專利名稱：穩(wěn)定的淀粉樣beta單體和寡聚體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抵抗原纖維形成(fibrillogenesis)的單體的和寡聚的淀粉樣beta 肽，它們作為抗原或篩選試劑用于治療阿爾茨海默氏病(Alzheimer’ s disease)和其它與 蛋白錯誤折疊有關(guān)的疾病。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)是與老化有關(guān)的神經(jīng)變性疾病，特征是，淀粉樣前體蛋白 (APP)裂解產(chǎn)生的淀粉樣- β (Αβ)蛋白的不可溶淀粉樣沉積物發(fā)生累積(Blermow，K.，et al. ,Lancet 368 :387-403(2006)).因蛋白錯誤折疊引起的疾病有多種，AD是其中之一，另 有多達22種其它已知疾病如帕金森病(Parkinson’ s disease)和II型糖尿病(Dobson， C. Μ. , Protein Pept. Lett. 13 :219-227 (2006))。目前針對AD和大多數(shù)其它蛋白錯誤折 疊疾病都尚無有效療法，部分原因是，對于這些沉積物是否有毒性以及如何導(dǎo)致毒性仍不 明了。事實上，雖然不可溶的淀粉樣沉積物以前被認為導(dǎo)致AD，但最近的關(guān)注點已從其轉(zhuǎn) 移到將可溶性A β寡聚種類視作毒性因子(Haass，C. and Selkoe D.J.，Nature Reviews Mol. Cell. Biol. 8 :101-112(2007))。此外，抗Αβ寡聚體的構(gòu)象依賴性抗體(如多克隆 All抗體)已被發(fā)現(xiàn)與除了 Αβ以外的其它寡聚種類發(fā)生反應(yīng)，提示蛋白錯誤折疊疾病 雖然涉及不同的蛋白，但這些毒性結(jié)構(gòu)是共有的(Glabe，C.G.，Trends Biochem. Sci. 29 討2巧47(2004))。因此，全球的很多研究都集中在為了藥物篩選和免疫的目的分離和鑒定 這類可溶性寡聚體。但無論單體還是寡聚體性質(zhì)的Aβ蛋白都高度傾向于進一步聚集形 成原纖維(frbril)。這種原纖維化是自發(fā)成核依賴性聚合反應(yīng)，其反應(yīng)速率對肽濃度敏感 (Lomakin, A.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 1125-1129 (1996)) 故而，原纖維的 形成嚴重制約了寡聚體制劑的壽命，以及它們所能保持的濃度。AD中涉及的野生型Αβ蛋白是在> ΙΟΟμΜ的濃度極具原纖維化傾向的肽。低 濃度(>2(^11至< ΙΟΟμΜ)時，所述蛋白傾向于緩慢寡聚(寡聚體都是含有多個單體的 可溶性結(jié)構(gòu))然后再進展成惰性纖維狀態(tài)。這種寡聚狀態(tài)最近被指認為神經(jīng)毒性劑，并因 此被視為參與 AD 之中的毒性種類(Haass，C.，and Selkoe, D. J.，Nature Reviews Mol. Cell. Biol. 8 :101-112(2007)).在生理條件下產(chǎn)生這些毒性結(jié)構(gòu)的通用方法涉及，4°C 將20-100 μ M肽溶液在細胞培養(yǎng)基(F-U)中保溫或在緩沖鹽溶液中保溫數(shù)日(Lambert， Μ. P.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 :6448-6453 (1998) ；Stine, W. B.，et al.， T. Biol. Chem. 278 11612-11622 (2003)) 0因成核率和延伸率嚴重依賴于肽濃度(Lomakin， Α.，et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :1125-11 (1996))，肽濃度增加超過 100 μ M 將 有損寡聚體制劑的穩(wěn)定性。在傳統(tǒng)觀點所認識的淀粉樣原纖維裝配中，核觸發(fā)的聚合和寡 聚結(jié)構(gòu)甚至被認為是同類型的。寡聚體制劑因此一旦形成其壽命將非常有限且不可預(yù)料 (聚集成核是自發(fā)事件)。在4°C的稀釋溶液ΟΟμΜ-25μΜ)中，Aβ (42)寡聚體制劑一般 僅穩(wěn)定Mh，Ai3 (40)寡聚體制劑可能能穩(wěn)定一周。在較少稀釋的溶液(> ΙΟΟμΜ)中，Αβ 蛋白的不溶性大大下降。因而，在藥物篩選實驗中，原纖維化過程是重大缺陷，需要在相對 較高濃度穩(wěn)定蛋白。
本發(fā)明旨在通過提供形成穩(wěn)定寡聚體的工程化A β肽來克服這些問題。此前尚無人報道穩(wěn)定的A β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也無人報道僅含A21C/A30C 二硫鍵、無其它 復(fù)雜半胱氨酸的A β肽。US 2006/0018918披露了 A β異構(gòu)體，其是基于僅憑考慮A β的一 級結(jié)構(gòu)，并且出于穩(wěn)定A β的非天然構(gòu)象以便用作疫苗的目的，而對所有Ser和Ala進行多 重半胱氨酸替換。A21C和A30C突變是與另外三種或四種發(fā)生在位置Ala2，Ser8, Ser26, 和Ala42的半胱氨酸突變體一起獲得的。這些Αβ異構(gòu)體的氧化產(chǎn)生由15種可能的同工 型組成的混合物，它們有不同的分子內(nèi)二硫鍵，其中僅3種可能的同工型包含A21C/A30C 二 硫鍵，但總是與其它二硫鍵組合。此前文獻報道的A β肽二硫鍵突變體是L17C/U4C，L17C/M35C，和L17C/ V36C(Shivaprasad, S. and Wetzel, R.，Biochemistry 43 :153-15317 (2004)) 這些突變 都是非保守替換。而且，這些突變都是特意為研究原纖維結(jié)構(gòu)中Leul7靠近Leu34，Met35， 和Val36的程度而生成的。Siivaprasad和W^tzel提供信息表明，這三種突變經(jīng)歷原纖維 形成時具有的延遲時間(lag times)與還原型突變(突變后的殘基是半胱氨酸)和氧化 型突變(突變后的殘基是胱氨酸)的幾乎相同。這些作者還公開了其它同為非保守替換 的二硫鍵突變體，即 V18C/L34C，F(xiàn)19C/A30C, F19C/I32C，和 F19C/L34C(Wetzel，R.，etal.， Biochemistry 46 1-10 (2007)) 這些突變被發(fā)現(xiàn)與 L17C/L34C，L17C/]\05C，和 L17C/V36C 突變體有相似的行為。因此，所有此前公開的關(guān)于Αβ蛋白的二硫鍵突變體都被證實易于 聚集成穩(wěn)定性與野生型肽產(chǎn)生的原纖維相似的原纖維。L17C/L34C, L17C/M35C, L17C/V36C, V18C/L34C, F19C/A30C, F19C/I32C，和F19C/L34C突變體的這些氧化型衍生物都原纖維化， 因為它們與 Hoyer 等(Hoyer，W. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 :5099-5104(2008)) 提供的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不兼容，但它們與目前已知的Αβ-肽原纖維結(jié)構(gòu)相容，在這種結(jié)構(gòu)中，兩 個 β -鏈彼此背靠背堆積(參見 Petkova，Α. Τ.，et al.，Biochemistry 45 :498-512)。Aβ 寡聚體制劑見 WO 2007/005358, WO 2007/005359, WO 2007/142320 和 WO 2004/067561。這些文獻描述的寡聚體制劑已用分子間交聯(lián)劑(W02007/005358)，非生理 ρΗ(在WO 2007/005359中是ρΗ 9)和/或添加劑(W02007/005359中稱40%甘油或TFE在 37°C使寡聚體穩(wěn)定;WO 2007/142320中是GMl神經(jīng)節(jié)苷脂；WO 2004/067561中是SDS)獲 得。發(fā)明概述本發(fā)明提供共價約束(covalently constrained)的單體和寡聚形式Aβ A21C/ A30C肽，它們抵抗原纖維的形成。本發(fā)明的肽經(jīng)大小排阻層析(size exclusion chromatography, SEC)，遠紫外⑶(指示螺旋結(jié)構(gòu))，和NMR(也是指示螺旋樣結(jié)構(gòu))測定， 保留了其野生型的大多數(shù)特性。因為原纖維化步驟被阻斷，本發(fā)明的Αβ肽依據(jù)濃度被分 群為數(shù)種具有螺旋結(jié)構(gòu)(coil-structure)的低分子量寡聚體(從SEC洗脫下來的最大約 42kDa的蛋白)，以及具有β -結(jié)構(gòu)的高分子量寡聚體(從SEC洗脫下來的約75_85kDa和 170kDa的蛋白)。而且，通過對濃縮的蛋白溶液加熱，獲得了 6nm寬、通常30nm長的野生型 樣原原纖維(protofibrilIar)結(jié)構(gòu)。具有β -結(jié)構(gòu)的高分子量寡聚體由All多克隆抗體 識別。發(fā)明簡述本發(fā)明提供單體的和寡聚的Αβ肽，其空前地抵抗原纖維形成。
為防止聚集副反應(yīng)耗竭濃縮的單體和寡聚體A β肽庫，本發(fā)明人設(shè)計了共價約束 的Αβ肽。本發(fā)明的這些Aβ肽在野生型Aβ (40) (SEQ ID NO :1)或Αβ (42) (SEQ ID NO 2)肽的位置21和30被半胱氨酸替換，產(chǎn)生分子內(nèi)二硫鍵連接的Αβ (40)A21C/A30C(SEQ ID NO :3)和Αβ (42)A21C/A30C(SEQ IDNO :4)肽(圖ΙΑ)。這些氨基酸替換有效阻斷了能 引起淀粉樣變(amyloidosis)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，該機制的一種假設(shè)示于

圖1B，所述轉(zhuǎn)換還允許 分出數(shù)個寡聚態(tài)群體，包括具有被認為是毒性種類的結(jié)構(gòu)的高分子量寡聚體。本發(fā)明 的Αβ肽形成潛在的毒性寡聚狀態(tài)，其與野生型Aβ肽所產(chǎn)生的狀態(tài)相似，具有與野生型寡 聚體相同的遠紫外(far-UV)圓二色譜(circular dichroism, CD)，它們也結(jié)合All抗體， 并形成具有野生型形狀的原原纖維(protofibri)。經(jīng)大小SEC、遠紫外⑶光譜、和1N異核 單量子相干(heteronuclear single quantum coherence, HSQC)核磁共振(NMR)譜測定， 本發(fā)明Αβ肽的非寡聚的螺旋狀態(tài)仍保留野生型模樣。由于本發(fā)明的肽中有約束性二硫鍵(constraining disulphide bond)，無需其它 穩(wěn)定寡聚體的方法，包括(i)非生理(升高)PH以增加這些肽的排斥力，(ii)用添加劑，包 括2，2，2-三氟乙醇(TFE)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，甘油，或GMl神經(jīng)節(jié)甘脂形式的細胞膜 糖脂，來誘導(dǎo)寡聚結(jié)構(gòu)，(iii)添加陰離子以篩選電荷由此增加穩(wěn)定性，和(iv)當用上述 (i)-(iii)之一或數(shù)項制得寡聚體時，用分子間交聯(lián)使所述寡聚體共價穩(wěn)定。本發(fā)明的Αβ 肽實際上是首例在生理條件下形成穩(wěn)定寡聚體的Aβ肽，這是通過阻止原纖維化步驟獲得 的。而且，避免了對寡聚制劑進行長時間保溫而結(jié)果不可預(yù)料，因為本發(fā)明的Αβ肽可以純 化并快速濃縮成寡聚狀態(tài)。一方面，本發(fā)明提供包含與SEQ ID NO :4的氨基酸17-21對應(yīng)的氨基酸序列LVFFC 的肽，以及與SEQ ID NO 4的氨基酸30-36對應(yīng)的氨基酸序列CIIGLMV。本發(fā)明的肽還在對 應(yīng)于SEQ ID NO 4的Cys21和Cys30之間包含二硫鍵。在本發(fā)明一優(yōu)選方面，所述肽通過 將含有氨基酸序列LVFFC的肽與含有氨基酸序列CIIGLMV肽經(jīng)分子間二硫鍵連接而獲得。 在本發(fā)明更優(yōu)選方面，所述兩種肽是單個肽鏈的組成成分，其在Cys21和Cys30之間有二硫 鍵。此外，氨基酸序列LVFFC與氨基酸序列CIIGLMV通過含4-20個氨基酸，如6-16個，優(yōu) 選7-12個，或更優(yōu)選8-10個氨基酸，如9個氨基酸的肽來融合。本發(fā)明還提供所述肽的變 體，其中一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸被保守取代而替換，一或多個， 如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸被刪除，或一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或 2個氨基酸被插入。優(yōu)選地，融合肽包含與SEQ ID NO :4的氨基酸22- 對應(yīng)的氨基酸序列 EDVGSNKG。相應(yīng)地，本發(fā)明的肽優(yōu)選包含與SEQ ID NO :4的氨基酸17-36對應(yīng)的氨基酸序 列LVFFCEDVGSNKGCIIGLMV，以及所述肽的變體，其中一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或 2個氨基酸被保守取代而替換，一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸被刪除， 或一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸被插入。還更優(yōu)選地，本發(fā)明的肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列1-40，全長氨基酸序列 SEQ ID NO :4，以及所述肽的變體，其中一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸 被保守取代而替換，一或多個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸被刪除，或一或多 個，如1，2，3，4，5個，或優(yōu)選1或2個氨基酸被插入。本發(fā)明的肽還可在對應(yīng)于氨基酸22 (SEQ ID NO 5)的位置包含甘氨酸取代，或者
6對應(yīng)于氨基酸22 (SEQ ID NO 6)的位置包含谷氨酰胺取代，或在對應(yīng)于氨基酸22 (SEQ ID NO 8)的位置包含賴氨酸取代。本發(fā)明的肽還可在對應(yīng)于氨基酸23 (SEQ ID NO 7)的位置 包含天冬酰胺取代。本發(fā)明的肽還可在對應(yīng)于SEQ ID NO :4中氨基酸35的位置包含甲硫 氨酸亞砜(methionine sulphoxide)殘基。而且，本發(fā)明的肽可包含(a) —或多個末端氨基酸被馬來酰亞胺化 (maleimidated) ； (b) 一或多個末端氨基酸被半胱氨酸化(cysteinylated) ； (c)所述肽的 羧基末端被酰胺化，即羧基末端的游離COOH被轉(zhuǎn)變成CONH2 ；和/或所述肽的氨基末端被乙 ?；?，即氨基末端的游離NH2基團被轉(zhuǎn)變成酰胺CH3CONH-(AcNH-)。本發(fā)明的肽可通過化學(xué) 合成制得，或通過重組DNA技術(shù)制得。保守取代是指，一個氨基酸用具有相似極性和疏水性質(zhì)的氨基酸取代。具有所述 相似性質(zhì)的氨基酸分組的實例見表1。保守取代還可包括用非常規(guī)氨基酸進行取代。非常 規(guī)氨基酸包括，但不限于，表1的括號中的例子，其中，PL是指吡咯賴氨酸(pyrrolysine)， DA是指脫氫丙氨酸(dehydroalanine)，NL是指正亮氨酸(norleucin)，SC是指硒代半胱氨 酸(selenocysteine)，HC 是指高半胱氨酸(homocysteine)，CL 是指瓜氨酸(citrulline)， OR是指鳥氨酸(ornithine)。表1.
權(quán)利要求
1.肽，包含與SEQID NO 4的氨基酸17-21對應(yīng)的氨基酸序列L-V-F-F-C以及與SEQ ID NO :4的氨基酸30-36對應(yīng)的氨基酸序列C-I-I-G-L-M-V，還在對應(yīng)于SEQ ID N0:4之氨 基酸21和30的半胱氨酸殘基之間有二硫鍵，或所述肽的變體，其中1，2，3，4，或5個氨基酸 被保守取代替換，1，2，3，4，或5個氨基酸被刪除，或1，2，3，4，或5個氨基酸被插入。
2.權(quán)利要求1的肽，包含與SEQID NO 4的氨基酸17-36對應(yīng)的氨基酸序列L-V-F-F-C-E-D-V-G-S-N-K-G-C-1-1-G-L-M-V,或所述肽的變體，其中1，2，3，4，或5個氨基酸被保守 取代替換，1，2，3，4，或5個氨基酸被刪除，或1，2，3，4，或5個氨基酸被插入。
3.權(quán)利要求2的肽，包含與SEQID NO 4的氨基酸1_40對應(yīng)的氨基酸序列，或所述肽 的變體，其中1，2，3，4，或5個氨基酸被保守取代替換，1，2，3，4，或5個氨基酸被刪除，或1， 2，3，4，或5個氨基酸被插入。
4.權(quán)利要求2的肽，包含氨基酸序列SEQID而4，或所述肽的變體，其中1，2，3，4，或 5個氨基酸被保守取代替換，1，2，3，4，或5個氨基酸被刪除，或1，2，3，4，或5個氨基酸被插 入。
5.權(quán)利要求2-4之一的肽，在對應(yīng)于SEQID NO 4中氨基酸22的位置包含甘氨酸取代。
6.權(quán)利要求1-5之一的肽，在對應(yīng)于SEQID NO :4中氨基酸35的位置包含甲硫氨酸 亞砜殘基取代。
7.權(quán)利要求1-6之一的肽，其中(a)一或兩個末端氨基酸被馬來酰亞胺化；(b)一或兩個末端氨基酸被半胱氨酸化；(c)N-端氨基酸被乙?；?；和/或(d)C-端氨基酸被酰胺化。
8.權(quán)利要求1-7之一的肽，經(jīng)化學(xué)合成制得。
9.權(quán)利要求1-7之一的肽，經(jīng)重組DNA技術(shù)制得。
10.抗體，與權(quán)利要求1-9之一的肽特異性反應(yīng)。
11.鑒定適于治療阿爾茨海默氏病的化合物的方法，包括應(yīng)用權(quán)利要求1-9之一的肽。
12.選擇結(jié)合蛋白的方法，包括應(yīng)用權(quán)利要求1-9之一的肽。
13.權(quán)利要求1-9之一的肽在制備藥物組合物方面的用途，所述藥物組合物打算用于 免疫接種以預(yù)防性或治療性處理阿爾茨海默氏病，任選與佐劑聯(lián)用。
14.藥物制劑，包含治療有效量的權(quán)利要求1-9之一的肽，任選與佐劑聯(lián)用。
15.用于哺乳動物，包括人，抗阿爾茨海默氏病的免疫接種的疫苗，包含權(quán)利要求1-9 之一的肽，任選與佐劑聯(lián)用。
16.用于哺乳動物，包括人，抗阿爾茨海默氏病的免疫接種的疫苗，包含治療有效量的 權(quán)利要求10所述抗體。
17.對患阿爾茨海默氏病或面臨患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險的哺乳動物，包括人，進行預(yù) 防性或治療性處理的方法，其中將治療有效量的權(quán)利要求1-9之一的肽給予該哺乳動物。
18.對患阿爾茨海默氏病或面臨患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險的哺乳動物，包括人，進行預(yù) 防性或治療性處理的方法，其中將治療有效量的權(quán)利要求10的抗體給予該哺乳動物。
19.對患阿爾茨海默氏病或面臨患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險的哺乳動物，包括人，進行預(yù)防性或治療性處理的方法，其中將治療有效量的權(quán)利要求11的化合物給予該哺乳動物。
20.對患阿爾茨海默氏病或面臨患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險的哺乳動物，包括人，進行預(yù) 防性或治療性處理的方法，其中將治療有效量的權(quán)利要求12的結(jié)合蛋白給予該哺乳動物。
21.非人轉(zhuǎn)基因動物，表達編碼淀粉樣前體蛋白(APP)的核苷酸序列，其包含A21C/ A30C突變。
22.權(quán)利要求21的非人轉(zhuǎn)基因動物，所述APP是突變的人APP，其包含A21C/A30C突變。
23.權(quán)利要求22的非人轉(zhuǎn)基因動物，所述APP是蛋白SEQID NO :11。
24.非人轉(zhuǎn)基因動物，表達編碼Aβ肽的核苷酸序列，其包含A21C/A30C突變。
25.權(quán)利要求對的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中的淀粉樣-beta肽選自SEQID N0:3，SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10。
26.權(quán)利要求21-25之一的非人轉(zhuǎn)基因動物，選自脊索動物(chordateanimal)。
27.權(quán)利要求沈的非人轉(zhuǎn)基因動物，是轉(zhuǎn)基因小鼠。
28.多肽，是包含A21C/A30C突變的APP。
29.權(quán)利要求28的多肽，是突變的人APP，其包含A21C/A30C突變。
30.權(quán)利要求四的多肽，是SEQID NO 110
31.核苷酸序列，編碼權(quán)利要求1-9和觀-30之一的多肽。
32.表達系統(tǒng)，包含權(quán)利要求31的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了抵抗原纖維形成的單體的和寡聚的淀粉樣beta肽異構(gòu)體，以及它們作為篩選試劑或抗原在治療阿爾茨海默氏病和其它與蛋白錯誤折疊有關(guān)的疾病的方法和藥物制劑中的用途。本發(fā)明還提供了表達修飾的淀粉樣前體蛋白或淀粉樣beta肽的轉(zhuǎn)基因動物。
文檔編號A61P25/28GK102065881SQ200980122412
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日
發(fā)明者安德斯·桑德伯格, 托雷夫·哈德 申請人:Mivac發(fā)展股份公司