專利名稱：從糞便試樣中回收核酸的方法、核酸分析方法以及糞便試樣處理裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于從糞便試樣中高純度地回收核酸的從糞便試樣中回收核酸 的方法、使用了由該核酸回收方法回收的核酸的核酸分析方法、以及糞便試樣處理裝置。本申請基于2008年7月23日在日本申請的日本特愿2008-189684號要求優(yōu)先權(quán)， 并將其內(nèi)容援引于此。
背景技術(shù)：
與歐美同樣，在日本，結(jié)腸癌的患者數(shù)也在逐年急劇增加，結(jié)腸癌已占居癌癥死亡 率的前幾位。其原因認(rèn)為是日本人的飲食生活轉(zhuǎn)變成歐美型的以肉食為中心。具體而言， 每年約6萬人左右罹患結(jié)腸癌，在按照臟器分類的死亡數(shù)方面，結(jié)腸癌排在第三位，僅次于 胃癌、肺癌，預(yù)測今后也會進(jìn)一步增加。另一方面，結(jié)腸癌與其他的癌癥不同，通過在發(fā)病初 期進(jìn)行治療，近100%能夠治愈。因此，將結(jié)腸癌作為早期癌診察的對象是非常有意義的，用 于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的檢查方法的研究和開發(fā)正在盛行。作為用于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的檢查方法，進(jìn)行的有例如灌腸檢查、結(jié)腸鏡檢查等。灌 腸檢查是如下檢查向大腸中注入鋇使其附著于大腸的粘膜面，照射X射線拍攝其表面的 凹凸，觀察大腸的表面。另一方面，結(jié)腸鏡檢查是通過內(nèi)窺鏡直接觀察大腸內(nèi)部的檢查。特 別是結(jié)腸鏡檢查的靈敏度和特異性高，還具有也能夠切除息肉和早期癌的優(yōu)點。然而，這些 檢查方法存在成本高、給受試者帶來的負(fù)擔(dān)大、伴隨并發(fā)癥的風(fēng)險的問題。例如，灌腸檢查 中存在X射線暴露和腸梗阻的危險性。另外，結(jié)腸鏡檢查由于將內(nèi)窺鏡直接插入大腸內(nèi)因 而具有侵入性。進(jìn)而，需要內(nèi)窺鏡操作熟練，能夠檢查的設(shè)施有限。因此，這些檢查方法不 適于定期體檢等以無癥狀的普通人為對象的結(jié)腸癌檢查。近年來，作為結(jié)腸癌的一次篩查方法，正廣泛實施一種非侵入性且低成本的糞便 潛血檢查。糞便潛血檢查是調(diào)查糞便中所含的紅細(xì)胞來源的血紅蛋白的有無的檢查，是間 接預(yù)測結(jié)腸癌的存在的方法。作為糞便潛血檢查被廣泛利用的原因，可列舉出可在常溫下 進(jìn)行糞便的采集和保存，也不需要冷藏和冷凍等特殊的保存條件；以及，可以在普通家庭簡 單地進(jìn)行；操作非常簡便。但是，在糞便潛血檢查中，存在靈敏度低至25%左右、漏檢結(jié)腸 癌的概率高的問題。進(jìn)而，陽性命中率也低，糞便潛血檢查為陽性的受試者中實際為結(jié)腸癌 患者的比例為10%以下，包括很多假陽性。因此，強烈期望開發(fā)可靠性更高的新型檢查方 法。作為也適于定期體檢等的、非侵入性、簡便、且可靠性高的新型檢查方法，調(diào)查糞 便中有無癌細(xì)胞或有無癌細(xì)胞來源的基因的檢查受到矚目。這些檢查方法由于直接調(diào)查有 無癌細(xì)胞或癌細(xì)胞來源的基因，因此可以期待成為與調(diào)查有無伴隨結(jié)腸癌的患病產(chǎn)生的消 化道出血的、作為間接的結(jié)腸癌檢查方法的糞便潛血檢查法相比可靠性更高的檢查法。為了以高精度檢測糞便中的癌細(xì)胞等，有效地回收糞便中的癌細(xì)胞來源的核酸很 重要。特別是，由于糞便中的癌細(xì)胞來源的核酸為微量，且糞便中含有大量消化殘留物和細(xì)菌，因此核酸非常容易被分解。因此，為了有效地從糞便試樣回收核酸、特別是人等哺乳 動物細(xì)胞來源的核酸，重要的是調(diào)制糞便試樣以防止糞便中核酸的分解并且能夠穩(wěn)定地保 存至檢查操作時為止。作為這種糞便試樣的調(diào)制方法，例如有從采集的糞便中分離從大腸 等消化道脫落的癌細(xì)胞的方法。通過從糞便中分離癌細(xì)胞，可以抑制細(xì)菌等來源的蛋白酶、 DNase, RNase等分解酶造成的影響。作為從糞便中分離癌細(xì)胞的方法，例如公開了以下方 法(1)為從糞便中分離細(xì)胞的方法，其包含(a)將糞便冷卻至低于其凝膠凝固點的溫度 的工序；和(b)將糞便保持在低于其凝膠凝固點的溫度以使得糞便實質(zhì)上為保持完好的狀 態(tài)，同時從糞便中采集細(xì)胞的工序(例如，參照專利文獻(xiàn)1。)。另外，公開了以下方法(2) 在通常周圍溫度下將糞便分散到含有蛋白酶抑制物質(zhì)、粘液溶解劑和殺菌劑的運輸培養(yǎng)基 中，然后分離從大腸脫落的細(xì)胞(例如，參照專利文獻(xiàn)2。)。另外，糞便中含有對PCR(Polymerase Chain Reaction)等核酸擴增反應(yīng)有抑制作 用的物質(zhì)(例如膽汁酸和其鹽等)(例如，參照非專利文獻(xiàn)1。)。例如，據(jù)報道，成人的平均 糞便排泄量約為200 400g/日，健康人其糞便中的膽汁酸排泄量為200 650mg/日，另 外，在伴有回腸障礙的患者的情況下，其膽汁酸的排泄量甚至為健康人的10倍。即，換算為 每Ig糞便時，健康人的每Ig糞便中含有約0. 5mg 3. 25mg的膽汁酸，患者的每Ig糞便中 含有健康人的10倍的膽汁酸。另一方面，還報道，膽汁酸鹽所導(dǎo)致的PCR的抑制效果在50 μ g/mL左右的濃度下 產(chǎn)生。因此，從糞便中提取核酸并用PCR等對其進(jìn)行擴增時，為了使擴增效率提高，期望防 止膽汁酸鹽等核酸擴增反應(yīng)中的抑制物質(zhì)的殘留(carry over) 0現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特表平11-511982號公報專利文獻(xiàn)2 日本特表2004-519202號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 :ffilson IG, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，1997 年， 第63卷，第3741 51頁。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題在上述(1)的方法中，一邊冷卻糞便試樣一邊分離細(xì)胞。如果不在冷卻的情況下 進(jìn)行該分離操作，則由于糞便試樣的變質(zhì)等而無法得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。因此，為了有效地 防止糞便試樣的變質(zhì)，在采集糞便后迅速進(jìn)行冷卻很重要。然而，如診察等那樣在家里進(jìn)行 糞便采集時，采集后立即將糞便試樣冷卻非常困難，不現(xiàn)實。此外，從糞便試樣中分離細(xì)胞 的操作很繁雜，存在導(dǎo)致檢查所需的費用增大的問題。在上述O)的方法中，通過添加殺菌劑等，從而不需要冷卻操作就能在室溫下進(jìn) 行糞便試樣的調(diào)制和保存，但是由于需要從糞便中分離從大腸脫落的細(xì)胞的操作，因此操 作性還是差，結(jié)果，存在花費成本的問題。進(jìn)而，在專利文獻(xiàn)1和2以及非專利文獻(xiàn)1中，均完全沒有記載從糞便中回收核酸 時防止膽汁酸、膽汁酸鹽等核酸擴增反應(yīng)中的抑制物質(zhì)的殘留。
本發(fā)明的目的在于提供一種減少膽汁酸等核酸擴增反應(yīng)中的抑制物質(zhì)的殘留、不 需要繁雜的操作且高純度地回收糞便中的核酸的方法；使用由該方法回收的核酸進(jìn)行分析 的方法；以及該回收和分析方法中使用的糞便試樣處理裝置。用于解決問題的方案本發(fā)明人等為了解決上述課題，發(fā)現(xiàn)，通過在核酸提取工序之前，將采集的糞便浸 泡在以水溶性有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)中的抑制物質(zhì)除去用的溶液中并保存 規(guī)定的時間，能夠溶出并除去糞便中所含的核酸擴增反應(yīng)中的抑制物質(zhì)，從糞便中高純度 地回收核酸。S卩，本發(fā)明包括，(1) 一種從糞便試樣中回收核酸的方法，其為從糞便中高純度地回收核酸的方法， 具有以下工序(A)將采集的糞便添加到以水溶性有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)中的抑制 物質(zhì)的除去用溶液中而調(diào)制糞便試樣，并將上述糞便試樣保存規(guī)定的時間，從而使核酸擴 增反應(yīng)抑制物質(zhì)溶出的工序；(B)在工序(A)之后，從糞便試樣中除去核酸擴增反應(yīng)中的抑制物質(zhì)的除去用溶 液并回收糞便來源的固體成分的工序；和(C)從在工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中回收核酸的工序。(2)上述(1)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，也可以不將采集的糞便制 成懸浮液，而是立即添加到核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中，調(diào)制糞便試樣。(3)上述(1)或( 所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有 機溶劑優(yōu)選為水溶性醇和/或酮類。(4)上述(1) C3)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有 機溶劑的濃度優(yōu)選為30%以上。(5)上述C3)或(4)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有 機溶劑優(yōu)選含有選自由乙醇、丙醇、和甲醇組成的組中的1種以上作為水溶性醇。(6)上述(1)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有機溶 劑優(yōu)選為乙醇。(7)上述C3)或(4)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有 機溶劑優(yōu)選含有丙酮和/或甲乙酮作為酮類。(8)上述⑴ (7)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述 糞便和上述核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液的混合比率優(yōu)選為設(shè)糞便體積為1時，相 對于該1，核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液體積為1以上。(9)上述(1) (8)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (B)中的從糞便試樣中除去核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液優(yōu)選通過離心分離法來進(jìn) 行。(10)上述(1) (9)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (A)中，保存糞便試樣的時間優(yōu)選為1小時以上。(11)上述(1) (9)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (A)中，保存糞便試樣的時間優(yōu)選為12小時以上。
(12)上述(1) (9)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (A)中，保存糞便試樣的時間優(yōu)選為M小時以上。(13)上述(1) (9)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (A)中，保存糞便試樣的時間優(yōu)選為72小時以上。(14)上述(1) (13)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (A)中，保存糞便試樣的溫度優(yōu)選為4°C以上。(15)上述(1) (13)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序 (A)中，保存糞便試樣的溫度優(yōu)選為20°C以上。(16)上述(1) (15)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上 述核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液優(yōu)選含有表面活性劑。(17)上述(1) (16)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上 述核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液優(yōu)選含有著色劑。(18)上述(1) (17)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法的上述工序 (C)優(yōu)選為如下工序從在工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中同時回收常居腸細(xì)菌 來源的核酸和常居腸細(xì)菌以外的生物來源的核酸。(19)上述(18)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述常居腸細(xì)菌 以外的生物優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞。(20)上述(1) (19)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法的上述工序 (C)優(yōu)選具有(a)使工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中的蛋白質(zhì)變性，并使核酸從上述 糞便來源的固體成分中的常居腸細(xì)菌和常居腸細(xì)菌以外的生物中溶出的工序；和(b)回收上述工序(a)中溶出的核酸的工序。(21)上述00)所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，優(yōu)選在上述工序(a)之 后、上述工序(b)之前具有(c)除去通過上述工序(a)而變性的蛋白質(zhì)的工序。(22)上述00)或所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工序(a)中 的蛋白質(zhì)的變性優(yōu)選使用選自由離液序列高的鹽、有機溶劑和表面活性劑組成的組中的1 種以上來進(jìn)行。(23)上述0 所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，使用的上述有機溶劑優(yōu) 選為酚類。(24)上述 (2 中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工 序(c)中的變性的蛋白質(zhì)的除去優(yōu)選使用氯仿來進(jìn)行。(25)上述00) (24)中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法中，上述工 序(b)中的核酸的回收優(yōu)選具有以下工序(bl)使上述工序(a)中溶出的核酸吸附于無機支撐體的工序；和(b2)使上述工序(bl)中吸附的核酸從無機支撐體溶出的工序。(26)另外，本發(fā)明為通過上述(1) 0 中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸 的方法而回收的核酸。(27)另外，本發(fā)明為使用回收的核酸對哺乳動物細(xì)胞來源的核酸進(jìn)行分析的核酸 分析方法，該回收的核酸為利用上述(1) 06)中任一項所述的核酸回收方法從糞便試樣
8中回收的核酸。(28)上述(XT)所述的核酸分析方法中，使用的上述哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選為消化道 細(xì)胞。(29)上述(XT)所述的核酸分析方法中，使用的上述哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選為從大腸 脫落的細(xì)胞。(30)上述、2Τ) (29)中任一項所述的核酸分析方法中，被分析的上述哺乳動物 細(xì)胞來源的核酸優(yōu)選為指示致瘤性轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物。(31)上述(XT) (29)中任一項所述的核酸分析方法中，被分析的上述哺乳動物 細(xì)胞來源的核酸優(yōu)選為指示炎癥性消化器官疾病的標(biāo)記物。(32)上述(XT) (31)中任一項所述的核酸分析方法中的分析優(yōu)選為選自由 mRNA的表達(dá)分析、K-ras基因的突變分析、以及DNA的甲基化分析組成的組中的1種以上。(33)另外，本發(fā)明為包括溶液除去機構(gòu)的糞便試樣處理裝置，該溶液除去機構(gòu)用 于從糞便試樣中除去下述核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液，該糞便試樣是將采集的糞便 浸泡于以水溶性有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中保存規(guī)定的 時間后的糞便試樣。(34)上述(33)所述的糞便試樣處理裝置中的上述溶液除去機構(gòu)優(yōu)選具有離心分 離機構(gòu)、溶液抽吸排出機構(gòu)和廢液回收部。(35)上述(34)所述的糞便試樣處理裝置中，優(yōu)選上述溶液抽吸排出機構(gòu)為溶液 抽吸排出噴嘴，該糞便試樣處理裝置還具有洗滌上述溶液抽吸排出噴嘴的機構(gòu)。(36)本發(fā)明為一種核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液，其是用于調(diào)制核酸回收用 糞便試樣的溶液，以水溶性有機溶劑為有效成分，用以降低回收的核酸中的核酸擴增反應(yīng) 抑制物質(zhì)。(37)上述(36)所述的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中，上述水溶性有機溶 劑優(yōu)選為水溶性醇和/或酮類。(38)上述(37)所述的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中，上述水溶性有機溶 劑的濃度優(yōu)選為30%以上。(39)本發(fā)明為一種糞便采集用試劑盒，其具有上述(36) (38)中任一項所述的 核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液、和含有該核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液的糞便采
集各器。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的從糞便試樣中回收核酸的方法，能夠有效地溶出除去糞便中所含的 核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)，并從糞便試樣中回收高純度的核酸。另外，根據(jù)本發(fā)明，由于不需 要從糞便試樣中分離哺乳動物細(xì)胞等作為檢測對象的生物或其細(xì)胞等之類繁雜的操作，因 此即使在處理多個待測物時，也能夠有效地降低勞力和成本。特別是，通過使用本發(fā)明的糞 便試樣處理裝置，能夠更簡便地從糞便試樣中回收核酸。像這樣，通過利用本發(fā)明的從糞便試樣中回收核酸的方法、以及使用由該回收方 法回收的核酸的核酸分析方法，從而能夠高靈敏度且高精度地分析糞便中的核酸。因此，期 望通過利用本發(fā)明，對以結(jié)腸癌為首的各種癥狀和疾病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷、治療過程的觀 察以及其他異常情況的病理學(xué)研究等有益。


圖1為表示本發(fā)明的糞便試樣處理裝置的一個實施方式的圖。圖2為表示本發(fā)明的糞便采集用試劑盒中能夠使用的糞便采集容器A的一個實施 方式的圖。圖3為表示本發(fā)明的糞便采集用試劑盒中能夠使用的糞便采集容器B的一個實施 方式與其使用方法的一個例子的圖。圖4為表示實施例1中每100 μ L所提取的RNA溶液中的膽汁酸量的圖。圖5為表示實施例2中以脫氧膽酸鈉濃度為橫軸、以GAPDH擴增量為縱軸的測定 結(jié)果的圖。附圖標(biāo)記說明1…容器本體Ia…隆起部2 …蓋3…糞便采集棒3a …杯S…核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液11…容器本體12 …蓋13…糞便采集棒13a...子L13b…可動蓋15 …袋E...糞便101…糞便試樣處理裝置102…離心分離機構(gòu)103…溶液抽吸排出噴嘴104…廢液回收部105…溶液抽吸排出噴嘴洗滌機構(gòu)
具體實施例方式本發(fā)明中，核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)是指對核酸擴增反應(yīng)有抑制作用的物質(zhì)，具體 而言，可列舉出膽汁酸、膽汁酸鹽等。以下，將核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)簡稱為抑制物質(zhì)A。另 外，本發(fā)明中，核酸擴增反應(yīng)意味著像PCR等那樣的利用DNA聚合酶且伴隨核酸伸長的擴增 反應(yīng)。本發(fā)明的從糞便試樣中回收核酸的方法(以下，有時稱作“本發(fā)明的核酸回收方 法”。)，將采集的糞便與以水溶性有機溶劑為有效成分的抑制物質(zhì)A的除去用溶液混合后， 保存規(guī)定的時間。通過將糞便在與抑制物質(zhì)A的除去用溶液混合的狀態(tài)下保存規(guī)定的時 間，能夠有效地溶出除去糞便中所含的膽汁酸和膽汁酸鹽等抑制物質(zhì)A。由此，能夠顯著減少抑制物質(zhì)A在從糞便試樣中回收的核酸中的殘留，能夠回收高純度的核酸。推測水溶性有機溶劑所帶來的上述抑制物質(zhì)A量的降低效果、即能夠使抑制物質(zhì) A在回收的核酸中的殘留減少的效果，是由抑制物質(zhì)A與核酸在水溶性有機溶劑中的溶解 性的差異引起的。即，膽汁酸等抑制物質(zhì)A易溶于醇等水溶性有機溶劑中，但難溶于非極性 有機溶劑中。另一方面，核酸在醇中由于鹽的效果而不溶化，難溶于醇等水溶性有機溶劑 中。因此推測，如果使糞便與醇等水溶性有機溶劑混合，則能夠使抑制物質(zhì)A溶出到水溶性 有機溶劑中，將其與不溶于水溶性有機溶劑成分的核酸分離，因而能夠降低回收的核酸中 的抑制物質(zhì)A量。關(guān)于本發(fā)明的核酸回收方法，具體而言，首先，作為工序(A)，將采集的糞便添加到 以水溶性有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液(以下，簡稱為除去用 溶液S)中，調(diào)制糞便試樣。然后，將調(diào)制的上述糞便試樣保存規(guī)定的時間，從而使抑制物質(zhì) A溶出。本發(fā)明的核酸回收方法中使用的除去用溶液S以水溶性有機溶劑為有效成分。糞 便等生物試樣通常含有大量的水分，但除去用溶液S以在水中的溶解度高的溶劑、或能與 水以任意比例混合的水溶性有機溶劑作為有效成分。因此，能夠與糞便試樣迅速混合，獲得 更高的抑制物質(zhì)A量的降低效果。本發(fā)明中，水溶性有機溶劑是指醇類或酮類，是具有直鏈結(jié)構(gòu)且在室溫附近例如 15 40°C下為液態(tài)的溶劑。另外，本發(fā)明中的水溶性有機溶劑中不含有機酸。通過以具有 直鏈結(jié)構(gòu)的水溶性有機溶劑作為有效成分，與以具有苯環(huán)等環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機溶劑作為有效 成分相比，能夠迅速地進(jìn)行與糞便的混合。具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機溶劑通常容易與水分離，因 此不易與糞便混合，難以獲得好的抑制物質(zhì)A量的降低效果。即使是在水中一定程度溶解 的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機溶劑，為了使糞便均勻地分散，也需要劇烈混合或者加溫。另外還考 慮到，為了易于將糞便與具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機溶劑混合，預(yù)先制作有機溶劑與水的混合溶 液，然后將糞便與該混合溶液混合。然而，為了制作該混合溶液，需要將具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有 機溶劑與水劇烈混合、或者加溫，故不優(yōu)選。除去用溶液S中所含的水溶性有機溶劑優(yōu)選為在水中的溶解度為12重量％以上 的水溶性有機溶劑，更優(yōu)選為在水中的溶解度為20重量％以上的水溶性有機溶劑，進(jìn)一步 優(yōu)選為在水中的溶解度為90重量％以上的水溶性有機溶劑，特別優(yōu)選為能與水以任意比 例混合的水溶性有機溶劑。作為能與水以任意比例混合的水溶性有機溶劑，例如有甲醇、乙 醇、正丙醇、2-丙醇、丙酮等。除去用溶液S中所含的水溶性有機溶劑只要是滿足上述定義、核酸的溶解性低但 抑制物質(zhì)A能夠溶解的溶劑，則沒有特別限定。作為該水溶性有機溶劑，例如有醇類和酮 類，作為醇類有作為水溶性醇的甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、巰基乙醇等，作為酮類有丙酮、甲乙 酮(在水中的溶解度為90重量％)等。丙醇可以為正丙醇，也可以為2-丙醇。另外，丁 醇可以為1-丁醇(在水中的溶解度為20重量％)，也可以為2-丁醇(在水中的溶解度為 12. 5 重量 ％ )。作為除去用溶液S中所含的水溶性有機溶劑，優(yōu)選醇類或酮類，更優(yōu)選選自由水 溶性醇、丙酮、和甲乙酮組成的組中的1種以上。這些溶劑中，膽汁酸鹽等抑制物質(zhì)A的溶 解性高，能夠獲得更優(yōu)異的抑制物質(zhì)A量的降低效果。進(jìn)而，從容易獲得性、處理容易性、安全性等觀點來看，更優(yōu)選水溶性醇，進(jìn)一步優(yōu)選乙醇、丙醇、甲醇。特別是乙醇，由于安全性 最高，在家庭內(nèi)也容易處理，因此在定期體檢等篩選檢查中特別有用。除去用溶液S中的水溶性有機溶劑濃度只要為能夠發(fā)揮抑制物質(zhì)A量的降低效果 的濃度，則沒有特別限定，可以考慮水溶性有機溶劑的種類等而適當(dāng)決定。例如，使用水溶 性醇、酮類作為有效成分時，除去用溶液S的水溶性有機溶劑濃度優(yōu)選為30%以上。通過使 水溶性有機溶劑濃度為充分的高濃度，從而混合糞便與除去用溶液S時，水溶性有機溶劑 成分迅速地滲透到糞便中，能夠迅速發(fā)揮抑制物質(zhì)A的除去效果。另外，本發(fā)明和本申請說明書中，只要沒有特別記載，“ %，，意味著“體積％ ”。特別是使用水溶性醇作為有效成分時，除去用溶液S的水溶性有機溶劑濃度優(yōu)選 為30%以上，更優(yōu)選為50%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為50 80%，特別優(yōu)選為50%以上且不足 70%。如果水溶性有機溶劑濃度高，則即使對于水分含量多的糞便，用少量的除去用溶液S 也足夠，且能夠發(fā)揮充分的抑制物質(zhì)A量的降低效果。另外，使用丙酮、甲乙酮作為有效成分時，本發(fā)明的除去用溶液S的水溶性有機溶 劑濃度優(yōu)選為30%以上，更優(yōu)選為60%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為80%以上。此外，本發(fā)明中使用的水溶性有機溶劑可以只含有1種水溶性有機溶劑，也可以 是2種以上的水溶性有機溶劑的混合溶液。例如，可以是2種以上的醇的混合溶液，也可以 是醇和其他種類的水溶性有機溶劑的混合溶液。進(jìn)而，從能夠更加改善抑制物質(zhì)A量的降 低效率和核酸回收效率方面來看，也優(yōu)選為醇和丙酮的混合溶液。采集的糞便中所添加的除去用溶液S的體積沒有特別限定，但糞便與除去用溶液 S的混合比率優(yōu)選為，設(shè)糞便體積為1時，相對于該1，除去用溶液S的體積為1以上。這是 由于，向裝有除去用溶液S的糞便采集容器中加入糞便時，如果使用與糞便等量以上的除 去用溶液S，則可使糞便完全浸泡于除去用溶液S中，能夠有效地獲得本發(fā)明的效果。例如， 糞便與除去用溶液S等量時，能夠使裝有除去用溶液S的糞便采集容器輕量化和小型化。 另一方面，通過添加相對于糞便為5倍以上體積的除去用溶液S，能夠迅速并且有效地進(jìn)行 糞便向除去用溶液S中的分散。進(jìn)而，通過使用該體積的除去用溶液S，還可以抑制糞便中 含有的水分所導(dǎo)致的水溶性有機溶劑濃度的降低。為了使裝有除去用溶液S的糞便采集容 器的輕量化和糞便分散性的提高這兩方面效果取得較好的平衡，更優(yōu)選糞便與除去用溶液 S的混合比率為1 1 1 20，進(jìn)一步優(yōu)選為1 3 1 10，更優(yōu)選為1 5左右。另外，供于本發(fā)明的核酸回收方法的糞便只要為動物的糞便，則沒有特別限定，但 優(yōu)選為哺乳動物來源的糞便，更優(yōu)選為人來源的糞便。例如，優(yōu)選為了定期體檢或診斷等而 采集的人的糞便，但也可以是家畜或野生動物等的糞便。另外，作為試樣的糞便可以是采集 后保存了一定時間的糞便，但優(yōu)選剛采集后的糞便。進(jìn)而，采集的糞便優(yōu)選為剛排泄后的糞 便，但也可以是排泄后經(jīng)過一段時間的糞便。供于本發(fā)明的核酸回收方法的糞便的量沒有特別限定，但優(yōu)選為IOmg Ig的范 圍。糞便量過多時，采集操作費工夫，糞便采集容器也變大，因此處理性等可能會降低。相 反糞便量過于少量時，糞便中所含的從大腸脫落的細(xì)胞等哺乳動物細(xì)胞數(shù)變得過少，因此 無法回收所需的核酸量，目標(biāo)核酸分析的精度可能會降低。另外，由于糞便是不均質(zhì)的，即 各種各樣的成分不均勻地存在，因此為了避免哺乳動物細(xì)胞的存在于局部的影響，優(yōu)選在 采集糞便時從糞便的多個不同部位采集。
除去用溶液S可以通過適當(dāng)稀釋水溶性有機溶劑并將其調(diào)整至所期望的濃度從 而得到。用于稀釋的溶劑沒有特別限定，優(yōu)選為水或PBS等緩沖液。另外，只要不損害水溶 性有機溶劑成分所帶來的抑制物質(zhì)A量的降低效果，除去用溶液S中除水溶性有機溶劑以 外還可以含有任意的成分。例如，可以含有離液序列高的鹽，也可以含有表面活性劑。通過 含有離液序列高的鹽或表面活性劑，從而能更有效地抑制糞便中的細(xì)胞活性和各種分解酶 的酶活性。作為除去用溶液S中所含的離液序列高的鹽，例如有鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化 鈉、高氯酸鈉和三氯醋酸鈉等。作為除去用溶液S中所含的表面活性劑，優(yōu)選為非離子性表 面活性劑。作為該非離子性表面活性劑，例如有TweenSO、CHAPS (3_[3_膽酰胺丙基二甲氨 基]-1-丙磺酸內(nèi)鹽)、Triton X-100、Tween20等。離液序列高的鹽和表面活性劑的種類 和濃度，只要是能夠獲得抑制物質(zhì)A量的降低效果的濃度，則沒有特別限定，可以考慮糞便 量、之后的工序和分析方法等而適當(dāng)決定。此外，除去用溶液S中可添加適當(dāng)著色劑。通過對除去用溶液S著色，可以獲得防 止誤吞、減輕糞便顏色等效果。作為該著色劑，優(yōu)選用作食品添加劑的著色料，優(yōu)選藍(lán)色或 綠色等?？闪信e出如堅牢綠FCF (綠色3號)、亮藍(lán)FCF (藍(lán)色1號)、靛藍(lán)胭脂紅(藍(lán)色2 號)等。另外，可以混合添加多種著色劑，也可以單獨添加。在除去用溶液S中添加糞便后，通過使糞便與除去用溶液S混合，能夠獲得更好的 抑制物質(zhì)A量的降低效果。優(yōu)選糞便與除去用溶液S的混合能夠充分進(jìn)行、并且糞便采集 者能夠簡便進(jìn)行的方法。這是由于，通過將糞便充分地分散于除去用溶液S中，能夠使水 溶性有機溶劑成分充分地滲透到糞便中，并且能夠使糞便中的抑制物質(zhì)A充分地溶出到除 去用溶液S中。另外，混合糞便與除去用溶液S的方法只要是通過物理方法進(jìn)行混合的方 法，則沒有特別限定。例如，可以通過向預(yù)先裝有除去用溶液S的可密閉的容器中投入采集 的糞便，密閉后，將該容器上下顛倒而進(jìn)行混合，也可以通過將該容器置于旋渦混合器等震 蕩器上進(jìn)行混合。另外，還可以將糞便與除去用溶液S在混合用顆粒的存在下進(jìn)行混合。 為了迅速并且充分地進(jìn)行混合，該混合方法優(yōu)選使用震蕩器的方法和使用混合用顆粒的方 法。特別是，通過使用預(yù)先含有混合用顆粒的糞便采集容器，從而在家庭等沒有特殊裝置的 環(huán)境中也能夠簡便并且充分地進(jìn)行混合。作為混合用顆粒，只要是不損害水溶性有機溶劑成分所帶來的抑制物質(zhì)A量的降 低效果的組合物，并且具有通過與糞便碰撞從而能夠迅速并且充分地將糞便分散至除去用 溶液S中的硬度和比重的顆粒，則沒有特別限定。進(jìn)而，混合用顆?？梢允怯?種材質(zhì)形成 的顆粒，也可以是由2種以上的材質(zhì)形成的顆粒。作為這樣的混合用顆粒，例如有由玻璃、 陶瓷、塑料、膠乳、金屬等形成的顆粒。此外，混合用顆?？梢允谴判灶w粒，也可以是非磁性 顆粒。將糞便添加到除去用溶液S中，處于使糞便浸泡于除去用溶液S中的狀態(tài)，從而能 夠發(fā)揮抑制物質(zhì)A量的降低效果。因此，不一定需要在添加到糞便除去用溶液S中之后迅速使糞便與除去用溶液S 混合。還可以處于使糞便浸泡于除去用溶液S中的狀態(tài)，從而在保存時運輸?shù)那闆r下利用 該運輸中的振動而混合。像這樣，為了使抑制物質(zhì)A從糞便中溶出，將使糞便浸泡于除去用溶液S中而得到的糞便試樣保存規(guī)定的時間。保存糞便試樣的時間只要是能夠發(fā)揮抑制物質(zhì)A量的降低效 果的時間，則沒有特別限定，可以考慮水溶性有機溶劑的種類和濃度、糞便與除去用溶液S 的混合比、保存溫度等而適當(dāng)決定。本發(fā)明的核酸回收方法中，該糞便試樣的保存時間優(yōu)選 保存1小時以上，更優(yōu)選保存12小時以上，進(jìn)一步優(yōu)選保存M小時以上，特別優(yōu)選保存72 小時以上。另外，還可以保存168小時以上。例如，通過將該糞便試樣至少保存1小時以上， 從而使溶出的抑制物質(zhì)A的量達(dá)到如下程度在通常的PCR反應(yīng)條件下能夠充分抑制糞便 中抑制物質(zhì)A的殘留所導(dǎo)致的影響。關(guān)于水溶性有機溶劑所帶來的抑制物質(zhì)A量的降低效果，保存糞便試樣的溫度為 低溫時，不如溫度高時更能獲得好的效果。具體而言，本發(fā)明中，工序(A)中的糞便試樣的 保存溫度優(yōu)選為4°C以上，更優(yōu)選為20°C以上。但是，優(yōu)選在保存溫度50°C以下進(jìn)行保存。 其原因是，通過在50°C以上的高溫條件下長時間保存，該糞便試樣中的水溶性有機溶劑的 濃度可能會由于揮發(fā)等而低于發(fā)揮抑制物質(zhì)A量的降低效果所需的充分的濃度。本發(fā)明的核酸回收方法中，糞便試樣的保存溫度只要為4°C以上即可發(fā)揮抑制物 質(zhì)A量的降低效果。S卩，工序(A)中的保存可以使用恒溫裝置等在溫度被控制的環(huán)境下進(jìn) 行，但也可以不需要溫度被控制的特殊的環(huán)境，而在室溫下進(jìn)行。另外，還可以在通常進(jìn)行 糞便的采集或糞便試樣的運輸?shù)鹊臏囟认逻M(jìn)行。因此，例如，即使在溫度非控制下運輸工序 (A)中調(diào)制的糞便試樣時，也可將該運輸期間作為保存期間。更具體而言，在像定期體檢等 情況下，糞便采集者調(diào)制糞便試樣的場所和進(jìn)行核酸提取操作的場所是分開的，將調(diào)制的 糞便試樣運輸?shù)竭M(jìn)行核酸提取操作的場所時，只要運輸時的溫度為4 50°C，則無論有無 溫度控制，都可將該運輸時間作為工序(A)中的保存時間。為了減少從糞便回收的核酸中的抑制物質(zhì)A的量，還可以在提取核酸后進(jìn)行抑制 物質(zhì)A的溶出除去操作。然而，進(jìn)行臨床上的待測物的檢查時，這種檢查工序的增加直接關(guān) 系到人事費用的增加。相對于此，使用本發(fā)明的核酸回收方法時，可以在檢查場所進(jìn)行的檢查工序之前 進(jìn)行如下工序糞便采集者在采集糞便后直接將糞便浸泡于除去用溶液S中，溶出除去抑 制物質(zhì)。因此，本發(fā)明的核酸回收方法可期待削減臨床檢查等中的成本。另外，如上所述，糞便中的核酸非常容易分解。因此，通常調(diào)制糞便試樣后，迅速地 供于核酸回收、分析工序中。另外，糞便試樣調(diào)制時和核酸回收、分析時的時間間隔較長的 情況下，為了抑制核酸分解的進(jìn)行，而在冷凍、冷藏等低溫環(huán)境下保存糞便試樣。然而，本發(fā) 明的核酸回收方法中，調(diào)制糞便試樣后，即使在室溫等溫度比較高的環(huán)境下長時間保存時 也能夠非常有效地從該糞便試樣中回收核酸。這是由于，通過使糞便與水溶性有機溶劑混 合，從而防止糞便中所含的核酸的分解等并穩(wěn)定地保持核酸，推測水溶性有機溶劑所帶來 的這種高效地回收核酸、即防止核酸的分解等、穩(wěn)定地保持并有效地回收核酸這一效果，是 由于以下的原因而得到的(1)由于水溶性有機溶劑成分具有的脫水作用，哺乳動物細(xì)胞或病毒等具有作為 檢測對象的核酸的常居腸細(xì)菌以外的生物的細(xì)胞被活化；(2)由于常居腸細(xì)菌的細(xì)胞活性顯著降低，并且經(jīng)時的變化被抑制；(3)由于水溶性有機溶劑成分具有的蛋白質(zhì)變性作用，糞便中的蛋白酶、DNase, RNase等各種分解酶的活性顯著降低。
S卩，本發(fā)明的核酸回收方法中，為了調(diào)制糞便試樣，使用以水溶性有機溶劑為有效 成分的除去用溶液S。因此，即使在為了溶出抑制物質(zhì)A而將調(diào)制的糞便試樣保存充分的 時間的情況下，也能在糞便試樣的保存期間抑制糞便試樣中核酸的分解并穩(wěn)定地保持該核 酸。因此，能夠在之后的工序(C)中非常有效地回收核酸。糞便中所含的抑制物質(zhì)A在除去用溶液S中優(yōu)先被溶出，但在除去用溶液S中的 溶解性較低的核酸殘留于糞便來源的固體成分中。因此，在工序(A)之后，作為工序(B)，從 糞便試樣中除去除去用溶液S并回收糞便來源的固體成分。然后，作為工序(C)，從回收的 糞便來源的固體成分中回收核酸，從而能夠回收抑制物質(zhì)A的含量較低的高純度的核酸。工序(B)中的將除去用溶液S從糞便試樣中除去的方法，可以從分離液體成分和 固體成分時通常所使用的分離方法中適當(dāng)選擇而進(jìn)行。該分離方法只要是不損害糞便試樣 中的核酸，能夠?qū)⒓S便試樣的液體成分即除去用溶液S連同溶出的抑制物質(zhì)A—起從固體 成分即糞便來源的固體成分中分離的方法，則沒有特別限定。例如，可以通過離心分離法除 去上清、回收作為沉淀的糞便來源的固體成分，也可以利用過濾法對糞便試樣進(jìn)行過濾器 過濾、回收殘留在過濾面上的糞便來源的固體成分。本發(fā)明中特別優(yōu)選離心分離法。工序(C)中的核酸回收方法沒有特別限定，只要是從試樣中回收核酸時通常采用 的方法，則可以通過任意方法進(jìn)行。從糞便來源的固體成分中回收的核酸既可以是DNA，可 以是RNA，也可以是DNA和RNA這兩者。糞便來源的固體成分中主要含有哺乳動物細(xì)胞等常居腸細(xì)菌以外的生物(以下， 稱為哺乳動物細(xì)胞)來源的核酸、和常居腸細(xì)菌來源的核酸。從糞便來源的固體成分中回 收核酸時，可以分別回收哺乳動物細(xì)胞來源的核酸和常居腸細(xì)菌細(xì)胞來源的核酸，但特別 優(yōu)選同時回收。通過同時回收哺乳動物細(xì)胞來源的核酸和常居腸細(xì)菌來源的核酸，從而糞 便中大量存在的常居腸細(xì)菌來源的核酸作為載體發(fā)揮功能。其結(jié)果，與預(yù)先從糞便中分離 哺乳動物細(xì)胞等后回收核酸相比，對于量較少的哺乳動物細(xì)胞來源的核酸能夠更有效地回 收核酸。例如，作為工序(a)，使糞便來源的固體成分中的蛋白質(zhì)變性，使核酸從上述糞便 來源的固體成分中的哺乳動物細(xì)胞等和常居腸細(xì)菌中溶出，然后作為工序(b)，回收溶出的 核酸，從而能夠從糞便來源的固體成分中同時回收哺乳動物細(xì)胞來源的核酸和常居腸細(xì)菌 來源的核酸。工序(a)中的糞便來源的固體成分中的蛋白質(zhì)的變性可以通過公知的方法進(jìn)行。 例如，通過向糞便來源的固體成分中添加離液序列高的鹽、有機溶劑、表面活性劑等通常用 作蛋白質(zhì)變性劑的化合物，能夠使糞便來源的固體成分中的蛋白質(zhì)變性。工序(a)中，作為 添加到糞便來源的固體成分中的離液序列高的鹽或表面活性劑，可以使用與作為添加到除 去用溶液S中的離液序列高的鹽和表面活性劑而列舉的物質(zhì)同樣的物質(zhì)。作為有機溶劑， 優(yōu)選為酚類。酚類可以為中性，也可以為酸性。使用酸性的酚類時，能夠選擇性地將RNA優(yōu) 先于DNA提取至水層中。另外，工序(a)中，向糞便來源的固體成分中添加離液序列高的鹽、 有機溶劑、表面活性劑等時，可以添加1種化合物，也可以添加2種以上的化合物。也可以在工序(a)和工序(b)之間設(shè)置工序(C)，除去通過工序(a)而變性的蛋白 質(zhì)。通過在回收核酸之前預(yù)先除去變性的蛋白質(zhì)，能夠提高回收的核酸的質(zhì)量。工序(C) 中的蛋白質(zhì)的除去可以通過公知的方法進(jìn)行。例如，通過離心分離使變性蛋白質(zhì)沉淀并僅
15回收上清，能夠除去變性蛋白質(zhì)。另外，也可以添加氯仿，通過旋渦混合器等充分?jǐn)嚢杌旌?后進(jìn)行離心分離，使變性蛋白質(zhì)沉淀并僅回收上清。由此，與僅進(jìn)行離心分離相比，能夠更 完全地除去變性蛋白質(zhì)。工序(b)中溶出的核酸的回收可以通過乙醇沉淀法或氯化銫超速離心法等公知 的方法進(jìn)行。作為回收方法的例子，可列舉出以下的工序(bl)和工序( )。作為工序(bl)， 使工序(a)中溶出的核酸吸附于無機支撐體上。然后，作為工序0^2)，使工序(bl)中吸附 的核酸從無機支撐體上溶出。由此，能夠回收核酸。工序(bl)中使用的無機支撐體可以使 用能吸附核酸的公知的無機支撐體。另外，該無機支撐體的形狀也沒有特別限定，可以為顆 粒狀，也可以為膜狀。作為該無機支撐體，例如有硅膠、硅基氧化物、玻璃、硅藻土等含二氧 化硅的顆粒(珠子)，或尼龍、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、硝基纖維素等的多孔質(zhì)膜等。工序( )中使用的溶劑可考慮回收的核酸的種類與之后的核酸分析方法等而適 當(dāng)使用通常用于使核酸從這些公知的無機支撐體溶出的溶劑。例如，作為該溶出用溶劑，特 別優(yōu)選純化水。另外，優(yōu)選在工序(bl)之后、工序( )之前，使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液對吸 附有核酸的無機支撐體進(jìn)行洗滌。使用含有用于從哺乳動物細(xì)胞等中溶出核酸的充分濃度的離液序列高的鹽或表 面活性劑的除去用溶液S來調(diào)制糞便來源的固體成分時，工序(C)中從糞便來源的固體成 分回收核酸時，也可以省略工序(a)?？梢韵蚬ば?B)中回收的糞便來源的固體成分中直接添加離液序列高的鹽等蛋 白質(zhì)變性劑，但優(yōu)選暫時懸浮到適當(dāng)?shù)娜艹鲇盟巹┲泻笤偬砑拥鞍踪|(zhì)變性劑?；厥誅NA時， 作為該溶出用藥劑，例如可以使用磷酸緩沖液或tris緩沖液等。優(yōu)選通過高壓蒸汽滅菌等 使DNase失活的藥劑，進(jìn)而更優(yōu)選含有蛋白酶K等蛋白質(zhì)水解酶的藥劑。另一方面，回收 RNA時，作為該溶出用藥劑，例如可以使用檸檬酸緩沖液等。然而，由于RNA是非常容易分解 的物質(zhì)，因此優(yōu)選使用含有硫氰酸胍或鹽酸胍等RNase抑制劑的緩沖液。另外，也可以在工 序(C)之前，預(yù)先用PBS (磷酸緩沖生理鹽水、pH7. 4)等適當(dāng)?shù)木彌_液對工序(B)中回收的 糞便來源的固體成分進(jìn)行洗滌。根據(jù)之后的分析方法的不同，也可以不從糞便來源的固體成分中提取并純化核 酸，而僅在糞便來源的固體成分中添加并混合適當(dāng)?shù)娜艹鲇盟巹?，從糞便來源的固體成分 中溶出核酸，從而能夠回收核酸。例如，糞便試樣中存在大量病原菌等時，對這些病原菌來 源的核酸進(jìn)行分析時，從糞便試樣中僅回收固形成分后，添加并混合含有蛋白酶K等蛋白 水解酶的PBS等溶出用藥劑。將由此得到的均勻的糞便試樣溶液直接用于核酸分析，從而 能夠檢測病原菌來源的基因等。此外，從糞便來源的固體成分中回收核酸也可以使用核酸 提取試劑盒、病毒檢測試劑盒等市售的試劑盒來進(jìn)行。本發(fā)明的核酸回收方法中，可以使將采集的糞便浸泡于以水溶性有機溶劑為有效 成分的除去用溶液S中保存規(guī)定時間的工序分配到保存或運輸時間中。因此，通過使用本 發(fā)明的核酸回收方法從采集的糞便中回收核酸，從而像診察等篩選檢查那樣，從糞便采集 后到核酸分析時為止有一段間隔時，或者糞便采集場所與核酸分析場所分開時，也能夠穩(wěn) 定地保持核酸。另外，與此同時，能夠邊使抑制物質(zhì)A溶出邊保存或運輸糞便試樣。此外， 不需要非得設(shè)定用于冷藏或冷凍的特殊的機器或保存溫度條件，而能夠簡便地使糞便試樣 中的抑制物質(zhì)A溶出。
關(guān)于本發(fā)明的核酸回收方法中的工序(B)，例如，可通過使用含有溶液除去機構(gòu)的 處理裝置從而簡便并且迅速地進(jìn)行，該溶液除去機構(gòu)用于從糞便試樣中除去作為液體成分 的除去用溶液S。這種溶液除去機構(gòu)只要是通常能夠分離固體成分和液體成分的固液分離 機構(gòu)，則沒有特別限定，優(yōu)選為離心分離機構(gòu)。另外，只要是具備用于抽吸除去由離心分離 機構(gòu)分離的上清的溶液抽吸排出機構(gòu)和廢液回收部的裝置，則能夠?qū)Χ鄠€糞便試樣自動進(jìn) 行工序(B)。作為溶液抽吸排出機構(gòu)，優(yōu)選為從前端的噴嘴抽吸上清的溶液抽吸排出噴嘴。 作為這種溶液抽吸排出噴嘴，可列舉出如電動移液管等。具有作為溶液抽吸排出機構(gòu)的溶液抽吸排出噴嘴的裝置，其進(jìn)一步具備洗滌溶液 抽吸排出噴嘴的機構(gòu)時，從多個糞便試樣中抽吸除去上清時，能夠針對每個糞便試樣洗滌 溶液抽吸排出噴嘴，因而能夠避免外部的雜菌等混入(污染)糞便試樣中。另外，溶液抽吸 排出噴嘴的前端部為能夠裝卸的尖部等時，例如，通過具有廣泛使用的尖部安裝和卸載裝 置，針對每個糞便試樣能夠自動地替換尖部等，從而即使在不具備溶液抽吸排出噴嘴洗滌 機構(gòu)的情況下，也能夠避免對糞便試樣的污染。圖1為表示本發(fā)明的核酸回收方法中用于自動進(jìn)行工序(B)的糞便試樣處理裝置 的一個實施方式的圖。本實施方式的糞便試樣處理裝置101具有離心分離機構(gòu)102、用于抽 吸除去由離心分離機構(gòu)102分離的上清的溶液抽吸排出噴嘴103、廢液回收部104和溶液抽 吸排出噴嘴洗滌機構(gòu)105。首先，將采集的糞便浸泡于糞便采集容器內(nèi)的除去用溶液S中并 保存規(guī)定的時間。將糞便試樣以糞便采集容器的蓋打開的狀態(tài)設(shè)置于該糞便試樣處理裝置 101的離心分離機構(gòu)102中。此時，可一次性設(shè)置多個糞便試樣進(jìn)行離心分離。然后，使溶 液抽吸排出噴嘴103的前端與離心分離后的糞便試樣的上清接觸，從糞便采集容器中抽吸 并除去上清。將由溶液抽吸排出噴嘴103抽吸的上清廢棄于廢液回收部104中，然后通過 溶液抽吸排出噴嘴洗滌機構(gòu)105洗滌溶液抽吸排出噴嘴中接觸了上清的部位。洗滌后以同 樣的方式從另外的糞便試樣中抽吸除去上清。像這樣，通過使用具備圖1所示機構(gòu)的糞便 試樣處理裝置，從同時經(jīng)離心分離處理處理過的多個糞便試樣中依次抽吸除去上清，能夠 自動進(jìn)行工序(B)0利用本發(fā)明的核酸回收方法能夠有效地回收顯著降低了膽汁酸等抑制物質(zhì)A的 殘留的、高純度的核酸。因此，可期待通過對使用本發(fā)明的核酸回收方法回收的核酸進(jìn)行分 析而得到可靠性高的分析結(jié)果。因此，利用本發(fā)明的核酸回收方法回收的核酸可供于各種 各樣的核酸分析。特別是，不僅非常適用于糞便中大量存在的常居腸細(xì)菌來源的核酸的分 析，還非常適用于糞便中僅少量含有的常居腸細(xì)菌以外的生物來源的核酸的分析。另外，本發(fā)明的核酸回收方法的工序(C)中，同時回收哺乳動物細(xì)胞等常居腸細(xì) 菌以外的生物來源的核酸和常居腸細(xì)菌來源的核酸時，能夠非常有效且高純度地回收遠(yuǎn)比 常居腸細(xì)菌來源的核酸微量的哺乳動物細(xì)胞來源的核酸。因此，通過使用這樣回收的核酸 進(jìn)行核酸分析，能夠高靈敏度且高精度地檢測結(jié)腸癌等特定的疾病標(biāo)記物。作為這種常居腸細(xì)菌以外的生物來源的核酸，例如，有癌細(xì)胞來源的核酸等哺乳 動物細(xì)胞來源的核酸、肝炎病毒等感染癥的初期或后期的該感染癥的致病菌來源的核酸 等。此外，也可以是寄生蟲來源的核酸。特別是，由于是從糞便中回收的核酸，因此利用本 發(fā)明的核酸回收方法回收的核酸優(yōu)選供于大腸、小腸、胃等消化道細(xì)胞來源的核酸的分析， 但更優(yōu)選供于從大腸脫落的細(xì)胞來源的核酸的分析。
另外，本發(fā)明中，常居腸細(xì)菌是糞便中比較大量存在的細(xì)菌細(xì)胞，意味著通常棲 息在人等動物的腸內(nèi)的常居菌。作為該常居腸細(xì)菌，例如有擬桿菌屬(Bacteroides)、真 桿菌屬(Eubacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium) 等專性厭氧菌，埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、檸檬酸桿菌屬(CitrcAacter)、腸球菌屬(Enterococcus)等兼性厭氧菌等。另外，由本發(fā)明的核酸回收方法回收的核酸也適用于對早期發(fā)現(xiàn)和精確性的要求 較強烈的、用于調(diào)查有無癌的發(fā)病或罹患感染癥的核酸分析。另外，還優(yōu)選供于用于調(diào)查有 無結(jié)腸炎、腸炎、胃炎、胰腺炎等炎癥性疾病的發(fā)病的核酸分析。此外，還可以供于息肉等隆 起性病變的檢查或胃潰瘍等大腸、小腸、胃、肝臟、膽囊、膽管的疾病的檢查。例如，通過使用由本發(fā)明的核酸回收方法回收的核酸來檢測并分析癌細(xì)胞來源的 核酸、即發(fā)生突變等的核酸，能夠檢查有無結(jié)腸癌或胰腺癌等癌癥的發(fā)病。另外，通過調(diào)查 是否能檢測到作為感染癥等原因的病原菌來源的核酸、例如病毒來源的核酸或寄生蟲來源 的核酸等，能夠調(diào)查有無感染癥的罹患或有無寄生蟲的存在。特別是，通過使用由本發(fā)明 的核酸回收方法回收的核酸來檢測甲型、戊型肝炎病毒等被排到糞便中的病原菌來源的核 酸，能夠非侵入性并且簡便地進(jìn)行感染癥檢查。此外，通過調(diào)查是否能檢測到常居腸細(xì)菌 以外的病原細(xì)菌、例如腸道出血性大腸桿菌0-157等引起食物中毒的菌或病原菌來源的核 酸，能夠調(diào)查有無細(xì)菌感染癥的罹患。特別優(yōu)選通過核酸分析來檢測指示致瘤性轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物和指示炎癥性消化器官 疾病的標(biāo)記物。作為該指示致瘤性轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物，例如有癌胚抗原(CEA)、唾液酸Tn抗原 (STN)等公知的癌標(biāo)記物，或APC基因、p53基因、K-ras基因等中有無突變等。另外，pl6、 hMLHI、MGMT、ρ 14、APC、E-鈣黏蛋白、ESRl、SFRP2等基因的甲基化的檢測作為大腸疾病的診 斷標(biāo)記物也是有用的(例如，參照Lind et al.、“A CpG island hypermethyIation profile of primary colorectal carcinomas andcolon cancer cell lines，，、Molecular Cancer> 2004年、第3卷第觀章)。此外，已經(jīng)報道了糞便試樣中的幽門螺旋桿菌來源的DNA被用 作胃癌標(biāo)記物(例如參照 Nilsson et al.、Journal of ClinicalMicrobiology、2004 年、 第42卷第8號、第3781 8頁)。另一方面，作為指示炎癥性消化器官疾病的標(biāo)記物，例如 有Cox-2基因來源的核酸等。本發(fā)明的從糞便試樣中回收的核酸可以采用公知的核酸分析方法進(jìn)行分析。作為 該核酸分析方法，例如有使用PCR等來檢測特定的堿基序列區(qū)域的方法和對核酸進(jìn)行定量 的方法等。例如，通過檢測編碼癌基因等的堿基序列區(qū)域、和含有小隨體的堿基序列區(qū)域等 有無基因突變，能夠調(diào)查有無癌癥的發(fā)病。使用從糞便試樣中回收的DNA時，能夠檢測例如 DNA上的甲基化、堿基的插入、缺失、置換、重復(fù)、或倒置等突變。此外，回收RNA時，通過逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)(RT =Reverse transcription)合成cDNA后，可將該cDNA與DNA同樣地用于擴增分 析中。使用回收的RNA時，能夠檢測例如RNA上的堿基的插入、缺失、置換、重復(fù)、倒置、或剪 接變體(isoforms)等突變。另外，還可以檢測RNA表達(dá)量。特別優(yōu)選進(jìn)行mRNA的表達(dá)分 析、K-ras基因的突變分析、以及DNA的甲基化分析等。另外，這些分析可以通過該領(lǐng)域中 公知的方法進(jìn)行。另外，也可以使用K-ras基因突變分析試劑盒、甲基化檢測試劑盒等市售 的分析試劑盒。本發(fā)明通過將糞便采集到預(yù)先含有除去用溶液S的糞便采集容器中，能夠更簡便且迅速地調(diào)制采集的糞便。另外，通過使用本發(fā)明的具有除去用溶液S與含有除去用溶液 S的糞便采集容器的糞便采集用試劑盒，能夠更簡便地進(jìn)行本發(fā)明的核酸回收方法。另外， 該糞便采集用試劑盒中還可以適當(dāng)具有糞便采集棒等除除去用溶液S與含有其的糞便采 集容器以外的組成物。本發(fā)明中使用的糞便采集容器的形態(tài)和大小等沒有特別限定，可以使用能夠收納 溶劑的公知的糞便采集容器。為了處理簡便，優(yōu)選糞便采集容器的蓋和糞便采集棒一體化 的糞便采集容器。另外，為了能夠控制糞便采集量，更優(yōu)選糞便采集棒能夠采集一定量的糞 便的糞便采集容器。作為這種公知的糞便采集容器，例如有日本特公平6-7觀37號公報中 公開的糞便采集容器等。圖2和圖3是分別表示本發(fā)明的糞便采集用試劑盒中能夠使用的糞便采集容器A 和B的一個實施方式的圖。另外，本發(fā)明的糞便采集用試劑盒中能夠使用的糞便采集容器 不限定于這些糞便采集容器。首先對圖2的糞便采集容器進(jìn)行說明。本實施方式的糞便采集容器A具有與糞便 采集棒3 —體化的蓋2和容器本體1，容器本體1的內(nèi)部含有除去用溶液S。糞便采集棒3 的前端有能夠采集一定量糞便的杯3a，在該杯3a的底部布有網(wǎng)作為篩子。另一方面，容器 本體1的底部有與杯3a的形狀大致相同的、并與杯3a的形狀重合的隆起部la。通過將杯 3a嵌合到隆起部Ia中，使得杯3a中采集的糞便能夠從杯3a的底部布的網(wǎng)中擠出，因此能 夠?qū)⒓S便迅速地分散于除去用溶液S中。圖3所述的糞便采集容器具有與前端尖銳的糞便采集棒13 —體化的蓋12和容器 本體11，是容器本體11內(nèi)部具有含有除去用溶液S的密封袋15的糞便采集容器B。在糞 便采集棒13的前端側(cè)空出能夠采集一定量糞便E的孔13a。另外，作為孔13a的蓋的可動 蓋1 通過在糞便采集棒13上滑動而連接在糞便采集棒13的兩側(cè)部。以下對本糞便采集 容器B的使用方法的一個實施方式進(jìn)行說明。首先，如圖3的a所示，首先，將糞便采集棒13上的可動蓋1 推離孔13a而靠近 蓋12側(cè)，使孔13a處于完全開口的狀態(tài)，將糞便采集棒13壓入糞便E中。于是如圖3的b 所示，糞便E被填充至孔13a中。在該狀態(tài)下，通過將可動蓋1 滑動至糞便采集棒13的 前端側(cè)而蓋住孔13a，從而將多余的糞便E分離，因此能夠準(zhǔn)確地采集孔13a的容積量的糞 便E (圖3的c)。然后，使可動蓋13b回到原來的位置使孔13a處于完全開口的狀態(tài)(圖3 的d)，然后將蓋12收納至容器本體11中(圖3的e)。在糞便采集棒13被收納至容器本 體11中時，糞便采集棒13的尖銳的前端扎破含有除去用溶液S的袋15，從而容器本體11 被除去用溶液S充滿至含有糞便E的孔13a以上的水位，糞便E與除去用溶液S直接接觸 (圖3的f)。此時，容器本體11被蓋12密封，因此除去用溶液S不會漏出。然后，通過搬 運等而移動容器本體11，從而將容器11內(nèi)部的除去用溶液S與糞便E混合。這樣的糞便采 集容器B由于將糞便采集棒13插入容器中之后溶液才開始填滿容器中，因此即使使用像甲 醇那樣對人體有害的除去用溶液S時，也能夠避免因溶液漏出而導(dǎo)致的事故，在家庭中也 能夠安全處理。實施例接著，示出實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地說明，但本發(fā)明不限定于以下的實施例。 另外，沒有特別記載時，“％”意味著“體積％ ”。此外，MKN45細(xì)胞和SW1116細(xì)胞使用由常
19規(guī)方法培養(yǎng)的細(xì)胞。[實施例1]測定存在于通過本發(fā)明的核酸回收方法從糞便中回收的RNA溶液中的膽汁酸量。分別各取Ig采自于1名健康人的糞便至7支15mL的聚丙烯管中。分取之后，在 不添加乙醇的情況下迅速對其中1支迅速進(jìn)行RNA提取操作。具體而言，添加并混合酚類 混合物“Trizol” (Invitorogen公司制)，然后添加并混合氯仿，進(jìn)行離心分離處理。通過 該離心分離處理而分離上清(水層)。向該分離的上清中添加醋酸鈉和乙醇并攪拌。然后， 對該溶液進(jìn)行離心分離處理，除去上清即乙醇，得到沉淀。將該沉淀在室溫下風(fēng)干并溶解于 DEPC處理過的水中，得到100 μ L的RNA溶液(IA)。分取之后，迅速對剩下的6支糞便添加IOmL的99. 5%乙醇溶液(除去用溶液S)， 然后在20°C下靜置12分鐘(1B)、1小時(IC)、12小時(ID)、M小時(1E)、72小時(IF)、168 小時(IG)而保存這些糞便試樣。經(jīng)過各保存時間后，立刻進(jìn)行離心，除去上清即乙醇(除 去用溶液幻，得到糞便來源的固體成分。然后，對得到的糞便來源的固體成分與(IA)同樣 地進(jìn)行RNA提取操作，得到各100 μ L的RNA溶液。向得到的各RNA溶液中添加十七烷酸(C17:0)和23去甲脫氧膽酸Q3N-DCA)作 為內(nèi)標(biāo)，用醚提取。接著，通過對膽汁酸的羧基丁基化而制得丁酯。另外，通過對膽汁酸的 羥基乙酰化而制得醋酸酯，制得丁基 乙酰基衍生物。使用0V-1701 (GLsci ence公司制) 利用GCMS-QP5050系統(tǒng)(島津制作所制)對生成的丁基·乙?；苌镞M(jìn)行氣相色譜分析， 測定RNA溶液中殘留的膽汁酸量。圖4為表示測定結(jié)果所得到的每100 μ L所提取的RNA溶液中的膽汁酸量的圖。由 這些結(jié)果可知，通過將糞便試樣在除去用溶液S中浸泡(保存)1小時以上，能夠充分除去 作為抑制物質(zhì)A的膽汁酸。進(jìn)而，在1小時至對小時之間，能夠急劇地除去膽汁酸。另外， 糞便試樣在除去用溶液S中的浸泡時間超過72小時的試樣幾乎看不到除去效率的變化。[實施例2]確認(rèn)由膽汁酸導(dǎo)致的RT-PCR的反應(yīng)抑制。具體而言，以從培養(yǎng)細(xì)胞ΜΚΝ45細(xì)胞所 回收的RNA作為模板，向擴增GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)mRNA的一步實時(Oneltep real time)RT-P CR的反應(yīng)液中添加膽汁酸的主要成分即脫氧膽酸鈉的稀釋系列，確認(rèn)由 脫氧膽酸鈉導(dǎo)致的抑制條件。邊按照一步法I^rime Script RT-PCR試劑盒(TaKaRa)的說明書邊混合各試劑， 向反應(yīng)液中添加脫氧膽酸鈉，使脫氧膽酸鈉的最終濃度為0、1、2、4、10、15、20 μ g/25 μ L，進(jìn) 行42°C 5分鐘、95°C 10秒鐘的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后，將由95°C 5秒鐘、60°C 30秒鐘構(gòu)成的 反應(yīng)條件重復(fù)40個循環(huán)來進(jìn)行PCR。此時，使用TaqMan基因表達(dá)分析(Gene Expression Assays)、庫存Qnventoried)的GAPDH檢測用TaqMan引物和探針。通過 ABI Prism 7700 序列檢測系統(tǒng)(S equence Detection System) (Applied Biosystems公司制)分析調(diào)制的試劑，確認(rèn)TaqMan PCR的擴增效率。由已知濃度的質(zhì)粒 DNA所示的CT值算出拷貝數(shù)，由由此得到的初期核酸量的推測值的降低程度進(jìn)行抑制的評 價。圖5為表示以脫氧膽酸鈉濃度為橫軸、GAPDH擴增量為縱軸的測定結(jié)果的圖。由 這些結(jié)果可確認(rèn)到，當(dāng)反應(yīng)體系內(nèi)含有的脫氧膽酸鈉的濃度增加至4μ g/25 μ L以上時，可確認(rèn)到抑制物質(zhì)A所導(dǎo)致的核酸擴增反應(yīng)的抑制。在此，以5μ L在實施例1的條件下所得到的RNA為模板，使反應(yīng)體系為25 μ L 而進(jìn)行RT-PCR。此時，使用保存時間為1小時的RNA(IC)時，反應(yīng)液中的膽汁酸濃度約 為3.75yg/25yL，使用保存時間為12小時的RNA(ID)時，反應(yīng)液中的膽汁酸濃度約為 1. 6 μ g/25 μ L。BP,弄清楚了，只要保存時間為1小時以上，即能有效地抑制回收核酸時從 糞便帶入的膽汁酸所導(dǎo)致的對核酸擴增反應(yīng)的影響。此外，還考慮到，從糞便中回收的核酸 的情況下其他雜質(zhì)物也有影響，因此認(rèn)為比保存12小時時的濃度(約1.6 μ g/25 μ L)還小 的膽汁酸量也會產(chǎn)生抑制。因此可知，更優(yōu)選保存12小時以上。[實施例3]分別各取Ig采自于1名健康人的糞便至3支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅 速對其中1支添加IOmL的70%乙醇溶液(除去用溶液S)，然后在室溫(20°C )下靜置1分 鐘，作為糞便試樣(3A)。分取后對另外1支添加IOmL的70%乙醇溶液(除去用溶液S)使 糞便充分分散，然后在室溫下靜置并保存18小時，作為糞便試樣(3B)。分取后對剩下的1 支添加IOmL的70%乙醇溶液(除去用溶液S)使糞便充分分散，然后在室溫下靜置并保存 36小時，將其作為糞便試樣(3C)。經(jīng)過各保存時間后，立即對各樣品進(jìn)行離心，除去上清即 乙醇(除去用溶液S)，得到糞便來源的固體成分。另外，隨時從除去了乙醇的各糞便試樣中回收RNA。具體而言，向各糞便來源的固 體成分中添加并混合酚類混合物“Trizol” (Invitorogen公司制)，然后添加并混合氯仿， 進(jìn)行離心分離處理。通過該離心分離處理得到上清(水層)。向該上清中添加醋酸鈉和乙 醇，攪拌后進(jìn)行離心分離處理。通過該離心分離處理得到沉淀，然后風(fēng)干該沉淀物。將這些 沉淀物溶解于DEP C處理過的水中，得到RNA溶液。使用各RNA溶液中的一部分(5 μ L)，采用作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用試劑盒的ReverTra Ace qP CR RT Kit來合成cDNA。以該cDNA為模板，向其中添加12. 5 μ L的2Χ ^( Μ&η PCR master mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems 公司制)，并分別添加人 GAPDH 用正 向引物(序列號1 5 ‘ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘)和人GAPDH用反向引物(序列號2 5 ‘ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ‘)使反應(yīng)液中最終濃度為900nmol，最終體積為25 μ L，調(diào) 制 PCR 溶液。利用 ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems 公司制)對該 PCR 溶液進(jìn)行使用了 STOR green的PCR分析。PCR的熱循環(huán)于95°C 10分鐘的變性循環(huán)之后， 在將95°C 30秒鐘、55°C 30秒鐘、72°C 30秒鐘重復(fù)45個循環(huán)的條件下進(jìn)行。定量基于以利 用濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的稀釋系列作為模板而得到的熒光強度的結(jié)果來進(jìn)行。將樣品(3A)來源的RNA用于模板時，與樣品(3B)相比，可見到約80%以上的擴增 效率的降低。另外，樣品(3B)和樣品(3C)的差約為10%左右，沒有看到樣品(IA)和樣品 (IB)那種程度的差。即，由這些結(jié)果可知，使用向糞便中添加除去用溶液S、浸泡并保存一定時間的本 發(fā)明的核酸回收方法而得到的核酸，核酸的擴增效率很好。這是由于通過本發(fā)明的核酸回 收方法，可以降低回收的核酸中的糞便來源的抑制物質(zhì)A的量。另外，本實施例中，雖然沒 有確認(rèn)由除去用溶液S溶出除去的物質(zhì)是什么，但由于回收的核酸的擴增效率良好，因此 推測糞便中所含的膽汁酸以外的抑制物質(zhì)A也被溶出除去。[實施例4]
分別各取Ig采自于1名健康人的糞便至3支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速 對其中1支添加IOmL的70%乙醇溶液，然后在4°C下靜置1分鐘，作為糞便試樣(4A)。分 取后對另外1支添加IOmL的70%乙醇溶液(除去用溶液S)使糞便充分分散，然后在4°C 下靜置并保存12小時，作為糞便試樣GB)。分取后對剩下的1支添加IOmL的70%乙醇溶 液(除去用溶液幻使糞便充分分散，然后在4°C下靜置并保存72小時，將其作為糞便試樣 GC)。經(jīng)過各個時間后，隨時通過離心分離除去乙醇，接著用7mL的PBS洗滌，然后通過離 心除去上清即PBS。與實施例3同樣地提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。接著，通過利用細(xì)菌的16S rRNA基 因用正向引物(序列號3 5' -AGGAGGTGATCCAACCGCA-3‘)和細(xì)菌的16S rRNA基因用反 向引物(序列號4 5 ‘ -AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3 ‘)的實時PCR檢測大腸桿菌的基因。 將樣品(4A)來源的RNA用于模板時，與樣品GB)相比，可見到約70%以上的擴增效率的降 低。另外，樣品(4B)和樣品(4C)的差約為30%左右。S卩，由這些結(jié)果可知，即使保存時的溫度為4°C時，使用本發(fā)明的核酸回收方法所 得到的核酸，核酸的擴增效率也很好，即，推測以膽汁酸鹽為代表的抑制物質(zhì)A從回收的核 酸中被除去。[實施例5]代替實施例1中使用的乙醇，制作添加了 55%甲醇、5%異丙醇的醇溶液。將該醇 溶液用作除去用溶液S，準(zhǔn)備醇溶液浸泡糞便樣品，與實施例1同樣地制作改變了浸泡(保 存)時間的樣品。即，分取之后，迅速對其中1支添加IOmL的醇溶液使糞便充分分散，然后 在室溫(20°C )下靜置1分鐘，作為糞便試樣(5A)。分取后對另外1支添加IOmL的醇溶液 使糞便充分分散，然后在室溫下靜置并保存12小時，作為糞便試樣(5B)。分取后對剩下的 1支添加IOmL的醇溶液使糞便充分分散，然后在室溫下靜置并保存36小時，將其作為糞便 試樣(5C)。隨時通過離心分離從這些樣品中除去醇溶液，得到糞便來源的固體成分。接著， 用7mL的99. 5%乙醇洗滌糞便來源的固體成分，通過離心除去上清即99. 5%乙醇，對糞便 來源的固體成分進(jìn)行風(fēng)干。接著，用“Trizol”和氯仿提取RNA。對得到的水層添加乙醇，用 旋渦混合器很好地攪拌，然后向RNeasy midi kit (Qiagen公司制)的RNA回收用柱(硅膠 柱)中添加該水層與乙醇的混合液并離心，依照所附的操作規(guī)程，對該RNA回收用柱進(jìn)行洗 滌操作和RNA溶出操作，從而回收RNA。使用所回收的各RNA溶液中的一部分，與實施例3同樣地進(jìn)行使用了 STOR green 的PCR分析。其結(jié)果，將樣品(5A)來源的RNA用于模板時，與樣品(5B)相比，可見到約40% 的擴增效率的降低。另外，樣品(5B)和樣品(5C)的差約為20%左右，為樣品(5A)和樣品 (5B)的差的約一半。S卩，由這些結(jié)果可知，即使使用乙醇以外的醇作為除去用溶液S時，也能夠提取除 去膽汁酸鹽等抑制物質(zhì)A并回收高純度的核酸。另外，暫時用有機溶劑提取RNA后，進(jìn)一步 用硅膠柱進(jìn)行純化，從而除去糖類和核酸分解物等物質(zhì)。由此，糞便中的核酸的擴增效率上升。[實施例6]向4g健康人的糞便中混合5. OX IO5個K-ras基因密碼子12突變?yōu)镚CT的人結(jié)腸 癌來源的培養(yǎng)細(xì)胞SW1116細(xì)胞，將該混合而成的物質(zhì)作為結(jié)腸癌患者疑似糞便。分別各取0. 5g該糞便至6支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速對其中2支添加IOmL的改性乙醇 (55%乙醇和5%異丙醇的醇溶液)使糞便充分分散，然后在室溫(20°C )下靜置1分鐘，作 為糞便試樣(6A)。分取后迅速對另外的2支添加IOmL的改性乙醇(除去用溶液幻使糞便 充分分散，然后在室溫下靜置并保存12小時，作為糞便試樣(6B)。分取后迅速對剩下的2 支添加IOmL的改性乙醇(除去用溶液幻使糞便充分分散，然后在室溫下靜置并保存36小 時，將其作為糞便試樣(6C)。(6A)、(6B)、(6C)的各樣品經(jīng)過各保存時間后，隨時通過離心分離除去改性乙醇， 得到糞便來源的固體成分。接著，用7mL的99. 5%乙醇洗滌糞便來源的固體成分，通過離心 除去上清即99. 5%乙醇，將該固體成分風(fēng)干。另外，隨時從除去了乙醇的各糞便來源的固體成分中回收DNA溶液。即，使用糞便 來源DNA提取試劑盒“QIAamp DNA Stool Mini Kit”(Qiagen公司制)從各糞便來源的固 體成分中回收DNA。用吸光度法對回收的DNA的濃度進(jìn)行定量，結(jié)果，能夠從各糞便來源的 固體成分中回收幾乎同等量的DNA。使用回收的DNA，用等位基因特異性PCR(allele specific-PCR)法檢測K-ras密 碼子12的GCT突變序列。即，以使正義鏈側(cè)的引物的3'末端與GCT突變序列相匹配的 方式進(jìn)行設(shè)計，從而擴增GCT突變型等位基因。另外，反義鏈側(cè)的引物來源于內(nèi)含子部分 的堿基序列。平均每一個反應(yīng)使用各50pmol的與K-ras密碼子12GCT突變型密碼子相 對應(yīng)的正向引物(序列號5 5 ‘ -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 ‘)和反向引物(序列號6 5 ‘ -CTCATGAAAATGGTCAGAGAAACC-3 ‘ )、1. 25U 的 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa 公司制)、1 X Ex Taq Buffer,200 μ M dNTP Mixture、和IOng的模板核酸來進(jìn)行PCR。溫度條件為94°C 1分 鐘、55°C 1分鐘、72°C 1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)。PCR反應(yīng)后，通過以3 % NuSieve (FMC公司制)制作的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴增產(chǎn) 物，結(jié)果確認(rèn)到179bp的擴增產(chǎn)物。其結(jié)果，將樣品(6A)來源的DNA用于模板時，2個樣品 其中的一個看不到擴增。此外，另外一個的條帶也比樣品(6B)來源的DNA淡很多，可見到 擴增效率的降低。另外，2個樣品(6B)來源的DNA和2個樣品(6C)來源的DNA都很好地擴 增，基本見不到條帶濃度的差異。由以上的結(jié)果可推測，保存時間方面，時間越長核酸的擴增效率越好，即，抑制核 酸擴增的膽汁酸鹽等的除去效率越好。可知，通過使用由本發(fā)明的核酸回收方法所回收的DNA，從而即使是基因突變等要 求較高精確性的核酸分析，也能夠高精度地進(jìn)行核酸分析。另外，本實施例中使用混合了異 丙醇和乙醇的改性乙醇作為除去用溶液S，但能夠得到與使用相同醇濃度的50%的乙醇溶 液時同等的結(jié)果。[實施例7]使用如圖2所示的糞便采集容器A調(diào)制糞便試樣并回收核酸。該糞便采集容器A 具有與糞便采集棒3 —體化的蓋2和容器本體1，為內(nèi)部含有5mL的作為除去用溶液S的 59 %乙醇溶液的糞便采集容器A。另外，糞便采集棒3的前端具備具有4個直徑為3mm的孔 的0. 5mL容量的杯3a。首先，使用糞便采集棒3采集約0. 5g糞便至杯3a中，并將其插入該糞便采集容器 A中蓋上蓋2。于是，容器本體1的底部的隆起部Ia從杯3a的孔中擠出糞便，絲狀的糞便分散于溶液中。將這樣調(diào)制的糞便試樣作為糞便試樣(7A)。另一方面，與糞便試樣(7A)同樣地采集約0. 5g糞便至含有5mL的59%乙醇溶液 的15mL聚丙烯管中，使糞便與除去用溶液S的體積比為1 10，將其作為對照試樣(7B)。將糞便試樣(7A)和對照試樣(7B)在30°C下保存2天，然后與實施例2同樣地回 收RNA。此時，從糞便試樣(7A)除去的乙醇，與從對照試樣(7B)除去的乙醇相比，顯示更深 的茶褐色。另外，與實施例3同樣地回收RNA、合成cDNA后，進(jìn)行人GAPDH基因的定量PCR。 將樣品(7B)來源的RNA用于模板時，與樣品(7A)來源的RNA相比可見到約40%的擴增效 率的降低。其結(jié)果可推測，由于使用如圖2所示的糞便采集容器A，從而可迅速地將糞便分散 于除去用溶液S中，能夠更高純度地回收核酸。另外，通過使用這種糞便采集容器A，從而糞 便采集者在采集糞便后能夠簡便且迅速地進(jìn)行糞便試樣的調(diào)制和保存，因此能夠減少檢查 工序操作者的人事費的一部分。[實施例8]使用如圖3所示的糞便采集容器B調(diào)制糞便試樣并回收核酸。該糞便采集容器的 糞便采集棒13前端尖銳，具有2. 5mL容量的孔13a。另外，糞便采集容器B具有與糞便采 集棒13 —體化的蓋12和容器本體11，在容器本體11內(nèi)部具有含有作為除去用溶液S的 59%甲醇溶液的密封袋15。首先，使用袋15內(nèi)含有5mL的59%甲醇溶液的糞便采集容器B，按照圖3的順序 采集約0. Ig的糞便，使袋15內(nèi)的5mL的59%甲醇溶液與糞便混合而調(diào)制糞便試樣(8A)。 將該糞便試樣(8A)在18°C下靜置并保存36小時，然后與實施例5同樣地回收RNA，進(jìn)行使 用了 STOR green的PCR分析，結(jié)果確認(rèn)到擴增效率良好。由該結(jié)果也清楚了，通過使用如圖3所示的糞便采集容器B進(jìn)行本發(fā)明的核酸回 收方法，能夠高純度地回收核酸，因此可謀求糞便采集用試劑盒的輕量化、小型化和確保安 全性。[實施例9]使用如圖1所示的糞便試樣處理裝置自動進(jìn)行本發(fā)明的核酸回收方法中的工序 (B)，從糞便試樣中回收核酸。首先，與實施例7同樣地，調(diào)制2管在圖2所示的糞便采集容器A內(nèi)混合了糞便與 59%乙醇溶液(除去用溶液S)的糞便試樣。將該2管糞便試樣在室溫下保存12小時后， 打開糞便采集容器的蓋部分，固定于糞便試樣處理裝置中的離心分離機構(gòu)內(nèi)。固定的糞便 試樣通過離心分離工序分離成上清部分即乙醇溶液(除去用溶液S)和糞便來源的固體成 分。用溶液抽吸排出噴嘴抽吸1管糞便試樣的上清部分并廢棄至廢液回收部中。廢棄后， 用洗滌層洗滌噴嘴，對剩余的糞便試樣同樣地進(jìn)行上清的除去。除去上清后，可與實施例5同樣地從得到的糞便固體成分中回收RNA。[實施例10]分別各取Ig采自于1名健康人的糞便至8支15mL的聚丙烯管中。分取之后， 迅速添加6mL的70%乙醇溶液(除去用溶液S)充分地分散糞便并調(diào)制糞便試樣，然后 在-4 °C (IOA) ,0 °C (IOB) ,4 °C (IOC) ,8 °C (IOD) ,12 °C (IOE) ,16 °C (IOF) ,20 °C (IOG)、 24V (IOH)各條件下將調(diào)制的糞便試樣靜置并保存M小時。
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各樣品經(jīng)過各保存時間后，離心并除去上清即乙醇溶液，得到糞便來源的固體成 分。接著，與實施例1同樣地從得到的糞便來源的固體成分中回收RNA。使用所回收的 各RNA溶液中的一部分，與實施例3同樣地進(jìn)行使用了 STOR green的PCR分析。將與STOR green反應(yīng)后的各糞便試樣(樣品)的分析結(jié)果示于表1。分別將樣品 (IOA)和(IOB)來源的RNA用于模板時，沒有確認(rèn)到擴增。另一方面，分別將樣品(IOC) 樣品(IOF)來源的RNA用于模板時，確認(rèn)到擴增。另外，樣品(IOG)和樣品(IOH)來源的 RNA的情況下，可見到樣品(IOC) 樣品(IOF)來源的RNA的數(shù)倍左右的擴增。S卩，保存溫度為4°C以上時，抑制物質(zhì)A的除去效率很好，20°C以上時能夠更好地 除去抑制物質(zhì)并且核酸擴增效率上升。[表1]
權(quán)利要求
1.一種從糞便試樣中回收核酸的方法，其特征在于，其為從糞便中高純度地回收核酸 的方法，具有以下工序(A)將采集的糞便添加到以水溶性有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去 用溶液中而調(diào)制糞便試樣，并將上述糞便試樣保存規(guī)定的時間，從而使核酸擴增反應(yīng)抑制 物質(zhì)溶出的工序；(B)在工序(A)之后，從糞便試樣中除去核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液并回收糞 便來源的固體成分的工序；和(C)從在工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中回收核酸的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，不將采集的糞便制成 懸浮液，而是將采集的糞便立即添加到核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中，調(diào)制糞便試 樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述水溶 性有機溶劑為水溶性醇和/或酮類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述水溶 性有機溶劑的濃度為30%以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有機溶 劑含有選自由乙醇、丙醇、和甲醇組成的組中的1種以上作為水溶性醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有機溶劑 為乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有機溶 劑含有丙酮和/或甲乙酮作為酮類。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，關(guān)于上述 糞便與上述核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液的混合比率，相對于糞便體積1，核酸擴增反 應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液體積為1以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(B)中的從糞便試樣中除去核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液是通過離心分離法來進(jìn) 行的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(A)中，保存糞便試樣的時間為1小時以上。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(A)中，保存糞便試樣的時間為12小時以上。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(A)中，保存糞便試樣的時間為M小時以上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(A)中，保存糞便試樣的時間為72小時以上。
14.根據(jù)權(quán)利要求1 13中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(A)中，保存糞便試樣的溫度為4°C以上。
15.根據(jù)權(quán)利要求1 13中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(A)中，保存糞便試樣的溫度為20°C以上。
16.根據(jù)權(quán)利要求1 15中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述核 酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液含有表面活性劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求1 16中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述核 酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液含有著色劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求1 17中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(C)為如下工序從在工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中同時回收常居腸細(xì)菌來 源的核酸和常居腸細(xì)菌以外的生物來源的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述常居腸細(xì)菌以 外的生物為哺乳動物細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求1 19中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工 序(C)具有以下工序(a)使工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中的蛋白質(zhì)變性，并使核酸從上述糞便 來源的固體成分中的常居腸細(xì)菌和常居腸細(xì)菌以外的生物中溶出的工序；和(b)回收上述工序(a)中溶出的核酸的工序。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，在上述工序(a)之 后、上述工序(b)之前具有(c)除去通過上述工序(a)而變性的蛋白質(zhì)的工序。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述工序(a) 中蛋白質(zhì)的變性是使用選自由離液序列高的鹽、有機溶劑和表面活性劑組成的組中的1種 以上來進(jìn)行的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述有機溶劑為酚類。
24.根據(jù)權(quán)利要求21 23中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其中，上述 工序(c)中的變性的蛋白質(zhì)的除去是使用氯仿來進(jìn)行的。
25.根據(jù)權(quán)利要求20 M中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方法，其特征在 于，上述工序(b)中的核酸的回收具有以下工序(bl)使上述工序(a)中溶出的核酸吸附于無機支撐體的工序；和(b2)使上述工序(bl)中吸附的核酸從無機支撐體溶出的工序。
26.一種核酸，其為通過權(quán)利要求1 25中任一項所述的從糞便試樣中回收核酸的方 法而回收的核酸。
27.一種核酸分析方法，其使用回收的核酸對哺乳動物細(xì)胞來源的核酸進(jìn)行分析，該回 收的核酸為利用權(quán)利要求1 26中任一項所述的核酸回收方法從糞便試樣中回收的核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳動物細(xì)胞為消化道細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳動物細(xì)胞為從大腸脫落的 細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求27 四中任一項所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳動物細(xì)胞來 源的核酸為指示致瘤性轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27 四中任一項所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳動物細(xì)胞來 源的核酸為指示炎癥性消化器官疾病的標(biāo)記物。
32.根據(jù)權(quán)利要求27 31中任一項所述的核酸分析方法，其中，上述分析為選自由mRNA的表達(dá)分析、K-ras基因的突變分析、以及DNA的甲基化分析組成的組中的1種以上。
33.一種糞便試樣處理裝置，其包括溶液除去機構(gòu)，該溶液除去機構(gòu)用于從糞便試樣中 除去下述核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液，該糞便試樣是將采集的糞便浸泡于以水溶性 有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中保存規(guī)定的時間后的糞便試樣。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的糞便試樣處理裝置，其中，上述溶液除去機構(gòu)具有離心分 離機構(gòu)、溶液抽吸排出機構(gòu)和廢液回收部。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的糞便試樣處理裝置，其中，上述溶液抽吸排出機構(gòu)為溶液 抽吸排出噴嘴，該糞便試樣處理裝置還具有洗滌上述溶液抽吸排出噴嘴的機構(gòu)。
36.一種核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液，其為用于調(diào)制核酸回收用糞便試樣的溶 液，以水溶性有機溶劑為有效成分，用以降低回收的核酸中的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液，其中，上述水溶性有 機溶劑為水溶性醇和/或酮類。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液，其中，上述水溶性有 機溶劑的濃度為30%以上。
39.一種糞便采集用試劑盒，其具有權(quán)利要求36 38中任一項所述的核酸擴增反應(yīng)抑 制物質(zhì)除去用溶液、和含有該核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液的糞便采集容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供一種不需要繁雜的操作且高純度地回收糞便中的核酸的方法、使用通過該方法回收的核酸進(jìn)行分析的方法、以及該方法中使用的糞便試樣處理裝置，該方法具有以下工序(A)將采集的糞便添加到以水溶性有機溶劑為有效成分的核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液中而調(diào)制糞便試樣，并將上述糞便試樣保存規(guī)定的時間，從而使核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)溶出的工序；和(B)在工序(A)之后，從糞便試樣中除去核酸擴增反應(yīng)抑制物質(zhì)除去用溶液并回收糞便來源的固體成分的工序；和(C)從在工序(B)中回收的糞便來源的固體成分中回收核酸的工序。
文檔編號C12M1/00GK102105583SQ200980128539
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者谷上恭央, 長岡智紀(jì) 申請人:奧林巴斯株式會社