專利名稱：自回避分子識(shí)別系統(tǒng)用于dna擴(kuò)增的制作方法
自回避分子識(shí)別系統(tǒng)用于DNA擴(kuò)增相關(guān)應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)這個(gè)申請(qǐng)于2008年8月20日向美國(guó)臨時(shí)專利局要求了優(yōu)先日期12/229159。它關(guān) 系到美國(guó)的專利申請(qǐng)11/647609，同時(shí)是美國(guó)專利申請(qǐng)11/271366—部分的延續(xù)，有以2004 年11月13日提出的臨時(shí)專利申請(qǐng)11/271366和60/627459為基礎(chǔ)。聲明中關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或發(fā)展。無(wú)。聯(lián)合研究協(xié)議中當(dāng)事人的姓名不適用。以光盤提交公司引用的參考材料。無(wú)
背景技術(shù)：
1.發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及到核酸化學(xué)領(lǐng)域，更具體到一種物質(zhì)組分成為復(fù)制DNA和RNA的引物， 更具體到用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增DNA的領(lǐng)域。這些物質(zhì)的組分包括非標(biāo)核苷酸能夠與其互補(bǔ) 的天然核苷酸結(jié)合，并且按照一些規(guī)則形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，這些規(guī)則是基于大量的實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)，非標(biāo)核苷酸不與自身強(qiáng)烈的相結(jié)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶可以接受在引物和模板 中的非標(biāo)核苷酸。2.相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明在過(guò)去15多年來(lái)，科學(xué)家尋求創(chuàng)新的分子識(shí)別系統(tǒng)，該系統(tǒng)的結(jié)合性能被用于不 同的方面。一些系統(tǒng)中的模型結(jié)構(gòu)也被用于DNA和RNA中。此外，DNA和RNA的分子識(shí)別 系統(tǒng)已被廣泛地應(yīng)用，因?yàn)樗鼈冎g的分子識(shí)別系統(tǒng)和/或天然DNA和RNA遵循簡(jiǎn)單的規(guī) 則，簡(jiǎn)單到一個(gè)普通的人可以利用它得到有用的事情。DNA作為一種模型來(lái)說(shuō)明分子結(jié)構(gòu)和堿基識(shí)別的規(guī)則。由于它是以四個(gè)部分組成， 對(duì)于一個(gè)長(zhǎng)度為η的DNA，不同的DNA序列內(nèi)的DNA分子識(shí)別系統(tǒng)的專利數(shù)量將是巨大的。 因此，只有當(dāng)啟發(fā)式的識(shí)別規(guī)則被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)利用這個(gè)新的識(shí)別規(guī)則，使技術(shù)熟練的人能夠 預(yù)測(cè)哪些DNA序列與其它的序列結(jié)合，從而避免不必要的實(shí)驗(yàn)，這樣的分子識(shí)別系統(tǒng)才被 視為可以被專利保護(hù)的。這種啟發(fā)式規(guī)則來(lái)源于對(duì)天然的DNA，RNA和其修改形式(例如，2'-甲酯改良 RNA)和類似物(例如，PNA)進(jìn)行大量的熔化溫度相的測(cè)量實(shí)驗(yàn)。一般來(lái)說(shuō)，如果沒(méi)有這些 大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分子識(shí)別無(wú)法準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)。對(duì)于DNA，這些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被做了很多年，已經(jīng)取 得了很多啟發(fā)式規(guī)則的例子。其中，三個(gè)規(guī)則尤其的重要Α與T配對(duì)，G與C配對(duì)，而且兩 條DNA鏈?zhǔn)欠雌叫械?。幾十年?lái)，這些規(guī)則允許一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)兩個(gè)DNA 分子能夠在水溶液中結(jié)合。當(dāng)完全遵循該規(guī)則，兩個(gè)完全互補(bǔ)的、長(zhǎng)度在15-20個(gè)核苷酸的 DNA鏈，能夠在一般的生理緩沖液中(37°C)高選擇性地結(jié)合，并且不受復(fù)雜的混合物中其 它DNA分子的影響。進(jìn)一步預(yù)測(cè)DNA之間結(jié)合的親和力大致趨勢(shì)的規(guī)則也已經(jīng)被發(fā)展了很多年。一般 來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)DNA鏈相結(jié)合比短DNA鏈相結(jié)合有較高的熔融溫度。G: C配對(duì)比A: T配對(duì)有更高的 熱穩(wěn)定性。這些規(guī)則對(duì)于一個(gè)專業(yè)從業(yè)者要獲得DNA系統(tǒng)的實(shí)用性并非絕對(duì)的必要。利用 更多的高參數(shù)化模型來(lái)改進(jìn)熔融溫度[A1198a] [A1198b] [Mar85] [Mat98]，對(duì)于DNA識(shí)別系統(tǒng)的實(shí)用性并沒(méi)有本質(zhì)性的提高。因此，從大約100個(gè)熔化溫度的實(shí)驗(yàn)中總結(jié)的規(guī)則是必 要的和足夠的讓一個(gè)DNA識(shí)別系統(tǒng)模型有核心的實(shí)用性；類似的，從數(shù)以千計(jì)的熔融溫度 試驗(yàn)取得的規(guī)則未必可以使這個(gè)系統(tǒng)具有核心的實(shí)用性，盡管它們可以擴(kuò)大系統(tǒng)的效用。一類非天然的(或，在這里用，“非標(biāo)準(zhǔn)的“)DNA類似物(例如，X和Y)，它們可以 彼此配對(duì)形成穩(wěn)定的X: Y同時(shí)可以增加非標(biāo)準(zhǔn)DNA雙螺旋的穩(wěn)定性。但是，當(dāng)X和Y，與標(biāo) 準(zhǔn)的DNA堿基配對(duì)，則無(wú)助于雙螺旋的穩(wěn)定性。在這個(gè)例子中，通過(guò)增加X(jué)和Y得到的最有 用的遺傳密碼子具有特殊的生物物理特性，其中A Y，T Y，G Y，C Y，A X，T X，G X和C X這 些不匹配的堿基對(duì)，與X:Y堿基對(duì)相比較，均顯著地降低雙螺旋的穩(wěn)定性。還有更多有用的 是，非標(biāo)準(zhǔn)的不匹配的堿基對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)的不匹配的堿基對(duì)(例如，A:G，C:A, T:G，等)，這些不 匹配的堿基對(duì)比X:Y配對(duì)有顯著地不穩(wěn)定性。在美國(guó)專利5432272和后續(xù)的專利中，披露了一個(gè)人工發(fā)明的分子識(shí)別系統(tǒng)的模 型(

圖1)。在這里，這種人工的分子識(shí)別系統(tǒng)的設(shè)計(jì)基于兩種沃森_克里克核酸互補(bǔ)配對(duì) 的原則大小互補(bǔ)(大與小的嘌呤嘧啶配對(duì))和氫鍵互補(bǔ)(一個(gè)堿基給于氫，另一個(gè)堿基 接受氫)。這兩個(gè)原則產(chǎn)生出簡(jiǎn)單的堿基配對(duì)規(guī)則(“Α與T配對(duì)，G與C配對(duì)“)并且成 為遺傳學(xué)，分子生物學(xué)和生物技術(shù)的基礎(chǔ)。美國(guó)專利5432272指出，這些原則可以被用于不 同于腺嘌呤核苷酸(A)和胸腺嘧啶(T)和鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的非天然核苷酸中。例 如，有十二個(gè)非天然堿基組成六個(gè)堿基，這些堿基對(duì)采用互不相同的氫鍵模式同時(shí)具有沃 森_克里克堿基配對(duì)的幾何形狀。圖1顯示了一些標(biāo)準(zhǔn)的和非標(biāo)準(zhǔn)的堿基對(duì)和他們的命 名。這些堿基類似物提供非標(biāo)氫鍵模式是人工擴(kuò)展遺傳信息系統(tǒng)的一部分(Artificially Expanded Genetic Information System, or AEGIS)0美國(guó)專利5432272和其繼任者告訴我們，人工擴(kuò)展遺傳信息系統(tǒng)(AEGIS)的氫鍵 模式與該系統(tǒng)中使用的雜環(huán)可以相互獨(dú)立。這意味著不同的雜環(huán)化合物通?？梢宰鳛榉肿?識(shí)別元件互用。反過(guò)來(lái)說(shuō)，人工分子識(shí)別系統(tǒng)中的單元的選擇，可以有其他考慮，而不只局 限于簡(jiǎn)單的識(shí)別規(guī)則。因此，人工擴(kuò)展遺傳信息系統(tǒng)(AEGIS)中pyADA的氫鍵模式可以是 胸苷，尿苷，尿苷衍生物攜帶5位熒光基團(tuán)，攜帶5位生物素，和其他的衍生物。經(jīng)過(guò)大約100個(gè)熔化溫度的實(shí)驗(yàn)，AEGIS分子識(shí)別系統(tǒng)的實(shí)用性得到了充足地支 持。AEGIS分子識(shí)別系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用在臨床診斷中的分支DNA(bDNA)中，用來(lái)檢測(cè)艾滋病 毒，乙肝和丙型肝炎病毒[Elb04a] [Elb04b]。這個(gè)例子說(shuō)明，盡管由AEGIS單元構(gòu)建的DNA 雙鏈有不同的序列，也不能夠進(jìn)行精確的預(yù)測(cè)，這并沒(méi)有妨礙該人工識(shí)別系統(tǒng)被用于每年 40萬(wàn)病人的臨床診斷[Ben04]。這也說(shuō)明了正交性在核酸分析化學(xué)中的應(yīng)用，在由AEGIS 單元建立的寡核苷酸分子中，含有AEGIS單元的寡核苷酸只與其互補(bǔ)的寡核苷酸識(shí)別，但 是不與天然的DNA序列結(jié)合。人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到，在文獻(xiàn)中有一類DNA類似物，他們有相反的行為并且可能有不 同的用途。在這里，核苷酸類似物具有“自回避”的性質(zhì)。自回避核苷酸構(gòu)件被指定為A*， T*，G*，和C*。要成為“自回避”，其中A*:T，T*:A，G*:C和C*:G配對(duì)，在雙鏈DNA中應(yīng)該提供 更高的穩(wěn)定性(與標(biāo)準(zhǔn)的不匹配配對(duì)相比較)，A*:T*和G*: C*雖然是正式匹配，但是對(duì)雙 鏈的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)較少。15年前在DNA結(jié)構(gòu)中使用這樣的特性已經(jīng)被確認(rèn)，在那里Gamper和 其他人試圖將A*和T*的類似物(其中A*是二氨基嘧啶，T*是2-thiothymidine)嵌入單鏈 DNA或RNA分子中，用于防止形成“二級(jí)結(jié)構(gòu)”[Kut96]。他們用了近乎十年時(shí)間致力于發(fā)展一個(gè)相應(yīng)的G*和C*，后來(lái)以肌苷為G*的首選。他們選擇包括5-6融合pyrrolopyrimidine 系統(tǒng)(圖2) [Woo96]，一個(gè)胞苷脫氨基的類似物與天然產(chǎn)物zebularine相似的化合物為 O [Gam06] ] [Lahoud等人(2008) Properties of pseudo-complementary DNA substituted with weakly pairing analogs of guanine or cytosine. Nuclecic Acids Res. 36, 6999-7008]，和4-N的烷基化胞嘧啶[Lah08a，b，c]衍生物。他們大部分的工作致力于獲得 聚合酶，該酶能夠?qū)⒍被奏ぃ?-硫代胸苷，和肌苷的三磷酸添加到以模版導(dǎo)向的引物的 3'-端。第一個(gè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)源自于這種工作是由美國(guó)專利5912340披露(發(fā)布于 1999/06/15)。該專利(US5912340)不涉及合成DNA聚合酶或多元PCR的引物。相反， US5912340聲稱一對(duì)寡核苷酸(ODNs)，它們的序列具有互補(bǔ)性，但是它們之間不能形成雙 鏈結(jié)構(gòu)，卻可以與天然的寡核苷酸結(jié)合，如果這對(duì)寡核苷酸是由天然核苷酸組成的，那么它 們之間就能夠形成穩(wěn)定的雙鏈DNA。US5912340專利的發(fā)明者會(huì)滿意，如果有“足夠“數(shù)量的核苷酸(這里討論*類似 物的衍生物)被嵌入兩條寡核苷酸中以防止彼此相互的結(jié)合，或(在以后的工作中)，如果 有足夠數(shù)量的類似物在DNA或RNA中，以防止DNA或RNA分子的自身折疊。US5912340沒(méi)有 提供任何熔融溫度，也沒(méi)有后續(xù)工作，也沒(méi)有提供保證，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員幾乎不需要 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，就可以預(yù)測(cè)這些寡核苷酸有用的性能。此外，US5912340也沒(méi)有提供聚合酶 對(duì)這些非天然化合物作為模板或引物的數(shù)據(jù)，因此，不能確定他們將會(huì)被聚合酶接受，進(jìn)而 更不確定他們是否會(huì)被聚合酶高效率地接受以達(dá)到用于PCR的要求。US5912340或后續(xù)工作也不必要這樣做，因?yàn)樵搶＠闹饕繕?biāo)是獲得不能相互 結(jié)合的互補(bǔ)堿基。該專利也沒(méi)有專利PCR引物和提供適合PCR的引物。最近，在一些專利文獻(xiàn)(美國(guó)專利7371580公布于美國(guó)2009年11月15日US 2003/0211474A1，提交于2008年5月13日)中描述了將二氨基嘌呤，2-硫代胸苷，肌苷，和 pyrrolopyrimidine運(yùn)用到一個(gè)核苷酸探針中。在這里，被建議的實(shí)用性是防止這些探針之 間形成所謂的“交叉結(jié)合”，同時(shí)仍允許含有這些核苷酸類似物的探針可以和天然的DNA結(jié) 合。然而，這項(xiàng)專利中含有很少熔融溫度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包含很少的熔融溫度，也沒(méi)有提供足 夠的如何使用這些系統(tǒng)的指導(dǎo)，同時(shí)也沒(méi)有這些探針在高度多元化組合中的工作示例。如果這是可行的，一個(gè)自回避分子識(shí)別系統(tǒng)(SAMRS)將會(huì)被及其有價(jià)值的應(yīng)用在 多元聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中。在這里，以SAMRS核苷酸構(gòu)建的寡核苷酸將被作為PCR引物， 而不是作為探針。其中一條引物作為正向引物，與被復(fù)制的目標(biāo)寡核苷酸序列互補(bǔ)；另外 一條引物作為反向引物，其序列與被復(fù)制的目標(biāo)寡核苷酸的5'-端某一部分的序列相同。 這樣的PCR引物，如果用SAMRS核苷酸來(lái)構(gòu)建，可提供多個(gè)(超過(guò)一對(duì))，甚至是很多很多 對(duì)。由于是自回避，他們應(yīng)該能夠支持在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增許多目標(biāo)底物，并提供了解 決“多元PCR技術(shù)的難題”。解決多元PCR技術(shù)難題的方案將會(huì)是DNA分析化學(xué)中的一個(gè)“圣杯”。這方面的證 據(jù)包括文獻(xiàn)中報(bào)道了大量的不同研究小組，多次多方嘗試，往往用聰明的結(jié)構(gòu)，包括環(huán)刪除 解決來(lái)自引物之間相互結(jié)合所產(chǎn)生的“聚合酶鏈反應(yīng)混亂” [Bro97]和[Fre07]。另一個(gè)例 子是，在并行基因組測(cè)序中，為了避免多元PCR擴(kuò)增的問(wèn)題，首先將復(fù)雜的DNA混合物稀釋 成單個(gè)的DNA分子，然后分別擴(kuò)增單個(gè)的DNA分。這不是在解決多元PCR的問(wèn)題，而是在避免這個(gè)問(wèn)題，從而有引起了單分子化學(xué)中操作成本等問(wèn)題。盡管多元PCR的問(wèn)題眾所周知，美國(guó)專利7371580沒(méi)有提到它的核苷酸類似物可 能被用來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)下文)，在上述專利及其相關(guān)工作中所提到的很 多部分不能應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的引物，另外，一個(gè)技術(shù)工人在不經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)后，沒(méi)有辦 法將這些系統(tǒng)用在顯而易見(jiàn)的實(shí)際應(yīng)用中。本專利的目的就是提供自我避免的核苷酸類似 物以及足量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)揭示如何使用這個(gè)系統(tǒng)，特別該系統(tǒng)應(yīng)用在PCR技術(shù)中，包括多 元PCR，工具包，以及使用該項(xiàng)技術(shù)的過(guò)程。發(fā)明簡(jiǎn)介本發(fā)明確定SAMRS核苷類似物(T*，A*，G*和C*)，當(dāng)分別與天然的腺嘌呤，胸腺嘧 啶，胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)時(shí)能夠添加雙螺旋的穩(wěn)定性，當(dāng)分別與A*，T*，G*和C*配對(duì)時(shí)降低 雙螺旋的穩(wěn)定性，當(dāng)將SAMRS堿基嵌入一個(gè)寡核苷酸類似物的3'-端，該寡核苷酸可以作 為引物用于PCR擴(kuò)增技術(shù)。此外，這項(xiàng)發(fā)明提供了一些特定的核苷酸類似物，用于聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)的引物中，并提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)證明。此外，這項(xiàng)發(fā)明也提供了物質(zhì)成分構(gòu)成多 元PCR的多元化引物對(duì)，并提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，這些成分可以在足夠高的濃度下實(shí)現(xiàn)多 元聚合酶鏈反應(yīng)。圖示的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.人工擴(kuò)展的基因信息系統(tǒng)(AEGIS)。12個(gè)核酸堿基根據(jù)沃森-克里克的堿 基配對(duì)規(guī)則形成堿基對(duì)。這樣就得到了能夠被應(yīng)用到系統(tǒng)生物學(xué)中的工具一人工擴(kuò)展的 基因信息系統(tǒng)(AEGIS)。嘧啶堿基類似物被指定為“py “，嘌呤為“pu “。大寫(xiě)字母分別代 表氫鍵模式中的受體(A)和供體(D)。因此，胞嘧啶是pyDAA。請(qǐng)注意字母代號(hào)Z和P小溝 的陰影代表孤對(duì)電子(這些部位可能是一些聚合酶的識(shí)別位點(diǎn))，M代表可附加表示集團(tuán)的 位置。圖2. SNAP2架構(gòu)，動(dòng)態(tài)地以一個(gè)模板組裝兩個(gè)引物片段，每個(gè)片段包含8個(gè)核 苷酸，其中一個(gè)片段的3'-端接CH2CHCK在模板DNA 5'-端的那個(gè)片段)，在模板DNA 3'-端的那個(gè)片段5'-端含有氨基。這些片段在動(dòng)態(tài)的平衡條件下，可以通過(guò)亞胺鍵形成 動(dòng)態(tài)可逆的二聚體。亞胺鍵的形成和斷開(kāi)在水中是可逆的，這種可逆性有利于，與模板完全 互補(bǔ)的、最穩(wěn)定的二聚體的形成。如果DNA聚合酶能夠利用這種復(fù)合的引物復(fù)制模板DNA， 這種引物的特異性應(yīng)該是16個(gè)堿基引物所具有的特異性(因此在人類基因組中的結(jié)合處 是專一的)，因?yàn)檫@兩個(gè)片段的連接必須在模板的鄰接部位發(fā)生。但是，這種二聚體引物對(duì) 不匹配堿基對(duì)的排斥性是非常高的，應(yīng)該含有8個(gè)核苷酸的引物所具有的特性。這種結(jié)構(gòu) (SNAP2)表面上類似于[Stu89], Szybalski, [Szy90]，和科特勒等人[Kot93]提出的結(jié)構(gòu)， 其中多個(gè)短片段被連接成為一個(gè)復(fù)合的序列。在這些提案中，個(gè)個(gè)片段以共價(jià)鍵連接，這種 連接是不可逆轉(zhuǎn)的，因此不具有動(dòng)態(tài)平衡所有的特性和功能。初步的數(shù)據(jù)請(qǐng)參閱[Lea06]。圖3.詳細(xì)介紹了在圖示2中的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在這里，兩個(gè)引物片段臨時(shí)形成一個(gè)亞 胺鍵的連接。初步數(shù)據(jù)，請(qǐng)參閱[Lea06]圖4. 2004年11月13日提交的，美國(guó)序列號(hào)60/627459和60/627460中提及的， 自回避分子識(shí)別系統(tǒng)(SAMRQ中的雜環(huán)化合物。這些雜化堿基通過(guò)兩個(gè)氫鍵形成堿基對(duì)， 可以被嵌入PNA或DNA的骨架中，與天然的G，A，C，和T通過(guò)兩個(gè)氫鍵結(jié)合，但不與自身結(jié) 合。這使得這些片段的序列與其他片段的序列有正交性。
圖5. 2005年11月12日提交的，美國(guó)序列號(hào)11/271366中提及的，自回避分子識(shí) 別系統(tǒng)(SAMRQ中的雜環(huán)化合物。圖6.在這項(xiàng)工作中嘗試過(guò)的，因?yàn)楦鞣N原因被拋棄的，自回避分子識(shí)別系統(tǒng) (SAMRS)中的雜環(huán)化合物。5-methylzebularine作為C*與G形成的氫鍵太弱，同時(shí)化學(xué)合 成中也有問(wèn)題。3-methylpyrimidin-2-one作為T*所提供的氫鍵也不夠強(qiáng)。圖7.目前首選的自回避分子識(shí)別系統(tǒng)(SAMRS)。一個(gè)分子識(shí)別系統(tǒng)，能夠與其序 列互補(bǔ)的天然DNA相互結(jié)合，而不與互補(bǔ)的SAMRS序列結(jié)合。SAMRS堿基(以星號(hào)*表示) 與標(biāo)準(zhǔn)的堿基通過(guò)兩個(gè)氫鍵互補(bǔ)，而任何兩個(gè)大小互補(bǔ)的SAMRS堿基之間(最多)只有一 個(gè)氫鍵。請(qǐng)注意，在G*-C*和A*-T*的擺動(dòng)結(jié)構(gòu)中不具備兩個(gè)有效的氫鍵。在開(kāi)發(fā)SAMRS 概念時(shí)，非標(biāo)準(zhǔn)堿基在Bermer實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)規(guī)則詳見(jiàn)[Gey03]。因此，在本圖示雜環(huán)化合物 所形成的堿基對(duì)中，氨基作為氫鍵給體均有氫鍵受體，沒(méi)有堿基對(duì)含有一個(gè)負(fù)電荷，并且沒(méi) 有堿基對(duì)是非芳香性。圖8.標(biāo)準(zhǔn)的引物(圖8a)和含有SAMRS的引物(圖8b)PCR擴(kuò)增人類基因組中不 同的癌癥基因。SAMRS系統(tǒng)中氫鍵模式實(shí)施如下T*是2-硫代胸腺嘧啶；Α*是2-氨基嘌 呤；G*是次黃嘌呤；C*是Ν4-乙烷基胞嘧啶。模板人類基因組DNAQ5ng/25微升)，每一 個(gè)引物(200nM)。dNTPs(每一種分別為0. 2mM)。SAMRS引物的反應(yīng)體系中另外增加5mM的 氯化鎂。Taq聚合酶1.0單位/0.025毫升。40個(gè)PCR循環(huán)94°C變性1分鐘，然后SAMRS 引物在55°C退火，標(biāo)準(zhǔn)的引物在60°C退火1分鐘；然后引物延伸72°C 90秒。3%瓊脂糖凝 膠分離產(chǎn)物同時(shí)染色顯影(其中一個(gè)引物5'-放射性標(biāo)記)。圖9.如示例18中所述，用標(biāo)準(zhǔn)的引物(圖9a)和含有SAMRS的引物(圖9b)同 時(shí)PCR擴(kuò)增五個(gè)和十個(gè)人類基因組中不同的癌癥基因。SAMRS氫鍵模式如下T*是2-硫代 胸腺嘧啶；Α*是2-氨基嘌呤；G*是次黃嘌呤；C*是Ν4-乙烷基胞嘧啶。模板人類基因組 DNA(25ng/25微升)，每一個(gè)引物OOOnM)。dNTPs (每一種分別為ImM)。圖10.用以下的引物(濃度為500nM)擴(kuò)增Taq聚合酶的基因SAMRS-21+4-F 5' -TAT CTG CGT GCC CTG TCT CTG * G * A * G * G-3'序列 編號(hào)1SAMRS-21+4-R 5' -CCA ATG CCA ACC TCT ACC TCC 女 A 女 G 女 A 女 G—3'序列 編號(hào)2SAMRS-17+8-F 5' -TAT CTG CGT GCC CTG TC 女 T 女 C 女 T 女 G 女 G 女 A 女 G 女 G-3'序列編號(hào)3SAMRS-17+8-R 5' -CCA ATG CCA ACC TCT AC 女 C 女 T 女 C 女 C 女 A 女 G 女 A 女 G-3'序列編號(hào)4一個(gè)星號(hào)*后面的字母表示目前首選的雜環(huán)化合物。引物的3-端故意設(shè)計(jì)成重 疊；有標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸組成的引物沒(méi)有得到相應(yīng)的產(chǎn)品，只有引物二聚體(下箭頭，41個(gè)堿 基)。2%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影。圖11.所測(cè)試的不同C*的結(jié)構(gòu)和縮寫(xiě)。圖12.示例13中，以含有SAMRS組分的寡核苷酸為模板進(jìn)行引物延伸的數(shù)據(jù)。圖13.示例14中，以含有SAMRS組分的引物進(jìn)行引物延伸的凝膠顯影圖示。圖14.示例15中，凝膠顯影顯示聚合酶能夠復(fù)制含有連續(xù)SAMRS組分的模板底物。圖15.示例16中的凝膠顯影顯示聚合酶能夠復(fù)制含有2-硫代胸腺嘧啶的模板底 物。圖16.示例17中的凝膠顯影顯示DNA聚合酶能夠在不同濃度的氯化鉀中復(fù)制含 有SAMRS組分的模板底物。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在試圖構(gòu)建自回避分子識(shí)別系統(tǒng)以支持PCR反應(yīng)時(shí)，有三個(gè)問(wèn)題需要用實(shí)驗(yàn)來(lái)證 實(shí)。首先，在許多PCR技術(shù)，尤其是那些沒(méi)有用“巢式PCR構(gòu)架”的PCR中[Bro97]，PCR引 物的濃度必須比目標(biāo)底物高很多倍。在過(guò)去十年的文獻(xiàn)中(美國(guó)專利5912340，[Lah08]和 其中的參考文獻(xiàn))描述了將氨基嘌呤、硫代胸苷、乙基化胞嘧啶、肌苷和其它SAMRS成份嵌 入一個(gè)單鏈寡核苷酸中，以防止自我折疊而形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這方面的信息并不詳盡，因?yàn)楹?有SAMRS的寡核苷酸片段與含有標(biāo)準(zhǔn)堿基的寡核苷酸具有相同的數(shù)量。PCR擴(kuò)增需要至少 100倍放大，而且大多數(shù)最好超過(guò)100倍放大，PCR中引物的終濃度最好是100納摩爾或更 大。在這樣的濃度條件下，自我回避系統(tǒng)的可行性需要一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)，最好是顯示在 正常的PCR條件下，完全互補(bǔ)的SAMRS引物不能形成引物二聚體。這表現(xiàn)為在示例4中，這 一點(diǎn)已經(jīng)得到證實(shí)。第二，聚合酶必須能夠捕獲引物和模板的復(fù)合物并且能夠延伸引物。如果這點(diǎn)被 證明，然后聚合酶必須能夠復(fù)制擴(kuò)增的產(chǎn)品。這兩點(diǎn)也必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，眾所周知，因 為聚合酶對(duì)底物的接受有很強(qiáng)的特異性[Hor95]。文獻(xiàn)(如美國(guó)專利7371580)中涉及的 結(jié)合特性沒(méi)有實(shí)驗(yàn)支持。此外，文獻(xiàn)表明非標(biāo)準(zhǔn)SAMRS核苷三磷酸可能作為聚合酶的底物 (見(jiàn)[Lah08]和其中引用的參考文獻(xiàn))，這并不意味著含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的引物能夠被聚合 酶所接受，當(dāng)然更不能說(shuō)明包含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的模板能夠被聚合酶接受。示例4(圖10)展 示出單元PCR的配方，示例18 (圖9)展示了多元PCR。本規(guī)范教導(dǎo)我們引物和模板的熔化溫度決定了引物和模板復(fù)合物可否被聚合酶 擴(kuò)增。這就提出了第三個(gè)問(wèn)題。那些對(duì)天然DNA及其類似物有一些經(jīng)歷的人相信某些通則 (例如，含有2'-甲酯核苷酸的雙螺旋比2'-脫氧核苷酸的雙螺旋更穩(wěn)定，RNA:DNA雙鏈 比DNA:DNA雙鏈更穩(wěn)定)適用于所有雜環(huán)系統(tǒng)，并且支持以這些規(guī)則為基礎(chǔ)的DNA分子的 分子識(shí)別。例3表明，在很多情況下這些規(guī)則并不適合用于SAMRS核苷酸。本發(fā)明在這里講述，為什么這些問(wèn)題需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)解決，為什么以前的專利文 獻(xiàn)沒(méi)有提到的本發(fā)明中的聲明，并且通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，本專利讓大家更好的理解和領(lǐng)悟發(fā) 明的核心。在前幾代的結(jié)構(gòu)被探索之后，本專利在此聲明和確定了一組首選的SAMRS系統(tǒng) (圖 4-6)。最初，SAMRS核苷類似物(T*，A*，G*和C*)，被設(shè)計(jì)為與A，T，C和G分別形成兩個(gè) 互補(bǔ)的氫鍵，但只有一個(gè)氫鍵分別在假定的堿基對(duì)A*:T*和G*:C*中。依據(jù)這個(gè)原則(圖 5)除去G底部的氫鍵給于集團(tuán)(一個(gè)氨基)，則形成G*(正式名稱為次黃嘌呤)，同樣地，丟 棄C頂部的氫鍵給于集團(tuán)(也是一個(gè)氨基)，則形成C* (正式名稱為zebularine)。我們最 初丟棄了 T底部氫鍵的接受集團(tuán)(一個(gè)C = 0單元)形成了 T* ( 一個(gè)吡啶2酮的C-苷)。 由于天然的腺嘌呤(A)底部沒(méi)有參與氫鍵的集團(tuán)，我們將2，6_ 二氨基嘌呤頂部的氫鍵給于 集團(tuán)(一個(gè)氨基)除去，產(chǎn)生A* (是2-氨基嘌呤)。
我們預(yù)期，這些T* A，A* T，C* G和G* C堿基對(duì)，將有助于穩(wěn)定雙螺旋與A T堿基 對(duì)有大致相同的程度，因?yàn)樗鼈兌己袃蓚€(gè)氫鍵。此外，這些設(shè)計(jì)均與設(shè)計(jì)非標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸 的規(guī)則相兼容[Gey03]，其中大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)補(bǔ)償?shù)聂驶鶜滏I單位與雙螺旋的穩(wěn)定性兼 容，但是無(wú)補(bǔ)償?shù)陌被鶆t與雙螺旋的穩(wěn)定性不兼容。合成第一代T*(2-脫氧核苷吡啶2-酮)的路線已經(jīng)有報(bào)道[LanOO] [Woo03] [Sil99]。但2-吡啶-2-酮和腺嘌呤形成的堿基對(duì)非常弱。因此，在2-吡啶-2-酮上加入 甲基，利用著名的甲基對(duì)雙螺旋的穩(wěn)定效應(yīng)。A*采用2'脫氧核苷-2-氨基腺嘌呤，它的帶 保護(hù)集團(tuán)的Phosphoramidite可以從Glen Research買到。同時(shí)A*是唯一的首選雜環(huán)結(jié) 構(gòu)其環(huán)外官能集團(tuán)，在合成其phosphoramidite的過(guò)程中需要進(jìn)行保護(hù)。苯氧乙?；贿x 為2-氨基腺嘌呤中環(huán)外氨基的保護(hù)基團(tuán)。因?yàn)?，第一代的O(Zebularine)不能承受通常 寡核苷酸去除保護(hù)基時(shí)的堿性條件。第一代的C*，2 ‘-脫氧核苷-嘧啶-2-酮(即zebularine中的核苷堿基)已有 報(bào)道[Viv04]。它的5-甲基衍生物可以從Glen Research買到[SinOl]。肌苷在商業(yè)上可 用多種形式，可從適當(dāng)?shù)南佘彰摪毖苌锍杀镜土暮铣?。也可以?-deazainosine的形 式獲得。大量的實(shí)驗(yàn)表明，第一代的SAMRS核苷類似物需要改進(jìn)，以提供有用的成分。5_甲 基pyrid-2-one與A的配對(duì)和5-methylpyrimidin-2-one與G的配對(duì)，對(duì)雙螺旋的穩(wěn)定性 貢獻(xiàn)太小。因此，我們期望修改核苷糖環(huán)的骨架以提高PCR引物的親和力。例如，它是標(biāo)準(zhǔn)的 做法，使用ribosides或2' -Ο-methylribosides提高一個(gè)堿基對(duì)的穩(wěn)定性。我們?cè)噲D這 樣做，但是沒(méi)有達(dá)到所需的穩(wěn)定性。在Pyrimidines的雜環(huán)的5位添加炔集團(tuán)(ftOpynyl)， 也可用于增加嘧啶堿基對(duì)的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)測(cè)試一系列含有上述核苷酸衍生物的寡核苷酸序 列，仍未能實(shí)現(xiàn)自回避寡核苷酸系統(tǒng)所要求的性能?？紤]到zebularine可能與G配對(duì)形成 了一個(gè)弱堿基對(duì)，因?yàn)樗鼈冎g是“推-推式“的電子系統(tǒng)，我們準(zhǔn)備了嘧啶-2-酮的5位 甲氧基衍生物。這也沒(méi)有給出需要的穩(wěn)定性，即使有些含有這種C*的寡核苷酸可以作為引 物，并且能夠與模板穩(wěn)定的結(jié)合。zebularine雜環(huán)的(圖11)各種甲基衍生物也未能滿足要求。此外，我們發(fā)現(xiàn) zebularine雜環(huán)化合物的兩種化學(xué)不穩(wěn)定性，包括酸催化d印yrimidinylation和堿催化 Michael加成。這些結(jié)果有些出人意料，就在當(dāng)時(shí)，其它的實(shí)驗(yàn)室在試圖將其納入寡核苷酸， 以防止他們折疊時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了同樣地現(xiàn)象。當(dāng)以2-硫代胸苷替代5-methylpyrid-2-0ne作為T*時(shí)，我們得到了充足的穩(wěn) 定性。2-硫代胸苷中的硫原子，是眾所周知的一個(gè)弱氫鍵受體[Sis05]，因此，它不會(huì)與 isoguanine的異構(gòu)體配對(duì)。2_硫代胸苷也可能是一個(gè)更好的T*，因?yàn)樗cA的配對(duì)比T與 A的配對(duì)有更好的穩(wěn)定性。以zebularine的衍生物作為C*，我們分別測(cè)試了 N4-甲基和N4-乙烷基胞嘧啶。 這些堿基早在1987年
已經(jīng)被嵌入寡核苷酸，并且可以與G配對(duì)[Ngu98]。這些相 關(guān)文獻(xiàn)，特別是含有這些寡核苷酸合成細(xì)節(jié)的文獻(xiàn)，被收集在本專利的參考文獻(xiàn)中。這些提 供了目前SAMRS發(fā)明中首選的組分(圖7)。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，獲得了一系列的SAMRS堿 基的熔化溫度。這些數(shù)據(jù)為研究者提供了一個(gè)重要的，使用這個(gè)系統(tǒng)的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。
這些規(guī)則，顧名思義，具有啟發(fā)性。在預(yù)測(cè)SAMRS系統(tǒng)中的一個(gè)序列的結(jié)合特性有 一定的不精確性，就像預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA，標(biāo)準(zhǔn)的RNA，和AEGIS分子識(shí)別系統(tǒng)中某個(gè)序列的結(jié) 核性一樣不精確。因此，作為一般規(guī)則，如果一個(gè)普通技術(shù)人員希望設(shè)計(jì)一個(gè)SAMRS序列 與預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)的DNA結(jié)合，并使其Tm為25°C。那么，他們會(huì)從預(yù)選序列的5'-端到 3'-端方向?qū)懴略摌?biāo)準(zhǔn)DNA的序列，然后在其下面按照反平行的方向?qū)懗鯯AMRS的序列， 并且遵循T*與A匹配，C*與G匹配，A*與T匹配，G*與C匹配的原則。然后，我們轉(zhuǎn)向目標(biāo)(b)，尋找條件實(shí)現(xiàn)含有SAMRS的寡核苷酸能作為引物。實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)由兩個(gè)氫鍵組成的堿基對(duì)的雙螺旋不太穩(wěn)定，通常需要更長(zhǎng)的序列來(lái)增加雙鏈的穩(wěn)定 性。例如，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度在25個(gè)核苷酸的SAMRS寡核苷酸，才能在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件下， 被DNA聚合酶有效地延伸。通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，復(fù)合式的引物效果最好。當(dāng)然，自回避特性只需要應(yīng)用在引 物的3'-端，如果引物的3'-端沒(méi)有SAMRS組件，那么在很多引物存在的情況下，一些引 物3'-端的部分片段可能會(huì)重疊，這些重疊，在含有三磷酸核苷酸和聚合酶的PCR反應(yīng)條 件下，會(huì)產(chǎn)生引物二聚體。相反地，引物的5'-端不需要SAMRS來(lái)避免引物二聚體的形成。因此，基于聚合酶和SAMRS寡核苷酸之間相互作用的幾點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明包括一些 幾點(diǎn)(a)聚合酶能夠接受只包含SAMRS堿基的寡核苷酸(包括3'-端的第一個(gè)堿基 不是SAMRS堿基)作為引物，但是需要至少15個(gè)寡核苷酸的長(zhǎng)度，最好超過(guò)15個(gè)核苷酸。(b)DNA聚合酶能夠在PCR中使用含有SAMRS堿基的引物，包括N4-乙烷基胞嘧啶， 我們本來(lái)預(yù)計(jì)該堿基因?yàn)閭?cè)鏈的緣故在模板要被拒絕，同樣地，我們?cè)A(yù)計(jì)耐熱聚合酶會(huì) 拒絕肌苷，因?yàn)樗窍佘盏拿摪碑a(chǎn)品。與此相反，PCR擴(kuò)增不支持上一代的SAMRS組件。(c)即使在引物濃度大于100納米的情況下，自回避特性依然成立。此外，自回避， 只要在引物的3'-末端嵌入四個(gè)到八個(gè)SAMRS組分，就可以有效地避免序列互補(bǔ)的引物 形成引物二聚體。在常規(guī)的多元PCR中，利用30個(gè)含有SAMRS組分的引物，在一個(gè)試管內(nèi) 同時(shí)擴(kuò)增15個(gè)目標(biāo)底物，含有SAMRS組分的引物不需要任何的優(yōu)化，就可以避免引物之間 3'-末端序列的二聚。(d) SAMRS元件所產(chǎn)生的不丟失，當(dāng)引物3'末端的第一個(gè)堿基為標(biāo)準(zhǔn)的核苷 酸，即使在大量的引物中，一個(gè)引物有與其完全互補(bǔ)的引物存在(例4，圖10) JfSAMRS 組件嵌入引物群的3'-末端，依然能產(chǎn)生自回避的效果。這樣就可以利用商品化的、 CPG(controlled pore glass)上的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸開(kāi)始引物的合成，有利于降低引物合成的費(fèi)用。(e)展示關(guān)鍵性的熔化溫度數(shù)據(jù)以支持啟發(fā)式的規(guī)則。(f) 一些啟發(fā)式規(guī)則可以從DNA轉(zhuǎn)移到SAMRS系統(tǒng)，而有些則不能。因此，較長(zhǎng) SAMRS寡核苷酸序列比短序列具有較高的Tm值，如例7中，增加核苷酸的長(zhǎng)度從18到25 使Tm值從30. 8上升至42. 0°C。同樣地，增加鹽的濃度(例7)可以增加Tm值。同樣地， 以2，6_ 二氨基嘌呤取代2-氨基嘌呤作為A*也可以增加Tm(例8)。提高氯化鉀的濃度可 以降低聚合酶遇到模板中SAMRS時(shí)的停頓(例17)。但是，將SAMRS系統(tǒng)中堿基的糖環(huán)，由 2'-脫氧核糖替換為2'-甲氧基核糖時(shí)，一般的啟發(fā)式規(guī)則不使用，因?yàn)檫@樣的替換顯著 的降低SAMRS堿基與標(biāo)準(zhǔn)堿基的結(jié)合穩(wěn)定性。
(g)接下來(lái)的問(wèn)題是選擇合適的聚合酶在PCR中使用SAMRS引物。例如，肌苷是 G*類似物中的首選。然而，很多來(lái)自于高溫生物體中的耐熱聚合酶遇到肌苷時(shí)會(huì)停頓，因?yàn)?肌苷是腺苷的脫氨化產(chǎn)物，可能是為了允許修復(fù)這個(gè)共同的缺陷。因此，Taq聚合酶是適合 于SAMRS系統(tǒng)的首選聚合酶。此外，實(shí)驗(yàn)證明SAMRS寡核苷酸可以被5 ‘-磷酸標(biāo)簽，并且寡核苷酸的5 ‘-端的 OH基團(tuán)可以被5'-氨基取代(因此在圖2所示的體系結(jié)構(gòu)中非常有用)。另外，在5'-末 端也可以進(jìn)一步的修飾，以包括連上生物素，捕獲標(biāo)簽，或熒光標(biāo)記。最后，對(duì)于PCR引物對(duì)，這里講到，這些引物均含有SAMRS組分，在一對(duì)引物中的第 一個(gè)引物，其序列與目標(biāo)底物的特定部位的序列完全互補(bǔ)，因此第一個(gè)引物與目標(biāo)底物的 特定部位相結(jié)合。第二個(gè)引物的序列與同一目標(biāo)底物上游某段的序列相同(即在底物的 5'-端方向)，其中“相同”指的是，第二個(gè)引物中的A或A*對(duì)應(yīng)于靶序列中的A，第二個(gè) 引物中的T或T*對(duì)應(yīng)于靶序列中的T，第二個(gè)引物中的G或G*對(duì)應(yīng)于靶序列中的G，第二 個(gè)引物中的C或C*對(duì)應(yīng)于靶序列中的C。這就意味著，第二個(gè)引物的核苷酸序列，與第一個(gè) 引物以目標(biāo)底物為模板進(jìn)行引物延伸所得產(chǎn)物的序列相互互補(bǔ)，同樣也意味著，第二個(gè)引 物將以第一個(gè)引物延伸的產(chǎn)物為底物，進(jìn)行引物延伸。這就是PCR系統(tǒng)中，任何一對(duì)引物序 列與底物中結(jié)合序列之間的關(guān)系。擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度(不包括引物本身所產(chǎn)生的部分)取決于兩個(gè)引物之間的間距。 實(shí)用的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為10-1000個(gè)核苷酸，最好是10到400核苷酸。因此，在目標(biāo)底物 與第一個(gè)引物3'-端結(jié)合的核苷酸序列，與目標(biāo)底物中與第二個(gè)引物3'-端有相同序列 的核苷酸片段之間，應(yīng)該有10到400核苷酸。范例范例1、制備堿基未受保護(hù)的硫代胸苷亞磷酰胺(thiothymidine phosphoramidite)05'-氧，4' -二甲氧基三苯甲基)-2'-脫氧-2-硫代胸苷.在2-硫代胸苷的無(wú)水吡啶(50毫升)溶液中(Berry & Associates，1. 95克， 7. 55毫摩爾)加入DMTrCl (2. 94克，8. 68毫摩爾)。該混合溶液在室溫下攪拌20小時(shí)。 用甲醇(10毫升)猝滅反應(yīng)，同時(shí)蒸發(fā)除去溶劑。所得的殘?jiān)苡贏cOEt，用蒸餾水和鹽 水洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，蒸發(fā)以除去大部分的溶劑。殘留物用硅膠柱純化， 使用正己烷(67%)和Ac0Et(33%)作為洗脫液，最終得到了 3. 90克的白色泡沫狀目標(biāo) 化合物(92 % )。匪R(Varian Mercury 300MHzspectrometer) =1H-Wr(CdcI3JOOMHz) 1.45(s，3H) ；2. 25-2. 34 (m, 1H) ；2. 59-2. 67 (m，1H) ；3. 36-3. 41 (dd，1H) ；3. 53-3. 57 (dd， 1H) ；3. 77(s，6H) ；4. 11 (m, 1H) ；4. 60 (m, 1H) ；6. 86(t, 1H) ；6. 81-7. 40 (m, 13H) ；7. 84(s, 1H). 13C-NMR(CDCl3) :12. 3,41. 3,55. 5,63. 2,71. 9,86. 8,87. 2,90. 1，113. 6，116. 7，127. 5， 128. 3，128. 3，130. 3，135. 5，136. 9，144. 5，159. 0，161. 1，174. 3. ESI-TOF (+) MASS :m/ z[M+Na] +calcd for C31H32N206S+Na :583. 1873 ；found :583. 1897.5 ‘ _{氧-[(4，4' -二甲氧基三苯甲基)_2 ‘-脫氧_2_硫代胸 苷]}_3' -[2-cyanoethyl bis(1-methylethyl)phosphoramidite.將上述實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物(300毫克，0. M毫摩爾)溶解在無(wú)水二氯甲烷(5毫 升)中，在反應(yīng)體系中加入N，N-diisopropylethylamine(235微升，1. 35毫摩爾)和2-cyanoethyl-N, N-diisopropyIchlorophosphoramidite (181 微升，0· 81 毫摩爾)。該 混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，向混合物中加入AcOEt，用蒸餾水和鹽水洗滌，有機(jī)相用無(wú) 水硫酸鈉干燥后，蒸發(fā)以除去大部分的溶劑。殘留物用硅膠柱純化，使用正己烷(33%) 和AcOEt(67% )作為洗脫液，最終得到了 348毫克的白色泡沫狀目標(biāo)化合物(85 % )。 NMR (Varian Mercury 3OOMHz spectrometer) 1H-NMR(CDCl3, 300MHz) 1. 04-1. 18(m， 12H) ；1. 40and 1. 42 (each s,3H) ；2. 26-2. 36 (m, 1H) ；2. 42and 2. 63 (each t，2H); 2.62-2. 79 (m, 1H) ；3. 31—3. 88 (m，6H) ； 3. 80(s，6H) ；4. 18 (m, 1H) ；4. 67 (m, 1H) ；6.92 (m， 1H) ；6. 82-7. 42 (m, 13H) ；7. 88and 7. 92 (each s, 1H) ；9. 36 (br s，1H) · 31P-NMR (CDCl3, 121MHz) (ppm,relto external StandardH3PO4 = 0) = 149. 7 ；150. 4. ESI-TOF (+)MASS :m/ z[M+Na]+calcd forC40H49N407PS+Na :783. 2952 ；found :783. 2909.高效液相餼譜法。高效液相色譜法純化寡核苷酸的過(guò)程如下所述。分析型的 高效液相色譜也可用于純化寡核苷酸。分析型的高效液相色譜法；Waters 600S控制器， Waters 616泵，Waters 486可調(diào)諧吸收檢測(cè)器。制備型的高效液相色譜；Waters PrepLC 系統(tǒng)控制器，Waters PrepLC 4000系統(tǒng)，Waters 486可調(diào)諧吸收檢測(cè)器。反相柱分析型 的HPLC柱Waters Nova-Pak C18(3. 9x 150mm)；制備型的HPLC C18 柱Waters Nova-Pak HR C18(7. 8x 300mm)。離子交換柱分析型的離子交換柱 DIONEX DNAPac PA-100 (4x 250mm), 制備型的離子交換柱DIONEX DNAPac PA-100 (9x 250mm)。反相色譜的緩沖溶液，緩沖溶液 A = 25mM TEAA (或25mM醋酸銨)，緩沖溶液B=在緩沖溶液A中加入20%的乙腈。離子交 換色譜的緩沖溶液溶液A = 25mM TEAA+200mM氯化鈉，溶液B = 25mM TEAA+1M氯化鈉。范例2、制備目前首選的SAMRS寡核苷酸亞磷酰胺(phosphoramidite)化學(xué)使得合成含有η個(gè)堿基的4η個(gè)DNA和RNA序 列變得相當(dāng)容易。因此，沒(méi)有必要再專利和擁有這些核苷酸序列。類似地，發(fā)明的成分是由 亞磷酰胺合成制備，合成的結(jié)果不依賴于核苷亞磷酰胺被加入的順序。在SAMRS組分中有 幾個(gè)亞磷酰胺可購(gòu)得。其他包含目前首選SAMRS成分的寡核苷酸已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道
[Ngu98]，制備程序如下2' -Deoxy-5' -dimethoxytritylinosine-3 ‘ -0-(3-cyanoethy 1-diisopropylaminophosphoramidite ( ^ g Glen Research)ΔΜΦ M-^M 度為 0.12摩爾。2' -Deoxy-5 ' -dimethoxytrityl—2-石智代月匈昔 _3 ‘ -0-(3-cyanoethy 1-diisopropylaminophosphoramidite)制備如上所述，溶解于無(wú)水乙腈(終濃度為0. 12 摩爾)。2' -Deoxy-5 ‘ -dimethoxytrityl-N4-ethylcytidine-3 ‘ _0_(3-cyanoethyl-d iisopropylaminoph osphoramidite)是從胸苷合成而來(lái)，并在無(wú)水乙腈溶解(終濃度為 0. 12 摩爾)。最后，2' -deoxy-5‘ -dimethoxytrityl—2-氛基口票吟 _3‘ -0-(3-cyanoeth yl-diisopropylaminophosphoramidite)上的保護(hù)集團(tuán)為N-苯氧乙?；苌?從2' 脫氧核苷-2-氨基嘌呤準(zhǔn)備而來(lái)，該化合物購(gòu)自Berry and Associates)溶解于無(wú)水乙腈 (終濃度為0. 12摩爾)。這些試劑在瓶中被安裝在應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的394DNA合成儀上 (Applied Biosystems 394DNA synthesizer (Foster City，CA))，DNA 合成開(kāi)始于用可控孔 徑的玻璃為固相，3'-端連接的標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸。耦合時(shí)間分別為10分鐘。3%的二氯乙酸 的二氯甲烷溶液用于脫三苯甲基(5' -detritylation)。合成后，產(chǎn)品在室溫下有氨水處 理16小時(shí)。然后冷凍和冷凍干燥。寡核苷酸用含7M尿素的20%的PAGE純化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， M-ethylcytidine中的氮并不需要保護(hù)。此外，還發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)的脫保護(hù)集團(tuán)的條件會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物產(chǎn)生，其中包括文獻(xiàn)中記載的硫磺從2-thioT中脫離。出于這個(gè)原因，苯氧乙?；挥?來(lái)保護(hù)2-氨基腺嘌呤。用dimethylformamidine來(lái)保護(hù)2-氨基嘌呤-5' -dimethoxytrit yl-3 ‘ -deoxynucleoside phosphoramidite 也可以，并且可以從 Glen Research 買至丨J0范例3、含有首選的和非首選的SAMRS組份的寡核苷酸的熔融溫度。范例3 (a)為了探索以5-methylzebularine作為C*氫鍵模式的SAMRS系統(tǒng)的熔化溫度，合 成一系列的寡核苷酸對(duì)，將其中的X和Y以*堿基的類似物替換。雙螺旋寡核苷酸的熔化 溫度在260納米處測(cè)量，溶液的體積為1毫升，單鏈寡核苷酸的濃度為3 μ M。圖表3.1.泖丨量熔化溫度中用到的序列
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=A，序列編號(hào)5
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=2-氨基嘌呤，序列編號(hào)6
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=T，序列編號(hào)7
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=2-硫代胸腺嘧啶，序列編號(hào)8
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=G，序列編號(hào)9
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=次黃嘌呤，序列編號(hào)10
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=C，序列編號(hào)11
SAMRS-Tml5-ACCAAGCXATCAAGT-3X=5-methylpyrimidin-2-one,
序列編號(hào)12
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=A，序列編號(hào)13
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=2-氨基嘌呤，序列編號(hào)14
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=T，序列編號(hào)15
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=2-硫代胸腺嘧啶，序列編號(hào)16
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=G，序列編號(hào)17
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=次黃嘌呤，序列編號(hào)18
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=C，序列編號(hào)19
SAMRS-Tml-C3-TGGTTCGYTAGTTCA--5/Y=5-methylpyrimidin-2-one,
序列編號(hào)20這些取代的雜環(huán)化合物作為SAMRS組份:A* = 2_氨基嘌呤；Τ* = 2_硫代胸腺嘧 啶；C* = 5-methylpyrimidin-2-one ；G* =次黃嘌呤·圖表3. 2.實(shí)驗(yàn)測(cè)試熔化溫度
X\YTΤ*AA*COGG*A55. 556. 843. 746. 545. 143. 546. 749. 8A*54. 552. 046. 845. 548. 144. 045. 846. 8T46. 348. 054. 052. 544. 645. 048. 446. 權(quán)利要求
1.通過(guò)酶進(jìn)行模板導(dǎo)向的引物聚合反應(yīng)，來(lái)擴(kuò)增寡核苷酸的一種過(guò)程，所述過(guò)程包括 (a)在水溶液中，一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸引物與上文所說(shuō)的寡核苷酸、聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)的核苷三 磷酸的相互作用，以及(b)在預(yù)選的時(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)培養(yǎng)上述的混合物，其中每個(gè)寡核苷酸引 物具有如下的形式(O-oligonucleotide)，氨基(-NH2)、和與一個(gè)磷酸鹽或氨基鏈接的生物素或熒光標(biāo)記集 團(tuán)，B是獨(dú)立選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、二氨基嘌呤、尿嘧啶、A*、T*、G*、和C*， D是獨(dú)立選自一個(gè)集團(tuán)包括A*、T*、G*、和C*，E是獨(dú)立選自一個(gè)集團(tuán)包括A、T、G、和C，K是 獨(dú)立選自一個(gè)集團(tuán)包括々、1\6、(^*、1^、6*、和C*，其中η是一個(gè)從4至25的整數(shù)，m是一 個(gè)從2到10的整數(shù)，一對(duì)引物中第一個(gè)引物的序列與被擴(kuò)增的寡核苷酸中某一部分的序列 互補(bǔ)，一對(duì)引物中第二個(gè)引物的序列，與同樣的被擴(kuò)增的寡核苷酸5'-端，距離第一個(gè)引 物結(jié)合部位10到1000處之間的某部位的核苷酸的序列相同，其中A*與胸腺嘧啶配對(duì)時(shí)， 能夠增加雙螺旋的穩(wěn)定性，但是，與T*配對(duì)不能增加雙螺旋的穩(wěn)定性，T*與腺嘌呤配對(duì)能 夠增加雙螺旋的穩(wěn)定性，但是，與A*配對(duì)則不能增加穩(wěn)定性，同樣地，G*與C*配對(duì)不能增 加雙螺旋的穩(wěn)定性，但是當(dāng)它與胞嘧啶配對(duì)時(shí)，能夠增加雙螺旋的穩(wěn)定性，C*與G*配對(duì)不 能增加雙螺旋的的穩(wěn)定性，但是當(dāng)它與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)時(shí)，則能夠增加雙螺旋的穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中A*是選自集團(tuán)包括2-氨基嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中T*是選自集團(tuán)包括2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代尿嘧啶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中G*是次黃嘌呤。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中C*是選自集團(tuán)包括N4-乙烷基胞嘧啶和N4-甲基胞 嘧啶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中，在引物中m和η的總數(shù)至少為15。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中，D部分被獨(dú)立地選自集團(tuán)包括T*、A*、G*和C*。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中，B部分被獨(dú)立地選自集團(tuán)包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥(niǎo) 嘌呤、胞嘧啶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中，Α*被選自集團(tuán)包括2-氨基嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中，Τ*被選自集團(tuán)包括2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代尿嘧啶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中G*是次黃嘌呤。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中C*是選自集團(tuán)包括N4-乙烷基胞嘧啶和N4-甲基胞 嘧啶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)程中，有至少5個(gè)引物對(duì)被接觸。
14.一個(gè)化合物具有如下的形式
15. 一個(gè)物質(zhì)的組成，包含一個(gè)多數(shù)的寡核苷酸對(duì)，每個(gè)寡核苷酸具有如下的形式
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述構(gòu)成中至少有一個(gè)B或一個(gè)D是選自集團(tuán)包括N4-乙烷基胞 嘧啶和N4-甲基胞嘧啶。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述構(gòu)成中的寡核苷酸可以溶解于水中，濃度在100納摩爾或更尚ο
全文摘要
本發(fā)明涉及自回避分子識(shí)別系統(tǒng)(SAMRS)，一種像DNA的分子，可以與其互補(bǔ)序列的天然DNA依照沃森-克里克規(guī)則結(jié)合，一但結(jié)合，便可以作為聚合酶延伸的引物，同時(shí)也可以在聚合酶鏈反應(yīng)中作為反向引物延伸的模板，但是，含有SAMRS組份的寡核苷酸類似物不與其序列互補(bǔ)的含有SAMRS組件的寡核苷酸結(jié)合。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，我們揭示了SAMRS組件在寡核苷酸中的這些特性，SAMRS組件在引物中最合適的位置，以及一些關(guān)鍵的生物物理數(shù)據(jù)以支持啟發(fā)式規(guī)則，以設(shè)計(jì)能夠用于引物延伸和PCR反應(yīng)中，含有SAMRS組件的寡核苷酸序列。我們也披露了含有這些成分的、可以被用于工具箱(kits)的一些寡核苷酸，和在PCR擴(kuò)增目標(biāo)寡核苷酸中使用這些成分的流程。
文檔編號(hào)C12P19/34GK102124020SQ200980132866
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日
發(fā)明者史蒂文·埃爾伯特·奔納, 星加周一, 陳非 申請(qǐng)人:史蒂文·埃爾伯特·奔納, 星加周一, 陳非