專利名稱：生產(chǎn)己二?；?7-adca的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)N-己二酰化的β-內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株，它們的構(gòu)建方 法，以及鑒定與功能性失活涉及己二酸降解的基因和酶的方法。
背景技術(shù)：
半合成的β -內(nèi)酰胺抗生素(SSA’ S)從β -內(nèi)酰胺中間產(chǎn)物開始以工業(yè)規(guī)模生 產(chǎn)，例如6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)、7-氨基-去乙酰氧基-頭孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基頭 孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸酯/鹽(7-ACCA)、7_氨基_3_[ (Z/ E)-l_丙烯-1-基]-3-頭孢烯-4-羧酸酯/鹽(7-PACA)、7-氨基去乙?；^孢烷酸 (7-ADAC)、7_氨基-3-氨甲?；跫谆?3-頭孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)等等。第一代7-ADCA制品衍生自PenG，其中5_元青霉烯環(huán)到6_元頭孢烯環(huán)的擴(kuò)環(huán) 和隨后苯乙?；?7-ADCA苯乙酸側(cè)鏈的切割均使用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。下一代7-ADCA制品 仍然從PenG獲得，但是在化學(xué)擴(kuò)環(huán)之后，使用合適的(青霉素)?；该复偾谐揭阴?基-7-ADCA的苯乙酸側(cè)鏈。已開發(fā)出其它方法，其中使用合適的擴(kuò)環(huán)酶體外進(jìn)行PenG到苯 乙?；?7-ADCA的擴(kuò)環(huán)，但是這些方法僅具有很低的工業(yè)重要性。最近期和最精致的7-ADCA生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)下述Penicillium chrysogenum, 所述Penicillium chrysogenum用編碼合適擴(kuò)環(huán)酶的基因轉(zhuǎn)化并表達(dá)所述基因。該經(jīng)改 造的Penicillium chrysogenum菌株在存在己二酸作為側(cè)鏈前體時(shí)在發(fā)酵管中生長(zhǎng)時(shí)， 生產(chǎn)并分泌己二?；?7-ADCA-見W093/05158。在該生產(chǎn)過程中，從發(fā)酵液中回收己二酰 基-7-ADCA，對(duì)其進(jìn)行合適的酰基酶處理，從而切除己二酸側(cè)鏈，之后進(jìn)一步純化、結(jié)晶和 干燥由此獲得的7-ADCA。其它側(cè)鏈前體已公開于W095/0414W2-(羧乙基硫代)乙酸和 3_(羧甲基硫代)_丙酸)、W095/04149Q-(羧乙基硫代)丙酸)、W096/38580 (苯乙酸)和 W098/048034和W098/048035 (多種二羧酸)中。擴(kuò)環(huán)酶負(fù)責(zé)多種N-酰基化青霉烷酸5元 環(huán)的擴(kuò)環(huán)，從而得到相應(yīng)的N-酰化去乙酰氧基頭孢烷酸。然而，除了被用作側(cè)鏈前體以外，己二酸鹽可以被降解并在初級(jí)代謝中被用作碳 源。這由 Robin et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 57，357-362))在使用蔗糖 作為主要碳源的分批培養(yǎng)物中證實(shí)。耗盡(源自蔗糖的)葡萄糖和果糖后，開始形成己二 ?；?6-APA和己二酰基-7-ADCA，并且在這一階段中，僅至多2%的己二酸被并入β -內(nèi) 酰胺化合物中，而剩余部分被用作碳源。作者提出，由于己二酸和脂肪酸之間的相似性， 己二酸降解很可能通過β-氧化而發(fā)生。在較晚的研究中，Thykaer et al. (Metabolic Engineering(2002) ,4,151-158)以生產(chǎn)己二?；?7-ADCA 的 Penicillium chrysogenum 菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)分析為基礎(chǔ)得出下述結(jié)論己二酸鹽降解通過氧化酶發(fā)生在微體 (乙醛酸循環(huán)體)中，而不是胞質(zhì)溶膠或線粒體中。通常(絲狀)真菌和酵母中，特別是 Penicillium chrysogenum中，在細(xì)胞內(nèi)定位、涉及的酶以及β -氧化途徑在微生物總體代 謝中的作用方面，氧化途徑的本質(zhì)仍然是不清楚的。為了減少己二酸降解，Thykaer et al. (2002)已提出缺失負(fù)責(zé)己二酸鹽降解的 酶，然而沒有將任何此類酶指定為合適的候選者。然而迄今為止，沒有提供直接或明確的證據(jù)表明己二酸實(shí)際上通過β-氧化途徑被降解。最有可能地，己二酸的降解還涉及其 它降解機(jī)制，例如所謂的苯甲酸鹽降解途徑(http://www. genome, ad. jp/dbget-bin/get pathway ？ org name = sma&mapno = 00362)。在所述途徑中，3-氧代己二酸鹽在兩個(gè)步驟 中被轉(zhuǎn)化成琥珀?；?CoA和乙?；?CoA——與Thykaer et al. (2002)的研究鑒定的產(chǎn)物 相同。己二酸鹽可以被Penicillium chrysogenum的酶很好地氧化，并且通過所述途徑將 獲得的己二酸鹽隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)中央碳代謝途徑。為了防止此類降解途徑對(duì)己二酸的任何損失，人們必須在早期步驟中，優(yōu)選地在 第一步驟中阻斷所述途徑。然而，所提出的己二酸鹽降解途徑以及內(nèi)酰胺生物合成途 徑均以相同的反應(yīng)開始，即用CoA-連接酶將己二酸活化成己二?；?CoA。另外，兩種途徑 均被指出位于過氧化物酶體中。因此，通過簡(jiǎn)單地按照作者的建議和抑制或缺失氧化 途徑的第一個(gè)酶，人們最可能還會(huì)抑制內(nèi)酰胺生物合成，這是甚至更不利的。發(fā)明詳述本發(fā)明在第一方面提供了用于鑒定能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的 微生物菌株的一個(gè)或多個(gè)下述基因的方法，所述基因編碼涉及己二酸鹽降解和/或脂肪酸
氧化的一種或多種酶，所述方法包括以下步驟a.選擇涉及己二酸鹽降解和/或脂肪酸β-氧化的一個(gè)或多個(gè)已知基因的核苷酸 序列和/或任選地由所述基因編碼的一種或多種已知酶的氨基酸序列；b.使用從步驟(a)中選擇的序列作為BLAST搜索中的探針，用于在能夠生產(chǎn)N-己 二?；膬?nèi)酰胺化合物的微生物菌株的可獲得的核苷酸或氨基酸序列中鑒定同源序 列。涉及脂肪酸β-氧化的酶可選自以下組 第 I 組CoA 連接酶(EC 6. 2. 1. xx) 第 II 組?；?CoA 脫氫酶(EC 1. 3. 99. xx)和?；?CoA 氧化酶(EC 1. 3. 3. xx) 第 III 組烯酰-CoA 水合酶(EC 4. 2. 1. 17) 第 IV 組3-羥基酰基-CoA 脫氫酶(EC 1. 1. 1.35) 第V組乙?；?CoA C-酰基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶-EC 2.3.1. 16)在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所選擇的序列(探針)是已知的基因的核苷酸序列或 已知的酶氨基酸序列(任選地由所述基因編碼的)，并且可選自(但不限于)由以下基因和 /或氨基酸序列組成的組(見表1)。表 權(quán)利要求
1.用于鑒定能夠生產(chǎn)N-己二?；膬?nèi)酰胺化合物的微生物菌株的一個(gè)或多個(gè)下 述基因的方法，所述基因編碼涉及己二酸鹽降解和/或脂肪酸β -氧化的一種或多種酶，所 述方法包括以下步驟a.選擇涉及己二酸鹽降解和/或脂肪酸β-氧化的一個(gè)或多個(gè)已知基因的核苷酸序列 和/或任選地由所述基因編碼的一種或多種已知酶的氨基酸序列；b.使用從步驟(a)中選擇的序列作為BLAST搜索中的探針，用于在能夠生產(chǎn)N-己二酰 化的內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株的可獲得的核苷酸或氨基酸序列中鑒定同源序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述涉及脂肪酸氧化的酶選自下述組a.第I 組=CoA 連接酶(EC 6. 2. 1. xx)b.第II組?；?CoA脫氫酶(EC1. 3. 99. xx)和酰基-CoA氧化酶(EC 1. 3. 3. xx)c.第III 組烯酰-CoA 水合酶(EC 4. 2. 1. 17)d.第IV組3-羥基?；?CoA脫氫酶(EC1. 1. 1.35)e.第V組乙?；?CoAC-酰基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶-EC 2. 3. 1. 16)。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入 N-己二酰化的β -內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶的基因具有大于1的“己二酸鹽/對(duì)照” 比，其中所述“己二酸鹽/對(duì)照”比是親本菌株在含有己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)所述基因的 轉(zhuǎn)錄本水平與親本菌株在不含己二酸的對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)所述基因的轉(zhuǎn)錄本水平的比 例。
4.在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?內(nèi)酰胺化合物的突 變體微生物菌株，其特征是所述菌株與非突變體親本菌株相比，具有經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng) 基的己二酸向N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的菌株，其特征是所述經(jīng)改進(jìn)的己二酸鹽并入產(chǎn)率為至少5%。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中編碼涉及己二酸降解并且可通過權(quán)利要求1-3 中任一項(xiàng)的方法鑒定的基因是功能性失活的。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述涉及己二酸降解的酶選自由以下組成的 組=CoA連接酶(EC 6. 2. 1. xx)，?；?CoA脫氫酶(EC 1. 3. 99. xx)和?；?CoA氧化酶(EC 1. 3. 3. xx)，烯?；?CoA 水合酶(EC 4. 2. 1. 17),3-羥基?；?CoA 脫氫酶(EC 1. 1. 1. 35)， 乙?；?CoA C-?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶-EC 2. 3. 1. 16)。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述編碼涉及己二酸降解的所述酶的基因選自 由以下組成的組SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5， SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11，SEQ ID NO 12，SEQ ID NO 13，SEQ ID NO 14，SEQ ID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17，SEQ ID NO 18，SEQ ID NO 19，SEQ ID NO 20，SEQ ID NO 21，SEQ ID NO 22，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25，SEQ ID No. 51，SEQ ID No. 52，SEQ ID No. 53，SEQ ID No. 54，SEQ ID No. 55,SEQ ID No. 56,SEQ ID No. 57,SEQ ID No. 58,SEQ ID No. 59,SEQ ID No. 60,SEQ ID No. 61，SEQ ID No. 62，SEQ ID No. 63，SEQ ID No. 64，SEQ ID No. 65，SEQ ID No. 66，SEQ ID No. 67,SEQ ID No. 68,SEQ ID No. 69,SEQ ID No. 89,SEQ ID No. 90,SEQ ID No. 91,SEQ ID No. 92，SEQ ID No. 93，SEQ ID No. 94，SEQ ID No. 92，SEQ ID No. 93，SEQ ID No. 101， SEQ ID No. 102，SEQ ID No. 103，SEQ ID No. 104，SEQ ID No. 105，SEQ ID No. 106，SEQ IDNo. 107,SEQ ID No. 108,SEQ ID No. 117,SEQ ID No. 118,SEQ ID No. 119,SEQ ID No. 120， SEQ ID No. 135以及與所列出的任何序列基本同源的核苷酸序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述N-己二酰化的內(nèi)酰胺化合物 選自由以下組成的組己二?；?6-ΑΡΑ，己二?；?7-ADCA，己二?；?7-ACA，己二酰 基-7-ACCA，己二酰基-7-PACA，己二?；?7-ADAC，己二酰基- -ACCCA組成的組。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株是真菌、細(xì)菌或酵母。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述真菌屬于PeniCillium物種。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述真菌是Penicilliumchrysogenum, 其優(yōu)選地用編碼擴(kuò)環(huán)酶或擴(kuò)環(huán)酶/水解酶的基因轉(zhuǎn)化過，并表達(dá)編碼擴(kuò)環(huán)酶或擴(kuò)環(huán)酶/水 解酶的基因。
13.用于構(gòu)建在權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)中定義的突變體菌株的方法，所述方法包括使 編碼涉及己二酸降解的酶的基因功能性失活。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述涉及己二酸降解的所述酶選自由以下組成的 組CoA-連接酶，酰基-CoA脫氫酶，酰基-氧化酶，烯?；?CoA水合酶，3-羥基?；?CoA 脫氫酶和乙酰基-CoA C-?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)，并且所述基因選自權(quán)利要求5中定義的 組。
15.用于生產(chǎn)N-己二酰化的β-內(nèi)酰胺化合物的方法，所述方法包括在包含己二酸的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)定義的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠生產(chǎn)N-己二酰基化的β-內(nèi)酰胺化合物的突變體微生物菌株，其特征是所述菌株與分突變體親本菌株相比具有經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng)基的己二酸向N-己二?；摩?內(nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102131917SQ200980129878
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者馬爾科·亞歷山大·范德勃戈, 魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司