專利名稱：在光合生物中誘導(dǎo)絮凝的制作方法
在光合生物中誘導(dǎo)絮凝相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2008年6月27日提交的美國臨時申請?zhí)?1/076，430的權(quán)益，出于 所有目的將其全部內(nèi)容通過弓I用結(jié)合在此。背景藻類是單細(xì)胞生物，通過光合作用產(chǎn)生氧氣。出于多種原因，一類(微藻)對于生 物技術(shù)應(yīng)用是有用的，這些原因包括它們的高生長速率以及對變化的環(huán)境條件的耐受性。 在多種工業(yè)過程中用于商業(yè)上重要的產(chǎn)品的微藻的用途是已知的和/或已經(jīng)被提出了。例 如，微藻在生產(chǎn)營養(yǎng)補劑、藥物、天然染料、用于魚和甲殼動物的一種食物來源、生物防治農(nóng) 業(yè)害蟲、在污水處理中產(chǎn)生氧以及去除氮、磷以及有毒物質(zhì)、以及污染控制(如生物降解塑 料或吸收二氧化碳)中具有用途。微藻(像其他生物一樣)含有作為膜組分、儲藏產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物以及能量來源的 脂類和脂肪酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些藻株、硅藻、以及藍(lán)細(xì)菌含有成比例地高水平的脂類(超過 30%)。在尋找用于生產(chǎn)生物燃料的一種可持續(xù)原料中，具有高油或脂含量的微藻株是特別 感興趣的。一些野生型藻類適合用于不同的工業(yè)應(yīng)用中。然而，已經(jīng)認(rèn)識到通過修飾藻類來 改進對于上述應(yīng)用有用的具體特征，這些相關(guān)的方法更可能是商業(yè)上可行的。為此，可以開 發(fā)具有超過野生型株的改進特征的藻株。已經(jīng)通過傳統(tǒng)的篩選和突變和選擇技術(shù)完成了這 樣的開發(fā)。另外，已經(jīng)廣泛地提出了將重組DNA技術(shù)用于藻類。此類方法可以提高生產(chǎn)商 業(yè)上有價值的產(chǎn)品的經(jīng)濟有效性。為了生產(chǎn)一些感興趣的商業(yè)產(chǎn)品，可以將生產(chǎn)這些產(chǎn)品的生物生長在液體環(huán)境 中。從這些液體環(huán)境中去除這些生物有時是有利的。去除生物的一種方法是將這些生物絮 凝或聚集以有助于去除。絮凝劑或絮凝化試劑通過引起液體中的膠體以及其他懸浮的顆粒 物(例如細(xì)胞)聚集從而促進了絮凝，形成一種絮狀物。將絮凝劑用于水處理過程中以提 高小顆粒的沉淀。例如，可以將一種絮凝劑用于游泳池或飲用水過濾中以幫助去除微觀顆 粒，否則這些微觀顆粒將引起水渾濁并且這些微觀顆粒單獨通過過濾將難以去除。許多絮凝劑是多價陽離子，如鋁、鐵、鈣或鎂。這些帶正電荷的分子與帶負(fù)電荷的 顆粒和分子相互作用從而減少聚集的障礙。此外，多種這些化學(xué)品在適當(dāng)?shù)腜H和其他條件 (如溫度和鹽度)下，與水反應(yīng)從而形成不可溶的氫氧化物，當(dāng)沉淀時這些氫氧化物連接到 一起從而形成長鏈或網(wǎng)狀，物理地將小顆粒俘獲到該較大的絮狀物中。使用化學(xué)絮凝劑使微藻絮凝是已知的。長鏈聚合物絮凝劑，如修飾的聚丙烯酰胺， 是由絮凝劑生產(chǎn)企業(yè)制造并銷售的。這些可以以干的或液體的形式提供，用于該絮凝過程 中。例如最常用的液體聚丙烯酰胺是作為一種具有10% -40%的活性物的乳液被提供的， 并且剩余部分是一種載體流體、多種表面活性劑以及膠乳。然而使用化學(xué)絮凝劑具有多個缺點。例如，用于水處理和其他過程中要求隨后去 除絮凝劑。加入和去除絮凝劑增加了商業(yè)生產(chǎn)一種感興趣的產(chǎn)品的成本，因此降低了生產(chǎn) 的經(jīng)濟可行性。
概述本披露的一個方面提供了多種載體，這些載體包括一個對一個絮凝部分進行編碼 的核酸以及一個調(diào)節(jié)元件，該調(diào)節(jié)元件被連接為用于在一種光合生物的細(xì)胞核中表達(dá)該絮 凝部分。在本發(fā)明中使用的這些絮凝部分可以包括碳水化合物結(jié)合蛋白、結(jié)合到萊茵衣藻、 鹽生杜氏藻(D. salina)、杜氏鹽藻(D. tertiolecta)、或雨生血球藻的一個細(xì)胞表面抗原 上的抗體、凝集素、i^huA蛋白、pl35蛋白、或形成一種牢固的蛋白-蛋白對的其他蛋白，其中 該對導(dǎo)致微藻的絮凝。在這些載體中使用的這些調(diào)節(jié)元件可以包括一種組成型啟動子、光 誘導(dǎo)型啟動子、群體敏感型啟動子、溫度敏感型啟動子、或氮饑餓響應(yīng)型啟動子。在此披露 的這些載體還可以包含多種核酸，這些核酸能夠?qū)⒃撔跄糠职邢虻郊?xì)胞表面上并且將該 絮凝部分的一部分進行錨定以使該絮凝部分的一部分被牢固地結(jié)合到該細(xì)胞表面上。使用 這些載體來轉(zhuǎn)化無維管的光合生物(如微藻)用于絮凝。在某些情況下，當(dāng)將該絮凝部分 分泌到該培養(yǎng)物中時，該錨定部分可以是任選的(取決于一個絮凝部分的特性)，是用于絮 凝的優(yōu)選的方法。另一個方面提供了使用無維管的光合生物進行絮凝的方法。無維管的光合生物的 實例是萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二形柵藻、或雨生血球藻。這些絮凝方法可以包括 通過用不同的絮凝部分進行轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生兩種明顯不同的光合生物并且通過允許這兩個絮 凝部分彼此相互作用來引起絮凝。絮凝部分的實例包括ThuA與pl35之間的蛋白-蛋白相 互作用、交配型特異性凝集素之間的相互作用、一個抗體-抗原對、以及能夠彼此識別為一 對并且形成一種穩(wěn)定的蛋白-蛋白復(fù)合體的其他蛋白。用于誘導(dǎo)無維管的光合生物絮凝的 方法的實例是，改變光照條件、培養(yǎng)密度、培養(yǎng)溫度、或養(yǎng)分有效性；在該培養(yǎng)物中加入凝集 素、蛋白、重金屬、陽離子的或化學(xué)的絮凝劑；或?qū)⑸鲜鲂跄齽└竭B到一種固體支持物上。另一個方面提供了再利用來自一個液體環(huán)境的培養(yǎng)物液體的方法。可以將無維管 的光合生物培養(yǎng)在具有本領(lǐng)域中已知的確定成分培養(yǎng)基的一種培養(yǎng)基中，如min-70、M-培 養(yǎng)基、或TAP培養(yǎng)基。在絮凝后，再利用該培養(yǎng)物的液體部分經(jīng)常是可能的并且經(jīng)濟上有利 的。在此披露的是能夠再利用包括對一個絮凝部分進行編碼的生長的微生物的液體；將該 生物與絮凝部分進行接觸并且由此使該生物絮凝；并且從該液體環(huán)境中去除聚集的微生物 的方法。一個具體方面提供了一種用于使一種無維管的光合生物絮凝的方法，該方法包括 在一種無維管的光合生物的外表面上表達(dá)一種對一個第一絮凝部分進行編碼的外源核酸 并且將該生物與一個第二絮凝部分進行接觸。這種生物可以是衣藻屬、杜氏藻屬、柵藻屬或 血球藻屬的一個成員，例如萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二形柵藻、或雨生血球藻，雖 然可以使用其他屬的成員。該第一絮凝部分可以是一種碳水化合物結(jié)合蛋白，如一種凝集 素并且具體地一種c型凝集素。碳水化合物結(jié)合蛋白的其他非限制性實例包括CD-SIGN、 Dectin-l、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-選擇素、P-選擇素、L-選擇 素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受體、磷脂酶A2受體、唾液酸粘附素(siglec-1)、sigleC-2、 siglec-3、 siglec-4、 siglec-5、 siglec-6、 siglec-7、 siglec-8、 siglec-9、 siglec-10、 siglec-11、以及半乳凝素類。在其他實施方案中，該第一絮凝部分可以是一種單價的、單價 態(tài)的或多價的抗體，例如一種scFv抗體，該scFv抗體結(jié)合到一種感興趣的生物的表面上的 一個抗原上。這類生物的實例包括衣藻屬、杜氏藻屬、柵藻屬或血球藻屬的成員，如萊茵衣
9藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二形柵藻、或雨生血球藻。一些實施方案還可以包括使用一個第 二絮凝部分。該第二絮凝部分可以是在一種固體支持物的表面上或在一個第二生物的表面 上，該第二生物可以是或可以不是一種無維管的光合生物。當(dāng)該第二絮凝部分被表達(dá)于一 個第二生物的表面上時，該第二絮凝部分可以是天然發(fā)生的或可以是一種外源核苷酸序列 表達(dá)的結(jié)果。在一些實施方案中，該第一和第二生物是相同的種，而在其他實施方案中，該 第一和第二生物是不同的品系、不同的屬或不同的界。例如，在一個實施方案中，該第一和 第二生物兩者都是藻類，而在另一個實施方案中，一個生物是一種藻類而另一個是一種細(xì) 菌或酵母。當(dāng)該第二絮凝部分是在一個第二生物或固體支持物的表面上時，該方法進一步 包括將該第一生物與該第二生物、與該固體支持物或兩者結(jié)合。另一個方面提供了一種無維管的光合生物，該光合生物包括在該生物的外部細(xì)胞 表面(如一個細(xì)胞膜或細(xì)胞壁)上的一種外源蛋白；該外源蛋白包括一個結(jié)合對的一個成 員。該外源蛋白可以是一種抗體，如一種單鏈可變區(qū)片段(scFv)抗體，或一種碳水化合物 結(jié)合蛋白，如一種凝集素(例如一種c型凝集素)。在其他實施方案中，該外源蛋白是一 種抗原，該抗原是一種抗體的目標(biāo)，并且在一個實施方案中，一種抗體對于那種抗原是特異 的。在一些實施方案中，該外源蛋白是一種融合或嵌合蛋白，其中部分的該蛋白發(fā)揮作用將 該蛋白錨定到該細(xì)胞表面上。該無維管的光合生物可以是一種藻類，例如一種綠藻，更具體 地衣藻屬、杜氏藻屬、柵藻屬或血球藻屬的一個成員，并且更具體地萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、 杜氏鹽藻、二形柵藻、或雨生血球藻中的一種。在一個實施方案中，該無維管的光合生物是 一種適鹽生物，如鹽生杜氏藻或杜氏鹽藻。在又其他實施方案中，該碳水化合物結(jié)合蛋白是 以下各項中的至少一個CD-SIGN、Dectin-l、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、 MMGL、E-選擇素、P-選擇素、L-選擇素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受體、磷脂酶A2受體、唾 液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、 siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、或半乳凝素類。又另一個方面提供了一種絮凝方法，該方法包括用一種對一個第一絮凝部分進行 編碼的核酸轉(zhuǎn)化一個第一無維管性光合生物，用一種對一個第二絮凝部分或一種用于生產(chǎn) 一個第二絮凝部分所必要的蛋白(該第二絮凝部分與該第一絮凝部分相互作用)進行編碼 的核酸轉(zhuǎn)化一個第二生物，該第二生物可以是或可以不是一種無維管的光合生物，表達(dá)該 第一和第二絮凝部分并且使這兩部分進行接觸從而使得絮凝發(fā)生。這兩個生物可以是相同 的或不同的屬、相同的或不同的種或相同的或不同的界。例如，這些生物可以是相同種的藻 類、不同種的藻類、或一種藻類和一種細(xì)菌或酵母。該第一生物、該第二生物或兩者可以是 衣藻屬、杜氏藻屬、柵藻屬或血球藻屬的成員，從而這些生物中的一個或兩者可以是萊茵衣 藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二形柵藻、或雨生血球藻。該第一或第二絮凝部分可以是抗體、 碳水化合物結(jié)合蛋白或交配型特異性凝集素。又另一個方面提供了一種載體，該載體包括一個對一個絮凝部分進行編碼的分 離的核酸、一個用于在該光合生物中(例如在細(xì)胞核中)表達(dá)該絮凝部分的調(diào)節(jié)元件、以及 一個允許該絮凝部分導(dǎo)向到該生物的表面上或被該生物分泌的靶向元件。該絮凝部分可以 是一種抗體或在此所述的碳水化合物結(jié)合蛋白的任何一種。絮凝部分的具體實例包括抗 體、凝集素、i^huA蛋白以及pb5蛋白。當(dāng)該核酸編碼一種抗體時，它可以是對于衣藻屬、杜 氏藻屬、柵藻屬或血球藻屬的一個成員例如萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二形柵藻、或雨生血球藻的表面的抗原的。在某些實施方案中，該載體進一步包括一種對一個錨定元件 進行編碼的核酸，該錨定元件將該絮凝部分錨定到該生物的表面上。又另一個方面提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括這些前述載體中的任何一 個。該宿主細(xì)胞可以是或可以不是一種無維管的光合生物。在一些實施方案中，該宿主細(xì) 胞是衣藻屬、杜氏藻屬、柵藻屬或血球藻屬的一個成員，例如萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽 藻、二形柵藻、或雨生血球藻。在另一個實施方案中，該宿主細(xì)胞是一種細(xì)菌或一種酵母。又另一個方法提供了一種用于再利用液體(如水或一種基于水的生長培養(yǎng)基)的 方法，該方法包括使一種無維管的光合生物生長在一個液體環(huán)境中(該無維管的光合生物 包括一種對一個絮凝部分進行編碼的外源核酸)，將該生物與一個第二絮凝部分進行接觸 (該第二絮凝部分直接地或間接地結(jié)合到該第一絮凝部分上，導(dǎo)致該生物的絮凝)，并且將 該液體環(huán)境中至少一部分液體與該生物分離。該第一和第二絮凝部分可以是在此所述的多 個部分中的任何一種，包括但不限于，抗體、碳水化合物結(jié)合蛋白、碳水化合物、重金屬絮凝 劑、化學(xué)絮凝劑、陽離子絮凝劑、以及交配型凝集素。該第二絮凝部分可以被附連到一個第 二生物的表面上，該第二生物可以是或可以不是一種無維管的光合生物，或可以被附連到 一種固體支持物上。又另一個方面提供了一種使一種無維管的光合生物絮凝的方法，包括將該無維管 的光合生物與一個第二生物進行接觸，該第二生物包括一種對一種抗體進行編碼的外源核 酸，該抗體結(jié)合到該無維管的光合生物的表面上的一個抗原上，由此引起絮凝。在一個實施 方案中，該抗體被表達(dá)在該第二生物的表面上。在另一個實施方案中，該抗體是一種單鏈可 變區(qū)片段(scFv)抗體。在又另一個實施方案中，該外源核酸編碼了一種融合或嵌合蛋白， 該融合或嵌合蛋白包括該抗體以及一個錨定組分，該錨定組分將該抗體錨定到該第二生物 的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的外表面上。在一個實施方案中，該第二生物是一種細(xì)菌，而在另一個實 施方案中，該第二生物是一種酵母。該無維管的光合生物可以是一種綠藻，例如衣藻屬、杜 氏藻屬、柵藻屬或血球藻屬的一個成員，并且更具體地萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二 形柵藻、或雨生血球藻。另一個方面提供了一種將一種無維管的光合生物絮凝的方法，該方法包括將該無 維管的光合生物與一個第二生物進行接觸，該第二生物包括一種對一個絮凝部分進行編碼 的外源核酸，該絮凝部分結(jié)合到該無維管的光合生物的一個表面組分上，由此引起該無維 管的光合生物的絮凝。該絮凝部分可以被該第二生物分泌、被表達(dá)在該第二生物的表面上、 或兩者。該第二生物可以是一種酵母、一種細(xì)菌、一種非光合藻類或一種光合藻類。在一些 實施方案中，該第二生物是大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母。該碳水化合物部分可以是下組中 的多個成員中的至少一個成員，該組選自CD_SIGN、Dectin-I、Dectin-2、HECL, Langerin、 Layilin、Mincle、MMGL, E-選擇素、P-選擇素、L-選擇素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受 體、磷脂酶 A2 受體、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、 siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素類。在具 體實施方案中，該碳水化合物結(jié)合蛋白是一種凝集素，例如一種c型凝集素。在在此說明的實施方案中的任何一個中，一種對一個絮凝部分(如一種抗體或一 種碳水化合物結(jié)合蛋白)進行編碼的外源核酸可以進一步包括一個或多個調(diào)節(jié)元件(如一 個啟動子)。啟動子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。誘導(dǎo)型啟動子包括但不限于，光誘導(dǎo)型啟動子、群體敏感型啟動子、溫度敏感型啟動子或氮敏感型啟動子。應(yīng)當(dāng)理解的是，除非另外說明，當(dāng)提及一個絮凝部分在一種生物或固體支持物的 表面上表達(dá)或存在時，這種提及是指該生物或固體支持物的外表面，即該表面面對該有待 絮凝的生物存在其中的環(huán)境。通過引用進行結(jié)合在本說明書中提到的所有公開物、專利、以及專利申請都通過引用以相同程度結(jié) 合在此，如同各個單獨的公開物、專利或?qū)＠暾埗紝ｉT地并且個別地表明要通過引用進
行結(jié)合。附圖簡要說明在所附權(quán)利要求中具體提出了本發(fā)明的新穎的特征。通過參考以下詳細(xì)描述以及 以下附圖將獲得對本發(fā)明特征和優(yōu)點的更好的理解，這些詳細(xì)描述提出了說明性實施方案 (在這些說明性實施方案中使用了本發(fā)明的原理)

圖1展示了本披露中使用的多個構(gòu)建體圖2是一個通過凝集素進行絮凝的流程圖。執(zhí)行Q. C.；執(zhí)行大規(guī)模生長的質(zhì)量控 制，包括生長速率、培養(yǎng)基PH，以及對于菌株污染進行篩選。N ；對于條件令人不滿意來前進 到下一個步驟的替代的工作流程。圖3是一個由一種抗-Fusl抗體誘導(dǎo)的絮凝的流程圖。圖4是一個由!^huA和pb5的表達(dá)誘導(dǎo)的絮凝的流程圖。圖5是一個在基因修飾的萊茵衣藻中由基因誘導(dǎo)的絮凝的流程圖，這些基因是由 氮饑餓來調(diào)節(jié)的。圖6顯示了在大腸桿菌中生產(chǎn)的重組凝集素的活性。A-D是萊茵衣藻，其中A和C 是陰性對照并且B和D是對應(yīng)地存在來自蓋罩大蝸牛(H. pomatia)和滑北螈(T. vulgaris) 的FITC-結(jié)合的凝集素。E-H是二形柵藻，其中E和G是陰性對照并且F和H是對應(yīng)地存在 來自蓋罩大蝸牛OLpomatia)和滑北螈(T. vulgaris)的FITC-結(jié)合的凝集素。圖7顯示將一種LppOmpA-凝集素融合蛋白插入大腸桿菌的細(xì)胞膜中。圖8顯示了 β -自轉(zhuǎn)運蛋白扁豆(L. culinaris)凝集素融合蛋白對二形柵藻的沉 淀的影響。圖9顯示了一種蛋白質(zhì)印跡，該蛋白質(zhì)印跡顯示了將一種Lpp0mpA-SCFv5融合物 正確地插入大腸桿菌的質(zhì)膜中。圖10顯示了在巴斯德畢赤酵母中分泌的凝集素的蛋白質(zhì)印跡。標(biāo)記1 (蓋罩大蝸 牛凝集素)和2(扁豆凝集素)的代表性實例顯示了蛋白分泌到該生長培養(yǎng)基中。圖11顯示了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)這些支架凝集素融合蛋白=(I)Pirlb-蓋罩 大蝸牛凝集素，(^Pirlb-扁豆凝集素，以及C3)Pirla-滑北螈凝集素。圖12顯示了將一種Pirla-凝集素融合蛋白插入巴斯德畢赤酵母的膜中。圖13顯示了 Fasl-凝集素融合物的表達(dá)。條帶1 :Fasl-扁豆凝集素；條帶2 Fasl-截短的扁豆凝集素；條帶3 :Fasl-雞冠刺桐(E. cristagalli)凝集素。圖14顯示了一種蛋白質(zhì)印跡，該蛋白質(zhì)印跡描述了 !^asl-凝集素融合蛋白的亞細(xì) 胞定位。WT :21gr ；對照細(xì)胞質(zhì)酶；1 :Fasl-扁豆凝集素融合物；2 :Fasl-截短的扁豆凝集 素融合物；3 =Fasl-T.雞冠刺桐凝集素融合物。
圖15顯示了 Fasl-滑北螈凝集素融合蛋白構(gòu)建體的存在對沉降的影響。圖16顯示了在萊茵衣藻中全細(xì)胞表達(dá)GPl-凝集素蛋白。1 :GP1_蓋罩大蝸牛凝 集素融合物；2 :GP1-截短的扁豆凝集素融合物。圖17顯示了一種蛋白質(zhì)印跡，該蛋白質(zhì)印跡顯示了 GPl-凝集素融合蛋白的亞細(xì) 胞定位。WT :21gr ；對照細(xì)胞質(zhì)酶；GPl-蓋罩大蝸牛凝集素。圖18顯示了 GPl-蓋罩大蝸牛凝集素構(gòu)建體的存在對沉降的影響。圖19顯示了 一種蛋白質(zhì)印跡，該蛋白質(zhì)印跡顯示了在萊茵衣藻中表達(dá)一種 SCFV5-FaSl融合蛋白。1:該融合蛋白在此顯示。較高的條帶是殘留的與爭光霉素蛋白的 完整融合物。圖20顯示了一種蛋白質(zhì)印跡，該蛋白質(zhì)印跡描述了 i^asl融合蛋白的亞細(xì)胞定位。 WT :21gr ；對照細(xì)胞質(zhì)酶；scFV5-Fasl融合物。存在定位于該膜部分上的scFv5-Fasl蛋 白。(箭頭)。圖21顯示了在萊茵衣藻中N03_誘導(dǎo)表達(dá)蓋罩大蝸牛凝集素。泳道1 時間0，ΤΑΡ ； 泳道2 時間12小時，TAP ；泳道3 時間M小時，TAP ；泳道4 時間12小時，TAP-NH4C1+7. 4mM KNO3 ；泳道 5 時間 24 小時，TAP-NH4Cl+7. 4mM KNO3 泳道 6 對照。圖22顯示了在氮缺乏后兩個萊茵衣藻株的絮凝。圖23顯示了在將氮減少到最小后兩個萊茵衣藻株的絮凝。詳細(xì)說明本披露在此提供了在光合生物中并且具體地在無維管的光合生物(NVPO)中引發(fā) 絮凝的新穎的方法。出于工業(yè)或農(nóng)業(yè)的目的，光合生物、具體地單細(xì)胞的生物如微藻或藍(lán)細(xì) 菌的生長經(jīng)常涉及從液體環(huán)境中收獲這些生物的細(xì)胞。當(dāng)前，許多這種收獲是通過離心、壓 帶機處理、向液體環(huán)境中加入化學(xué)絮凝劑、或多種方法的一些組合來完成的。傳統(tǒng)的絮凝方 法可能導(dǎo)致額外的成本(例如，絮凝劑的成本、從該液體和/或生物中去除絮凝劑的成本、 等)以及其他問題(例如，污染，產(chǎn)品純化、等)。本披露提供了用于使光合生物絮凝的新穎 的組合物、宿主細(xì)胞以及方法，這些新穎的組合物、宿主細(xì)胞以及方法能夠克服傳統(tǒng)的絮凝 方法的缺點。本披露利用了不同分子之間的強的分子相互作用(例如，抗體與抗原、蛋白和碳 水化合物、蛋白-蛋白結(jié)合對、等)。可以使用絮凝對(兩個組分的復(fù)合體)或絮凝復(fù)合體 (多于兩個組分的復(fù)合體)。在一些實例中，一個絮凝對或復(fù)合體的一個成員將被自然地表 達(dá)在將被絮凝的一個生物上，但是生產(chǎn)的水平可以從基因方面被提高。在其他實例中，一個 絮凝對或復(fù)合體的一個成員將被重組地表達(dá)于有待絮凝的一個生物上。然后將該生物與該 第二(和/或隨后的)絮凝部分進行接觸以誘導(dǎo)絮凝。附帶地可以將該第二或隨后的絮凝 部分加入(例如，到一種固相如一種珠粒或篩上)，在一個分離的生物上進行表達(dá)(該生物 與該第一生物可以是相同的或不同的種)然后將該分離的生物與該第一生物進行接觸、或 在相同的生物上進行表達(dá)(例如，在一個可誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件的控制下)。所使用的一種方法涉及基因操作一種光合生物(例如一種NVP0)以表達(dá)一個或多 個絮凝部分。基因操作可以涉及用一種對一個絮凝部分進行編碼的核酸瞬時地或整合地轉(zhuǎn) 化一種光合生物(例如，萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、杜氏鹽藻、二形柵藻、雨生血球藻)或一種 非光合生物(例如大腸桿菌)。在一些實例中，該絮凝部分是一種能夠結(jié)合到另一種蛋白、一種碳水化合物或另一種感興趣的分子上的蛋白。例如，可以用一個對融合到一個抗體上 的一個萊茵衣藻細(xì)胞表面蛋白進行編碼的基因轉(zhuǎn)化萊茵衣藻，從而在該細(xì)胞的表面上抗體 的表達(dá)將引起這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的或任何其他目標(biāo)生物的絮凝。已經(jīng)在萊茵衣藻的葉綠體 中生產(chǎn)了抗體，但是這樣的表達(dá)沒有在該細(xì)胞的表面上產(chǎn)生抗體。參見，例如Mayfield et al. , PNAS 100(2) :438-42 (2003)?？商娲?，該抗體可以被表達(dá)于一種非光合生物的表面 上。在一個實施方案中，該非光合生物是一種原核生物如一種細(xì)菌。在另一個實施方案中， 該非光合生物是一種真核生物，例如一種真菌，并且更具體地一種酵母。然后該非光合生物 的表面上的細(xì)胞表面抗體結(jié)合到多個光合生物上，導(dǎo)致了絮凝。宿主細(xì)胞本披露還考慮了用在此所述的一個或多個核酸轉(zhuǎn)化的一種宿主細(xì)胞。在某些實施 方案中，該宿主細(xì)胞是光合的。在一些情況下，該宿主細(xì)胞是光合的并且無維管的。在其他 情況下，該宿主細(xì)胞是光合的并且有維管的。在又其他情況下，該宿主細(xì)胞是非光合的。該 宿主細(xì)胞可以是真核的或原核的。可以用對一個或多個絮凝部分進行編碼的多個基因轉(zhuǎn)化 一些宿主細(xì)胞。例如，一個單個的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以包含對一個、兩個、三個或更多個蛋白或 其亞基進行編碼的外源核酸。例如，可以用對一種抗體進行編碼的一個基因轉(zhuǎn)化一種藻類 如萊茵衣藻、一種細(xì)菌如大腸桿菌或一種藍(lán)細(xì)菌、或一種酵母如巴斯德畢赤酵母，該抗體識 別該有待絮凝的生物的一種細(xì)胞表面蛋白，其中將該抗體作為一種融合蛋白或以兩個或更 多個內(nèi)部組裝的亞基進行生產(chǎn)。該有待絮凝的生物可以是與表達(dá)該表面蛋白的生物相同或 不同。這些構(gòu)建體可以包含相同基因的多個拷貝、和/或?qū)ο嗤鞍走M行編碼的多個基因、 和/或在該編碼序列的一個或多個部分中具有突變的多個基因。可以用一種在此所述的載體(例如包括一個或多個絮凝部分編碼基因的一種載 體)轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞。該載體可以包含用于轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞的細(xì)胞核或一個葉綠體或其他 質(zhì)體的一個質(zhì)體啟動子或一個核啟動子。該載體還可以編碼一種融合蛋白或試劑，該融合 蛋白或試劑選擇性地將該載體產(chǎn)物靶向到細(xì)胞核或該葉綠體或其他質(zhì)體中。使用本領(lǐng)域中 已知的任何方法，可以發(fā)生一種宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。一個宿主生物是包括一種宿主細(xì)胞的一個生物。在某些實施方案中，該宿主生物 是光合的。一種光合生物是一種生物，該生物是自然地光合的(具有一種質(zhì)體)或該生物 是被基因設(shè)計為或另外地被修飾為是光合的。在一些實例中，可以用一種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化一種 光合生物，該構(gòu)建體使得該光合裝置的全部或部分不可操作。在一些實例中，它是無維管的 并且光合的。該宿主細(xì)胞可以是原核的。本發(fā)明的一些光合原核生物的實例包括但不限于 藍(lán)細(xì)菌(例如藍(lán)藻、集胞藻、節(jié)旋藻(Athrospira))。該宿主生物可以是單細(xì)胞的或多細(xì)胞 的。在幾個實施方案中，該宿主生物是真核的(例如綠藻)。在此考慮的生物的實例包括但 不限于，紅藻門、綠藻門、不等鞭毛門、tribophyta、灰藻門、chlorarachniophytes、裸藻、定 鞭藻門、隱藻、腰鞭毛類、以及浮游植物。在其他實施方案中，該宿主生物是非光合的。非光 合宿主生物包括細(xì)菌和酵母。適合的細(xì)菌宿主生物的實例可以在變形菌門中找到，并且包 括但不限于大腸桿菌。適合的酵母生物的實例可以在子囊菌門中找到，并且包括但不限于 巴斯德畢赤酵母以及釀酒酵母。一個宿主生物可以在允許光合作用的條件下進行生長，然而，這不是一個必要條 件(例如，一個宿主生物可以在無光下進行生長)。在一些實例中，該宿主生物可以以這樣一種方式被基因修飾，即減少和/或破壞光合作用的能力。在生長條件下當(dāng)一個宿主生物 不能光合作用時(例如由于無光和/或基因修飾)，典型地，將向該生物提供必需的營養(yǎng)物 以支持在無光合作用下的生長。例如，可以用任何需要的營養(yǎng)物補充一個生物在其中(或 其上)生長的一種培養(yǎng)基，這些營養(yǎng)物包括一種有機碳源、氮源、磷源、維生素、金屬、脂類、 核酸、微量營養(yǎng)物、或一種生物特異的需要物。有機碳源包括該宿主生物能夠代謝的任何碳 源，包括但不限于，乙酸鹽、簡單的碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖)、復(fù)雜的碳水化合 物(例如淀粉、糖原)、蛋白、以及脂類。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到不是所有的生物 都將能夠充分地代謝一種特定的營養(yǎng)物并且應(yīng)當(dāng)意識到營養(yǎng)物混合物可能需要從一種生 物到另一種生物進行修飾，從而提供適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物混合物。可以將一個宿主生物生長在陸地上，例如在池塘、水渠、垃圾中，或生長在封閉的 或部分封閉的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中。也可以將這些宿主生物直接生長在水中(例如洋、海、 湖、河、水庫、等)。在藻類被大量培養(yǎng)的實施方案中，可以將該藻類生長在高密度光生物反 應(yīng)器中。大量培養(yǎng)藻類的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如可以將藻類生長在高密度光生物 反應(yīng)器中(參見，例如 Lee et al, Biotech. Bioengineering 44 :1161-1167,1994)以及其 他生物反應(yīng)器(例如用于污水和廢水處理的那些)中(例如Sawayama et al,Appl. Micro. Biotech. ,41 :729-731,1994)。此外，可以將藻類大量培養(yǎng)以去除重金屬(例如Wilkinson， Biotech. Letters, 11 :861-864,1989)、氫(例如美國專利申請
發(fā)明者C·貝恩克, M·門德斯, P·李, Y·潘 申請人:藍(lán)寶石能源公司