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      結(jié)合蛋白體內(nèi)半衰期的體外估測的制作方法

      文檔序號:580660閱讀:289來源:國知局
      專利名稱:結(jié)合蛋白體內(nèi)半衰期的體外估測的制作方法
      技術(shù)領域
      本發(fā)明概況地涉及結(jié)合蛋白。具體地,本發(fā)明提供了用于估測治療性結(jié)合蛋白的 體內(nèi)半衰期的體外方法。
      背景技術(shù)
      治療劑在受試者的循環(huán)中的持續(xù)時間取決于多種因素。典型地,將任意藥劑在循 環(huán)系統(tǒng)中的持久性表征為可量化的藥代動力學值,諸如半衰期(t1/2)。根據(jù)具體的藥劑,可 能影響它的半衰期的一些更明顯的因素包括、但不限于藥劑對不同的血漿或肝降解活性 (例如,蛋白水解活性、糖酵解活性)的敏感性、藥劑在血液中的溶解度、藥劑的免疫原性、 肝的濾出藥劑的能力和它的結(jié)合一種或更多種血清結(jié)合蛋白(例如,血清白蛋白)的能力。對于許多候選治療劑,在確定這樣的候選分子是否可以開發(fā)成有效的治療劑時, 藥代動力學半衰期非常重要。因而,無論在高通量篩選計劃中候選分子表現(xiàn)得對目標靶物 如何有活性,如果它缺少允許該分子在受試者的循環(huán)中持續(xù)足夠長以達到適當穩(wěn)態(tài)濃度從 而提供希望的治療益處的體內(nèi)半衰期,這樣的分子可能實際上幾乎不具有治療價值。因此, 在候選治療劑的篩選過程中的某個時刻,必須評估每種有希望的候選分子的藥代動力學體 內(nèi)半衰期的指征,以便從該過程排除具有不希望的體內(nèi)半衰期的那些分子。典型地,使用諸如大鼠或小鼠等小哺乳動物,得到候選分子是否具有可接受的體 內(nèi)半衰期的首要指征。無論這樣的小哺乳動物體內(nèi)半衰期研究可能有怎樣的價值,但是,這 樣的程序?qū)⒋罅康娜肆?、時間和費用消耗在篩選過程上。顯然,如果在藥物開發(fā)過程中可以 使用可靠的且簡單的體外方法來測定候選分子是否具有保證它們的持續(xù)包含的藥代動力 學體內(nèi)半衰期,會使新治療劑的篩選過程更有效且更經(jīng)濟。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明提供了簡單的、有效的且可靠的估測結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期的體外方法。 在一個方面,本發(fā)明的結(jié)合蛋白包含治療性結(jié)合蛋白。在另一個方面,本發(fā)明的結(jié)合蛋白包 含參照結(jié)合蛋白。在一個具體的方面,本發(fā)明提供了估測結(jié)合蛋白的體內(nèi)藥代動力學半衰 期(t1/2)的體外方法,所述結(jié)合蛋白具有一個或更多個免疫球蛋白(Ig)折疊。所述方法可 容易地適應自動化的和機器人的(robotic)高通量篩選程序,允許以有效且省時的方式估 測多種結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期。因此,所述方法特別適用于篩選和開發(fā)新的治療性結(jié)合蛋 白(例如針對治療靶標的不同抗體構(gòu)建體)的程序。本發(fā)明的一個實施方案涉及估測目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期,其包含下述步驟 (a)使用體外蛋白酶反應試驗,測定目標結(jié)合蛋白和至少2種不同參照結(jié)合蛋白中的每一種的體外半衰期,其中所述參照結(jié)合蛋白具有已知的不同的體內(nèi)半衰期,
      (b)確定每種參照結(jié)合蛋白的已知體內(nèi)半衰期和體外蛋白水解半衰期之間的關(guān)系,
      (c)從所述參照結(jié)合蛋白的已知體內(nèi)半衰期和體外蛋白水解半衰期之間的關(guān)系,估測 與目標結(jié)合蛋白的體外蛋白水解半衰期相關(guān)聯(lián)的目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期。在一個方面,結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期是指在人中的半衰期。其它動物物種,包括脊 椎動物和無脊椎動物物種,也適用于本發(fā)明。示例性的物種包括、但不限于哺乳動物、鳥綱 (aves)、pices、爬行動物和兩棲動物。在一個方面,目標結(jié)合蛋白是治療劑。在一個具體方面,目標結(jié)合蛋白具有一個或 更多個Ig折疊??梢詫⑼ㄟ^蛋白水解反應試驗測得的每種參照結(jié)合蛋白的已知體內(nèi)半衰期和它 們各自的體外蛋白水解半衰期之間的關(guān)系繪圖,例如,通過相對于測得的每種參照結(jié)合蛋 白的體外蛋白水解半衰期繪制已知體內(nèi)半衰期,得到參照圖(標準曲線)。這樣的標準曲線 也可以計算得到,無需制作數(shù)據(jù)的實際圖表。許多合適的蛋白酶或蛋白酶組合可以用于本文所述的估測結(jié)合蛋白(例如,目標 結(jié)合蛋白)的體內(nèi)半衰期的體外蛋白酶試驗中。合適的蛋白酶的實例包括、但不限于嗜熱 菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及其組合。本文使用的參照結(jié)合蛋白通常結(jié)合已知的同源配體,并具有已知值的體內(nèi)半衰 期,例如,在人中的半衰期。在一個方面,參照結(jié)合蛋白包含一個或更多個Ig折疊。這樣的 參照結(jié)合蛋白的實例是具有例如一個或更多個Ig折疊的已知的治療性抗體分子以及其它 已知的治療性結(jié)合蛋白。在一個實施方案中,本文提供的估測目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期的方法是,通過 在蛋白水解反應試驗中測定體外半衰期,然后根據(jù)線性公式計算估測的體內(nèi)半衰期
      y = mx + b (方程式1)
      其中“y”是體內(nèi)半衰期(例如,按天計算),m”是體內(nèi)半衰期和體外蛋白酶介導的蛋白 水解半衰期之間的線性關(guān)系的實測斜率,“X”是在蛋白水解反應試驗中測得的體外半衰期, 且常數(shù)“b”是y-截距,即,按照所述線性關(guān)系與體外蛋白水解半衰期為零(χ = 0)時相對 應的理論體內(nèi)半衰期。本發(fā)明的一個實施方案涉及估測目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期的方法,其包含,在 蛋白水解試驗中測定它的體外半衰期,然后在圖(即,標準曲線)上估測與它的體外蛋白水 解半衰期相對應的它的體內(nèi)半衰期,所述圖通過相對于至少2種參照結(jié)合蛋白的體外蛋白 水解半衰期值繪制體內(nèi)半衰期值而得到。這樣的標準曲線是參照結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期和 體外蛋白水解半衰期之間的關(guān)系的圖示。在圖1中顯示了這樣的線性標準曲線的一個實 例。一個方面提供了使用圖1所示的標準曲線的一種替代方案,是從2種或更多種參 照結(jié)合蛋白的已知的體內(nèi)人半衰期和它們各自的體外蛋白水解半衰期,建立關(guān)系或標準曲 線(圖解地或計算地)。有利地,可以與測定目標結(jié)合蛋白的體外蛋白水解半衰期平行地或 根據(jù)相同方法,測定參照結(jié)合蛋白的體外蛋白水解半衰期。以此方式,則可以從新得到的標 準曲線估測目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期。在本發(fā)明的另一個方面,提供了測定2種或更多種目標結(jié)合蛋白的相對體內(nèi)半衰期的方法,其包含,在體外蛋白水解反應試驗中測定每種結(jié)合蛋白的體外蛋白水解半衰期, 其中目標結(jié)合蛋白的體外蛋白水解半衰期之間的相對差異,指示目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰 期之間的相對差異。盡管該方法沒有提供每種目標結(jié)合蛋白的體內(nèi)半衰期的值,但是允許 按照它們的體內(nèi)半衰期對結(jié)合蛋白排序,這歸因于本文首次公開的結(jié)合蛋白的體外蛋白水 解半衰期和體內(nèi)半衰期之間的強關(guān)聯(lián)性。在表征一群結(jié)合蛋白的情況下,當不立即需要或 要求該群體的每個成員的實際體內(nèi)半衰期時,這樣的排序特別有用。此外,以此方式根據(jù)它 們的相對體內(nèi)半衰期排序一大群目標結(jié)合蛋白的能力,提供了在群內(nèi)鑒別相對于該群的剩 余成員具有某種性質(zhì)(例如,更長的半衰期)的單個結(jié)合蛋白或結(jié)合蛋白亞群的方法。分 子的這種相對排序或排列允許選擇候選分子子集,不需要立即對整個群體進行體內(nèi)試驗來 獲知該群體中的哪些成員具有將候選物保留用于臨床開發(fā)所需的藥代動力學性質(zhì)。因而,本文所述的方法通過減少鑒別表現(xiàn)出作為治療劑的希望的結(jié)合蛋白所需的 時間和資源消耗(二者都是以費用和人員的方式),在治療劑的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中提供了優(yōu)點。


      圖1是一幅圖(標準曲線),它顯示了參照結(jié)合蛋白的已知的體內(nèi)人半衰期和計算 的體外嗜熱菌蛋白酶蛋白水解半衰期之間的強線性關(guān)系(R2 = 0.885)。
      具體實施例方式本發(fā)明部分地基于下述發(fā)現(xiàn),即體外蛋白水解試驗可以用于估測目標結(jié)合蛋白的 體內(nèi)半衰期。治療性結(jié)合蛋白會表現(xiàn)出寬范圍的體內(nèi)半衰期(t1/2)。在篩選候選結(jié)合蛋白 可能開發(fā)成有用的治療劑的過程中的某個時刻,進行候選結(jié)合蛋白分子的體內(nèi)半衰期的臨 床前預測,以便避免將其它資源耗費在這樣的分子上,其不能在動物(例如,人)的循環(huán)系 統(tǒng)中持續(xù)足以有效地為受試者提供希望的治療益處的時間段,或者可能在該受試者的循環(huán) 系統(tǒng)中持續(xù)不希望長的時間段。對于在藥物開發(fā)計劃中繼續(xù)感興趣的特定候選結(jié)合蛋白而 言被視作可接受的體內(nèi)半衰期取決于藥物開發(fā)人員的目標和判斷,但是,這樣的估測必須 在某個時刻進行,以將資源聚焦在一個或更多個分子上,所述分子具有適合開發(fā)成有效的 治療藥物的最佳的或最理想的一組性質(zhì)。體內(nèi)半衰期(例如,對于人藥物候選物)的臨床 前預測通常需要小哺乳動物研究(例如,在小鼠或大鼠中)和復雜的分析技術(shù),由于它們的 成本和工作,對于相對小量的候選分子的研究最好將它們保留。因此,在藥物篩選和開發(fā)過 程中的任意時間使用簡單的體外試驗,所述體外試驗可以常規(guī)地用于預測象體內(nèi)半衰期一 樣有用和重要的藥代動力學參數(shù),可能對藥物開發(fā)計劃的總效率、經(jīng)濟學和方向具有重大 影響。本發(fā)明提供了體外試驗,其可以意外地以令人驚奇的準確度預測結(jié)合蛋白在受試 者中的體內(nèi)半衰期。它是基于已知結(jié)合蛋白(參照結(jié)合蛋白)在蛋白酶切割試驗中的體外 半衰期和體內(nèi)半衰期之間的密切關(guān)系的發(fā)現(xiàn),所述已知結(jié)合蛋白被批準施用于受試者,且 目前可在市場上得到。在一個方面,受試者是脊椎動物或無脊椎動物。這樣的脊椎動物可 以包括哺乳動物、pices、鳥綱、兩棲動物和爬行動物。在一個具體方面,受試者是人。為了更清楚地描述本發(fā)明,定義了下面的術(shù)語
      術(shù)語“結(jié)合蛋白”是指結(jié)合配體(同源配體、同源結(jié)合配偶體)的任意蛋白分子。如本文使用的,存在2大類結(jié)合蛋白(1)參照結(jié)合蛋白和(2)目標結(jié)合蛋白;二者都在下面予 以討論。在一個方面,結(jié)合蛋白具有至少一個Ig折疊。當結(jié)合蛋白是抗體時,配體是抗原。 Ig折疊是首先在全長免疫球蛋白分子(即,全長抗體分子)的可變(V)和恒定(C)區(qū)中鑒別 出的三維球狀結(jié)構(gòu)域(參見,例如,Janeway禾口 Travers,The Immune System In Health and Disease (Current Biology Ltd 禾口 Garland Publishing, Inc., New York, 1994), 第3. 6-3. 7頁)。Ig折疊包括多肽鏈的2個反向平行的層或片,其中每個多肽鏈具有稱作 β鏈的構(gòu)象,且每個鏈層稱作β片。二硫鍵連接每個β片的中心β鏈,使得2個β片在 一起,并形成大致圓柱形狀(也稱作“Greek關(guān)鍵桶”)。免疫球蛋白分子的C區(qū)的Ig折疊 具有2個反向平行的β片,其中一個β片具有4個反向平行的β鏈,且另一個β片具有 3個反向平行的β鏈。免疫球蛋白分子的V區(qū)的Ig折疊具有2個反向平行的β片,其中 一個β片具有4個反向平行的β鏈,且另一個β片具有5個反向平行的β鏈??梢杂糜诒疚乃龇椒ㄖ械慕Y(jié)合蛋白包括由4個多肽鏈、2個重(H)鏈和2個輕 (L)鏈組成的全長抗體分子以及具有抗原(配體)結(jié)合域和至少一個Ig折疊的眾多抗體構(gòu) 建體中的任一種。如上所述,全長抗體分子具有多個V和C結(jié)構(gòu)域,且因此具有多個Ig折 疊??贵w構(gòu)建體包括全長抗體分子的功能性抗體片段、融合體、突變體、變體或衍生物,且這 樣的抗體構(gòu)建體可以僅具有一個Ig折疊。在全長免疫球蛋白分子(例如,IgG、IgM和IgA) 中,每個重鏈由重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域CH1、 CH2和CH3組成。每個輕鏈由輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由結(jié)構(gòu)域 (CL)組成。VH和VL區(qū)可以進一步細分成稱作“互補性決定區(qū)”(CDR)的超變區(qū),其間夾雜 有稱作“框架區(qū)”(FR)的更保守的區(qū)域。每個VH和VL由3個CDR和4個FR組成,從氨基 末端向羧基末端以下述次序排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。全長免疫球蛋白 分子可以是任意類型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(例如,IgGU IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。不同的抗體構(gòu)建體已經(jīng)證實,抗原結(jié)合功能可以由全長免疫球蛋白分子的片段或 部分來執(zhí)行。這樣的抗體構(gòu)建體可能具有雙特異性的(結(jié)合2個相同的抗原分子)、雙重特 異性的(結(jié)合2個不同的抗原分子)或可結(jié)合2種或更多種不同抗原的組合的多特異性的 形式。包含在術(shù)語“結(jié)合蛋白”內(nèi)的抗體構(gòu)建體的實例包括Fab片段,它是包含VL、VH、CL 和CHl結(jié)構(gòu)域的單價(包含單個結(jié)合部位)片段;F(ab’)2片段,即包含通過在鉸鏈區(qū)的二 硫鍵相連的2個Fab片段的二價(包含2個結(jié)合部位)片段;Fd片段,其包含VH和CHl結(jié) 構(gòu)域;Fv片段,其包含抗體的單條臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域;單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (Ward等人, Nature, 341 \ 544-546 (1989) ;Winter 等人,PCT 公開 WO 90/05144 Al,通過引用并入 本文),其包含單個可變結(jié)構(gòu)域;雙可變結(jié)構(gòu)域(DVD)抗體;和分離的抗體分子V區(qū)的互補 性決定區(qū)(CDR)。眾所周知,通過用木瓜蛋白酶切割全長抗體分子,可以容易地產(chǎn)生Fab片 段,且通過用胃蛋白酶切割全長抗體分子,可以產(chǎn)生F(ab’)2片段。盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由分開的基因編碼,可以使用重組DNA方法 用合成的連接序列將編碼所述結(jié)構(gòu)域的基因連接起來,使得重組基因編碼單個蛋白鏈,其 中VL和VH區(qū)通過肽接頭相連,形成稱作單鏈Fv (scFv)的單價分子(參見例如,Bird等 k Science,242\ 423-426 (1988) ;Huston 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85·. 5879-5883 (1988))。這樣的scFv抗體構(gòu)建體具有一個配體(抗原)結(jié)合域和至少一個Ig折疊,因此被包含在術(shù)語“結(jié)合蛋白”內(nèi),且可以用于本文所述的方法中。雙抗體(diabody) 也被包含在術(shù)語“結(jié)合蛋白”內(nèi)。雙抗體是二價的雙特異性的抗體,其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表 達在單個多肽鏈上,但是使用這樣的連接物,它太短,不足以允許同一鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之 間配對,由此迫使結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對,并產(chǎn)生2個抗原結(jié)合部位(參見例 如,Holliger 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90·. 6444-6448 (1993) ;Poljak 等 人,Structure, 2·. 1121-1123 (1994))。術(shù)語“結(jié)合蛋白”也包括在例如PCT
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