專利名稱：Cdca1表位肽及包含它的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2008年6月19日提交的美國臨時申請No. 61/074，062和2008年10 月28日提交的美國臨時申請No. 61/197，599的權(quán)益，通過述及將它們的全部內(nèi)容收入本文。本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作 為癌癥疫苗非常有效的新肽，及用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明了⑶8陽性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)可識別主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) I類分子上發(fā)現(xiàn)的由腫瘤相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。自第 一例TAA——黑素瘤抗原(MAGE)家族發(fā)現(xiàn)以來，人們主要通過免疫學(xué)手段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多 其它 TAA(Boon Τ, Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 ；Boon T & van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725-9)。這些TAA中，有一些當(dāng)前正在作為免疫治療靶 接受臨床開發(fā)。能夠誘導(dǎo)強(qiáng)力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了針對各種類 型癌癥的肽疫苗接種策略的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用(Harris CC, J NatlCancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 ；Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999Jul 1,59(13) 3134-42 ；Vissers JL et al.，Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554-9 ；van der Burg SH et al.，J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14 ；Tanaka F et al.，Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 ；Fujie T et al.，Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72 ；Kikuchi M et al. ,Int J Cancer 1999May 5,81(3) :459-66 ；Oiso Met al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項(xiàng)使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽的臨床試驗(yàn) 報告。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗(yàn)中只觀察到了較低的客觀應(yīng)答率(Belli F et al.，J Clin Oncol 20020ctl5,20 (20) :4169-80 ；Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42 ；Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004Sep,10(9) :909-15).癌細(xì)胞增殖和存活不可缺少的TAA是作為免疫療法的理想靶標(biāo)，這是因?yàn)槿藗兪?知治療馬區(qū)動的免疫選擇(therapeutically driven immune selection)會導(dǎo)致TAA的刪 除、突變或下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞免疫逃逸，使用這樣的TAA可以將由此發(fā)生的癌細(xì)胞免疫 逃逸的風(fēng)險降至最低。CDCAl (細(xì)胞分裂周期相關(guān)的1)被鑒定為與細(xì)胞周期基因諸如CDC2、細(xì)胞周期蛋 白、拓?fù)洚悩?gòu)酶II等等共表達(dá)的一類基因的一個成員(Walker et al. ,Curr Cancer Drug Targets 200IMay ；1 (1) :73-83)。特別發(fā)現(xiàn)CDCAl與有絲分裂中的HeLa細(xì)胞的著絲粒有 關(guān)，因此被認(rèn)定為酵母Nuf2a的功能同源物(J CellBiol 2001 Jan 22 ； 152 (2) :349-60)。另外，通過使用含有23，040種基因的基因組范圍cDNA微陣列進(jìn)行的基因表達(dá)譜 分析(Cancer Res 2006Nov 1 ；66 (21) :10339-48)，還確定了 CDCAl是在這數(shù)種癌癥中上調(diào) 的新分子。事實(shí)上，已經(jīng)證明CDCAl在乳腺癌(W02005/028676)、膀胱癌(W02006/085684)、 食道癌(W02007/013671)、小細(xì)胞肺癌(SCLC) (W02007/013665)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)(W02005/089735)中上調(diào)，通過述及將這些公開文本的內(nèi)容收入本文。⑶CAl的表達(dá)特別 在SCLC、NSCLC和腫瘤細(xì)胞系中上調(diào)，盡管在除睪丸外的23種正常組織中沒有檢測到表 達(dá)。另外，siRNA對⑶CAl表達(dá)的下調(diào)在表達(dá)⑶CAl的的肺癌細(xì)胞系中引起細(xì)胞生長遏制 (W02005/089735)?？傊?，此數(shù)據(jù)提示⑶CAl是新的、可能是普遍的癌抗原。因而，⑶CAl衍生的表位 肽可作為癌癥免疫治療劑應(yīng)用于多種癌癥的治療。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于可充當(dāng)免疫療法靶標(biāo)的合適表位肽的發(fā)現(xiàn)。認(rèn)識到⑶CAl在 多種類型的癌癥，包括乳腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌和食道癌中上調(diào)，本發(fā)明 針對這種細(xì)胞分裂周期相關(guān)的1 (CDCAl) (SEQID NO :35，由GenBank登錄號NM_145697 (SEQ ID NO 34)的基因編碼)，進(jìn)行進(jìn)一步分析。具體而言，選擇了含有如下表位肽的CDCAl基 因產(chǎn)物，所述表位肽引發(fā)對相應(yīng)分子特異性的CTL。使用CDCAl衍生的HLA-AM402結(jié)合候 選肽刺激獲自健康供體的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。建立了特異性識別用相應(yīng)候選肽沖 激的HLA-AM陽性靶細(xì)胞的CTL，并鑒定了能誘導(dǎo)針對CDCAl的強(qiáng)而特異性的免疫應(yīng)答的 HLA-A24限制性表位肽。這些結(jié)果證明了 CDCAl具有強(qiáng)免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫 療法的有效靶物。因而，本發(fā)明的一個目的是提供具有CTL誘導(dǎo)能力并具有選自SEQ IDNO =3,4,11, 14，22和23的氨基酸序列的肽。本發(fā)明涵蓋經(jīng)過修飾的肽，它們具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，4，11，14，22或23中替代、摻入、刪除或添加一個、兩個或更多個氨基酸而得到的氨基 酸序列，只要經(jīng)過修飾的肽保留原來的CTL誘導(dǎo)能力。當(dāng)對受試者施用時，本發(fā)明的肽呈遞在抗原呈遞細(xì)胞或外來體的表面上，然后誘 導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個目的是提供呈遞任何本發(fā)明肽的抗原呈遞細(xì)胞和 外來體，以及用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。施用本發(fā)明的CDCAl多肽或編碼所述多肽的多核苷酸以及呈遞CDCAl多肽的外來 體和抗原呈遞細(xì)胞可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的一個目的是提供含有本發(fā)明多 肽或編碼它們的多核苷酸，以及含有它們的外來體和抗原呈遞細(xì)胞作為活性組分的藥物制 劑。本發(fā)明的藥物制劑可用作疫苗。本發(fā)明的另一個目的是提供治療和/或預(yù)防(即防范)癌癥(腫瘤)，和/或預(yù)防 其手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，以及用于誘導(dǎo)CTL的方法、用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，這些方法包 括施用本發(fā)明的CDCAl多肽、編碼CDCAl多肽的多核苷酸、呈遞CDCAl多肽的外來體或抗原 呈遞細(xì)胞或藥物制劑的步驟。另外，本發(fā)明的CTL還可用作針對癌癥的疫苗。本發(fā)明涵蓋 的癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)。在閱讀下面的詳細(xì)描述連同附圖和實(shí)施例后，本發(fā)明在上文之外的其它目的和特 征會變得更加顯而易見。然而應(yīng)當(dāng)理解，上面的發(fā)明概述和下面的詳細(xì)描述都是例示性的 實(shí)施方案，而非限制本發(fā)明或本發(fā)明的其它備選實(shí)施方案。具體而言，雖然本文中參照多個 具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述描述是例示本發(fā)明而不構(gòu)成本發(fā)明的限制。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到各種修改和應(yīng)用，而不偏離如所附權(quán)利要求描述的本發(fā)明精神和范 圍。類似地，根據(jù)此概述和下文描述的某些實(shí)施方案很容易想到本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)點(diǎn)，它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。根據(jù)上文連同所附實(shí)施例、數(shù)據(jù)、 圖及自它們得出的所有合理推論，單獨(dú)地或與并入本文的參考文獻(xiàn)一起考慮，容易想到這 樣的目的、特征、好處和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡述在考慮本發(fā)明的附圖簡述和后面的詳細(xì)描述及優(yōu)選實(shí)施方案后，本發(fā)明的各方面 和應(yīng)用對于熟練技術(shù)人員會變得顯而易見。

圖1包括一系列照片，(a)至(g)，顯示對用⑶CAl衍生的肽誘導(dǎo)的CTL進(jìn)行 的 IFN- y ELISP0T 測定的結(jié)果。用 CDCA1-A24-10-119 (SEQ ID NO 3)刺激的 8 號孔
(a)、用CDCA1-A24-10-335 (SEQ ID NO 4)刺激的 1 號孔(b)、用 CDCA1-A24-10-48 (SEQ ID NO 11)刺激的 1 號孔(C)、用 CDCA1-A24-10-5 (SEQ ID NO 14)刺激的 4 號孔(d)、 用 CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID NO :22)刺激的 2 號孔(e)和用 CDCA1-AM-9-56 (SEQ ID NO: 23)刺激的2號孔(f)中的CTL分別顯示與對照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。相反，對用 ⑶CA1-AM-10-74(SEQ IDNO 2)刺激的CTL沒有檢測到針對經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞的特異性 IFN-Y生成(g)。擴(kuò)增用矩形框標(biāo)示的孔中的細(xì)胞以建立CTL系。在圖中，“+"指示針 對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的 IFN-Y生成。圖2包括一系列線圖，(a)至(g)，呈現(xiàn)對在上文IFN- y ELISA測定 中用 CDCA1-A24-10-119(SEQ ID NO 3) (a)、CDCA1-A24-10-335(SEQ ID NO 4)
(b)、CDCA1-A24-10-48(SEQ ID NO 11) (c)、CDCA1-A24-10-5 (SEQ ID N0:14)(d)、 CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID NO :22) (e)和 CDCA1-A24-9-56 (SEQ IDNO :23) (f)建立的 CTL 系進(jìn) 行的IFN- y ELISA測定的結(jié)果。結(jié)果證明通過用所有肽刺激而建立的CTL系均顯示與對照 相比強(qiáng)的IFN-Y生成。相反，對用CDCA1-AM-10-74(SEQ ID NO 2)建立的CTL系中沒有 檢測到針對經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞的特異性IFN-γ生成(g)。在圖中，“+〃指示針對經(jīng)適宜 肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生 成。圖3是描繪從經(jīng)SEQ ID NO :23刺激的CTL系通過有限稀釋建立的CTL克隆的 IFN-Y生成的線圖。結(jié)果證明通過用SEQ ID NO :23刺激而建立的CTL克隆與對照相比顯示 出強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，“+〃指示針對用SEQ ID NO :23沖激過的靶細(xì)胞的IFN-γ 生成，而"-"指示針對未用任何肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。圖4是描繪針對外源表達(dá)⑶CAl和HLA_AM402的靶細(xì)胞的特異性CTL活性 的線圖。用CDCA1-AM-9-56 (SEQ ID NO 23)建立的CTL克隆顯示針對用CDCAl和 HLA-A*2402 (菱形)二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的高特異性CTL活性(菱形)。相反，沒有檢測 到顯著的針對表達(dá)HLA-AM402 (三角形)或⑶CAl (圓形)的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。實(shí)施方案的描述下文描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，但在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案時可使用 與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方 法之前要理解，本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法、方案、等，因?yàn)樗鼈兛梢勒?例行實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤?方案的目的，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。
通過述及明確將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完 整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類 公開文本。I.定義除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員的普遍理解相同的含義。然而，如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非 另有明確說明。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該 術(shù)語不但適用于天然存在的氨基酸聚合物，還適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多 個氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在的殘基諸如相應(yīng)天然存在氨基酸的人工化 學(xué)模擬物。如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與發(fā)揮天然 存在型氨基酸相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在型氨基酸指由遺傳密 碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后經(jīng)過修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨 酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué) 結(jié)構(gòu)(結(jié)合有氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)的α碳)但具有經(jīng)過修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過修飾的主 鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸 模擬物”指具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮相似功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以用它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員 會推薦的單字母符號來指稱。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，而且，除非另 有明確說明，通過它們公認(rèn)的單字母代碼來指稱。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達(dá)⑶CAl基因的癌癥，包括例如乳腺癌、膀胱 癌、食道癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。除非另有定義，術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文 中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染 細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。II.肽為了證明⑶CAl衍生的肽作為被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識別的抗原發(fā)揮功 能，對CDCAl (SEQ ID NO :3 衍生的肽進(jìn)行分析以確定它們是否是受常見的HLA等位基因 HLA-A24 限制的抗原表位(Date Y et al.，TissueAntigens 47 :93-101,1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；KuboRT et al.，J Immunol 152:3913—24,1994)?；?于它們對HLA-AM的結(jié)合親和力來鑒定⑶CAl衍生的HLA-AM結(jié)合肽的候選者。用負(fù)載有 這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用每一種下面的肽成功建立了 CTL:CDCA1-A24-10-119(SEQ ID NO 3),CDCA1-A24-10-335(SEQ ID NO 4),CDCA1-A24-10-48 (SEQ ID NO: 11)，CDCA1-A24-10-5(SEQ ID NO :14)，
CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID N0:22)，禾口CDCA1-A24-9-56(SEQ ID NO :23)。這些建立的CTL針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞顯示強(qiáng)的特異性CTL活性。本文中的 這些結(jié)果證明⑶CAl是被CTL識別的抗原，而且這些肽是⑶CAl的受HLA-AM限制的表位肽。由于⑶CAl基因在大多數(shù)癌組織，包括例如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小細(xì)胞肺癌 (SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中過表達(dá)，它是免疫療法的良好靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供與 CDCAl的CTL識別表位對應(yīng)的九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸 殘基組成的肽)。本發(fā)明的九肽和十肽的特別優(yōu)選例子包括那些由選自SEQ ID NO :3,11, 14,22和23的氨基酸序列組成的肽。一般而言，可使用互聯(lián)網(wǎng)上現(xiàn)有可用的軟件程序，諸如Parker KC et al., JImmunol 1994Jan 1,152(1) 163-75中記載的軟件程序，在計(jì)算機(jī)上(in silico)計(jì)算各 種肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力?？梢匀缋鏟arker KC et al. , JImmunol 1994Jan 1,152(1) :163-75 ；及 Kuzushima K et al.，Blood 2001,98(6) :1872-81 中所述來測量與 HLA 抗原的結(jié)合親和力。例如 Journal of Immunological Methods，1995，185 181-190 和 Protein kience，2000，9 :1838-1846中記載了用于測定結(jié)合親和力的方法。因此，本發(fā)明 涵蓋使用此類已知程序鑒定的結(jié)合的HLA抗原的⑶CAl肽。本發(fā)明的九肽和十肽的側(cè)翼可以任選有額外的氨基酸殘基，只要該肽保留其CTL 誘導(dǎo)能力。此類具有CTL誘導(dǎo)能力的肽通常小于約40個氨基酸，常常小于約20個氨基酸， 通常小于約15個氨基酸。由選自SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23的氨基酸序列組成的肽 的側(cè)翼的具體氨基酸序列不受限制，可以由任何種類的氨基酸組成，只要它不削弱原始肽 的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明還提供具有CTL誘導(dǎo)能力和選自SEQ ID NO :3，4，11，14，22 和23的氨基酸序列的肽。一般而言，蛋白質(zhì)中一個、兩個、或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能， 而且在有些情況中甚至?xí)鰪?qiáng)原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實(shí)上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即 由與原始參照序列相比其中修飾(即替代、添加、刪除或插入)一個、兩個或數(shù)個氨基酸 殘基的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland etal. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一個 實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有在選自SEQ ID NO 3,4,11,14, 22和23的氨基酸序列中插入、添加、刪除和/或替代一個、兩個或甚至更多個氨基酸而得到 的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，對氨基酸序列進(jìn)行個別的添加或替代而改變單個氨基酸或 小比例的氨基酸，往往會導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性的保留。因此，它們常常稱作“保守替 代”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變的結(jié)果是獲得與原始蛋白質(zhì)功能相似的修飾蛋白 質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域公知的。氨基酸側(cè)鏈的特性的例子包括 疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W, Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具 有下面的共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)； 含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有互為保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，而且可包括非 保守修飾，只要經(jīng)過修飾的肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除 CDCAl的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的CTL可誘導(dǎo)肽。為了保留必需的CTL誘導(dǎo)能力，可修飾(插入、添加、刪除和/或替代)少量(例 如1個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。在本文中，術(shù)語“數(shù)個”意味著5個或更少的氨 基酸，例如3個或更少。要修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選20%或更少，更優(yōu)選15%或更少，甚 至更優(yōu)選10%或更少或者1至5%。對本發(fā)明的優(yōu)選肽CDCA1-A24-10-119(SEQ ID NO :3)、CDCA1-A24-10-335 (SEQ ID NO 4), CDCA1-A24-10-48(SEQ ID NO 11)、CDCA1-A24-10-5 (SEQ ID NO: 14)、 CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID NO :22)和 CDCA1-A24-9-56 (SEQ ID NO :23)的同源性分析確認(rèn)了 這些肽與任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽不具有顯著的同源性。因此，這些肽在用于免 疫療法時產(chǎn)生未知的或不想要的免疫應(yīng)答的可能性顯著降低。因而，預(yù)期這些肽對于在癌 癥患者中引發(fā)針對CDCAl的免疫力是非常有用的。當(dāng)在免疫療法的環(huán)境中使用時，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上，優(yōu) 選作為與HLA抗原的復(fù)合物。因此，優(yōu)選選擇這樣的肽，其不僅可誘導(dǎo)CTL，而且擁有對HLA 抗原的高結(jié)合親和力。為此目的，可通過替代、插入、刪除和/或添加氨基酸殘基來對肽進(jìn) 行修飾，以產(chǎn)生具有改良結(jié)合親和力的修飾肽。在天然被展示的肽之外，由于通過結(jié)合HLA 抗原而被展示的肽的序列的規(guī)律是已知的(J Immunol 1994,152 3913 ；Immunogenetics 1995,41 178 J Immunol 1994，155 :4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫 原性肽。例如，可以用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代從N端起第二個氨基酸， 和/或用苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代C端氨基酸，以提高HLA-AM 結(jié)合親和力。因此，本發(fā)明涵蓋下述肽，其具有選自SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23的氨 基酸序列，其中所述SEQID NO的氨基酸序列的N端起的第二個氨基酸被苯丙氨酸、酪氨 酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代，和/或其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列的C端氨基酸被 苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代。不僅可以在肽的末端氨基酸處引 入替代，而且可以在可能的TCR識別位置處引入替代。數(shù)項(xiàng)研究證明了肽中的氨基酸替 代可等同或好于原來的，例如CAP1、p53 (264-272)、Her_2/neu(369_377)或 gp 100 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57，4570-4577，1997，Τ. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002)Feb 1 ； 168(3) :1338-47.，S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52 :199-206及 S. 0. Dionne etal. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53,307—314)。
本發(fā)明還涵蓋對期望肽的N和/或C端添加一個至兩個氨基酸。本發(fā)明也包括這 樣的具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽。然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列一部分相同 時，可能誘發(fā)副作用，如針對特定物質(zhì)的自身免疫性病癥和/或變應(yīng)性癥狀。因此，優(yōu)選首 先使用可得數(shù)據(jù)庫實(shí)施同源性搜索以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的 情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索了解到甚至不存在與目標(biāo)肽相比有1個或2個氨基酸差異的肽時， 可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任 何此類副作用的危險。雖然預(yù)期如上所述對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但是對以高 結(jié)合親和力的存在作為指標(biāo)而選擇得到的候選肽進(jìn)一步檢查CTL誘導(dǎo)能力的存在。在本文 中，短語“CTL誘導(dǎo)能力”指肽在抗原呈遞細(xì)胞上呈遞時誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的 能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進(jìn)CTL溶解靶細(xì)胞、和提高 CTL IFN-Y生成的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如 B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞(DC))，或更具體的說就是人外周血單個核淋巴細(xì)胞 衍生的DC，用肽刺激后，與CD8陽性細(xì)胞混合，然后測量由CTL針對靶細(xì)胞生成和釋放的 IFN-γ。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)生成的表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000Aug, 61(8) :764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimalepitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice -dependence on HLA classll restricted T (H)response中記載的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記靶細(xì) 胞，并且可以根據(jù)從靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒性活性?；蛘?，可通過測量在攜帶固定 化肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)存在下由CTL生成和釋放的IFN-Y，并使用抗IFN-γ單克隆抗 體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)，來評估CTL誘導(dǎo)能力。作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)那些對HLA抗原具有高結(jié)合親 和力的并非必然具有高CTL誘導(dǎo)能力。然而，在那些鑒定和評估的肽中，發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23的氨基酸序列的九肽或十肽不但展現(xiàn)對HLA抗原的高結(jié)合親和 力，還展現(xiàn)特別高的CTL誘導(dǎo)能力。因此，例示這些肽作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。在上文所述修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它物質(zhì)，只要所得的連接的肽 保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。合適物質(zhì)的例子包括例如肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然 的和合成的聚合物、等。肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾 不破壞原始肽的生物學(xué)活性?？蓪?shí)施這些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶定功能和 投遞功能)或使多肽穩(wěn)定化。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或 非天然氨基酸；此概念也可適用于本發(fā)明多肽?？梢砸远喾N方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 本發(fā)明的肽作為與HLA抗原結(jié)合的復(fù)合物被呈遞在細(xì)胞(例如抗原呈遞細(xì)胞)或 外來體的表面上，然后誘導(dǎo)CTL。因此，本發(fā)明還包括在細(xì)胞或外來體的表面上與HLA抗原形成復(fù)合物的肽。此類外來體可例如使用日本專利申請公表平11-510507和W099/03499 中詳述的方法來制備，而且可使用從治療和/或預(yù)防的對象患者獲得的APC來制備。呈遞 本發(fā)明肽的外來體或細(xì)胞可作為疫苗用于接種。上文復(fù)合物中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的HLA 抗原類型匹配。例如，，HLA-AM (特別是HLA-AM02)在日本人群中占優(yōu)勢，因此對于日本 人群的治療是適宜的。使用在日本人和白種人中高度表達(dá)的AM型有利于獲得有效結(jié)果， 也可使用AM02等亞型。通常，在臨床上，預(yù)先調(diào)查需要治療的患者的HLA抗原類型，以便 恰當(dāng)選擇對特定抗原具有高水平結(jié)合親和力，或具有通過抗原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。當(dāng)將AM型HLA抗原用于外來體或細(xì)胞時，優(yōu)選使用具有選自SEQ IDNO =3,4,11, 14，22和23的氨基酸序列的肽。在本文中，本發(fā)明的肽還可描述為“⑶CAl肽”或“⑶CAl多肽”。III. CDCAl 肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或 化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或作為更長的、由兩個或更多個肽構(gòu)成的多肽 來合成。然后可以對肽進(jìn)行分離，即純化，從而使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋 白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可基于選定的氨基酸序列通過化學(xué)合成來獲得?？蛇m用于合成的常規(guī) 肽合成法的例子包括⑴Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；(iii)P印tide Synthesis (日文)，Maruzen Co.，1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( H JC ) Maruzen Co., 1985 ；(ν) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；(vi)W099/67288 ；和(vii)Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, “ Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118。或者，可通過適用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先，制備以可表達(dá)形式(例如在 與啟動子序列對應(yīng)的調(diào)節(jié)序列下游)包含編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)移入合 適宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn) 肽。IV.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括天然存在⑶CAl基因 (GenBank登錄號NM_145697 (SEQ ID NO 34))衍生的多核苷酸以及具有它們經(jīng)過保守修飾 的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本 質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，任何給定蛋白質(zhì)都有很多種功能上相同的核酸來編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCGjP G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在 任何由密碼子規(guī)定為丙氨酸的位置，該密碼子可改變成任何所述的對應(yīng)密碼子，而不改變 所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每 一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到核酸 中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況中是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在 正常情況中是色氨酸的唯一密碼子)都可進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一 種所公開的序列隱含涵蓋編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。DNA由A、T、C、和G等堿基 合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，它們之間有或無居間氨基酸序列。例如， 居間氨基酸序列可提供多核苷酸或所翻譯的肽的切割位點(diǎn)(例如酶識別序列)。另外，在編 碼本發(fā)明肽的編碼序列以外，多核苷酸還可包括任何別的序列。例如，多核苷酸可以是包括 表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(質(zhì) 粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過使用例如聚合酶和內(nèi)切核酸酶經(jīng)由常規(guī)重組技術(shù) 操作多核苷酸來制備。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn) 染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可使用PCR技術(shù)或合適宿主 中的表達(dá)來擴(kuò)增多核昔酸(參見例如Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1989)?；蛘撸墒褂霉滔嗉夹g(shù)來合成 多核苷酸，如 Beaucage SL & IyerRP，Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.， EMBO J 1984,3 :801-5 中記載的。V.抗原呈遞細(xì)胞(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的抗原呈 遞細(xì)胞(APC)。通過接觸本發(fā)明的肽、或通過以可表達(dá)形式導(dǎo)入編碼本發(fā)明肽的核苷酸而獲 得的APC可衍生自接受治療和/或預(yù)防的患者，而且可作為疫苗以它們自身或與其它藥物 (包括本發(fā)明的肽、外來體、或細(xì)胞毒性T細(xì)胞)組合來施用。APC不限于特定種類的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞(DC) ,Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì) 胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì) 胞所識別。由于DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，可以使用DC作為本發(fā)明 的 APC。例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后以體外、離體或體內(nèi)方式用本發(fā)明的 肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，受試者的體內(nèi)誘導(dǎo)出呈 遞本發(fā)明肽的APC。短語“誘導(dǎo)APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺 激)細(xì)胞，以在細(xì)胞的表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物?；蛘?，在將本發(fā) 明的肽提供給APC以容許APC呈遞肽后，可以把這些APC作為疫苗施用于受試者。例如，離 體施用可包括下述步驟a 自第一受試者收集APC ；b 使步驟a的APC接觸肽；并c 對第二受試者施用負(fù)載有肽的APC。
第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體?；蛘?，依照本發(fā) 明，提供本發(fā)明的肽在制備用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物中的用途。另外，本發(fā)明提 供一種制備用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括將本發(fā)明 的肽與藥學(xué)可接受載體一起混合或配制的步驟。另外，本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì) 胞的本發(fā)明肽。通過步驟(b)獲得的APC可作為疫苗施用于受試者。依照本發(fā)明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語“高水平的 CTL誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對于不與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水 平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC可通過下述方法來制備，該方法包括 在體外將含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟。所導(dǎo)入的基因可以是 DNA或RNA的形式。用于進(jìn)行導(dǎo)入的方法的例子包括但不限于此領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的各種 方法，諸如可使用脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res 1996， 56 :5672-7 ;J Immunol 1998，161 :5607-13 ;J Exp Med 1996，184 :465-72 ；國際公開文本 No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實(shí)施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細(xì)胞中 經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑以呈遞 本發(fā)明的肽。VI.細(xì)胞毒性T細(xì)胞被誘導(dǎo)的針對任何本發(fā)明肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞在體內(nèi)加強(qiáng)靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng) 答，并因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供通過任何本發(fā)明肽特 異性誘導(dǎo)或活化的分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。此類細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過下述步驟來獲得(1)對受試者施用本發(fā)明的肽，自受 試者收集細(xì)胞毒性T細(xì)胞；或( 在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APCjP CD8陽性細(xì)胞、或外周血單個核白細(xì)胞，然后分離細(xì)胞毒性T細(xì)胞?？梢詮闹委熀?或預(yù)防的對象患者獲得用呈遞本發(fā)明肽的APC刺激而誘導(dǎo)的細(xì)胞 毒性T細(xì)胞，而且，可以使用它們本身，或者將它們與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體) 組合來施用以獲得調(diào)節(jié)效果。得到的細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性針對呈遞本發(fā)明的肽(例如與 用于誘導(dǎo)的肽相同的肽)的靶細(xì)胞起作用。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)CDCAl的細(xì)胞，或者是 經(jīng)CDCAl基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因本發(fā)明肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞該肽的細(xì)胞也可充 當(dāng)活化CTL攻擊的靶物。VII. T 細(xì)胞受體(TCR)本發(fā)明還提供一種含有編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)亞基的多肽的核酸的組合 物，及使用該組合物的方法。所述TCR亞基具有形成賦予T細(xì)胞針對呈遞CDCAl的腫瘤細(xì)胞 的特異性的TCR的能力。通過使用本領(lǐng)域已知方法，可鑒定用一種或多種本發(fā)明肽誘導(dǎo)的 CTL 的 TCR 亞基即 α 和 β 鏈的核酸(W02007/032255 及 Morgan et al.，J Immunol, 171, 3288(2003)).衍生的TCR在體內(nèi)和在體外能以高親合力結(jié)合展示CDCAl肽的靶細(xì)胞，且任 選介導(dǎo)對呈遞CDCAl肽的靶細(xì)胞的有效殺傷。可將編碼TCR亞基的核酸摻入合適載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領(lǐng) 域公知的。有用的是，可將核酸或含有它們的載體轉(zhuǎn)移入T細(xì)胞，例如來自患者的T細(xì)胞。 有利的是，本發(fā)明提供一種即用型(off-the-shelf)組合物，其容許快速修飾患者自己的T 細(xì)胞(或其他哺乳動物的T細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的經(jīng)過修飾的T細(xì)胞。還有，本發(fā)明提供這樣的CTL，它是通過用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的，所述核酸編碼在 HLA-AM背景下結(jié)合CDCAl肽(例如SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23)的TCR亞基多肽。經(jīng) 過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL能夠在體內(nèi)歸巢至癌細(xì)胞，而且能在體外通過公知的培養(yǎng)方法來擴(kuò)增(例如 Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。本發(fā)明的 T 細(xì)胞可用于形成在需 要治療或防護(hù)的患者中治療或預(yù)防癌癥方面有用的免疫原性組合物(W02006/031221)。預(yù)防和防范包括降低源自疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可 發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防 和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進(jìn)展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病 相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動。或者，預(yù)防和防范包括旨在減輕特定 病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，降低血管發(fā)生等)的廣泛的預(yù)防性療法。治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除 癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及 降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低 其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu) 成有效治療和/或預(yù)防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。VIII.藥物制劑或藥物組合物由于⑶CAl表達(dá)在數(shù)種癌癥類型(包括乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小細(xì)胞肺癌 (SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC))中與正常組織相比特異性升高(Cancer Res 2006Nov 1；66(21) :10339-48, W02005/028676, W02005/089735, W02006/085684, W02007/013665, W02007/013671)，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫 瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/ 或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物制劑或藥物組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的肽或編碼 所述肽的多核苷酸作為活性組分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì)胞(諸如APC)的表面 上表達(dá)本發(fā)明的肽，用它作為藥物制劑或藥物組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的細(xì)胞毒 性T細(xì)胞也可用作本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物的活性組分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性組分在制備用于治療癌癥的 藥物組合物或藥物制劑中的用途(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療癌癥或腫瘤的選自下組的活性組分(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或制劑的方 法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體與選自下組的活性組分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物 或制劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體的 步驟，其中所述活性組分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上本發(fā)明肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明的藥物組合物或制劑可用于預(yù)防癌癥或腫瘤和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也 稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺 乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑 猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù) 后復(fù)發(fā)。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID NO :3，4，11，14,22和23的氨基酸序列的 多肽是能誘導(dǎo)強(qiáng)且特異性免疫應(yīng)答的HLA-AM限制性表位肽或者候選者。因此，包括任何 這些具有氨基酸序列SEQ ID N0:3，4，ll，14，22和23的多肽的本發(fā)明藥物制劑特別適合于 對其HLA抗原為HLA-AM的受試者施用。這同樣適用于含有編碼任何這些多肽的多核苷酸 的藥物制劑或藥物組合物。要用本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物治療的癌癥或腫瘤不受限制，包括其中涉及 CDCAl的所有種類的癌癥或腫瘤，包括例如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)和 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。在上述活性組分之外，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可含有其它具有誘導(dǎo)針對 癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細(xì) 胞、等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例 如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性 組分，只要該物質(zhì)不抑制活性組分例如任何本發(fā)明肽的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗 炎劑、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還 可以與一種或多種其它藥理學(xué)作用劑順序或同時施用。藥物和藥理學(xué)作用劑的量取決于例 如所使用的藥理學(xué)作用劑的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可包 括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它作用劑。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可包括在制品和試 劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制 品可包括任何本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和 試管。容器可以是用多種材料制成的，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該藥物制劑 用于治療或預(yù)防一種或多種疾病狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。在上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物的試劑盒可任選進(jìn)一 步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的稀釋劑。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場看可 取的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說明書的包裝插 頁。如果期望，藥物制劑或藥物組合物可存在于藥包或分配器裝置中，該藥包或分配 器裝置可裝有一個或多個含有活性組分的單位劑量形式。例如，藥包可包括金屬或塑料箔， 諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。(1)含有肽作為活性組分的藥物制劑或藥物組合物本發(fā)明的肽可以直接作為藥物制劑或藥物組合物施用，或者如果必要，通過常規(guī) 配制方法加以配制。在后一種情況中，在本發(fā)明的肽之外，還可以視需要包括通常用于藥物 的載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、 培養(yǎng)液、等等。另外，藥物制劑或藥物組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面 活性劑等等。本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可用于抗癌目的。本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合，以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。肽 組合可采取雞尾酒的形式，或者可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個肽化學(xué)連接起 來，或者表達(dá)成單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示 的肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘撸梢詫κ茉囌呤┯迷谒鼈兊?細(xì)胞表面上展示任何本發(fā)明肽的APC，結(jié)果在受試者中誘導(dǎo)CTL，而且可提高針對癌細(xì)胞的 攻擊性；這樣的APC可通過用本發(fā)明的肽刺激衍生自受試者的APC(例如DC)來獲得。包括本發(fā)明的肽作為活性組分、用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤的藥物制劑或藥 物組合物還可包括已知可有效建立細(xì)胞免疫的佐劑。或者，藥物制劑或藥物組合物可以與 其它活性組分一起施用，或者可以通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的 蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時可增強(qiáng)針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。本文中涵蓋的佐 劑包括文獻(xiàn)中記載的(ClinMicrobiol Rev 1994，7 :277-89)。合適佐劑的例子包括但不限 于磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、等等。另外，可方便地使用脂質(zhì)體制劑；其中肽結(jié)合于數(shù)微米直徑的珠子的顆粒制劑； 和其中脂質(zhì)結(jié)合于肽的制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可進(jìn)一步包括引發(fā)(prime) CTL的成分。脂質(zhì)已經(jīng)被鑒定為能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的作用劑。例如，可將 棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的和氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后可以將該 脂化肽在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化后施用。作為引發(fā)CTL應(yīng)答 的脂質(zhì)的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰絲 氨酰-絲氨酸(P3CSS)，當(dāng)共價連接至適宜肽時，可用來引發(fā)CTL(參見例如Deres et al.,Nature 1989,342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至 靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。本發(fā)明肽的劑量 可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)調(diào)整，通常是0. OOlmg至 lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù) 月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物制劑或藥物組合物本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物也可含有可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的 核酸。在本文中，短語“可表達(dá)形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時會在體內(nèi)表達(dá)成可誘 導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實(shí)施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括 多核苷酸表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件?？膳鋫涠嗪塑账?，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組(關(guān) 于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51:503-12)。 參見例如 Wolff et al. ,Science 1990，247 :1465-8 ；美國專利 No. 5，580，859 ;5，589，466 ； 5，804, 566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；及 WO 98/04720。基于 DNA 的投遞技術(shù)的例 子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介 導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主， 諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如痘苗病毒作為載體來表達(dá)編碼肽的核苷酸序列。 在導(dǎo)入宿主后，重組痘苗病毒表達(dá)表達(dá)免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答?？捎糜诿庖呓臃N 方案的痘苗載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體是卡介苗(BCG， Bacille Calmette Guerin)。BCG 載體記載于 Stover et al. , Nature 1991,351:456-60。 其它多種可用于治療性施用或免疫接種的載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載 體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此 類。參見例如 Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock et al.，J Leukoc Biol 2000,68 :793-806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。將多核苷酸投遞入受試者可以是直接地，其中使受試者直接暴露于攜帶多核苷酸 的載體，或者是間接地，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入 受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 :488-505 ；Wu and Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993,33 :573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-32 ；Morgan & Anderson，Arm Rev Biochem 1993,62 :191-217 ；Trends inBiotechnology 1993,11(5) 155-215。Ausubel 等人編著的 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993 及 Krieger, Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中記載的重組DNA技術(shù)領(lǐng)域公知的方法也可以用于本發(fā)明。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局 部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。可以依 據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)調(diào)整合適載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽 的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量，通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù) 人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。IX.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外來體和 APC也可用于誘導(dǎo)CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要 該化合物不抑制它們的CTL誘導(dǎo)能力。因此，上述任何本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物均可 用于誘導(dǎo)CTL，而且在它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文討論 的。(1)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸來誘導(dǎo)APC的方法。APC 的誘導(dǎo)可以如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分所述來實(shí)施。本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)具有高 水平CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”項(xiàng)目下也提到了這種誘導(dǎo)。(2)誘導(dǎo)CTL的方法另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽、編碼所述肽的多核苷酸、呈遞所述肽的外來 體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。本發(fā)明還提供一種使用編碼如下所述的多肽的多核苷酸來 誘導(dǎo)CTL的方法，所述多肽能夠形成可識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物的T細(xì)胞受體 (TCR)亞基。優(yōu)選的是，用于誘導(dǎo)CTL的方法包括至少一個選自下組的步驟a:使其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽的復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體接 觸⑶8陽性T細(xì)胞，和b:將編碼能夠形成可識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物的TCR亞基的多肽的多 核苷酸導(dǎo)入⑶8陽性T細(xì)胞。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導(dǎo)出CTL，而且靶向癌細(xì)胞的 免疫應(yīng)答的強(qiáng)度增大。或者，肽和編碼肽的多核苷酸可用于離體治療方法，其中在體外使本 發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APC和CD8陽性細(xì)胞或外周血單個核白細(xì)胞，并在誘 導(dǎo)CTL后，將活化的CTL細(xì)胞返還給受試者。例如，該方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b 使肽接觸步驟a的APC ；c 將步驟b的APC與⑶8+T細(xì)胞混合，并共培養(yǎng)以誘導(dǎo)CTL ；并d:自步驟c的共培養(yǎng)物收集⑶8+T細(xì)胞。或者，依照本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽在制備用于誘導(dǎo)CTL的藥物制劑或藥物組 合物中的用途。另外，本發(fā)明提供了一種制備用于誘導(dǎo)CTL的藥物制劑或藥物組合物的方 法或工藝，其中該方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受載體一起混合或配制的步驟。另外， 本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)CTL的本發(fā)明的肽。通過步驟d獲得的具有細(xì)胞毒性活性的⑶8+T細(xì)胞可作為疫苗施用于受試者。上 文步驟c中用來與⑶8+T細(xì)胞混合的APC也可通過將編碼本發(fā)明肽的基因轉(zhuǎn)移入APC來制 備，如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分中詳述的；但是不限于此。因而，任何可將本發(fā)明的肽 有效地呈遞給T細(xì)胞的APC或外來體均可用于本發(fā)明的方法。提供下面的實(shí)施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā) 明。實(shí)施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例材料和方法細(xì)胞系通過將Epstein-Bar病毒轉(zhuǎn)化入HLA-AM陽性人B淋巴細(xì)胞，建立了 AM淋巴母 細(xì)胞樣細(xì)胞系(AMLCL)細(xì)胞。自⑶CAl衍牛的肽的候詵物詵擇使用結(jié)合預(yù)測軟件“BIMAS“ (http //www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla bind)預(yù)測了⑶CAl衍生的結(jié)合HLA-AM402的9聚物和10聚物肽，該算法記載于Parker KC et al.J Immunol 1994,152(1) 163-75 及 Kuzushima K et al. Blood 2001,98(6) 1872-81。由 American Peptide Company Inc. (Sunnyvale, CA)依照標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成 了這些肽，并通過反相高效液相層析(HPLC)進(jìn)行了純化。分別通過分析性HPLC和質(zhì)譜術(shù) 分析測定了肽的純度(> 90% )和身份。將肽以20mg/ml在二甲亞砜(DMSO)中溶解，并保 存于-80°C。體外CTL誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來誘導(dǎo)針對人白細(xì) 胞抗原(HLA)上呈遞的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如別處所述(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112-8)在體外生成 DC。具體而言，將用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_AM402陽性)分離的外周血單個核 細(xì)胞(PBMC)通過塑料組織培養(yǎng)皿粘附(BectonDickinson)來加以分離，以富集它們的單 核細(xì)胞級分。將富集了單核細(xì)胞的群體在含有2%熱滅活自體血清(AQ的AIM-V培養(yǎng)基 (Invitrogen)中、于1000U/ml粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和 1000U/ml白介素(IL)-4(R&D System)存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DC 在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37°C 沖激3小時。所生成的細(xì)胞表現(xiàn)出在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)DC相關(guān)分子，諸如CD80、CD83、 ⑶86和II類HLA(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用絲裂霉素C(MMC)滅活(30 微克/ml，30min)，并以1 20比例與自體CD8+T細(xì)胞混合；自體CD8+T細(xì)胞是用CD8陽性 分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的。在48孔板(Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個 孔在0. 5mlAIM-V/2% AS培養(yǎng)基中含有1. 5x IO4個經(jīng)肽沖激的DC、3x IO5個CD8+T細(xì)胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后，給這些培養(yǎng)物補(bǔ)充 IL-2 (CHIRON)至終濃度 20IU/ml。 在第7天和第14天，將T細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進(jìn)一步刺激。每次的DC均通過與上文 所述相同的方式來制備。在第21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的A24LCL細(xì)胞的 CTL(Tanaka H et al. ,Br J Cancer2001Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 200IApr 20,84(8) :1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24) 8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2006May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. ,Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。CTL擴(kuò)增程序使用與Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 19950ct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb,2(2) :216-23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)物中擴(kuò)增CTL。在40ng/ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)存在下，將總共切IO4個 CTL與兩種經(jīng)MMC滅活的人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系一起懸浮在25ml AIM-V/5% AS培養(yǎng)基 中。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng) 物補(bǔ)加新鮮的含有 30IU/ml IL-2 的 AIM-V/5% AS 培養(yǎng)基(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 200IJan 5,84(1) 94-9 ；Umano Y et al. , Br J Cancer 2001Apr 20,84(8) :1052-7; Uchida N et al.，ClinCancer Res 2004Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2006May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。CTL克降的津立在96孔圓底微量滴定板(Nalge Nunc hternational)中進(jìn)行稀釋以獲得0. 3、 1、和3個CTL/孔。在總共150 μ 1/孔含有5% AS的AIM-V培養(yǎng)基中將CTL與IxlO4個細(xì) 胞/孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體、和125U/ml IL-2 一起溫 育。10天后向培養(yǎng)基添加50 μ 1/孔IL-2，以達(dá)到終濃度125U/ml IL-2。在第14天測試 CTL活性，并使用與上文所述相同的方法來擴(kuò)增CTL克隆(Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24) :8577-86 ；SudaT et al. , Cancer Sci 2006May,97(5) :411-9; Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。特異件CTL活件為了檢查特異性CTL活性，實(shí)施干擾素(IFN)-Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)測定和 IFN-Y酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的A24LCL (lx IO4/孔)作為 刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實(shí)施IFN-γ ELISP0T 測定和IFN-γ ELISA測定。強(qiáng)迫表達(dá)靶基因和/或HLA-A24的細(xì)胞的建立通過PCR來擴(kuò)增編碼靶基因或HLA-AM的可讀框的cDNA。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆 入pCAGGS載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染入C0S7，一種無靶基因和HLA-AM的細(xì)胞系。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene(Invitrogen) 收獲經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作CTL活性測定的靶細(xì)胞(5x IO4個細(xì)胞/孔)。MM自⑶CAl衍生的HLA-A24結(jié)合肽的預(yù)測表1依最高結(jié)合親和力的次序顯示⑶CAl的HLA_AM402結(jié)合肽。選擇并檢查了 總共40種具有潛在HLA-AM結(jié)合能力的肽以確定表位肽。表1 自CDCAl衍生的HLA-AM結(jié)合肽
權(quán)利要求
1.一種具有細(xì)胞毒性τ淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中該肽包含氨基酸序 列SEQ ID NO 35或其片段。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，其中該肽是九肽或十肽。
3.權(quán)利要求1或2的分離的肽，其中該肽包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQID NO :3，4，11，14，22 和 23 ；禾口(b)SEQID NO :3，4，11，14，22和23，其中替代、插入、刪除或添加了 1，2或數(shù)個氨基酸。
4.權(quán)利要求1-3的分離的肽，其具有下面的兩項(xiàng)特征之一或二者(a)所述SEQID NO的氨基酸序列的N端起第二個氨基酸是選自下組的氨基酸，或被修 飾成選自下組的氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，和(b)所述SEQID NO的氨基酸序列的C端氨基酸是選自下組的氨基酸，或被修飾成選自 下組的氨基酸苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
5.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽。
6.一種用于誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其使用權(quán)利要求1-4中 任一項(xiàng)所述的肽和/或權(quán)利要求5中所述的多核苷酸進(jìn)行。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述方法包括下面的兩個步驟之一或二者(a)使抗原呈遞細(xì)胞接觸權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽，和(b)將權(quán)利要求5中所述的多核苷酸導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞。
8.一種分離的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞在其表面上呈遞權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽。
9.權(quán)利要求8的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是通過權(quán)利要求6或7的方法誘導(dǎo)的。
10.一種誘導(dǎo)CTL的方法，其是通過使用下述進(jìn)行的(a)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽；(b)權(quán)利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽的抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體；(d)編碼能夠形成識別權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的肽與HLA抗原的復(fù)合物的T細(xì)胞受 體(TCR)亞基的多肽的多核苷酸；或(e)它們的組合。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述方法包括至少一個選自下組的步驟(a)使CD8陽性T細(xì)胞接觸在其表面上呈遞權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽的抗原呈 遞細(xì)胞和/或外來體，和(b)將編碼能夠形成識別權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽與HLA抗原的復(fù)合物的T細(xì) 胞受體(TCR)亞基的多肽的多核苷酸導(dǎo)入⑶8陽性T細(xì)胞。
12.一種用于誘導(dǎo)CTL的作用劑，其中所述作用劑包含選自下組的活性組分(a)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽；(b)權(quán)利要求5中列出的多核苷酸；(c)在它的表面上呈遞權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽的抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體；和(d)它們的組合。
13.一種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1-4的任一種肽。
14.一種分離的CTL，其是通過權(quán)利要求10或11的方法誘導(dǎo)的。
15.一種藥物制劑，其包含選自下組的活性組分(a)至少一種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽；(b)至少一種權(quán)利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞至少一種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽的抗原呈遞細(xì)胞和/或 外來體；(d)權(quán)利要求13或14的CTL；和(e)它們的組合，與藥學(xué)可接受載體組合，配制用于選自下組的目的 (i)治療癌癥； ( )預(yù)防癌癥；(iii)預(yù)防癌癥的手術(shù)后復(fù)發(fā)；和(iv)它們的組合。
16.一種在受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所述受試者施 用下述各項(xiàng)的步驟(a)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽；(b)權(quán)利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽的抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體；(d)權(quán)利要求13或14的CTL；或(e)它們的組合。
17.一種用于在受試者中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的疫苗，所述疫苗包含選自下組的活性組分(a)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽；(b)權(quán)利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的肽的抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體；(d)權(quán)利要求13或14的CTL；和(e)它們的組合。
18.權(quán)利要求15的藥物制劑或權(quán)利要求17的疫苗，其配制為供施用于HLA抗原為 HLA-A24的受試者。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述受試者的HLA抗原為HLA-AM。
全文摘要
本文中公開了針對癌癥的肽疫苗。具體而言，本發(fā)明描述了自CDCA1衍生的引發(fā)CTL的表位肽。本發(fā)明還提供特異性識別經(jīng)所述肽沖激的HLA-A24陽性靶細(xì)胞的建立的CTL。還提供了呈遞任何所述肽的抗原呈遞細(xì)胞和外來體以及用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有CDCA1多肽或編碼它們的多核苷酸以及外來體和抗原呈遞細(xì)胞作為活性組分的藥物制劑。另外，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防(即防范)癌癥(腫瘤)，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，以及用于誘導(dǎo)CTL的方法、用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，這些方法使用本發(fā)明的CDCA1多肽、編碼所述多肽的多核苷酸、呈遞所述多肽的外來體或抗原呈遞細(xì)胞、或藥物制劑。要治療的癌癥包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。
文檔編號C12N5/00GK102119171SQ20098013120
公開日2011年7月6日 申請日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者吉村祥子, 大澤龍司, 角田卓也 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司