專利名稱：通過修飾的轉(zhuǎn)運蛋白表達而最小化氨基甲酸乙酯產(chǎn)生的功能增強的酵母的制作方法
通過修飾的轉(zhuǎn)運蛋白表達而最小化氨基甲酸乙酯產(chǎn)生的功能增強的酵母
背景技術：
氨基甲酸乙酯(也稱為尿烷)作為來源于用酵母發(fā)酵食物和飲料的直接副產(chǎn)物形 成。例如，氨基甲酸乙酯(可能的致癌劑)的形成通過尿素與乙醇的反應而存在于發(fā)酵葡 萄汁(grape must)(葡萄酒(wine))中?？梢杂猛ㄟ^DUR1，2的組成型表達降解尿素的酵母菌株來產(chǎn)生具有低氨基甲酸乙 酯濃度的發(fā)酵飲料或食品(Coulon 等，2006，Am. J. Enol. Vitic. :113-124) 0在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，DUR3基因編碼在某些條件下主動 轉(zhuǎn)運尿素至酵母細胞內(nèi)的尿素轉(zhuǎn)運蛋白(DUR3p)。DUR3基因的轉(zhuǎn)錄正常情況下受到氮分 解代謝物阻抑(NCR，ElBerry 等，1993，J. Bacteriol. 175 :4688-4698 ；Goffeau 等，1996， Science 274 (5287)，546-547 Johnston 等，1994，Science 265 (5181)，2077-2082)。這只 是利用糖類的酵母細胞中涉及氮代謝的合成代謝酶和分解代謝酶的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的一個方面。 概述本發(fā)明部分涉及提供用于降低發(fā)酵飲料或食品中氨基甲酸乙酯濃度的產(chǎn)品和方 法，其使用已轉(zhuǎn)化來在發(fā)酵條件下表達尿素轉(zhuǎn)運蛋白如DUR3以主動轉(zhuǎn)運尿素至酵母細胞 內(nèi)的酵母菌株。還可以修飾酵母以在發(fā)酵條件下表達胞內(nèi)尿素降解酶活性，如DUR1，2。本發(fā)明部分提供已轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下例如組成型表達DUR3的新的酵母菌株， 以及用于酵母菌株的功能增強以使該酵母在發(fā)酵條件下例如組成型表達酵母DUR3的方 法，以及該酵母菌株在降低發(fā)酵飲料或食品氨基甲酸乙酯中的用途。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供已轉(zhuǎn)化以組成型表達DURl，2和DUR3的新的酵 母菌株，以及該酵母菌株在降低發(fā)酵飲料或食品氨基甲酸乙酯中的用途。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供轉(zhuǎn)化以不斷表達DUR3p的酵母菌株和轉(zhuǎn)化以不 斷表達DUR3p和尿素酰胺裂合酶(amidolyase) 二者的酵母菌株，該尿素酰胺裂合酶包含尿 素羧化酶(urea carboxylase)和脲基甲酸酯水解酶活性二者。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供已轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下持續(xù)攝取尿素的酵母菌 株。其中該酵母可以組成型表達DUR3。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供已轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下持續(xù)攝取并同時降解尿 素的酵母菌株。其中該酵母菌株可以組成型表達DUR1，2和DUR3 二者。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用于修飾酵母菌株的方法，其包括轉(zhuǎn)化該酵母 菌株以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達的氮分解代謝物阻抑。其中該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可 以由DUR3編碼，且其中該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以是DUR3P。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用于修飾酵母菌株以組成型表達DUR3的方法。 其中該方法可以包括將1/2TRPI-PGKp-D UR3_PGKt-kanMX_l/2TRPl盒整合入TRPl基因座。 其中該方法可以包括用包含編碼DUR3p的編碼序列的新的核酸轉(zhuǎn)化該酵母菌株。其中該方 法可以包括用包含不受氮分解代謝物阻抑的啟動子的重組核酸轉(zhuǎn)化該酵母。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供通過上文該功能增強的酵母菌株，如在發(fā)酵條件下例如通過組成型表達來表達DUR3或DUR1，2和DUR3 二者的菌株的用途來產(chǎn)生發(fā)酵飲 料或食品的方法。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供組成型表達DUR3或DURl，2和DUR3 二者的轉(zhuǎn)化 的酵母菌株以降低發(fā)酵飲料或食品中氨基甲酸乙酯的濃度的用途。其中該發(fā)酵飲料或食品 可以是葡萄酒，且降低的氨基甲酸乙酯的濃度可以是30ppb以下。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用組成型表達DUR3或DURl，2和DUR3 二者的轉(zhuǎn) 化的酵母菌株產(chǎn)生的具有降低的氨基甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品。其中該發(fā)酵飲料或 食品可以是葡萄酒，且降低的氨基甲酸乙酯的濃度可以是30ppb以下。附圖簡述

圖1.DUR3 遺傳盒。圖2顯示釀酒酵母DUR3p蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO :7)。圖3顯示釀酒酵母DUR3編碼序列(SEQ ID NO 8)。圖4顯示在DUR1，2起始密碼子ATG處終止的DUR1，2基因上游區(qū)域的部分序列 (SEQ ID NO 9)。突出顯示兩個推定的NCR元件GATAA(G)框(一個在位點巧4至-58，另 一個在位點-320至-3 )以及推定的TATAA框。圖5顯示DUR3基因上游區(qū)域的部分序列(SEQ ID NO 10)。圖6顯示多蛋白質(zhì)序列比對，說明DUR3p(序列NP_011847. 1(SEQ ID NO 7)) 和其他 7 種蛋白質(zhì)(序列 ΝΡ_595871· 1(SEQ ID NO :11)、ΧΡ_452980· 1 (SEQ ID N0:12)、 NP_982989. 1 (SEQ ID NO :13)、XP_364218. 1 (SEQ ID NO :14)、XP_329657. 1 (SEQ ID NO 15) ,NP_199351. 1 (SEQ ID NO :16)和 NP_001065513. 1 (SEQ ID NO :17))之間的同源性。圖 7 顯示DUR3p(SEQ ID NO :7)與(預測的)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)尿素轉(zhuǎn)運蛋白的BLAST比較并顯示共有序列。在其他實施方案中，本發(fā)明的尿素轉(zhuǎn) 運蛋白在最佳比對時，可以與釀酒酵母DUR3p序列或與粟酒裂殖酵母尿素轉(zhuǎn)運蛋白或與此 圖中顯示的共有序列具有各種程度的同一性，如80%同一性。圖8顯示Chardonnay葡萄酒中的葡萄酒酵母菌株522、522DUR1，2 [522EG_的另一 種命名]、522DUR3和522DUR1，2/DUR3[522E 的另一種命名]的發(fā)酵譜(重量損失)。 Chardonnay葡萄酒產(chǎn)生自接種至最終0D600 = 0. 1并在20°C孵育至完成( 300小時) 的未過濾的Calona Chardonnay葡萄汁。圖9是本發(fā)明的DUR3自身克隆盒的示意圖。圖 10 是自身克隆的 leu2-PGKlp-kanMX-PGKlp-DUR3-PGKlt-leu2 盒通過 PGKl 啟 動子同向重復的重組，用kanMX標記和隨后的標記喪失整合入釀酒酵母工業(yè)菌株的LEU2基 因座的示意圖。發(fā)明詳述本文未直接定義的任意術語應理解為具有與本發(fā)明的領域內(nèi)所理解的通常與它 們相關的意義。在下文或說明書中的其他地方討論了某些術語，以向描述本發(fā)明實施方案 的組合物、設備、方法等及如何產(chǎn)生或使用它們的實施者提供其他指導。應理解，可以以一 種以上的方式表述同一事物。因此，可以將其他語言和同義詞用于本文所討論的任意一個 或多個術語。本文是否闡述或討論術語并不重要。提供了一些同義詞或可替代的方法、材 料等。除非明確地說明，一個或幾個同義詞或等同物的列舉不排除其他同義詞或等同物的 使用。實例(包含術語的實例)在說明書中的使用只是為了說明性目的，而不限制本發(fā)明 的實施方案的范圍和意義。
本文所提到的“酵母菌株”可以是釀酒酵母的菌株。在其他實施方案中，本發(fā)明可 以例如使用貝酵母(S. bayanus)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)酵母菌株。在其他方面，本發(fā)明涉及用于發(fā)酵以產(chǎn)生各種產(chǎn)品，如發(fā)酵飲料或食品的酵母菌 株?！鞍l(fā)酵飲料或食品”可以是但不限于葡萄酒、白蘭地酒、威士忌、蒸餾酒精、乙醇、清酒 (sake)、雪利酒、啤酒、生面團、面包、醋或醬油。在各個方面，本發(fā)明涉及基因的修飾和重組基因的用途。在此背景中，術語“基因” 按照其通常定義使用，意指有效連接的核酸序列組。在本發(fā)明的背景中，基因的修飾可以包 含在基因中有效連接的各個序列中任一序列的修飾?！坝行нB接”指特定序列直接或間接地 相互作用以實現(xiàn)它們的預期功能，如基因表達的介導和調(diào)節(jié)。有效連接的序列的相互作用 可以通過例如蛋白質(zhì)介導，而該蛋白質(zhì)又反過來與這些序列相互作用。在本發(fā)明的背景中，“啟動子”指當轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)有效連接至目的序列時，能夠介導 或調(diào)節(jié)目的核苷酸序列以期望的空間或時間模式及期望的程度轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。當序列 功能性連接使得允許待通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)介導或調(diào)節(jié)的目的序列的轉(zhuǎn)錄時，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和目 的序列“有效連接”。在一些實施方案中，為了有效連接，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以和目的序列位于相 同的鏈上。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以位于目的序列的5’。在這類實施方案中， 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以直接是目的序列的5’或這些區(qū)域間可以存在間插序列。在一些實施方案 中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以位于目的序列的3’。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和目的序列的有效連接可以需要適 當?shù)姆肿?如轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì))結(jié)合至轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)上，因此本發(fā)明包含在體外或在體內(nèi)提 供這類分子的實施方案。本發(fā)明的各種基因和核酸序列可以是重組序列。術語“重組”意指一些事物已重 新組合，因此提到核酸構(gòu)建體時，此術語指由通過分子生物學技術在某一點連接在一起或 形成的核酸序列組成的分子。當與蛋白質(zhì)或多肽一起提到時，術語“重組”指利用通過分子 生物學技術產(chǎn)生的重組核酸構(gòu)建體表達的蛋白質(zhì)或多肽分子。當與遺傳組成一起提到時， 術語“重組”指具有在天然存在的親代基因組中不存在的新的等位基因組合的配子或子代 或細胞或基因組。重組核酸構(gòu)建體可以包含連接至或通過操作以連接至在自然界不連接或 在自然界中在不同位點連接的核酸序列的核苷酸序列。因此，稱核酸構(gòu)建體為“重組體”是 指利用遺傳工程通過人為干預操作的核酸分子。重組核酸構(gòu)建體可以例如通過轉(zhuǎn)化引入宿主細胞。這類重組核酸構(gòu)建體可以包括 已經(jīng)分離出來并重新引入宿主物種細胞中的來源于相同宿主細胞物種或來源于不同宿主 細胞物種的序列。作為宿主細胞最初轉(zhuǎn)化的結(jié)果或者作為隨后重組和/或修復事件的結(jié)果，重組核 酸序列可以整合進入宿主細胞基因組。備選地，重組序列可以作為染色體外元件保持。這 類序列例如可以通過用如轉(zhuǎn)化的酵母菌株的生物體作為通過突變、群體交配或原生質(zhì)體融 合進行的菌株改進方法的起始菌株來復制。如術語“重組”在本文的使用，認為產(chǎn)生的保留 了本發(fā)明重組序列的菌株本身是“重組體”。在本發(fā)明的各個方面，可以利用如在例如Itakura等，美國專利號4，598，049 ； Caruthers等，美國專利號4，458，066 ；和Itakura美國專利號4，401，
轉(zhuǎn)化是通過將一個或多個外源核酸摻入細胞從而改變細胞所攜帶的遺傳物質(zhì)的 方法。例如，可以利用各種方法轉(zhuǎn)化酵母(Gietz等，19%)。通過將外源核酸摻入細胞遺傳 物質(zhì)中，或者利用細胞暴露于外源核酸所產(chǎn)生的細胞內(nèi)源遺傳物質(zhì)的改變可以實現(xiàn)這種轉(zhuǎn) 化。轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)化細胞是通過對外源核酸的攝取已在功能上增強的細胞或細胞后代。如本 文所用，這些術語適用于通過隨后的細胞世代保持了期望的遺傳改變的轉(zhuǎn)化細胞的后代， 并與同樣可以存在于隨后的細胞世代的細胞中的其他突變或改變無關。用于產(chǎn)生葡萄酒的轉(zhuǎn)化宿主細胞可以例如包含釀酒酵母或裂殖酵母屬的菌株， 如Bourgovin (RC 212釀酒酵母)、ICV D-47釀酒酵母、71B-1122釀酒酵母、K1V-1116釀酒 酵母、EC-1118釀酒酵母、Vinl3、Vin7、N96和TO352。存在酵母菌株的各種商業(yè)來源，如 Lallemand Inc.(加拿大)、AB Mauri (澳大利亞)和 Lesaffre (法國)。在各種實施方案中，本發(fā)明的一些方面可以利用具有尿素轉(zhuǎn)運活性，如DUR3的尿 素轉(zhuǎn)運活性的內(nèi)源或外源酶。類似地，在一些實施方案中，本發(fā)明的一些方面可以利用具有 尿素降解活性，如DURl，2p的尿素羧化酶和脲基甲酸酯水解酶活性的內(nèi)源或外源酶。這些 酶可以與DUR3p或DURl，2p同源，或與具有相關活性的DUR3p或DUR1，2p的區(qū)域同源。當序列(如天然DUR3p或DURl，2p或天然DUR3或DUR1，2核酸序列和用于本 發(fā)明中的其他蛋白質(zhì)或核酸序列)最佳比對時，序列間的同源性程度可以表示為同一性 百分比，意指序列間精確匹配的出現(xiàn)?？梢岳酶鞣N算法，如Smith和Waterman, 1981， Adv. App 1. Math 2 :482 的局部同源性算法，Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443 的同源性比對算法，Pearson 和 Lipman，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444 的 相似性檢索方法和這些算法的計算機化執(zhí)行程序(如Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI, U. S. A.)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA)進行用于同一性比較的序列的最佳比對。也可以利用描述于Altschul等，1990， J. Mol. Biol. 215 :403-10中的BLAST算法(利用公開的默認設置值)進行序列比對?？?以通過 National Center For Biotechnology Information (通過互聯(lián)網(wǎng)在 http://www. ncbi.nlm.nih. gov/)獲得進行BLAST分析的軟件。BLAST算法涉及首先通過鑒定待查序列 中長度W的短字串來鑒定高得分序列對(HSP)，該字串與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比 對時將匹配或滿足一定的正值閾值分數(shù)T。T稱為相鄰字串得分閾值。最初的相鄰字串命 中作為種子用于起始檢索以發(fā)現(xiàn)更長的HSP。字串命中沿著每條序列在兩個方向延伸，直至 累積比對得分可以增加。當滿足以下參數(shù)時，每個方向上字串命中的延伸停止累積比對得 分從它的最大達到值降低量X ；由于一個或多個負得分殘基比對的累積，累積得分趨向零 或更低值；或者達到任一條序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速 度。對于雙鏈核酸比較，BLAST程序可以利用如下作為默認值字串長度(W)ll、BL0SUM62 評分矩陣(Henikoff 和 Henikoff，1992，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89:10915-10919)比 對(B)50、期望值(E) 10(在其他實施方案中其可以改變?yōu)?或0. 1或0. 01或0. 001或 0. 0001 ；盡管遠高于0. 1的E值不可以鑒定功能上相似的序列，但它可以用于檢查具有較 低顯著性的命中，對短區(qū)域的相似性，E值在0. 1和10之間)、M = 3、N = 4。對于蛋白質(zhì) 比較，BLASTP可以利用如下默認值G= 11 (缺口開放罰分)；E = 1(缺口延伸罰分)；E = 10 (期望值，在該設置下，預期在與所檢序列具有相同大小的數(shù)據(jù)庫中偶然出現(xiàn)具有等于或 好于所定義的比對分數(shù)S的10個命中；可以增加或減少E值以改變檢索的嚴格性)；和W=3 (字串大小，對于BLASTN默認值是11，對于其他blast程序默認值是3)。BLOSUM矩陣 為比對中的每個位點指定概率分數(shù)，該概率分數(shù)基于在相關蛋白質(zhì)的共有序列模塊間出現(xiàn) 置換的已知頻率。在BLAST2. 0中默認使用BL0SUM62(缺口存在罰分=11 ；每個殘基的缺 口罰分=1 ； λ比率=0. 85)置換矩陣。各種其他矩陣可以用作BL0SUM62的替代，其包含 ΡΑΜ30(9,1,0. 87) ；ΡΑΜ70(10，1，0. 87) ；BL0SUM80(10,1,0. 87) ；BL0SUM62(11，1，0· 82)和 BL0SUM45 (14，2,0. 87)。利用BLAST算法的兩個序列間統(tǒng)計學相似性的一個測量是最小總 和概率(smallest sum probability，P(N))，其提供兩條核苷酸或氨基酸序列間偶然出現(xiàn) 匹配的概率的指示。在本發(fā)明的其他實施方案中，如果在測試序列的比較中，最小總和概率 小于約1、優(yōu)選小于約0. 1、更優(yōu)選小于約0.01和最優(yōu)選小于約0. 001，則認為核苷酸或氨基 酸序列基本相同。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以基本相同，如與DUR3p或 DURl，2p，或DUR3或DURl，2核酸序列基本相同。當最佳比對時，這些序列的基本同一性可以 用同一性百分比反映，例如同一性百分比可以是大于50 %、80 %到100 %、至少80 %、至少 90%或至少95%，在基因?qū)ぐ械孜锏那闆r下，其可以指基因?qū)ぐ械孜锏囊徊糠峙c靶序列的 一部分的同一性，其中同一性的程度有利于同源配對和重組和/或修復。兩條核酸序列基 本相同的另一個指示是這兩條序列在中等嚴格條件下，或優(yōu)選在嚴格條件下互相雜交。例 如，在中等嚴格條件下，可以在0. 5MNaHP04、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、lmM EDTA中，在65°C 進行與結(jié)合濾膜的序列的雜交，并在0. 2x SSC/0. 1% SDS中在42°C下洗滌(參見Ausubel 等，(編輯)，1989, Current Protocols in Molecular Biology, 1 卷，Green Publishing Associates, Inc.，和 John Wiley & Sons, Inc.，紐約，在 2. 10. 3 頁)。備選地，例如，在 嚴格條件下，可以在0. 5M NaHPO4,7% SDSUmM EDTA中，在65°C進行與結(jié)合濾膜的序列的 雜交，并在0. Ix SSC/0· SDS中在68°C洗滌(參見Ausubel等，(編輯)，1989，同上引 文)。根據(jù)目的序列，可以按照已知方法修改雜交條件(參見TijSSen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- -Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第二章，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" ,Elsevier, ) ο 通常，在P艮定的離子強度 和PH下，選擇的嚴格條件為對于特定序列而言比其熱熔點低約5°C。對于嚴格雜交，洗滌可 以例如是至少15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘、105分鐘或120分鐘。正如本領域所熟知，可以在多肽，如DUR3或DUR1，2的結(jié)構(gòu)中進行一些修改和改 變，而基本不改變該肽的生物學功能，從而獲得生物學上等同的多肽。在本發(fā)明的一方面， 具有尿素轉(zhuǎn)運活性的蛋白質(zhì)可以包含通過保守氨基酸取代而不同于天然DUR3序列的蛋白 質(zhì)。類似地，具有尿素羧化酶/脲基甲酸酯水解酶活性的蛋白質(zhì)可以包含通過保守氨基酸 取代而不同于天然DUR1，2序列的蛋白質(zhì)。如這里所用，術語“保守氨基酸取代”指在蛋白 質(zhì)中的給定位點上用一個氨基酸對另一個氨基酸進行取代，其中可以進行這種取代而不實 質(zhì)上造成相關功能的損失。在進行這類改變時，可以基于側(cè)鏈取代基，例如，它們的大小、電 荷、疏水性、親水性等的相對類似性進行類似氨基酸殘基的取代，并可以通過常規(guī)測試，針 對它們對蛋白質(zhì)功能的影響測定這類取代。在一些實施方案中，可以進行將一個氨基酸殘基取代為另一個具有類似疏水性值 (例如，在加或減2.0的值之內(nèi))的氨基酸殘基的保守氨基酸取代，其中下面可以是具有約-1. 6的親水指數(shù)的氨基酸殘基，如Tyr(-1. 3)或6)。賦予氨基酸殘基如下疏水性 值(如美國專利號4，554，101中所詳述，其在此處引用作為參考)=Arg(+3. 0) ；Lys (+3. 0)； Asp (+3. 0) ；Glu(+3. 0) ；Ser (+0. 3) ；Asn(+0. 2) ；Gln(+0. 2) ；Gly (0) ；Pro (-0. 5)； Thr (-0. 4) ；Ala(-0. 5) ；His(-0. 5) ；Cys (-1. 0) ；Met(-1. 3) ；Val (-1. 5) ；Leu(-1. 8)； Ile (-1.8) ；Tyr (-2. 3) ；Phe (-2. 5)；和 Trp (-3. 4)。在其他實施方案中，可以進行將一個氨基酸殘基取代為另一個有類似親水指 數(shù)(例如，在加或減2.0的值之內(nèi))的氨基酸殘基的保守氨基酸取代。在這類實施方案 中，可以基于其疏水性和電荷特性來指定每個氨基酸殘基的親水指數(shù)，如下Ile(+4. 5)； Val (+4. 2) ；Leu (+3. 8) ；Phe (+2. 8) ；Cys (+2. 5) ；Met(+1. 9) ；Ala(+1. 8) ；Gly (-0. 4)； Thr (-0. 7) ；Ser (-0. 8) ；Trp (-0. 9) ；Tyr (-1. 3) ；Pro (-1.6) ；His (-3. 2) ；Glu (-3. 5)； Gln (-3. 5) ；Asp (-3. 5) ；Asn (-3. 5) ；Lys (-3. 9)；和 Arg (-4. 5)。在其他實施方案中，可以進行將一個氨基酸殘基取代為同類的另一個氨基酸殘 基的保守氨基酸取代，其中將氨基酸分為非極性、酸性、堿性和中性類，如下非極性Ala、 Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met ；酸性Asp、Glu ；堿性Lys、Arg、His ；中性Gly、Ser、Thr、 Cys、Asn、Gin、Tyr0在其他實施方案中，保守氨基酸改變包含根據(jù)親水性或疏水性、大小或體積或電 荷考慮的改變。一般可以將氨基酸表征為疏水的或親水的，這主要取決于氨基酸側(cè)鏈的 特性。根據(jù)Eisenberg等(J. Mol. Bio. 179 125-142，184)的標準化的共有疏水性標度 (consensus hydrophobicity scale)，疏水氨基酸顯示大于零的疏水性，而親水氨基酸顯 示小于零的疏水性。遺傳編碼的疏水氨基酸包含Gly、Ala、Wie、Val、Leu、lie. Pro, Met和 ρ，遺傳編碼的親水氨基酸包含Thr、His、Glu、Gin、Asp、Arg、Ser和Lys。非遺傳編碼的 疏水氨基酸包含叔丁基丙氨酸，而非遺傳編碼的親水氨基酸含瓜氨酸和高半胱氨酸?？梢愿鶕?jù)其側(cè)鏈特性進一步細分疏水或親水氨基酸。例如，芳香族氨基酸是具有 包含至少一個芳香環(huán)或雜芳香環(huán)的側(cè)鏈的疏水氨基酸，該環(huán)可以含有一個或多個取代基， 如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2, -NO、-NH2, -NHR、-NRR、_C(0)R、-C(O)OH、-C(O) OR、-C(O) NH2、-C(O) NHR、-C (O)NRR 等，其中 R 獨立地是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、 (C「C6)鏈烯基、取代的(C「C6)鏈烯基、(C「C6)炔基、取代的(C「C6)炔基、(C5-C2tl)芳基、取 代的(C5-C2tl)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基、取代的5-20元 雜芳基、646元烷雜芳基(alWieteroaryl)或取代的646元烷雜芳基。遺傳編碼的芳香族 氨基酸包含Phe、Tyr和Tryp。非極性氨基酸是具有如下側(cè)鏈的疏水氨基酸，該側(cè)鏈在生理pH下不帶電荷并且 具有這樣的化學鍵，在該化學鍵中，兩個原子中的每個原子一般平均占有這兩個原子共用 的電子對(即側(cè)鏈不是極性的)。遺傳編碼的非極性氨基酸包含Gly、LeU、Val、Ile、Ala和 Met。可以將非極性氨基酸進一步細分為包含脂肪族氨基酸，脂肪族氨基酸是具有脂肪烴側(cè) 鏈的疏水氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包含Ala、Leu、Val和lie。極性氨基酸是具有如下側(cè)鏈的親水氨基酸，該側(cè)鏈在生理pH不帶電荷，但是其具 有這樣的化學鍵，在該化學鍵中，兩個原子之一更近地占有這兩個原子共用的電子對。遺傳 編碼的極性氨基酸包含kr、Thr, Asn和Gin。酸性氨基酸是具有小于7的側(cè)鏈pKa值的親水氨基酸。由于氫離子的失去，酸性氨基酸在生理PH下通常具有帶負電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包含Asp和Glu。堿 性氨基酸是具有大于7的側(cè)鏈pKa值的親水氨基酸。由于水合氫離子的結(jié)合，堿性氨基酸 在生理pH下通常具有帶正電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包含Arg、Lys和His。本領域技術人員將理解，上述分類不是絕對的，可以將一個氨基酸分在一種以上 的類別中。此外，可以基于指定的測定或與以前鑒定的氨基酸比較，根據(jù)已知行為和/或特 征性化學、物理或生物學特性來分類氨基酸。在本發(fā)明的各個方面，可以調(diào)節(jié)宿主的尿素轉(zhuǎn)運和降解活性，以使得它在發(fā)酵條 件下，如在葡萄酒發(fā)酵條件下處于所期望的水平。術語“發(fā)酵條件”指在該條件下，生物體， 如釀酒酵母通過發(fā)酵產(chǎn)生能量，即發(fā)生發(fā)酵的培養(yǎng)條件。廣義地定義，發(fā)酵是厭氧反應的總 和，在缺乏氧氣的情況下該厭氧反應可以為微生物的生長提供能量。通過底物水平的磷酸 化提供發(fā)酵中的能量。在發(fā)酵中，一種有機化合物(能量源)起到電子供體的作用，而另一 有機化合物是電子受體。各種有機底物，如糖類、氨基酸、嘌呤和嘧啶都可以用于發(fā)酵。在 一方面，本發(fā)明涉及能夠進行產(chǎn)生乙醇的糖發(fā)酵的生物體，如酵母。在葡萄酒發(fā)酵中，葡萄汁的培養(yǎng)條件來源于用作原料的果汁。例如，葡萄汁的主要 組分是葡萄糖(通常約75-150g/l)、果糖(通常約75-150g/l)、酒石酸(通常約2_10g/l)、 蘋果酸(通常約l_8g/l)和游離氨基酸(通常約0. 2-2. 5g/l)。但是，在主要反應是將糖類 轉(zhuǎn)化為乙醇的方法中，實際上可以將任意水果或含糖的植物體汁液加工為醇飲料。葡萄酒酵母通常在約3. 2至4. 5的pH范圍內(nèi)生長和發(fā)酵，并且需要約0. 85的最 小水活性(或者約88%的相對濕度)?？梢宰尠l(fā)酵自發(fā)進行，或者可以通過用先前已發(fā)酵 的葡萄汁接種來起始發(fā)酵，在這種情況下，可以用約IO6到約107CfU/ml果汁的酵母群體接 種果汁?？梢越o葡萄汁通氣以增大酵母群體。一旦發(fā)酵開始，二氧化碳的快速產(chǎn)生通常將 維持厭氧條件。發(fā)酵的溫度通常是10°C -30°C，發(fā)酵的持續(xù)時間可以例如從幾天延長至幾 周。在一個方面，本發(fā)明提供能夠降低發(fā)酵醇飲料中的氨基甲酸乙酯濃度的酵母菌 株。例如，本發(fā)明可以用于提供具有小于40ppb ( μ g/L)、35ppb、30ppb、25ppb、20ppb、15ppb、 IOppb或5ppb (或50ppb和Ippb間的任意整數(shù)值)的氨基甲酸乙酯濃度的葡萄酒。在其 他實施方案中，本發(fā)明可以用于提供具有小于約500ppb、400ppb、300ppb、200ppb、150ppb、 100ppb、90ppb、80ppb、70ppb、60ppb、50ppb、40ppb、30ppb、20ppb 或 IOppb (或 500ppb 和 IOppb間的任意整數(shù)值)的氨基甲酸乙酯濃度的強化(fortified)葡萄酒或蒸餾酒精。在其他實施方案中，本發(fā)明可以提供能夠在葡萄汁中維持降低的尿素濃度的酵母 菌株。例如，尿素濃度可以維持在約 15mg/l、10mg/l、5mg/l、^ig/l、;3mg/l、aiig/l 或 lmg/1 以下。在一方面，本發(fā)明提供篩選在發(fā)酵條件下具有期望水平的尿素降解活性的發(fā)酵生 物體的天然突變體的方法。例如，可以篩選缺少DUR3的NCR的酵母菌株。酵母突變和篩選 方法的實例參見2000年10月31日發(fā)給Mortimer等的美國專利號6，140，108。在這類方 法中，可以用誘變劑如乙基甲磺酸、亞硝酸或羥胺處理酵母菌株，產(chǎn)生具有堿基對取代的突 變體?？梢岳缤ㄟ^在適合的培養(yǎng)基上涂板來篩選具有改變的尿素降解活性的突變體。在其他實施方案中，可以利用定點誘變改變宿主中尿素轉(zhuǎn)運或尿素降解活性的水 平。例如，可以利用定點誘變從酵母啟動子，如DUR3或DUR1，2啟動子除去NCR介導元件。例如，可以通過取代來缺失或修飾如圖4中所示的天然DUR1，2啟動子序列中的GATAA(G) 框。在一個實施方案中，例如，可以通過將G取代為T來修飾一個或兩個GATAA框，這樣序列 變?yōu)門ATAA。定點誘變的方法公開于例如Rothstein，1991 ；Simon和Moore，1987 ；Winzeler 等，1999 ；和Negrittoet等，1997中。在其他實施方案中，也可以突變編碼在釀酒酵母中介 導NCR的Gln3p和feitlp的基因以調(diào)節(jié)NCR。然后可以將缺乏NCR的篩選或改造的啟動子 有效連接至DUR3編碼序列，以在發(fā)酵條件下介導DUR3的表達?？梢韵鄬τ诜寝D(zhuǎn)化的親本菌株測量本發(fā)明酵母菌株的相對尿素轉(zhuǎn)運或降解酶活 性。例如，可以篩選本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的酵母菌株，以在發(fā)酵條件下具有高于親本菌株的尿素轉(zhuǎn) 運或降解活性，或者在相同發(fā)酵條件下，活性以一定比例高于親本菌株的活性，如活性為親 本菌株活性的至少150 %、200 %、250 %、300 %、400 %或500 %。類似地，可以利用類似的活 性倍數(shù)，相對于衍生自本發(fā)明重組核酸的非重組序列測定由本發(fā)明重組核酸表達或編碼的 酶的活性。在本發(fā)明的一方面，可以提供包含具有DUR3編碼序列或其同源物的重組核酸分 子的載體，該核酸分子處于介導DUR3多肽的受調(diào)節(jié)表達的異源啟動子序列的控制下。為了 提供這類載體，可以將來源于釀酒酵母的DUR3可讀框(ORF)插入含有可調(diào)節(jié)重組DUR3基 因表達的表達盒的質(zhì)粒中?？梢詫⒅亟M分子引入選定的酵母菌株以提供具有改變的尿素轉(zhuǎn) 運活性的轉(zhuǎn)化菌株。在其他實施方案中，也可以通過用另一個啟動子置換天然啟動子來影 響宿主，如釀酒酵母中天然DUR3編碼序列同源物的表達。也可以用其他調(diào)節(jié)元件來構(gòu)建利 用內(nèi)源編碼序列的重組表達盒。可以將重組基因或表達盒整合進入宿主如釀酒酵母的染色 體DNA中?？梢詮倪m合的天然釀酒酵母啟動子篩選用于本發(fā)明的其他實施方案中的啟動子， 如PGKl或CARl啟動子。這類啟動子可以與其他調(diào)節(jié)元件如PGKl或CARl終止子一起使 用?？梢允褂酶鞣N天然或重組啟動子，其中篩選或構(gòu)建啟動子以在選定的條件，如釀酒條件 下介導尿素降解活性，如DURl，2p活性的表達。例如，可以將各種組成型啟動子有效連接至 DUR3編碼序列。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供發(fā)酵糖類的方法，如發(fā)酵葡萄酒的方法，該方法使用 宿主，如用調(diào)節(jié)該宿主尿素轉(zhuǎn)運(攝取)活性的重組核酸轉(zhuǎn)化的酵母菌株。例如，在釀造葡 萄酒的酵母菌株中，可以調(diào)節(jié)DUR3基因的NCR以增強尿素的攝取。根據(jù)本發(fā)明的該方面， 可以利用酵母菌株進行葡萄汁發(fā)酵，以引起有限量的氨基甲酸乙酯產(chǎn)生。盡管本文公開了本發(fā)明的各種實施方案，但是可以根據(jù)本領域技術人員的常識在 本發(fā)明范圍內(nèi)進行許多改變和修改。這類修改包含為了以基本相同的方式達到相同的效果 而用已知等同物取代本發(fā)明的任意方面。數(shù)字范圍包含定義該范圍的數(shù)字。在此說明書中， 詞語“包含”用作開放式術語，基本上等同于短語“包含但不限于”，并且詞語“包括”具有相 應的意義。本文對參考文獻的引用不應理解為承認這類參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術。本 說明書中引用的所有出版物(包含但不限于專利和專利申請)在此引用作為參考，就如每 一單個出版物被明確和單獨地說明在此引用作為參考并如同在此進行了充分陳述。本發(fā)明 包含基本上如前文所述并參考實施例和附圖的所有實施方案和變體。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達的 氮分解代謝物阻抑的酵母菌株。例如，該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以由DUR3編碼，且該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以是DUR3p。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達和 尿素降解酶表達二者的氮分解代謝物阻抑的酵母菌株。該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以由DUR3編碼， 而該尿素降解酶可以由DUR1，2編碼，且該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以是DUR3p，而該尿素降解酶可 以是尿素羧化酶/脲基甲酸酯水解酶。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供已轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下不斷攝取尿素的酵母菌 株。該酵母可以例如組成型表達DUR3。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供已轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下不斷攝取尿素并同時降 解尿素的酵母菌株。其中該酵母菌株可以組成型表達DUR1，2和DUR3 二者。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用于修飾酵母菌株的方法，其包括轉(zhuǎn)化該酵母 菌株以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達的氮分解代謝物阻抑。該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以例 如由DUR3編碼，且該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以是DUR3p。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用于修飾酵母菌株的方法，其包括轉(zhuǎn)化該酵母 菌株以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達和尿素降解酶表達的氮分解代謝物阻抑。該尿 素轉(zhuǎn)運蛋白可以由DUR3編碼，而該尿素降解酶可以由DURl，2編碼，且該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以 是DUR3p，而該尿素降解酶可以是尿素羧化酶或脲基甲酸酯水解酶。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用于修飾酵母菌株以組成型表達DUR3的方法。 該方法可以包括將l/2TRPl-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-l/2TRPl盒整合入TRPl基因座。備選 地，該方法可以包括用包含編碼DUR3p的編碼序列的重組核酸轉(zhuǎn)化該酵母菌株。備選地，該 方法可以包括用包含不受氮分解代謝物阻抑的啟動子的重組核酸轉(zhuǎn)化該酵母。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達 的氮分解代謝物阻抑的酵母菌株產(chǎn)生發(fā)酵飲料或食品的方法。該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以由DUR3 編碼，且該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以是DUR3p。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用轉(zhuǎn)化以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白表達 和尿素降解酶表達二者的氮分解代謝物阻抑的酵母菌株產(chǎn)生發(fā)酵飲料或食品的方法。該尿 素轉(zhuǎn)運蛋白可以由DUR3編碼，而該尿素降解酶可以由DUR1，2編碼。該尿素轉(zhuǎn)運蛋白可以 是DUR3p，而該尿素降解酶可以是尿素羧化酶或脲基甲酸酯水解酶。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供組成型表達DUR3以降低發(fā)酵飲料或食品中氨 基甲酸乙酯濃度的轉(zhuǎn)化的酵母菌株的用途。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供組成型表達DURl，2和DUR3 二者以降低發(fā)酵飲 料或食品中氨基甲酸乙酯濃度的轉(zhuǎn)化的酵母菌株的用途。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供組成型表達DUR3以產(chǎn)生具有低于30ppb的氨基 甲酸乙酯濃度的葡萄酒的轉(zhuǎn)化的酵母菌株的用途。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供組成型表達DURl，2和DUR3 二者以產(chǎn)生具有低 于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度的葡萄酒的轉(zhuǎn)化的酵母菌株的用途。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用組成型表達DUR3的轉(zhuǎn)化的酵母菌株產(chǎn)生的 具有降低的氨基甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用組成型表達DUR1，2和DUR3 二者的轉(zhuǎn)化的酵 母菌株產(chǎn)生的具有降低的氨基甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用組成型表達DUR3的轉(zhuǎn)化的酵母菌株產(chǎn)生的 具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度的葡萄酒。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供用組成型表達DUR1，2和DUR3 二者的轉(zhuǎn)化的酵 母菌株產(chǎn)生的具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度的葡萄酒。實施例在此參考以下非限制性實施例進一步描述本發(fā)明。實施例后是所使用的實驗方法 的描述。實施例1 釀酒酵母葡萄酒菌株中DUR3基因的克隆和組成型表達。用抗生素抗性標記kanMX進行克隆篩選。轉(zhuǎn)化了酵母菌株U⑶avis 522 (Montrachet) ,Prise de Mousse (ECl 118)和 K7_01(清酒酵母)以組成型表達 DUR3 或 DUR1，2和DUR3 二者。廣泛的測試表明，轉(zhuǎn)化的酵母基本上等同于其親本菌株。這表示，預 期的DUR3或DURl，2和DUR3 二者的組成型表達是唯一的遺傳和代謝修飾。實施例2 用DUR3基因盒轉(zhuǎn)化酵母。用包含PGKl啟動子和終止子信號控制下的DUR3基因的重組核酸轉(zhuǎn)化酵母。PGKl 啟動子不受 NCR。DUR3 基因盒-l/2TRPl-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-l/2TRPl。實施例 3 用重組酵母進行發(fā)酵研究以確立降低的氨基甲酸乙酯的出現(xiàn)。DUR3的組成型表達產(chǎn)生酵母菌株，其不僅重吸收作為精氨酸代謝的副產(chǎn)物排泄的 尿素，還吸收天然存在于葡萄汁中的尿素。在暴露于522DUK3酵母菌株的葡萄酒中觀察到氨 基甲酸乙酯的顯著降低( 81% )，暴露于K7—和PDMduk3酵母菌株后分別觀察到25%和 13%的降低(數(shù)據(jù)在表1中)。還已顯示，組成型表達DUR3的酵母與組成型表達DUR1，2的 酵母同樣有效地降低氨基甲酸乙酯濃度。在552和K7酵母菌株中，DUR1，2和DUR3都組成型表達的組合將氨基甲酸乙酯降 低至大約與DURl，2或DUR3單獨組成型表達相同的程度。但是，PDME (DUR1，2和DUR3) 是能夠?qū)⑵咸丫破咸阎械陌被姿嵋阴ソ档椭链笥赑DMDUK3(DUR3)或PDMrc(DURl，2)菌株 單獨的程度的酵母菌株的實例。實施例4 允許除去選擇標記的自身克隆盒。圖9和10顯示允許篩選轉(zhuǎn)化酵母和隨后通過同向重復的重組除去抗生素抗性標 記的DUR3遺傳盒l(wèi)eu2-PGKlp-kanMX-PGKp-DUR3-PGKlt-leu2，其按下文所述在本實施例中使用。用包含PGKl啟動子和終止子信號控制下的DUR3基因的重組核酸轉(zhuǎn)化酵母，該重 組核酸允許篩選轉(zhuǎn)化酵母和隨后通過同向重復的重組除去抗生素抗性標記。該PGKl啟動 子不受 NCR。DUR3 基因盒-leu2-PGKlp-kanMX-PGKp-DUR3-PGKlt-leu2。用 leu2_PGKlp-kan MX-PGKp-DUR3-PGKlt-leu2 盒轉(zhuǎn)化了 4 個菌株CY3079、Bordeaux Red 和 DUR1，2 轉(zhuǎn)化的菌 株 D80ec-和 D254ec-。這產(chǎn)生了 D254ec-的 55 個菌株、D80ec-的 125 個菌株、Bordeaux Red的約200個菌株和CY3079的約300個菌株。每個菌株選擇約20-60個克隆進行微發(fā) 酵(mini-fermentation)以測定EC降低。在實驗室條件下2個CY3079克隆具有94. 2%和 46. 5%的EC降低；3個Bordeaux Red克隆具有57. 6% -64. 9%的EC降低；D80ec-克隆具 有60. 8% -66. 的EC降低；和2個D2Mec-克隆具有87. 5%禾口 75. 的EC降低。用于 以上實施例的實驗方法pHVX2D3 的構(gòu)建
為了將DUR3置于組成型PGKl啟動子和終止子信號的控制下，將DUR3 ORF克隆入 PHVX2。使用包含構(gòu)建入它們的5’末端的B10I限制酶位點的以下引物，從522基因組DNA 擴增 DUR3 ORF :DUR3forXhol(5' -AAAACTCGAGATGGGAGAATTTAAACCTCCGCTAC-3 ‘ ) (SEQ ID NO :l)DUR3revXhol(5 ‘ -AAAACTCGAGCTAAATTATTTCATCAACTTGTCCGAAATGTG-3 ‘ )(SEQ ID NO 2)。PCR、0.8%瓊脂糖凝膠顯示和PCR凈化Oliagen，美國-PCR純化試劑盒)后，用 Xhol (Roche，德國)消化PCR產(chǎn)物(插入片段)和pHVX2 (載體)二者。ffi SAP (Fermentas, 美國)處理消化的載體以防止再環(huán)化后，在22°C連接插入片段和線性化的SAP處理的載體 (T4 DNA連接酶-Fermentas，美國)過夜；用連接混合物(5 μ 1)轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細胞 (Invitrogen，美國)，隨后在補充lOOyg/mL氨芐青霉素(Fisher，美國)的LB(Difco，美 國)平板上培養(yǎng)。收集源自隨機選擇的轉(zhuǎn)化體菌落的質(zhì)粒Oliagen，美國-QIApr印Spin Minipr印試劑盒)并通過EcoRl (Roche，德國)消化；用內(nèi)部-外部引物進行PCR以鑒定具 有期望的插入片段的質(zhì)粒。將產(chǎn)生的包含PGKlp-DUR3-PGKlt的質(zhì)粒命名為pHVX2D3。pHVXKD3 的構(gòu)建通過用Xhol和Mil (Fermentas，美國)雙消化從pUG6獲得kanMX標記。消化后， 凝膠純化Oliagen，美國-凝膠提取試劑盒)1500bp的kanMX條帶并連接入線性化的SAP處 理的pHVX2D3的Sal 1位點。用連接混合物(5 μ 1)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)在LB-氨芐青霉素(100 μ g/mL) 上的DH5 α 感受態(tài)細胞。通過從M個隨機選擇的菌落分離的質(zhì)粒的HindIII (Roche,德 國)消化來鑒定重組質(zhì)粒。將產(chǎn)生的包含PGKlp-DUR3-PGKlt-kanMX的質(zhì)粒命名為pHVXKD3。pUCTRPl 的構(gòu)建用各自在它們的5’末端包含BamHl和后面的Apal位點的TRPl特異性引物，從 522 基因組 DNA PCR 擴增 TRPl 編碼序列=BamHlApalTRPlORFfwd (5 ‘ -AAAAAAGGATCCAAAAAA GGGCCCATGTCTGTTATTAATTTCACAGG-3‘ )(SEQ ID NO 3)BamHlApalTRPlORFrev(5‘ -AAAAAA GGATCCAAAAAAGGGCCCCTATTTCTTAGCATTTTTGACG-3' ) (SEQID NO 4).。擴增、凈化和定量后，將 750bp的片段連接入線性化的SAP處理的pUC18的 BamHl (Roche，德國)位點。最初通過藍/白篩選(在補充50 μ g/mL Xgal的LB-氨芐青霉 素上培養(yǎng))和隨后通過Hindlll/EcoRl消化確認來鑒定重組質(zhì)粒。產(chǎn)生的包含TRPl的質(zhì) 粒稱為pUCTRPl。pUCMD 的構(gòu)建用盒特異性引物從pHVXKD3質(zhì)粒DNA擴增位于pHVXKD3內(nèi)的 PGKlp-DUR3-PGK1t-kanMX 盒pHVXKfwdl。ng(5‘ -CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGC AGTGAG-3‘ )(SEQ ID NO5)pHVXKrevlong(5‘ -CTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCMGGCGATTAAGT TGGG-3‘ )(SEQ ID NO :6).。擴增、凈化和定量后，為了便于連接入線性化的SAP處理的pUCTRP 1的平端 EcoRV(i^ermentas，美國)位點，用多核苷酸激酶(New England Biolabs，美國)處理PCR產(chǎn) 生的 6500bp的平端片段。最初用E-Iyse分析鑒定重組質(zhì)粒，然后通過Apal (Stratagene，美國)/&ill消化 確認。簡言之，通過在瓊脂糖凝膠的孔內(nèi)裂解菌落，然后進行電泳，E-Iyse有效地針對質(zhì)粒 DNA的存在篩選大量菌落。更具體而言，在選擇性培養(yǎng)基上成斑塊后，將菌落的小等份試樣懸于5 μ 1 TBE緩沖液中，然后與10 μ 1 SRL緩沖液(25% ν/ν蔗糖、50 μ g/mLRNA酶、lmg/ mL溶菌酶)混合。通過吹吸混合后，將細胞懸液上樣至0.2% (w/v) SDS-0.8% (w/v)瓊脂 糖凝膠的孔內(nèi)?？變?nèi)細胞懸液變得澄清表明細胞裂解( 30分鐘)后，將DNA在20V電泳 45分鐘，然后在80V電泳45分鐘。最后按需要用STORtm Mfe (Invitrogen，美國)對凝膠 進行染色。線性DUR3盒轉(zhuǎn)化進入釀酒酵母并篩選轉(zhuǎn)化體。用Apal (Stratagene，美國)從pUCMD切割6536bp的DUR3盒并在0. 8%瓊脂糖凝 膠上顯示。從凝膠分離并提取Oiiagen，美國-凝膠提取試劑盒)預期的6536bp的條帶。 提取、凈化并用Nanodrop ND-1000分光光度計(Nanodrop，美國)定量后，用250ng線性盒 轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株522，522eg_、PDM、PDMeg_、K7和K7EG_。用醋酸鋰/聚乙二醇/ssDNA法轉(zhuǎn)化 酵母菌株。轉(zhuǎn)化后，在涂布于補充300 μ g/mL G418 (Sigma，美國)的YPD平板上之前，將細 胞在YPD中于30°C恢復2小時。將平板在30°C孵育至菌落出現(xiàn)。Calona Chardonnay從Calona Vineyards、Okanagan Valley 獲得未過濾的Chardonnay 葡萄汁(23. 75 白利糖度、PH 3.41、氨91.6mg/L、FAN 309. 6mg/L)并用于修飾的酵母的接種。將來自新劃 線培養(yǎng)的YPD平板的親本菌株(522、PDM、K7和K9)以及適當?shù)墓δ茉鰪姷木甑膯尉浣?種入5mL YPD并培養(yǎng)過夜(30°C -旋轉(zhuǎn)輪)。將細胞傳代培養(yǎng)至50mL YPD (OD600 = 0. 05)中 并再次培養(yǎng)過夜(30°C -180轉(zhuǎn)/分鐘水浴搖床)。通過離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C、5分鐘) 收集細胞并用50mL無菌水洗滌一次。將細胞沉淀懸于5mL無菌水中并測量0D·。用細胞懸 液接種裝有200mL從Calona Vineyards, Kelowna, BC，加拿大獲得的未過濾的Chardonnay 葡萄汁的無菌的250mL Schott瓶至最終0D_ = 0. 1。用裝有無菌水的滅菌(70% ν/ν乙 醇)蒸汽塞在無菌條件下密封瓶子。在20°C孵育密封瓶，并每天稱重以監(jiān)測CO2產(chǎn)生。在 Excel中對數(shù)據(jù)作圖以產(chǎn)生發(fā)酵譜。在發(fā)酵結(jié)束時，通過離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C、5分鐘) 除去細胞，并將 50mL葡萄酒倒入無菌的50mL Schott瓶中。在70°C水浴中孵育瓶子整 48小時以最大化EC產(chǎn)生，然后保存在4°C直至進行GC/MS分析。通過SPME和GC-MS定量葡萄酒中的氨基甲酸乙酯。將Chardormay葡萄酒在70°C加熱48小時以刺激氨基甲酸乙酯產(chǎn)生。將IOmL 葡萄酒樣品吸入20mL的樣品小管。加入小磁力攪拌棒和3克NaCl并用PTFE/硅氧烷膜 (septan)蓋上小管。將小管放在22°C的攪拌器上并攪拌使其平衡15分鐘。使用前將SPME 纖維(65μπι碳蠟(carbowax)/二乙烯基苯)在250°C調(diào)節(jié)30分鐘。樣品平衡后，將纖維 插入液面上空間。30分鐘后，將纖維從樣品小管移出并插入注射口 15分鐘。每個樣品運 轉(zhuǎn)前進行空白運轉(zhuǎn)。用外標法進行定量。在包含12% (ν/ν)乙醇和ImM酒石酸(ρΗ 3.1) 的蒸餾H2O中，按0. lmg/mL制備氨基甲酸乙酯(Sigma-Aldrich，Milwaukee, WI)標準貯存 液。用5、10、20、40、90yg/L的EC濃度制備校準標準。該標準溶液于4°C保存在冰箱中。用 Agilent 6890N GC作為界面的5973N Mass Selective Detector定量葡萄酒中的氨基甲酸 乙酯。使用60m χ 0. 25mm內(nèi)徑、0. 25 μ m厚度的DBWAX熔凝硅石空心柱(J&W Scientific, Folsom,CA)0載氣是36cm/秒恒流的超高純度氦。注射器和輸送線(transfer line)溫度 設在250V。烘箱溫度最初設在70°C 2分鐘，然后按8°C /分鐘升至180°C并保持3分鐘。 然后按程序?qū)囟劝?0°C /分鐘提高至220°C，并在220°C保持15分鐘。總運行時間是35. 75分鐘。注射模式是無分流5分鐘(清洗流5mL/分鐘，清洗時間5分鐘)。用電子碰 撞離子化以選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式操作MS;MS quad溫度150°C，MS源溫度230°C。溶 劑延遲為8分鐘。用100毫秒的停留時間監(jiān)測到特異性離子44、62、74、89。用質(zhì)量62針對 可靠的EC標準的質(zhì)譜進行定量。發(fā)酵譜顯示在圖8中，由功能增強的菌株和對照菌株產(chǎn)生的乙醇的最終量顯示在 表2中。表1釀制葡萄酒的過程中氨基甲酸乙酯降低的總結(jié)。通過GC/MS定量由清酒酵母菌株 (K7、K7EC-⑶、K7·3、K7EC-DUE3)和葡萄酒酵母菌株(522、522ec_、522DUK3、522e 、PDM、PDMec_、 PDMdue3, PDMec^due3)從未過濾的Calona Chardonnay葡萄汁產(chǎn)生的Chardonnay葡萄酒中的 氨基甲酸乙酯(μ g/L)。在20°C孵育發(fā)酵至完成( 300小時)。EG_DUR1，2的組成型表達 ■DUR3的組成型表達 組合的DURl，2和DUR3的組成型表達
權利要求
1.酵母菌株，其已轉(zhuǎn)化，以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn)運蛋白蛋白質(zhì)的基因表達的氮分 解代謝物阻抑。
2.權利要求1的酵母菌株，其中所述尿素轉(zhuǎn)運蛋白由DUR3編碼。
3.權利要求1的酵母菌株，其中所述尿素轉(zhuǎn)運蛋白是DUR3p。
4.權利要求1至3中任一項的酵母菌株，其進一步轉(zhuǎn)化，以在發(fā)酵條件下降低尿素降解 酶的基因表達的氮分解代謝物阻抑。
5.權利要求4的酵母菌株，其中所述尿素降解酶由DUR1，2編碼。
6.權利要求4的酵母菌株，其中所述尿素降解酶是尿素羧化酶/脲基甲酸酯水解酶或 尿素酰胺裂合酶。
7.權利要求1至6中任一項的酵母菌株，其進一步轉(zhuǎn)化，以在發(fā)酵條件下不斷攝取尿ο
8.權利要求7的酵母菌株，其中已轉(zhuǎn)化所述酵母以組成型表達DUR3。
9.權利要求4的酵母菌株，轉(zhuǎn)化其以在發(fā)酵條件下不斷攝取并不斷降解尿素。
10.權利要求9的酵母菌株，其中轉(zhuǎn)化所述酵母菌株以組成型表達DUR1，2和DUR3。
11.用于修飾酵母菌株的方法，其包括轉(zhuǎn)化所述酵母菌株以在發(fā)酵條件下降低尿素轉(zhuǎn) 運蛋白的基因表達的氮分解代謝物阻抑。
12.權利要求11的方法，其中所述尿素轉(zhuǎn)運蛋白由DUR3編碼。
13.權利要求11的方法，其中所述尿素轉(zhuǎn)運蛋白是DUR3p。
14.權利要求11、12或13的方法，其中其進一步轉(zhuǎn)化所述酵母菌株，以在發(fā)酵條件下降 低尿素降解酶的基因表達的氮分解代謝物阻抑。
15.權利要求14的方法，其中所述尿素降解酶由DUR1，2編碼。
16.權利要求14的方法，其中所述尿素降解酶是尿素羧化酶、脲基甲酸酯水解酶或尿 素酰胺裂合酶。
17.權利要求11至16中任一項的方法，其中轉(zhuǎn)化所述酵母菌株以組成型表達DUR3。
18.權利要求11至17中任一項的方法，其中用包含編碼DUR3p的編碼序列的重組核酸 轉(zhuǎn)化所述酵母菌株。
19.權利要求18的方法，其中將所述編碼DUR3p的編碼序列有效連接至不受氮分解代 謝物阻抑的啟動子。
20.產(chǎn)生發(fā)酵飲料或食品的方法，其包括在發(fā)酵條件下維持權利要求1至10中任一項 的酵母菌株，以產(chǎn)生具有降低的氨基甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品。
21.權利要求1至10中任一項的轉(zhuǎn)化的酵母菌株的用途，其用于產(chǎn)生具有降低的氨基 甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品。
22.權利要求20的方法，其中所述發(fā)酵飲料或食品具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度。
23.權利要求21的用途，其中所述發(fā)酵飲料或食品具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度。
24.權利要求20或22的方法，其中所述發(fā)酵飲料或食品是葡萄酒。
25.權利要求21或23的用途，其中所述發(fā)酵飲料或食品是葡萄酒。
26.具有降低的氨基甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品，其使用權利要求1至10中任一項的轉(zhuǎn)化的酵母菌株產(chǎn)生。
27.權利要求26的發(fā)酵飲料或食品，其是葡萄酒。
28.權利要求27的葡萄酒，其具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了釀酒酵母菌株，其已轉(zhuǎn)化，以在磷酸甘油酸激酶(PGK1)啟動子和終止子序列的調(diào)控下組成型表達DUR3(編碼尿素轉(zhuǎn)運蛋白蛋白質(zhì))，產(chǎn)生降低的氮分解代謝物阻抑，其中該轉(zhuǎn)化的酵母菌株可進一步轉(zhuǎn)化，以組成型表達諸如尿素羧化酶、脲基甲酸酯水解酶或尿素酰胺裂合酶的尿素降解酶，這也產(chǎn)生降低的氮分解代謝物阻抑；產(chǎn)生該菌株的方法；該菌株產(chǎn)生具有低于30ppb的降低的氨基甲酸乙酯濃度的發(fā)酵飲料或食品的方法和用途。
文檔編號A23L3/3463GK102057035SQ200980121822
公開日2011年5月11日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權日2008年4月14日
發(fā)明者H·J·J·范維倫, J·I·胡斯尼克 申請人:英屬哥倫比亞大學