專利名稱：用于去除特定的種子組織或結(jié)構(gòu)進(jìn)行種子分析的方法
用于去除特定的種子組織或結(jié)構(gòu)進(jìn)行種子分析的方法I.背景 A.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于分析種子的方法以及根據(jù)該分析來對(duì)種子及其后續(xù)用途做出決策，具體地說，本發(fā)明涉及用于積極有效地去除特定種子組織或結(jié)構(gòu)以便能夠測(cè)試和分析種子及其被去除的組織或結(jié)構(gòu)的方法。B.技術(shù)問題種子公司的一個(gè)主要目的是開發(fā)種子，該種子可生長成合乎作物生產(chǎn)者商業(yè)要求的植物。種子公司針對(duì)合乎商業(yè)要求的種子的研究與開發(fā)投入大量資源。常規(guī)的研究與開發(fā)技術(shù)往往很費(fèi)力并需要大量的土地和空間。研究中涉及的所有或大部分種子都種植在研究試驗(yàn)田。在從種子萌發(fā)長出植株后，從各植株獲得組織樣品。把該組織樣品送到實(shí)驗(yàn)室以得出關(guān)于種子和來自種子的植物的研究與開發(fā)所需要的信息。這些方法是產(chǎn)業(yè)中眾所周知的。土地、勞動(dòng)力和機(jī)器的資源成本是巨大的。成千英畝(如果不是幾十萬英畝的話)的實(shí)驗(yàn)田可能被使用。從事耕作、種植、維護(hù)、獲取植物組織樣品、把植物組織樣品送到實(shí)驗(yàn)室、在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析的工人和機(jī)器的合適數(shù)目是巨大的。時(shí)間也是一種因素和成本。關(guān)于植物及其種子是否應(yīng)當(dāng)用于生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量或種子的決策，或者關(guān)于植物及其種子是否應(yīng)當(dāng)用于進(jìn)一步研究的決策，都必須等到來自出苗植物的組織樣品是可行的。一種典型的方法如下。把已知親緣、表型或基因型的種子種植在室外實(shí)驗(yàn)田或種植在溫室內(nèi)。在田間或溫室內(nèi)必須生長出統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的植物數(shù)量。這包括相當(dāng)大的物理空間和勞動(dòng)力。在植物出苗后，從植株上取出組織樣品。進(jìn)行試驗(yàn)以鑒定出樣品的遺傳組成或其它特征。當(dāng)然，這種方法需要花費(fèi)大量的時(shí)間。植物必須生長到組織樣品可以非破壞性地采集的點(diǎn)。樣品必須小心地處理并送到實(shí)驗(yàn)室。遺傳試驗(yàn)必須在目標(biāo)基因的鑒定做出之前進(jìn)行。可以獲得具有獲取并測(cè)試(遺傳學(xué)或別的方法)相關(guān)遺傳材料、或組織、部分或結(jié)構(gòu)而無需一定要從種子長到植物的方法，可能是有益的。正如技術(shù)人員所了解的，勞動(dòng)力、 時(shí)間和空間上的節(jié)約可以是巨大的。從大多數(shù)生長植物中獲取具有相關(guān)細(xì)胞材料的組織樣品并不是很難。按照慣例， 用某種工具(例如手工操作的葉片鉆孔器)取出來自生長植物的相對(duì)小部分組織或組織樣品。如果恰當(dāng)做到了，那么在小的葉片鉆孔器正常情況下不顯著地影響植物的健康或生存力的意義上，樣品的取出就是非破壞性的。例如，用葉片鉆孔器鉆取相關(guān)細(xì)胞用于植物分析。雖然這樣的葉片樣品對(duì)植物來說不是破壞性的，并且相對(duì)容易送到實(shí)驗(yàn)室和進(jìn)行保存， 從種子公司實(shí)驗(yàn)田中獲得來自正常數(shù)量的植物的植物組織樣品仍然是勞動(dòng)力和時(shí)間的巨大投入。它要求各植物長在生長地點(diǎn)并獲取葉片樣品。來自試驗(yàn)田植物結(jié)出的種子也具有相關(guān)的細(xì)胞材料。然而，為了獲取它并對(duì)它進(jìn)行試驗(yàn)或測(cè)定而不顯著地影響種子的生存力或萌發(fā)潛力，則完全是另外一回事。大多數(shù)種子及其部分的大小相對(duì)小是一個(gè)原因。另一個(gè)是某些種子中的有關(guān)組織或結(jié)構(gòu)僅僅是整個(gè)種子的一個(gè)子集(subset)，并且許多回?cái)?shù)(times)是在外殼(outer cover)的里面。這使得它很難僅僅獲取或獲得有關(guān)材料。此外，某些種子的組成使得非破壞性取樣很困難。玉米種子的堅(jiān)韌外層或組織即粒殼(pericarp)就是一個(gè)例子。若不使用破壞或損傷種子的方法則很難去除。再者，所有的這些問題對(duì)復(fù)粒種子的高通量獲取和取樣都是有對(duì)抗作用的。精確去除小目標(biāo)的特定組織或結(jié)構(gòu)以獲取其它特定組織或結(jié)構(gòu)，并且如此有效地進(jìn)行， 是有重大意義的挑戰(zhàn)。因此，產(chǎn)業(yè)上需要顯著地減少用來評(píng)價(jià)植物及其種子以用于潛在商業(yè)生產(chǎn)或進(jìn)一步用于植物和種子研究與開發(fā)的資源。本領(lǐng)域還需要從種子去除和/或獲取特定組織或結(jié)構(gòu)的方法，包括以非破壞性的和相對(duì)高通量的方式。II.發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面是一種方法，該方法用于減少將以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)的種子選擇所耗資源。收集種子作為用于可能選擇的候選者，并分別給予標(biāo)識(shí)符。去除單粒候選種子的特定組織或結(jié)構(gòu)以暴露或獲取該候選種子的特定組織、部分或結(jié)構(gòu)，或者以分離和收集特定組織、部分或結(jié)構(gòu)。對(duì)候選種子的暴露的組織或去除的組織進(jìn)行試驗(yàn)或分析。對(duì)該試驗(yàn)或分析的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)并可以對(duì)是否選擇該候選種子類型進(jìn)行例如商業(yè)生產(chǎn)做出決策。這些結(jié)果可以記錄下來并且與種子的標(biāo)識(shí)符相聯(lián)系。該方法避開了實(shí)驗(yàn)田或溫室中生長植物以及從生長植物取組織樣品的時(shí)間、空間和勞動(dòng)力?？梢杂孟鄬?duì)高通量方法直接從種子快速做出決策。根據(jù)本發(fā)明這一方面的一種裝置可包括種子保持器(seed holder)和進(jìn)行協(xié)調(diào)以便去除特定種子組織或結(jié)構(gòu)的工具。種子保持器把一粒種子與另一粒種子隔離開并將其遞給所述工具進(jìn)行組織去除。然后，可以對(duì)該種子中的任一暴露組織或來自該種子的去除組織進(jìn)行試驗(yàn)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，方法包括受控制激光，其以相對(duì)快速和精確的方式切除、 切割、分離或去除來自種子的組織、部分或結(jié)構(gòu)以獲得或暴露種子的所需部分，而不顯著地影響種子生存力或萌發(fā)潛力?？梢詫?duì)種子的有關(guān)暴露部分或組織進(jìn)行試驗(yàn)或分析，和/或?qū)ΨN子的去除部分或組織進(jìn)行試驗(yàn)或分析。在另一個(gè)方面，方法包括自動(dòng)化步驟或自動(dòng)化組件，其中可以移動(dòng)到組織去除站的多粒候選種子具有去除的特定組織、部分或結(jié)構(gòu)，并且具有進(jìn)行試驗(yàn)和評(píng)價(jià)的任一(或兩者)保留種子或其去除的組織。所述試驗(yàn)或評(píng)價(jià)可包括但不限于在細(xì)胞、分子或納米級(jí)水平上的遺傳、物理或化學(xué)分析。III.附圖簡述A.附1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面的通用方法的流程圖。圖2是舉例說明與實(shí)施

圖1方法的第一個(gè)具體實(shí)施例1有關(guān)的裝置和功能性的框圖。圖3是根據(jù)實(shí)施例1的本發(fā)明一個(gè)方面的示意局部透視圖。圖4A-C是圖3的板18的平面圖。圖4D是板18 —個(gè)孔的放大的局部剖視圖，進(jìn)一步顯示該孔中玉米種子的定位。
圖5A和5B是典型玉米種子的放大的平面和側(cè)面剖視圖。圖6A舉例說明在激光切除之前，大量玉米種子沉積在板18相應(yīng)各孔中的一種方式。圖6B圖解說明單粒種子沉積在板18各孔中的一種備選方式。圖7是允許為板18各孔設(shè)計(jì)切除區(qū)域的軟件模板的平面示意圖。圖8A是舉例說明激光切除的放大的示意側(cè)面仰視圖，激光切除可去除來自種子的組織，在種子一個(gè)表面留下了矩形棱柱形狀的空腔。圖8B是圖8A激光切除的種子的放大的頂部平面圖。圖9A-C舉例說明來自種子的激光切除、特別是粒殼部分的去除以暴露或去除種子胚乳中的某些的矩形棱柱空腔80的各種視圖。圖10A-C顯示具有矩形棱柱空腔組合的種子，即空腔的替代切除圖案。圖IlA-C顯示可以用激光切除成單籽粒的圖案的又一個(gè)替代實(shí)施例，矩形形狀中有第一通道和矩形形狀中有第二通道，第二通道與第一通道間隔開，并圍繞第一通道。圖12A-C顯示種子中激光切除圖案的另一個(gè)實(shí)施例的各種視圖，此處矩形棱柱通過粒殼以暴露或切除種子胚的一部分。圖13A-C類似于圖10A-C，但舉例說明控制激光以產(chǎn)生更圓的圖案。圖14A-C類似于圖11A-C，但舉例說明控制激光以產(chǎn)生圓形圖案。圖15是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)備選實(shí)施方案的實(shí)施例2的圖解說明，其中來自種子激光切除的碎片通過真空收集到容器中，然后對(duì)容器內(nèi)的碎片或去除組織進(jìn)行試驗(yàn)或分析， 并與種子中的暴露組織對(duì)照。圖16是根據(jù)實(shí)施例2的方法的局部剖面?zhèn)让嫜鲆晥D。圖17是用任選真空系統(tǒng)去除一組種子激光切除所產(chǎn)生的碎片的按比例縮小的圖解說明，每粒種子都定位在盤或板的孔中。圖18是使用激光進(jìn)行切割的任選種子切割器和基于磁力的種子保持和定向系統(tǒng)的圖解說明。IV.發(fā)明詳述A.概要為了更好地理解本發(fā)明，下面詳細(xì)地描述了本發(fā)明的若干示例性實(shí)施方案。要經(jīng)常參考附圖。用參考數(shù)字和字母來標(biāo)明附圖中的某些部件和位置。在整個(gè)附圖中，用相同的參考數(shù)字或字母來標(biāo)明相同或相似的部件和位置，除非另有說明。B.示例性實(shí)施方案的正文下面所描述的示例性實(shí)施方案主要是在玉米和玉米種子方面。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這只不過是本發(fā)明多個(gè)方面可使用的種子的一個(gè)實(shí)施例。另外，主要示例性實(shí)施方案的正文是去除玉米籽粒的相對(duì)少量的組織或結(jié)構(gòu)以(a)暴露和測(cè)試種子的特定內(nèi)部組織或結(jié)構(gòu)或(b)測(cè)試被去除的組織或結(jié)構(gòu)。去除可被有意控制以最小化或避免對(duì)種子生存力或萌發(fā)潛力的有害作用。然而，本發(fā)明可用于實(shí)際上去除更多的組織、甚至到威脅或破壞種子生存力的點(diǎn)，如果應(yīng)用時(shí)需要這樣的話。所述實(shí)施方案可以類似方式應(yīng)用于其它種子。實(shí)例包括但不限于燕麥、大豆、小麥、黑麥、水稻、油菜(canola)、蕓薹(Brassica sp.)、高粱、向日葵、大麥、黍、苜蓿、棉花、花生、亞麻、紅花、棕櫚、橄欖、篦麻、椰子、粟、擬南芥(arabidopsis)、番茄或高粱的種子。C.示例性的通用方法圖1舉例說明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面的通用示例性方法200。方法200允許對(duì)種子進(jìn)行選擇以用于進(jìn)一步研究或商業(yè)生產(chǎn)而無需從種子生長到植物后再測(cè)試植物的活組織。 該方法可避免從種子生長到植物，然后獲取非破壞性樣品進(jìn)行分析，再選擇決策時(shí)所需要使用的土地、勞動(dòng)力、時(shí)間、設(shè)備和材料。該方法對(duì)種子可以是非破壞性的，允許多個(gè)樣品的相對(duì)高通量，且基本上自動(dòng)化。方法200包括以下步驟。對(duì)不同基因型和/或不同玉米品種的大量玉米籽粒進(jìn)行分析和比較，以鑒定和選擇是否有任何基因型和/或品種可用于進(jìn)一步研究與開發(fā)或種植，生產(chǎn)商業(yè)或研究規(guī)模的數(shù)量。該方法同樣適用于其它種子特異性試驗(yàn)或分析，這些對(duì)于技術(shù)人員來說都是顯而易見的。1.候選種子的鑒定(步驟201/202)采用一個(gè)或多個(gè)因素來決定哪粒種子將是用于評(píng)價(jià)的候選種子(圖1，步驟201)。 在該實(shí)施例中，預(yù)先選擇一組分別具有不同性狀或基因型和/或玉米品種的大量單獨(dú)的候選種子。將各候選種子與其它的候選種子分離開，但與可以鑒定候選種子的信息相聯(lián)系 (步驟20幻。該同一性(identity)可以通過該方法與各種子相維持。各種子的鑒定可以是通過特定信息和/或通過與種子相關(guān)信息或身份有關(guān)的某些代碼。它可以被記錄或存儲(chǔ) (例如在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫)。其它方法是可能的。候選種子的預(yù)選擇可以基于任何數(shù)目的因素或標(biāo)準(zhǔn)。從事研究工作的科學(xué)家們選出了多個(gè)因素或標(biāo)準(zhǔn)。因素和標(biāo)準(zhǔn)的類型實(shí)例是本領(lǐng)域公知的。其中一些是基因型、表型、親緣、性狀或特征。這些因素或標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步論述可以在諸如以下的參考文獻(xiàn)中找至丨J (a) Chahal, G. S & Gosal, S. S. , 2002. "Principles and Procedures of Plant Breeding，，，Alpha Science International, United Kingdom ； (b)Falconer, D. S. 1989. “Introduction to Quantitative Genetics，，,第三版，Longman. Burnt Mill ； 禾口(c)Frisch, Μ· & Melchinger, Α· Ε· ,2005. "Selection Theory for Marker-assisted Backcrossing. "Genetics =Published Articles Ahead of Print, T 2005 ^ 3 ^ 31 日胃表，10. 1534/遺傳學(xué).104. 035451 ；這些參考文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。2.單粒種子的分離(步驟204)通過多種方法中的任一種分離單粒候選種子以把它用來去除特定組織(圖1，步驟204)以獲取或暴露該種子的某個(gè)(些)特定組織、部分或結(jié)構(gòu)進(jìn)行試驗(yàn)，或收集去除的組織進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于本說明書的目的而言，有時(shí)將種子的組織、部分或結(jié)構(gòu)統(tǒng)統(tǒng)稱為組織。 分離的一個(gè)實(shí)施例是將候選種子置于空腔或孔內(nèi)。另一個(gè)是通過某種裝置抓住、保持住或箝制住種子或者將種子抓到、夾到或箝到某種裝置(例如用真空；通過鉗夾作用)。另一個(gè)是將物質(zhì)施加到種子上，種子被吸引至或保持在表面或元件上(例如膠粘劑；磁性材料)。 其它的是可能的?；竟δ苁潜３址N子進(jìn)行精確和有效的組織去除及將所述種子與其它的分離開來，同時(shí)保持所述種子的身份。3.特定組織的去除(步驟205)從種子的規(guī)定位置去除種子的組織。多種方法都可以使用。在某些方法中，可以用來將種子以某種方式第一次定向。這可能有助于規(guī)定組織的去除。
組織去除的一個(gè)實(shí)施例是使用激光(參見圖幻。根據(jù)后面更詳細(xì)地描述，激光的強(qiáng)度可以精確地控制。它也可以聚焦到可以有效地用來僅僅自種子一側(cè)去除相對(duì)小面積的組織的束寬，和聚焦到相對(duì)小的可控深度。激光束可以按各種方式操作以實(shí)現(xiàn)組織去除。一個(gè)實(shí)施例是可編程光柵掃描。控制激光束以程序化速度和方向相對(duì)于待去除區(qū)域移動(dòng)。激光束可以聚焦在種子上和跨種子精確地移動(dòng)以切除它碰到的種子部分并去除組織。切除通過一個(gè)來源限定，以去除或破壞，尤其通過切割、刮擦或蒸發(fā)(汽化)去除或破壞(Merriam-Webster Online Dictionary 2007)。另一個(gè)來源將其描述為通過蒸發(fā)、切削或其它腐蝕性方法去除來自物體表面的物質(zhì)(WIKIPEDIA. “Ablation"article [在線]，[于 2008-08-18 檢索]。從因特網(wǎng)上檢索 <URL (http://en. wikipedia. org/wlki/Ablalion>)。 本文使用的切除是指去除或分離來自種子的此種子組織的這些動(dòng)作或類似動(dòng)作。在某些情形下，這基本上都會(huì)導(dǎo)致具有某組織被去除的候選種子暴露或允許接觸到內(nèi)部組織。切除可導(dǎo)致產(chǎn)生一塊或正好幾塊去除組織(更多在切割或切削的意義上)?；蛘?，切除可導(dǎo)致被去除的組織基本上呈碎塊狀(更多在來自磨蝕、腐蝕性過程的碎片或非常小的顆粒、甚至灰塵樣的意義上，等等)?；蛘撸谐蓪?dǎo)致被去除的材料蒸發(fā)、升華或成漿。激光可以按這些方式起作用以去除來自種子的特定組織。正如較早前提到的，可以將去除的組織收集起來用于試驗(yàn)或分析?；蛘撸梢詫?duì)保留種子進(jìn)行試驗(yàn)或分析，因?yàn)榭梢栽O(shè)計(jì)組織去除以暴露或允許觸及保留種子內(nèi)的組織。就玉米而論，可以控制激光束以去除粒殼區(qū)域，從而獲得非破壞性地觸及感興趣的底層種子組織、部分或結(jié)構(gòu)。正如圖5A和5B中玉米籽粒橫切面所顯示的，兩種可能性是胚74或胚乳76。胚74通常位于種子的尖帽末端67 (tip cap end)處或其附近，及比另一個(gè)更接近種子的扁平一側(cè)。胚乳大致沿胚側(cè)的整個(gè)對(duì)側(cè)延伸，但外側(cè)變寬并占據(jù)相對(duì)于尖帽(tip cap)的種子末端內(nèi)部的大部分。因此，觸及來自玉米種子變平一側(cè)的胚或胚乳是可能的，無需去除更多間插的(intervening)種子組織。特別是，可以通過基本上去除少量外種皮或粒殼而使胚或胚乳暴露出來。經(jīng)過初始化和校正，可以控制激光僅僅足以去除粒殼而獲得足夠的內(nèi)部入口 (internal access)，可以對(duì)某些所需要的內(nèi)部組織或結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。也可以控制激光僅僅足以去除粒殼而獲得足夠觸及內(nèi)部，而不顯著地影響種子的生存力或萌發(fā)潛力。憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)試，可以調(diào)節(jié)激光束的功率和速度以滿足這些目的。如圖8-14所示，所去除的面積通常是籽粒一側(cè)總面積的一部分。切除的典型深度將是通過粒殼后正好足以暴露但不破壞靶標(biāo)的內(nèi)部組織或結(jié)構(gòu)。經(jīng)過適當(dāng)?shù)陌惭b、校正和經(jīng)驗(yàn)測(cè)試，通過控制激光所產(chǎn)生的熱量，僅僅去除某些種子組織，及僅僅去除這么多的種子組織以獲取感興趣的底層組織或結(jié)構(gòu)，激光的操作對(duì)種子可以是非破壞性的。這樣的操作在通常不顯著地降低保留種子的生存力或其萌發(fā)潛力的意義上是非破壞性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，激光包括在控制切除的移動(dòng)、 面積和深度的高準(zhǔn)確度及切除效率方面的多種益處。然而，非破壞性的種子組織去除的其它方法是可能的。一個(gè)實(shí)例是噴水器或噴磨料器(abrasive jet)(例如，市場(chǎng)上購自 Berkeley Chemical Research, Inc. , Berkeley, CA 94706-026 ；Flow International Corporation, Kent, WA USA;和其它公司)。另一個(gè)是帶有合適大小的刀片(bit)和尖頭(tip)(例如鐫刻、切割、磨碎、雕刻、砂磨或挖刨刀尖(routing bit tip)，可得自種類繁多的商業(yè)位置或在線得自Robert Bosch Tool Corporation)的磨碎工具(例如Dremel牌MultiPro 旋轉(zhuǎn)工具)。去除來自種子的組織的可替代工具或方法的其它描述和說明參見美國申請(qǐng)序列號(hào)11/939,402，申請(qǐng)日為2007 年11月13日，該申請(qǐng)已轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)的所有人并通過引用全部結(jié)合到本文中。圖18中的系統(tǒng)在申請(qǐng)序列號(hào)11/939,402中也有更詳細(xì)的描述，它提供通過切去種子的一個(gè)單塊而去除來自種子的組織的一個(gè)具體實(shí)施例。在圖18的實(shí)施例中，切割工具是激光。4.種子特異性分析(步驟206)許多分析都可應(yīng)用于已去除組織后的種子或來自該種子的去除組織。一個(gè)實(shí)施例是遺傳分析。通過本領(lǐng)域已知的方法，例如，胚的暴露允許進(jìn)行測(cè)定來檢測(cè)核酸，通過該核酸可獲得有關(guān)該種子的遺傳信息。一種這樣的方法的一個(gè)實(shí)施例如下。在準(zhǔn)備任何數(shù)目的PCR分析時(shí)，可以把經(jīng)切除的種子浸入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物中。檢測(cè)器可以產(chǎn)生表示某些PCR方面的信號(hào)， 由該信號(hào)可以獲得基因型分型。這樣一種信號(hào)的細(xì)節(jié)及其應(yīng)用是眾所周知的。種類繁多的 PCR檢測(cè)器是市售的。一個(gè)實(shí)例是PCR光學(xué)檢測(cè)器(例如Chromed 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)器，得自 Bio-Rad Laboratories,Inc. ,Life Science Research Group,2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 USA)?？梢杂煤塑账嵝蛄衼矸蛛x來自其它生物、特別是其它植物、更特別是其它單子葉植物的相應(yīng)序列。按這種方式，可以用例如PCR、雜交等方法來基于其序列同源性鑒定這類序列或其片段。在PCR方法中，可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)，以由從任何感興趣的植物提取的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。用于設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，其中公開于 hnis 等(編著)，(1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York) ；Innis 禾口 Gelfand (編著)，(1995) PCR Strategies (Academic Press, new York)；禾口 Innis禾口 Gelfand (編著)，(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)，這些文獻(xiàn)通過引用全文結(jié)合至本文中。已知的PCR方法包括但不限于使用配對(duì)引物、嵌套引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。在雜交技術(shù)中，使用全部或部分的核苷酸序列作為與存在于所選生物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組或cDNA文庫)中的其它相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交的探針。雜交探針可以為基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可用諸如 32p的可檢測(cè)基團(tuán)或任何其它可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。制備雜交探針以及構(gòu)建基因組文庫的方法是本領(lǐng)域公知的。為了在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，這樣的探針包括獨(dú)特的且一般是長度至少約 10個(gè)核苷酸或長度至少約20個(gè)核苷酸的序列。這樣的探針可用于通過PCR擴(kuò)增選定植物的相應(yīng)序列。該技術(shù)可用于從需要的生物中分離出另外的編碼序列，或作為診斷測(cè)定來確定生物中編碼序列的存在情況。雜交技術(shù)包括平板DNA文庫(或者為噬菌斑或者為菌落) 的雜交篩選。這些序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”是指探針與其靶序列的雜交程度在檢測(cè)上高于與其它序列的雜交程度的條件(例如相對(duì)于
9背景至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境下將有差異。通過控制雜交嚴(yán)格性和/或洗滌條件，可鑒定出與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))。另一種分析可以是細(xì)胞水平分析。關(guān)于玉米的一個(gè)實(shí)施例描述于Gabriella Consonni等,“Genetic Analysis as a Tool to Investigate the Molecular Mechanisms Underlying Seed Development in Maize (在玉米種子的開發(fā)中，遺傳分析作為工具來研究分子機(jī)制)”，Annals of Botany 2005 96(3) 353-362，其通過引用結(jié)合到本文中。再一個(gè)實(shí)施例是納米級(jí)分析。參見例如Georg H. H.等，“Analysis of Detergent-Resistant Membranes in Arabidopsis. Evidence for Plasma Membrane Lipid” (在阿布屬中清潔劑抗性膜的分析質(zhì)膜脂質(zhì)的證據(jù))，Plant Physiol. 2005年1 月；137(1) :104-116，其通過引用結(jié)合到本文中。化學(xué)分析是另一個(gè)實(shí)施例。例如，可進(jìn)行多種試驗(yàn)來鑒定組織的化學(xué)性狀。當(dāng)然，其它的方法或分析也是可能的。組織去除步驟為這樣的分析提供樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可在種子上進(jìn)行的不同分析和試驗(yàn)。5.從候選種子中選擇(步驟211)—旦分析已經(jīng)完成，來自該分析的結(jié)果或信息可以用于例如將一種種子與另一種種子區(qū)別開，或者鑒定種子的性狀。這可用于相對(duì)于另一種選擇一種種子，或者因?yàn)槠湫誀钸x擇種子。一個(gè)實(shí)施例是通過基因型分型表明是比其它基因型更抗旱的種子。通過用激光對(duì)種子的有效的非破壞性切除(或種子組織的其它去除)，以及通過合適的基因型分型測(cè)定，可以鑒定出具有抗旱遺傳組成的種子。如圖1所圖解說明的，可以從大量不同候選種子中進(jìn)行選擇。鑒定并收集不同的候選種子1，2，....，n(步驟20幻。第一樣品種子1(步驟20 通過步驟204、205和206 進(jìn)行加工處理，并記錄來自步驟206的試驗(yàn)的結(jié)果或數(shù)據(jù)(步驟207)。一種或多種其它樣品種子(例如樣品2，3，....，n)進(jìn)行類似的加工處理(步驟204-206)，各自存儲(chǔ)的試驗(yàn)結(jié)果(207)與其鑒定信息(20 相關(guān)。這在兩種或更多種樣品(步驟210)之間提供一種比較基礎(chǔ)，隨后在兩種或更多種(步驟211)認(rèn)為是所需要的種子之間進(jìn)行選擇(例如用于進(jìn)一步研究或商業(yè)生產(chǎn))。如圖1所示，樣品間的比較可以基于任何能夠用樣品的種子特異性試驗(yàn)進(jìn)行分析的多種因素。重要的是，非破壞性的組織去除和分析允計(jì)做出這樣的鑒定而不用將種子種植并等待去測(cè)試來自其生長植物的組織樣品或者在種子種植并生長成植物時(shí)必須使用土地或溫室空間、勞動(dòng)力和供應(yīng)。種子組織進(jìn)行測(cè)試或者獲取有關(guān)底層組織或結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試時(shí)的受控制、準(zhǔn)確、非破壞性去除，允計(jì)根據(jù)種子的組織進(jìn)行分析后做出選擇，而無需根據(jù)從種子生長出的植物進(jìn)行分析后做出選擇。如可以理解的那樣，這代表了種子公司的選擇過程中對(duì)時(shí)間、勞動(dòng)力和資源(包括土地資源)的潛在巨大節(jié)約。受控制、準(zhǔn)確、非破壞性組織去除能夠基本上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，因此提高了植物選擇過程的處理量(through put)和效率。就玉米種子而論，至少外(粒殼)組織的去除很困難。對(duì)于大規(guī)模的種子，這沒有考慮到如此做可實(shí)際或可行的有效和/或非破壞性。玉米種子的粒殼78 (圖5A和圖5B) 是相對(duì)堅(jiān)硬的種子組織(有點(diǎn)像指甲)，難以與底層種子組織結(jié)構(gòu)分開。任何去除粒殼部分以暴露籽粒里面的組織或結(jié)構(gòu)都是既費(fèi)力又困難的。這是本領(lǐng)域眾所周知的。已嘗試過多種方法來去除粒殼。一些方法包括化學(xué)浴(浸漬)或機(jī)械方法(例如磨碎)。這些都需要工人很小心并且耗時(shí)。它們也往往會(huì)對(duì)種子造成破壞。暴露玉米種子的內(nèi)部組織的一個(gè)重要原因是為了獲取雄性和雌性遺傳材料來測(cè)定和評(píng)價(jià)遺傳內(nèi)容物。這使得研究人員有能力知道種子是否含有目標(biāo)基因。如果含有，則種子可以被鑒定為候選種子用于進(jìn)一步研究或用于生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量的種子。方法200中，可用受控制的力量以非破壞性的方式去除特定的種子組織。這又允許可以進(jìn)行試驗(yàn)和分析、 選種，然后將選出的種子種植，使其萌發(fā)，供進(jìn)一步使用。一種進(jìn)一步使用是從選出的種子開發(fā)商業(yè)數(shù)量的種子；例如種子公司的商品種子產(chǎn)品。但是另外或或者，種子組織的去除提供了種子樣品用于試驗(yàn)。本方法不僅可用于去除粒殼部分，而且可用于去除特定類型和數(shù)量的內(nèi)部組織(例如胚乳或胚)。舉例來說， 激光的受控制操作可以切除粒殼區(qū)域以及正好位于粒殼之下的胚部分。來自切除的碎片 (即被去除的組織)可以收集起來并進(jìn)行試驗(yàn)。該碎片基本上是候選種子樣品。因此，對(duì)碎片的試驗(yàn)就是對(duì)種子的試驗(yàn)。如果適當(dāng)?shù)乜刂?，那么組織可以通過激光切除以保留種子的非破壞性方式去除，致使保留種子仍保留萌發(fā)潛力。然而，這并不是所需要的。通過取出候選種子的少量樣品，可以馬上對(duì)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，使得可以對(duì)種子及其性狀做出快速?zèng)Q策。因?yàn)槿雍驮囼?yàn)可以在單粒種子上進(jìn)行(這對(duì)植物或植物的其它種子是非破壞性的)，所以， 對(duì)于許多候選種子，本方法可以不僅快速而且提供相對(duì)高通量。處理種子以去除種子的某些相對(duì)精確量的組織的方法還有其它有益的應(yīng)用。存在需要去除種子某些部分的各種情形。上述方法采用多個(gè)步驟非破壞性地取出所需種子組織。種子組織或暴露的種子組織的其它應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的。D.具體的實(shí)施例1 (圖2-14)圖2-14舉例說明圖1方法的一個(gè)具體的途徑(approach)。去除種子組織的切除工具或方法是激光。在這個(gè)具體的實(shí)施例中，用特定的種子保持器(seed holder)來使候選種子相對(duì)于激光定位。圖2給出實(shí)施圖1方法200的系統(tǒng)和裝置300的示意框圖說明。準(zhǔn)備并提供多個(gè)種子樣品301A-N用于種子處理系統(tǒng)302的加工和分析。種子處理系統(tǒng)302把樣品301傳遞給種子保持器305，種子保持器305限定試驗(yàn)位置320。組織去除工具302可由定位器304 控制以對(duì)試驗(yàn)位置320中的種子進(jìn)行操作，具體地講是從種子的規(guī)定區(qū)域去除規(guī)定量的種子組織。一旦組織被去除，就在種子上進(jìn)行種子特異性試驗(yàn)306。正如所顯示的，在該實(shí)施例中，試驗(yàn)是在試驗(yàn)位置上進(jìn)行的，試驗(yàn)位置與組織去除步驟的位置相同。這可以節(jié)約時(shí)間并提高流通的效率。收集試驗(yàn)結(jié)果307并可以記錄在例如計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器308。參考號(hào)310-315顯示這些樣品的通用流動(dòng)途徑和來自這些樣品的試驗(yàn)結(jié)果。這些運(yùn)行中的許多都可以基本上自動(dòng)化。這使得多樣品種子可以使用最少的人工步驟處理，因而可以提高精確度和效率。圖3舉例說明激光切除系統(tǒng)10，激光切除系統(tǒng)10可用作組織去除工具來實(shí)施圖1 和圖2的示例性方法200和示例性系統(tǒng)300。1.組織去除工具在圖3所顯示的系統(tǒng)10中，激光器16是組織去除工具。一個(gè)實(shí)例是Firestar f201系列，型號(hào)FSF201SB，水冷密封二氧化碳(CO2)，200瓦激光器，市場(chǎng)上購自Synrad， Inc. of Mukiteo, Washington (USA)。激光器16具有典型的特征和可調(diào)節(jié)性(例如功率或強(qiáng)度)。CO2型激光器已被證明效率高以及價(jià)格合理，高功率。它在紅外波長下工作。它廣泛應(yīng)用于切割和焊接，但也常常用于外科手術(shù)，因?yàn)槎鄶?shù)生物組織中的水都會(huì)吸收可見光的CO2激光器頻率?？梢允褂闷渌愋偷臍怏w激光器，也可以使用其它類型的激光器(例如化學(xué)激光器、金屬蒸氣激光器、固態(tài)激光器(例如YAG)和半導(dǎo)體)。激光器16通常可包括光學(xué)包裝，例如束傳遞組件(參見圖8中的參考數(shù)字130)， 以聚焦和控制激光束。也可以使用常規(guī)輔助設(shè)備，例如電源、控制電路，等等。這樣的光學(xué)設(shè)備和輔助設(shè)備通常可得自激光器銷售商或制造商，如它們來自Synrad。至于以上鑒定的 FSF201SB激光器，使用束傳遞系統(tǒng)，束傳遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)移來自密封激光器的原激光束并使其聚焦在切割種子的位置(例如試驗(yàn)位置)。光學(xué)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是Haas激光器技術(shù)公司的產(chǎn)品1.25”系列束傳遞系統(tǒng)，帶有5”聚焦透鏡?？梢允褂萌魏谓?jīng)典類型的激光切割系統(tǒng)，包括飛行光學(xué)系統(tǒng)、混合系統(tǒng)和樞軸-束(pivot-beam)系統(tǒng)，以精確地控制激光束相對(duì)于其靶標(biāo)應(yīng)用的移動(dòng)。憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)試和校正，激光器16可以設(shè)定為切除種子一側(cè)的圖案或區(qū)域至相對(duì)可控深度。根據(jù)制造商的安裝說明書，激光器16可以構(gòu)造成產(chǎn)生根據(jù)玉米籽粒表面的所需切除設(shè)計(jì)的某一寬度、功率、調(diào)制(modulation)和顏色的激光束132，以去除粒殼區(qū)域并觸及粒殼下面的組織，并且這樣做是非破壞性的。應(yīng)當(dāng)理解，激光器可以如此精確地和精密地控制，如有需要，有可能在種子籽粒表面上蝕刻標(biāo)記、字母或數(shù)字，如果理想的話。一種用途是直接在種子上作標(biāo)記以辨別種子樣
P
ΡΠ O為了適當(dāng)?shù)乜刂朴衩追N子組織去除的位置、大小和深度，組織去除工具理想的是應(yīng)當(dāng)具有預(yù)定空間分辨率。切除可以視種子的不同而不同。它可以橫穿板18從種子到種子變化。它可以按去除的組織量(例如面積和體積)、去除的組織位置或哪種組織被去除 (例如粒殼、胚乳和/或胚)而變化。如果將對(duì)象暴露給細(xì)胞進(jìn)行遺傳試驗(yàn)，則激光切除可以剖開種子的特定組織、部分或結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。在一個(gè)實(shí)施例中，然后可以將經(jīng)切除的種子置于溶液(或加入到孔40的溶液，在其中進(jìn)行種子切除)中以提取DNA，然后對(duì)其進(jìn)行分析。 所述溶液和DNA提取方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。應(yīng)當(dāng)理解，用其它形式的能量或力量來去除來自種子的組織或結(jié)構(gòu)也是可能的。 一些例子先前已有提及。在激光切除的這個(gè)實(shí)施例中，激光能量作為切除模式的設(shè)定和應(yīng)用類似于醫(yī)學(xué)、 通常是外科手術(shù)或生物學(xué)應(yīng)用中的激光切除。其中種子同人體軟組織類似，因?yàn)樗巧锊⒑写罅康乃?。該過程受到材料的性質(zhì)及其吸收能量的能力的巨大影響。因此，切除激光器的波長應(yīng)當(dāng)具有最小吸收深度(absorption depth) 0盡管這些激光器平均可以有低的功率，但是它們可以提供按下列公式得出的峰強(qiáng)度和積分通量(fluence)強(qiáng)度(W/cm2)=平均功率(W)/焦點(diǎn)面積(cm2)峰強(qiáng)度(W/cm2)=峰功率(W)/焦點(diǎn)面積(cm2)積分通量(J/cm2)=激光脈沖能量(J)/焦點(diǎn)面積(cm2)而峰功率是
峰功率(W)=脈沖能量(J)/脈沖持續(xù)時(shí)間(S)。種子的激光切除類似于激光軟組織手術(shù)。高聚焦激光束與軟組織的相互作用使含水量高的軟組織基本上汽化。這樣一種激光可產(chǎn)生非常小的切口。CO2激光波長(例如 10, 600nm)被含水生物組織高度吸收。它也往往比固態(tài)Er YAG激光器的成本低，其特征也在于被水高度吸收的波長。進(jìn)行種子的切除類似于角膜的表面切除，其應(yīng)用于若干類型的眼科折射手術(shù)(例如LASIK和LASEK)。通過用聚焦激光束照射固體而從該固體中去除物質(zhì)。在低激光通量時(shí)，物質(zhì)被所吸收的激光能量加熱并蒸發(fā)或升華。在高激光通量時(shí)，物質(zhì)通常轉(zhuǎn)變成等離子體。通常，激光切除是指用脈沖激光去除物質(zhì)，但有可能用連續(xù)波激光束切除物質(zhì)，如果激光強(qiáng)度足夠高的話。經(jīng)過其激光能量被吸收的深度并因此被單激光脈沖去除的物質(zhì)量，取決于物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)和激光波長。激光脈沖可以在非常寬范圍的持續(xù)時(shí)間(毫秒至飛秒)和通量內(nèi)變化，并且可以準(zhǔn)確地進(jìn)行控制。激光器配置(setup)的類型可包括但不限于移動(dòng)材料、混合系統(tǒng)和飛行選項(xiàng) (options)系統(tǒng)。移動(dòng)材料具有固定切割頭并移動(dòng)其下方的物質(zhì)。它需要極少的光學(xué)裝置， 但需要移動(dòng)工作物或?qū)ξ镔|(zhì)進(jìn)行切除。混合激光器提供以一個(gè)軸移動(dòng)的桌子并沿較短的軸移動(dòng)其頭。飛行光學(xué)裝置的特征是在工作物上方以兩個(gè)水平維數(shù)移動(dòng)的固定桌和切割頭 (帶激光束)。束移動(dòng)的另一個(gè)實(shí)施例是通過旋轉(zhuǎn)或振動(dòng)鏡。鏡以可追蹤表面上所需圖案的方式移動(dòng)。激光接觸表面的接觸點(diǎn)應(yīng)當(dāng)在激光的光學(xué)系統(tǒng)的焦平面上并通常與其焦點(diǎn)同步。 這個(gè)點(diǎn)通常很小(例如小于毫米的分?jǐn)?shù)，取決于波長)。只有當(dāng)激光束經(jīng)過表面的上方，該焦點(diǎn)里面的面積才顯著地受到影響。由激光傳遞的能量使焦點(diǎn)下方的物質(zhì)表面發(fā)生變化。 它可以使表面加熱并隨后使物質(zhì)汽化，或許可以使物質(zhì)斷裂(稱為“玻璃(glass)”或“玻璃化(glass up)”)和使表面剝落。這就是物質(zhì)怎樣被去除。通過對(duì)控制器進(jìn)行編程，可以在諸如種子的物體上蝕刻出不同的圖案，以使激光束隨時(shí)間穿越特殊的圖案。小心地調(diào)整激光束的軌跡以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的一致去除深度。要避免十字交叉路徑。也要考慮激光束移動(dòng)的速度。改變激光束的強(qiáng)度和分布允許更多柔性。例如，通過改變激光的時(shí)間比例(稱為“任務(wù)周期”)，在每個(gè)脈沖期間開啟，傳遞到表面的功率可以根據(jù)物質(zhì)適當(dāng)?shù)乜刂?。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到的，下面是在控制激光器操作中的因素(a)電動(dòng)機(jī)相對(duì)于種子移動(dòng)激光束的速度；(b)激光器的瓦數(shù)(通常為確定量，例如75瓦)，(c)激光器的頻率(控制當(dāng)激光擊中種子產(chǎn)生的熱量)。另外，其它操作也可以影響激光器取樣。可以使用壓縮空氣(例如30psi)去除來自激光沖擊的區(qū)域的碎片。真空是備用的?？梢酝ㄟ^鼓風(fēng)機(jī)或真空泵的通風(fēng)作用來去除由該過程引起的煙霧，以及去除種子表面的碎片，使得激光器基本上能夠持續(xù)不斷地鐫刻物質(zhì)。2.種子保持器每粒種子都可保持在通過組織去除工具進(jìn)行組織去除的位置。一個(gè)實(shí)施例是容器，包括由在底和開放頂部之間的側(cè)壁所限定的孔或空腔。圖3和圖4A-D顯示具有許多(96 個(gè))孔40按加標(biāo)行矩陣和加標(biāo)列矩陣(8行A-H和12列1-12)排列的多孔容器或多孔板
18。各孔位置可以按行/列加標(biāo)記(例如A/l，A/2，......H11，H12)。以這種方式，可以記
錄相對(duì)于具體孔有關(guān)孔內(nèi)種子的鑒定信息，其中放入種子以保持板18中各種子和其身份之間的關(guān)系。如圖4A所示，在該實(shí)施例中，孔40在板18頂部42相等地間隔開。96孔40 與常規(guī)數(shù)目的植物育種測(cè)定或許多實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中所使用的種子或樣品相對(duì)應(yīng)。板18可以是種類繁多的材料和構(gòu)型中的任一種。其主要功能是使各種子相對(duì)于組織去除工具保持在固定位置并且與其它種子隔開，這樣在種子之間沒有混雜。板18的一個(gè)實(shí)施例具有以下特征。它是其中有圓柱形狀機(jī)器加工孔40的固體金屬。金屬的實(shí)例包括但不限于鋁、鋼或黃銅、或它們的合金。其它的是可能的?；蛘?，可以使用塑料。塑料的實(shí)例是丙烯酸塑料。其它材料是可能的。實(shí)例有橡膠或金屬箔。材料應(yīng)當(dāng)與組織去除工具及其力量相匹配。鋁的實(shí)例將是6061級(jí)粗鋁。各孔的側(cè)壁和底可構(gòu)造成吸收激光、減少反射和/或引起激光的擴(kuò)散性反射，如果使用激光束組織去除工具的話。對(duì)于金屬或金屬的合金，這些表面可以進(jìn)行粉末涂層、陽極化、噴砂、上漆或另外構(gòu)造或配制成減少反射或基本上光擴(kuò)散。在板18的實(shí)施例中，將其設(shè)計(jì)成每孔裝一粒種子。各個(gè)孔都具有特殊的設(shè)計(jì)元素，它有助于將種子放在孔的中心(例如下文所討論的錐形底)?？滓灿檬辜す夥瓷錅p至最小或?yàn)楣鈹U(kuò)散的物質(zhì)進(jìn)行粉末涂層。一個(gè)實(shí)例是Alesta 牌粉末涂料，得自DuPont of Wilmington,DE USA。噴砂和陽極化是改變表面、尤其是鋁的其它方法，以使其更少鏡狀、更多擴(kuò)散。其它的方法是可能的。對(duì)于塑料，材料本身就可吸收光或使光擴(kuò)散，或者反射阻減性構(gòu)造 (reflection-deterring texturing)可以進(jìn)行機(jī)器加工或模制成塑料。另一種減少反射的方法是改變限定孔的底和/或側(cè)壁的幾何形狀。使這些部分的表面成角，可有助于阻減離開孔開放頂部的不想要的激光束反射。通過對(duì)每粒單獨(dú)的種子使用單獨(dú)的孔，每粒種子與其它種子的單一化和分離是自動(dòng)實(shí)現(xiàn)的。每個(gè)孔40都是具有錐形埋頭的底58的圓柱形碗狀物?？梢杂枚喾N方法完成對(duì)種子的定位和定向。關(guān)于板18，每個(gè)孔40做得比籽粒60 的最長尺寸寬一些，但具有錐形埋頭底面58 (floor 58)。這有助于把玉米種子60放在孔40 的中心。典型玉米種子的形狀和內(nèi)部內(nèi)容物見圖5A和圖5B所示。注意胚74怎樣位于種子尖帽末端(tip cap end)66附近，和一個(gè)平扁側(cè)面(flattened side face)62附近。胚乳76占據(jù)尖帽62對(duì)面的大部分側(cè)面和末端。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，孔40的底面或底58的錐形埋頭幫助把玉米種子(或任何種子或顆粒)自動(dòng)地放在孔40的中心。另外，按合適的直徑，孔 40和錐形埋頭傾向于一般平行于跨過孔40底的平面，定位具有其平扁面的玉米種子。這使得玉米種子最大的表面面積側(cè)之一暴露在孔40的頂部。對(duì)于每個(gè)孔，激光可以根據(jù)任何深度設(shè)定(參見圖8中的平面D)。經(jīng)過初始化和經(jīng)驗(yàn)測(cè)試，可以建立一組種子樣品顆粒的平均深度。這避免了針對(duì)每粒種子都必須調(diào)整切割深度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)大多數(shù)玉米種子工作良好。然而，切割的深度以及切除的面積可以根據(jù)每個(gè)種子樣品進(jìn)行差異控制，或者如果需要的話，它們可以根據(jù)不同類型的種子或不同品種的種子進(jìn)行調(diào)整，因?yàn)槠骄N子大小可
14以變化。如可以理解的那樣，激光可以跨越種子相同的位置進(jìn)行多次掃描以增量式去除組織直到某一最終的深度?；蛘?，用一次掃描切割到最終的深度。經(jīng)驗(yàn)測(cè)試可以建立理想的過程。圖6A舉例說明種子保持器的替代實(shí)施例。泡罩包裝(blister pack)類型元件 100具有底板或基底，其上有多個(gè)孔穴，塑料泡形狀透明塑料容器102從孔穴延伸。更多細(xì)節(jié)可以參見美國專利申請(qǐng)序列號(hào)60/975，389，申請(qǐng)日為2007年9月沈日，該申請(qǐng)已轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)的所有人并通過引用全部結(jié)合到本文中。容器或泡102類似于板18的孔40。每個(gè)泡將接受種子、使種子單一化和使一粒種子與另一粒種子隔離開。釋放板(release sheet) 可以可移動(dòng)地粘在或連在基底100中孔穴的頂部上方以密封泡102的內(nèi)容物，如果需要的話。圖6A顯示泡罩包裝100，其被構(gòu)造成相對(duì)于板18的孔40的數(shù)目和間隔，具有相同的數(shù)目和間隔的泡102。泡罩包裝100可用于存放候選種子樣品(以加上標(biāo)簽的方式)(8行 xl2列)，并且在泡102上方有釋放板。通過去除來自泡罩包裝100的釋放板，這96個(gè)樣品可以容易地轉(zhuǎn)移到板18的96個(gè)孔中，將具有空孔的板18倒放在泡罩包裝100上，并且孔 40和泡102對(duì)齊，然后將泡罩包裝100和板18都顛倒過來使種子從泡罩包裝100轉(zhuǎn)移到板 18。但是，泡罩包裝100的另一種用途是可用作板18的替代物。泡罩包裝100可以放置成孔穴朝上并且它們上面無需任何釋放板?？梢詫⒏鞣N子籽粒放入各自的泡內(nèi)。然后，可以對(duì)組織去除工具按照關(guān)于板18的說明進(jìn)行操作，以移動(dòng)到第一個(gè)泡102內(nèi)的種子上并對(duì)該種子進(jìn)行操作，然后移動(dòng)到下一粒種子和泡，等等。其它種子保持器是可能的。例如，具有適合于接受器或托架(cradle)的頭的支承架(pedestal)或針(pin)可用于保持單粒種子，與其它種子隔離開，其方式是可遞給組織去除工具，并由組織去除工具對(duì)其進(jìn)行操作。支架(rack)或壓機(jī)(press)和密封容器中的管子是可隔離種子并使各種子保持在某一位置用于組織去除的裝置的其它實(shí)施例。圖18舉例說明替代種子保持器的一個(gè)實(shí)施例。在系統(tǒng)150中，輪子IM與種子填充器裝置152同步轉(zhuǎn)動(dòng)。輪子巧4裝有多個(gè)磁鐵156A-F，磁鐵156A-F圍繞其周長相等的間隔開。每粒種子60先前已經(jīng)上漆或浸入磁性或基于鐵的油漆158。同步和一般同時(shí)地， 種子60B自種子填充器152落下。在落下種子60C之前，通過基于鐵的油漆158的磁性吸引力吸引到磁鐵156C而與磁鐵156C相結(jié)合，朝向激光器16的激光束132旋轉(zhuǎn)。種子60D 處在試驗(yàn)位置并具有被激光束132去除的組織。經(jīng)過加工的種子60E朝向刮刀162移動(dòng)。 種子60F用刮刀162從其磁鐵156F進(jìn)行敲打。因此，系統(tǒng)150同樣使種子單一化和使一粒種子與另一粒種子隔離開，并使用組織去除工具。此外，即使無需容器(例如孔或泡)，各種子也相當(dāng)均一地定位。事實(shí)上，通過把磁性油漆158(例如磁性引發(fā)劑油漆，市場(chǎng)上可購自 11 Hawthorn Parkway, Vernon Hills, IL 60061 USA 的 Rust-oleum，或磁性墻壁油漆，得自 Kling Magnetics,PO Box 348 343 Rt. 295-Chatham,NY 12037USA)放在各種子 60 上的同一位置(這里是在其冠上)，系統(tǒng)150—般使各粒種子均一定位。它可以使各粒種子60更均一地和自動(dòng)化地以相同的一般取向定向至激光束132。關(guān)于系統(tǒng)如系統(tǒng)150的更多細(xì)節(jié)可以參見美國申請(qǐng)序列號(hào)11/939，402，申請(qǐng)日為2007年11月13日，該申請(qǐng)已轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)的所有人并通過引用結(jié)合到本文中。該通過引用結(jié)合至本文的申請(qǐng)公開了適用于種子外部的一部分的金屬或鐵磁材料的應(yīng)用。然后，種子可以被自動(dòng)地吸引到(永磁或電磁的) 磁場(chǎng)。根據(jù)種子上磁性油漆的位置，種子可以按預(yù)定取向自動(dòng)地定位。這將允許使用組合來相對(duì)于組織去除工具定位和保持種子。系統(tǒng)150也可以使用自動(dòng)化種子填充器或運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)按有序方式移動(dòng)種子填充器斜槽110B，以便種子60在激光加工處理之后，置于盤或泡罩包裝100B的各個(gè)孔或泡內(nèi)(參見種子60A-F將怎樣以行和列形式連續(xù)沉積終止的說明)。或者，自動(dòng)化電動(dòng)定位器或運(yùn)動(dòng)控制器可以相對(duì)于斜槽IlOB以這種有序的方式移動(dòng)盤100B?？蛇M(jìn)行程序化和自動(dòng)化的種子填充器或其它類似種子或顆粒處理組件可得自多個(gè)銷售商，包括Elmor 產(chǎn)品得自 Elmor Angewandt Elektronik of Mangelegg 58 CH-6430 Schwyz, Switzerland.這樣的機(jī)器可以按時(shí)落下一粒種子，或者連續(xù)填裝多孔容器，像多孔板18或多泡泡罩或泡包裝。其它類型的小顆粒處理器或傳送器(conveyor)均可用來移動(dòng)、單一化、轉(zhuǎn)移個(gè)體種子或用別的方法處理個(gè)體種子。這類機(jī)器的另一個(gè)來源是填充器 (filler)和包裝機(jī)，包括用于種子的填充器和包裝機(jī)，得自Visser International Trade & Engineering B. V. , P.0. box5103, 3295 ZG' s-Gravendeel, The Netherlands。雖然圖18中的系統(tǒng)150說明使用激光器通過合適配置和控制切去每粒種子的種皮(clip)或部分，系統(tǒng)150可用于正好切除或去除少量的表面組織，如關(guān)于系統(tǒng)110所描述的。這將很可能需要當(dāng)種子60處于激光束路徑時(shí)，輪子IM至少在一瞬間停止，激光束 132光柵掃描跨過種子60的一側(cè)。3.自動(dòng)化處理可以用市售的設(shè)備使系統(tǒng)10的多個(gè)功能自動(dòng)化或半自動(dòng)化。實(shí)施例如下。如圖3所示，板或其它種子保持器18可以定位在激光器16移動(dòng)場(chǎng)內(nèi)的基底12。 在這個(gè)實(shí)施例中，板18具有96個(gè)間隔放置的孔40，其大小為每個(gè)孔接受一個(gè)玉米籽粒60。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以用系統(tǒng)10以自動(dòng)化方式對(duì)大量種子(這里為96個(gè))相對(duì)快速地進(jìn)行加工處理。然而，由于種子的切除是用激光能量，因此怎樣把每粒種子遞給激光束并不是無足輕重的事。同樣，使用可用于組織去除的其它力量存在復(fù)雜性(例如噴水，磨碎)?；?2(平臺(tái)，桌子等)支撐框架14，框架14又支撐自動(dòng)化組織去除工具。在圖 3中，工具是激光器16，激光器16通過XYZ定位系統(tǒng)20或其它電動(dòng)定位裝置或系統(tǒng)可編程地移動(dòng)?？梢允褂梅N類繁多的市售電動(dòng)定位器中的任一種。圖3圖解說明可移動(dòng)軌道22 可以沿著框架14的頂部通過計(jì)算機(jī)控制的電動(dòng)機(jī)M移動(dòng)。套件(carriageUe可以跨過軌道22通過計(jì)算機(jī)控制的電動(dòng)機(jī)28移動(dòng)。激光器16可以相對(duì)于套件30上板18的上表面上下移動(dòng)，這是通過電動(dòng)機(jī)32由計(jì)算機(jī)控制的。套件30在與套件沈相連的臂上移動(dòng)。 如圖3所示，這允許激光器16相對(duì)于板18的多個(gè)自由度移動(dòng)。組織去除工具的三維移動(dòng)相對(duì)于種子保持器發(fā)生的方式可以變化。有可能種子保持器可以相對(duì)于激光器移動(dòng)，或者它們兩者彼此相對(duì)移動(dòng)。控制器36，例如是市售的，可以與計(jì)算機(jī)38連通。計(jì)算機(jī)38包括軟件，該軟件允許用戶對(duì)XYZ定位器20的移動(dòng)編程，并因此使激光器16相對(duì)于板18中各孔40移動(dòng)?？刂破?6可通過分線盒34中的某種電源執(zhí)行該程序，分線盒34將控制電動(dòng)機(jī)MJ8和32 以非常精確地定位激光器16及其激光束32，并且使激光束跨種子移動(dòng)。按這一方式，可以完成96孔盤18的每個(gè)孔40中的單粒種子的自動(dòng)化激光切除，無需手工勞動(dòng)或控制。具有可編程控制的定位系統(tǒng)的實(shí)例可得自Synrad并由諸如以下的公司制造Techno Inc. of New Hyde Park,New York USA ；Anorad Corp. of Shirley, New York USA ； 禾口 Aerotech, Inc.of Pittsburgh, PA USA。其它自動(dòng)化的實(shí)施例將包括種子填充器，如先前所討論的。它可用于移動(dòng)單粒種子并將其落在種子保持器的規(guī)定孔、泡或指定位置。此外，在組織已被去除之后，設(shè)備可用于把種子從孔、泡或其它位置移動(dòng)到指定位置。一個(gè)實(shí)施例將是磁性帶或其它磁性涂層或附件用到每粒種子60上，如上面關(guān)于圖18 中所描述的，允許每粒種子在多個(gè)位置之間自動(dòng)移動(dòng)。電磁或其它磁化物體可用于從一批種子60中挑選出個(gè)體種子60，將這些個(gè)體化種子移動(dòng)到各自孔40上方的位置，然后讓它們?cè)诳?0內(nèi)沉積下來。通過反過來的過程，在切除之后，該系統(tǒng)可以把種子從每個(gè)孔中抓出來并將它們移到另一個(gè)站點(diǎn)。又一個(gè)替代物將是真空系統(tǒng)，例如可以用普通技術(shù)人員的技能開發(fā)，并且可用于將種子從一批中吸出來，將它們單一化，讓它們?cè)诳?0內(nèi)沉積下來，然后按適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取出它們。此外，對(duì)于另外的功能，還可以使用種子保持器例如板18或泡罩包裝100，或具有孔或空腔的其它種子保持器，單一化、隔離和保持種子，通過組織去除工具進(jìn)行操作?？?0、 泡102等也可像測(cè)定容器一樣起作用。一個(gè)實(shí)施例是在組織去除之后，可直接將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的液體混合物加入到孔40或泡102中。反應(yīng)可以發(fā)生，并對(duì)諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種數(shù)據(jù)中的任一個(gè)進(jìn)行分析。這避免了必須移動(dòng)并保持對(duì)復(fù)粒種子鑒定的示蹤。這樣的原位種子特異性分析可有效地進(jìn)行并具有多樣品的相對(duì)高通量。可以記錄與每粒種子身份有關(guān)的分析結(jié)果(例如記錄在數(shù)據(jù)庫或別的地方)。然后，可以以多種方式使用這些結(jié)果。自動(dòng)化液體處理設(shè)備也可用于以受控制的預(yù)編程的方式移動(dòng)液體或液體混合物或懸浮液。一個(gè)實(shí)施例是上述液體PCR測(cè)定。例如，在組織去除之后，液體可用于種子的其它試驗(yàn)。這樣的液體處理設(shè)備是市售的并廣泛用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。實(shí)例有自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)，得自 PerkinElmer Life And Analytical Sciences, Inc. , 940 Winter Street, ffaltham, Massachusetts 02451 USA。如圖3所示，計(jì)算機(jī)38不僅可用于促進(jìn)對(duì)自動(dòng)化處理設(shè)備進(jìn)行編程，而且可以用于記錄和存儲(chǔ)關(guān)于組織去除和/或種子上進(jìn)行的任何種子特異性分析的信息。其它處理組件可包括用于保持樣品或樣品集身份的示蹤的子系統(tǒng)。條形碼或其它機(jī)器可讀的標(biāo)記或標(biāo)簽(例如RF標(biāo)簽)可以固定在任何包括種子的容器、載體、盤或板上。 這將允許可以保留樣品與原始鑒定信息的關(guān)系。4.操作為了圖3中系統(tǒng)10的有效、高通量操作，使個(gè)體籽粒60沉積在板18各自的孔40 內(nèi)。圖6A舉例說明這樣做的一種可能方式。泡罩包裝100，具有96個(gè)透明塑料泡102，可以裝有已知來源或身份的種子。剝落的膠粘劑覆蓋層(未顯示)可在泡102的每一個(gè)中都含有種子，甚至當(dāng)泡罩包裝100被顛倒時(shí)。泡罩包裝100可以引起去除切除板18、剝落的覆蓋層，并將板18倒置，以便孔40的每一個(gè)都與泡102對(duì)準(zhǔn)排列。泡包裝100和板18的組合可以交叉翻轉(zhuǎn)，來自泡包裝100的96粒種子中的每一個(gè)都將落入相應(yīng)的孔40和板18。 然后，可以把板18放在基底12上的參考位置。在切除之后，可用反過來的程序?qū)⒎N子放回泡包裝100的泡102用于移到下一步驟，如果需要的話。
圖6B顯示一個(gè)替代的系統(tǒng)。種子管110可以與種子單一化裝置(singulator) 112 連通。此組合可以把單粒種子向下遞送到管110，管110可與孔40對(duì)準(zhǔn)。管110可移動(dòng)到下一個(gè)孔40和下一個(gè)單粒種子被遞送，依此類推。盤或種子填充器都是市售的。較早時(shí)已經(jīng)給出實(shí)例。有其它方式把種子放入孔40內(nèi)。一種就是人工把種子放入每個(gè)孔40內(nèi)。這可能是優(yōu)選的，因?yàn)槭褂谜呖梢源_保種子位于孔40的中心并且玉米籽粒既平又寬的一側(cè)相對(duì)于孔40中開放頂部基本上面都朝上。如先前提及的，板18可有意制造成對(duì)于每個(gè)孔40都具有錐形底58以有助于把籽粒60放入孔40的中心，因?yàn)檫@樣一種孔的幾何形狀促進(jìn)玉米種子以寬的扁平一側(cè)面都朝上的方式平放。一旦單粒種子60位于各孔40內(nèi)，并且板18位于其系統(tǒng)10的基底12上的參考位置，控制器36就用激光器16開始切除過程以去除來自種子的特定組織。如圖7所舉例說明的，在PC 38上，控制器36可包括軟件，該軟件允許用戶可以根據(jù)每個(gè)孔40設(shè)計(jì)特定的切除圖案。PC 38上的計(jì)算機(jī)顯示器IM可以顯示每個(gè)孔40的中心。用戶可以指定或設(shè)計(jì)與孔40相關(guān)的特定切除圖案。如圖7所示，圖案在水平面上可以是矩形(參見參考數(shù)字12 。矩形圖案122的尺寸可以選擇并且甚至可以顯示在計(jì)算機(jī)屏幕IM上。用戶也可以選擇功率水平、顏色、調(diào)制和其它有關(guān)操作參數(shù)以控制矩形形狀在每粒種子中怎樣被切除、切割、蝕刻或以別的方式成形，以及深度。正如可以認(rèn)識(shí)到的那樣，各種各樣的圖案用激光器16都是可能的。圖8A和圖8B 及圖9A-C舉例說明可能形狀的一個(gè)實(shí)施例。在這個(gè)實(shí)施例中，激光器16用光學(xué)部件130構(gòu)造成產(chǎn)生激光束132，激光束132的切割寬度為0. 0005 (在1/4英寸焦長度)。形狀122的尺寸為0. 2平方英寸，如圖8B所舉例說明的，控制器36是程序化的，以便激光束132對(duì)籽粒60表面前后地掃描以切除或去除組織來做出該形狀。如圖8B所示，激光束將從形狀122的一側(cè)到另一側(cè)切割第一斜面92A 為0.0005。然后，它將沿略微不同的路徑往回走(參考號(hào)96B)。它將前后地掃描進(jìn)行地蝕刻或切除另外的材料，但保持矩形形狀122直到達(dá)到最后的深度。圖8B舉例說明線性路徑 92A到92H。事實(shí)上，在圖7的程序化形狀122中，大約有30-40次掃描來完成空腔80的切去。在這個(gè)實(shí)施例中，在玉米籽粒中正好足夠的組織被切除就露出其底層的有關(guān)組織或結(jié)構(gòu)。通過激光束以相對(duì)快速方式掃描，完成了種子組織的切除而無需過度加熱或其它條件，這些實(shí)際上會(huì)負(fù)面地影響發(fā)芽勢(shì)。自動(dòng)化系統(tǒng)10可以允許96個(gè)不同的種子按此方式依次切除而無需任何人工步驟。圖8A用示意圖說明且不是按比例繪制矩形棱柱形狀的空腔80。激光以該形狀切除來自種子60的材料以去除外部粒殼并暴露內(nèi)部組織。這可以是胚乳。它可以是胚。在任何情況下，該過程可以構(gòu)造成不會(huì)顯著地影響玉米種子60的發(fā)芽勢(shì)。圖9B和圖9C顯示對(duì)于該種子通過激光器16產(chǎn)生的空腔80的替代視圖。應(yīng)理解，激光器16產(chǎn)生空腔80的確切方式可以變化。激光束132可以用XYZ定位器前后地移動(dòng)，例如圖1所示的?；蛘撸梢杂泄鈱W(xué)方法去改變激光束132的角度或產(chǎn)生激光束的前后掃描切割作用。一旦板18參考Al位置上孔40內(nèi)的種子60 (參見圖4A)的激光切除已完成，激光器16就可通過控制器36移動(dòng)到板18位置A2上孔40上方參考的位置，并且針對(duì)該孔和種子，可以進(jìn)行激光切除過程以蝕刻形狀122。一旦完成，激光器16就移動(dòng)到位置A3，依此類推，直到行1完成為止。然后，可以開始下一行并繼續(xù)進(jìn)行直到所有96個(gè)位置都完成為止?？梢岳斫猓康耐ǔＪ侨コ銐虿牧弦院侠淼孬@取種子60的特定內(nèi)部組織。對(duì)于這些目的，被切除的面積位于種子60 —側(cè)的絕對(duì)中心或者它精確地到某一深度并不是必需的。通過經(jīng)驗(yàn)測(cè)試和調(diào)整，及每個(gè)孔40內(nèi)種子60的相對(duì)一致定位(即，同孔40中心的可能定位一致)，對(duì)激光進(jìn)行編程以切割放在孔40中心的中心的形狀122，通常導(dǎo)致切除足夠材料以獲取合理地暴露至所需要的內(nèi)部組織。這些形狀122的程序化在許多系統(tǒng)中并不復(fù)雜。商業(yè)系統(tǒng)通常允許對(duì)形狀作出選擇并顯示在打印文件(print file)，然后該文件被傳輸?shù)娇刂破?6。PC38或控制器36的合適模板或圖形用戶界面(⑶I)允許調(diào)整空腔40的形狀、面積和深度。圖10A-C到圖14A-C包括在內(nèi)正好給出切除的形狀和深度可以怎樣變化的幾個(gè)額外實(shí)施例。如圖10A-C所舉例說明的，種子60表面頂上附近的第一個(gè)較大的矩形棱柱空腔可被形成至第一深度。然后，較小面積的矩形棱柱形狀可以蝕刻到較低的深度。第三個(gè)，仍然是較小的矩形棱柱可以蝕刻到仍然較低的深度。這產(chǎn)生了樓梯步階型空腔80B。圖IlA-C 顯示在種子中可以蝕刻出兩個(gè)矩形通道，較小的一個(gè)與較大的一個(gè)空間上間隔并在較大一個(gè)的里面。圖12A-C說明胚上方矩形區(qū)域的去除。圖13A-C和圖14A-C顯示圖案可以不是矩形，例如更圓。當(dāng)然，更復(fù)雜的形狀是可能的。激光束的高度柔性可以制造空腔幾乎無限數(shù)量的形狀和深度。這些形狀也可以設(shè)計(jì)成非破壞性地去除組織以暴露感興趣的底層種子組織。因?yàn)榧す饪梢杂羞@樣的相對(duì)窄的束寬，該系統(tǒng)允許激光束相對(duì)于待切除顆?；蛭锲?item)非常精確和精密地定位。激光束的光柵掃描允許切割的最終深度的進(jìn)行性和準(zhǔn)確控制。任選地，激光束可以針對(duì)物品或種子的非常具體的部分。例如，激光切除可以針對(duì)玉米籽粒進(jìn)行程序化以去除正好位于一端的尖帽處或其附近的組織或者正好位于另一端附近的組織或它們之間某一部位的組織?；谑噶?vector-based)的激光束控制也是可能的。基于矢量(vector-based)的移動(dòng)遵循圖案的直線和曲線。一旦所有96粒種子都已切除，它們就準(zhǔn)備好做試驗(yàn)(如有需要)以獲得關(guān)于種子的信息。例如，各種遺傳試驗(yàn)方法或測(cè)定可以用于鑒定種子中存在的遺傳材料。根據(jù)對(duì)種子的這種直接測(cè)試，植物研究人員可因此做出該種子對(duì)于植物高級(jí)或育種實(shí)驗(yàn)中的繼續(xù)使用或?qū)τ谏虡I(yè)生產(chǎn)是否是理想的快速?zèng)Q定。種子組織特定部分的去除、或保留的種子部分的暴露部分的用途，都可用于特殊的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，其可包括直接DNA、RNA、脂質(zhì)或蛋白質(zhì)分離。因此，這個(gè)實(shí)施方案可用于植物育種過程，其中可以直接從種子相對(duì)快速地獲取對(duì)具有所需性狀或特征并隨后用于在田間或溫室萌發(fā)直到成熟的種子的鑒定情況。遺傳分析試驗(yàn)的實(shí)施例描述于美國專利 6，472，185和6，368，806，所述專利通過引用結(jié)合到本文中。正如本領(lǐng)域眾所周知的，通過各種技術(shù)，在此整個(gè)過程中可知道并保存各種子的身份及其歷史。例如，在泡罩包裝實(shí)施例中，圖6A，條形碼108或其它機(jī)器可讀的標(biāo)記可適用于泡罩包裝100，其鑒定出利用行和列指示字母/數(shù)字，以孔到孔為基礎(chǔ)，關(guān)于泡罩包裝內(nèi)的種子的原始和必需信息。通過把各種子保持在泡罩包裝中(在板18中)其相應(yīng)的列
19和行位置，再后退到泡罩包裝100或后退到某些其它96孔盤，可以保持各種子的身份。這將允許種子可以用已知的目標(biāo)基因鑒定及其身份通過記錄該陣列的96個(gè)位置的位置得以保持。E.具體的實(shí)施例2(圖15-17)代替去除組織以獲取候選種子的內(nèi)部，或在某些情況下除此之外，可以收集去除的組織(或其部分)并對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)或分析。此類試驗(yàn)或分析可以用來做出選擇決策。圖15以示意圖的形式顯示一個(gè)具體的實(shí)施例。圖15與圖1類似，但具有以下主要區(qū)別。圖15的方法400利用某些組織去除工具或方法402來去除來自候選種子401A的特定組織。種子401A可以在某種保持器組件中定位或位于位置405?？梢詫⑷コ慕M織 (或其部分)收集在收集容器403中。對(duì)所收集的去除組織進(jìn)行種子特異性分析(參考號(hào) 406)。所得結(jié)果用(步驟407)來做出決策(例如選擇或不選擇種子401A類型供進(jìn)一步使用)。任選地，試驗(yàn)結(jié)果和/或決策可以由計(jì)算機(jī)408存儲(chǔ)或運(yùn)用。可以理解，實(shí)施例1或2可以至少部分地自動(dòng)化。而且，任一個(gè)實(shí)施例本身可提供快速、局部樣品收集和分析。舉例來說，便攜式激光器裝置可以充當(dāng)實(shí)驗(yàn)生長試驗(yàn)田。可以把來自生長玉米植物的候選種子取出、放入單孔40并進(jìn)行激光切除?？梢詫⒑线m溶液加入到孔40內(nèi)的經(jīng)切除的種子上，將DNA抽提到該溶液中，取出溶液并進(jìn)行遺傳學(xué)評(píng)估或別的評(píng)估?；蛘?，通過激光切除去除的組織可以放入合適溶液或其它測(cè)定中，并用別的遺傳學(xué)方法進(jìn)行評(píng)估。這些評(píng)估可以用來做出關(guān)于取自候選種子的植物的生長地點(diǎn)決策。這避免了取樣后再返回到很遠(yuǎn)的實(shí)驗(yàn)室和交通費(fèi)開支并始終監(jiān)視哪株植物與哪粒種子相聯(lián)系。圖16和圖17說明從候選種子取出的組織可以怎樣收集起來用于分析的一個(gè)實(shí)施例。種子70被激光器16切除，例如在實(shí)施例1中論述的。可以使激光切除所產(chǎn)生的一縷微細(xì)顆?；蛐☆w粒(從它們時(shí)常漂浮在空氣中的意義上講它們像煙一樣起作用)與種子60 分離開。有時(shí)，它們重新調(diào)配(reformulate)和包被孔40的各個(gè)側(cè)面。這需要在每個(gè)切除過程之后清潔板18。真空罩(vacuum hood)或真空頭140(例如透明塑料)可以固定在光學(xué)裝置或激光器16上。可以在孔40內(nèi)種子60的切除期間，用孔40上方的激光器16使其降低。通過在操作性連通中利用真空罩140，通過真空管144到真空142，這些微細(xì)物可以基本上(如果不是全部的話)被去除以消除這一問題?；蛘撸ㄟ^真空或別的方法收集這些微細(xì)顆?？蓪?dǎo)致收集足夠的材料進(jìn)行試驗(yàn)， 而不是測(cè)試種子。這將需要感興趣的激光切除組織進(jìn)行試驗(yàn)。例如，如果正好需要粒殼進(jìn)行試驗(yàn)，則可以控制激光以正好切除粒殼。所去除的粒殼顆?？梢酝ㄟ^真空收集起來，然后對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)。另一方面，如果需要胚乳進(jìn)行試驗(yàn)，則激光可以切除粒殼，所去除的粒殼顆粒可以不理或去除，然后激光可以切除暴露出的胚乳，可將其通過例如真空收集到容器中。通過去除胚上方的粒殼，可以收集胚組織，然后激光切除暴露出的胚，通過真空收集胚顆粒。圖16以簡化形式說明從單粒候選種子的激光切除和真空收集。密封或密封襯墊 141密封罩140至圍繞保持種子70的孔40的表面?？梢詫?duì)激光器16進(jìn)行操作以引起激光束132切除種子70?？梢詫?duì)真空源142(例如真空泵)進(jìn)行操作以引起微細(xì)顆粒從孔40 移動(dòng)到容器146，但使種子70留在適當(dāng)?shù)奈恢谩？梢匀〕鋈萜?46并且所收集的顆粒來自經(jīng)過試驗(yàn)的種子70。
真空系統(tǒng)的實(shí)例包括各種各樣的市售顆粒過濾系統(tǒng)或可去除和/或收集微細(xì)顆?；蚴占臒熖幚頇C(jī)(fume handler) 0顆粒提取設(shè)備市場(chǎng)上可得自諸如以下的公司AER of Old Saybrook, CT USA禾口 Fumex of Kennesaw, VA USA。這種設(shè)備通常用于工業(yè)空氣過濾/空氣污染控制系統(tǒng)，以單獨(dú)或組合形式用于煙霧(mist)、粉塵(dust)、煙(smoke)、塵霧(fume)和氣體/蒸氣污染物。該系統(tǒng)可包括筒狀和袋狀粉塵/煙霧收集器、濕粉塵收集器、靜電除塵器、介質(zhì)過濾系統(tǒng)和其它組件。圖17說明具有多個(gè)孔40的盤可以與圖16的真空萃取激光切除系統(tǒng)一起使用。這本身就可提供從大量候選種子中有效地真空收集被去除的切除組織。真空收集的一個(gè)替代法將是在每個(gè)孔40中加入凝膠物質(zhì)。凝膠對(duì)激光束是透射的。由激光切除產(chǎn)生的微細(xì)顆粒往往可以通過凝膠收集和懸浮在凝膠中。激光可能必須調(diào)整(其可憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)試完成)到使用較深的切割功率，如果使用凝膠的話。對(duì)在凝膠中收集的微細(xì)顆?？蛇M(jìn)行萃取、收集和測(cè)定都是可能的。為了產(chǎn)生足量的微細(xì)顆粒用于某些試驗(yàn)， 激光器或其它組織去除工具可能必須去除更多的組織，相比如果正好去除足以暴露內(nèi)部組織而言。F.任選和備選方案將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可以采取許多形式和實(shí)施方案。本文詳細(xì)描述的實(shí)施方案僅通過實(shí)施例予以說明而不是限制性的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的各種變化都包括在本發(fā)明之內(nèi)。然而，下面提供了任選、備選和變通方案的另外幾個(gè)實(shí)施例。1.種子的類型以類似的方式，以上描述的系統(tǒng)和方法均適用于除玉米種子以外的種子?？赡苄枰{(diào)整，這都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。2.組織去除工具的類型正如先前所討論的，從候選種子去除其組織可以通過不同的方法或組件(統(tǒng)稱為 “工具”)來完成。激光器就是一種這樣的工具。它可以在一種模式中用來產(chǎn)生小顆粒。在另一種模式中可以用來將種子切成小塊(參見例如圖18和所示同樣構(gòu)造的相關(guān)描述并描述于美國申請(qǐng)序列號(hào)11/939，402，申請(qǐng)日為2007年11月13日，該申請(qǐng)已轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)的所有人并通過引用全部結(jié)合到本文中)。其它組織去除工具先前已有提及。申請(qǐng)序列號(hào)11/939，402包括了另外的細(xì)節(jié)和實(shí)施例。3.對(duì)種子分析的類型可以在種子上進(jìn)行各種測(cè)定。先前已給出了某些實(shí)施例。一個(gè)實(shí)施例是測(cè)定溶液可以在種子60被切除或組織被去除或暴露之后直接置入孔40內(nèi)。溶液可以進(jìn)行提取和進(jìn)行試驗(yàn)以鑒定感興趣的遺傳材料。準(zhǔn)備時(shí)，可以將各孔排干并將種子移到載體(carrier) 或包裝中供進(jìn)一步使用?；蛘?，已鑒定為具有目標(biāo)基因的種子可以在板18的陣列中從其相關(guān)位置取出，并將保留種子棄去。另一個(gè)替代的方案是，在切除之后，將種子60移到另一容器中，可以在該容器中進(jìn)行測(cè)定。另外的試驗(yàn)類型可包括但不限于細(xì)胞、分子或納米級(jí)水平上的遺傳、物理或化學(xué)分析。某些非限制性的實(shí)施例是a.光譜;b.遺傳；
c.各種核苷酸提取和指紋分析(例如DNA、RNA分離)；d.蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分離；e.表型分型；f.性狀或特征鑒定；g.遺傳標(biāo)記輔助鑒定和選擇；h.高通量篩選。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可在生物組織上進(jìn)行的分析類型，并且可能在對(duì)于種子做出研究與開發(fā)決策以及商業(yè)生產(chǎn)決策方面是理想的或需要的。遺傳分析試驗(yàn)的幾個(gè)實(shí)施例如下。與群體成員間的遺傳多態(tài)性相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記可以通過本領(lǐng)域已很好建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。這些方法包括例如基于PCR的序列特異性擴(kuò)增方法、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)法、同工酶標(biāo)記物檢測(cè)法、等位基因特異性雜交 (ASH)檢測(cè)法、植物基因組的擴(kuò)增可變序列檢測(cè)法、自動(dòng)維持序列復(fù)制檢測(cè)法、簡單序列重復(fù)(SSRs)檢測(cè)法、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè)法或擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLPs)檢測(cè)法。 存在其它的方法。也存在和可以使用根據(jù)物理或化學(xué)性狀的多種分析。僅提及了種子或種子組織分析的幾種方法。其它的是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢詫?duì)種子的樣品部分進(jìn)行分析，或可以對(duì)取樣后種子的剩余部分進(jìn)行分析。樣品可以是單個(gè)小塊或多個(gè)小塊。它甚至可以是多個(gè)小顆粒。一個(gè)實(shí)施例是什么可以稱為所產(chǎn)生的碎片， 例如，當(dāng)激光切除種子時(shí)。如所討論的，所述碎片散布在小顆粒中并可以是像一縷粉塵或煙一樣?？梢詫⑵涫占饋磉M(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光分析是檢測(cè)某些基因存在的一個(gè)實(shí)例。收集來自激光切除的種子碎片的另一個(gè)實(shí)施例是使用在種子上面一側(cè)和面向種子有膠粘劑的帶狀物(tape)。激光可以通過此帶狀物或者在它周圍通過，切除種子并且引起一縷碎片上升。碎片將粘在帶狀物上?？梢杂脤?shí)時(shí)熒光分析來分析帶狀物上的碎片。另一個(gè)選項(xiàng)是分析已經(jīng)過切除的種子。例如，激光切除可去除碎片，留下具有空腔的種子(參見例如圖12A-C)。可以將合適的溶液加入到空腔內(nèi)以使遺傳材料從種子提取到溶液中。可以對(duì)溶液進(jìn)行分析，例如，為了說明一個(gè)或多個(gè)基因的存在情況。a.種子分析的應(yīng)用類型試驗(yàn)應(yīng)用的實(shí)施例包括但不限于諸如以下的事件a.針對(duì)性狀或特征的植物育種過程；b. DNA 或非 DNA 鑒定；c.具有所需性狀或特征的種子的鑒定，用于后續(xù)在田間或溫室中萌發(fā)至成熟。d.基于所需性狀的存在與否進(jìn)行選擇；e.基于遺傳標(biāo)記的存在與否進(jìn)行選擇。來自試驗(yàn)種子的信息用途描述于美國專利第7，227，065號(hào)，其通過引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例如下。除了進(jìn)行表型觀察之外，也可以檢查植物的基因型。植物的基因型可以用來鑒定同一品種或相關(guān)品種的植物。例如，基因型可以用來確定植物的譜系。有許多基于實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)可用于植物基因型的分析、比較和表征；在這些技術(shù)當(dāng)中有同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNAs (RAPDs)、任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AP-PCR)、DNA 擴(kuò)增指紋分析(DAF)、序列表征擴(kuò)增區(qū)域(SCARs)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLPs)、簡單序列重復(fù)(SSRs)(它們也被稱為微衛(wèi)星(Microsatellites))和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。同工酶電泳和 RFLPs，其論述可參見 Lee，M. ,“Inbred Lines of Maize and Their Molecular Markers (自交系玉米及其分子標(biāo)記)，”TheMaize Handbook, (Springer-Verlag, New York, Inc. 1994，第 423-432 頁)(通過引用結(jié)合到本文中)，已經(jīng)廣泛地用來測(cè)定遺傳組成。同工酶電泳具有相對(duì)低數(shù)目的可利用標(biāo)記物和低數(shù)目的等位基因變體。RFUs允許更多鑒別，因?yàn)樗鼈冊(cè)谟衩字芯哂休^高程度的等位基因變異，并且可以發(fā)現(xiàn)較大數(shù)目的標(biāo)記物。這些方法均因以下參考文獻(xiàn)中論述的SSRs而失色=Smith等，“An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize(Zea mays L.) :comparisons with data from RFLPs and pedigree (在玉米中 SSR基因座作為分子標(biāo)記物用途的評(píng)價(jià)(Zea mays L.)與RFLP和譜系的數(shù)據(jù)比較)”，Theoretical and Applied Genetics(1997),第 95 卷，163-173 禾口 Pejic 等，"Comparative analysis of genetic similarity among maize inbreds detected by RFLPs, RAPDs, SSRs, and AFLPs (通過 RFLPs，RAPDs，SSRs和AFLPs檢測(cè)的玉米自交系中基因相似性的比較分析)，” Theoretical and Applied Genetics (1998)，1248-1255，通過引用結(jié)合到本文中。SSR技術(shù)比RFLPs應(yīng)用更有效、更實(shí)際?？梢猿Ｒ?guī)使用更多標(biāo)記基因座。采用SSRs與采用RFUs相比較而言，每個(gè)標(biāo)記基因座可以發(fā)現(xiàn)更多等位基因。單核苷酸多態(tài)性也可用于鑒定本發(fā)明的獨(dú)特遺傳組成和保留該獨(dú)特遺傳組成的子代系。為了提高整體分辨率，可以將各種分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來使用。玉米DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜已經(jīng)快速構(gòu)建并在遺傳研究中廣泛實(shí)現(xiàn)。一種這樣的石if究 δ述于 Boppenmaier 等，"Comparisons among strains of inbreds for RFLPs (自交系株中 RFLPs 的比較)”，Maize Genetics Cooperative Newsletter，65 :1991，第 90 頁，其通過引用結(jié)合到本文中。在植物育種方法中可以使用分子標(biāo)記，其包括通過使用諸如以下的技術(shù)鑒定出的標(biāo)記物同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNAs (RAPDs)、任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增指紋分析(DAF)、序列表征擴(kuò)增區(qū)域(SCARs)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLPs)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和簡單序列重復(fù)(SSRs)。分子標(biāo)記的一種應(yīng)用是數(shù)量性狀基因座(Quantitative Trait Loci, QTL)作圖。 QTL作圖是已知與對(duì)定量性狀具有可檢測(cè)效應(yīng)的等位基因緊密連鎖的標(biāo)記的應(yīng)用。育種過程中的選擇基于在植物基因組中與正作用等位基因連鎖的標(biāo)記的累積和/或與負(fù)作用等位基因連鎖的標(biāo)記的消除。在定量性狀選擇的育種過程中也可以使用分子標(biāo)記。例如，與等位基因緊密連鎖的標(biāo)記或含有在實(shí)際的目標(biāo)等位基因內(nèi)的序列的標(biāo)記，可以用來在回交育種程序中選擇含有目標(biāo)等位基因的植物。標(biāo)記也可用來根據(jù)輪回親本的基因組和針對(duì)供體親本的標(biāo)記進(jìn)行選擇。采用該程序，可以使來自所選植物中保留的供體親本的基因組的量減至最低。它也可以用來減少在回交程序中所需要的輪回親本的回交數(shù)目。分子標(biāo)記在選擇過程中的應(yīng)用常常被稱為遺傳標(biāo)記增強(qiáng)選擇。植物育種的目的是在單變種或雜種中組合不同的所需性狀。對(duì)于農(nóng)田作物，這些性狀可包括抗病蟲害、耐熱和抗旱、減少作物成熟的時(shí)間、較高產(chǎn)量和更好的農(nóng)藝品質(zhì)。隨著許多作物的機(jī)械化收獲，諸如萌發(fā)、植叢建立(stand establishment)、生長速度、成熟、株高和穗高等植物特征的均一性變得很重要。傳統(tǒng)的植物育種在開發(fā)新的改良商品作物中是一種重要的工具。農(nóng)田作物通過利用植物的授粉方法的多項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行育種。如果花粉從一朵花轉(zhuǎn)移到同一株植物的同一朵或另一朵花上，則植物是自花授粉的。當(dāng)用同一家系或品系內(nèi)的個(gè)體來授粉，則植物是近緣授粉的。如果花粉來自不同家系或品系的不同植物上的花朵， 則植物是異花授粉的。本文所用的術(shù)語“異花授粉(cross pollination)”和“異型雜交 (out-cross)，，不包括自花授粉或近緣授粉。一直進(jìn)行自花授粉并根據(jù)類型選擇了許多世代的植物成為幾乎所有基因座都是純合的并產(chǎn)生純育后代的均一種群。兩個(gè)不同的純合系之間的雜交產(chǎn)生許多基因座可能都是雜合的雜種植物的均一種群。兩株分別在大量基因座是雜合的植物的雜交將產(chǎn)生遺傳上不同的異源植物種群并且將是不均一的。玉蜀黍(Zea mays L.)，在美國常常稱為玉米(corn)，可以通過自花授粉和異花授粉技術(shù)兩者進(jìn)行育種。玉米在同一植株上具有分離的雄花和雌花，分別位于雄花花穗 (tassel)和雌花花穗(ear)上。在玉米中，當(dāng)風(fēng)將來自雄花花穗的花粉吹到從雌花花穗頂部伸出的穗絲上，自然授粉就發(fā)生了。在玉米植物育種程序中雜種玉米變種的開發(fā)包括以下三個(gè)步驟(1)從不同的種質(zhì)庫中根據(jù)初始育種雜交選擇植物；( 使來自若干世代育種雜交的所選植物自花受精， 產(chǎn)生一系列自交系，自交系在個(gè)體上是純育的并且高度均一；和(3)讓所選自交系與一種不相關(guān)的自交系雜交產(chǎn)生雜種子代(Fl)。在足量的近交之后，成功的雜交子代將只用來改良開發(fā)近交的種子。優(yōu)選地，自交系在其約95%或以上的基因座應(yīng)當(dāng)包含純合等位基因。在玉米的育種過程期間，品系的活力降低。當(dāng)兩個(gè)不同的自交系雜交產(chǎn)生雜種子代(Fl)時(shí)，活力被恢復(fù)。自交系的純合性和同質(zhì)性的一個(gè)重要結(jié)果在于自交種限定對(duì)之間的雜種可以無限期地繁殖，只要自交親本的同質(zhì)性得以保持。一旦鑒定出產(chǎn)生優(yōu)良雜種的近交種，就可以利用這些近交親本生產(chǎn)連續(xù)供應(yīng)的雜種種子，然后可以從這種雜種種子供應(yīng)產(chǎn)生雜種玉米植物。自交系可用于生產(chǎn)單雜交雜種、雙雜交雜種或三品種雜交雜種。單雜交種是當(dāng)兩個(gè)自交系雜交產(chǎn)生Fl子代時(shí)產(chǎn)生的。雙雜交種是由四個(gè)自交系成對(duì)雜交(Α χ B和C χ D)， 然后兩個(gè)Fl雜交種再次雜交(Α χ B)χ(C χ D)所產(chǎn)生的。三品種雜交種是由三個(gè)自交系產(chǎn)生的，其中三個(gè)自交系中的兩個(gè)雜交(Α χ B)，然后所得的Fl雜交種與第三個(gè)自交系雜交 (Α χ B)χ C。在每一種情況下，來自母本的粒殼組織是雜種種子的組成部分并且可以保護(hù)雜種種子。大規(guī)模商品玉米雜種生產(chǎn)，正如今天所實(shí)際采用的，需要使用某種形式的雄性不育系統(tǒng)，雄性不育系統(tǒng)控制或滅活雄性能育性。一種控制植物中雄性能育的可靠方法也提供改良植物育種的機(jī)會(huì)。這對(duì)玉米雜種的開發(fā)尤為真實(shí)，其依賴于某種雄性不育系統(tǒng)。有若干種方式可以對(duì)玉米植物進(jìn)行操作以便雄性不育。這些包括使用人工或機(jī)械去雄(或去雄花花穗)、細(xì)胞質(zhì)遺傳雄性不育、細(xì)胞核遺傳雄性不育、殺配子劑等。雜交玉米種子常常通過摻入人工或機(jī)械去雄的雄性不育系統(tǒng)來生產(chǎn)。將玉米的兩種自交品種的交替帶狀播種條(Alternate strips)種植在田間，并在花粉落下(shed)之前，從自交種之一(雌性)去除帶有花粉的雄花花穗。前提是與外來玉米花粉源足夠隔離，去雄近交種的雌性花穗將僅來自另一自交種(雄性)才能育，因此所產(chǎn)生的種子是雜種并將形成雜種植物。通過使用細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)自交種，可以避免花大量勞力的去雄過程。CMS 自交種的植物是雄性不育的，因?yàn)槠溥z傳因子在細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)胞核正好相反，所以核連鎖基因在回交期間沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，這一特征只通過玉米植物的母本遺傳，因?yàn)橹挥写菩圆艦槭芫N子提供細(xì)胞質(zhì)。CMS植物用來自另一個(gè)不是雄性不育的自交種的花粉受精。來自第二自交種的花粉可以貢獻(xiàn)或不貢獻(xiàn)使雜種植物雄性能育的基因，根據(jù)雜交種的預(yù)定用途，任一選項(xiàng)都可能是優(yōu)選的。相同的雜種種子、由去雄能育玉米產(chǎn)生的部分和采用CMS系統(tǒng)產(chǎn)生的部分可以混合以保證適當(dāng)花粉負(fù)荷在雜種植物生長時(shí)為受精作用所利用。CMS系統(tǒng)自1950年代以來一直在成功地使用，并且雄性不育性狀定期回交成自交系。參見Wych， 第 585-586 頁，1998。有若干種賦予可利用的遺傳雄性不育的方法，例如，在賦予雄性不育的基因組內(nèi)分離位置上的多突變基因(公開于美國專利第4，6M，465和4，727，219號(hào)(Brar等人)) 和染色體易位(由Patterson描述于美國專利第3，861,709和3，710，511號(hào))。這些專利和所引用的所有專利都通過引用結(jié)合到本文中。除了這些方法之外，先鋒高級(jí)育種公司 (Pioneer Hi-Bred)的Albertsen等人在美國專利第5，432，068號(hào)中還描述了一種核雄性不育系統(tǒng)，它包括鑒定對(duì)雄性能育至關(guān)重要的基因；使這個(gè)對(duì)雄性能育至關(guān)重要的天然基因沉默；去除來自必需雄性能育基因的天然啟動(dòng)子并用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替它；插入該遺傳工程基因后返回到植物；因此產(chǎn)生作為雄性不育的植物，因?yàn)檎T導(dǎo)型啟動(dòng)子沒有處于“開 (on)”狀態(tài)，導(dǎo)致雄性能育基因沒有被轉(zhuǎn)錄。通過誘導(dǎo)或擰“開(on)”該啟動(dòng)子，使能育性得以恢復(fù)，誘導(dǎo)或擰“開”該啟動(dòng)子又使賦予雄性能育的基因被轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域賦予遺傳雄性不育的這些方法和其它方法都具有它們自身的益處和缺點(diǎn)。 某些其它的方法使用了多個(gè)步驟，例如將編碼與雄性組織特定啟動(dòng)子相關(guān)的細(xì)胞毒性物質(zhì)的基因或其中鑒定出對(duì)能育性至關(guān)重要的基因的反義系統(tǒng)和對(duì)植物中插入該基因是反義的基因遞送到植物中(參見Fabinjanski等，EPO 89/3010153. 8公布號(hào)329，308和PCT申請(qǐng) PCT/CA90/00037,公布號(hào)為 WO 90/08828)。另一個(gè)可用于控制雄性不育的系統(tǒng)利用殺配子劑。殺配子劑不是遺傳系統(tǒng)，而是一種局部施用的化學(xué)藥品。這些化學(xué)藥品影響對(duì)雄性能育至關(guān)重要的細(xì)胞。這些化學(xué)藥品的應(yīng)用僅影響在生長季節(jié)施用了殺配子劑的植物的能育性(參見Carlson，Glerm R.，美國專利第4，936，904號(hào))。殺配子劑的應(yīng)用、應(yīng)用的定時(shí)和基因型特異性常常限制該方法的實(shí)用性并且在所述有情況下并不是合適的。雄性不育自交種的應(yīng)用只不過是玉米雜種生產(chǎn)中的一種因素。玉米植物育種程序中玉米雜種的開發(fā)一般需要純合自交系的開發(fā)、這些品系的雜交和雜交結(jié)果的評(píng)價(jià)。玉米植物育種程序?qū)碜詢煞N或以上自交系或各種其它種質(zhì)源的遺傳背景進(jìn)行結(jié)合產(chǎn)生育種群體，由該育種群體通過所需表型自花授粉和選擇而開發(fā)的新的自交系。雜交種也可以用作植物育種材料的一種來源或者用作去開發(fā)或獲得新玉米品系的來源群體。本領(lǐng)域已知的并在玉米植物育種程序中使用的植物育種技術(shù)包括但不限于輪回選擇、混合選擇、集團(tuán)選擇、回交、制造雙單倍體、譜系育種、開放授粉育種、限制性片段長度多態(tài)性增強(qiáng)選擇、遺傳標(biāo)記增強(qiáng)選擇和轉(zhuǎn)化。通常使用這些技術(shù)的組合。從雜交種獲得的自交系可以利用上述
25植物育種技術(shù)進(jìn)行開發(fā)。使新的自交系與其它自交系雜交，對(duì)來自這些雜交的雜種進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而確定其中哪一些具有商業(yè)潛力。最古老最傳統(tǒng)的分析方法是觀察表型性狀，但也可以使用基因型分析。育種方法的描述也可以在以下幾種參考書之一中找到(例如Allard， Principles of Plant Breeding,1960 ；Simmonds, Principles of Crop Improvement, 1979 ；Fehr, "Breeding Methods for Cultivar Development，，，Production and Uses,第二版，Wilcox 編輯，1987)?；亟豢梢杂脕砀牧甲越幌岛屠眠@些自交系產(chǎn)生的雜種?；亟豢梢杂脕韺⑻囟ǖ乃栊誀顝囊粋€(gè)品系即供體親本轉(zhuǎn)移到稱為輪回親本的自交系，輪回親本具有總體良好的農(nóng)藝特征但還缺乏所需要的性狀。通過輪回親本與供體親本(非輪回親本)第一次雜交， 可以完成所需要的性狀到具有總體良好農(nóng)藝特征的自交系的這種轉(zhuǎn)移。然后，使這次雜交的子代與輪回親本回交，接著在所得到的子代中根據(jù)從非輪回親本轉(zhuǎn)移來的所需性狀進(jìn)行選擇。通常，在根據(jù)所需性狀進(jìn)行選擇的四代或以上回交之后，子代將基本上含有輪回親本的所有基因，只是控制所需性狀的基因除外。但是如果在選擇期間使用分子標(biāo)記或者用原種種質(zhì)(elite germplasm)作為供體親本，則回交代的數(shù)目可以少一些。然后，使最后的回交代自交，得到基因發(fā)生了轉(zhuǎn)移的純育子代?；亟灰部梢耘c譜系育種結(jié)合使用，以開發(fā)新的自交系。例如，可以產(chǎn)生Fl，F(xiàn)l與其親本系之一回交，得到BCl。讓子代自交并進(jìn)行選擇，以便新開發(fā)出的自交系具有輪回親本的許多屬性并且還具有非輪回親本的若干所需屬性。輪回選擇是在植物育種程序中為了改良植物種群而使用的一種方法。該方法使多個(gè)單株彼此交叉授粉后形成子代，然后讓子代生長。然后通過任何數(shù)目的方法選出優(yōu)良子代，其中包括單株、半同胞子代、全同胞子代、自交子代和頂交子代。所選出的子代彼此交叉授粉后形成子代的另一種群。將該種群種植，再次選擇優(yōu)良植株進(jìn)行彼此交叉授粉。輪回選擇是一種循環(huán)過程，因此可以按需重復(fù)多次。輪回選擇的目的是為了改良種群性狀。然后可以將改良種群用作育種材料的來源以獲得在雜種使用的自交系或者用作人造栽培種的親本。人造栽培種是由若干所選自交系的互交所形成的所得子代。混合選擇，當(dāng)與本申請(qǐng)較早論述的分子標(biāo)記增強(qiáng)選擇結(jié)合使用時(shí)是一種很有用的技術(shù)。在育種程序中，雙單倍體的產(chǎn)生也可以用來開發(fā)自交系。雙單倍體通過來自雜合植物的一組染色體(IN)加倍而產(chǎn)生，從而產(chǎn)生完全純合的個(gè)體。例如，參見Wan等， "Efficient Production of Doubled Haploid Plants Through Colchicine Treatment of Anther-Derived Maize Callus，，，Theoretical and Applied Genetics, 77 :889-892,1989 和美國專利申請(qǐng)2003/000M79。這可能是有利的，因?yàn)榇诉^程省去了為從雜合來源獲得純合植物所需要的自交世代。單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)用于各種植物以產(chǎn)生單倍體組織、單倍體植物和單倍體種子。單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)可以通過所選系(作為雌性)與誘導(dǎo)系雜交，產(chǎn)生來自任何基因型的單倍體植物。對(duì)于玉米，這樣的誘導(dǎo)系包括Mock 6(Coe，1959，Am. Nat. 93 =381-382 ； Sharkar 和 Coe，1966，Genetics 54 :453-464)、RWS (參見Geiger，H. H. Application of the in-vivo-haploid induction in hybrid maize breeding'，[在線]，[于 2008—08—18 檢索], 自因特網(wǎng)檢索 <https://www. uni-hohenheim. de/ % 7Eipspwww/350b/indexe. html#Project3>)、KEMS(Deimling, Roeber, 和 Geiger, 1997, Vortr. Pfianzenzuchtg38 203-224)或 KMS 和 ZMS(Chalyk，Bylich & Chebotar，1994，MNL 68 47 ；Chalyk 和 Chebotar, 2000, Plant Breeding 119 :363_364)，和不定型配子體(ig)突變(Kermicle 1969Science 166:1422-1424)；這些參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。用于獲得單倍體植物的方法也開公于Kobayashi，M.等，Journ. of Heredity 71 (1) 9 14,1980, Pollacsek, Μ. ， Agronomie (Paris)12(3) 247 — 251，1992 ； Cho-Un-Haing 等，Journ. of Plant Biol，1996，39 (3) 185-188 ;Verdoodt，L.等，1998 年 2 月，96(2) 294-300 ；Genetic Manipulation in Plant Breeding, Proceedings International Symposium Organized by EUCARPIA, Sep. 8-13,1985, Berlin, Germany ； Chalyk φ,1994, Maize Genet Coop. Newsletter 68 47 ；Chalyk, S. Τ. , 1999, Maize Gener.Coop. 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D.，Seed Science and Technology 14，第 1-8 頁 (1995)，該參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容特意通過引用結(jié)合到本文中。通 過這些技術(shù)，可以通過分析沿著基因組在各種基因座上的等位基因組成，來證實(shí)自花授粉系的純合性。這些方法允許對(duì)本文所公開的發(fā)明的快速鑒定。另外可參見“Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis (通過后控制禾口電泳鑒定雜交玉米種子中的非典型植物)”Sarca，V.等，Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol. 20(1),H 29-42 頁。另一種形式的商品雜種生產(chǎn)包括使用雄性不育雜種種子和雄性授粉種子的混合物。當(dāng)種植時(shí)，所得雄性不育雜種植物由授粉植株來授粉。該方法主要用于生產(chǎn)具有增強(qiáng)品質(zhì)谷粒性狀(例如高含油量)的谷物，因?yàn)樵谑诜壅咧斜磉_(dá)的所需品質(zhì)谷粒性狀也將在雄性不育雜種植物上結(jié)出的谷粒中表達(dá)。在這種方法中，所需品質(zhì)谷粒性狀不是必須通過加長程序例如輪回回交選擇被摻入到自交親本系中。這種方法的一種用途描述于美國專利第 5，704，160 和 5，706，603 號(hào)。在植物育種領(lǐng)域中有許多重要的因素要考慮，例如識(shí)別重要的形態(tài)特征和生理特征的能力，設(shè)計(jì)目標(biāo)基因型性狀和表型性狀的評(píng)價(jià)技術(shù)的能力，和找出和利用新的或改進(jìn)的組合中所需性狀的基因的能力。由玉米植物育種程序引起的商品玉米雜種系開發(fā)的目的是開發(fā)新的自交系以生產(chǎn)合并產(chǎn)生谷物高產(chǎn)量和優(yōu)良農(nóng)藝外觀的雜種。育種者探尋的主要性狀之一是產(chǎn)量。然而， 許多其它的主要農(nóng)藝性狀在雜種組合中十分重要并對(duì)產(chǎn)量有影響或者在別的方面提供雜種組合中的優(yōu)良外觀。這樣的性狀包括收獲時(shí)谷粒水分百分比、相對(duì)成熟度、抗莖桿折斷、 抗根部倒伏、谷粒品質(zhì)和抗病蟲害。另外，品系本身必須具有親本性狀的可接受外觀，親本性狀例如種子產(chǎn)量、籽粒大小、花粉產(chǎn)生，所有這些都影響提供以足夠數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行雜交的親本系的能力。已經(jīng)表明，這些性狀處于遺傳控制之下，許多(若不是全部的話)性狀都受到多個(gè)基因的影響。育種者采用了各種方法幫助確定哪些植物應(yīng)當(dāng)從分離種群選擇出來并最終確定哪些自交系將用來開發(fā)雜交種進(jìn)行商業(yè)化。除了對(duì)種質(zhì)和育種者使用的其它技能的知識(shí)之夕卜，選擇過程的組成部分依賴于與使用統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析用來幫助確定哪些植物、哪些植物家系和最終哪些自交系和雜種組合對(duì)感興趣的一種或多種性狀來說明顯好一些或不同。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法用來評(píng)估錯(cuò)誤，以便可以更準(zhǔn)確地確定兩個(gè)自交系或兩個(gè)雜種系之間的差異。統(tǒng)計(jì)分析包括計(jì)算平均值、測(cè)定變異源的統(tǒng)計(jì)顯著性和計(jì)算合適的方差組分。5%或顯著性水平習(xí)慣用來確定給定性狀發(fā)生的差異是否真實(shí)或者是否由環(huán)境或?qū)嶒?yàn)誤差引起。植物育種領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將知道怎樣評(píng)價(jià)兩種植物品種的性狀以確定由這些品種表達(dá)的兩種性狀之間是否沒有顯著差異。例如，參見Fehr， Walt,Principles of Cultivar Development，第 261-286 頁(1987)，其通過引用結(jié)合到本文中。平均性狀數(shù)值可用于確定性狀差異是否顯著，優(yōu)選對(duì)在相同環(huán)境條件下生長的植物性狀進(jìn)行測(cè)量。4.任選的便攜式系統(tǒng)采用上述方法和裝置的多個(gè)方面，對(duì)生長在田間或溫室中的植物選取便攜式激光器切除種子或葉片的一小部分，同時(shí)在植物上，收集或獲取植物的特定組織，并且就地分析該組織或?qū)⑵涫占谂c標(biāo)識(shí)符相關(guān)的容器中，并拿著它返回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，可能是切實(shí)可行的。 5.激光鐫刻以切割泡罩包裝中的種子和捕獲飛行中的經(jīng)切割的種子圖18中公開了另一個(gè)選項(xiàng)。可將激光器16調(diào)整到切割模式(例如鐫刻模式)，它可以通過合適的配置對(duì)整個(gè)種子進(jìn)行完全切割、解剖或分離。這將允許種子整塊被分離，然后收集(例如泡罩包裝100A的孔)。這可以進(jìn)行自動(dòng)化和同步化，以便復(fù)粒種子可以被系列切割，然后將其切去的多個(gè)小塊收集起來。可以保持與小塊所來源種子的關(guān)系。一個(gè)實(shí)施例是同時(shí)收集同樣加標(biāo)容器(另一個(gè)泡罩包裝100B)中的每粒種子。6.復(fù)粒種子的批量分離分析(Bulk segregate Analysis, BSA)有可能利用類似的方法和裝置對(duì)復(fù)粒種子進(jìn)行批量分離分析(BSA)。組織去除工具可以安裝成去除來自同一孔(例如板18孔40)的復(fù)粒種子的組織。然后，來自復(fù)粒種子的組織可以通過BSA進(jìn)行分析?？梢允褂脠D18?？梢詮膹?fù)粒種子中收集切下的多個(gè)小塊?；蛘?，可以將復(fù)粒切割種子置入同一孔內(nèi)。激光切除可以設(shè)定至將這些多個(gè)小塊切成可用來進(jìn)行BSA的大小?；蛘?，磨碎機(jī)構(gòu)可以把種子磨碎成混合的微細(xì)顆粒。BSA 的一個(gè)實(shí)施例描述于 S Quarrie 等，“Bulk segregant analysis with molecular markers and its use for improving drought resistance in maize (利用分子標(biāo)記物進(jìn)行批量分離分析及其用于提高玉米耐干旱的用途)”，Journal of Experimental Botany，第 50 卷，1299—1306，版權(quán) 1999, Oxford University Press，其通過引用結(jié)合到本文中。7.復(fù)粒種子的同時(shí)取樣任選地，可以對(duì)多粒種子進(jìn)行同時(shí)取樣。一個(gè)實(shí)施例將是把多粒種子定位在已知位置，然后同時(shí)去除或暴露種子組織，或每粒種子的一部分。把多粒種子定位在已知位置的方法示于和描述于例如美國申請(qǐng)序列號(hào)12/336，084，申請(qǐng)日為2008年12月16日，該申請(qǐng)已轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)的所有人并通過引用全部結(jié)合到本文中。切除、去除或暴露種子組織的一種方式是用激光器(如本文所述)。同時(shí)從大量種子切除、去除或暴露種子組織的一種方式是將單激光束分裂成多激光束，每束激光都控制到種子的合適位置并且控制功率和用其它操作特征切除或去除種子組織，以產(chǎn)生樣品(例如來自種子的小片(chip)，其大小足夠用于分析)。有許多分裂激光束的方式用于此目的。在美國專利6，562，698和6，327，090中論述了幾個(gè)實(shí)施例，這兩個(gè)專利通過引用結(jié)合到本文中。其它的也是可能的?；蛘撸瑔晤^可裝有多激光器或一個(gè)或多個(gè)激光束分裂器，其中每個(gè)激光器構(gòu)造成產(chǎn)生一束或多束以切除或去除來自種子的組織。再者，可能有多頭，每個(gè)都有激光器照此去做。該系統(tǒng)可控制各束的產(chǎn)生和操作，以及怎樣針對(duì)其相應(yīng)種子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以校正各激光器或激光束，怎樣將其定向或移動(dòng)到操作位置，和操作以完成同時(shí)切除的特征，或復(fù)粒種子的組織、小片或樣品去除。例如，可以用來實(shí)現(xiàn)這些實(shí)施方案的激光器構(gòu)造是在激光器中加入電流計(jì)頭(galvo head)。
權(quán)利要求
1.一種用于以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)或用于研究的種子的有資源效率的選擇方法，所述方法包括a.提供一種或多種候選種子；b.唯一地鑒定所述一種或多種候選種子中的每一粒；c.去除第一候選種子的特定組織或結(jié)構(gòu)；d.進(jìn)行以下的種子特異性分析1.第一候選種子，和/或 .第一候選種子的去除的特定組織或結(jié)構(gòu)；e.存儲(chǔ)來自與第一候選種子的唯一鑒定相關(guān)的種子特異性分析的數(shù)據(jù)；和f.運(yùn)用所述數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)第一候選種子是否應(yīng)當(dāng)被選擇出來用于以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)或用于研究。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述評(píng)價(jià)將所述數(shù)據(jù)或由所述數(shù)據(jù)得出的結(jié)論與其它種子的類似數(shù)據(jù)或結(jié)論進(jìn)行比較。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括提供許多候選種子并去除來自第二候選種子的特定組織或結(jié)構(gòu)；進(jìn)行第二候選種子，和/或第一候選種子的去除的特定組織或結(jié)構(gòu)的種子特異性分析；存儲(chǔ)來自與第二候選種子的唯一鑒定相關(guān)的種子特異性分析的數(shù)據(jù)；和運(yùn)用所述數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)第二候選種子是否應(yīng)當(dāng)被選擇出來用于以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)或用于研究。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述評(píng)價(jià)將所述數(shù)據(jù)或由所述數(shù)據(jù)得出的結(jié)論與和第一候選種子有關(guān)的類似數(shù)據(jù)或結(jié)論進(jìn)行比較。
5.權(quán)利要求1的方法，其中去除組織或結(jié)構(gòu)的步驟不顯著地影響種子的生存力或萌發(fā)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述去除步驟包括使用激光束。
7.權(quán)利要求6的方法，所述方法還包括所述種子與其它種子隔離開。
8.權(quán)利要求7的方法，其中隔離所述種子包括將所述種子置于有底和側(cè)壁的孔或空腔內(nèi)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述底和側(cè)壁具有擴(kuò)散或控制激光束反射的表面特征。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述表面特征包括一個(gè)或多個(gè)與激光束、表面質(zhì)地、表面涂層或表面處理有關(guān)的表面角。
11.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將步驟a至步驟e中的一個(gè)或多個(gè)自動(dòng)化。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述種子特異性分析包括遺傳分析、化學(xué)或物理分析、性狀或特征分析和表型分析中的一個(gè)或多個(gè)。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述種子包括農(nóng)業(yè)種子。
14.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括許多候選種子，所述候選種子中每一個(gè)與包含基因型或表型中一個(gè)或多個(gè)的其它種子有至少一種差異。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述種子包括玉米。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述組織或結(jié)構(gòu)包括玉米種子的粒殼部分。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述粒殼部分正好足以暴露感興趣的底層組織或結(jié)構(gòu)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述底層組織或結(jié)構(gòu)包括胚或胚乳。
19.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將種子置于容器中與種子的唯一標(biāo)識(shí)符相關(guān)的加標(biāo)位置上。
20.一種用于去除特定種子組織或結(jié)構(gòu)以確保進(jìn)行種子特異性分析的方法，所述方法包括a.使用激光非破壞性地切除、切割或去除來自種子的組織或結(jié)構(gòu)；b.測(cè)試所述種子的組織或結(jié)構(gòu)或所述種子的被去除的組織或結(jié)構(gòu)；和c.將試驗(yàn)結(jié)果用于評(píng)價(jià)種子是否應(yīng)當(dāng)被選擇出來供進(jìn)一步使用。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述進(jìn)一步使用是在種子的研究與開發(fā)以及在商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)中的進(jìn)一步使用。
22.—種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品通過權(quán)利要求20的方法以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)。
23.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括控制激光正好足以切除、切割或去除種子的外層組織或結(jié)構(gòu)以暴露感興趣的底層組織或結(jié)構(gòu)。
24.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括使用激光切去種子的一部分。
25.權(quán)利要求M的方法，所述方法還包括收集種子并切去種子的一部分。
26.一種使允許種子選擇的樣品組織所需要的時(shí)間和空間減少的方法，所述種子用于以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)或用于研究，所述方法包括a.提供許多候選種子；b.唯一地鑒定所述候選種子中的每一粒；c.去除各候選種子的特定組織或結(jié)構(gòu)；d.進(jìn)行各候選種子或被去除的組織或結(jié)構(gòu)的種子特異性分析；e.存儲(chǔ)來自與各候選種子唯一鑒定相關(guān)的種子特異性分析的數(shù)據(jù)；和f.運(yùn)用所述數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)任何候選種子是否應(yīng)當(dāng)被選擇出來用于以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)或用于研究，而無需培育種子。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述去除特定組織或結(jié)構(gòu)的步驟是在各種子上自動(dòng)進(jìn)行的。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述自動(dòng)去除包括控制與各種子有關(guān)的激光束。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述種子特異性分析包括遺傳、非遺傳、納米級(jí)、光譜、表型或細(xì)胞水平分析中的一個(gè)或多個(gè)。
30.一種測(cè)試、去除或暴露種子的特定種子結(jié)構(gòu)或組織的方法，所述方法包括a.用激光非破壞性地切除種子的外層組織以暴露底層組織或結(jié)構(gòu)；和b.直接測(cè)試暴露的底層組織或結(jié)構(gòu)的遺傳內(nèi)容物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述測(cè)試是針對(duì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述切除涉及相對(duì)小體積的組織，包括玉米籽粒的粒殼。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述切除涉及包含在空腔或孔內(nèi)的單粒種子，該空腔或孔具有使非擴(kuò)散性激光反射最小化的表面質(zhì)地、處理或涂層。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述切除是在許多種子上進(jìn)行的，各種子在各自的孔或空腔內(nèi)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述各自的孔或空腔是在單一元件中形成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種減少資源的方法，該方法用于選擇以商業(yè)數(shù)量生產(chǎn)的種子或用于研究。收集作為候選者用于選擇的種子樣品并給予標(biāo)識(shí)符。去除來自候選種子的特定組織或結(jié)構(gòu)。對(duì)候選種子或去除的組織或結(jié)構(gòu)進(jìn)行試驗(yàn)或分析。記錄試驗(yàn)或分析的結(jié)果使其與種子標(biāo)識(shí)符相關(guān)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)并對(duì)是否選擇候選種子用于商業(yè)生產(chǎn)或用于研究做出決策判斷。節(jié)約了與讓植物在實(shí)驗(yàn)田或溫室中生長并從生長植物取組織樣品相關(guān)的時(shí)間、空間和勞動(dòng)力。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102165320SQ200980133857
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
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