專(zhuān)利名稱(chēng)：新的益生長(zhǎng)雙歧桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)益生抗炎菌株，其用于預(yù) 防、減輕或治療疾病以及用于制備人類(lèi)或?qū)櫸锸称返挠猛?，或藥物組合物。此外，本發(fā)明涉 及由所述菌株獲得的細(xì)菌多糖、其用于治療疾病的用途、以及包含該多糖的藥物組合物。
背景技術(shù)：
乳酸菌已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間知曉發(fā)酵糖產(chǎn)生酸尤其是主要的新陳代謝組分乳酸的細(xì)菌。此類(lèi)細(xì)菌 可以在牛奶或乳品、活著的或腐敗植物中發(fā)現(xiàn)，也可以在人類(lèi)和動(dòng)物腸道中發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)上， 這類(lèi)細(xì)菌被稱(chēng)為“乳酸菌”。乳酸菌指發(fā)酵糖產(chǎn)生酸(包括乳酸)的革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)運(yùn)動(dòng)微 需氧或厭氧細(xì)菌的相當(dāng)異種的一類(lèi)，乳酸菌包括，例如，雙歧桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、 乳球菌屬、明串珠菌屬和片球菌屬。幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，乳酸菌已用于制備食品和飼料產(chǎn)品，包括大部分乳制品，現(xiàn)在，乳 酸菌在制備所有發(fā)酵乳品例如酸奶、發(fā)酵全脂牛奶、乳凍食品(junket)、乳酪和黃油中是必 不可少的。大量記載各種乳酸菌有益影響人類(lèi)和/或動(dòng)物健康的報(bào)道的發(fā)表吸引了對(duì)這類(lèi) 細(xì)菌進(jìn)一步的興趣。尤其是，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的特定菌株能夠在腸粘膜集群，并 輔助維持宿主健康。這類(lèi)細(xì)菌通常被稱(chēng)為益生菌或益生菌劑。益生菌益生微生物已經(jīng)被定義為“在足量施用時(shí)賦予宿主健康益處的活的微生物”(FAO/ WHO 2002)。盡管已經(jīng)鑒別很多益生菌(尤其是乳桿菌屬或雙歧桿菌屬菌株)，然而大量的研 究也表明參考其系統(tǒng)分類(lèi)并不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)益生菌。而相反地，每一菌株應(yīng)當(dāng)分別評(píng)價(jià)。研 究也表明即使是密切相關(guān)的益生菌也可能對(duì)健康產(chǎn)生相當(dāng)不同的影響。然而，清楚的是，大部分鑒別的益生菌除了其健康有益效果之外，具有一些額外的 特征。抗膽汁酸通常認(rèn)為，益生菌劑發(fā)揮其對(duì)腸道上皮的有益效果的先決條件是足量的活益生菌 存在。進(jìn)入腸上部后，益生菌接觸高水平的膽汁鹽。因此，最重要的是益生菌抗膽汁酸。腸屏障功能腸屏障功能在粘膜與外界的交界處調(diào)節(jié)運(yùn)輸和宿主防御機(jī)制。細(xì)胞間和旁細(xì)胞流 受到膜泵、離子通道和緊密聯(lián)結(jié)的嚴(yán)密調(diào)控，調(diào)節(jié)滲透性至生理需求。任何水平的干擾、特 別是由于增加滲透性引起的細(xì)菌易位和由于受損上皮細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用引起的口腔 耐受性破壞，可以導(dǎo)致炎癥和組織損傷。上皮屏障抑制諸如LPS及其他炎性化合物的高分子量物質(zhì)從腸腔側(cè)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。
緊密聯(lián)結(jié)引起該上皮屏障的功能之一。緊密聯(lián)結(jié)或閉合帶是膜連接在一起形成對(duì) 液體實(shí)質(zhì)上的非滲透屏障的兩個(gè)上皮細(xì)胞的緊密結(jié)合區(qū)域，其將血管系統(tǒng)與消化道腔相分 離。因此，已經(jīng)證明，降低所述緊密聯(lián)結(jié)屏障功能導(dǎo)致不需要的物質(zhì)諸如LPS由腸腔進(jìn)入循 環(huán)系統(tǒng)的侵入增加。相反地，預(yù)期誘導(dǎo)緊密聯(lián)結(jié)屏障功能引起不需要的物質(zhì)諸如LPS的侵 入減少。胞外多糖和生物膜形成盡管存活對(duì)于粘附和集群能力(即生物膜形成)是重要的，但是它也被認(rèn)為是益 生菌發(fā)揮它的有益效果所需的一個(gè)重要的促成因素，無(wú)論它是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、病原體排除 或與粘膜的接觸增強(qiáng)(1)。很多細(xì)菌在生物膜發(fā)生中的重要特征是粘液樣物質(zhì)，已知為胞外多糖(EPQ或胞 外基質(zhì)。胞外多糖是包括乳桿菌屬和雙歧桿菌的很多細(xì)菌表面上存在的胞外聚合物O)。 EPS形成粘液層，其松弛地附著于細(xì)胞表面或分泌到環(huán)境中(3)。通過(guò)比較非EPS產(chǎn)生菌和EPS產(chǎn)生菌等基因變體研究了這些分子的生理功能。表 明細(xì)胞結(jié)合EPS保護(hù)細(xì)菌抵御噬菌體和細(xì)胞壁降解酶⑷。最近，Mao等人發(fā)現(xiàn)，由大腸桿 菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖增強(qiáng)該菌在模擬胃腸流體中的存活(5)。這些發(fā)現(xiàn)表明，某些細(xì)菌產(chǎn) 生的胞外多糖事實(shí)上可能對(duì)于它們?cè)谀c中生存是必不可少的?？捎糜谌闃I(yè)制備諸如酸奶的發(fā)酵乳品的菌株很重要的技術(shù)特征是其在發(fā)酵乳品 的流變學(xué)和質(zhì)地改善中的用途(30)。在很大程度上菌株的結(jié)構(gòu)特征與EPS的產(chǎn)生相關(guān) (30)。盡管這是重要的技術(shù)特征，EPS很可能由于其特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)接受者產(chǎn)生有益的 健康效果。已經(jīng)顯示，乳酸菌所產(chǎn)生的一些種類(lèi)的EPS對(duì)于人類(lèi)健康具有有益效果，例如降 低膽固醇的能力(6)、免疫調(diào)節(jié)活性(7 ;8)、對(duì)胃腸粘液的微生物粘附(9;10)、抗氧化劑和 自由基清除活性(11)以及益生(雙歧(bifidogenic))作用(12)。近來(lái)，已經(jīng)表明，產(chǎn)生高水平EPS的德氏乳桿菌(LactcAacillus delbrueckii)顯 著降低結(jié)腸炎的鼠模型中炎癥的嚴(yán)重性(1 。因此，看起來(lái)清楚的是高產(chǎn)量特定EPS可能 與益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。涉及腸微生物群的胃腸并發(fā)癥炎癥是先天免疫系統(tǒng)的復(fù)雜反應(yīng)，涉及在侵染、毒素暴露或細(xì)胞傷害位點(diǎn)處的白 細(xì)胞和血漿蛋白質(zhì)的累積和活化。盡管炎癥在控制感染和促進(jìn)組織修復(fù)中起到防護(hù)功能， 其也會(huì)引起組織損傷和疾病。胃腸機(jī)能紊亂諸如炎癥性腸病(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎和 過(guò)敏性腸綜合征是自發(fā)性炎癥。涉及胃腸炎癥的其它疾病為隱窩炎、食物過(guò)敏、和食物過(guò)敏 引起的異位性皮炎(14-16)?？肆_恩病和潰瘍性結(jié)腸炎在北歐、英國(guó)和北美洲最為流行，其中每100，000達(dá)500 人受影響。雖然這些疾病具有不同的病因?qū)W，但均涉及機(jī)能紊亂的粘膜免疫系統(tǒng)對(duì)土著菌 群及其他腔抗原的不當(dāng)響應(yīng)(6)。這些紊亂的急性治療依賴(lài)于抗生素和抗炎藥，而在嚴(yán)重病 例中，手術(shù)則是必要的。長(zhǎng)期的治療包括生活方式改變、飲食調(diào)整和停止吸煙(7)。已經(jīng)表 明益生菌通過(guò)對(duì)胃腸上皮和粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮正效應(yīng)而延長(zhǎng)免于這些病癥(8)。過(guò)敏性腸綜合征(IBS)影響7-31%的已經(jīng)克服由于沙門(mén)氏菌屬、彎曲桿菌屬或志 賀氏菌屬感染導(dǎo)致的感染性胃腸炎患者。具有腹瀉但不具有感染性起始的IBS可以在經(jīng)歷
4“不利”生活事件的個(gè)體中發(fā)生(17)。盡管臨床試驗(yàn)表明在IBS中益生菌的效力變化大，但 是雙盲安慰劑對(duì)照研究已經(jīng)表明，某些益生菌的混合物可對(duì)IBS具有有益效果(18-20)，因 此突出了識(shí)別新的益生菌的重要性。益生菌劑的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)已經(jīng)表明，益生菌具有減輕具有胃腸炎性并發(fā)癥如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎的患 者癥狀的能力01;22)。具體地說(shuō)，雙歧桿菌已經(jīng)被描述為在胃腸疾病的預(yù)防和治療中具 有潛力的益生菌，如 EP 1 688481、EP 0 199535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903 和 WO 00/53200 所述。EP 0 768 375 (Nestle SA)描述了雙歧桿菌屬的具體菌株，其能夠埋入腸內(nèi)菌叢 并能夠競(jìng)爭(zhēng)性地排除病原菌粘著至腸細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，這些雙歧桿菌幫助免疫調(diào)節(jié)并因此幫 助個(gè)體健康的維持。雙歧桿菌的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)甚至可賦予未出生的兒童。WO 01/97822例 如描述了通過(guò)母親攝入動(dòng)物雙歧桿菌屬(Bifidobacterium animal is)菌株BB-12 ,減少 了兒童中特應(yīng)性疾病的發(fā)生。此外，WO 03/099037 (Nestec SA)描述了動(dòng)物雙歧桿菌屬菌 株BB-12 能夠有利地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。盡管已經(jīng)描述了相當(dāng)多的具有抗炎性質(zhì)的雙歧桿菌屬菌株，但只有少數(shù)菌株已經(jīng) 被報(bào)道在體內(nèi)有效治療實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的腸炎。W004052462A1 (B. Pot, Danisco A/S)描述了某些兩歧雙歧桿菌和乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)菌株能夠在結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)鼠模型中減少炎癥的嚴(yán)重性。W02007/09369A1 (Nestec SA)描述了長(zhǎng)雙歧桿菌菌株 BL999 (ATCCBAA-999)在結(jié) 腸炎的實(shí)驗(yàn)鼠模型中減少炎癥的嚴(yán)重性。EP 1688481 和EP 1141235B(University College of Cork)描述了嬰兒長(zhǎng)雙歧桿 菌菌株UCC356M在結(jié)腸炎的鼠模型中減少炎癥的嚴(yán)重性。Foligne等Q007)描述了在結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)鼠模型中減少炎癥嚴(yán)重性的三種雙歧 桿菌。然而，這些文件對(duì)于EPS產(chǎn)生、菌株的EPS組成、緊密聯(lián)結(jié)的強(qiáng)度都并未描述，并 且，除了 EP1688481之外，對(duì)于雙歧桿菌屬菌株的膽汁酸抗性也沒(méi)有描述。由于即使是密切相關(guān)的益生菌也對(duì)健康產(chǎn)生頗為不同而特定的效應(yīng)，因此對(duì)新的 益生菌存在持續(xù)的需求，包括能夠調(diào)理炎性腸疾病、抗膽汁酸和由于高水平的EPS而能夠 集群于腸的新的抗炎雙歧桿菌屬菌株。發(fā)明概述本發(fā)明出乎意料地發(fā)現(xiàn)特定長(zhǎng)雙歧桿菌菌株綜合了膽汁抗性、改善腸屏障功能 和體內(nèi)大量產(chǎn)生具有優(yōu)異抗炎性的胞外多糖這些重要的益生特征。特別地，本發(fā)明人出乎意料地鑒別了長(zhǎng)雙歧桿菌的一個(gè)特定益生菌株，即長(zhǎng)雙歧 桿菌DSM 21062，其綜合了所有上述重要的益生特征。預(yù)期直接來(lái)源于該益生菌的菌株很可能保持其益生特征。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及長(zhǎng)雙歧桿菌細(xì)菌細(xì)胞的菌株，其可用于益生菌劑， 耐受膽汁鹽，產(chǎn)生高量的胞外多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模 型中具有抗炎效應(yīng)，其特征在于所述菌株為登記號(hào)DSM 21062的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株或其突變 株，其中所述突變株通過(guò)使用保藏菌株作為起始材料獲得，并且其中所述突變株具有保留的或進(jìn)一步改善的表征DSM 21062的抗炎效應(yīng)、膽汁耐受性和/或EPS表達(dá)。如在實(shí)施例中表明，長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062菌株在體內(nèi)具有一些非凡的免疫調(diào)節(jié) 性能，表明其可以有效防御多種疾病。因此，在第二方面，本發(fā)明涉及包含長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062細(xì)菌細(xì)胞或其突變株的組合物用于制備藥物的用途。特別地，所述菌株可用于制備治療哺乳動(dòng)物胃腸道炎性病癥的藥物。許多益生菌劑用于制備食品或飼料產(chǎn)品；因此，本發(fā)明的另一重要方面是提供包 含長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062或其突變株的人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锝M合物。當(dāng)制備所述食品或飼料產(chǎn)品時(shí)，制造商通常使用用于加工食品和飼料產(chǎn)品的所謂 的起子培養(yǎng)物。起子培養(yǎng)物廣泛用于乳品業(yè)。一般地，起子培養(yǎng)物給予各種食品或飼料產(chǎn) 品特定的特征。沿用已久的事實(shí)是稠度、質(zhì)地、主體和口感與用于制備所述食品或飼料的起 子培養(yǎng)物的EPS產(chǎn)生強(qiáng)烈地相關(guān)。因此，本發(fā)明的另一方面是包含長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062 或其突變株的起子培養(yǎng)物組合物，優(yōu)選地其中所述起子培養(yǎng)物組合物具有以下濃度的活細(xì) 胞，所述濃度的范圍為每克所述組合物IO4至1012CFU。本發(fā)明也設(shè)計(jì)一種制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，所述方法包括向食品或飼料產(chǎn) 品起始材料添加包含長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062或其突變株的起子培養(yǎng)物組合物，并將由此接 種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活躍的條件下。由實(shí)施例可見(jiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062不僅產(chǎn)生高量的胞外多糖，也產(chǎn)生相當(dāng)不 常見(jiàn)類(lèi)型的EPS，該EPS通常富含甘露糖和葡萄糖殘基。眾所周知，一些類(lèi)型的EPS涉及對(duì)人類(lèi)健康的特定效應(yīng)(6)、(9 ； 10)、(11)、(12)。 因此，本申請(qǐng)考慮，長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062EPS異常結(jié)構(gòu)可能參與甚至負(fù)責(zé)由該菌株產(chǎn)生的 獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)效果。因此，另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062或其突變株分 離的多糖。包含所述長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062或其突變株的多糖的藥物組合物也是本發(fā)明的
一方面。進(jìn)一步考慮，長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062的EPS的獨(dú)特結(jié)構(gòu)可能通常涉及炎性疾病。先 前表明，當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物時(shí)，含有甘露糖的復(fù)雜聚合物(甘露聚糖)具有顯著的生物學(xué)活 性。因此，在本發(fā)明的一方面，長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062細(xì)胞或所述細(xì)胞的部分通常用于治療 炎性疾病。特別地，本發(fā)明涉及一種治療炎性疾病的方法，其特征在于向需要治療的人施用 有效量的包含多糖的組合物，所述組合物包含獲得自DSM 21062或DSM 21062的突變株的 EPS。定義在討論本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施方案之前，提供與本發(fā)明的主要方面相關(guān)的特定術(shù)語(yǔ)的定義。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“胞外多糖”指高分子量聚合物，其由通過(guò)微生物分泌到周?chē)h(huán) 境中的糖殘基組成。表達(dá)“益生菌劑(probiotics或probioticum)指的是包含益生微生物的組合物。 益生菌定義為對(duì)宿主的衛(wèi)生和健康具有有益效果的微生物細(xì)胞。益生微生物已經(jīng)被定義為 “在足量施用時(shí)賦予宿主健康益處的活的微生物”(FA0/WH0 2002)。表達(dá)“益生元”指增加腸內(nèi)益生菌的數(shù)量的組合物或組合物的組分。因此，益生元 指任何由土著菌在結(jié)腸中特別發(fā)酵的任何非活的食品組分，認(rèn)為其具有積極價(jià)值，例如，雙
6歧桿菌屬，乳桿菌屬。聯(lián)合施用益生菌與一種或多種益生化合物可以提高施用的益生菌劑 在體內(nèi)的生長(zhǎng)，產(chǎn)生更加顯著的健康益處，稱(chēng)為協(xié)同益生(symbiotic)。表達(dá)“相對(duì)富含甘露糖殘基的EPS”指其中甘露糖是存在的至少第二最豐富種類(lèi)的 單糖的EPS。表達(dá)““Glu-N 甘露糖比”指葡糖胺(Glu-N)和甘露糖的量之間的比。表達(dá)“相對(duì)富含葡萄糖殘基的EPS”指其中葡萄糖是存在的最豐富種類(lèi)的單糖的 EPS。表達(dá)““Glu-N 葡萄糖比”指葡糖胺(Glu-N)和葡萄糖的量之間的比。僅通過(guò)例舉的方式，如下描述本發(fā)明的實(shí)施方案發(fā)明詳述本發(fā)明旨在鑒別一種新的益生菌株，其可用于預(yù)防、減輕或治療與炎癥、尤其是腸 炎相關(guān)的紊亂、病癥或疾病。這里，我們第一次描述了益生長(zhǎng)雙歧桿菌菌株，其特征在于耐受膽汁鹽，產(chǎn)生大 量胞外多糖(EPS)，加強(qiáng)體外上皮細(xì)胞的緊密聯(lián)結(jié)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBQ誘導(dǎo)的 結(jié)腸炎模型中具有抗炎效應(yīng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌株是長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062)。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的布達(dá)佩斯條約，所述益生長(zhǎng)雙歧桿菌菌株DSM 21062 于 2008 年 1 月 23 日保藏于德國(guó) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)Inhoffenstra β e 7B,38124 Braunschweig。實(shí)施例1表明長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062)能夠在實(shí)驗(yàn)結(jié)腸炎小鼠模型中預(yù)防 炎癥。從

圖1可見(jiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062)對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的防護(hù)效應(yīng)明 顯好于其它測(cè)試菌株的效應(yīng)。用DSM 21062處理的小鼠的宏觀炎癥分?jǐn)?shù)(macroscopic inflammation score) (Wallace分?jǐn)?shù))為2. 85+/-0. 52，而該分?jǐn)?shù)高于其它菌株(菌株9555 3. 5+/-0. 53 ；菌株 9553 :3. 55+/-0. 58，菌株8773 :4. 75+/-0. 77，菌株 8818 :4. 0+/-0. 58)。 TNBS參照的平均Wallace分?jǐn)?shù)為5. 15+/-0. 62，而防護(hù)的陽(yáng)性對(duì)照(潑尼松龍)為高度防 護(hù)性的，平均Wallace分?jǐn)?shù)為2. 35+/-0. 31。在健康小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到炎癥跡象(Wallace 分?jǐn)?shù)0. 5賦予所有乙醇-處理的小鼠)。Caco-2細(xì)胞單層的跨上皮電阻(TEER)使得能夠測(cè)量與緊密聯(lián)結(jié)破壞相關(guān)的旁細(xì) 胞離子流變化(Velarde et al. (1999) Toxicology in Vitro 13，723-727)，因此該測(cè)定可 用于定量益生菌對(duì)緊密聯(lián)結(jié)的保護(hù)效應(yīng)。在實(shí)施例6中，表明長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062) 在其響應(yīng)于緊密聯(lián)結(jié)破壞性癸酸鈉(ClO)時(shí)減少Caco-2細(xì)胞層跨上皮電阻(TEER)降低的 能力優(yōu)于其它益生菌。不囿于理論，我們預(yù)期緊密聯(lián)結(jié)強(qiáng)度與腸屏障功能和腸上皮的緊致 度正相關(guān)，因此可能當(dāng)采用小鼠(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型時(shí)與上皮的響應(yīng)相關(guān)。所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062)在所述研究中進(jìn)一步產(chǎn)生與其它菌株相比大 量的EPS。DSM 21062在實(shí)施例2所描述獲得的并通過(guò)HPLC在PAlO柱(高pH陰離子交換 色譜法)測(cè)量的EPS提取物中產(chǎn)生至少3mg/ml，諸如超過(guò)5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更多。然而，EPS的量和實(shí)際組成對(duì)于其功能皆是重要的。先前表明，當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物 時(shí)，含有甘露糖的復(fù)雜聚合物(甘露聚糖)具有顯著的生物學(xué)活性。這包括活化免疫系統(tǒng)，然后將甘露糖結(jié)合于識(shí)別分子例如在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞上表達(dá)的甘露糖受體(CD206) (23-25)。近來(lái)已經(jīng)表明甘露糖受體為新疫苗的靶標(biāo)，不僅用于使免疫防御針對(duì)癌癥和傳染 病，也用于在自身免疫性疾病的治療中特異性誘導(dǎo)耐受性06)。腸樹(shù)突細(xì)胞(DC)被認(rèn)為取 樣并呈遞共生菌至腸相關(guān)免疫系統(tǒng)07)并表明具有高含量甘露糖的EPS能夠調(diào)節(jié)對(duì)腸微 生物群落的免疫反應(yīng)。已經(jīng)表明來(lái)自真菌的EPS具有免疫刺激和抗腫瘤效應(yīng)，并且來(lái)自這 些真菌的EPS含有甘露糖08 ；29)。就我們所知，尚未教導(dǎo)真菌EPS選擇其免疫刺激效應(yīng) 的機(jī)制是通過(guò)與甘露糖結(jié)合受體的相互作用，我們考慮，情況正是如此。因此，認(rèn)為本發(fā)明 長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062)的重要特征在于其產(chǎn)生相對(duì)富含甘露糖殘基的EPS，例如測(cè) 得Glu-N 甘露糖比為40或更高，例如超過(guò)50甚至60或更高。如表II所表明的，甘露糖 殘基的絕對(duì)量也顯著高于其它研究的細(xì)菌。而且，分析DSM 21062產(chǎn)生的EPS顯示其還出 乎意料地富含葡萄糖殘基。所述菌株產(chǎn)生相對(duì)富含葡萄糖殘基的EPS，例如，測(cè)得Glu-N 葡萄糖比為50以上，例如超過(guò)100，或者甚至180以上。葡萄糖殘基的絕對(duì)量也出乎意料地 尚ο這顯示所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM2106》產(chǎn)生具有獨(dú)特的化學(xué)組成的EPS。預(yù) 期這些獨(dú)特的EPS至少部分負(fù)責(zé)所述菌株的有益效果，因此從所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 21062)或其突變分離的多糖可用于配制包含所述多糖的益生元或藥物組合物，其可用于預(yù) 防、減輕或治療各種炎性疾病或病癥。正如所述，所述菌株EPS的甘露糖殘基的高量和葡萄 糖殘基的量被認(rèn)為是顯著的。我們相信，特別是分離自菌株DSM 21062(或其突變體)并相 對(duì)富含甘露糖和葡萄糖殘基的多糖制備物將證明特別地有效。然而，任何這里提及的包含 任一所述多糖的益生元或藥物組合物為本發(fā)明的一種實(shí)施方案。如實(shí)施例4表明，所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM 2106 進(jìn)一步能夠抑制致病菌株的 生長(zhǎng)。該實(shí)施例表明該菌株能夠抑制選自以下的菌株單核細(xì)胞增多性利斯特菌、沙門(mén)氏菌 SSP、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。值得注意的是，長(zhǎng)雙歧桿菌菌株(DSM2106》能夠抑制致病菌株的生長(zhǎng)，因?yàn)楫a(chǎn)生 除了有機(jī)酸之外的抗微生物物質(zhì)對(duì)于雙歧桿菌屬菌株而言是罕有的。只分離了少數(shù)能夠產(chǎn) 生過(guò)氧化氫和熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)抗菌化合物的菌株(30)。EP1688481 (Univ. College of Cork) 描述了一種具有抗微生物活性的嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌。該菌株的抗微生物活性可能是由于產(chǎn)生 了乙酸和乳酸，因?yàn)檫M(jìn)行的測(cè)定不涉及PH調(diào)節(jié)。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了評(píng)價(jià)來(lái)自益生菌株長(zhǎng)雙歧 桿菌 DSM 21062、CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773 和 CHCC8818 的 pH 調(diào)節(jié)條件培養(yǎng)基的抗微 生物活性的測(cè)定。在該測(cè)定中，長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062在抑制病原體生長(zhǎng)上明顯優(yōu)異，該效 應(yīng)與EP 168848中描述的嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌菌株相反，不是由于產(chǎn)生乙酸或乳酸，該測(cè)定表 明長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062通過(guò)獨(dú)特的機(jī)制發(fā)揮其抗微生物效應(yīng)。TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎導(dǎo)致小鼠重量顯著損失，這可以通過(guò)DSM 21062抵消至一定程 度，但不能通過(guò)其它細(xì)菌處理實(shí)現(xiàn)。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的菌株特征在于，接受所述菌株的動(dòng)物經(jīng)歷的由于 TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎引起的重量損失顯著小于(在ρ = 0. 1水平)接受對(duì)照菌株的動(dòng)物的重
量損失。由上清楚的是DSM 21062可以用于制備藥物。實(shí)施例1表明，DSM 21062可用于 制備治療哺乳動(dòng)物胃腸道炎性病癥的藥物。人體胃腸道炎癥的實(shí)例包括過(guò)敏性腸綜合征(IBS)、炎癥性腸病(IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、克羅恩病、間質(zhì)性膀胱炎、酸性腸綜合征、 胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、痢疾、斑疹傷寒癥和與食物過(guò)敏相關(guān)的腸炎。在本發(fā)明的一實(shí)施方案 中，DSM 21062用于制備預(yù)防、減輕或治療任何這些病癥的藥物。在另一方面，本發(fā)明涉及包含DSM 21062或其突變株的人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锝M合物。 優(yōu)選，所述細(xì)菌可以作為添加劑施用至正常的飲食或者作為營(yíng)養(yǎng)完全人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锏慕M 分。劑型可以是液體或固體。在后一情況下，所述產(chǎn)品可以粉末化并形成片劑、顆粒或膠囊， 或者簡(jiǎn)單與其它食物組分混合，形成功能性食品。本發(fā)明的食品組合物可以是使用DSM 21062或其突變株產(chǎn)生的任何可攝取的材 料，選自乳、凝乳、乳基發(fā)酵產(chǎn)品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、乳基粉末、乳濃縮物、乳酪、 涂抹干酪、調(diào)味品、飲料、冰淇淋、發(fā)酵的基于谷物的產(chǎn)品、嬰兒配方、片劑、液體細(xì)菌懸液、 干口服添加劑、濕口服添加劑、干管道飼喂或濕管道飼喂。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。本文中所用的 術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受載體”是指適于施用于人類(lèi)或動(dòng)物并且與所述益生活性有機(jī)體相容的一 種或多種固體或液體填充稀釋劑或囊化物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“相容的”涉及能夠與DSM 21062或其 突變株混合的藥物組合物組分，混合的方式使得在正常使用條件下沒(méi)有會(huì)實(shí)質(zhì)上降低選擇 用于本發(fā)明的有機(jī)體的益生效能的相互作用。藥學(xué)可接受載體必須具有足夠高的純度，并 且足夠低的毒性，使得其適于施用于被處理的人類(lèi)和動(dòng)物。本文中所述的固體組合物優(yōu)選為片劑、膠囊或顆粒(包括許多顆粒)。優(yōu)選所述 固體組合物為口服劑型。常規(guī)配制技術(shù)的綜述可以在例如“!"he Theory and Practice of Industrial Wiarmacy”中找到(31)或(32)。因此，所述片劑可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法 制備，并且可以是壓縮的、腸包衣的、糖包衣的、膜包衣的、或多次壓縮的，含有適宜的粘合 劑、潤(rùn)滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、粉末化劑、流動(dòng)-產(chǎn)生劑和熔化劑。具有液體或固體內(nèi) 含物的膠囊(軟膠囊和硬膠囊)可以根據(jù)制藥工業(yè)公知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。作為一個(gè)實(shí) 例，可以使用適宜的填充機(jī)將益生活性有機(jī)體填充至明膠膠囊中。本文中所述的固體組合 物也可以是丸。所述人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锝M合物或劑型應(yīng)當(dāng)如上所述至少包含DSM 21062或其突變 株，從而每一個(gè)體可獲得的兩種菌株之一的量為約IO3-IO14CFU/天，諸如IO6-IO13CFU/天， 包括IO8-IO12CFU/天，或甚至IO9-IOiiCFU/天。該量取決于個(gè)體重量，優(yōu)選對(duì)于人類(lèi)為約 IO9-IO12CFU/天，對(duì)于寵物為IO7-IOiciCFU/天。然而，會(huì)理解，對(duì)于任何特定患者的具體劑量 水平將取決于多種因素，包括所用的具體化合物的活性、年齡、體重、健康概況、性別、飲食、 施用時(shí)間、施用途徑、排泄速度、藥物聯(lián)合以及進(jìn)行治療的特定疾病的嚴(yán)重程度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锝M合物或營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑劑型進(jìn)一步包 含一種或多種益生物質(zhì)。適宜的益生物質(zhì)的實(shí)例為低聚果糖(F0Q和菊糖。然而，也考慮 從DSM 21062的細(xì)菌細(xì)胞獲得的其它益生物質(zhì)，諸如低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)、 甚至多糖組合物。微生物參與包括大部分乳品的食品和飼料產(chǎn)品的制備。細(xì)菌培養(yǎng)物，尤其是通常 分類(lèi)為乳酸菌的細(xì)菌培養(yǎng)物在制備所有發(fā)酵乳品、乳酪和黃油中必不可少。這些微生物的 培養(yǎng)物經(jīng)常被經(jīng)常稱(chēng)為起子培養(yǎng)物，并通過(guò)行使多種功能賦予各種乳制品特定特征。為了 使所述起子培養(yǎng)物發(fā)揮其功能，必不可少的是它包含足量的活細(xì)胞。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含活長(zhǎng)雙歧桿菌DSM21062或其突變株的起子培養(yǎng)物，并且優(yōu)選其中所述起子 培養(yǎng)物組合物具有一定濃度的活細(xì)胞，該濃度在每克所述組合物IO4至IO12CFU的范圍內(nèi)。起子培養(yǎng)物通常用于通過(guò)根據(jù)食品或飼料產(chǎn)品起始材料添加起子培養(yǎng)物組合物 并將由此接種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活躍的條件下來(lái)制備食品或飼料產(chǎn)品。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述食品為乳基產(chǎn)品，諸如乳酪、酸奶、黃油，或者液體發(fā)酵乳產(chǎn)品，諸 如例如酪乳或飲用酸奶。特別優(yōu)選本發(fā)明用于制備牛乳產(chǎn)品的用途。盡管益生效應(yīng)與活細(xì)胞相關(guān)，很多報(bào)道已經(jīng)顯示死的或失活的細(xì)菌也可以具有 獨(dú)特的有益健康性能。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，死的或滅活的長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062或其突變株或所述細(xì)胞的部分用于治療炎性疾病。尤其是，此類(lèi)細(xì)胞或者此類(lèi)細(xì)胞的 部分被考慮用于制備治療哺乳動(dòng)物胃腸道炎癥的藥物，諸如過(guò)敏性腸綜合征(IBS)、炎癥性 腸病(IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、與食物過(guò)敏相關(guān)的腸炎、克羅恩病、間質(zhì)性膀胱炎、酸性 腸綜合征、胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、痢疾或斑疹傷寒癥。以權(quán)利要求的形式呈現(xiàn)本發(fā)明本發(fā)明的優(yōu)選方面和實(shí)施方案可以所謂的權(quán)利要求的形式呈現(xiàn)。這些如下給出。1、長(zhǎng)雙歧桿菌細(xì)菌細(xì)胞的菌株，其可用作益生菌劑，耐受膽汁鹽，產(chǎn)生大量胞外多 糖(EPS)，加強(qiáng)體外緊密聯(lián)結(jié)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中具有抗 炎效應(yīng)。2、權(quán)利要求1的菌株，其中計(jì)算為(IOOx(平均Wallace分?jǐn)?shù)“TNBS-陽(yáng)性對(duì)照 組-平均Wallace分?jǐn)?shù)“處理”組)/平均Wallace分?jǐn)?shù)“TNBS-陽(yáng)性對(duì)照組”)的“ ％相對(duì) 防護(hù)”為35 %或更高，諸如40 %，或者甚至43 %或更高。3、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中當(dāng)EPS根據(jù)實(shí)施例2的方法分離時(shí)，所述菌株 產(chǎn)生至少3mg/ml，諸如超過(guò)5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更高。4、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株產(chǎn)生相對(duì)富含甘露糖殘基的 EPS，測(cè)得Glu-N 甘露糖比為40或更高，例如超過(guò)50，或者甚至60或更高。5、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株產(chǎn)生相對(duì)富含葡萄糖殘基的 EPS，測(cè)得Glu-N 葡萄糖比為50或更高，例如超過(guò)100，或者甚至180或更高。6、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中共培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞(ATCC HTB-37)的體 外培養(yǎng)層與所述細(xì)菌菌株引起Caco-2細(xì)胞層的緊密聯(lián)結(jié)統(tǒng)計(jì)上顯著的加強(qiáng)，所述緊密聯(lián) 結(jié)測(cè)量為所述Caco-2細(xì)胞層在暴露于緊密聯(lián)結(jié)破壞劑癸酸鈉后所述Caco-2細(xì)胞層的跨上 皮電阻。7、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株還能夠抑制致病菌株的生長(zhǎng)。8、根據(jù)權(quán)利要求7的菌株，其中所述致病菌株選自單核細(xì)胞增多性利斯特菌、沙 門(mén)氏菌ssp、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。9、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中接受所述菌株的動(dòng)物由于TNBS-誘導(dǎo)的 結(jié)腸炎經(jīng)歷重量損失，該重量損失小于接受對(duì)照菌株的動(dòng)物的重量損失。10、根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其為登記號(hào)DSM 21062的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株 或其突變株，其中所述突變株通過(guò)使用該保藏菌株作為起始材料獲得，并且其中所述突變 株具有保留的或進(jìn)一步改善的表征DSM 21062的抗炎效應(yīng)、膽汁耐受性和/或EPS表達(dá)。11、包含根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞的菌株或所述細(xì)胞的部分的組合物
10用于制備藥物的用途。12、包含根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞的菌株或所述細(xì)胞的部分的組合 物用于制備治療哺乳動(dòng)物胃腸道炎癥的藥物的用途。13、權(quán)利要求12的用途，其中所述炎癥選自以下病癥組成的組過(guò)敏性腸綜合征 (IBS)、炎癥性腸病(IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、克羅恩病、間質(zhì)性膀胱炎、酸性腸綜合征、 胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、痢疾、斑疹傷寒癥和與食物過(guò)敏相關(guān)的腸炎。14、人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锝M合物，其包含至少一種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞的 菌株。15、一種起子培養(yǎng)物組合物，其包含權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選其中 所述起子培養(yǎng)物組合物具有一定濃度的活細(xì)胞，該濃度在每克所述組合物IO4至IO12CFU的 范圍內(nèi)。16、一種制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求15的起子培養(yǎng) 物添加到食品或飼料產(chǎn)品起始材料中并將由此接種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活 躍的條件下。17、權(quán)利要求16的方法，其中所述食品是乳，優(yōu)選牛乳。18、從權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株分離的多糖。19、權(quán)利要求18的多糖，其相對(duì)富含甘露糖殘基，測(cè)得Glu-N 甘露糖比為40或 更高，例如超過(guò)50，或者甚至60或更高。20、權(quán)利要求18的多糖，其相對(duì)富含葡萄糖殘基，測(cè)得Glu-N 葡萄糖比為50或 更高，例如超過(guò)100，或者甚至180或更高。21、權(quán)利要求18的多糖，其根據(jù)權(quán)利要求17和18相對(duì)富含甘露糖和葡萄糖殘基兩者。22、藥物組合物，其包含權(quán)利要求18至21任一項(xiàng)的多糖。23、權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞或所述細(xì)胞的部分用于治療炎性疾病的用途。24、前述權(quán)利要求23的用途，其中所述疾病為過(guò)敏性腸綜合征(IBS)、炎癥性腸病 (IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、與食物過(guò)敏相關(guān)的腸炎、克羅恩病、間質(zhì)性膀胱炎、酸性腸綜 合征、胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、痢疾或斑疹傷寒癥。25、治療炎性疾病的方法，其特征在于向需要治療的人施用有效量的前述權(quán)利要 求任一項(xiàng)的包含多糖的組合物。在以下非限制性實(shí)施例和附圖中進(jìn)一步闡明本發(fā)明，其中圖1 =(A)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的宏觀炎癥評(píng)價(jià)，表示為Wallace分?jǐn)?shù)。以細(xì)菌處理 的小鼠與單獨(dú)接受TNBS或假治療的小鼠相比較。(B)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的宏觀炎癥評(píng)價(jià)， 表示為％防護(hù)，與單獨(dú)接受TNBS或假治療的小鼠相比較。*表明防護(hù)顯著不同于假治療， P ^ 0.05廣ρ ^0.01的統(tǒng)計(jì)顯著性水平( 0. 002的統(tǒng)計(jì)顯著性水平；O不顯著(t檢 驗(yàn))。誤差棒指示Ix平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2 沒(méi)有細(xì)菌處理可以減輕重量損失，除了菌株DSM 21062，其中注意到減少體 重?fù)p失的正趨勢(shì)(12. 4% +/-1. 6,p = 0. 09)。防護(hù)的陽(yáng)性對(duì)照(潑尼松龍)在減輕重量損失 方面非常顯著。(4. 75% +/-1. 25,ρ ^ 0. 001)。_表明防護(hù)顯著不同于假治療，ρ彡0. 001。
圖3 =MPO測(cè)定證實(shí)在發(fā)炎組織中，特別是對(duì)于TNBS對(duì)照組，嗜中性白細(xì)胞的大量 滲入(12. 56+/-3. 75)，與“健康小鼠”不同，其中僅測(cè)到非常微弱的活性(1.75+/-0. 07)。通 過(guò)類(lèi)皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)進(jìn)行防護(hù)顯著降低了該參數(shù)G.21+/-0.96)。發(fā)現(xiàn)所有細(xì)菌處理組的平 均值均遠(yuǎn)在陽(yáng)性對(duì)照值之下，然而沒(méi)有觀察到顯著降低。表現(xiàn)出最佳的降低的菌株為菌株 DSM 21062 (p = 0. 07)。誤差棒指示Ix平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4 通過(guò)當(dāng)?shù)攘康募?xì)菌生物質(zhì)沉淀時(shí)形成的球團(tuán)粒度所表明的長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062、瘤胃乳桿菌菌株CHCC8818和干酪乳桿菌菌株CHCC8773的蓬松性。圖5 測(cè)量穿過(guò)Caco-2細(xì)胞匯合層的跨上皮電阻。“無(wú)處理”為既未用ClO亦未用 益生菌劑處理的Caco-2細(xì)胞層，“C10”為僅用ClO處理的細(xì)胞層。益生菌劑處理(恥_12， CRL-431，La-5和DSM 21062)細(xì)胞層，然后以ClO挑戰(zhàn)，示于四個(gè)右側(cè)的柱)。誤差棒指示 Ix平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。"表示P <0.01的統(tǒng)計(jì)顯著性水平，_ < 0.001的統(tǒng)計(jì)顯著性水平(t 檢驗(yàn))。
實(shí)施例實(shí)施例1 體內(nèi)分析長(zhǎng)雙歧桿菌DSM 21062的抗炎潛能培養(yǎng)條件和所用菌株在本研究中使用以下菌株長(zhǎng)雙歧桿菌菌株DSM 21062 (CHCC8879)。菌株瘤胃乳 桿菌菌株CHCC8818、干酪乳桿菌菌株CHCC8773、兩歧雙歧桿菌菌株CHCC9555和兩歧雙歧桿 菌菌株CHCC9553用作對(duì)照菌株。菌株CHCC8818、CHCC8773、CHCC9555和CHCC9553為在產(chǎn) 生本發(fā)明的篩選過(guò)程中鑒定和研究的Chr. Hansen培養(yǎng)物收集的4個(gè)推定的益生菌株。乳桿菌屬于37°C培養(yǎng)于 MRS 肉湯(Difco，BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) 使 用 Anaerocult A 培養(yǎng)袋(Merck，Darmstadt，Germany)于 37°C MRS 肉湯+0.05%半胱氨酸 氫氯化物中培養(yǎng)雙歧桿菌。對(duì)于每一菌株，在生長(zhǎng)曲線以及瓊脂培養(yǎng)基上細(xì)菌計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)上建立了 0D600nm/ CFU (集落形成單位)對(duì)應(yīng)關(guān)系。關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，每日將500μ 1各菌株從不同的儲(chǔ)瓶接種到50ml相應(yīng)的生長(zhǎng)培養(yǎng) 基中，以確保最后的細(xì)菌計(jì)數(shù)> 101(ICFU。離心培養(yǎng)物，在PBS中洗滌，并在將所述細(xì)菌施用于動(dòng)物前再懸浮于足夠體積的 緩沖液中。TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎和炎癥記分描述用于炎性標(biāo)記的模型和測(cè)定的方案對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)方法，先前描述于(33)。簡(jiǎn)言 之，通過(guò)胃內(nèi)途徑每日給予10只小鼠的組別或者碳酸鹽緩沖液(“TNBS陽(yáng)性對(duì)照”)或者 新鮮培養(yǎng)的IxlO9活細(xì)菌(“處理”)，連續(xù)進(jìn)行5日。此外，以10mg/kg的潑尼松的商業(yè)制 備物(Cortancyl，Sanofi Aventis,France)處理10只小鼠的組，在施用TNBS前口服5日， 并在TNBS處理后口服連續(xù)2日(“陽(yáng)性防護(hù)對(duì)照”)。通過(guò)直腸內(nèi)施用50%乙醇中50μ 1 TNBS溶液(Sigma-Aldrich Chemical)誘發(fā) 急性結(jié)腸炎。施用100mg/kg TNBS在所用的BALB/c小鼠中引起中度嚴(yán)重的腸炎。10只小 鼠的組也被給予碳酸鹽緩沖液，但是僅接受50 μ 1的50%乙醇溶液(無(wú)TNBS ；“陰性”(健 康)對(duì)照")。接下來(lái)每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重減輕。誘導(dǎo)結(jié)腸炎2日后，處死小鼠。研究設(shè)計(jì)
12示于表I。在小鼠解剖后，兩位獨(dú)立的觀察者在不知情的情況下以Wallace尺度對(duì)結(jié)腸的宏 觀炎癥進(jìn)行計(jì)分(34)。如前所述，％相對(duì)防護(hù)計(jì)算為100x(平均Wallace分?jǐn)?shù)“TNBS-陽(yáng) 性對(duì)照”組-平均Wallace分?jǐn)?shù)“處理”組)/平均Wallace分?jǐn)?shù)“TNBS陽(yáng)性對(duì)照組”。公布時(shí)缺失表I 體內(nèi)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的研究設(shè)計(jì)(i.r.=直腸內(nèi)施用，i.g.=胃內(nèi)施用)
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)雙歧桿菌細(xì)菌細(xì)胞的菌株，其用作益生菌劑，耐受膽汁鹽，產(chǎn)生高量的胞外 多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中具有抗炎效應(yīng)，其特征在 于所述菌株為登記號(hào)DSM 21062的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株或其突變株，其中所述突變株通過(guò)使用 該保藏菌株作為起始材料獲得，并且其中所述突變株具有保留的或進(jìn)一步改善的表征DSM 21062的抗炎效應(yīng)、膽汁耐受性和/或EPS表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的菌株，其中共培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞(ATCCHTB-37)的體外培養(yǎng)層與所 述菌株引起所述Caco-2細(xì)胞層的緊密聯(lián)結(jié)統(tǒng)計(jì)上顯著的加強(qiáng)，所述緊密聯(lián)結(jié)測(cè)量為所述 Caco-2細(xì)胞層在暴露于緊密聯(lián)結(jié)破壞劑癸酸鈉后所述Caco-2細(xì)胞層的跨上皮電阻。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株還能夠抑制致病菌株的生長(zhǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株產(chǎn)生相對(duì)富含甘露糖殘基的EPS， 測(cè)得Glu-N 甘露糖比為40或更高。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株產(chǎn)生相對(duì)富含葡萄糖殘基的EPS， 測(cè)得Glu-N 葡糖糖比為50或更高。
6.包含根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞的菌株或所述細(xì)胞的部分的組合物用于 制備藥物的用途。
7.包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞的菌株或所述細(xì)胞的部分的組合物用于 制備治療哺乳動(dòng)物胃腸道炎癥的藥物的用途。
8.人類(lèi)或?qū)櫸锸澄锝M合物，其包含至少一種權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞的菌株。
9.一種起子培養(yǎng)物組合物，其包含權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選其中所述 起子培養(yǎng)物組合物具有一定濃度的活細(xì)胞，該濃度在每克所述組合物IO4至IO12CFU的范圍 內(nèi)。
10.一種制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求9的起子培養(yǎng)物添 加到食品或飼料產(chǎn)品起始材料中并將由此接種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活躍的 條件下。
11.從權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株分離的多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的長(zhǎng)雙歧桿菌益生抗炎菌株，其用于預(yù)防、減輕或治療疾病以及用于制備人類(lèi)或?qū)櫸锸称返挠猛荆蛩幬锝M合物。所述菌株產(chǎn)生大量具有高含量的甘露糖和葡萄糖殘基的胞外多糖。因此，本發(fā)明還涉及由所述菌株獲得的細(xì)菌多糖組合物，其用于治療疾病的用途，以及包含此類(lèi)多糖的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102089422SQ200980127197
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者延斯·基爾德斯加德, 托馬斯·岡納森, 托馬斯·簡(jiǎn)森, 托馬斯·達(dá)爾曼·萊澤, 梅特·魏澤, 班奈迪特·佛林巴爾德, 瑪麗·福克恩伯格 迪特 申請(qǐng)人:科.漢森有限公司