán)利要求13 18中任一項(xiàng)的方法，包括通過(guò)所述ECS的流體流，其中所述流體流 還以死端模式再循環(huán)或循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及可縮放的生物反應(yīng)器，其包括至少1個(gè)包括歧管和空心纖維膜裝置的盒體；上頂板；和下頂板，其中盒體是模塊化部件，其適于彼此配合及與頂板配合，以限定內(nèi)部毛細(xì)管外培養(yǎng)空間(ECS)，且其中空心纖維膜裝置包括分離的入口和出口。本發(fā)明還涉及用于此類(lèi)生物反應(yīng)器的成套工具，用于此類(lèi)生物反應(yīng)器和利用細(xì)胞和/或微生物代謝的方法的盒體，所述方法包括利用本發(fā)明的生物反應(yīng)器的步驟。
文檔編號(hào)C12M1/12GK102057033SQ200980121214
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者S·J·弗拉瑟, W·愛(ài)德華茲 申請(qǐng)人:辛尼克薩生命科學(xué)(私人)有限公司