專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)在低pH下發(fā)酵生產(chǎn)二羧酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)二羧酸的方法。本發(fā)明特別涉及通過(guò)酵母的發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)二羧酸。
背景技術(shù)：
二羧酸(例如延胡索酸和琥珀酸)是重要的化合物，其在食品工業(yè)中用于食物 制備和防腐，在醫(yī)藥工業(yè)中用于配制藥物制品，以及用于其他工業(yè)用途，例如(生物)聚 合物的單體。為了滿(mǎn)足對(duì)二羧酸的日益增加的需要，正在開(kāi)發(fā)更高效和更具成本效益的 生產(chǎn)方法。傳統(tǒng)上通過(guò)發(fā)酵能夠生產(chǎn)大量二羧酸的細(xì)菌來(lái)制造二羧酸。這例如描述于US 5，573，931中，其中描述了通過(guò)使用細(xì)菌菌株生產(chǎn)高濃度的琥珀酸的方法。然而，與用細(xì)菌 生產(chǎn)二羧酸的用途相關(guān)的一個(gè)主要的缺點(diǎn)是二羧酸鹽的形成。如果使用細(xì)菌，則發(fā)酵期間 的PH需要被維持在pH 6-7的范圍內(nèi)，這高于所有二羧酸的pKa值。因此，大部分酸將以其 鹽的形式被生產(chǎn)，這些鹽必須被轉(zhuǎn)化成酸。在大規(guī)模生產(chǎn)方法中這不實(shí)用不高效，并且提高 生產(chǎn)成本。此外，并非細(xì)菌的微生物也已被用于生產(chǎn)有機(jī)酸。EP 0 424 384公開(kāi)了在含有 碳酸鈣的培養(yǎng)基中通過(guò)Miizopus生產(chǎn)有機(jī)酸的需氧方法。EP 1 183 385公開(kāi)了經(jīng)遺傳操 縱的酵母細(xì)胞，所述酵母細(xì)胞具有Crabtree陰性表型并且含有用于生產(chǎn)乳酸的外源核酸 分子。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)二羧酸的方法。所述方法包括在低于二羧酸PKa的pH值下， 在存在含碳水化合物的底物和少量氧時(shí)發(fā)酵酵母。本發(fā)明的方法提供了二羧酸產(chǎn)物的高產(chǎn) 率，允許更簡(jiǎn)單的下游加工，并且比現(xiàn)有方法更具成本效益，現(xiàn)有方法中生產(chǎn)的是鹽，其必 須隨后被轉(zhuǎn)化成酸。因?yàn)槎人峋哂卸嘤谝粋€(gè)的PKa值，所以pH應(yīng)當(dāng)?shù)陀诙人岬淖畹?PKa0對(duì)大部分酸而言，pH應(yīng)典型地在pH 1. 0到pH 5. 5的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在pH 2. 0和pH 4.0之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，在3.0的pH值下生產(chǎn)琥珀酸。另一優(yōu)點(diǎn)是由于pH低，所以 污染的風(fēng)險(xiǎn)被降低。酸生產(chǎn)階段之前優(yōu)選是針對(duì)最優(yōu)生物質(zhì)生產(chǎn)的生物質(zhì)形成階段。在生物質(zhì)形成階 段中，PH在pH 2到pH 7的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，pH在pH 3到pH 6的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，pH在 pH 4到pH 5的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的方法更具成本效益，并可導(dǎo)致低30%的成本價(jià)格。原因之一是滴定 劑成本被顯著降低。本發(fā)明的方法可被用于生產(chǎn)任何二羧酸。合適的例子包括己二酸、延胡索酸、衣康 酸(itaconic acid)、琥珀酸、蘋(píng)果酸、草酸。優(yōu)選地，二羧酸是琥珀酸、延胡索酸或蘋(píng)果酸。在本發(fā)明方法中使用的酵母可以是任何合適的酵母。酵母的合適例子包括 Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia 禾口 Yarrowia， 例如 Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyvermoces lactis、 Candida sonorensis、Pichia stipidis 禾口 Yarrowia lipolytica 的物禾中。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明方法中使用的真核微生物是Saccharomyces cerevisiae——一種廣泛使用的 工業(yè)上感興趣的微生物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的酵母是經(jīng)遺傳修飾的酵母。在本文中使 用時(shí)，在根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母被定義為下述酵母細(xì)胞，其含有所述酵母 細(xì)胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽，或者經(jīng)所述酵母細(xì)胞中天然不存在的核苷酸序列 或多肽轉(zhuǎn)化或遺傳修飾過(guò)，或者其含有內(nèi)源核酸序列的額外的一個(gè)或多個(gè)拷貝。野生型酵 母細(xì)胞在本文中被定義為重組細(xì)胞的親本細(xì)胞。 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的酵母是經(jīng)遺傳修飾的酵母，其包含編碼選自下組 的異源酶的核苷酸序列，所述組由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸還原酶和延胡索酸 酶組成。異源酶的優(yōu)選的實(shí)施方案如下文定義。當(dāng)用于指出給定的(重組)核酸或多肽分子與給定的宿主生物或宿主細(xì)胞之間的 關(guān)系時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同源的”應(yīng)當(dāng)被理解為表示該核酸或多肽分子天然地由相同物種、優(yōu)選地相 同品種或株系的宿主細(xì)胞或生物生產(chǎn)。在關(guān)于核酸(DNA或RNA)或蛋白質(zhì)的方面，使用術(shù)語(yǔ)“異源的”表示下述核酸或蛋 白質(zhì)，其不作為其存在的生物、細(xì)胞、基因組或DNA或RNA序列的部分天然存在，或其被發(fā)現(xiàn) 于與其天然被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞或基因組或DNA或RNA序列中的位點(diǎn)不同的細(xì)胞或位點(diǎn)。異源核 酸或蛋白質(zhì)對(duì)其被引入的細(xì)胞而言不是內(nèi)源的，而是得自另一細(xì)胞或是以合成方式或重組 方式生產(chǎn)的。優(yōu)選地，經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。PEP 羧激酶(EC 4. 1. 1. 49)優(yōu)選地是異源酶，優(yōu)選地源于細(xì)菌，更優(yōu)選地具有PEP羧激酶活性的 酶源于 Escherichia coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或 Anaerobiospirillum sp.，更優(yōu)選地，Mannheimia succiniciproducens 或 Actinobacillus succinogenes。在一 個(gè)實(shí)施方案中，PEP羧激酶源于A(yíng)ctinobaciIlus succinogenes (PCKa)，其中PCKa優(yōu)選地已 被修飾為在第120-122位上用DAF氨基酸序列代替EGY。優(yōu)選地，用與SEQ ID NO 6的氨 基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列同一性的PEP羧激酶對(duì)根據(jù) 本發(fā)明的酵母細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼 延胡索酸還原酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，延胡索酸還原酶是異源酶，優(yōu)選地是NAD(H)-依 賴(lài)型延胡索酸還原酶，其可源于任何合適的來(lái)源，例如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或植物。優(yōu)選 地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的酵母包含異源的NAD(H)-依賴(lài)型延胡索酸還原酶，優(yōu)選地源 于Trypanosoma sp.，例如源于Trypanosoma brucei。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼 NAD (H)-依賴(lài)型延胡索酸還原酶的核苷酸序列在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。在編碼NAD (H)-依賴(lài)型 延胡索酸還原酶的核苷酸序列包含過(guò)氧化物酶體或線(xiàn)粒體靶向信號(hào)的情況下，可能必須修 飾或缺失大量氨基酸(和編碼核苷酸序列中相應(yīng)的核苷酸序列)，從而阻止酶的過(guò)氧化物 酶體或線(xiàn)粒體靶向。過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)的存在可例如通過(guò)SchKiteret al，Nucleic acid Research 2007，35，D815-D822所公開(kāi)的方法來(lái)確定。優(yōu)選地，用與SEQ ID NO :7具 有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列同一性的NAD (H)-依賴(lài)型延胡索酸還原 酶來(lái)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼延 胡索酸酶的核苷酸序列，所述延胡索酸酶可以是異源或同源的酶。編碼異源延胡索酸酶 的核苷酸序列可以源于任何合適的來(lái)源，優(yōu)選地來(lái)自微生物來(lái)源，優(yōu)選地來(lái)自酵母，例如Saccharomyces cerevisiae,或來(lái)自絲狀真菌，例如Rhizopus oryzae。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明 方法中的酵母過(guò)表達(dá)編碼與SEQ ID N0:8的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、 92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%的序列同一性的延胡索酸酶的核苷酸序 列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母還包含編碼 蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的核苷酸序列，所述蘋(píng)果酸脫氫酶在所述核苷酸序列表達(dá)后在胞質(zhì)溶 膠中有活性。優(yōu)選地，MDH缺乏過(guò)氧化物酶體或線(xiàn)粒體靶向信號(hào)，以將酶定位于胞質(zhì)溶膠 中。胞質(zhì)溶膠MDH可以是任何合適的同源或異源蘋(píng)果酸脫氫酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵 母細(xì)胞包含編碼下述蘋(píng)果酸脫氫酶的核苷酸序列，所述蘋(píng)果酸脫氫酶與SEQ ID N0:9的氨 基酸序列具有至少 70%，優(yōu)選地至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%的序列同一性。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白(優(yōu)選地，蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MAE))的核苷酸序列。二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是同源或異源 的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是異源的蛋白質(zhì)。二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可源于任何合適的生 物，優(yōu)選地源Pombe0優(yōu)選地，二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是下述蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白(MAE)，所述蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQ ID NO :10具有至少80%、85%、90%、95%或99% 或100%的序列同一性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的酵母是包含異源PEP-羧激酶、異源NAD(P) H-依賴(lài)型延胡索酸還原酶、異源延胡索酸酶、異源蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和胞質(zhì)溶膠蘋(píng)果酸脫氫 酶的經(jīng)遺傳修飾的酵母。這些酶的優(yōu)選的實(shí)施方案如本文上文中定義。序列同一性在本文中被定義為通過(guò)比較序列測(cè)定的兩條或更多條氨基酸(多肽 或蛋白質(zhì))序列或兩條或更多條核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系。通常，在被比較的序 列的整個(gè)長(zhǎng)度上比較序列同一性或相似性。在本領(lǐng)域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序 列之間的序列相關(guān)度，這根據(jù)情況通過(guò)這類(lèi)序列串之間的匹配測(cè)定。測(cè)定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計(jì)為在測(cè)試的序列之間給予最大匹配。測(cè)定同一性和 相似性的方法被編碼于公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。測(cè)定兩條序列之間同一性和相似性的 優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括BLASTP和BLASTN，公眾可從NCBI和其它來(lái)源(BLAST Manual, Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)獲得。使用 BLASTP 的氨基酸序列比 較的優(yōu)選參數(shù)為缺口開(kāi)放11. 0，缺口延伸1，Blosum 62矩陣。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸多聚體，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知類(lèi)似物，因 為它們能夠以類(lèi)似于天然存在的核苷酸的方式與單鏈核酸雜交(例如肽核酸)。多核苷酸 可以是天然或異源的結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的全長(zhǎng)或亞序列。除非另有說(shuō)明，該術(shù)語(yǔ)包括特 定的序列及其互補(bǔ)序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中的酵母過(guò)表達(dá)編碼本文上文定義 的任何酶的核苷酸序列。本領(lǐng)域可獲得多種手段用于在本發(fā)明方法中在酵母中過(guò)量表達(dá)編 碼酶的核苷酸序列。具體地，可以通過(guò)提高細(xì)胞中編碼酶的基因的拷貝數(shù)，例如通過(guò)在細(xì)胞 的基因組中整合額外的基因拷貝，通過(guò)表達(dá)來(lái)自著絲粒載體、來(lái)自附加體多拷貝表達(dá)載體 的基因，或者通過(guò)引入包含多拷貝基因的(附加體)表達(dá)載體，來(lái)過(guò)量表達(dá)編碼酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，用(強(qiáng))組成型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的酶的過(guò)量表達(dá)。含碳水化合物的底物可以是任何含碳水化合物的底物，包括糖蜜(molasse)，甘蔗 汁，戊糖和己糖，例如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖。優(yōu)選地，含碳水化合物的底物是含葡萄 糖的底物，如麥芽糖、蔗糖、葡萄糖或葡萄糖漿。含碳水化合物的底物的碳水化合物含量以 干物質(zhì)含量為基礎(chǔ)優(yōu)選地多于50 % w/w,更優(yōu)選地多于55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 % w/w，最優(yōu)選地多于 85%、90%、95%或 99% w/w。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選地包括在碳(C)-受限的條件下發(fā)酵酵母。C-受限的條件 在本文中被定義為溶解的碳水化合物的濃度低于lg/Ι，優(yōu)選地低于0. 9g/l、0. 8g/l或低于 0. 5g/l溶解的碳水化合物。發(fā)現(xiàn)在C-受限的條件下發(fā)酵酵母導(dǎo)致與非C-受限的條件相比 提高的琥珀酸產(chǎn)率。用于發(fā)酵的氧可以以任何合適的形式供應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧以空氣的形式 供應(yīng)。氧應(yīng)當(dāng)小量供應(yīng)。這反映于酵母的氧吸收速率(OUR)和/或氧吸收比速率(q02)中。 本發(fā)明中的OUR低于約8. Ommol氧/L/小時(shí)，優(yōu)選地低于約5. 0、4. 0、3. 0或2. Ommol氧/L/ 小時(shí)，更優(yōu)選地低于約1. 0或0. 5mmol氧/L/小時(shí)，優(yōu)選地高于0. Olmmol氧/L/小時(shí)。本發(fā)明方法中的氧吸收比速率(q02)范圍在Smmol氧/g生物質(zhì)干重/小時(shí)到 0. 5mmol氧/g生物質(zhì)干重/小時(shí)之間，優(yōu)選地在5、4、3或2mmol氧/g生物質(zhì)/小時(shí)到約 0. 4,0. 3或0. 2mmol/氧/g生物質(zhì)/小時(shí)之間。根據(jù)本發(fā)明的方法可以以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)模式進(jìn)行。這些發(fā)酵模式是本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的。取決于發(fā)酵模式，發(fā)酵期間的生物質(zhì)濃度可在發(fā)酵期間或多或少地變 化。在分批和補(bǔ)料分批模式中，生物質(zhì)濃度通常提高。因此，在分批和補(bǔ)料分批模式中，氧 吸收比速率通常降低。本發(fā)明方法的溫度典型地在10°C和40V之間，優(yōu)選地在20V和35°C之間，更優(yōu)選 地在30°C和35°C之間。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，除了含碳水化合物的底物之外還存在額外 的電子供體。額外的電子供體優(yōu)選地是有機(jī)電子供體。有機(jī)電子供體的合適例子包括甘油、 甲酸鹽/酯和多元醇例如甘露醇、山梨醇和木糖醇。


圖1.應(yīng)用的OUR對(duì)pH 3下進(jìn)行90小時(shí)后的琥珀酸生產(chǎn)的影響。實(shí)施例1. Μχ . Saccharomyces cerevisiae ^/^ ! 1. 1.構(gòu)建酵母菌株1. 1. 1.構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體對(duì)S. cerevisiae表達(dá)載體pRS414(Sirkoski R. S. and Hieter P,Genetics, 1989, 122(1) :19-27)進(jìn)行BamHI/NotI限制性消化，隨后在該載體中連接由磷酸烯醇式丙酮酸羧 激酶(來(lái)源Actinobacillus succinogenes)合成基因構(gòu)建體(SEQ ID NO :1)構(gòu)成的BamHI/ NotI限制性消化片段之后，制造了表達(dá)構(gòu)建體PGBS414PPK-3。使用連接混合物轉(zhuǎn)化E. coli T0P10 (Invitrogen)，得到酵母表達(dá)構(gòu)建體pGBS414PPK_l。隨后用AscI和NotI限制性消化 PGBK414PPK-1。為 了制造 pGBS414PPK_3，將由來(lái)自 T. brucei (FRDg)合成基因構(gòu)建體(SEQID NO 2)的酵解酶體延胡索酸還原酶構(gòu)成的AscI/NotI限制性消化片段連接進(jìn)經(jīng)限制性 消化的PGBS414PPK-1載體中。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化E. coli T0P10 (Invitrogen)，得到酵 母表達(dá)構(gòu)建體PGBS414PPK-3。對(duì)S. cerevisiae表達(dá)載體pRS415(Sirkoski R. S. and Hieter P,Genetics, 1989, 122(1) :19-27)進(jìn)行BamHI/NotI限制性消化，隨后在該載體中連接由延胡索酸酶(來(lái)源 Rhizopus oryzae)合成基因構(gòu)建體(SEQ ID NO 3)構(gòu)成的BamHI/NotI限制性消化片段之 后，制造了表達(dá)構(gòu)建體PGBS415FUM-3。使用連接混合物轉(zhuǎn)化E. coli T0P10 (Invitrogen)， 得到酵母表達(dá)構(gòu)建體PGBS415FUM-1。隨后用AscI和NotI限制性消化pGBK415FUM_l。為 了制造 PGBS415FUM-3，將由來(lái)自 S. cerevisiae (MDH3)合成基因構(gòu)建體(SEQ ID NO 4) 的過(guò)氧化物酶體蘋(píng)果酸脫氫酶構(gòu)成的AscI/NotI限制性消化片段連接進(jìn)經(jīng)限制性消化的 PGBS415FUM-1載體中。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化E. coli T0P10 (Invitrogen)，得到酵母表達(dá) 構(gòu)建體 PGBS415FUM-3。對(duì) S. cerevisiae 表達(dá)載體 pRS416 (Sirkoski R. S. and Hieter P, Genetics, 1989,122(1) :19-27)進(jìn)行BamHI/NotI限制性消化，隨后在該載體中連接由 Schizosaccharomyces pombe蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成基因構(gòu)建體(SEQ ID N0:5)構(gòu)成的 BamHI/NotI限制性消化片段之后，制造了表達(dá)構(gòu)建體pGBS416MAE_l。使用連接混合物轉(zhuǎn)化 E. coli TOPlO(Invitrogen)，得到酵母表達(dá)構(gòu)建體 pGBS416MAE_l。1. 1. 2.構(gòu)建 S. cerevisiae 菌株通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pGBS414PPK-3、pGBS415FUM_3 和 pGBS416MAE_l (在 1. 1.下 描述)轉(zhuǎn)化進(jìn) S. cerevisiae 菌株 RWB064(MATA ura3_52 leu2_112 trpl-289 adhl: :lox adh2: : Iox gpdl: : Kanlox)中，制造過(guò)表達(dá) PCKa、MDH3、FUMR、FRDg 禾口 SpMAEI 的菌株 SUC-200。根據(jù)W02008/000632，針對(duì)在S. cerevisiae中的表達(dá)對(duì)所有基因都進(jìn)行了密碼子 對(duì)優(yōu)化。1. 2.在低pH和氧受限條件下的S. cerevisiae琥珀酸生產(chǎn)在30°C和220rpm下，在搖瓶Qx300ml)中將酵母菌株SUC-200 (過(guò)表達(dá)PCKa、 MDH3、FUMR、FRDg和 SpMAEI 的 MATA ura3-52 leu2_112 trpl-289 adhl:Iox adh2::lox gpdl: :Kanlox)培養(yǎng) 3 天。培養(yǎng)基以 Verduyn (Verduyn et. al. , 1992, Yeast 8,501-517)為 基礎(chǔ)，但是如表1中所示對(duì)碳源和碳源進(jìn)行了改動(dòng)。表1.預(yù)培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基組成
化合物濃度(g/1)C6H12O6 · H2O20. 0(NH2)2CO2. 3KH2PO43. 0MgSO4 · 7H200. 5
a維生素溶液
權(quán)利要求
1.用于制備二羧酸的方法，所述方法包括在低于有機(jī)酸最低PKa的pH值下，在存在含 碳水化合物的底物和少量氧時(shí)發(fā)酵酵母。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述二羧酸是延胡索酸、蘋(píng)果酸或琥珀酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述pH在pH1.0到pH 5. 5的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中所述氧以低于約Smmol氧/L/小時(shí)的氧 吸收速率被供應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中所述氧以8到0.5mmol/g生物質(zhì)干重/ 小時(shí)之間的范圍內(nèi)的氧吸收比速率被供應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，所述方法包括在碳受限的條件下發(fā)酵酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，所述方法在存在額外的電子供體時(shí)進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法，其中所述酵母是&iccharomycesCerevisiae0
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述酵母是經(jīng)遺傳修飾的酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼選自下組的異源酶 的核苷酸序列，所述組由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸還原酶和延胡索酸酶組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)二羧酸的方法。所述方法包括在下述pH下在存在含碳水化合物的底物和少量氧時(shí)發(fā)酵酵母，所述pH下二羧酸中的至少50％是酸性形式。本發(fā)明的方法提供了二羧酸產(chǎn)物的高產(chǎn)率并且比現(xiàn)有的方法更具成本效益，現(xiàn)有方法中生產(chǎn)的鹽在回收期間必須被轉(zhuǎn)化成酸。本發(fā)明的方法還導(dǎo)致更簡(jiǎn)單和更便利的下游加工。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102089436SQ200980126943
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者瑞內(nèi)·維爾瓦爾, 米克爾·萊納德斯·奧古斯特·詹森 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司