專利名稱：利用非天然核苷酸擴增dna的過程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PCR擴增寡核苷酸的進程(

圖1)，被擴增的寡核苷酸序列中含有一個 或多個非相鄰的非天然核苷酸，該擴增是在巢式PCR中進行的(nested PCR) [Bro97]。附圖簡要說明圖1、一組含有不同氫鍵模式的雜環(huán)化合物。在本專利中所使用的雜環(huán)化合物被標 記為dZ和dP ；圖2、巢式PCR的示意圖，人工擴展基因信息系統(tǒng)(AEGIS)中的核苷與天然的核苷被嵌入PCR的引物中(primers)形成嵌合式的PCR引物。該嵌合式的PCR引物包含兩部 分，標示部分(該部分由非天然的核苷組成)和特異的底物結(jié)合部分(該部分由天然的核 苷組成)，用低濃度的嵌合式的PCR引物啟動PCR擴增，可以顯著地減少PCR中的非特異性 擴增。當嵌合式的引物在前幾輪PCR中被耗盡后，后續(xù)的PCR擴增將通過高濃度的含有非 天然核苷的外部標記引物進行；圖3、凝膠電泳放射自顯影圖展示舉例1中的PCR產(chǎn)物。左手邊天然核苷組成的 引物PCR擴增后所得的產(chǎn)物。右手邊含有非天然核苷(dP)的引物PCR擴增后所得的產(chǎn) 物；圖4、凝膠電泳放射自顯影圖展示舉例2中的巢式PCR產(chǎn)物；圖5、凝膠電泳放射自顯影圖展示舉例3中，以含有相鄰dZs的寡核苷酸為模版的 引物延伸的產(chǎn)物；圖6、凝膠電泳放射自顯影圖展示舉例4中的引物延伸的產(chǎn)物；圖7、凝膠電泳放射自顯影圖展示舉例5中的PCR產(chǎn)物；圖8、凝膠電泳放射自顯影圖展示兩種巢式PCR的產(chǎn)物。由非天然核苷酸(AEGIS) 組成的引物所得的PCR產(chǎn)物(右手邊)比天然核苷酸組成的引物所得的PCR產(chǎn)物(左手 邊)更清晰。

發(fā)明內(nèi)容
化合物6-氨基-5-硝基-3- (1’ - β -D-2’ -脫氧呋喃型)_2 (1氫)-吡啶酮(dZ) 的phosphoramidite衍生物，以及三聚磷酸和硫代三聚磷酸的合成已經(jīng)被申報在美國專利 11. 372400 ST [Hut03]。與dZ配對的堿基dP (2-氨基-8-(1'- β -D-2，-脫氧呋喃型)-咪 唑[1，2-α]-1，3，5-三嗪-4(8氫)-烷(氫鍵模式puAAD)及其衍生物的合成在[Hut03] [Yan06]已經(jīng)報道。雖然任何一種圖1中所示的核苷酸，均可能用在PCR的引物中，但是，在 本發(fā)明中dZ和dP是其中的首選。以本專利申請的優(yōu)先權(quán)日期起不到一年之前，我們發(fā)表了 PCR擴增包含一個dP或 一個dZ的寡核苷酸的方法[Yan07]。然而，先前的技術(shù)表明，經(jīng)過多重PCR循環(huán)之后，PCR 產(chǎn)物中的dP和dZ被部分丟失了。本發(fā)明的核心是首次將非天然的核苷酸dP和(或)dZ嵌 入到PCR的引物中，形成“嵌合式的引物”(chimericprimers)。嵌合式的引物包含兩部分， 5-末端部分和3-末端部分。5-末端部分由含有dP和(或)dZ的非天然寡核苷酸組成，該 部分用于標記3-末端部分且不接觸寡核苷酸的目標底物。3-末端部分是由天然的寡核苷 酸組成，該部分核苷酸的序列與被擴增的目標底物的序列互補。以嵌合式的引物進行PCR 擴增可以采用嵌套的方式[Bro97]，其中任何非天然核苷酸的損失將會在后續(xù)的PCR循環(huán) 中得以恢復。在巢式PCR的前幾輪擴增中，嵌合式的引物會被消耗掉，后續(xù)的PCR擴增將由 含有非天然核苷酸的“外部引物”(external primers)來繼續(xù)。在本專利申請的優(yōu)先權(quán)日期之前的所有文獻報道中，沒有任何的文獻曾經(jīng)報道過 或者預測過，聚合酶能夠擴增含有多個非天然核苷酸的寡核苷酸[Hor95]。本專利中的第一 個關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，成功地PCR擴增包含多個dP和多個dZ的寡核苷酸，這一發(fā)現(xiàn)在本申請的 優(yōu)先權(quán)日期以前沒有任何的文獻報道。此外，我們在此首次發(fā)現(xiàn)，某些DNA聚合酶能夠復制 多個相鄰的dZ和鄰近的dP。第三個發(fā)現(xiàn)是，將dP和(或)dZ嵌入“嵌合式的引物”和“外部引物”中，并用這些引物進行巢式PCR，可以提到PCR的專一性、得到更干凈的PCR產(chǎn)物。 這一結(jié)果超出了我們和本研究領(lǐng)域的預測。鑒于以上的結(jié)果，我們在此聲明，用含有dZ和 dP的引物進行PCR的技術(shù)是一種有用的，可以申請專利的發(fā)明。
具體實施例方式實例1、含有dZ和dP的巢式PCR這個例子表明，含有dZ和dP的嵌合式引物能夠進行PCR擴增。以下的寡核苷 酸的合成是通過常規(guī)的phosphoramidite的方法。這里列出來兩個反方向的嵌合式引物 (R-36-Std和R-36-Nest)，他們的堿基序列大致上相同，唯一不同的是，在R-36-Nest的 5-末端，不與模板互補的序列中的一些G被P所替代R-36-Std :3，-CCATGGTAGCTATGCGCAACGCTAGCGAGGAAGGAC-5’ -P32 序列編號 1R-36-Nest :3，-CCATGGTAGCTATGCGCAACPCTAPCGAPGAAPGAC-5’ -P32 序列編號 2兩個正方向的嵌合式引物(F-34-Std和F-34-Nest)他們之間的差別與兩個反方 向嵌合式引物的差別類似。5’ -CTAPGACPACGPACTPCCCATGGGAGACCGCGGT-3’ (F-34-Nest)序列編號 55’ -CTAGGACGACGGACTGCCCATGGGAGACCGCGGT-3’ (F-344td)序列編號 6 —對互補 的模板序列Temp-R-47 5 ’ -CCATGGGAGACCGCGGTGGGCCCGGCCGGGTACCATCGATACGCGTT-3 ’ 序列編 號3Temp-F-47 3 ’ -GGTACCCTCTGGCGCCACCCGGGCCGGCCCATGGTAGCTATGCGCAA-5 ’ 序列編
號4嵌合式引物中下劃線部分(3-末端)的序列是與模板的序列互補。非下劃線部分 (5-末端)是標記部分，其序列中包含非天然的核苷酸。在另外的實驗中，嵌合式和非嵌合 式的引物被用于下列的條件中
權(quán)利要求
1.一個擴增寡核苷酸序列的過程，這一過程包括上述的寡核苷酸序列與一個正向的嵌 合引物和一個反向的嵌合引物在水溶液中的接觸，這其中，正向嵌合引物的核苷酸序列與 被擴增的寡核苷酸3'-端一個區(qū)域的序列是互補的，反向嵌合引物的核苷酸序列與被擴 增的寡核苷酸5'-端一個區(qū)域的序列是相同的，同時正向和反向嵌合引物與被擴增的寡 核苷酸接觸的序列的5'-端均含有一個獨特的寡核苷酸標記序列，該標記序列中包含至 少一個非標準的核苷酸，該非標準的核苷酸的堿基選自圖1中所示的堿基結(jié)構(gòu)，將上述被 擴增的寡核苷酸與正向和反向嵌合引物組成的混合物與酶和三磷酸核苷作用，此處的酶包 括DNA聚合酶，RNA聚合酶，和逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶能夠接受和復制含有非標準核苷酸的嵌合弓I 物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過程中，所提及的核苷選自一組包含以下結(jié)構(gòu)的類似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的酶包含Phusion，Vent和De印Vent。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述pH值被調(diào)節(jié)為了優(yōu)化擴增產(chǎn)物雙鏈的退火溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述pH值介于6.5到7. 5之間。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求1中所述過程中，多個片段被同時擴增。
7.一個擴增寡核苷酸序列的過程，這一過程包括上述的寡核苷酸序列與一個正向的 引物和一個反向的引物在水溶液中的接觸，這其中，正向引物的核苷酸序列與被擴增的寡 核苷酸3'-端一個區(qū)域的序列是互補的，反向引物的核苷酸序列與被擴增的寡核苷酸 5'-端一個區(qū)域的序列是相同的，并且這三種核苷酸序列的混合物與酶和三磷酸核苷作 用，此處的酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，和逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶能夠接受和復制上述的引物和 含有至少兩個非標準核苷酸的寡核苷酸序列，該非標準的核苷酸的堿基選自一組包含以下結(jié)構(gòu)的類似物
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的酶包含Phusion，Vent和De印Vent。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述pH值被調(diào)節(jié)為了優(yōu)化擴增產(chǎn)物雙鏈的退火溫度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述pH值介于6.5到7. 5之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求7中所述非標準的核苷酸在被擴增的寡核苷酸中是相鄰的。結(jié)構(gòu)的類似物。
全文摘要
這個公開的發(fā)明講述通過模板和引物與DNA聚合酶和非標準核苷酸的三磷酸的相互作用來擴增寡核苷酸的過程，這里的非標準核苷酸可以形成堿基配對并且具有標準的沃森-克里克幾何結(jié)構(gòu)，但是，非標準核苷酸堿基對之間的氫鍵模式不同于標準的堿基對A:T和G:C之間的氫鍵模式。因此，本發(fā)明涉及核苷酸類似物及其衍生物，當它們被嵌入到DNA和RNA中時，增加可復制的核苷酸數(shù)目超出天然DNA和RNA中的四種核苷酸。本發(fā)明還涉及到聚合酶將非標準核苷酸的三磷酸類似物和衍生物嵌入寡核苷酸中，更具體地說，聚合酶和非標準核苷酸的三磷酸支持聚合酶鏈反應(PCR)，包括PCR產(chǎn)品中含有多個非標準核苷酸單位。本發(fā)明中提供的例子表明這一過程使用6-氨基-5-硝基-3-(1′-β-D-2′-脫氧呋喃型)-2(1氫)-吡啶酮來實施非標準“小堿基”的給-給-受(pyDDA)氫鍵模式，和2-氨基-8-(1′-β-D-2′-脫氧呋喃型)-咪唑[1，2-α]-1，3，5-三嗪-4(8氫)-烷來實施“大堿基”的受-受-給(puAAD)氫鍵模式。
文檔編號C12P19/34GK102066574SQ200980123411
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者史蒂文·埃爾伯特·奔納, 楊尊義, 陳非 申請人:史蒂文·埃爾伯特·奔納, 楊尊義, 陳非