專利名稱：：抑制TNFα的穩(wěn)定和可溶的抗體的制作方法抑制TNFα的穩(wěn)定和可溶的抗體相關(guān)信息本申請(qǐng)要求2008年6月25日提交的US61/075,640和2008年6月沈日提交的US61/075,956的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：腫瘤壞死因子α(TNFα，也稱為惡液質(zhì)素)是由許多細(xì)胞類型(包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)響應(yīng)內(nèi)毒素或其他刺激物而產(chǎn)生的天然發(fā)生的哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子。TNFa是炎性、免疫和病理生理反應(yīng)的主要介體(mediator)(Grell，M.，等人(1995)Cell,83793-802)?？扇苄訲NFa通過前體跨膜蛋白的斷裂而形成(Kriegler，等人(1988)Cell53:45-53)，并且分泌的17kDa多肽裝配成可溶性同三聚體復(fù)合物(Smith，等人(1987)，J.Biol.Chem.262:6951-6954；關(guān)于TNFA的綜述，參見Butler,等人(1986)，Nature320584；Old(1986),Science230:630)。然后這些復(fù)合物結(jié)合在多種細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的受體。結(jié)合產(chǎn)生一系列促炎效應(yīng)，包括(i)釋放其他促炎細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素IL-6、IL-8和IL-1，()釋放基質(zhì)金屬蛋白酶和(iii)上調(diào)內(nèi)皮粘附分子的表達(dá)，從而通過誘集白細(xì)胞進(jìn)入血管外組織來進(jìn)一步放大炎性和免疫級(jí)聯(lián)。許多病癥與升高的TNFa水平關(guān)聯(lián)，它們中的許多具有顯著的醫(yī)學(xué)重要性。已顯示TNFa在許多人類疾病中上調(diào)，所述疾病包括慢性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、膿毒癥、充血性心力衰竭、支氣管哮喘(asthmabronchiale)和多發(fā)性硬化。人TNFα轉(zhuǎn)基因小鼠組成型地產(chǎn)生高水平的TNFα并且發(fā)展與RA相似的自發(fā)性、破壞性多關(guān)節(jié)炎(Keffer等人1991，EMB0J.，10，4025-4031)。TNFa因而被稱為促炎細(xì)胞因子。TNFa現(xiàn)已被認(rèn)為是RA(其為特征在于多關(guān)節(jié)炎癥和破壞的慢性進(jìn)行性和使人虛弱的疾病，具有全身性的發(fā)熱以及不適和疲勞癥狀)發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子。RA還導(dǎo)致慢性滑液炎癥，且經(jīng)常進(jìn)展至關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞。在RA患者的滑液和外周血中都發(fā)現(xiàn)了增加的TNFa水平。當(dāng)給RA患者施用TNFa阻斷劑時(shí)，他們減少了炎癥，改善了癥狀和延緩了關(guān)節(jié)損傷(McKown等人(1999)，ArthritisRheum.42:1204-1208)。在生理學(xué)上，TNFa還與抵抗特定感染的保護(hù)作用關(guān)聯(lián)(Cerami.等人(1988)，Immunol.Today9:28)。TNFa由已被革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖活化的巨噬細(xì)胞釋放。因此，TNFa似乎為參與和細(xì)菌性膿毒癥關(guān)聯(lián)的內(nèi)毒性休克的發(fā)展和發(fā)病機(jī)制的具有中心重要性的內(nèi)源性介體(Michie，等人(1989),Br.J.Surg.76:670-671.；Debets.等人(1989)，SecondViennaShockForum,p.463-466；Simpson,等人(1989)Crit.CareClin.5:27-47；Waage等人(1987)·Lancet1:355-357；Hammerle.等人(1989)SecondViennaShockForump.715-718；Debets.等人(1989)，Crit.CareMed.17:489-497；Calandra.等人(1990)，J.Infect.Dis.161:982-987；Revhaug等人(1988)，Arch.Surg.123:162-170)。至于其他器官系統(tǒng)，還已顯示TNFa在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)的炎性和自身免疫性病癥(包括多發(fā)性硬化、格-巴二氏綜合征(Guillain-Barresyndrome)和重癥肌無力)和在神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病(包括阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病)中起著至關(guān)重要的作用。TNFa還牽涉視網(wǎng)膜和肌肉的相關(guān)系統(tǒng)的病癥(包括視神經(jīng)炎、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、皮肌炎、肌萎縮側(cè)索硬化和肌營養(yǎng)不良)以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷(包括創(chuàng)傷性腦損傷、急性脊髓損傷和中風(fēng))。肝炎是除了其他誘發(fā)劑(trigger)以外可由病毒感染(包括EB病毒(Epstein-Barrvirus)、巨細(xì)胞病毒和甲型-戊型肝炎病毒)引起的另一種TNFa相關(guān)炎性病癥。肝炎引發(fā)肝門和小葉區(qū)域中的急性肝炎癥，然后引發(fā)纖維化和腫瘤進(jìn)展。TNFa還可介導(dǎo)引起主要的癌癥發(fā)病率和死亡率的癌癥的惡病質(zhì)(TisdaleMJ.(2004)，LangenbecksArchSurg.389:299-305)。TNFa在炎癥、細(xì)胞免疫應(yīng)答和許多疾病的病理學(xué)中所起的至關(guān)重要的作用已導(dǎo)致對(duì)于TNFα的拮抗劑的研究。設(shè)計(jì)用于治療TNFα介導(dǎo)的疾病的一種TNFα拮抗劑是特異性結(jié)合TNFa，從而阻斷其功能的抗體或抗體片段?？筎NFα抗體的使用已顯示，TNFα的阻斷可逆轉(zhuǎn)由TNFa促成的效應(yīng)，包括IL-l、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子和組織破壞的減少(Feldmann等人(1997)，Adv.Immunol.1997:283-350)。最近已成為商購可獲得的TNFα的特異性抑制劑包括已在RA和克羅恩病的治療中顯示臨床效果的抗TNFα的單克隆嵌合小鼠-人抗體(英禾1J昔單抗、Remicade;CentocorCorporation/Johnson&Johnson)。以團(tuán)注的形式(這導(dǎo)致穩(wěn)定地減少直至下一次注射的高起始濃度)每周一次或以更長的間隔靜脈內(nèi)或皮下施用所有市售的TNFα抑制劑。它們的分布容積(volumeofdistribution)是有限的。盡管獲得這些進(jìn)展，但仍然需要用于治療TNFα相關(guān)病癥例如RA的新型有效的抗體或其他免疫結(jié)合劑。特別地，迫切需要對(duì)于關(guān)節(jié)炎和其他TNFα介導(dǎo)的病癥的有效且持續(xù)的治療具有最佳功能性質(zhì)的免疫結(jié)合劑，其允許更靈活的施用和配制方式并且具有提高的組織滲透性從而增加分布容積。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一般目的是提供在體外和體內(nèi)特異性結(jié)合TNFα的穩(wěn)定和可溶的抗體或其他免疫結(jié)合劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫結(jié)合劑是scFv抗體或Fab片段。本發(fā)明提供了特異于TNFα的穩(wěn)定和可溶的scFv抗體和Fab片段，其包含就穩(wěn)定性、溶解性、對(duì)TNFa的體外和體內(nèi)結(jié)合以及低免疫原性進(jìn)行最優(yōu)化的特定輕鏈和重鏈序列。所述抗體經(jīng)設(shè)計(jì)用于TNFa介導(dǎo)的病癥的診斷和/或治療。還公開了用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的核酸、載體和宿主細(xì)胞、用于分離其的方法和所述抗體在醫(yī)藥中的用途。附圖概述圖1描述了來自44個(gè)抗-TNFRabMab雜交瘤的上清液在結(jié)合TNFα(Biacore測定)和中和其活性(Li^9測定)中的相對(duì)能力。圖2描述了20種抗TNFRabMab單鏈抗體和7種人源化抗TNF單鏈抗體在選擇性結(jié)合TNFa中的能力(ELISA分泌測定，請(qǐng)注意對(duì)于該測定使用來自細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液，未就單鏈抗體的含量對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化)。圖3描述了EP43max(圖3A)禾ΠEP34max(圖3B)對(duì)人TNFα的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。圖4描述了EP43max的效力(空心方塊)，ESBA105的效力(實(shí)心圓)。EP43max的EC5tl為lng/ml并且ESBA105的EC5tl為6.5ng/ml。圖5描述了EP43max、EP6max和EP19max在熱去折疊測定(FTIR)中的性能。圖6描述了EP43max和其衍生物的熱變性曲線，如通過FIlR分析比較的。圖7描述了EP43max(圖7A)和其EP43minmax變體(圖7B)在熱脅迫測試中的比較。圖8描述了本文中用于將抗原結(jié)合部位從兔單克隆抗體移植入高度可溶且穩(wěn)定的人抗體構(gòu)架的⑶RHl的界定。圖9a舉例說明Epi34max和阿達(dá)木單抗阻斷1000pg/ml重組人TNFα的細(xì)胞毒性活性(鼠L929細(xì)胞)的潛能。Ep34max和阿達(dá)木單抗的IC50分別被測定為1.03ng/ml和8.46ng/ml。圖9b舉例說明阿達(dá)木單抗和Ep34max阻斷10pg/ml重組人TNFα的細(xì)胞毒性活性(人Kym-I細(xì)胞)的潛能。英利昔單抗和Ep34maX(791)的IC5tl分別被測定為66.2ng/ml禾口0.69ng/ml。圖IOa舉例說明Epi34max和英利昔單抗阻斷1000pg/ml重組人TNFα的細(xì)胞毒性活性(鼠細(xì)胞)的潛能。Ep34maX和英利昔單抗的IC5tl分別被測定為1.04ng/ml和13.9ng/ml。圖IOb舉例說明英利昔單抗和Ep34max(791)阻斷10pg/ml重組人TNF的細(xì)胞毒性活性(人Kym-I細(xì)胞)的潛能。英利昔單抗和Ep34maX的IC5tl分別被測定為14.Sng/ml禾口0.63ng/ml。圖11舉例說明與ESBA903相比較，從Ep34maX的酰胺I帶區(qū)域中的傅里葉變換紅外光譜擬合的BioATRFT-IR熱變性曲線圖。ESBA903的V50為71.12，且EP34max的V50為71.50；ESBA903的斜率為2.481，EP34max的斜率為2.540圖12舉例說明Ep34max和ESBA903scFv抗體的DSC熱去折疊曲線。EP34max的Tm為78.Il0C,ESBA903的Tm為76.19"C。發(fā)明詳述本發(fā)明的一般目的是提供在體外和體內(nèi)特異性結(jié)合TNFα的穩(wěn)定和可溶的免疫結(jié)合劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體衍生物是scFv抗體或Fab片段。本發(fā)明的免疫結(jié)合劑優(yōu)選包含輕鏈和/或重鏈。定義為了可更容易地理解本發(fā)明，如下定義某些術(shù)語。另外的定義示于本說明書的上下文中。本文中使用的術(shù)語“抗體”是“免疫球蛋白，，的同義詞。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)v(SkerraΑ.和Pluckthun，Α.(1988)Science240:1038-41)，scFv(Bird,R.Ε.等人(1988)Science242:423-26；Huston,J.S.等人(1988；Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-83),Fab,(Fab')2或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他片段。術(shù)語“⑶R”是指抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)主要促成抗原結(jié)合的6個(gè)高變區(qū)之一。所述6個(gè)CDR的最常用的定義之一由KabatΕ.A.等人，(1991)kquencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應(yīng)用于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R1、⑶R2和⑶R3(⑶RLi、⑶RL2、⑶RL3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R2和⑶R3(⑶RH2、⑶RH3或H2、H3)。然而，如本文中使用的，根據(jù)下列殘基(Kabat編號(hào))定義重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl(⑶RHl或Hl)其始于位置沈并且終止于位置36之前。這基本上是由Kabat和Chotia分別定義的⑶RHl的融合物(關(guān)于示例說明，也參見圖8)。本文中使用的術(shù)語“抗體構(gòu)架”是指可變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)(CDR)的支架。從本質(zhì)上講，其是不具有CDR的可變結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(或區(qū)域；VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(或區(qū)域；^的分子。此類scFv分子可具有一般結(jié)構(gòu)=NH2-V^接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭C00H。術(shù)語“免疫結(jié)合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結(jié)合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，以便免疫結(jié)合劑能夠特異性識(shí)別靶抗原。免疫結(jié)合劑的非限定性實(shí)例包括全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限于(i)Fab片段，由Vl、VH、Cl和ChI結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，(iii)Fab'片段；(iv)由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(ν)包含抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如Dab片段，其由Vh或八結(jié)構(gòu)域組成，Camelid或Shark抗體(例如，sharkIg-NARsNanobodieS)；和(Vii)納米抗體(Nanobody)，包含可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。如本文中使用的，用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的編號(hào)系統(tǒng)相應(yīng)于由A.Honegger,J.Mol.Biol.309(2001)657-670定義的系統(tǒng)(AHo系統(tǒng))。AHo系統(tǒng)與由Kabat等人(Kabat，Ε.A.，等人(1991)kquencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)定義的最常用的系統(tǒng)之間的換算表提供于A.Honegger,J.Mol.Biol.309(2001)657-670中。術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原(例如，TNF)上免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的部位。表位通常以獨(dú)特的空間構(gòu)象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸。參見，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷，G.Ε.Morris,Ed.(1996)。術(shù)語“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指抗體對(duì)預(yù)先確定的抗原上的表位的結(jié)合。通常，抗體以大約小于10_7m，例如大約小于10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或更小的親和力(Kd)結(jié)合。術(shù)語〃K/是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通常，本發(fā)明的抗體以小于大約1(ΤΜ，例如小于大約10_8Μ、10_9Μ或10.Μ或更小的解離平衡常數(shù)(Kd)結(jié)合TNF，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)在BIAC0RE儀中測定的。如本文中所使用的，“同一性”是指兩個(gè)多肽、分子之間或兩個(gè)核酸之間匹配的序列。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個(gè)DNA分子的每一個(gè)中的位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的位置都被賴氨酸占據(jù))時(shí)，各個(gè)分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個(gè)序列共有的匹配位置的數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置的數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，那么這兩個(gè)序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個(gè)位置中有3個(gè)位置匹配)。通常，在將兩個(gè)序列比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過使用，例如，通過計(jì)算機(jī)程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等(I97O)J.Mol.Biol.48:443-453的方法來提供。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.ApplBiosci.，411-17(1988))，使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在mgcg.com上獲得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(JMolBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長度權(quán)重來測定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性?！跋嗨频摹毙蛄惺钱?dāng)比對(duì)時(shí)共有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似的殘基是進(jìn)行比對(duì)的參照序列中的相應(yīng)氨基酸殘基的保守置換。在這點(diǎn)上，參照序列中的殘基的“保守置換”是用在物理或功能上與相應(yīng)的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。因此，“經(jīng)保守置換修飾的”序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個(gè)或多個(gè)保守置換的序列。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)相似性”是包含由兩個(gè)序列共有的匹配殘基或保守置換的位置的數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置的數(shù)目XlOO的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配以及10個(gè)位置中有2個(gè)包含保守置換，那么這兩個(gè)序列具有80%的正相似性。如本文中使用的，術(shù)語“保守的序列修飾”意指不會(huì)不利地影響或改變包含氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。此類保守的序列修飾包括核苷酸和氨基酸置換、添加和缺失。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入修飾。保守氨基酸置換包括其中用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基替代人抗VEGF抗體中的預(yù)測的非必需氨基酸殘基。鑒定不消除抗原結(jié)合作用的核苷酸和氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997))。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少兩個(gè)，優(yōu)選更多的進(jìn)行比對(duì)的氨基酸序列的矩陣產(chǎn)生的氨基酸序列(允許在比對(duì)中出現(xiàn)缺口)，其使得可能確定各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基。共有序列是包含在各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸的序列。如果兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸等同地出現(xiàn)在單個(gè)位置上，那么共有序列包括兩個(gè)或所有此類氨基酸。可在不同水平上分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列。例如，可在單個(gè)殘基水平、多個(gè)殘基水平、具有缺口的多個(gè)殘基水平等上展示保守性或變異性。殘基可展示相同殘基的保守性或可在種類水平上保守。氨基酸種類的實(shí)例包括具有下列的氨基酸種類極性的但不帶電荷的R基團(tuán)(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R基團(tuán)(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負(fù)電荷的R基團(tuán)(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R基團(tuán)(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸種類(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且可使用結(jié)構(gòu)測定法或其他數(shù)據(jù)來定義以估量可置換性。在該意義上，可置換的氨基酸可以指可在該位置上進(jìn)行置換并且保持功能保守性的任何氨基酸。然而，將認(rèn)識(shí)到，相同種類的氨基酸在它們的生物物理性質(zhì)上可具有一定程度的不同。例如，將認(rèn)識(shí)到，某些疏水性R基團(tuán)(例如，丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸)比其他疏水性R基團(tuán)(例如，纈氨酸或亮氨酸)更加親水(即，具有更高的親水性或更低的疏水性)。相對(duì)親水性或疏水性可使用本領(lǐng)域公知的方法(參見，例如，Rose等人，Science,229834-838(1985)和Cornette等人，JMol.Biol，195:659-685(1987))來測定。如本文中所使用的，當(dāng)一個(gè)氨基酸序列(例如，第一￥11或八序列)與一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸序列(例如，數(shù)據(jù)庫中的一個(gè)或多個(gè)VH或VL序列)比對(duì)時(shí)，可將一個(gè)序列(例如，第一Vh或\序列)中的氨基酸位置與一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸序列中的“相應(yīng)位置”相比較。如本文中所使用的，“相應(yīng)位置”表示當(dāng)對(duì)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，即當(dāng)序列進(jìn)行比對(duì)以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性或百分?jǐn)?shù)相似性時(shí)進(jìn)行比較的序列中的等同位置。如本文中使用的，“嵌合"免疫結(jié)合劑具有與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源的重鏈和/或輕鏈的部分，同時(shí)鏈的其余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體以及此類抗體的片段中的相應(yīng)序列同一或同源。本文中使用的人源化抗體是一種嵌合抗體。如本文中使用的，“人源化抗體〃是使用重組DNA技術(shù)合成以規(guī)避對(duì)外來抗原的免疫應(yīng)答的免疫結(jié)合劑。人源化是用于減少異種來源的單克隆抗體的免疫原性的良好建立的技術(shù)。人源化抗體由人源化的重鏈可變區(qū)、人源化的輕鏈可變區(qū)和完全人恒定結(jié)構(gòu)域組成?？勺儏^(qū)的人源化包括受體構(gòu)架的選擇(通常人受體構(gòu)架)、待插入可變結(jié)構(gòu)域受體構(gòu)架的來自供體免疫結(jié)合劑的CDR的范圍和來自供體構(gòu)架的殘基至受體構(gòu)架內(nèi)的置換。用于將⑶R移植入人受體構(gòu)架的一般方法已由Winter在美國專利5，225，539(其以其全文通過引用合并入本文)中公開。US6，407，213(其教導(dǎo)以其全文通過引用合并入本文)公開了構(gòu)架的許多氨基酸位置，其中來自供體免疫結(jié)合劑的置換是優(yōu)選的。如本文中所使用的，術(shù)語“功能性質(zhì)”是例如為了提高多肽的生產(chǎn)性質(zhì)或治療功效，其提高(例如相對(duì)于常規(guī)多肽)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結(jié)合劑)的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是提高的穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是提高的溶解性(例如，在細(xì)胞條件下)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是非聚集性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是表達(dá)(例如，在原核細(xì)胞中)的提高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是在內(nèi)含體純化方法后重折疊產(chǎn)量的提高。在某些實(shí)施方案中，功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。術(shù)語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。當(dāng)將核酸與另一個(gè)核酸序列置于功能關(guān)系中時(shí)，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子或增強(qiáng)子有效地連接至所述編碼序列。11術(shù)語“載體”是指能夠運(yùn)輸已與其連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其是指可將另外的DNA區(qū)段連接至其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接至病毒基因組中。某些載體(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)能夠在已將它們引入其中的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在引入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組，從而它們可隨宿主基因組一起復(fù)制。術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指已向其中引入了表達(dá)載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可包括細(xì)菌、微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞。易于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)；月市炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Mi^ptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)。適當(dāng)?shù)奈⑸锇ㄡ劸平湍?Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(Pichiapastoris)。適當(dāng)?shù)膭?dòng)物宿主細(xì)胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系)和NSO細(xì)胞。術(shù)語“治療”、“療法”和“醫(yī)治”是指本文中描述的治療性或預(yù)防性措施。“治療”的方法利用給有此治療需要的受試者(例如，患有TNFα介導(dǎo)的病癥的受試者或最終可能獲得這樣的病癥的受試者)施用本發(fā)明的抗體以預(yù)防、治愈、延遲、減輕病癥或復(fù)發(fā)性病癥的嚴(yán)重度或改善其一個(gè)或多個(gè)癥狀，或以延長在這樣的治療不存在的情況下所預(yù)期的受試者的存活。術(shù)語"TNF介導(dǎo)的病癥"或"TNF介導(dǎo)的疾病"是指其癥狀或疾病狀態(tài)的發(fā)作、進(jìn)展或持續(xù)需要TNF的參與的任何病癥。示例性TNF介導(dǎo)的病癥包括但不限于，一般炎癥的慢性和/或自身免疫性狀態(tài)、免疫介導(dǎo)的一般炎性病癥、炎性CNS疾病、影響眼、關(guān)節(jié)、皮膚、粘膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、泌尿道或肺的炎性疾病、一般葡萄膜炎的狀態(tài)、視網(wǎng)膜炎、HLA-B27+葡萄膜炎、貝切特氏病(Behcet'sdisease)、干眼綜合征、青光眼、干燥綜合征、糖尿病(包括糖尿病性神經(jīng)病變)、胰島素抵抗、一般關(guān)節(jié)炎的狀態(tài)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和賴特綜合征(Reiter'ssyndrome),青少年關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、多發(fā)性硬化、格-巴二氏綜合征、重癥肌無力、肌萎縮性側(cè)索硬化、結(jié)節(jié)病、腎小球腎炎、慢性腎病、膀胱炎、銀屑病(包括銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、化膿性汗腺炎、脂膜炎、壞疽性膿皮病、SAPHO綜合征(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨炎)、痤瘡、斯威特氏綜合征(Sweet'ssydrome)、天皰瘡、克羅恩病(包括腸外表現(xiàn))、潰瘍性結(jié)腸炎、支氣管哮喘、超敏性肺炎、普通變態(tài)反應(yīng)(generalallergies)、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纖維化、韋格納氏肉芽腫(Wegener'sgranulomatosis)、川崎綜合征(Kawasakisyndrome)、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(Churg-Mraussvasculitis)、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、燒傷、移植物抗宿主病、宿主抗移植物反應(yīng)、器官或骨髓移植后的排斥事件、一般脈管炎的全身性和局部狀態(tài)、系統(tǒng)性和盤狀紅斑狼瘡、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子癇、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、手術(shù)后炎癥例如眼手術(shù)(例如白內(nèi)障(晶狀體置換)或青光眼手術(shù))、關(guān)節(jié)手術(shù)(包括關(guān)節(jié)鏡手術(shù))、關(guān)節(jié)相關(guān)結(jié)構(gòu)(例如韌帶)上的手術(shù)，口腔和/或牙科手術(shù)、微創(chuàng)心血管手術(shù)(例如PTCA，旋切術(shù)，支架放置)，腹腔鏡和/或內(nèi)窺鏡腹膜內(nèi)和婦科學(xué)手術(shù)、內(nèi)窺鏡泌尿?qū)W手術(shù)(例如前列腺手術(shù)、輸尿管鏡檢查術(shù)、膀胱鏡檢查、間質(zhì)性膀胱炎)后的炎癥或一般地手術(shù)期間的炎癥(預(yù)防)、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、貝爾麻痹、克雅病(Creutzfeld-Jakobdisease)、癌癥相關(guān)骨質(zhì)溶解、癌癥相關(guān)炎癥、癌癥相關(guān)疼痛、癌癥相關(guān)惡病質(zhì)、骨轉(zhuǎn)移瘤(bonemetastases)、急性和慢性疼痛(無論此類疾病是否由TNFα的中心或外周作用引起以及無論它們是被分類為炎性、傷害性還是神經(jīng)病性疼痛)，坐骨神經(jīng)痛、腰痛、腕管綜合征、復(fù)雜性局部疼痛綜合征(CRPQ、痛風(fēng)、皰疹后神經(jīng)痛、纖維肌痛、局部疼痛狀態(tài)、轉(zhuǎn)移性腫瘤引起的慢性疼痛綜合征、痛經(jīng)(dismenorrhea)、細(xì)菌性、病毒性或真菌性膿毒癥、肺結(jié)核、AIDS、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、血脂異常、心功能不全和慢性心力衰竭。術(shù)語"有效劑量"或"有效給藥量"是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。術(shù)語“治療有效劑量”定義為足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。對(duì)于該用途有效的量將取決于待治療的病癥的嚴(yán)重度和患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)。術(shù)語“受試者”是指任何人或非人動(dòng)物。例如，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療患有TNF介導(dǎo)的病癥的受試者。術(shù)語"兔類動(dòng)物"是指分類學(xué)兔形目(Lagomorpha)的成員，包括兔科(Leporidae)(例如野兔和兔)和鼠兔科(Ochotonidae)(鼠兔)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，兔類動(dòng)物是兔。本文中使用的術(shù)語“兔”是指屬于兔科的動(dòng)物。不同的命名法被用于產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑。此類免疫結(jié)合劑通常利用編號(hào)(例如#34)來確定。在使用前綴例如EP或Epi的情況下(例如，EP34，其與Epi34或#34相同)，表示相同的免疫結(jié)合劑。除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但下面描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例只是舉例說明性的而非限定性的。在下列部分更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個(gè)方面。應(yīng)理解，可隨意組合不同實(shí)施方案、參數(shù)和范圍。此外，取決于具體的實(shí)施方案，可不使用選擇的定義、實(shí)施方案或范圍?？筎NFα抗體在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合TNFa，從而適合于在體內(nèi)阻斷TNFα的功能的免疫結(jié)合劑。此類免疫結(jié)合劑的⑶R來源于US7，431，927中公開的兔抗TNFα單克隆抗體。已知兔抗體具有特別高的親和力。此外，本文中公開的CDR序列是天然序列，這意味著所得的免疫結(jié)合劑不必進(jìn)行親和力成熟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑體內(nèi)中和TNFa。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合TNFa的免疫結(jié)合劑，其包括CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3氨基酸序列中的至少一個(gè)。用于本發(fā)明的免疫結(jié)合劑的示例性CDR氨基酸序列示于SEQIDNo:3-50(表1)中?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的方法將SEQIDNo3-50中所示的⑶R移植至任何適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合支架(參見例如，Riechmann，L.等人(1998)Nature332:323-327Jones,P.等人(1986)Nature321522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.NatlAcad.See.U.S.Α.86:10029-10033；屬于Winter的美國專利5，225，539和屬于Queen等人的美國專利5，530，101；5，585，089；5，693，762和6，180，370)。可將來自不同親本抗體的⑶R組合入一個(gè)抗體中以產(chǎn)生另外的抗體種類。然而，優(yōu)選，人源化本文中公開的免疫結(jié)合劑，從而使其適合用于治療性應(yīng)用。13因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人TNFa的免疫結(jié)合劑，所述免疫結(jié)合劑包含(i)人源化的重鏈可變區(qū)(VH)，所述重鏈可變區(qū)包含人重鏈可變構(gòu)架序列和源于兔免疫結(jié)合劑的⑶RHI、⑶RH2和⑶RH3序列；和/或(ii)人源化的輕鏈可變區(qū)(VL)，所述輕鏈可變區(qū)包含人輕鏈可變構(gòu)架序列和源于兔免疫結(jié)合劑的⑶RLi、⑶RL2和⑶RL3序列。如本領(lǐng)域中已知的，許多兔VH鏈具有額外的成對(duì)的半胱氨酸(相對(duì)于鼠和人的對(duì)應(yīng)物)。除了在cys22與cys92之間形成的保守的二硫橋外，在一些兔鏈中還存在cys21-cys79橋以及在⑶RHl的最后一個(gè)殘基與⑶RH2的第一個(gè)殘基之間形成的⑶R間S-S橋。此外，經(jīng)常在CDR-L3中發(fā)現(xiàn)成對(duì)的半胱氨酸殘基。此外，許多兔抗體CDR不屬于任何之前已知的經(jīng)典結(jié)構(gòu)(canonicalstructure)。特別地，CDR-L3通常比人或鼠對(duì)應(yīng)物的CDR-L3長得多。除了兔之外，本發(fā)明還可用于移植任何兔類動(dòng)物的⑶R。在抗體的情況下，可將SEQIDNo:3-50中所示的兔⑶R移植入來自任何物種的任何抗體的構(gòu)架區(qū)。然而，之前已發(fā)現(xiàn)，包含在所謂的“質(zhì)量控制”篩選(W00148017)中鑒定的構(gòu)架的抗體或抗體衍生物的特征在于普遍較高的穩(wěn)定性和/或溶解性，從而其還可用于細(xì)胞外應(yīng)用例如中和人TNFα的背景中。此外，還已發(fā)現(xiàn)，這些VL(可變輕鏈)和VH(可變重鏈)可溶性和穩(wěn)定的構(gòu)架的一個(gè)特定組合特別適合于容納兔CDR。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在移植入所述構(gòu)架或其衍生物后，許多種兔CDR的環(huán)構(gòu)象可得到完全保持，且很大程度上不依賴于供體構(gòu)架的序列。此外，與兔野生型單鏈相比，包含不同兔CDR的所述構(gòu)架或其衍生物可進(jìn)行良好的表達(dá)和良好的產(chǎn)生，并且仍然幾乎完全保持原始供體兔抗體的親和力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將SEQIDNo:3-50中所示的⑶R移植入通過EP1479694中公開的“質(zhì)量控制”篩選獲得的人抗體構(gòu)架。用于本發(fā)明的示例性構(gòu)架的氨基酸序列示于下列的SEQIDNo1禾口2中。SEQIDNo1Fffl.4的可變輕鏈EIVMTQSPSTLSASV⑶RVIITC(X)n=3_5。WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3_50VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3_50FGQGTKLTVLGSEQIDNo2Fff1.4的可變重鏈EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)n=3_50ffVRQAPGKGLEWVS(X)n=3_50RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(X)n=3_50WGQGTLVTVSSX可以是任意天然發(fā)生的氨基酸。可存在至少3個(gè)和多至50個(gè)氨基酸。通常將⑶R插入其中X存在的位置。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合TNFα的免疫結(jié)合劑，其包含VH或VL氨基酸序列中的至少一個(gè)。用于本發(fā)明的免疫結(jié)合劑的示例性VH或VL氨基酸序列示于SEQIDNo:51-111中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合TNFa的免疫結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:51-111中所示的氨基酸序列具有大體上的相似性的氨基酸序列，并且其中所述免疫結(jié)合劑保持或改善了本發(fā)明的抗TNFa免疫結(jié)合劑的期望的功能性質(zhì)。示例性百分比相似性包括但不限于大約50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%或95%的同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合TNFa的免疫結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:51-111中所示的氨基酸序列具有大體上的同一性的氨基酸序列，并且其中所述免疫結(jié)合劑保持或改善了本發(fā)明的抗TNFa免疫結(jié)合劑的期望的功能性質(zhì)。示例性百分比同一性包括但不限于大約50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%或95%的同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合TNFa的免疫結(jié)合劑，其包含具有相對(duì)于SEQIDNo:51-111中所示的氨基酸序列的保守置換的氨基酸序列，并且其中所述免疫結(jié)合劑保持或改善了本發(fā)明的抗TNFa免疫結(jié)合劑的期望的功能性質(zhì)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫結(jié)合劑包含至少一個(gè)與SEQIDNo:3_50中的任一個(gè)至少80%，更優(yōu)選至少85%，90%，95%或100%同一的⑶R序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由SEQIDNo3_8組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由SEQIDNo9-14組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由15-20組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由21-26組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由27-32組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由33-38組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由39-44組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了免疫結(jié)合劑，其包含由45-50組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或最優(yōu)選6個(gè)⑶R。本文中于SEQIDNo:3_50中提供的⑶R序列還可包含置換。優(yōu)選，所述序列具有3個(gè)，更優(yōu)選2個(gè)和最優(yōu)選僅1個(gè)置換。所述置換優(yōu)選使免疫結(jié)合劑的選擇性結(jié)合能力不被削弱但使所述免疫結(jié)合劑的親和力改變，優(yōu)選增強(qiáng)。表1.Rabmab供體CDRSEQIDNoSEQIDNoSEQIDNoSEQIDNoSEQIDNoSEQIDNo權(quán)利要求1.特異性結(jié)合人TNFa的免疫結(jié)合劑，所述免疫結(jié)合劑包含(i)人重鏈可變構(gòu)架序列和源于兔免疫結(jié)合劑的CDRHI、CDRH2和CDRH3序列；和/或()人輕鏈可變構(gòu)架序列和源于兔免疫結(jié)合劑的⑶RLi、⑶RL2和⑶RL3序列。2.權(quán)利要求1的免疫結(jié)合劑，其中所述人重鏈可變區(qū)構(gòu)架與SEQIDN0:1具有至少90%的同一性和/或所述人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列與SEQIDNO2具有至少85%的同一性。3.權(quán)利要求2的免疫結(jié)合劑，其中所述人重鏈可變區(qū)構(gòu)架是或包含SEQIDN0:1和/或所述人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列是或包含SEQIDNO:2。4.權(quán)利要求2的免疫結(jié)合劑，其中所述人重鏈可變區(qū)構(gòu)架是或包含SEQIDNO89或SEQIDNO:90和/或所述人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列是或包含SEQIDNO:91。5.權(quán)利要求1或2的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其在重鏈構(gòu)架(VH)中在選自根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的位置H24、H25、H56、H82、H84、H89和H108的位置處包含一個(gè)或多個(gè)置換；和/或在輕鏈構(gòu)架(VL)中在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的位置L87處包含置換。6.權(quán)利要求5的免疫結(jié)合劑，其中所述置換選自根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的位置HM處的蘇氨酸(T)、位置H25處的纈氨酸(V)、位置H56處的甘氨酸(G)或丙氨酸(A)、位置H82處的賴氨酸(K)、位置H84處的蘇氨酸(T)、位置H89處的纈氨酸(V)和位置H108處的精氨酸(R)及位置L87處的蘇氨酸⑴。7.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其中所述免疫結(jié)合劑在重鏈氨基酸位置12、103和144(AHo編號(hào))中的至少一個(gè)位置處包含增強(qiáng)溶解性的置換。8.權(quán)利要求7的免疫結(jié)合劑，其中所述增強(qiáng)溶解性的置換選自(a)位置12處的絲氨酸⑶；(b)位置103處的蘇氨酸⑴；和(c)位置144處的蘇氨酸⑴。9.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO3,SEQIDNO:4、SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDNO7禾口SEQIDNO:8的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)CDR序列。10.權(quán)利要求9的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)(VL)的位置22，74，95，97和99中的至少一個(gè)位置處具有置換，優(yōu)選位置L22處的蘇氨酸(T)、位置L74處的苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)、位置L95處的谷氨酸(E)和位置L99處的丙氨酸(A)。11.權(quán)利要求9-10的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDN0:51、SEQIDNO:53和SEQIDNO:55的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO58和SEQIDNO59的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。12.權(quán)利要求9-11的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO94、SEQIDNO95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。13.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO:9、SEQIDNO10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13禾口SEQIDNO:14的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。14.權(quán)利要求13的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO60和SEQIDNO62的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO:61和SEQIDNO63的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。15.權(quán)利要求14的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO:103、SEQIDNO:104或SEQIDNO:105具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。16.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19禾口SEQIDNO:20的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。17.權(quán)利要求15的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)(VL)的位置87、89和92中的至少一個(gè)位置處具有置換。18.權(quán)利要求16至17的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO:64和SEQIDNO66的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO65和SEQIDNO67的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。19.權(quán)利要求15至18的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO:106、SEQIDNO:107或SEQIDNO:108具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。20.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:25禾口SEQIDNO:26的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。21.權(quán)利要求20的免疫結(jié)合劑，所述重鏈構(gòu)架在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的構(gòu)架位置85和88處具有缺失。22.權(quán)利要求20至21的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO68和SEQIDNO70的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO69和SEQIDNO71的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。23.權(quán)利要求19至22的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO:109、SEQIDNO:110或SEQIDNO:111具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。24.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO27、SEQIDN0:28,SEQIDNO29,SEQIDNO30,SEQIDNO:31禾口SEQIDNO:32的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。25.權(quán)利要求M的免疫結(jié)合劑，所述重鏈構(gòu)架在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的構(gòu)架位置85和88處具有缺失。26.權(quán)利要求M至25的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)(VL)的位置86和87中的至少一個(gè)位置處具有置換，優(yōu)選位置L87處的蘇氨酸(T)和位置L88處的谷氨酰胺(Q)。27.權(quán)利要求M至沈的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO73和SEQIDNO75的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO74和SEQIDNO76的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。28.權(quán)利要求M至27的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO:112或SEQIDNO:113具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。29.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO33、SEQIDN0:34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37禾口SEQIDNO:38的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。30.權(quán)利要求四的免疫結(jié)合劑，所述重鏈構(gòu)架在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的構(gòu)架位置85和88處具有缺失。31.權(quán)利要求四至30的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)(VL)的位置15、48、90中的至少一個(gè)位置處具有置換。32.權(quán)利要求四至31的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO77和SEQIDNO79的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO78和SEQIDNO80的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。33.權(quán)利要求四至32的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO:114或SEQIDNO:115具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。34.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43禾口SEQIDNO:44的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。35.權(quán)利要求34的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)(VL)的位置57和87中的至少一個(gè)位置處具有置換，優(yōu)選位置L57處的纈氨酸(V)和位置L87處的蘇氨酸⑴。36.權(quán)利要求34至35的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，所述重鏈構(gòu)架在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的構(gòu)架位置85和88處具有缺失。37.權(quán)利要求34至36的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)的位置1、3、4、10、47、57、91和103中的至少一個(gè)位置處具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的置換，優(yōu)選增強(qiáng)穩(wěn)定性的置換選自(a)位置1處的谷氨酸(E)、(b)位置3處的纈氨酸(V)、(c)位置4處的亮氨酸(L)、(d)位置10處的絲氨酸⑶、(e)位置47處的精氨酸(R)、(e)位置57處的絲氨酸⑶、(f)位置91處的苯丙氨酸(F)和(g)位置103處的纈氨酸(V)。38.權(quán)利要求34至37的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO81和SEQIDNO83的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO82和SEQIDNO84的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。39.權(quán)利要求；34至38的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO:116、SEQIDNO:117或SEQIDNO:118具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。40.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其還包含與選自SEQIDNO45、SEQIDNO:46、SEQIDNO47,SEQIDNO48,SEQIDNO49和SEQIDNO:50的序列至少80%同一的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列。41.權(quán)利要求40的免疫結(jié)合劑，所述重鏈構(gòu)架在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的構(gòu)架位置85和88處具有缺失。42.權(quán)利要求40至41的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其在根據(jù)AHo編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)的位置1、3、4、10、47、57、91和103中的至少一個(gè)位置處具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的置換，優(yōu)選增強(qiáng)穩(wěn)定性的置換選自(a)位置1處的谷氨酸(E)、(b)位置3處的纈氨酸(V)、(c)位置4處的亮氨酸(L)、(d)位置10處的絲氨酸⑶、(e)位置47處的精氨酸(R)、(e)位置57處的絲氨酸(S)、(f)位置91處的苯丙氨酸(F)和(g)位置103處的纈氨酸(V)。43.權(quán)利要求40至42的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其包含與選自SEQIDNO85和SEQIDNO87的序列具有至少90%的序列同一性的重鏈可變區(qū)(VH)，和/或與選自SEQIDNO86和SEQIDNO88的序列具有至少90%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VL)。44.權(quán)利要求40至43的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其與SEQIDNO119、SEQIDNO:120或SEQIDNO:121具有至少90%的序列同一性，優(yōu)選100%的序列同一性。45.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑，其是抗體、scFv、Fab或Dab。46.具有與SEQIDNo:3-50的任何⑶R不同的⑶R的免疫結(jié)合劑，其與前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑競爭對(duì)人TNFα的結(jié)合。47.具有與SEQIDNo:3-50的任何⑶R不同的⑶R的免疫結(jié)合劑，其結(jié)合與前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑結(jié)合的相同的人TNFα上的表位。48.包含前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的免疫結(jié)合劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。49.編碼前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的可變重鏈區(qū)(VH)和/或可變輕鏈區(qū)(VL)的分離的核酸分子。50.包含權(quán)利要求49的核酸分子的表達(dá)載體。51.包含權(quán)利要求50的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。52.治療或預(yù)防受試者中的人TNFα介導(dǎo)的疾病的方法，其包括給所述受試者施用前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體以便治療所述受試者的TNFα介導(dǎo)的疾病。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述TNFα介導(dǎo)的疾病選自一般炎癥的慢性和/或自身免疫性狀態(tài)、免疫介導(dǎo)的一般炎性病癥、炎性CNS疾病、影響眼、關(guān)節(jié)、皮膚、粘膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、泌尿道或肺的炎性疾病、一般葡萄膜炎的狀態(tài)、視網(wǎng)膜炎、HLA-B27+葡萄膜炎、貝切特氏病、干眼綜合征、青光眼、干燥綜合征、糖尿病(包括糖尿病性神經(jīng)病變)、胰島素抵抗、一般關(guān)節(jié)炎的狀態(tài)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和賴特綜合征、青少年關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、多發(fā)性硬化、格-巴二氏綜合征、重癥肌無力、肌萎縮性側(cè)索硬化、結(jié)節(jié)病、腎小球腎炎、慢性腎病、膀胱炎、銀屑病(包括銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、化膿性汗腺炎、脂膜炎、壞疽性膿皮病、SAPHO綜合征(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨炎)、痤瘡、斯威特氏綜合征、天皰瘡、克羅恩病(包括腸外表現(xiàn))、潰瘍性結(jié)腸炎、支氣管哮喘、超敏性肺炎、普通變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纖維化、韋格納氏肉芽腫、川崎綜合征、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、燒傷、移植物抗宿主病、宿主抗移植物反應(yīng)、器官或骨髓移植后的排斥事件、一般脈管炎的全身性和局部狀態(tài)、系統(tǒng)性和盤狀紅斑狼瘡、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子癇、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、手術(shù)后炎癥例如眼手術(shù)(例如白內(nèi)障(晶狀體置換)或青光眼手術(shù))、關(guān)節(jié)手術(shù)(包括關(guān)節(jié)鏡手術(shù))、關(guān)節(jié)相關(guān)結(jié)構(gòu)(例如韌帶)上的手術(shù)，口腔和/或牙科手術(shù)、微創(chuàng)心血管手術(shù)(例如PTCA，旋切術(shù)，支架放置)，腹腔鏡和/或內(nèi)窺鏡腹膜內(nèi)和婦科學(xué)手術(shù)、內(nèi)窺鏡泌尿?qū)W手術(shù)(例如前列腺手術(shù)、輸尿管鏡檢查術(shù)、膀胱鏡檢查、間質(zhì)性膀胱炎)后的炎癥或一般地手術(shù)期間的炎癥(預(yù)防)、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、貝爾麻痹、克雅病、癌癥相關(guān)骨質(zhì)溶解、癌癥相關(guān)炎癥、癌癥相關(guān)疼痛、癌癥相關(guān)惡病質(zhì)、骨轉(zhuǎn)移瘤、急性和慢性疼痛，無論此類疼痛是否由TNFa的中心或外周作用引起以及無論它們是被分類為炎性、傷害性還是神經(jīng)病性疼痛、坐骨神經(jīng)痛、腰痛、腕管綜合征、復(fù)雜性局部疼痛綜合征(CRPQ、痛風(fēng)、皰疹后神經(jīng)痛、纖維肌痛、局部疼痛狀態(tài)、轉(zhuǎn)移性腫瘤引起的慢性疼痛綜合征、痛經(jīng)、細(xì)菌性、病毒性或真菌性膿毒癥、肺結(jié)核、AIDS、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、血脂異常、心功能不全和慢性心力衰竭。全文摘要本發(fā)明涉及特異于TNF的特別穩(wěn)定且可溶的scFv抗體和Fab片段，其包含就穩(wěn)定性、溶解性、TNF的體外和體內(nèi)結(jié)合以及低免疫原性進(jìn)行了優(yōu)化的特定輕鏈和重鏈序列。所述抗體設(shè)計(jì)用于診斷和/或治療TNF介導(dǎo)的病癥。還公開了用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的核酸、載體和宿主細(xì)胞、用于分離其的方法以及所述抗體在醫(yī)藥中的用途。文檔編號(hào)C12N15/13GK102076716SQ200980123825公開日2011年5月25日申請(qǐng)日期2009年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者D·厄里什,L·波拉斯,T·岡德申請(qǐng)人:艾斯巴技術(shù),愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司