專(zhuān)利名稱：用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行空間分割以及篩選的組合物以及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種方法，用以在單獨(dú)的微型反應(yīng)器中從變體細(xì)胞的文庫(kù)中對(duì)特定 的成員進(jìn)行分離，其中對(duì)由所述的細(xì)胞編碼得到的生物分子所具有的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述 的評(píng)價(jià)是以多種參數(shù)為基礎(chǔ)的，包括底物特異性以及動(dòng)力學(xué)有效性。
背景技術(shù)：
酶越來(lái)越多的被用來(lái)作為催化劑用于工業(yè)，農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)以及科學(xué)研究中。由于 它們所具有的底物特異性，化學(xué)選擇性以及環(huán)境兼容性，酶在諸如下述的應(yīng)用中提供了優(yōu) 勢(shì)手性純化的醫(yī)藥品的合成，紡織品的加工，食品的加工，醫(yī)學(xué)的診斷以及治療，生物轉(zhuǎn)化 以及生物治理。在對(duì)高分子量聚合物進(jìn)行修飾的方面，酶相較于傳統(tǒng)的化學(xué)加工而言所具 有的優(yōu)越性已經(jīng)被得以證實(shí)。對(duì)生物分子的遺傳變體的文庫(kù)所進(jìn)行的評(píng)價(jià)，需要同時(shí)對(duì)所生成的所述生物分子 所具有的表型進(jìn)行鑒定并且使所述的生物分子與編碼所述生物分子的文庫(kù)成員所具有的 基因型相互關(guān)聯(lián)起來(lái)，其目的在于對(duì)存在于所述文庫(kù)中的具有期望的性質(zhì)的具體成員進(jìn)行 識(shí)別，其中所述的生物分子例如是酶。通過(guò)這種方式，對(duì)期望的變體進(jìn)行篩選并且對(duì)其進(jìn)行 進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。定向進(jìn)化已經(jīng)被證實(shí)在下述情形中是格外成功的其中酶所具有的功能與 細(xì)胞的存活有直接的聯(lián)系，即，對(duì)一種重要的活性進(jìn)行的恢復(fù)，其中所述的活性已經(jīng)從另外 一種野生型細(xì)胞中被刪除了。然而，當(dāng)在所述的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)以及其他的轉(zhuǎn)移 酶的情形中時(shí)，這些本身不能夠提供一種可供篩選的表型的酶的進(jìn)化要困難的多。盡管用 以對(duì)這種類(lèi)型的酶進(jìn)行進(jìn)化的篩選策略確實(shí)存在，包括化學(xué)互補(bǔ)，噬菌體展示以及細(xì)菌細(xì) 胞表面展示，當(dāng)前的方法不能夠提供一種容易得到的或者被歸納的策略，用以對(duì)多種多樣 的酶進(jìn)行工程化處理。伴隨著對(duì)新的生物分子的需求的增長(zhǎng)，對(duì)于新的策略存在迫切的需 求，其中所述的策略被用來(lái)對(duì)酶進(jìn)行工程化處理，所述的酶具有改善的活性以及新的催化 功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種方法，用以在單獨(dú)的微型反應(yīng)器中從變體細(xì)胞的文庫(kù)中對(duì)特定 的成員進(jìn)行分離，其中對(duì)由所述的細(xì)胞編碼得到的生物分子所具有的表型或者活性進(jìn)行評(píng) 價(jià)，所述的評(píng)價(jià)是以多種參數(shù)為基礎(chǔ)的，包括底物特異性以及動(dòng)力學(xué)有效性。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及到用以對(duì)分泌產(chǎn)物的文庫(kù)進(jìn)行篩選的組合物以及方法， 所述的篩選針對(duì)的是新的表型，包括具有改善的催化性質(zhì)的酶或者改變的底物特異性的 酶，其中使用了微孔，用以對(duì)生成所述酶的細(xì)胞進(jìn)行空間上的分割。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用以在溶液相中實(shí)現(xiàn)生物分子的篩選的方法，例 如，定向進(jìn)化的生物分子的篩選，所述的方法包括使一種細(xì)胞文庫(kù)沉積在一種微型裝置之 上，其中在所述的微型裝置中含有多個(gè)孔，所述的孔能夠?qū)Υ嬖谟谌芤褐械乃黾?xì)胞進(jìn)行 空間上的分割。所述的細(xì)胞以大約每孔一個(gè)細(xì)胞的水平分布，并且大量的細(xì)胞在所述的溶 液中分泌出至少一種生物分子的變體。將這些被分泌出來(lái)的生物分子的變體與至少一種光
4學(xué)信號(hào)底物進(jìn)行接觸，每一種代表著一種期望的生物分子表型或者活性；并且以多種參數(shù) 為基礎(chǔ)，對(duì)由所述的細(xì)胞編碼得到的所述生物分子所具有的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一些情形中， 所述的“光學(xué)信號(hào)底物”是一個(gè)或者多個(gè)單元的綜合體，例如，一種抗體或者其他的特異性 配體或者小分子標(biāo)簽，它們與一種可探測(cè)性的標(biāo)記物發(fā)生了直接的共軛。例如，在一個(gè)兩種 要素的反應(yīng)中(例如，通過(guò)一種轉(zhuǎn)移酶催化的X+Y)，第一種要素，“Y”，受到一種抗體或者其 他配體的捕獲，其中所述的抗體或者其他配體被固定在一個(gè)表面例如一個(gè)培養(yǎng)板之上，并 且利用一種光學(xué)底物對(duì)所述的第二種要素，“X”，進(jìn)行探測(cè)，其中所述的光學(xué)底物例如是一 種經(jīng)過(guò)帶有熒光素標(biāo)簽的抗體。在此之后，將分泌出一種期望的生物分子變體的所述細(xì)胞 從所述的微型裝置中分離出來(lái)。任選的，通過(guò)下述方式對(duì)所述的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)對(duì)一種或者多種光學(xué)信號(hào)隨時(shí)間 的變化進(jìn)行探測(cè)，其中所述的光學(xué)信號(hào)是由存在于所述的細(xì)胞文庫(kù)之中的一種或者多種光 學(xué)信號(hào)底物產(chǎn)生的，其中這樣的變化代表著所述的生物分子的變體所具有的期望的生物 分子表型或者活性。本發(fā)明利用了各種不同的顯色底物，熒光底物，發(fā)光底物以及熒光共 振能量轉(zhuǎn)移(FRET)底物，用以對(duì)生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)量。許多供體/受體熒光共振能量轉(zhuǎn) 移(FRET)對(duì)是可以通過(guò)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)獲得的。它們包括，但不局限于5_羧基四甲基若丹明 (TAMRA)/QSY-7( 二芳基若丹明的衍生物)；尸胺/曙紅；色氨酸/尸胺；熒光黃/德州粉紅 (若丹明)；萘/尸胺；尸胺/十八烷基若丹明(ODR)；硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)/硼-二 吡咯亞甲基(BODIPY)；鋱/若丹明；尸胺/異硫氰酸熒光素(FITC)；嵌二萘(Pyrene)/香豆 素；5-(2_碘乙?；被一?氨基萘-1-磺酸(IAEDANS)/IAFBPE/Cy5 ；以及銪/Cy5。優(yōu) 選的，所述的光學(xué)信號(hào)是一種熒光信號(hào)。在一個(gè)方面，在所述的微型裝置中以實(shí)時(shí)的方式或 者近似于實(shí)時(shí)的方式對(duì)所述的生物分子的表型或者活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中所述的監(jiān)測(cè)是以所 述的熒光信號(hào)所具有的強(qiáng)度所發(fā)生的變化為基礎(chǔ)的。本發(fā)明提供的所述的生物分子是從由下述物質(zhì)所組成的組中篩選出來(lái)的分泌得 到的分子，肽，多肽，酶例如蛋白酶，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，氫化酶，裂解酶，異構(gòu)酶， 連接酶，聚合酶，以及抗體，細(xì)胞因子，趨化因子，核酸，代謝產(chǎn)物，小分子(小于1千道爾頓) 以及合成分子。例如，所述的生物分子所具有的分子量超過(guò)大約100道爾頓(Da)并且小于 大約100000道爾頓?；蛘呖晒┻x擇的，所述的生物分子所具有的分子量超過(guò)大約600道爾 頓并且小于大約30000道爾頓；超過(guò)大約800道爾頓并且小于大約10000道爾頓；或者超過(guò) 大約900道爾頓并且小于大約1000道爾頓。在一種方法中，通過(guò)下述方式對(duì)所述的酶生物分子所具有的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)對(duì)所 述的酶或者其他的生物分子發(fā)揮作用的所述兩種或者多種要素的端點(diǎn)處進(jìn)行探測(cè)。例如， 所述的酶將所述的要素連接在一起(例如，連接酶)或者對(duì)所述的要素進(jìn)行分離(例如，裂 解酶)。正如上文中所描述的，探測(cè)是通過(guò)使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)對(duì)或者一種基于 捕獲的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在所述的檢測(cè)中第一種要素是經(jīng)過(guò)生物素化的(并且利用一種基于 親和素的試劑對(duì)其進(jìn)行了捕獲)并且第二種要素被利用一種熒光素標(biāo)簽進(jìn)行了標(biāo)記。所述 的要素(底物)在結(jié)合方面的增加或者減少反映出了所述的酶所具有的改變的結(jié)合特異性 /活性。本發(fā)明提供了對(duì)所述的生物分子所具有的表型進(jìn)行的評(píng)價(jià)，其中所述的生物分子 是由所述的細(xì)胞編碼得到的，所述的評(píng)價(jià)是以多種參數(shù)為基礎(chǔ)的，其中所述的參數(shù)選自由下述的參數(shù)所組成的組中催化速率，反應(yīng)特異性，動(dòng)力學(xué)有效性，以及底物的結(jié)合親和性。 在另外一個(gè)方面，對(duì)速率或者底物耐受性，以及PH或者溫度耐受性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。優(yōu)選的，所 述的參數(shù)是以平行的方式被進(jìn)行評(píng)價(jià)的。本發(fā)明提供了對(duì)生物分子所進(jìn)行的篩選，其中所述的生物分子是由細(xì)胞進(jìn)行分泌 的。在一個(gè)方面，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。優(yōu)選的，所述的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。或者可供 選擇的，所述的細(xì)胞是原核細(xì)胞。本發(fā)明同樣提供了一種微型裝置，所述的微型裝置中含有能夠?qū)Υ嬖谟谌芤褐械?所述細(xì)胞進(jìn)行空間上的分割的孔，例如，在每一個(gè)孔內(nèi)僅僅含有一個(gè)單一的細(xì)胞。優(yōu)選的， 所述的孔所具有的直徑在大約10至大約100微米之間，例如，直徑為10微米，20微米，30 微米，50微米，或者75微米。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種將細(xì)胞從所述的微型裝置中進(jìn)行的分離，其中所 述的細(xì)胞能夠分泌出一種期望的生物分子變體。優(yōu)選的，通過(guò)利用玻璃毛細(xì)管的顯微操作 技術(shù)對(duì)所述的細(xì)胞進(jìn)行分離。任選的，本發(fā)明提供了對(duì)所述的期望的生物分子進(jìn)行的隨機(jī) 突變，用以進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。用于進(jìn)行隨機(jī)突變的適合的技術(shù)包括錯(cuò)配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)，密碼子盒式突變，脫氧核糖核酸(DNA)改組，交錯(cuò)延伸方法(StEP)，化學(xué)突變以及增 變株的使用。或者可供選擇的，對(duì)所述的生物分子進(jìn)行測(cè)序，用以識(shí)別所述的生物分子。被進(jìn)行查看的生物分子包括酶。例如，所述的生物分子是一種突變的糖基轉(zhuǎn)移酶 (GTase)，碳水化合物加工酶，碳水化合物結(jié)合酶，糖苷酶，或者是一種結(jié)合有碳水化合物的 外源凝集素親和性蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶能夠與化學(xué)合成作用進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，用于 進(jìn)行復(fù)雜的碳水化合物的快速以及大規(guī)模的生產(chǎn)?；蛘呖晒┻x擇的，所述的生物分子是細(xì) 胞因子，趨化因子，抗體，或者其他分泌得到的細(xì)胞代謝產(chǎn)物。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了已有的糖基轉(zhuǎn)移酶的定向進(jìn)化，從而對(duì)具有改變 的底物選擇性的更有潛力的催化劑進(jìn)行識(shí)別。更為具體的，本發(fā)明提供了對(duì)突變的糖基轉(zhuǎn) 移酶的識(shí)別，其中所述的糖基轉(zhuǎn)移酶能夠與化學(xué)合成作用進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，用于對(duì)糖共軛物進(jìn)行 快速以及大規(guī)模的生產(chǎn)，其中所述的糖共軛物是用于治療目的的，包括基于碳水化合物的 癌癥疫苗以及含有碳水化合物的抗生素。本發(fā)明所具有的其他特征以及優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)下述對(duì)于其優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明并且 通過(guò)所述的權(quán)利要求而變得顯而易見(jiàn)。在本發(fā)明中引用的全部參考文獻(xiàn)均被引入作為參考。


附圖1是一種方法的示意圖，其中所述的方法被用來(lái)對(duì)具有新的功能或者改進(jìn)的 功能的酶進(jìn)行識(shí)別。酵母細(xì)胞在所述的微型反應(yīng)器內(nèi)分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)。由于每一個(gè)細(xì)胞被 容納在其特有的孔內(nèi)，每一個(gè)孔對(duì)應(yīng)著一個(gè)單一的文庫(kù)成員。經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述的篩選之后， 所述的細(xì)胞被得以回收并且被用在下一輪的篩選中或者被用來(lái)進(jìn)行所述編碼蛋白質(zhì)的識(shí) 別。附圖2是一個(gè)示意圖，是對(duì)粘液素類(lèi)型的氧-連接的多糖進(jìn)行的描述。附圖3是一個(gè)示意圖，是對(duì)底物進(jìn)行的描述，其中所述的底物被用來(lái)進(jìn)行煙草 蝕刻病毒(TEV)的蛋白酶催化活性的探測(cè)，所述的底物含有一個(gè)二吡咯亞甲基二氟化硼(BODIPY)熒光團(tuán)(F)以及一個(gè)四甲基若丹明(TAMRA)猝光劑(Q)。附圖4是一個(gè)示意圖，表示的是用來(lái)進(jìn)行多肽N-乙?；鵢 α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移 酶(PPGalNAcTase)-Tl的催化活性的探測(cè)的底物。附圖5是一系列的圖表；㈧是一個(gè)示意圖，是對(duì)一種范例性的抗腫瘤疫苗進(jìn)行的 描述；(B)是一個(gè)示意圖，表示的是一種范例性的抗寄生蟲(chóng)疫苗；(C)是一個(gè)示意圖，是對(duì)一 種范例性的抗微生物疫苗進(jìn)行的描述；并且(D)是一個(gè)示意圖，是對(duì)一種范例性的抗微生 物試劑進(jìn)行的描述。附圖6是一個(gè)圖表，所述的圖表表示出的是對(duì)下述的糖基轉(zhuǎn)移酶所進(jìn)行的結(jié)構(gòu)的 比較BTG，MurG,以及 GtfB。附圖7是一個(gè)示意圖，表示的是用于酶工程學(xué)以及催化劑發(fā)展的定向進(jìn)化。附圖8A是一個(gè)示意圖，描述的是一種使蛋白質(zhì)與分泌蛋白質(zhì)的所述細(xì)胞相互關(guān) 聯(lián)的方法，在所述的方法中，底物/產(chǎn)物被捕獲至與其發(fā)生接觸的玻璃表面之上；(B)是一 個(gè)裝置的照片，在所述的裝置中含有直徑在50至100微米之間的孔；(C)是一個(gè)蛋白質(zhì)微 陣列的顯微鏡照片，所述的蛋白質(zhì)微陣列是分泌產(chǎn)物的蛋白質(zhì)微陣列，其中所述的分泌產(chǎn) 物來(lái)自于巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞；并且(D)是存在于微孔之中的巴斯德 畢赤酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞的顯微鏡照片。附圖9是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的顯微鏡照片，用于對(duì)不同的細(xì)胞類(lèi)型之間的蛋白質(zhì) 分泌水平進(jìn)行比較，其中所述的細(xì)胞類(lèi)型例如是，雜種細(xì)胞，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，以及分泌細(xì)胞因子的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。附圖10是一系列的顯微鏡照片，證實(shí)的是使用一種顯微操作器進(jìn)行的細(xì)胞回收。附圖11是一個(gè)圖表，表示的是一種用以探測(cè)微孔中的酶的轉(zhuǎn)換的方法，其中所述 的方法是經(jīng)由一種胰島素?cái)嗔褭z測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。附圖12是一系列的顯微鏡照片，證實(shí)的是在微孔內(nèi)利用10微克/毫升的異硫氰 基熒光素(FTC)-酪蛋白對(duì)增加濃度(0. 05微克/毫升，0. 5微克/毫升，以及5微克/毫 升)的胰島素進(jìn)行1小時(shí)的培養(yǎng)之后所得到的熒光信號(hào)的強(qiáng)度。附圖13是一系列的顯微鏡照片，描述的是在微孔內(nèi)利用10微克/毫升的異硫氰 基熒光素(FTC)-酪蛋白對(duì)0. 5微克/毫升的胰島素進(jìn)行1小時(shí)以及18小時(shí)的培養(yǎng)之后所 得到的熒光信號(hào)的強(qiáng)度。附圖14是一個(gè)圖表，表示的是一種用以探測(cè)微孔中的酶的轉(zhuǎn)化的方法，其中所述 的方法是經(jīng)由一種人鼻病毒-3C(HRV-3C)蛋白酶檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。附圖15是一系列的顯微鏡照片，表示的是在室溫(RT)條件下，在100微克/毫升 的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)肽的培養(yǎng)之后，所述的人鼻病毒-3C(HRV-3C)蛋白酶檢測(cè)所得 到的結(jié)果，其中所述的培養(yǎng)是在含有培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)的1倍的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行的。
具體實(shí)施例方式由于酶所具有的底物特異性，化學(xué)選擇性以及環(huán)境兼容性，它們?cè)谥T如下述方面 的應(yīng)用中提供了優(yōu)勢(shì)手性純化的醫(yī)藥品的合成方面，其中所述的醫(yī)藥品被用來(lái)進(jìn)行醫(yī)學(xué) 診斷以及治療。的確，這樣的酶可以被利用在所述的寡糖以及糖共軛物的合成之中，其中所 述的寡糖以及糖共軛物具有多種多樣的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括抗腫瘤疫苗(作用于，例如，神經(jīng)節(jié)苷脂(GM3)，一種與惡性黑素瘤相關(guān)的鞘糖脂)抗寄生蟲(chóng)疫苗(作用于，例如，瘧疾糖基磷脂 酰環(huán)己六醇(糖基磷脂酰肌醇錨定區(qū)))，抗微生物疫苗(作用于，例如，莢膜多糖抗原流行 性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)血清型b (HIB))，以及其他的抗微生物試劑。 范例性的抗腫瘤疫苗，抗寄生蟲(chóng)疫苗，抗微生物疫苗，以及抗微生物試劑分別在附圖5A-5D 中進(jìn)行了表示。糖基化的生物分子的使用不僅僅需要在結(jié)構(gòu)與功能之間的相互關(guān)系方面的 深入知識(shí)，同樣需要獲取用于大規(guī)模的臨床使用的精確的結(jié)構(gòu)。盡管許多野生型的酶(即，那些氨基酸序列與在天然存在的有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的氨基 酸序列相同的酶)可以在不進(jìn)行任何修飾的條件下被進(jìn)行使用，在許多情形中一種酶所具 有的物理性質(zhì)或者它的化學(xué)活性不能夠與一種期望的應(yīng)用相兼容?？赡苁橇钊似谕男碌?物理性質(zhì)可能包括，例如，熱穩(wěn)定性，對(duì)非水性溶劑、鹽類(lèi)、金屬、抑制劑、蛋白酶、極端PH值 的抗性以及類(lèi)似的性質(zhì)。降低酶的大小，廢除其對(duì)于輔助因子或者其他蛋白質(zhì)的依賴，改善 其在所述的宿主菌株中的表達(dá)以及其他類(lèi)似的變化對(duì)于一種特定的應(yīng)用而言同樣可能是 令人期望的。改進(jìn)的化學(xué)活性可能包括，例如，增加的催化速率，底物親和性以及特異性，區(qū) 域選擇性，對(duì)映選擇性，降低的產(chǎn)物抑制作用，或者一種改變的PH活性曲線。除此之外，對(duì) 一種或者多種酶所具有的作為一種代謝途徑的一部分而共同發(fā)揮功效的性質(zhì)進(jìn)行改變同 樣可能是令人期望的。伴隨著對(duì)于具有改善的活性以及新的催化功能的酶的需求的增長(zhǎng)，已經(jīng)研發(fā)出新 的方法，用以從一種蛋白質(zhì)變體的池中對(duì)一種期望的催化劑進(jìn)行分離。定向進(jìn)化已經(jīng)被證 實(shí)在下述情形中是格外成功的其中酶所具有的功能與細(xì)胞的存活有直接的聯(lián)系，即，對(duì)一 種重要的活性進(jìn)行的恢復(fù)，其中所述的活性已經(jīng)從另外一種野生型細(xì)胞中被刪除了。然而， 當(dāng)在所述的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)以及其他的轉(zhuǎn)移酶的情形中時(shí)，這些本身不能夠提供 一種可供篩選的表型的酶的進(jìn)化要困難的多。在這里所描述的本發(fā)明之前，沒(méi)有方法能夠 提供一種容易得到的或者被歸納的策略，用于對(duì)多種多樣的酶進(jìn)行工程化處理。所述的經(jīng)過(guò)分離的生物分子是經(jīng)過(guò)純化的天然存在的、合成制造的、或者重組的 化合物，例如，多肽，核酸，小分子，或者其他的試劑。純化的化合物為具有至少60%重量 (干重)的目標(biāo)化合物的化合物。優(yōu)選的，所述的制品具有至少75%、更優(yōu)選的至少90%、 并且最為優(yōu)選的至少99 %重量的目標(biāo)化合物。可以通過(guò)任何適宜的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)純度進(jìn)行測(cè) 量，所述的方法例如是，通過(guò)柱層析法，聚丙烯酰胺凝膠電泳法，或者高效液相色譜(HPLC) 分析?！凹兓摹被蛘摺氨举|(zhì)上純化的”意味著一種生物分子或者所述生物分子的生物學(xué)活 性部分中本質(zhì)上不含有來(lái)源于所述的細(xì)胞或者組織來(lái)源的細(xì)胞物質(zhì)或者其他的污染性大 分子，其中所述的污染性大分子例如是多糖，核酸，或者蛋白質(zhì)，所述的細(xì)胞或者組織來(lái)源 指的是獲得所述的生物分子的細(xì)胞或者組織。所述的術(shù)語(yǔ)“本質(zhì)上純化的”同樣包括這樣 的一種生物分子，在所述的生物分子中本質(zhì)上不含有化學(xué)前體或者化學(xué)合成時(shí)的其他化學(xué) 試劑。所述的語(yǔ)言“本質(zhì)上不含有細(xì)胞物質(zhì)”包括這樣的生物分子制品，所述的生物分子制 品是與所述細(xì)胞的細(xì)胞組分分離的，其中所述的生物分子是從所述的細(xì)胞中分離出來(lái)的。用于酶工程學(xué)以及催化劑研發(fā)的定向進(jìn)化在附圖7中表示出的是用于酶工程學(xué)以及催化劑研發(fā)的定向進(jìn)化發(fā)明的示意圖。 本發(fā)明提供了通過(guò)一種已有的酶骨架突變/生成新的活性的能力，這種能力是通過(guò)重復(fù)輪 回的突變以及篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)的。正如將在下文中詳細(xì)描述的，存在許多技術(shù)用于對(duì)所期望的
8生物分子進(jìn)行隨機(jī)的突變，用于進(jìn)一步的篩選。同樣存在許多合適的方法用于進(jìn)行篩選。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解，可以根據(jù)所述的生物分子所能夠獲得的結(jié)構(gòu)信息的量來(lái)選擇一 種具體的技術(shù)，其中所述的生物分子例如是一種目標(biāo)蛋白質(zhì)。當(dāng)選擇了一種單獨(dú)的技術(shù)時(shí)， 在維持高通量的同時(shí)，對(duì)存在于基因型以及表型之間的聯(lián)系進(jìn)行維持，是至關(guān)重要的。篩選策略在這里所描述的發(fā)明提供了一種可自動(dòng)化的、高通量的方法，用以對(duì)一種細(xì)胞編 碼得到的生物分子所具有的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中所述的評(píng)價(jià)是以多種參數(shù)為基礎(chǔ)的，所述 的參數(shù)包括底物特異性以及動(dòng)力學(xué)有效性。這種一般性的策略允許使用天然底物或者具有 最低的混亂程度的底物對(duì)多種多樣的酶進(jìn)行體外篩選。所述的目標(biāo)酶是通過(guò)所述的細(xì)胞機(jī) 構(gòu)制造得到的?；蛘呖晒┻x擇的，本發(fā)明同樣提供了在溶液中對(duì)其他分泌得到的生物分子 所進(jìn)行的篩選，所述的篩選針對(duì)的是一種期望的表型，其中所述的生物分子包括細(xì)胞因子， 趨化因子，抗體，以及代謝產(chǎn)物。對(duì)生物分子的遺傳變體的文庫(kù)所進(jìn)行的評(píng)價(jià)，需要同時(shí)對(duì)所生成的所述生物分子 所具有的表型進(jìn)行鑒定并且使所述的生物分子與編碼所述生物分子的文庫(kù)成員所具有的 基因型相互關(guān)聯(lián)起來(lái)，其目的在于對(duì)存在于所述文庫(kù)中的具有期望的性質(zhì)(催化速率，反 應(yīng)特異性，底物結(jié)合親和性)的具體成員進(jìn)行識(shí)別，其中所述的生物分子例如是酶。通過(guò)這 種方式，對(duì)期望的變體進(jìn)行篩選并且對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。對(duì)所述的生物分子所具有的 表型與生成其的所述細(xì)胞所具有的基因型之間進(jìn)行的相互關(guān)聯(lián)是具有挑戰(zhàn)性的。本發(fā)明提 供了一種方法，用以在單獨(dú)的微型反應(yīng)器內(nèi)從變體細(xì)胞的文庫(kù)中對(duì)特定的成員進(jìn)行分離， 其中對(duì)由所述的細(xì)胞分泌出的生物分子所具有的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述的評(píng)價(jià)是以多種參數(shù) 為基礎(chǔ)的，包括底物特異性以及動(dòng)力學(xué)有效性。對(duì)所述的文庫(kù)成員所進(jìn)行的空間分割允許 對(duì)每一種進(jìn)行平行的評(píng)價(jià)，并且從所述的微型反應(yīng)器中對(duì)表現(xiàn)出期望特征的成員進(jìn)行后續(xù) 的回收，用于進(jìn)行進(jìn)一步的分析。這種技術(shù)的一種重要的應(yīng)用在于對(duì)多種多樣的酶進(jìn)行的 定向進(jìn)化，其中所述的酶被用來(lái)進(jìn)行生物分子的體外構(gòu)建。一個(gè)例子是一種用于對(duì)變異的 糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行識(shí)別的方法，其中所述的糖基轉(zhuǎn)移酶利用完全的化學(xué)控制將糖從活化的供 體分子轉(zhuǎn)移到適宜的受體中去。這樣的酶能夠與化學(xué)合成方法進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，用來(lái)進(jìn)行復(fù)雜的 碳水化合物的快速并且大規(guī)模的生產(chǎn)。當(dāng)對(duì)來(lái)自于一個(gè)酶的變體文庫(kù)中的酶進(jìn)行進(jìn)化時(shí)，一種用以將一種令人期望的表 型與基因型進(jìn)行聯(lián)系的簡(jiǎn)單策略是必要的。對(duì)存在于各個(gè)間隔內(nèi)的文庫(kù)成員所進(jìn)行的空 間分割允許對(duì)具有獨(dú)特性質(zhì)的所述變體進(jìn)行識(shí)別，而不需要進(jìn)行底物的吸收或者表面的吸 附。出于那樣的原因，在這里所描述的本發(fā)明使用微制造的小室對(duì)細(xì)胞文庫(kù)進(jìn)行分 離，其中所述的細(xì)胞例如是酵母細(xì)胞，所述的細(xì)胞中的每一個(gè)均分泌一種目標(biāo)蛋白質(zhì)的變 異版本(附圖1)。通過(guò)軟光刻法以及復(fù)制成形來(lái)制造所述的可模壓的厚板，其中所述的厚 板是利用聚二甲基硅氧烷制成的并且是一種具有生物兼容性的材料，所述的材料是無(wú)毒的 并且是具有氣體滲透性的。一些材料所具有的硬度將不允許其進(jìn)行共形接觸，并且因此將 所述的微孔密封在底物之上，用來(lái)以平行的方式對(duì)生成的所述抗體所具有的特異性進(jìn)行測(cè) 試，其中所述的材料例如是聚苯乙烯。然而，聚二甲基硅氧烷(PDMS)是一種適合用于這種 技術(shù)的材料，因?yàn)樗鼪](méi)有毒性，它是具有氣體滲透性的，并且它可以輕易的被壓縮從而形成一種緊密的，但是具有可逆性的，與一種剛性底物所形成的密封。這樣的一種密封能夠延緩 或者防止存在于所述的可模壓的厚板之中的任何的液體和/或細(xì)胞發(fā)生滲漏或者漏出。被限制在微孔內(nèi)并且利用載玻片進(jìn)行密封的細(xì)胞(這樣一來(lái)可以利用的總體的 介質(zhì)被限定到所述的微孔所具有的體積)被粗略的以每個(gè)孔中一個(gè)細(xì)胞的水平分配在一 種裝置中，其中在所述的裝置中含有直徑為50微米的孔。附圖8C描述的是一種來(lái)自于單 個(gè)的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞的蛋白質(zhì)微陣列，而附圖8D表示出的是能夠 分泌出在8C中的所述蛋白質(zhì)微陣列的細(xì)胞。使表達(dá)一種人類(lèi)Fc的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞在 YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)夜生長(zhǎng)。之后將細(xì)胞粗略的以每孔一個(gè)細(xì)胞的水平裝載于一個(gè)聚二甲 基硅氧烷(PDMS)微型裝置中，其中在所述的微型裝置中含有50微米的孔。將所述的微型 裝置與一個(gè)載玻片進(jìn)行接觸，其中所述的載玻片經(jīng)過(guò)了山羊抗人類(lèi)Fc抗體的預(yù)處理，用以 對(duì)所分泌的Fc進(jìn)行捕獲。上述經(jīng)過(guò)分泌的蛋白質(zhì)在90分鐘的時(shí)間內(nèi)被捕獲并且使用一種 Cy5共軛的山羊抗人類(lèi)免疫球蛋白H+免疫球蛋白L抗體對(duì)上述得到的陣列進(jìn)行讀取。利用 一種作用于酵母細(xì)胞表面的熒光素染料對(duì)存在于所述的微孔之中的所述巴斯德畢赤酵母 細(xì)胞進(jìn)行成像。附圖9表示出的是與其他的細(xì)胞類(lèi)型相比較而言巴斯德畢赤酵母所分泌的 蛋白質(zhì)水平如何，其中所述的其他的細(xì)胞類(lèi)型例如是雜種細(xì)胞，以及分泌細(xì)胞因子的外周 血單核細(xì)胞(PBMC)。使用經(jīng)過(guò)純化的人類(lèi)Fc生成這種標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且將觀察到的所述的強(qiáng) 度數(shù)值用來(lái)對(duì)所述分泌物的確定的濃度進(jìn)行指定，其中所述的分泌物是從各個(gè)細(xì)胞中捕獲 得到的。在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中觀察到的被分泌蛋白質(zhì)所具有的劑量大大超出了所述檢 測(cè)的探測(cè)極限并且應(yīng)當(dāng)在微孔中提供了足夠的濃度水平，用以進(jìn)行所述補(bǔ)充的酶底物的轉(zhuǎn) 換。這些試驗(yàn)證實(shí)了探測(cè)分泌產(chǎn)物的能力，其中所述的分泌產(chǎn)物來(lái)自于各個(gè)酵母細(xì)胞。同 樣可以參見(jiàn)，Love等人于2006年在Nat. Biotechnol《自然生物技術(shù)》24(6) :703_707中發(fā) 表的文章；WO 2007/035633。在一種特定的實(shí)施例中，利用酶底物對(duì)一種被隔離的酵母細(xì)胞文庫(kù)進(jìn)行查看，其 中在發(fā)生成功的酶的轉(zhuǎn)換時(shí)所述的酶底物能夠產(chǎn)生一種熒光信號(hào)。由于所述的信號(hào)所具有 的強(qiáng)度與產(chǎn)物的形成直接相關(guān)，除了底物特異性之外，對(duì)文庫(kù)成員直接進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)方面 的比較，其中所述的比較是經(jīng)由實(shí)時(shí)熒光性監(jiān)測(cè)的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。使用顯微操作技術(shù)對(duì)來(lái) 自于熒光性孔內(nèi)的克隆物進(jìn)行回收并且將其用于下一輪的進(jìn)化以及篩選之中。在附圖10 中表示出的是使用一種顯微操作器進(jìn)行的細(xì)胞的回收。經(jīng)過(guò)利用一種顯微操作器進(jìn)行的回 收之后，酵母的存活能力為40-60%。用于對(duì)酶進(jìn)行改進(jìn)的突變技術(shù)能夠編碼氨基酸的變化的突變可以被有效的用來(lái)生成新的酶活性?？梢允褂帽?領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)獲得所述的基因，例如，通過(guò)從一種給定的有機(jī)體的基因 組文庫(kù)中進(jìn)行克隆物的分離的方法，通過(guò)對(duì)基因組脫氧核糖核酸(DNA)或者信使核糖核酸 (mRNA)的來(lái)源進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的方法，或者通過(guò)來(lái)自于一種表達(dá)克隆物文 庫(kù)的方法，其中所述的克隆物來(lái)自于一種DNA的異源混合物，所述的DNA異源混合物來(lái)自于 未經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的環(huán)境微生物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5958672)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，存在許 多種熟知的方法，用以對(duì)編碼所述酶以及其他的非催化性蛋白質(zhì)以及肽的基因進(jìn)行突變。 這些方法同時(shí)包括有理數(shù)的(rational)技術(shù)(例如，通過(guò)定點(diǎn)突變來(lái)生成點(diǎn)突變體或者點(diǎn) 突變組)以及隨機(jī)的技術(shù)(例如，隨機(jī)突變，組合突變以及重組)。一種有理數(shù)的設(shè)計(jì)，被稱為蛋白質(zhì)自動(dòng)化設(shè)計(jì)，利用一種運(yùn)算法則對(duì)可能實(shí)現(xiàn)一種期望的折疊的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行客 觀的預(yù)測(cè)。一種類(lèi)型的技術(shù)是那些依賴于點(diǎn)突變的技術(shù)，例如，錯(cuò)配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及寡 核苷酸定向突變(參見(jiàn)Cadwell以及Joyce于1992年在PCR Methods Applic.《聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法以及應(yīng)用》2 28-33中發(fā)表的文章；Kegler-Ebo DM等人于1994年在Nuc Acids Res《核酸研究》22(9) 1593-1599中發(fā)表的文章)。這些方法導(dǎo)致了一種酶文庫(kù)的 生成，在所述的酶文庫(kù)中含有這樣的成員，所述的成員在一種給定的蛋白質(zhì)中的一個(gè)具體 位置上具有20種不同的氨基酸中的任意一種。隨機(jī)方法包括，例如，化學(xué)突變(參見(jiàn)Singer以及Kusmierek于1982年在Annu Rev Biochem《生物化學(xué)年度回顧》51 :655_93中發(fā)表的文章)，遞歸集成突變(參見(jiàn)Arkin 以及Youvan于1992年在Proc Natl Acad Sci USA《美國(guó)科學(xué)院院刊》89 (16) :7811_5中 發(fā)表的文章；Delagrave等人于1993年在Protein Eng《蛋白質(zhì)工程》6 (3) :327_31中發(fā)表 的文章)，指數(shù)集成突變(參見(jiàn)Delagrave以及Youvan于1993年在Biotechnology《生物 技術(shù)》11(13) 1548-52中發(fā)表的文章)，順序隨機(jī)突變(參見(jiàn)Chen以及Arnold于1991年 在Biotechnology《生物技術(shù)》9 (11) 1073-7中發(fā)表的文章；Chen以及Arnold于1993年 在Proc Natl Acad Sci USA《美國(guó)科學(xué)院院刊》90 (12) :5618_22中發(fā)表的文章)，DNA改組 (參見(jiàn) Stemmer 于 1994 年在 Proc Natl Acad Sci USA《美國(guó)科學(xué)院院刊》91 (22) 10747-51 中發(fā)表的文章；Stemmer于1994年在Nature《自然》370 (6488) :389_91中發(fā)表的文章)以 及類(lèi)似的方法。重組是一種有效的隨機(jī)突變技術(shù)，其中DNA發(fā)生分解并且在新的組合中進(jìn) 行了重新的結(jié)合。DNA改組，是已知的最佳重組方法，允許在多個(gè)需要被組合的基因中形成 有效的突變(參見(jiàn)Stemmer WPC等人于1994年在Nature《自然》370 :389_391中發(fā)表的 文章)。交錯(cuò)延伸方法(StEP)是一種簡(jiǎn)單并且有效的方法，用以對(duì)多核苷酸序列進(jìn)行體外 的突變以及重組(參見(jiàn)Zhao H等人于1998年在Nature Biotechnol《自然生物技術(shù)》16: 258-261中發(fā)表的文章)。其他的突變技術(shù)包括化學(xué)突變以及所述的增變株的使用(參見(jiàn) Lai Y等人于2004年在Biotech Bioeng《生物技術(shù)與生物工程》86 622~627中發(fā)表的文 章；Coia G等人于1997年在Gene《基因》201 203-209中發(fā)表的文章)。這些技術(shù)可以被 進(jìn)行單獨(dú)的使用或者組合的使用，用以制造突變體。將表達(dá)所期望的酶或者蛋白質(zhì)的DNA從所述的表達(dá)文庫(kù)中分離出來(lái)并且對(duì)其進(jìn) 行測(cè)序。通過(guò)對(duì)所述的突變步驟以及篩選步驟的重復(fù)，新的酶以及其他的蛋白質(zhì)被人工的 建立起來(lái)。這種重復(fù)的過(guò)程被認(rèn)為是定向進(jìn)化。所述的目標(biāo)基因不必要在質(zhì)粒上被進(jìn)行表 達(dá)。在一個(gè)方面，經(jīng)過(guò)在所述的宿主染色體內(nèi)的整合之后，它們被進(jìn)行表達(dá)，或者作為一種 基因的染色體拷貝的突變結(jié)果而使它們進(jìn)行表達(dá)。在另外一個(gè)方面，在不存在突變的情況 下建立高復(fù)雜性的表達(dá)文庫(kù)。這可以通過(guò)對(duì)來(lái)自于一種來(lái)源的DNA進(jìn)行克隆以及表達(dá)的方 式來(lái)完成，其中在所述的來(lái)源中已經(jīng)含有大量不同的序列，所述的DNA例如是高異源性的 基因組DNA，其來(lái)自于環(huán)境微生物的混合物。表達(dá)文庫(kù)的活性篩選在本發(fā)明中描述的所述方法允許對(duì)所述的生物分子進(jìn)行功能方面的檢測(cè)。在一個(gè) 方面，對(duì)于所期望的生物學(xué)活性的篩選是通過(guò)使用核酸適配體來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中所述的核酸 適配體即，能夠與一種特異性的靶向分子進(jìn)行結(jié)合的寡核酸或者肽分子。在另外一個(gè)方面，對(duì)于所期望的生物學(xué)活性的篩選是通過(guò)使用一種溶液相的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述的檢測(cè)是利用熒光團(tuán)性質(zhì)的底物在所述的微型裝置的微孔內(nèi)進(jìn)行 的。在另外一個(gè)方面，生物學(xué)活性是經(jīng)由固體支撐的熒光性(或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移)來(lái) 進(jìn)行檢測(cè)的，其中使用抗體將底物/產(chǎn)物捕獲在與其發(fā)生接觸的所述的玻璃表面之上。優(yōu) 選的，一種或者多種所述的底物是熒光性的。在另外一個(gè)方面，對(duì)于所期望的生物學(xué)活性的 篩選是經(jīng)由固體支撐的親和性捕獲來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中一種或者多種底物被進(jìn)行了進(jìn)一步的衍 生，其中所述的衍生是使用一種化學(xué)反應(yīng)或者酶反應(yīng)(即，“點(diǎn)擊化學(xué)”，轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)簽，BirA 生物素化，等等)利用一種熒光團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。或者可供選擇的，使用一種固體支撐的基于抗 體的熒光性讀數(shù)器對(duì)所述的生物分子所具有的功能進(jìn)行檢測(cè)，其中兩種底物均具有親和性 標(biāo)簽，并且在一種夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)形式中對(duì)所述的產(chǎn)物進(jìn)行探測(cè)。優(yōu)選的， 所述的二級(jí)抗體與一種熒光團(tuán)發(fā)生了共軛。在一個(gè)方面，對(duì)所期望的生物學(xué)活性所進(jìn)行的篩選是通過(guò)下述方式來(lái)完成的將 表達(dá)所述酶的所述宿主細(xì)胞與一種顯色性化合物或者熒光性化合物進(jìn)行接觸，并且對(duì)在所 述的細(xì)胞內(nèi)或者在它們周?chē)l(fā)生的顏色的生成進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中所述的顯色性化合物或者 熒光性化合物是適合用于所述的酶反應(yīng)之中的。在美國(guó)專(zhuān)利No. 5914245描述的所述固相 檢測(cè)中，這些化合物被稱為光學(xué)信號(hào)底物，因?yàn)楫?dāng)它們與活化的酶或者與一種所述酶反應(yīng) 中的產(chǎn)物發(fā)生接觸時(shí)，能夠在吸光率、反射比、熒光性或者發(fā)光性方面產(chǎn)生一種可以測(cè)量的 變化。本發(fā)明提供了各種不同的顯色性、熒光性、發(fā)光性以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 底物，用以對(duì)生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)量。通常情況下，熒光團(tuán)能夠在一種波長(zhǎng)條件下吸收電磁 能量并且在另外一種波長(zhǎng)條件下放射出電磁能量。代表性的熒光團(tuán)包括，但不局限于，1， 5 5- (2-碘乙酰基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸；1，8-ANS ；4-甲基傘形酮；5-羧基-2，7- 二 氯熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM) ；5-羧基萘基熒光素；5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)； 5-FAM(5-羧基熒光素)；5-HAT(羥色胺)；5-羥色胺(HAT) ；5-R0X(羧基-X-若丹明)； 5-TAMRA(5-羧基四甲基若丹明)；6-羧基若丹明6G ；6-CR 6G ；6-JOE ；7-氨基-4-甲基香 豆素；7-氨基放線菌素D (7-AAD) ；7-羥基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖 啶；ABQ ；酸性品紅；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶紅；吖啶黃；叮啶 黃；Acriflavin Feulgen SITSA ；水母素(發(fā)光蛋白質(zhì))；AFP-自動(dòng)熒光蛋白_(Quantum Biotechnologies)參見(jiàn)sgGFP(超級(jí)發(fā)光綠色熒光蛋白)，SgBFP(超級(jí)發(fā)光藍(lán)色熒光蛋 白)；Alexa Fluor 350. TM. ；Alexa Fluor 430. TM. ；Alexa Fluor 488. TM. ；Alexa Fluor 532. TM. ；Alexa Fluor 546. TM. ；Alexa Fluor 568. TM. ；Alexa Fluor 594. TM. ；Alexa Fluor 633. TM. ；Alexa Fluor 647. TM. ；Alexa Fluor 660. TM. ；Alexa Fluor 680. TM.； 茜素氨羧絡(luò)合劑；茜素紅；別藻藍(lán)蛋白(APC) ；AMC，AMCA-S;AMCA(氨基甲基香豆素)；氨 基甲基香豆素-X ；氨基放線菌素D ；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA) ； Anilin Blue； anthrocyl stearate ；APC(別藻藍(lán)蛋白)；別藻藍(lán)蛋白-Cy7 ；APTRA-BTC ；APTS ；陽(yáng)離子艷紅 4G ；堿性橙 R ；還原紅 6B ；陽(yáng)離子黃 7GLL ；阿的平；ATTO-TAG. TM. CBQCA ；ATTO-TAG. TM. FQ ； 金胺；Aurophosphine G ；Aurophosphine ；BAO 9(雙氨基苯基惡二唑)；BCECF(高 pH)； BCECF(低pH)；硫酸黃連素；β -內(nèi)酰胺酶；BFP藍(lán)色熒光蛋白轉(zhuǎn)換的綠色熒光蛋白(GFP) (Υ66Η)；藍(lán)色熒光蛋白；藍(lán)色熒光蛋白/綠色熒光蛋白熒光共振能量轉(zhuǎn)移(BFP/GFP FRET)；Bimane ；二苯甲酰胺；二苯甲亞酰胺(赫斯特?zé)晒馊玖?(Hoechst) ；bis-BTC ；布蘭科福爾 熒光增白劑FFG ；布蘭科福爾熒光增白劑SV ；Β0Β0. TM. -1 ；Β0Β0. TM. -3 ；氟硼熒492/515 ； 氟硼熒493/503 ；氟硼熒500/510 ；氟硼熒505/515 ；氟硼熒530/10 ；氟硼熒542/563 ；氟 硼熒18/568 ；氟硼熒564/517 ；氟硼熒576/589 ；氟硼熒581/591 ；氟硼熒630/650-X ；氟 硼熒665/676;氟硼熒FI;氟硼熒FI ATP ；氟硼熒FI-神經(jīng)鞘氨醇；氟硼熒R6G SE ；氟硼 熒TMR ；氟硼熒TMR-X共軛物；氟硼熒TMR-X，SE ；氟硼熒TR ；氟硼熒TR ATP ；氟硼熒TR-X SE ；BO-PRO. TM. -1 ；BO-PRO. TM. -3 ；Brilliant Sulphoflavin FF ；BTC ；BTC-5N ；鈣黃綠素； 鈣黃綠素藍(lán)；鈣紅TM.；鈣綠；鈣綠-1 Ca. sup. 2+染料；鈣綠-2 Ca. sup. 2+ ；鈣綠_5NCa. sup. 2+ ；鈣綠-C18 Ca. sup. 2+ ； 丐橙；Calcofluor White ；羧基 _X_ 若丹明(5-R0X)； Cascade Blue. TM. ；Cascade Yellow ；兒茶酚胺；CCF2 (GeneBlazer) ；CFDA ；CFP-青色熒 光蛋白；青色熒光蛋白/黃色熒光蛋白熒光共振能量轉(zhuǎn)移(CFP/YFP FRET)；葉綠素；色霉 素A ；色霉素A ；CL-NERF ；CMFDA ；腔腸素；腔腸素cp ；腔腸素f ；腔腸素fcp ；腔腸素h ；腔腸 素hep ；腔腸素ip ；腔腸素η ；腔腸素0 ；香豆素鬼筆菌；C-藻青素；CPM甲基香豆素；CTC ； CTC 氰基甲；Cy2. TM. ；Cy3. 18. ；Cy3. 5. TM. ；Cy3. TM. ；Cy5. 18 ；Cy5. 5. TM. ；Cy5. TM. ；Cy7. TM.；青綠色熒光蛋白；環(huán)狀A(yù)MP熒光傳感器(FiCRhR) ；Dabcyl ；丹磺酰；丹磺酰胺；丹磺酰 尸胺；丹磺酰氯；丹磺?；鵇HPE ；丹磺酰氟；4’，6-聯(lián)脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；Dapoxyl ； Dapoxy 2 ；Dapoxyl 3，DCFDA ;DCFH(二氯二氫熒光素雙乙酸鹽)；DDA0 ;DHR(二氫若丹 明 123) ；Di-4-ANEPPS ;Di-8-ANEPPS(無(wú)比例)；DiA(4_Di-16_ASP) ；二氯二氫熒光素雙 乙酸鹽(DCFH)；吲哚一羰菁染料(DiD)-親脂性示蹤劑；噴哚一羰菁染料(DiIClS (5))； DIDS ；二氫若丹明 123 (DHR) ；Dil (DilC18 (3)) ；二硝基苯酚；DiO(Di0C18 (3))；吲哚三羰花 青(DiR)；吲哚三羰花青(DiR) (DiIC18(7)) ；DM-NEFR(高 pH) ；2，4_ 二硝基苯酚(DNP)； 多巴胺；DsRed ；DTAF ；DY-630-NHS ；DY-635-NHS ；增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白(EBFP)；增強(qiáng)型青 色熒光蛋白(ECFP)；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP) ；ELF 97 ；曙紅；赤蘚紅；赤蘚紅ITC ；溴 化乙錠；溴乙啡錠二聚體-I(EthD-I)；吖啶橙；EukoLight ；三氯化銪；增強(qiáng)型黃色熒光蛋 白(EYFP)；固藍(lán)；FDA5Feulgen(堿性副品紅)；FIF(甲醛化作用誘導(dǎo)的熒光素)；異硫氰 基熒光素(FITC) ；Flazo Orange ;Fluo_3 ;Fluo_4 ；熒光素(異硫氰基熒光素)；二乙酸 熒光素；熒光翡翠綠；熒光金(羥芪巴脒)；紅色熒光金；FluorX ；FM 1-43. TM. ；FM 4-46 ； Fura Red. TM.(高pH) ；Fura Red. TM. /Fluo-3 ；Fura-2 ；Fura-2/BCECF ；Genacryl Pink 3G ； Genacryl Yellow 5GF ；GeneBlazer(CCF2)；綠色熒光蛋白(S65T)；紅色轉(zhuǎn)換的綠色熒光 蛋白(rsGFP)；綠色熒光蛋白野生型；非紫外線(UV)激發(fā)(野生型綠色熒光蛋白)；綠色 熒光蛋白野生型；紫外線激發(fā)(野生型綠色熒光蛋白)；GFPuV;Gl0Xalic Acid;粒藍(lán)；血 卟啉；赫斯特?zé)晒馊玖?3258 ；赫斯特?zé)晒馊玖?3342 ；赫斯特?zé)晒馊玖?4580 ；HPTS ；羥 基香豆素；羥芪巴脒(熒光金)；羥色胺；吲哚-1，高鈣；吲哚-1，低鈣；吲哚一羰菁染料 (DiD) ； Intrawhite Cf ； JC-I J0-J0-1 J0-RP0-1 ；LaserPro ；Laurodan ；LDS 751 (DNA)； LDS 751 (RNA)；雷可福熒光增白劑PAF ；雷可福熒光增白劑SF ；雷可福熒光增白劑WS ；麗 絲胺若丹明；麗絲胺若丹明B ；鈣黃綠素/溴乙啡錠二聚體；L0L0-1 ；L0-PR0-1 ；Lucifer Yellow ；溶酶體示蹤劑藍(lán)色熒光探針；溶酶體示蹤劑藍(lán)白色熒光探針；溶酶體示蹤劑綠色 熒光探針；溶酶體示蹤劑紅色熒光探針；溶酶體示蹤劑黃色熒光探針；溶酶體傳感器藍(lán) 色熒光探針；溶酶體傳感器綠色熒光探針；溶酶體黃色/藍(lán)色熒光探針；Mag Green ；蘇丹紅(根皮紅 B) ；Mag-Fura Red ；Mag-Fura-2 ；Mag-Fura-5 ；Mag-Indo-I ；鎂綠；鎂橙；孔 雀綠；海藍(lán)；Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF ；MaxiIon Brilliant Flavin 8 GFF ； Merocyanin ；甲氧基香豆素；Mitotracker Green M ；Mitotracker Orange ；Mitotracker Red ；光輝霉素；單溴二胺；單溴二胺(mBBr-GSH)；單氯二胺；MPS(甲基綠派若寧均二苯 代乙烯)；NBD ；NBD Amine ；尼羅紅；Nitrobenzoxadidole ；去甲腎上腺素；核快紅；核黃； Nylosan Brilliant lavin E8G ；俄勒岡州綠；俄勒岡州綠488-X ；俄勒岡州綠TM.；俄勒岡 州綠TM. 488 ；俄勒岡州綠TM. 500 ；俄勒岡州綠TM. 514 ；海水藍(lán)；堿性副品紅(Feulgen)； PBFI ；PE-Cy5 ；PE_Cy7 ；PerCP ；PerCP-Cy5. 5 ；PE-德州粉紅紅 613；根皮紅 B (蘇丹紅)； Phorwite AR ；Phorwite BKL ；Phorwite Rev ；Phorwite RPA ；磷化氫 3R ；光致抗蝕劑；藻紅 蛋白 BPE；藻紅蛋白 R [PE] ；PKH26(Sigma) ；PKH67 ；PMIA ；Pontochrome Blue Black ； POPO-I ； P0P0-3 ；PO-PRO-I ； P0-PR0-3 ；櫻草黃；活性黃；碘化丙啶(PI) ；PyMPO ；芘；派若 寧；派若寧 B ;Pyrozal Brilliant Flavin 7GF ； QSY 7;喹丫咽氮堿；紅 61PE-德州 粉紅；試鹵靈；RH 414 ；若丹明-2 ；若丹明；若丹明110 ；若丹明123 ；若丹明5GLD ；若丹 明6G;若丹明B;若丹明B 200;若丹明B extra ;若丹明BB ；若丹明BG ；若丹明綠；若丹 明Phallicidine ；若丹明Phalloidine ；若丹明紅；若丹明WT ；孟加拉紅；R-藻青素；R-藻 紅蛋白(PE)；紅色轉(zhuǎn)換的綠色熒光蛋白(rsGFP) ；S65A;S65C;S65L;S65T;藍(lán)寶石綠色熒 光蛋白；SBFI ；羥色胺；Sevron Brilliant Red 2B ；Sevron Brilliant Red 4G ；Sevron Brilliant Red B ；Sevron Orange ；Sevron Yellow L ；超級(jí)發(fā)光的藍(lán)色熒光蛋白.TM.； sgBFP. TM.(超級(jí)發(fā)光的藍(lán)色熒光蛋白)；超級(jí)發(fā)光的綠色熒光蛋白.TM. ；sgGFP. TM.(超級(jí) 發(fā)光的綠色熒光蛋白)；SITS;SITS(櫻草黃)；SITS(均二苯代乙烯異硫代硫酸)；SNAFL 鈣黃綠素；SNAFL-I ；SNAFL-2 ；SNARF鈣黃綠素；SNARFl ；鈉綠；光譜淡綠；光譜綠；光譜橙； 光譜紅；SPQ(6-甲氧基-N-(3-硫丙基)喹啉)；均二苯代乙烯；磺?；舻っ鰾 can C； 磺?；舻っ?Extra ；SYTO11 ；SYTO12 ；SYTO13 ；SYTO14 ；SYTO15 ；SYTO16 ；SYTO17 ；SYTO18 ； SYT020 ；SYT021 ；SYT022 ；SYT023 ；SYT024 ；SYT025 ；SYT040 ；SYT041 ；SYT042 ；SYT043 ； SYT044 ；SYT045 ；SYT059 ；SYT060 ；SYT061 ；SYT062 ；SYT063 ；SYT064 ；SYT080 ；SYT081 ； SYT082 ； SYT083 ； SYT084 ； SYT085 ； SYTOX 藍(lán)；SYTOX 綠；SYTOX 橙；四環(huán)素；四甲基若丹明 (TRITC)；德州粉紅.TM.；德州粉紅-X. TM.共軛物；Thiadicarbocyanine (DiSC3)；噻嗪紅 R ；噻嗪橙；硫代香豆素5 ；硫代香豆素S ；硫代香豆素TCN ；Thiolyte ；ThioZole Orange ； Tinopol CBS(Calcofluor White) ；TMR；TO-PRO-I ；T0-PR0-3 ；T0-PR0-5 ；TOTO-I ；T0T0-3 ； Tricolor (PE-Cy5) ；TRITC四甲基若丹明硫氰酸鹽；不退色藍(lán)；不退色紅；Ultralite ； UranineB ；Uvitex SFC ；野生型綠色熒光蛋白；Wff 781 ；X-若丹明；XRITC ；二甲苯橙；Y66F ； Y66H ；Y66W ；黃綠色熒光蛋白；黃色熒光蛋白；Y0-PR0-1 ；Y0-PR0-3 ；YOYO-1 ；Y0Y0-3 ；Sybr Green，噻唑橙(內(nèi)在的螯合染料)，半導(dǎo)體納米粒子例如量子點(diǎn)，或者被囚禁的熒光團(tuán)(其 可以利用光或者其他的電磁能量來(lái)源而被活化)或者是它們的組合。
很多各種不同的適宜的供體(D)以及受體(A)熒光團(tuán)是可以通過(guò)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)獲得 的，這些供體以及受體熒光團(tuán)是適合被用在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)中的。對(duì)于所述的探 針對(duì)所進(jìn)行的選擇受到下述因素的影響系統(tǒng)的約束，以及在所期望的應(yīng)用中所使用到的 肽所具有的長(zhǎng)度以及序列。所述的肽所具有的長(zhǎng)度以及序列將能夠?qū)τ糜谶M(jìn)行所述探針的 連接的標(biāo)記位點(diǎn)產(chǎn)生影響。存在于所述的連接位點(diǎn)之間的距離將能夠?qū)λ龅墓w/受體對(duì)的選擇產(chǎn)生影響，這歸因于所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)所具有的距離依賴性。許多 供體/受體對(duì)是可以通過(guò)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)獲得的。這些包括，但不局限于，5-羧基四甲基若丹明 (TAMRA)/QSY-7( 二芳基若丹明的衍生物)；尸胺/曙紅；色氨酸/尸胺；熒光素/德州粉紅 (若丹明)；萘/尸胺；尸胺/十八烷基若丹明(ODR)；硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)/硼-二 吡咯亞甲基(BODIPY)；鋱/若丹明；尸胺/異硫氰酸熒光素(FITC)；嵌二萘(Pyrene)/香豆 素；5-(2_碘乙?；被一?氨基萘-1-磺酸(IAEDANS)/IAFBPE/Cy5 ；以及銪/Cy5。生物 素或者其他的小親和性標(biāo)簽被用來(lái)進(jìn)行所述蛋白質(zhì)的探測(cè)，其中所述的探測(cè)是經(jīng)由抗-抗 生物素抗體或者帶有親和素/鏈霉親和素標(biāo)簽的探測(cè)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中所述的探測(cè)劑例如 是辣根過(guò)氧化物酶或者是一種熒光染料。在一個(gè)方面，指示劑化合物被用來(lái)對(duì)一種酶反應(yīng)中的一個(gè)或者多個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行探 測(cè)，其中所述的探測(cè)是通過(guò)與所述的產(chǎn)物發(fā)生直接的或者間接的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。任選 的，這些指示劑化合物是作為所述的光學(xué)信號(hào)底物溶液中的一部分而被包含在內(nèi)的。例 如，美國(guó)專(zhuān)利No. 5914245中描述了一種脂肪酶檢測(cè)，所述的檢測(cè)能夠?qū)χ舅崤c所述的熒 光性染料若丹明B之間的相互作用進(jìn)行探測(cè)?？梢岳弥甘緞┗衔锏钠渌麢z測(cè)包括那 樣的一些檢測(cè)在其中有質(zhì)子的生成的檢測(cè)，或者在一種酶反應(yīng)的過(guò)程中會(huì)發(fā)生跨膜的質(zhì) 子、電子或者離子轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。可以通過(guò)在所述的底物溶液中容納各種不同的染料的方式 對(duì)這些活性進(jìn)行探測(cè)。異硫氰酸熒光素(FITC)是一種熒光素衍生物，其被用于很多范圍 的應(yīng)用之中，包括流式細(xì)胞術(shù)。被用來(lái)對(duì)PH的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)的范例性的熒光性指示劑染 料包括熒光素以及半萘酚羅丹熒以及它們?cè)?-9的pH范圍內(nèi)的衍生物以及LysoSensor， Oregon Green以及對(duì)甲氨基酚(Rhodol)以及它們?cè)?-7的pH范圍內(nèi)的衍生物。這些熒光 性的PH指示劑可以從Molecular Probes (Eugene, Oreg.)處獲得。顯色團(tuán)染料包括百里酚 藍(lán)(Thymol Blue)(大約在1. 2-2. 8以及8. 0-0. 6的pH范圍內(nèi)是有效的)，甲基紅(Methyl Red) (pH 4. 2-6. 2)，溴百里酚藍(lán)(Bromothymol Blue) (pH 6. 0-7. 6)以及酚紅(Phenol Red) (pH 6. 8-8. 2)，其中所述的顯色團(tuán)染料所具有的最大吸收波長(zhǎng)的變化是pH的函數(shù)。當(dāng)所述 的PH變?yōu)楦鼜?qiáng)的堿性時(shí)，酚酞(pH 8. 2-10.0)由無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色。這些比色性的pH指示 劑可以從Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)處獲得。在酶學(xué)中存在許多使用pH指示劑來(lái)探 測(cè)酶活性的例子(參見(jiàn)Lowry等人于1951年在J Biol Chem《生物化學(xué)雜志》193 :265_275 中發(fā)表的文章；Khalifah于1971年在J Biol Chem《生物化學(xué)雜志》246(8) :2561_73中 發(fā)表的文章)。指示劑已經(jīng)被用來(lái)對(duì)存在于溶液之中的各種不同的水解酶所具有的活性進(jìn) 行檢測(cè)，其中所述的指示劑例如是百里酚藍(lán)以及酚紅(參見(jiàn)Moris-Varas等人于1999年在 Bioorg Med Chem《生物有機(jī)化學(xué)與藥物化學(xué)》(10) :2183_8中發(fā)表的文章)。粘液素類(lèi)型的氧_連接的糖基化作用在高等的真核細(xì)胞中存在的氧-連接的糖基化作用的最為豐富的形式被認(rèn)為是 “粘液素類(lèi)型”(參見(jiàn)Hang H以及Bertozzi C于2005年在Bioorg Med Chem《生物有機(jī)化 學(xué)與藥物化學(xué)》13(17) :5021-5034中發(fā)表的文章)。在粘液素的生物合成中的第一個(gè)步驟 是α-N-乙?；被肴樘前?GalNAc)在絲氨酸或者蘇氨酸側(cè)鏈的羥基基團(tuán)上的加成作 用從而形成了所述的Tn-抗原；這種轉(zhuǎn)移是通過(guò)所述的多肽N-乙?；?α -半乳糖基氨基 轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcTase)來(lái)完成的(參見(jiàn)Ten Hagen等人于2003年在Glycobiol 13(1) 1R-16R中發(fā)表的文章)。所述的Tn-抗原進(jìn)一步的通過(guò)下游的糖基轉(zhuǎn)移酶被進(jìn)行了精細(xì)加工從而生成了各種不同的粘液素類(lèi)型的結(jié)構(gòu)(附圖2)。到目前為止，已經(jīng)識(shí)別出超過(guò)150 種含有粘液素類(lèi)型的糖基化作用的糖蛋白，它們中有許多都參與了疾病的惡化(參見(jiàn)Hang 于2005年發(fā)表的文章)。一種這樣的例子是粘蛋白1 (MUCl)，一種已經(jīng)被識(shí)別為腫瘤抗原 的糖蛋白，這是因?yàn)樗诎┌Y上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的增加的表達(dá)，所述的糖蛋白同時(shí)促進(jìn)了癌 細(xì)胞的粘附作用以及腫瘤的入侵作用(參見(jiàn)Yu等人于2007年在J Biol Chem《生物化 學(xué)雜志》282(1) :773-781中發(fā)表的文章；Kohlgraf等人于2003年在Cancer Res《癌癥研 究》63(16) :5011-5020中發(fā)表的文章)。與癌癥有關(guān)的粘液素具有高度的免疫原性并且可 以被用來(lái)作為免疫治療的靶向(參見(jiàn)Hanisch以及Ninkovic于2006年在Curr Prot Pep Sic《蛋白質(zhì)與肽科學(xué)的當(dāng)前研究進(jìn)展》7 307中發(fā)表的文章；Tarp以及Clausen在Press Biochem Biophys Acta ^R^^iJCM )。同源性的粘液素類(lèi)型的氧_連接的糖肽以及糖蛋白的合成所述的碳水化合物疫苗的研發(fā)需要獲取大量的同源性的糖肽以及糖蛋白(參見(jiàn) Grogan等人于2002年在Annu Rev Biochem《生物化學(xué)年度回顧》71 :593_634中發(fā)表的文 章)。然而，對(duì)天然糖蛋白或者重組糖蛋白所進(jìn)行的分離僅僅能夠生成有限劑量的異源性 的糖型結(jié)構(gòu)，它們中的每一種能夠表現(xiàn)出不同的生物學(xué)性質(zhì)(參見(jiàn)Freire等人于2006年 在Glycobiol 16(11) :1150中發(fā)表的文章)。糖共軛物的化學(xué)合成提供了同源性的底物， 這是經(jīng)由固相的肽合成(SPPS)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中使用到一種被進(jìn)行了適宜保護(hù)的糖基氨基 酸構(gòu)建模塊(參見(jiàn) MarcaurelIe 以及 Bertozzi 于 2002 年在 Glycobiol，12 (6) :69R_77R 中 發(fā)表的文章)。天然的化學(xué)連接以及表達(dá)的蛋白質(zhì)連接同樣可以被用來(lái)建立糖位點(diǎn)，特別 是在較大的肽并且甚至是蛋白質(zhì)中(參見(jiàn)Muir TW于2003年在Annu Rev Biochem《生物 化學(xué)年度回顧》72 249-289中發(fā)表的文章)。在這里進(jìn)行描述的本發(fā)明之前，完成這些合 成方法仍然需要一位經(jīng)過(guò)特別訓(xùn)練的藥劑師。本發(fā)明提供了酶的生成，其中所述的酶能夠 以一種制備型的比例進(jìn)行有效的糖共軛物的合成，這對(duì)于針對(duì)它們的研究提供了很大的幫 助，其中所述的研究是出于治療目的的研究。糖基轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)化，用于進(jìn)行所述的含有碳水化合物的天然產(chǎn)物的合成對(duì)糖蛋白以及糖脂所進(jìn)行的識(shí)別導(dǎo)致了對(duì)它們作為免疫治療靶向的研究，其中所 述的糖蛋白以及糖脂在所述的癌癥細(xì)胞的表面上發(fā)生了過(guò)表達(dá)(參見(jiàn)Slovin等人于2005 年在Immunol Cell Biol《免疫學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)》83 (4) :418中發(fā)表的文章)。由于與腫瘤 有關(guān)的碳水化合物抗原通常情況下是以低水平以及各種不同的糖型結(jié)構(gòu)來(lái)表達(dá)的，對(duì)具有 充足劑量的離散的糖共軛物所進(jìn)行的分離是困難的，其中所述的糖共軛物被用來(lái)研發(fā)基于 碳水化合物的抗癌癥疫苗。在這里所描述的本發(fā)明之前，隨著所述的自動(dòng)化裝配技術(shù)的出 現(xiàn)，用于所述的碳水化合物的化學(xué)合成的一般性方法已經(jīng)得到了改進(jìn)(參見(jiàn)Plante等人于 2003 ip^ Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 《石mb^^ljUfg 生物化學(xué)進(jìn)展》第58卷，第35-54頁(yè)中發(fā)表的文章)，但是仍然需要專(zhuān)門(mén)的醫(yī)師來(lái)完成所述 的大規(guī)模的保護(hù)基團(tuán)的操作，這種操作是實(shí)現(xiàn)立體化學(xué)控制以及供體/受體兼容性的必要 元素。所述的糖共軛物的化學(xué)合成所具有的其他缺點(diǎn)包括在生成能夠滿足臨床需求的大 規(guī)模劑量時(shí)所具有的困難以及在對(duì)所述經(jīng)過(guò)合成的材料進(jìn)行純化方面所具有的困難。自然條件有效的進(jìn)行了含有碳水化合物的化合物的制備，其中使用的是糖基轉(zhuǎn)移 酶(GTase)將糖從活化的供體分子(例如，UDP糖)向所述的適宜的受體(例如，蛋白質(zhì)/肽，脂質(zhì)，其他的糖類(lèi)以及天然產(chǎn)物糖苷配基——聚酮類(lèi)以及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi))進(jìn)行了轉(zhuǎn)移， 這種轉(zhuǎn)移作用是具有絕對(duì)的化學(xué)控制/立體化學(xué)性質(zhì)的。下述的糖基轉(zhuǎn)移酶使用三種不 同的供體對(duì)多種多樣的受體進(jìn)行了糖基化作用，其中所述的供體中具有非常類(lèi)似的折疊 GtfB-葡萄糖向萬(wàn)古霉素聚酮類(lèi)中的轉(zhuǎn)移，BTG β-糖基轉(zhuǎn)移酶，以及MurG-GlcNAc在細(xì)胞 壁生物合成中的轉(zhuǎn)移。盡管大多數(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶具有高度的底物選擇性，相對(duì)較少的結(jié)構(gòu)基序被用來(lái)對(duì) 很寬范圍的糖基化受體進(jìn)行糖基化作用(參見(jiàn)Hu Y以及Walker S于2002年在Chem Biol 《生物化學(xué)》9 :1287-1296中發(fā)表的文章)。本發(fā)明提供了對(duì)已有酶的定向進(jìn)化，用以對(duì)具有 改變的底物選擇性的更加有潛力的催化劑進(jìn)行識(shí)別。更為具體的，本發(fā)明提供了對(duì)突變的 糖基轉(zhuǎn)移酶所進(jìn)行的識(shí)別，其中所述的糖基轉(zhuǎn)移酶能夠與化學(xué)合成作用進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，用以對(duì) 用于治療目的的糖共軛物進(jìn)行快速并且大規(guī)模的生產(chǎn)，其中所述的用于治療目的的糖共軛 物包括基于碳水化合物的癌癥疫苗。經(jīng)過(guò)工程化處理的糖基轉(zhuǎn)移酶具有巨大的潛力可以被用于進(jìn)行生物學(xué)有關(guān)的糖 共軛物的合成，所述的合成可以通過(guò)下述方式中的任何一種來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然的糖基化作用 所具有的催化有效性進(jìn)行的改進(jìn)，或者導(dǎo)入非天然的糖殘基(參見(jiàn)Hancock等人于2006年 在Curr Opin Chem Biol《生物化學(xué)的當(dāng)前觀點(diǎn)》10 (5) :509_519中發(fā)表的文章)。然而， 在這里所描述的本發(fā)明之前，在通過(guò)定向進(jìn)化對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行工程化處理的方面進(jìn)行了 較少的嘗試，這在很大程度上歸因于用于對(duì)突變體進(jìn)行篩選以及選擇的方法的缺乏，其中 所述的篩選以及選擇的方法是以糖基轉(zhuǎn)移酶所具有的活性為基礎(chǔ)的。近來(lái)的例子包括對(duì) 唾液酸轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Lairson等人于2006年在Nat. Chem. Biol.《天然生物化學(xué)》2 (12) 724-728中發(fā)表的文章)以及葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Williams等人于2007年在Nat. Chem. Biol.《天然生物化學(xué)》3(10) :657-662中發(fā)表的文章)的工程化處理，但是在這些情況下 所使用到的所述的篩選方法所具有的一般性是不清楚的。所述的第一種方法需要通過(guò)有能 力的克隆物對(duì)熒光性底物進(jìn)行吸收，從而通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)它們進(jìn)行分選，而所述的第二 種方法利用所述的熒光性分子本身作為所述的聚酮類(lèi)受體。在這里所描述的本發(fā)明提供了 一種一般性的策略，所述的策略允許使用天然底物或者具有最低的混亂程度的底物對(duì)多種 多樣的酶進(jìn)行體外的篩選。M13噬菌體展示是一種方便的策略，用以在對(duì)酶的工程化處理以及篩選中對(duì)表型 與基因型進(jìn)行聯(lián)系，其中所述的酶不能夠提供基于細(xì)胞的表型(參見(jiàn)Hoess R于2001年在 Chem Rev《化學(xué)回顧》101 =3205-3218中發(fā)表的文章)在噬菌體展示的酶的進(jìn)化中，將酶以 及底物以最接近的方式結(jié)合在所述的噬菌體表面之上，從而通過(guò)對(duì)所述產(chǎn)物的親和性捕獲 而達(dá)到所述文庫(kù)的去卷積作用。近來(lái)，已經(jīng)研發(fā)出一種化學(xué)的直接方法，用以將所述的底物 連接到所述的噬菌體表面上，其中使用到了硒代半胱氨酸殘基(參見(jiàn)Love等人于2006年 在Chembiochem《化學(xué)與生物化學(xué)》7 (5) :753_756中發(fā)表的文章)。在那項(xiàng)研究中，所述的 細(xì)菌性的糖基轉(zhuǎn)移酶MurG以活化的形式在噬菌體上進(jìn)行了表達(dá)；然而，一種MurG的成功 進(jìn)化并未取得成功，這歸因于所述的結(jié)合噬菌體的酶沒(méi)有能力對(duì)結(jié)合噬菌體的底物進(jìn)行利 用。在本發(fā)明中提供的所述新技術(shù)將所述的方法擴(kuò)展至真核生物的酶，并且提供了經(jīng)過(guò)改 進(jìn)的方法，用以對(duì)突變的糖基轉(zhuǎn)移酶的文庫(kù)進(jìn)行篩選。在本發(fā)明中描述的所述方法所具有的一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)是既不用對(duì)所述的酶進(jìn)行檢測(cè)，所述的底物也不需要被連接在任何類(lèi)型的固體支撐物之上，其中所述的底物是針對(duì)那些酶 而言的底物，所述的固體支撐物例如是一種固體表面，另外一個(gè)細(xì)胞，等等。而且，本發(fā)明中 所述的方法是利用經(jīng)過(guò)分泌的生物分子在溶液中完成的。本發(fā)明提供了對(duì)生物分子的篩 選，其中所述的生物分子是由單獨(dú)的細(xì)胞進(jìn)行分泌的，而不是從小菌落中進(jìn)行分泌的，其中 小菌落指的是細(xì)胞團(tuán)。除此之外，可以通過(guò)利用玻璃毛細(xì)管的顯微操作技術(shù)從所述的裝置 中對(duì)分泌活性克隆物的細(xì)胞進(jìn)行回收，并且隨后可以對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)突變用以進(jìn)行進(jìn)一步的 篩選，或者對(duì)其進(jìn)行測(cè)序用以對(duì)所編碼的酶進(jìn)行識(shí)別。在本發(fā)明中描述的所述方法所具有的另外一個(gè)區(qū)別性的特征在于在所述的篩選 過(guò)程中，對(duì)每一個(gè)文庫(kù)成員所具有的多重特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。不同于在噬菌體上進(jìn)行的表面展 示方法，可以對(duì)存在于所述的微型反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞或者酵母、所述的酶轉(zhuǎn)換的速率進(jìn) 行實(shí)施的監(jiān)測(cè)，這種監(jiān)測(cè)是以發(fā)生在所測(cè)量到的熒光強(qiáng)度上的變化為基礎(chǔ)的。使用兩種底 物來(lái)進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)允許在所述的篩選過(guò)程中對(duì)底物的特異性或者選擇性進(jìn)行直接的 監(jiān)測(cè)，其中所述的兩種底物被利用不同的熒光團(tuán)進(jìn)行了修飾。與已有的技術(shù)相比，這些測(cè)量 方法能夠提供更大程度的克隆物的多樣性，其中所述的克隆物是被識(shí)別并且篩選出來(lái)用于 下一輪中的克隆物。應(yīng)用生物催化作用是用以進(jìn)行大批量的化學(xué)制劑、醫(yī)藥品以及食品成分的合成的一種 重要工具。然而，這種應(yīng)用的數(shù)量以及多樣性受到了局限，這可能歸因于存在于酶的穩(wěn)定 性、催化性質(zhì)中的限制，即，轉(zhuǎn)換率，以及底物的范圍。一種生物催化劑的工具試劑盒的取得 將能夠幫助行業(yè)克服當(dāng)前的局限并且能夠?qū)崿F(xiàn)許多新的應(yīng)用，從一步的酶轉(zhuǎn)化到多步的微 生物合成，這是經(jīng)由代謝途徑的工程學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)所述的含有碳水化合物的天然產(chǎn)物的生物合成是行業(yè)內(nèi)格外感興趣的，因?yàn)橥?過(guò)傳統(tǒng)的方式對(duì)它們進(jìn)行合成時(shí)需要冗長(zhǎng)的保護(hù)基團(tuán)的操作技術(shù)以及在糖基化供體/受 體兼容性方面的研究。來(lái)自于糖蛋白或者糖脂構(gòu)建體的治療性的疫苗是用于進(jìn)行癌癥的免 疫治療的一種有前途的方式，其中所述的糖蛋白或者糖脂構(gòu)建體在所述的惡性細(xì)胞的表面 上發(fā)生了過(guò)表達(dá)。新的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的合成具有抗生素抗性的細(xì)菌感染的增加的發(fā)生率預(yù)示著對(duì)改進(jìn)的構(gòu)建體的需求，其 中所述的構(gòu)建體用來(lái)對(duì)感染有腸球菌的患者進(jìn)行治療。許多大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)以及聚酮類(lèi)抗生 素中含有碳水化合物，這些碳水化合物能夠參與對(duì)一種細(xì)胞靶向的識(shí)別并且因此對(duì)于活 性而言是必不可少的(參見(jiàn)Walsh C于2003年發(fā)表的Antibiotics :Actions，origins, resistance《抗生素的作用，來(lái)源，抗性》第1版；美國(guó)微生物學(xué)會(huì)出版社(Americal Society for Microbiology Press)華盛頓)。在所述的糖取代基上及其周?chē)鷮?duì)已有的糖肽類(lèi)抗 生素所進(jìn)行的修飾已經(jīng)引發(fā)了新的治療劑的臨床試驗(yàn)，其中所述的治療劑包括奧利萬(wàn)星 (oritavancin)，所述的糖肽類(lèi)抗生素例如是萬(wàn)古霉素以及替考拉寧(參見(jiàn)Dong等人于 2002年在J Am Chem Soc《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》124 =9064-9065中發(fā)表的文章)。糖基轉(zhuǎn)移 酶的適應(yīng)作用將為針對(duì)治療試劑的研究提供新的材料，其中所述的糖基轉(zhuǎn)移酶作為催化劑 被用于多種多樣的碳水化合物與天然產(chǎn)物聚酮類(lèi)、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)的連接反應(yīng)之中。在本 發(fā)明中提供的所述方法能夠?qū)γ高M(jìn)行識(shí)別，其中所述的酶能夠有效的對(duì)一定范圍的底物進(jìn)行糖基化處理并且繼續(xù)進(jìn)行所述催化劑的生成，其中所述的催化劑能夠與化學(xué)合成反應(yīng)進(jìn) 行競(jìng)爭(zhēng)，用以對(duì)糖共軛物進(jìn)行快速并且大規(guī)模的生產(chǎn)。實(shí)施例1. 一種新技術(shù)的形成，所沭的技術(shù)被用來(lái)對(duì)具有改講的催化活件或者改 棚底皿鼎白_棚·細(xì)〒·下面的試驗(yàn)是由下述的內(nèi)容組成的(1)對(duì)一種技術(shù)進(jìn)行的描述，所述的技術(shù)用 于對(duì)一種酵母細(xì)胞文庫(kù)進(jìn)行空間分割，其中所述的酵母細(xì)胞能夠分泌一種目標(biāo)酶，以及(2) 對(duì)來(lái)自于一種滅活變體中的細(xì)胞進(jìn)行富集，用以確定所述的技術(shù)所具有的敏感性，其中所 述的細(xì)胞能夠表達(dá)一種活化的蛋白酶。簡(jiǎn)要的說(shuō)，將一種酵母細(xì)胞文庫(kù)裝載于具有50微米 的直徑的微孔內(nèi)，其中所述的酵母細(xì)胞能夠分泌出一種目標(biāo)蛋白質(zhì)，這樣一來(lái)每一個(gè)孔中 平均含有一個(gè)文庫(kù)成員。利用酶底物以平行的方式對(duì)存在于所述的裝置中的每一個(gè)間隔進(jìn) 行查看；成功的酶轉(zhuǎn)換會(huì)產(chǎn)生一種熒光性的信號(hào)。利用一種蛋白酶對(duì)所述的技術(shù)所具有的 可行性進(jìn)行證明?？椎奈⒅圃礻嚵幸呀?jīng)被用在多種多樣的生物學(xué)應(yīng)用之中。已經(jīng)證實(shí)微孔能夠被 有效的用來(lái)在所述的單一分子的水平上對(duì)酶學(xué)進(jìn)行研究，并且具有50-100微米的直徑的 孔已經(jīng)被用來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離，用以對(duì)在一種表面上捕獲到的分泌產(chǎn)物進(jìn)行篩選(參見(jiàn) Rondelez等人于2005年在Nat Biotechnol《自然生物技術(shù)》23 (3) :361_365中發(fā)表的文 章；Love等人于2006年在Nat Biotechnol《自然生物技術(shù)》24 (6) :703_707中發(fā)表的文 章)。屬于后面那種類(lèi)型的微型裝置在一種通常的顯微鏡載玻片尺寸(l”x 3”)的腳本中 含有大約100000個(gè)孔，這使得在一臺(tái)光學(xué)顯微鏡上在一天的時(shí)間內(nèi)使用10個(gè)這樣的裝置 對(duì)具有適度大小的文庫(kù)(IO6個(gè)成員)進(jìn)行篩選是可能的。表達(dá)宿主的篩選本發(fā)明提供了對(duì)由細(xì)胞分泌的生物分子的篩選。在一個(gè)方面，所述的細(xì)胞是原核 細(xì)胞。或者可供選擇的，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。優(yōu)選的，所述的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。一 種范例性的酵母細(xì)胞包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。能夠分泌出質(zhì)粒編碼的 蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞被用來(lái)進(jìn)行所述酶的表達(dá)，其中所述的酶被用來(lái)通過(guò)本發(fā)明中所述的 方法來(lái)進(jìn)行進(jìn)化。真核生物的表達(dá)宿主，例如酵母，在所述的多種多樣的酶的進(jìn)化方面提 供了超越細(xì)菌性表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，其中所述的酶包括多肽N-乙酰基-α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移 酶(ppGalNAcTase)，因?yàn)樗鼈兒羞M(jìn)行適宜的蛋白質(zhì)折疊、分泌以及翻譯后的修飾所必需 的機(jī)構(gòu)。對(duì)于使用微型裝置所進(jìn)行的空間分割而言，酵母同樣具有一種理想的大小(大約 5-10微米的直徑)，所述的空間分割是以每孔一個(gè)細(xì)胞的比例進(jìn)行的，其中每一個(gè)孔具有 50微米的直徑。除此之外，酵母快速的發(fā)生分裂，使得在幾小時(shí)內(nèi)對(duì)一種文庫(kù)成員所具有的 基因型進(jìn)行鑒定成為可能，其中所述的文庫(kù)成員來(lái)自于一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞。酵母細(xì)胞所具有的分泌被編碼的酶的能力相對(duì)于細(xì)胞周期而存在變化；在所述的 萌芽過(guò)程中，酵母在蛋白質(zhì)的分泌方面最為有效。在一個(gè)方面，通過(guò)使用酵母的表面展示對(duì) 所述酵母在分泌方面存在的大程度的變化進(jìn)行規(guī)避，或者對(duì)所述酵母無(wú)法分泌一種特定的 目標(biāo)蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行規(guī)避。酵母的表面展示已經(jīng)被有效的用在多種多樣的抗體的進(jìn)化反 應(yīng)中，并且?guī)追N活化的酶之前已經(jīng)被展示在所述酵母的表面之上(參見(jiàn)Gai以及Wittrup 于2007年在Current Opinion in Structural Biology《結(jié)構(gòu)生物學(xué)的當(dāng)前觀點(diǎn)》17 (4) 467-473中發(fā)表的文章)。
利用一種模型酶對(duì)所述的技術(shù)進(jìn)行的校驗(yàn)首先利用所述的3C類(lèi)型的半胱氨酸蛋白酶對(duì)上述發(fā)明的酶的篩選策略所具有的 可行性進(jìn)行測(cè)試，其中所述的半胱氨酸蛋白酶來(lái)自于煙草蝕刻病毒(TEV)(參見(jiàn)Malcolm B 于1995年在Protein Sci《蛋白質(zhì)科學(xué)》4(8) 1439-1445中發(fā)表的文章)。在煙草蝕刻病 毒(TEV)中的殘基151上的催化性的半胱氨酸上發(fā)生的突變產(chǎn)生了一種催化性質(zhì)滅活的變 體，其中所述的突變從半胱氨酸變?yōu)榱吮彼?參見(jiàn)Phan等人于2002年在J Biol Chem 《生物化學(xué)雜志》277 (52) :50564-50572中發(fā)表的文章)。以各種不同的比例(1 10000， 1 100,1 10)將含有所述基因的載體進(jìn)行混合，其中所述的基因是煙草蝕刻病毒(TEV) 蛋白酶的天然物種以及突變物種的基因，并且所述的載體混合物被用來(lái)建立一種模型文 庫(kù)，用于進(jìn)行所述的催化活性物種的富集。按照上文中所概述的內(nèi)容將利用所述的載體混 合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞分割在孔內(nèi)(附圖1)。使用對(duì)煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶而言 的最適宜的識(shí)別位點(diǎn)(ENLYFQG;序列識(shí)別號(hào)1)對(duì)所述的檢測(cè)所具有的敏感度進(jìn)行確定， 將其作為一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)底物的一部分(選項(xiàng)1 ；附圖3)(參見(jiàn)Malcolm于 1995年發(fā)表的文章；Behlke等人于2005年在Integrated DNA Technologies《綜合DNA技 術(shù)》中發(fā)表的文章Fluorescence and fluorescence applications《熒光性以及熒光性的 應(yīng)用》)。在所述的谷氨酸以及甘氨酸殘基之間發(fā)生的肽的斷裂破壞了所述的分子內(nèi)的熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的淬火并且生成了一種熒光信號(hào)。催化活性以及底物特異性的進(jìn)化經(jīng)過(guò)了克隆物的成功富集之后，開(kāi)始進(jìn)行用于所述的煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶 的定向進(jìn)化的模型試驗(yàn)，其中所述的克隆物能夠表達(dá)活性催化劑。為了對(duì)所述的篩選能力 進(jìn)行進(jìn)一步的證明，使用錯(cuò)配PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對(duì)所述的滅活的C151A突變體進(jìn)行隨 機(jī)突變，用以恢復(fù)成為具有催化能力的變體，其中所述的篩選是以所述的催化活性為基礎(chǔ) 的。盡管活性將可能被得以重建，利用改變的變異作用對(duì)有能力的變體進(jìn)行識(shí)別是可能的， 其中所述活性的重建是發(fā)生在殘基151上的所述變異作用的直接逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。由于所具有 的對(duì)酶的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行篩選的能力是可以預(yù)期的，對(duì)具有增強(qiáng)的催化活性的克隆物進(jìn)行識(shí)別 是可能的，其中所述的增強(qiáng)是相較于野生型煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶而言的。最終，可以 對(duì)一種變體文庫(kù)進(jìn)行檢查，其中所述的變體文庫(kù)是通過(guò)所述的野生型煙草蝕刻病毒(TEV) 蛋白酶的突變作用而構(gòu)建的，所述的突變作用被用來(lái)進(jìn)行一種非天然底物的斷裂(選項(xiàng) 2(2，X為丙氨酸)附圖3)。經(jīng)過(guò)每一輪的篩選之后，通過(guò)利用一種玻璃毛細(xì)管的顯微操作 技術(shù)將分泌活性克隆物的細(xì)胞從所述的裝置中回收。經(jīng)過(guò)回收的克隆物將可以被進(jìn)行隨機(jī) 突變用以進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，或者被進(jìn)行測(cè)序，用以對(duì)所編碼的酶進(jìn)行識(shí)別。實(shí)施例2. —種具有改進(jìn)的催化活性的突變的糖基轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)化下面的試驗(yàn)是由多肽N-乙?；? α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcTase)突變 體的進(jìn)化所構(gòu)成的，其中所述的多肽N-乙?；? α _半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcTase) 具有增強(qiáng)的催化有效性以及改變的底物特異性。微型裝置被用來(lái)對(duì)多肽N-乙?；?α -半 乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶-TKppGalNAcTase-Tl)突變體進(jìn)行篩選，其中所述的突變體具有改進(jìn) 的催化有效性。多肽N-乙?；?α-半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcTase)負(fù)責(zé)進(jìn)行所述 的α-N-乙?；被肴樘前?alpha-GalNAc)向絲氨酸/蘇氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，從而形成了 所述的Tn-抗原，一種與腫瘤有關(guān)的碳水化合物表位。在這項(xiàng)篩選中被識(shí)別出來(lái)的突變體被用來(lái)進(jìn)行所述的Tn-抗原的體外合成。一種鼠科動(dòng)物多肽N-乙酰基-α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl) 的新近的晶體結(jié)構(gòu)表明，這種蛋白質(zhì)能夠發(fā)生折疊從而形成獨(dú)特的催化結(jié)構(gòu)域以及外源 凝集素結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)Fritz等人于2004年在Proc Natl Acad Sci《美國(guó)科學(xué)院院刊》 101(43) 15307-15312中發(fā)表的文章)。錯(cuò)配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)被用來(lái)建立多肽N-乙 ?；?α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl)的隨機(jī)文庫(kù)，其中所述的多肽N-乙 ?；?α-半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶-TKppGalNAcTase-Tl)在其催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)生了突變。按 照之前所描述的對(duì)一種轉(zhuǎn)化體的文庫(kù)進(jìn)行空間上的分割并且使用熒光性的底物對(duì)其進(jìn)行 篩選(附圖4)。熒光性的多肽N-乙?；?α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcTase)底物的設(shè)計(jì) 以及合成一種經(jīng)過(guò)熒光素修飾的UDP-糖類(lèi)供體連同一種經(jīng)過(guò)5-羧基四甲基若丹 明(TAMRA)修飾的肽受體一同，允許在經(jīng)過(guò)糖基化作用之后在580納米下進(jìn)行產(chǎn)物的 探測(cè)，這種探測(cè)歸因于存在于所述的兩種熒光團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)(參 見(jiàn)Behlke于2005年發(fā)表的文章)。根據(jù)關(guān)于多肽N-乙?；?α _半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移 酶-TKppGalNAcTase-Tl)以及其他被保留的糖基轉(zhuǎn)移酶所具有的UDP-糖類(lèi)結(jié)合袋的結(jié)構(gòu) 信息，按照先前針對(duì)UDP-N-乙?；咸烟前?GlcNAc)所進(jìn)行的報(bào)道對(duì)一種UDP-N-乙?；?氨基半乳糖胺(GalNAc)底物(3)進(jìn)行合成，其中所述的底物在C-2處承載有熒光素(參見(jiàn) Fritz于2004年發(fā)表的文章；Patenaude于2002年發(fā)表的文章；Helm等人于2003年在J Am Chem Soc《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》125 :11168_11169中發(fā)表的文章)。使用可以商業(yè)購(gòu)買(mǎi) 獲得的試劑，利用一種C-末端5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)對(duì)含有一種最優(yōu)化的底物序 列(GAGAFFPTPGPAGAGK ；序列識(shí)別號(hào)2)的受體肽4進(jìn)行合成，其中所述的序列用于通過(guò)多 肽N-乙?；?α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl)而進(jìn)行糖基化作用(參見(jiàn) Gerken等人于2006年在J Biol Chem《生物化學(xué)雜志》281 (43) :32403_32416中發(fā)表的文 章)?；厥湛寺∥锼哂械幕钚缘拇_認(rèn)經(jīng)過(guò)足夠輪的文庫(kù)篩選以及擴(kuò)增之后(通常情況下為4-6輪)，通過(guò)利用一種毛細(xì) 玻璃管的顯微操作技術(shù)將分泌活性克隆物的細(xì)胞從所述的裝置中回收出來(lái)，并且隨后對(duì)其 進(jìn)行隨機(jī)突變用以進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，或者對(duì)其進(jìn)行測(cè)序用以對(duì)所編碼的酶進(jìn)行識(shí)別。利 用天然、未經(jīng)修飾的UDP-N-乙酰基氨基半乳糖胺(GalNAc)以及肽底物對(duì)所編碼的酶進(jìn)行 測(cè)試，用以識(shí)別出那些最能夠進(jìn)行所述Tn-抗原的體外合成的酶。具有這種能力的文庫(kù)成 員被用來(lái)對(duì)Tn-抗原進(jìn)行大量的合成，用以進(jìn)行進(jìn)一步的研究，其中所述的研究針對(duì)的是 所述抗原所具有的免疫學(xué)性質(zhì)以及在研發(fā)抗癌癥疫苗方面所具有的可能的用途。經(jīng)過(guò)分泌的酶或者在表面展示的酶可能不能夠?qū)写篌w積熒光團(tuán)的合成底物 進(jìn)行利用，其中所述的大體積熒光團(tuán)是被導(dǎo)入用以對(duì)酶的功能進(jìn)行檢測(cè)的。在一個(gè)方面，存 在于每一種底物之中的所述熒光團(tuán)所具有的位置是存在變化的，直至獲得了一種可以接受 的版本，其中所述的底物特別是所述的經(jīng)過(guò)修飾的UDP-N-乙?；被肴樘前?GalNAc)。 或者可供選擇的，經(jīng)過(guò)疊氮官能團(tuán)化的UDP糖類(lèi)被常規(guī)性的用來(lái)進(jìn)行體內(nèi)的糖基化作用 的研究；所述的疊氮基團(tuán)是一種有效的化學(xué)標(biāo)簽，用于進(jìn)行進(jìn)一步的衍生化以及底物的探測(cè)(參見(jiàn)Campbell等人于2007年在Molecular Biosystems《分子生物系統(tǒng)》3(3) 187-194中發(fā)表的文章)。在另外一個(gè)方面，所述的多肽N-乙?；?α -半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移 酶(ppGalNAcTase)受體肽是利用生物素進(jìn)行修飾的，從而允許在一種夾心類(lèi)型的檢測(cè)中 利用一種外源凝集素或者抗體對(duì)發(fā)生耦合的產(chǎn)物進(jìn)行捕獲以及隨后的探測(cè)。在一個(gè)方面， 所述的生物素標(biāo)簽被用在親和色譜法中，其中在所述的親和色譜法中一同使用了一種結(jié)合 有親和素(也可以是鏈霉親和素以及中性親和素)的柱，其中所述的親和素是生物素的天 然螯合劑?；蛘呖晒┻x擇的，這種標(biāo)簽被用在所述蛋白質(zhì)的探測(cè)中，其中所述的探測(cè)是經(jīng)由 抗生物素抗體或者帶有親和素/鏈霉親和素標(biāo)簽的探測(cè)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中所述的探測(cè)劑例 如是辣根過(guò)氧化物酶或者是一種熒光染料。具有改變的底物優(yōu)先性的突變的多肽N-乙?；?α-半乳糖基氨基轉(zhuǎn)移酶 (ppGalNAcTase)的進(jìn)化對(duì)一種被保留的糖基轉(zhuǎn)移酶所進(jìn)行的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)表明，所述酶所具有的具體殘 基與存在于所述的UDP糖類(lèi)供體(C-3以及C-4)中的半族所發(fā)生的接觸能夠增強(qiáng)UDP-N-乙 ?；被肴樘前?GalNAc)所具有的特異性，這種特異性的增強(qiáng)是相對(duì)于UDP-N-乙?；?葡萄糖胺(GlcNAc)而言的，其中所述的被保留的糖基轉(zhuǎn)移酶與多肽N-乙?；?α-半乳糖 基氨基轉(zhuǎn)移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl)是高度相關(guān)的(參見(jiàn)Patenaude等人于2002年在 Nat Struct Biol《天然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》9 (9) :685_690中發(fā)表的文章；Fritz等人于2006年 在J Biol Chem《生物化學(xué)雜志》281 (13) :8613_8619中發(fā)表的文章)。如上所述的利用一 種經(jīng)過(guò)熒光素修飾的UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)供體對(duì)所述的突變的T 1變體文庫(kù) 所進(jìn)行的篩選產(chǎn)生了這樣的克隆物，所述的克隆物能夠?qū)@種非天然的底物進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并 且增加了對(duì)于所述的糖基轉(zhuǎn)移酶所具有的活性位點(diǎn)特異性的理解。向其他的粘液素類(lèi)型的糖共軛物的合成的擴(kuò)展通過(guò)對(duì)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶ST6GalNAc_l進(jìn)行的突變對(duì)上文中所描述的合成進(jìn)行擴(kuò) 展，用以制備所述的唾液酸基Tn-抗原(附圖2)，其中使用到所述的體外合成的Tn-抗原作 為底物。酶的研發(fā)使得能夠?qū)@種類(lèi)型的糖共軛物進(jìn)行生物學(xué)的研究，其中所述的酶被用 來(lái)進(jìn)行各種不同的粘液素類(lèi)型的核心結(jié)構(gòu)的體外合成，所述的糖共軛物被牽涉在各種不同 的疾病之中。^MM 3.——fl夷島素Iff裂粉測(cè)丨下述的試驗(yàn)證實(shí)了在一種不含有細(xì)胞的微孔系統(tǒng)內(nèi)對(duì)酶活性所進(jìn)行的探測(cè)。在附 圖11中用圖表表示出的是一種用于在微孔內(nèi)對(duì)酶的轉(zhuǎn)換進(jìn)行探測(cè)的方法，其中所述的探 測(cè)是經(jīng)由一種胰島素?cái)嗔褭z測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在微孔內(nèi)，利用10微克/毫升的異硫氰基熒光 素_酪蛋白(FTC-casein)對(duì)增加濃度的(0. 05微克/毫升，0. 5微克/毫升，以及5微克/ 毫升)胰島素進(jìn)行1小時(shí)的培養(yǎng)。正如附圖12中所表示出的，所觀察到的熒光性信號(hào)所具 有的強(qiáng)度取決于存在于所述的微孔之中的所述胰島素具有的濃度。在一項(xiàng)單獨(dú)的試驗(yàn)中， 在微孔內(nèi)利用10微克/毫升的異硫氰基熒光素_酪蛋白(FTC-casein)對(duì)0. 5微克/毫升 的胰島素進(jìn)行培養(yǎng)，并且在1小時(shí)以及18小時(shí)時(shí)拍攝顯微鏡照片。正如附圖13中所表示 出的，所觀察到的熒光性信號(hào)所具有的強(qiáng)度取決于所述的培養(yǎng)時(shí)間。微孔之前已經(jīng)被用來(lái) 對(duì)在微孔內(nèi)分離的酶進(jìn)行研究。參見(jiàn)，JP2004309405A1 ；以及Rondelez等人于2005年在 Nat Biotechnol《自然生物技術(shù)》23 (3) :361_365中發(fā)表的文章。
4.發(fā)牛在微孔中的分泌的_的轉(zhuǎn)換——ΚΛ-mm -3C(HRV-3C)蛋

下述試驗(yàn)證明了一種酶對(duì)一種肽底物所進(jìn)行的斷裂，從而利用一種明亮的熒光性 信號(hào)對(duì)含有活性酶的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，其中所述的酶即為由存在于本發(fā)明中所述的微型裝置 中的單獨(dú)的巴斯德畢赤酵母(酵母)細(xì)胞分泌得到的蛋白酶，所述的肽底物上帶有一種熒 光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)報(bào)告基因?qū)?。具體的，巴斯德畢赤酵母經(jīng)過(guò)了遺傳工程化處理， 從而分泌出人類(lèi)鼻病毒3C蛋白酶(HRV-3CP)，所述的蛋白酶能夠切斷一種肽底物的序列 (EDANS-A-L-E-V-L-F-Q/G-P-K-DABCYL ；序列識(shí)別號(hào)3)。在附圖14中用圖表表示的是一種 用以對(duì)存在于微孔中的酶的轉(zhuǎn)換進(jìn)行探測(cè)的方法，其中所述的探測(cè)是經(jīng)由人鼻病毒-3C蛋 白酶(HRV-3CP)檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將能夠分泌所述的人鼻病毒-3C蛋白酶(HRV-3CP)酶的巴 斯德畢赤酵母裝載于所述的微型裝置之中。在存在有所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)肽 底物(EDANS-A-L-E-V-L-F-Q/G-P-K-DABCYL;序列識(shí)別號(hào)3)的條件下，在所述的微型裝置 中對(duì)所述的細(xì)胞進(jìn)行18小時(shí)的培養(yǎng)，其中所述的肽底物是以100微克/毫升的水平在YPD 中提供的，在所述的YPD中補(bǔ)充有50毫摩的Tris，pH為7. 0，150毫摩的氯化鈉，以及1毫 摩的乙二胺四乙酸(EDTA)。所述被分泌的酶成功的切斷了所述的底物，生成了一種熒光性 的信號(hào)。存在于所述的附圖15的左側(cè)小組中的箭頭指向的是存在于孔中的細(xì)胞，所述的細(xì) 胞對(duì)應(yīng)于在所述的附圖15的右側(cè)小組中很好的觀察到的明亮的熒光。
權(quán)利要求
1.一種用以實(shí)現(xiàn)溶液相的生物分子的篩選的方法，包括將一種細(xì)胞文庫(kù)沉積在一種微型裝置之上，其中在所述的微型裝置中含有能夠?qū)Υ嬖?于溶液之中的所述細(xì)胞進(jìn)行空間上的分割的孔，其中所述的細(xì)胞以大約每孔一個(gè)細(xì)胞的水 平被進(jìn)行了分配，其中大量的細(xì)胞能夠在所述的溶液中分泌至少一種生物分子的變體；將所述的經(jīng)過(guò)分泌的生物分子變體與至少一種光學(xué)信號(hào)底物進(jìn)行接觸，每一種代表著 一種期望的生物分子的表型或者活性；以多種參數(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)由所述的細(xì)胞編碼的所述生物分子所具有的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且將所述的細(xì)胞從所述的微型裝置中分離出來(lái)，其中所述的細(xì)胞分泌出一種期望的生物 分子變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中通過(guò)下述方式對(duì)所述的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)對(duì)一種 或者多種光學(xué)信號(hào)隨時(shí)間的變化進(jìn)行探測(cè)，其中所述的光學(xué)信號(hào)是由存在于所述的細(xì)胞文 庫(kù)之中的一種或者多種光學(xué)信號(hào)底物產(chǎn)生的，其中這樣的變化代表著所述的生物分子的變 體所具有的期望的生物分子表型或者活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其中所述的光學(xué)信號(hào)是一種熒光性的信號(hào)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其中在所述的微型裝置中以實(shí)時(shí)的方式或者近似于 實(shí)時(shí)的方式對(duì)所述的生物分子的表型或者活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中所述的監(jiān)測(cè)是以所述的熒光 性信號(hào)所具有的強(qiáng)度所發(fā)生的變化為基礎(chǔ)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的生物分子選自由下述所組成的組中肽， 多肽，蛋白酶，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂解酶，異構(gòu)酶，連接酶，酶，抗體，細(xì)胞因子，趨 化因子，核酸，代謝產(chǎn)物，小分子(小于1千道爾頓)以及合成分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其中所述的生物分子所具有的分子量超過(guò)大約600 道爾頓并且小于大約100000道爾頓。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的參數(shù)選自由下述參數(shù)所組成的組中催 化速率，反應(yīng)的特異性，動(dòng)力學(xué)有效性，以及底物的結(jié)合親和性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的參數(shù)是以平行的方式被進(jìn)行評(píng)價(jià)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的方法，其中所述的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的細(xì)胞具有存在于大約10微米至100微 米之間的直徑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中通過(guò)利用一種玻璃毛細(xì)管的顯微操作技術(shù)對(duì) 所述的細(xì)胞進(jìn)行分離。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其中進(jìn)一步的包括對(duì)所述的生物分子進(jìn)行隨機(jī)突 變的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其中進(jìn)一步的包括對(duì)所述的生物分子進(jìn)行測(cè)序的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的生物分子是一種突變的糖基轉(zhuǎn)移酶 (GTase)或者是一種糖苷酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中所述的方法，其中所述的糖基轉(zhuǎn)移酶能夠與化學(xué)合成方法進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，用以對(duì)復(fù)雜的碳水化合物進(jìn)行快速并且大規(guī)模的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法，用以在單獨(dú)的微型反應(yīng)器中從變體細(xì)胞的文庫(kù)中對(duì)特定的成員進(jìn)行分離，其中對(duì)由所述的細(xì)胞分泌出的生物分子所具有的表型進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述的評(píng)價(jià)是以多種參數(shù)為基礎(chǔ)的，包括底物特異性以及動(dòng)力學(xué)有效性。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102112624SQ200980129829
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者J·C·洛夫, K·洛夫 申請(qǐng)人:麻省理工學(xué)院