專利名稱：使哺乳動物祖細胞分化為產生胰島素的胰島細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及特定細胞類型的哺乳動物祖細胞分化成另一種細胞類型。更具體說，本發(fā)明涉及使包括干細胞在內的哺乳動物祖細胞分化為產生胰島素的胰島細胞的方法。
背景技術：
糖尿病(“糖尿病”)是美國發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。罹患糖尿病的患者具有代謝紊亂和異常升高的血糖水平(即，高血糖癥)，這是低水平的胰島素生成所導致的。胰腺朗格漢斯島中存在的β細胞(“胰島β細胞)產生胰島素。在I型和(較小程度上)II型糖尿病中，胰島素生成缺陷可以歸因于功能性的產生胰島素的胰島細胞的量不足。該細胞損失的原因可能是病毒性、化學性和/或自體免疫性的攻擊和破壞所述細胞。考慮到該病因學，已經試圖通過用供體胰腺細胞補充損失或損傷的細胞來逆轉或預防糖尿病的發(fā)生。雖然已經顯示這種基于細胞的療法是有前景的，但是為了研究和/或移植，胰腺細胞、特別是人胰腺細胞的供應在數(shù)量和質量兩方面而言都處于長期的供不應求。本發(fā)明提供了改善此供不應求的方法，部分地通過能夠利用來自包括非胰腺組織的任何組織的祖細胞來得到產生胰島素的胰腺細胞。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了使祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的方法，該方法包括(a) 在包含2mmol/L 丁酸鈉的無血清預誘導培養(yǎng)基中孵育祖細胞；和隨后，(b)在包含敲除替代血清(knock-out replacement serum)的誘導培養(yǎng)基中孵育祖細胞；持續(xù)足以使祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的時間。祖細胞可以是肝干細胞、臍帶基質干細胞或脂肪干細胞。優(yōu)選地，祖細胞衍生自人組織。誘導培養(yǎng)基還可包含約2%敲除替代血清。本發(fā)明另一個實施方案提供了體外評估化合物毒性的方法，包括使根據本發(fā)明從祖細胞分化的胰腺β胰島樣細胞與所述化合物接觸；和測量所述胰腺β胰島樣細胞的存活力，其中與所述化合物不存在時的存活力相比，在所述化合物存在時的存活力下降，表明所述化合物在體內是毒性的。本發(fā)明的另一個實施方案提供了在體外評估化合物活性的方法，包括使根據本發(fā)明從祖細胞分化的代謝活性胰腺β胰島樣細胞與所述化合物接觸；和測量所述胰腺β胰島樣細胞的代謝活性，其中與所述化合物不存在時的代謝活性相比，在所述化合物存在時的代謝活性降低或提高，表明所述化合物在體內具有活性。本發(fā)明進一步實施方案提供了用于治療有相應需要的個體中胰腺β胰島細胞的損失或耗竭的方法，包括向所述個體施用根據本發(fā)明從臍帶基質細胞分化的胰腺β胰島樣細胞群?；颊呖赡鼙辉\斷為具有糖尿病。本發(fā)明的進一步實施方案提供了藥物篩選試劑盒，包括一組本發(fā)明的胰腺β胰島樣細胞和至少一種用于測量胰島素生成和/或基因表達的試劑。在一個實施方案中，所述試劑盒包括至少一種用于培養(yǎng)祖細胞衍生的胰腺β胰島樣細胞的培養(yǎng)基。


圖1提供了根據本發(fā)明取自被分化為胰腺β胰島樣細胞的人肝干細胞的CDNA的 PCR分析結果。泳道1 (Pdx)、泳道2 (胰島素)、泳道3 (胰高血糖素)、泳道4 (促生長素抑制素)、泳道5 (glut2)、泳道6 (GADPH，對照)。圖2顯示了從根據本發(fā)明被分化為胰腺β胰島樣細胞的人UCM細胞的胰島素生成的免疫組織化學染色。棕色(黑色)染色表明胰島素的存在(10Χ放大)。圖3提供了根據本發(fā)明被分化為胰腺β胰島樣細胞的人UCM細胞的cDNA的PCR 分析結果。從左到右泳道I-Pdx-I ；泳道2-胰高血糖素；泳道3-胰島素；泳道4-glut 2 ； 泳道5-促生長素抑制素；泳道6-GAPDH (對照)。圖4是顯示根據本發(fā)明分化為胰腺β胰島樣細胞的人UCM細胞分泌到培養(yǎng)基中的胰島素的量(第5天)的圖。NSB 非特異性結合(對照)。
具體實施例方式本發(fā)明提供了將胰腺組織或非胰腺組織的祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的方法。通過使用本發(fā)明的教導，任何組織的祖細胞，包括脂肪祖細胞、肝祖細胞和臍帶基質祖細胞，可以被誘導分化為產生胰島素的胰腺細胞。術語“祖”細胞在本文概括地用于定義具有分化為更“成熟”細胞的能力的任何細胞。因此，術語“分化”不僅指單一細胞類型/譜系內的細胞“成熟”(例如，肝干細胞至成肝細胞)，但是可選地，還指細胞從一個類型/譜系“轉化”為另一個類型/譜系(例如，肝細胞至胰腺細胞)。作為例子，本文所使用的術語“肝祖細胞”被概括定義為包括不是完全成熟(即， 分化的)肝細胞或膽管細胞的任何細胞。因此，“肝祖細胞”包括肝干細胞及其后代不成熟的后代?！昂蟠笨梢园ㄗ灾鲝椭频母胃杉毎?、成肝細胞、來自其的雙潛能祖細胞和定向分化為特定細胞類型的祖細胞(例如，定向膽管細胞祖細胞或肝細胞)。根據本發(fā)明，肝祖細胞還可以“分化”為胰腺細胞。雖然本文祖細胞的討論和實例的大部分(如果不是全部)是參考人衍生的細胞群 (成年和胎兒的)，但本文教導不應限于人。事實上，本領域普通技術人員可以預期將本文教導應用于廣泛地從哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、狗等)分離和分化祖細胞。因此，本發(fā)明范圍預期包括任何哺乳動物和所有哺乳動物的祖細胞。肝祖細胞前述肝祖細胞群的每一種(例如，“干細胞”、“成肝細胞”或“肝細胞”)可以通過其各自大小和/或各群獨特的標志物的特定排列來鑒定。參見下表L
權利要求
1.一種用于使祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的方法，該方法包括(a)在包含丁酸鈉的無血清預誘導培養(yǎng)基中孵育所述祖細胞；和，隨后，(b)在包含敲除替代血清的誘導培養(yǎng)基中孵育所述祖細胞； 持續(xù)足以使所述祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的時間。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述祖細胞是人祖細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述祖細胞是肝干細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述祖細胞是臍帶基質干細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述祖細胞是脂肪干細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述誘導培養(yǎng)基包含約2%敲除替代血清。
7.一種用于使祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的方法，該方法包括(a)在包含組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACI)的無血清預誘導培養(yǎng)基中孵育所述祖細胞；和，隨后，(b)在包含敲除替代血清的誘導培養(yǎng)基中孵育所述祖細胞； 持續(xù)足以使所述祖細胞分化為產生胰島素的胰腺細胞的時間。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述HDACI是丁酸鈉、丁酸苯酯、視黃酸、丙戊酸、 APHA 化合物 8、Apicidin、(-)D印udecin、Scriptaid, Sirtinol 和制滴菌素。
全文摘要
本發(fā)明涉及將祖細胞分化為產生胰島素的胰島細胞的方法，以及使用此類細胞的組合物和方法。
文檔編號C12N5/071GK102282250SQ200980129009
公開日2011年12月14日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權日2008年5月22日
發(fā)明者J·C·路易茲, S·M·赫洛娃斯基 申請人:維斯塔治療公司