專(zhuān)利名稱：多能干細(xì)胞的分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。具體來(lái)講，本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法和組合物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生和純化能使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的試劑的方法。
背景技術(shù)：
用于I型糖尿病的細(xì)胞替代療法的進(jìn)展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開(kāi)發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細(xì)胞或β細(xì)胞的來(lái)源上。一種方法是從多能干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生功能性β細(xì)胞。在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育中，多能干細(xì)胞可在稱為原腸胚形成的過(guò)程中產(chǎn)生包括三個(gè)胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細(xì)胞群體。諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類(lèi)的組織將從內(nèi)胚層，經(jīng)由中間階段發(fā)育而來(lái)。該過(guò)程中的中間階段是形成定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)多種標(biāo)志物，例如，HNF-3 β、GATA4、MIXLl、CXCR4和S0X17。定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層導(dǎo)致形成胰腺。胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)胰-十二指腸同源盒基因Pdxl。在不存在Pdxl時(shí)，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因而，Pdxl表達(dá)標(biāo)志著胰腺器官發(fā)生中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。除了其他細(xì)胞類(lèi)型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌組織來(lái)自胰腺內(nèi)胚層的分化。據(jù)報(bào)道，從小鼠的胚胎細(xì)胞衍生了帶有胰島細(xì)胞特征的細(xì)胞。例如，Lumelsky等人 (Science 292 =1389,2001)報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞向類(lèi)似胰島的胰島素分泌結(jié)構(gòu)的分化。 Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)報(bào)道，衍生自小鼠胚胎干細(xì)胞的胰島素分泌細(xì)胞使鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中的血糖變正常。例如，Hori等人(PNAS 99 =16105,2002)揭示，用磷酸肌醇 3_ 激酶(LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了類(lèi)似β細(xì)胞的細(xì)胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 :998，2003)報(bào)道，從組成型表達(dá)1^x4的小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了胰島素生成細(xì)胞。Micallef等人報(bào)道說(shuō)，視黃酸可調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞定向形成Pdxl陽(yáng)性胰腺內(nèi)胚層。 在對(duì)應(yīng)于胚胎的原腸胚形成末的期間，加入胚胎干細(xì)胞分化第4天的培養(yǎng)物中時(shí)視黃酸是誘導(dǎo) Pdxl 最有效的(Diabetes 54:301,2005)。Miyazaki等人報(bào)道了過(guò)表達(dá)Pdxl的小鼠胚胎干細(xì)胞系。他們的結(jié)果顯示，外源Pdxl表達(dá)在所得的分化細(xì)胞中明顯增強(qiáng)了胰島素、生長(zhǎng)抑素、葡萄糖激酶、神經(jīng)元素3、 P48、Pax6 和 HNF6 基因的表達(dá)(Diabetes 53:1030,2004)。Skoudy等人報(bào)道說(shuō)，激活素A(TGF-β超家族的成員)能上調(diào)小鼠胚胎干細(xì)胞中的胰腺外分泌基因(Ρ48和淀粉酶)和內(nèi)分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達(dá)。使用InM激活素A時(shí)觀察到最大的效果。他們還觀察到，胰島素和PdxlmRNA的表達(dá)水平不受視黃酸的影響；然而，3nM FGF7處理導(dǎo)致Pdxl的轉(zhuǎn)錄水平升高(Biochem. J. 379 :749,2004)。Shiraki等人研究了特別地增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞分化為Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的效應(yīng)。他們觀察到，TGF β 2可再現(xiàn)地產(chǎn)生更高比例的PDXl陽(yáng)性細(xì)胞(Genes Cells. 2005年 6 月；10 (6) :503-16)。Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的情況下從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)braChyUry[陽(yáng)性]/HNF_3i3 [陽(yáng)性]內(nèi)胚層細(xì)胞(US 2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 頁(yè)，2006 年)聲稱"Wnt 禾口 TGF β/nodal/ 激活素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)為前原條的產(chǎn)生所必需”。然而，胚胎干細(xì)胞發(fā)育的小鼠模型可能不會(huì)完全模擬高等哺乳動(dòng)物(例如人)中的發(fā)育程序。Thomson等人從人胚泡分離了胚胎干細(xì)胞(Science 282 :114，1998)。同時(shí)， Gearhart和其同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡(jiǎn)單通過(guò)與白血病抑制因子(LIF) — 起培養(yǎng)來(lái)防止分化的小鼠胚胎干細(xì)胞不一樣，人胚胎干細(xì)胞必須維持在非常特殊的條件下 (美國(guó)專(zhuān)利 No. 6，200，806.W099/2074UW0 01/51616)。D' Amour等人描述了在高濃度激活素和低血清的存在下生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞衍生定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)基(D' Amour K A等人，2005)。將這些細(xì)胞移植到小鼠的腎囊下， 導(dǎo)致分化成具有某些內(nèi)胚層器官的特性的更成熟細(xì)胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞可進(jìn)一步分化成Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞(US 2005/0266554A1)。D' Amour 等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401 (2006))聲稱“我們已開(kāi)發(fā)出使人胚胎干(hEQ細(xì)胞轉(zhuǎn)化成能夠合成胰腺激素胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素、胰多肽和生長(zhǎng)激素釋放肽的內(nèi)分泌細(xì)胞的分化方法。該方法通過(guò)引導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)過(guò)類(lèi)似于定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體的階段轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)內(nèi)分泌激素的細(xì)胞來(lái)模擬體內(nèi)胰腺器官發(fā)生”。又如，F(xiàn)isk等人報(bào)道了用于從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生胰島細(xì)胞的系統(tǒng) (US2006/0040387A1)。在該情形中，分化途徑分成三個(gè)階段。首先，使用正丁酸鹽和激活素 A的組合，使人胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)胚層。然后將細(xì)胞與TGF β拮抗劑如Noggin并結(jié)合EGF 或β細(xì)胞素(betacellulin) —起進(jìn)行培養(yǎng)，以產(chǎn)生Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)煙酰胺誘導(dǎo)終末分化。在一個(gè)例子中，Benvenistry等人聲稱“我們得出如下結(jié)論P(yáng)DXl的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了胰富集基因的表達(dá)，胰島素表達(dá)的誘導(dǎo)可能需要僅存在于體內(nèi)的額外的信號(hào) (Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 :1923-1930)。激活素A是表現(xiàn)出廣泛生物活性的TGF-β家族成員，所述生物活性包括調(diào)控細(xì)胞增殖和分化以及促進(jìn)神經(jīng)元存活。激活素A是由兩個(gè)激活素βA亞基組成的同型二聚體， 其由抑制素(inhibin)A基因編碼。其他激活素已知是由βΑ、i3C、i3D和β E的同型二聚體或異型二聚體組成的。例如，激活素B由兩個(gè)βΒ亞基的同型二聚體組成。包含βΑ亞基和β B亞基的肽具有63%的同一性，并且八個(gè)半胱氨酸的位置在這兩種肽序列中均是保守的。激活素A通過(guò)與受體結(jié)合而對(duì)細(xì)胞施加其影響。所述受體由異聚受體復(fù)合物組成，該復(fù)合物由兩種類(lèi)型的受體(I型(ActR-I)和II型(ActR-II))組成，每一種含有細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。這些受體在結(jié)構(gòu)上與小的富半胱氨酸細(xì)胞外區(qū)域和由激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域相似。ActR-I(但ActR-II不是)在近膜結(jié)構(gòu)域中具有富含甘氨酸和絲氨酸殘基的區(qū)域(GS結(jié)構(gòu)域)。激活素A首先與ActR-II結(jié)合，后者以與組成性活性激酶形成的低聚體形式存在于細(xì)胞膜中。在缺乏ActR-II的情況下，ActR-I(其也作為低聚體形式存在)不能結(jié)合激活素A。在激活素A結(jié)合后，ActR-I被募集與ActR-II形成復(fù)合物。ActR-II然后使ActR-I在GS結(jié)構(gòu)域磷酸化并激活其相應(yīng)的激酶。激活素A的分離和純化通常是復(fù)雜的，通常會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率低。例如，Pangas，S. A.和 Woodruff, T.K聲稱“抑制素和激活素是具有包括調(diào)節(jié)垂體FSH分泌在內(nèi)的各種生理作用的蛋白質(zhì)激素”。類(lèi)似于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因家族的其他成員，它們經(jīng)歷從較大前體分子加工以及組裝成功能性二聚體。從天然來(lái)源分離抑制素和激活素僅能生產(chǎn)有限量的生物活性蛋白質(zhì)(J. Endocrinol. 172(2002) 199-210)。又如，Arai, K. Y.等人聲稱“激活素是屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_β超家族的多功能生長(zhǎng)因子。從天然來(lái)源分離激活素需要許多步驟并僅產(chǎn)生有限的量。盡管重組制劑已用于近來(lái)的研究，但重組激活素的純化仍需要多個(gè)步驟”(ftOtein Expression and Purification 49(2006)78-82)。已投入相當(dāng)大的努力來(lái)開(kāi)發(fā)更有效或更便宜的激活素A替代物。例如，US5215893 公開(kāi)了用于在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)含有抑制素的α或β鏈。具體來(lái)講，其涉及用于獲得或使用編碼抑制素的DNA，以及用于制備抑制素變體的方法，所述抑制素變體與天然的動(dòng)物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差別。又如，US5716810公開(kāi)了用于在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)含有抑制素的α或β鏈。具體來(lái)講，其涉及用于獲得或使用編碼抑制素的DNA，以及用于制備抑制素變體的方法，所述抑制素變體與天然的動(dòng)物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差別。又如，US552M88公開(kāi)了用于在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)含有抑制素的α或β鏈。具體來(lái)講，其涉及用于獲得或使用編碼抑制素的DNA，以及用于制備抑制素變體的方法，所述抑制素變體與天然的動(dòng)物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差別。又如，US5665568公開(kāi)了用于在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)含有抑制素的α或β鏈。具體來(lái)講，其涉及用于獲得或使用編碼抑制素的DNA，以及用于制備抑制素變體的方法，所述抑制素變體與天然的動(dòng)物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差別。又如，US4737578公開(kāi)了分子量約32，000道爾頓的具有抑制素活性的蛋白質(zhì)。所述分子由兩條分子量分別約18，000和約14，000道爾頓的鏈構(gòu)成，這兩條鏈通過(guò)二硫鍵鍵合而結(jié)合在一起。該18Κ鏈從人抑制素基因獲得并且具有如下分子式=Hler-Thr-Pr0-L eu-Met-Ser-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ser-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Gl U-Pro-Ala-Ala-His-Ala-Asn-Cys-His-Arg-Val-Ala-Leu-Asn-IIe-Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Glu-Arg-Trp-Ile-Val-Tyr-Pro-Pro-Ser-Phe-R. sub. 65-Phe-Hi s-Tyr-Cys-Hi s-Gly-Gly-Cys-Gly-Leu-His-Ile-Pro-Pro-Asn-Leu-Ser-Leu-Pro-Val-Pro-Gly-Ala-Pr o-Pro-Thr-Pro-Ala-Gln-Pro-Tyr-Ser-Leu-Leu-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala -Leu-Pro-Gly-Thr-Met-Arg-Pro-Leu-His-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser -Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-Asn-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH,其中 R. sub. 65是lie或Arg。該18K鏈通過(guò)與14K鏈的二硫鍵鍵合來(lái)連接。因此，仍存在對(duì)更便宜、更有效的激活素A替代物的巨大需要，以便于多能干細(xì)胞的分化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供能夠使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物細(xì)胞的化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述能夠使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的化合物是包含含有至少一個(gè)點(diǎn)突變的激活素A氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，所述方法包括用培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞，持續(xù)足以使所述多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的一段時(shí)間，所述培養(yǎng)基含有肽， 所述肽包含含有至少一個(gè)點(diǎn)突變的激活素A的氨基酸序列。


圖1示出了肽ACTN 2至肽ACTN 48的系統(tǒng)樹(shù)。圖2示出了肽ACTN 49至肽ACTN 94的系統(tǒng)樹(shù)。圖3示出了克隆進(jìn)pcDNA3. 1㈠中的野生型激活素A的原區(qū)(pro-region)的核酸序列。圖4示出了克隆進(jìn)pcDNA3. 1 (-)中的ACTN 1的成熟區(qū)的核酸序列。圖5示出了克隆進(jìn)pcDNA3. 1(_)中的ACTN 1的全長(zhǎng)基因(含有原區(qū)和成熟區(qū)) 的核酸序列。圖6示出了 ACTN 1 ( ACTN 1WT)和對(duì)照激活素A ( ■和▲ OriGeneWT)使人胚胎干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力。將克隆進(jìn)它們各自的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的ACTN 1 ( ACTN 1WT)和野生型對(duì)照激活素A ( ■ OriGene WT)轉(zhuǎn)染進(jìn) HEK293-E細(xì)胞，將獲得的純上清液(未濃縮)或濃縮的上清液(濃縮)以所示出的測(cè)定稀釋度添加至人胚胎干細(xì)胞。通過(guò)測(cè)量相對(duì)于未處理過(guò)的對(duì)照細(xì)胞的S0X17強(qiáng)度表達(dá)來(lái)確定分化。圖7示出了用于獲得本發(fā)明的肽的表達(dá)構(gòu)建體。分圖A示出了克隆進(jìn)pUNDER中的ACTN 1的全長(zhǎng)基因(含有原區(qū)和成熟區(qū))的核酸序列。分圖B示出了該表達(dá)載體的圖形表示。圖8示出了克隆進(jìn)它們各自的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的ACTN 1和野生型激活素A對(duì)照使人胚胎干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力。分圖A示出了上清液對(duì)測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的作用。將克隆進(jìn)PUNDER中的ACTN 1和克隆進(jìn)pCMV6_XL4中的野生型激活素A對(duì)照(OriGene)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293-F細(xì)胞(白色柱條)和CHO-S細(xì)胞(黑色柱條)中，并在定形內(nèi)胚層生物測(cè)定法中以所示稀釋度測(cè)試所獲得的純上清液或10倍濃縮上清液。所示的數(shù)據(jù)代表相對(duì)于未處理過(guò)的細(xì)胞的變化。分圖B示出了上清液對(duì)S0X17 表達(dá)的作用。將克隆進(jìn)PUNDER中的ACTN 1和克隆進(jìn)pCMV6_XL4中的野生型激活素A對(duì)照 (OriGene)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293-F細(xì)胞(白色柱條)和CHO-S細(xì)胞(黑色柱條)中，并在定形內(nèi)胚層生物測(cè)定法中以所示稀釋度測(cè)試所獲得的純上清液或10倍濃縮上清液。所示的數(shù)據(jù)代表相對(duì)于未處理過(guò)的細(xì)胞的變化。圖9示出了本發(fā)明的肽在用pUNDER載體轉(zhuǎn)染過(guò)的HEK293-F細(xì)胞的上清液中的表達(dá)，所述載體含有編碼所標(biāo)明的全長(zhǎng)肽(ACTN 2、ACTN 4、ACTN 5、ACTN 6、ACTN 7和ACTN 8)的基因。獲得上清液，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，用抗激活素A抗體探測(cè)細(xì)胞膜進(jìn)行分析。圖10示出了本發(fā)明的肽在用pUNDER載體轉(zhuǎn)染過(guò)的HEK293-F細(xì)胞的上清液中的表達(dá)，所述載體含有編碼所標(biāo)明的全長(zhǎng)肽(ACTN 9, ACTNlO, ACTN 11、ACTN 12、ACTN 14、 ACTN 16,ACTN 17,ACTN 18,ACTN 19,ACTN 20,ACTN 2UACTN 22 禾口 ACTN 23)的基因。獲得上清液，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，用抗激活素A抗體探測(cè)細(xì)胞膜進(jìn)行分析。圖11示出了本發(fā)明的肽的表達(dá)，所述肽被進(jìn)一步修飾而含有組氨酸置換。將 HEK293-F 細(xì)胞用含有編碼 ACTD 17、ACTD 18、ACTD 19、ACTD20、ACTD 21 和 ACTD 22 的基因的pUNDER載體轉(zhuǎn)染。獲得上清液，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，用抗激活素A抗體(Mab 3381-左手邊)或抗前體抗體(Mabl203-右手邊)探測(cè)細(xì)胞膜進(jìn)行分析。圖12示出了 ACTD 20的代表性IMAC純化曲線。上樣后，洗滌柱子并用20柱體積用線性梯度的咪唑(0-500mM)洗脫蛋白質(zhì)。圖 13 示出了 ACTD 17,ACTD 18,ACTD 19,ACTD 20,ACTD 21 和 ACTD 22 的咪唑級(jí)分的蛋白質(zhì)印跡洗脫圖。圖14示出了來(lái)自用含有卵泡抑素基因ACTA 1、ACTA 2和ACTA 3的載體轉(zhuǎn)染的 HEK293-F細(xì)胞的上清液的卵泡抑素變體表達(dá)的代表性蛋白質(zhì)印跡。用所標(biāo)明的抗體對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行探測(cè)。圖15示出了 ACTA 3(分圖Α)的代表性IMAC純化曲線。上樣后，洗滌柱子并用分級(jí)梯度的咪唑(10mM、50mM、150mM、250mM和500mM)洗脫蛋白質(zhì)。分圖B示出了 IMAC純化的洗脫曲線的銀染色凝膠。圖16示出了使用ACTA 3親和柱時(shí)肽變體ACTN 1的代表性純化的蛋白質(zhì)印跡(分圖A和B)。用所標(biāo)明的抗體對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行探測(cè)。分圖C示出了使用ACTA 3親和柱時(shí)肽變體ACTN 1的代表性純化的銀染色凝膠。圖17示出了人胚胎干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。分化通過(guò)使用IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)測(cè)量細(xì)胞數(shù)目(分圖Α)和S0X17強(qiáng)度(分圖B)來(lái)確定。用含有20ng/ml Wnt3a加標(biāo)明濃度的激活素的培養(yǎng)基(黑色柱條) 或缺少Wnt3a但具有指定濃度的激活素的培養(yǎng)基(白色柱條)處理人胚胎干細(xì)胞共四天。圖18示出了 ACTN 1(白色柱條)和對(duì)照激活素A(有陰影線的柱條和實(shí)心柱條) 使人胚胎干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力。獲得來(lái)自用克隆進(jìn)pcDNA3. 1 (-)中的ACTN 1 (白色柱條)和對(duì)照激活素A(帶陰影線的柱條)轉(zhuǎn)染的 HEK293-E細(xì)胞的上清液并濃縮，然后以所示稀釋度添加至人胚胎干細(xì)胞。通過(guò)測(cè)量S0X17 強(qiáng)度確定分化。
圖19示出了使用激活素A人胚胎干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。分圖A示出了使用市售重組人激活素A并測(cè)量S0X17強(qiáng)度時(shí)的人胚胎干細(xì)胞分化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將細(xì)胞用所標(biāo)明濃度的激活素A處理四天。所示數(shù)據(jù)為用IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)檢測(cè)的S0X17的平均表達(dá)水平。分圖B示出了 ACTN 1使人胚胎干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力。將來(lái)自用克隆進(jìn) pUNDER(pUNDER)中的ACTN 1和克隆進(jìn)pCMV6_XL4中的野生型激活素A對(duì)照(OriGene)轉(zhuǎn)染過(guò)的HEK293-F細(xì)胞(白色條柱)和CHO-S細(xì)胞(黑色條柱)的上清液以所標(biāo)明的濃度添加至人胚胎干細(xì)胞，并測(cè)定S0X17表達(dá)水平四天。圖20示出了激活素A ELISA的重組人激活素A(由生產(chǎn)商提供)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(分圖A)。分圖B比較了激活素A ELISA中的兩種市售重組人激活素A標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中中空方塊(口)指示由生產(chǎn)商(R&D Systems)提供的激活素A標(biāo)準(zhǔn)品而實(shí)心三角(▲) 指示購(gòu)自P^rotech的激活素A。圖21示出了在分化第一個(gè)步驟期間的多種處理后CXCR4表達(dá)的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。針對(duì)用激活素A處理或未用激活A(yù)處理或用兩種變體組氨酸肽(ACTD3和ACTD8)處理， 示出了 CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞百分比的直方圖，所述百分比以未純化的上清液母液或IMAC純化材料進(jìn)行測(cè)試。圖22分圖A至I示出了 S0X17表達(dá)的相對(duì)百分比強(qiáng)度對(duì)給定肽濃度的劑量滴定，其中肽濃度先前從ELISA結(jié)果計(jì)算得到。在每個(gè)分圖中，代表性曲線將野生型激活素 A(ACTNl)與變體肽進(jìn)行了比較。代表性R2值示出了每一曲線的相對(duì)擬合度。圖23示出了針對(duì)定形內(nèi)胚層的多種代表性標(biāo)志物，使用流式細(xì)胞檢測(cè)分析、PCR 和高內(nèi)涵測(cè)量在分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的結(jié)果。分圖A示出了在分化處理期間使用商業(yè)來(lái)源的激活素A或野生型ACTm肽時(shí)CXCR4表達(dá)的FACS分析。圖B示出了兩種變體肽 (ACTN4和ACTN48)與野生型ACTm肽相比較的CXCR4表達(dá)。分圖C至F示出了在用野生型激活素A或各變體肽處理后，在分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)細(xì)胞數(shù)目和S0X17表達(dá)的高內(nèi)涵分析。分圖G和H示出了在用野生型ACTm或變體肽ACTN4或ACTN48處理后，在分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)S0X17和F0XA2基因表達(dá)的RT-PCR結(jié)果。插入的表框示出了每一種基因標(biāo)志物的CT值。圖M示出了在分化的第一個(gè)步驟期間用野生型ACTm或變體肽ACTN4或ACTN48 處理后，在分化的第三個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的結(jié)果。結(jié)果圖示了細(xì)胞數(shù)目(分圖A和B)、PDXl蛋白表達(dá)(分圖C和D)、⑶X2蛋白表達(dá)(分圖E和F)的高內(nèi)涵分析，或PDXl或⑶X2(分圖 G和H)的RT-PCR結(jié)果。插入的表框示出了每一種基因標(biāo)志物的CT值。圖25示出了在分化的第一個(gè)步驟期間用野生型ACTm或變體肽ACTN4或ACTN48 處理后，在分化的步驟四結(jié)束時(shí)的RT-PCR結(jié)果。插入的表框示出了每一種基因標(biāo)志物的CT 值。
具體實(shí)施例方式將本發(fā)明的具體實(shí)施方式
部分分成以下幾個(gè)分部分，來(lái)描述或舉例說(shuō)明本發(fā)明的某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用，這是為了使公開(kāi)內(nèi)容清楚起見(jiàn)，并非限制本發(fā)明。定義
干細(xì)胞是由它們?cè)趩渭?xì)胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細(xì)胞的能力來(lái)定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和末端分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞以及移植后產(chǎn)生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的話) 組織形成的能力。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為(1)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類(lèi)型；( 多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類(lèi)型；C3)專(zhuān)能，指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生所有的細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞(HSC)可產(chǎn)生的后代細(xì)胞包括HSC(自我更新型)、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞以及作為血液正常組分的所有細(xì)胞類(lèi)型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產(chǎn)生比多能干細(xì)胞更有限的細(xì)胞譜系亞群；以及( 單能，指能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(如生精干細(xì)胞)。分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過(guò)程。分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是已經(jīng)在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“定向的”當(dāng)應(yīng)用到分化的過(guò)程時(shí)，指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞在正常環(huán)境下，它會(huì)繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞類(lèi)型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細(xì)胞類(lèi)型或回復(fù)到分化程度較低的細(xì)胞類(lèi)型。去分化指細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞的譜系當(dāng)中特化(或定向)程度較低的地位的過(guò)程。如本文所用，“細(xì)胞的譜系”限定細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來(lái)自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計(jì)劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)志物是指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞表型特異性相關(guān)并能夠用于評(píng)價(jià)非定向細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化的特征?！?β -細(xì)胞譜系”指對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子PDXl和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種具有陽(yáng)性基因表達(dá)的細(xì)胞NGN3、NKX2. 2、NKX6. UNEUROD, ISL1、HNF_3 β、MAFA、PAX4 或 PAX6。表達(dá) β 細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括β細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”、或“第1階段細(xì)胞”或 “第1階段”指表達(dá)至少一種如下標(biāo)志物的細(xì)胞SOX17、GATA4、HNF-3 0、GSC、CERl、Nodal、 FGF8、Brachyury、Miχ 樣同源盒蛋白、FGF4CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、 FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞PDX1、HNF-I β、PTF-I α、HNF6或ΗΒ9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞、原腸管細(xì)胞和后前腸細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”或“第5階段細(xì)胞”或 “第5階段”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞NGN3、NEUR0D、ISL1、PDX1、NKX6. 1、PAX4或 PTF-Ia。表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰內(nèi)分泌細(xì)胞、胰激素表達(dá)細(xì)胞、胰激素分泌細(xì)胞和β細(xì)胞系的細(xì)胞。如本文所用，“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過(guò)程中從上胚層產(chǎn)生的細(xì)胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)志物HNF-3i3、GATA4、 S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 MIXLl。如本文所用，“胚胎外內(nèi)胚層”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞群體S0X7、AFP或 SPARC。如本文所用，“標(biāo)志物”是在所關(guān)注細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。關(guān)于這一點(diǎn)，差異表達(dá)意指陽(yáng)性標(biāo)志物的水平增加，而陰性標(biāo)志物的水平降低。與其他細(xì)胞相比，所關(guān)注細(xì)胞中的核酸或多肽標(biāo)志物的可檢測(cè)水平足夠高或足夠低，使得可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法識(shí)別所關(guān)注細(xì)胞，并將所關(guān)注細(xì)胞與其他細(xì)胞區(qū)相區(qū)分。如本文所用，“中內(nèi)胚層細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞⑶48、脫中胚蛋白(EOMES)、SOXl7、DKK4、HNF-3 β、GSC、FGF17 或 GATA6。如本文所用，“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”指能夠表達(dá)至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。如本文所用，“胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞”或“第4階段細(xì)胞”或“第4階段”指能夠表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞NGN3、NEUROD, ISLl、PDXl、PAX4 或 NKX2. 2。如本文所用，“胰腺激素分泌細(xì)胞”指能夠分泌至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、 胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素或胰多肽。如本文所用，“胰腺激素分泌細(xì)胞”指能夠分泌至少一種以下激素的細(xì)胞胰島素、 胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素或胰多肽。如本文所用，“后前腸細(xì)胞”或“第3階段細(xì)胞”或“階段3”指能夠分泌至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞PDX1、HNFl、PTFl α、HNF6、ΗΒ9 或 PROXl。如本文所用，“前原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞=Nodal或FGF8。如本文所用，“原腸管細(xì)胞”或“第2階段細(xì)胞”或“第2階段”指能夠分泌至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞HNF1或HNF4a。如本文所用，“原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞=Brachyury、Mix樣同源盒蛋白或FGF4。本發(fā)明的肽本發(fā)明提供能夠使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物細(xì)胞的肽。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的肽是包含含有至少一個(gè)點(diǎn)突變的激活素A氨基酸序列的肽。 所述至少一個(gè)點(diǎn)突變可位于激活素A的有助于結(jié)合受體的區(qū)域內(nèi)?；蛘?，所述至少一個(gè)點(diǎn)突變可位于激活素A的處于同型二聚體界面內(nèi)的區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明的肽可含有一個(gè)點(diǎn)突變?；蛘?，本發(fā)明的肽可含有多個(gè)點(diǎn)突變。在一個(gè)實(shí)施例中，所述至少一個(gè)點(diǎn)突變通過(guò)分析激活素A的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)確定，其中選擇具體的氨基酸殘基用于突變。所述至少一個(gè)點(diǎn)突變可為至少一個(gè)氨基酸殘基插入的形式?；蛘?，所述至少一個(gè)點(diǎn)突變可為至少一個(gè)氨基酸殘基缺失的形式?；蛘?，所述至少一個(gè)點(diǎn)突變可為至少一個(gè)氨基酸殘基置換的形式。至少一個(gè)氨基酸的置換可為特定位置處的至少一個(gè)隨機(jī)氨基酸置換的形式?；蛘?，至少一個(gè)氨基酸的置換可為特定位置處的至少一個(gè)特定氨基酸置換的形式。在一個(gè)實(shí)施例中，用于置換的至少一個(gè)特定氨基酸用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)來(lái)選擇，使得所述至少一個(gè)具體氨基酸的置換將對(duì)所得的同型二聚體的形成沒(méi)有影響。在一個(gè)實(shí)施例中，將至少一個(gè)點(diǎn)突變引入激活素A氨基酸序列的至少一個(gè)選自如下的氨基酸殘基:10I、16F、39Y、41E、43E、74F、75A、76N、77L、78K、79S 和 82V。在一個(gè)實(shí)施例中，將至少一個(gè)點(diǎn)突變引入激活素A氨基酸序列的至少一個(gè)選自如下的氨基酸殘基 16F、18V、19S、20F、37A、38N、39Y、41E、74F、82V、107N、1091、IlOV 和 116S。本發(fā)明的肽的氨基酸序列可在表1中找到。在一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的肽的氨基酸序列回譯成核酸序列?？珊铣稍摵怂嵝蛄胁⑵洳迦氡磉_(dá)載體以使得能在哺乳動(dòng)物中表達(dá)?？蓪⒃摵怂嵝蛄胁迦氡磉_(dá)載體 pcDNA3. 1 (-)中。或者，可將核酸序列插入pcDNA3. 1(_)載體的變體中，其中所述載體已被改變以增強(qiáng)該插入的核酸序列在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，pcDNA3. 1 (-)載體的變體稱為pUNDER。本發(fā)明的肽的核酸序列可在表2中找到。可將含有本發(fā)明的肽的核酸序列的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中?；蛘?， 可將含有本發(fā)明的肽的核酸序列的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。任何轉(zhuǎn)染方法均適用于本發(fā)明。這種轉(zhuǎn)染方法可以是(例如)CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或LIPOFECTAMINE -介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。對(duì)于合適的轉(zhuǎn)染方法的例子，請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)例2?？蓪⒉溉閯?dòng)物細(xì)胞在懸浮液中培養(yǎng)，或者作為另一種選擇，作為單層培養(yǎng)。可用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子可在實(shí)例2中找到，并且可在實(shí)例3中找到可用于本發(fā)明的替代哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明的肽可在昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，例如Kron，R等人 (Journal of Virological Methods 72(1998)9-14)中描述的系統(tǒng)中表達(dá)。本發(fā)明的肽的純化可將本發(fā)明的肽從它們?cè)谄渲斜磉_(dá)的哺乳動(dòng)物中分離。在一個(gè)實(shí)施例中，可對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行分級(jí)，并移出含有本發(fā)明的肽的上清液?？蓮纳锨逡褐屑兓鲭??；蛘撸芍苯邮褂蒙锨逡?。在直接使用上清液的情況中，將上清液直接施用給人多能干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，在將上清液施用給人胚胎干細(xì)胞之前對(duì)其濃縮。在從上清液純化本發(fā)明的肽的情況中，可用任何合適的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如尺寸排阻色譜法純化所述多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)親和色譜純化本發(fā)明的肽。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)包括如下步驟的方法純化本發(fā)明的肽a.用編碼本發(fā)明的肽的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，b.讓所述肽在所述細(xì)胞中表達(dá)，c.將細(xì)胞進(jìn)行分級(jí)并收集含有所述肽的上清液，d.使所述上清液通過(guò)親和純化柱，該柱填充有含有能夠特異性結(jié)合所述肽的配體的固相基質(zhì)，以及e.將結(jié)合的肽從固相基質(zhì)洗脫，洗脫液含有所述肽的純化制劑。在一個(gè)實(shí)施例中，能夠特異性結(jié)合本發(fā)明的肽的配體是卵泡抑素。在一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)一步修飾本發(fā)明的肽以含有至少一個(gè)能夠特異性結(jié)合親和純化柱中的固相基質(zhì)上的配體的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)一步修飾本發(fā)明的肽以在它們的氨基酸序列中含有至少一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)。所述進(jìn)一步的修飾可包括刪減氨基酸殘基以形成能夠特異性結(jié)合親和純化柱中的固相基質(zhì)上的配體的區(qū)域。作為另一種選擇，所述進(jìn)一步的修飾可包括插入氨基酸殘基以形成能夠特異性結(jié)合親和純化柱中的固相基質(zhì)上的配體的區(qū)域。作為另一種選擇，所述進(jìn)一步的修飾可包括置換氨基酸殘基以形成能夠特異性結(jié)合親和純化柱中的固相基質(zhì)上的配體的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，所述至少一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)由兩個(gè)組氨酸殘基組成。在一個(gè)實(shí)施例中，將組氨酸殘基置換進(jìn)所述肽的包含含有至少一個(gè)點(diǎn)突變的激活素A氨基酸序列的氨基酸序列中。表3列出了已進(jìn)一步修飾而含有金屬結(jié)合位點(diǎn)的本發(fā)明的肽。在這些實(shí)施例中，能夠特異性結(jié)合所述肽的配體是鎳。在一個(gè)替代實(shí)施例中，根據(jù)Pangas，S. A.和Woodruff (J. Endocrinol. 172(2002) 199-210)中描述的方法純化本發(fā)明的肽。在一個(gè)替代實(shí)施例中，根據(jù)Arai，K. Y.等人(Protein Expression andPurification 49(2006)78-82)描述的方法純化根據(jù)本發(fā)明的肽。多能干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)多能干細(xì)胞的特件描述可通過(guò)(例如)以下方法來(lái)確認(rèn)多能干細(xì)胞的多能性將細(xì)胞注入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的體內(nèi)，使用4%的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后用組織學(xué)方法檢查來(lái)自三種胚層的細(xì)胞類(lèi)型的證據(jù)?；蛘?，可通過(guò)產(chǎn)生擬胚體并評(píng)估擬胚體的與三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)志物的存在來(lái)確定多能性?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)G帶技術(shù)并比較已公布的相應(yīng)靈長(zhǎng)類(lèi)物種的核型來(lái)分析增殖的多能干細(xì)胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，其意指細(xì)胞為整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒(méi)有明顯的改變。多能干細(xì)胞的來(lái)源可使用的多能干細(xì)胞的類(lèi)型包括從妊娠后形成的組織衍生而來(lái)的確立多能細(xì)胞系，包括在妊娠期間任何時(shí)間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時(shí)間通常是但不一定是在大約10至12周妊娠前。非限制性的例子是已建立的人胚胎干細(xì)胞系或人胚胎生殖細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系HI、H7和H9 (WiCell)。還可設(shè)想的是，在此類(lèi)細(xì)胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開(kāi)的組合物，在此情況下，源細(xì)胞將是直接取自源組織的原代多潛能細(xì)胞。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群體的細(xì)胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細(xì)胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens，GA)。在一個(gè)實(shí)施例中，人胚胎干細(xì)胞是如Thomson等人所述制備(美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，843，780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr.Top. Dev. Biol. 38 :133ff.，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)所描述方法制備人胚胎干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，如hkahashi等人(Celll31 :1-12,2007)所述制備多能干細(xì)胞。多能干細(xì)胞的培養(yǎng)在一個(gè)實(shí)施例中，通常在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞可以多種方式支持多能干細(xì)胞?；蛘?，在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞，但同樣支持多能干細(xì)胞的增殖而不會(huì)進(jìn)行顯著的分化。使用通過(guò)此前培養(yǎng)另一細(xì)胞類(lèi)型而調(diào)理過(guò)的培養(yǎng)基來(lái)支持多能干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)而不分化。作為另一種選擇，用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基來(lái)支持多能干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)而不分化?？蓪⒍嗄芨杉?xì)胞接種至合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是胞外基質(zhì)成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基材是MATRIGEL (Becton Dickenson) 0 MATRIGEL 是來(lái)自于EngeIbreth-HoIm-Swarm腫瘤細(xì)胞的可溶性制劑，其在室溫下會(huì)發(fā)生膠化從而形成重構(gòu)基底膜。其他的細(xì)胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴(kuò)增的細(xì)胞類(lèi)型，這可包括單獨(dú)的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合。可在存在可促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和保持理想特性的培養(yǎng)基存在的情況下，以合適的分布將多能干細(xì)胞接種于所述基質(zhì)上。所有這些特性可得益于對(duì)接種分布的認(rèn)真考慮并可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。合適的培養(yǎng)基可用如下組分制備，例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)， Gibco # 11965-092 ； Knockout達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(KODMEM)，Gibco # 10829-018 ；Ham' s F12/50% DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mML_ 谷氨酰胺，Gibco # 15039-027; 非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β-巰基乙醇，Sigma # M7522 ；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF), Gibco# 13256-029oM雜〒_ M成』夷_ i傾_在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種從多能干細(xì)胞產(chǎn)生胰腺激素生成細(xì)胞的方法， 該方法包括如下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞，b.使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，c.使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，并且d.使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是胰腺激素生成細(xì)胞。在一個(gè)替代方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞可表達(dá)PDXl和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子NGN3、NKX2. 2、NKX6. 1、NEUROD、ISLl、HNF_3 β、 MAFA、ΡΑΧ4或ΡΑΧ6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是β細(xì)胞。適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞包括例如人胚胎干細(xì)胞系Η9 (NIH編碼WA09)、人胚胎干細(xì)胞系Hl (NIH編碼WA01)、人胚胎干細(xì)胞系H7(NIH編碼WA07)和人胚胎干細(xì)胞系 SA002 (Cellartisj^W )。同樣適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種下列多能細(xì)胞特征性標(biāo)志物的細(xì)胞ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、連接蛋白 43、連接蛋白 45、0CT4、S0X2、Nanog、hTERT、 UTF-I、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60 或 Tral-81。定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自S0X17、GATA4、HNF-3 β、GSC、CERl、Nodal、 FGF8、Brachyury, Mix 樣同源盒、FGF4CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGFl7、GATA6、 CXCR4、C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為原條前體細(xì)胞。在一個(gè)替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自PDXl、HNF-I β、PTFl α、HNF6、ΗΒ9和PROXl。 適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物選自NGN3、NEUROD, ISLl、PDXl、NKX6. 1、PAX4和 PTF-Ia。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)以下激素中的至少一種胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的細(xì)胞為表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰激素表達(dá)細(xì)胞。或者，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰激素分泌細(xì)胞。胃汰娜_尉普胃紐龍力___成,在本發(fā)明的一個(gè)方面，可通過(guò)用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞， 持續(xù)足以使所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的時(shí)間，而使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？捎煤斜景l(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約一天至約七天。作為另一種選擇，可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約一天至約六天。作為另一種選擇，可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約一天至約五天。作為另一種選擇， 可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約一天至約四天。作為另一種選擇，可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約一天至約三天。作為另一種選擇，可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約一天至約兩天。在一個(gè)實(shí)施例中，可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞約四天?？稍陲曫B(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)多能干細(xì)胞。或者，可在細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，將多能干細(xì)胞在涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)和分化。細(xì)胞外基質(zhì)可以是從小鼠肉瘤細(xì)胞提取的可溶性基底膜制劑(其可由BD Biosciences以商品名MATRIGEL 銷(xiāo)售)。作為另一種選擇，細(xì)胞外基質(zhì)可以是低生長(zhǎng)因子 MATRIGEL 。作為另一種選擇，細(xì)胞外基質(zhì)可以是纖粘蛋白。在一個(gè)替代實(shí)施例中，將多能干細(xì)胞在包被有人血清的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)和分化?？稍趯?duì)組織培養(yǎng)基底進(jìn)行包被前，將細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行稀釋。適用于稀釋細(xì)胞外基質(zhì)以及適用于包被組織培養(yǎng)基材的方法的例子可在如下文獻(xiàn)中找到=Kleinman, H. K.等人，Biochemistry 25 :312(1986)或 Hadley，Μ· Α·等人，J. Cell. Biol. 101 :1511 (1985)。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞外基質(zhì)是MATRIGEL 。在一個(gè)實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 10稀釋的MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 15稀釋的MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 30稀釋的MATRIGEL 。 在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 60稀釋的MATRIGEL 。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞外基質(zhì)是低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 。在一個(gè)實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 10稀釋的低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 15稀釋的低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 30稀釋的低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 60稀釋的低生長(zhǎng)因子MATRIGEL ?？捎煤斜景l(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞，所述肽已從表達(dá)所述肽的細(xì)胞的上清液純化。作為另一種選擇，可用含有本發(fā)明的肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞，所述肽未從表達(dá)所述肽的細(xì)胞的上清液純化。
在其中用含有未從表達(dá)本發(fā)明肽的細(xì)胞的上清液純化的所述肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞的情況中，可以約1 10稀釋度至約1 100的終濃度使用所述上清液。在一個(gè)實(shí)施例中，上清液以約1 10稀釋度至約1 50的終濃度使用。在一個(gè)實(shí)施例中，上清液以約1 10稀釋度至約1 40的終濃度使用。在一個(gè)實(shí)施例中，上清液以約1 20稀釋度至約1 50的終濃度使用。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQFFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNLGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQWFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFADMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQHFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFADLGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQNFVSFKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQHFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQWFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFALMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANKCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGRCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVSFKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQHFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQLFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANHCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANRGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSKMGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNTCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECMGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVSFKDIGffNDffIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQLGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQLFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANHCAGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDRGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQDFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNTCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPHANRGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNYCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQNFVS FKDIGffNDffIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNLCCKKQDFVS FKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMIVEECGCSo在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGR TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQTKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQRMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGK TKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞=GLEOTGKVNICCKKQEreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSFAQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCV。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCV。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCV。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSFSQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQTKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQMFGQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSFGK AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSFGK TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQQMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreR AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQRMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQMFGKAKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGS SLSFHSTVINHYRMRGHSPffANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD DGQNIIKKDIQRMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCV。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGK TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQRMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreR AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSFGK TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQLFGQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQTKDIGffNDffIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreR TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMVVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQGMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ TKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQNMKVEECGCT。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有如下肽的培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞GLE⑶GKVNICCKKQSreQ AKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD GQNIIKKDIQRMVAEECGCT。胃汰娜力陽(yáng)普胃紐龍;泖丨表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可通過(guò)在進(jìn)行特定方案之前或之后檢測(cè)該標(biāo)志物的存在來(lái)確定。多能干細(xì)胞通常不表達(dá)這類(lèi)標(biāo)志物。因而，當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)它們時(shí)即檢測(cè)到多潛能細(xì)胞的分化。可通過(guò)將處理過(guò)的細(xì)胞群體暴露于可特異性識(shí)別由表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的試劑(例如抗體)來(lái)確定分化效率。用于評(píng)估蛋白質(zhì)標(biāo)志物和核酸標(biāo)志物在培養(yǎng)的或分離的細(xì)胞中的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法包括定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、RNA印跡法、 原位雜交法(參見(jiàn)例如，Current Protocols in MolecularBiology (Ausubel 等人(編輯)，2001增補(bǔ)版))和免疫測(cè)定法(如對(duì)切片材料的免疫組織化學(xué)分析)、蛋白質(zhì)印跡法，對(duì)于在完整細(xì)胞中可接近的標(biāo)志物而言有流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)(參見(jiàn)例如，Harlow 禾口 Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1998))。例如，多能干細(xì)胞的特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且多能干細(xì)胞的其他特征不斷地被鑒別。多能干細(xì)胞標(biāo)志物包括(例如)一種或多種如下物質(zhì)的表達(dá):ABCG2、 cripto、F0XD3、連結(jié)素 43、連結(jié)素 45、0CT4、S0X2、Nanog, hTERT、UTFU ZFP42、SSEA-3、 SSEA-4、Tral-60 或 Tral-81。在用本發(fā)明方法處理多能干細(xì)胞后，可通過(guò)將處理過(guò)的細(xì)胞群體暴露于特異性識(shí)別由表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物(例如CXCR4)來(lái)進(jìn)行純化。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法或通過(guò)本發(fā)明提出的任何方法，使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)的方法，使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。可通過(guò)用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑KAAD-環(huán)巴胺處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后移除含有纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有視黃酸、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)例子在Nature Biotechnology 24， 1392-1401(2006)中公開(kāi)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào) 11/736，908中公開(kāi)的方法，通過(guò)用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞一段時(shí)間，來(lái)使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào) 11/779，311中公開(kāi)的方法，通過(guò)用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞一段時(shí)間，來(lái)使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)序列號(hào)為60/990，529的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)的方法， 通過(guò)處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，來(lái)使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？梢詫⒈磉_(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞用至少一種其他額外的因子進(jìn)行處理，這些因子可增強(qiáng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成。作為另一種選擇，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過(guò)本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增殖。另外，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過(guò)本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞形成其他細(xì)胞類(lèi)型的能力，或可改善任意其他額外分化步驟的效率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺、TGF-β家族的成員(包括TGF-i3 1、2和3)、血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA和-BB、富血小板血漿、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、II)、生長(zhǎng)分化因子(例如， GDF-5、-6、-8、-10、-ll)、胰胰高血糖素樣肽-I 和 II (GLP-I 和 II) ,GLP-I 和 GLP-2 模擬體 、毒蜥外泌肽-4、視黃酸、甲狀旁腺激素、胰島素、孕酮、抑酶肽、氫化可的松、乙醇胺、β巰基乙醇、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胃泌素I和II、銅螯合劑(例如，三亞乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β細(xì)胞素、ITS、成頭蛋白、神經(jīng)突生長(zhǎng)因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、 丁酸鈉、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132 (EMD, CA)、N2和B27添加劑(Gibco， CA)、甾體類(lèi)生物堿(例如，環(huán)巴胺(EMD，CA))、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂體提取物、胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)、印第安豪豬蛋白、音猬蛋白、蛋白酶體抑制劑、notch通路抑制劑、音猬蛋白抑制劑或它們的組合。所述至少一種其他額外的因子可由從胰腺細(xì)胞系(例如PANC-I (ATCC No CRL-1469)、CAPAN-I (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3 (ATCC No :CRL_1687)、HPAF-II (ATCC No CRL-1997))、肝細(xì)胞系例如 H印 G2(ATCC No :HTB_8065)、腸細(xì)胞系例如 FHs 74 (ATCC No: CCL-241)獲得的調(diào)理培養(yǎng)基提供。
胃汰娜力陽(yáng)普胃紐龍;泖丨胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且其他胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物不斷被鑒別。這些標(biāo)志物可用于確定根據(jù)本發(fā)明處理過(guò)的細(xì)胞是否已分化而獲得胰腺內(nèi)胚層譜系特征性特性。胰腺內(nèi)胚層譜系的特異性標(biāo)志物包括一種或多種轉(zhuǎn)錄因子，例如 Hlxb9、PTF-la、PDX-1、HNF-6、HNF-I β 的表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)將處理過(guò)的細(xì)胞群體暴露于可特異性識(shí)別由表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的試劑(例如抗體)來(lái)確定分化效率。用于評(píng)估蛋白質(zhì)標(biāo)志物和核酸標(biāo)志物在培養(yǎng)的或分離的細(xì)胞中的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法包括定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、RNA印跡法、原位雜交法(參見(jiàn)例如，Current Protocols inMolecular Biology (Ausubel 等人(編輯)， 2001增補(bǔ)版))和免疫測(cè)定法(如對(duì)切片材料的免疫組織化學(xué)分析)、蛋白質(zhì)印跡法，對(duì)于在完整細(xì)胞中可接近的標(biāo)志物而言有流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)(參見(jiàn)例如，Harlow和Lane， Using Antibodies :A Laboratory Manual, New York :CoId Spring HarborLaboratory Press (1998))ο徹4普胃紐龍;M勿_胞』_成,可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法或通過(guò)本發(fā)明公開(kāi)的任何方法，使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)的方法，使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)例子在 NatureBiotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除該含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的一個(gè)例子在 D’ Amour 等人，NatureBiotechnology, 2006 中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的一個(gè)例子在D’ Amour等人， NatureBiotechnology, 2006 中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的一個(gè)例子在D’ Amour等人， NatureBiotechnology, 2006 中公開(kāi)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/736，908中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào) 11/779,311中公開(kāi)的方法，通過(guò)用可抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào) 60/953，178中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)根據(jù)序列號(hào)為60/990，5 的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)的方法處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)的方法，所述方法包括用包含足量的TGF-β受體激動(dòng)劑的培養(yǎng)基處理表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)增加。所述TGF-β受體激動(dòng)劑可以是任何能結(jié)合并激活TGF-β受體的任何試劑。在一個(gè)實(shí)施例中，所述TGF-β受體激動(dòng)劑選自激活素Α、激活素B和激活素C。在一個(gè)替代實(shí)施例中，所述TGF-β受體激動(dòng)劑可以是激活素A的肽變體。這種肽變體的例子在轉(zhuǎn)讓給Centocor R&D，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)61/076，889中公開(kāi)。可以將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞用至少一種其他額外的因子進(jìn)行處理，這些因子可增強(qiáng)表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成。作為另一種選擇，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過(guò)本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增殖。另外，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過(guò)本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞形成其他細(xì)胞類(lèi)型的能力，或可改善任意其他額外分化步驟的效率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺、TGF-β家族的成員(包括TGF-i3 1、2和3)、血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA和-BB、富血小板血漿、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、II)、生長(zhǎng)分化因子(例如， GDF-5、-6、-8、-10、-ll)、胰胰高血糖素樣肽-I 和 II (GLP-I 和 II) ,GLP-I 和 GLP-2 模擬體 、毒蜥外泌肽-4、視黃酸、甲狀旁腺激素、胰島素、孕酮、抑酶肽、氫化可的松、乙醇胺、β巰基乙醇、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胃泌素I和II、銅螯合劑(例如，三亞乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β細(xì)胞素、ITS、成頭蛋白、神經(jīng)突生長(zhǎng)因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、 丁酸鈉、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132 (EMD, CA)、N2和B27添加劑(Gibco， CA)、甾體類(lèi)生物堿(例如，環(huán)巴胺(EMD，CA))、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂體提取物、胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)、印第安豪豬蛋白、音猬蛋白、蛋白酶體抑制劑、notch通路抑制劑、音猬蛋白抑制劑或它們的組合。所述至少一種其他額外的因子可由從胰腺細(xì)胞系(例如PANC-I (ATCC No CRL-1469)、CAPAN-I (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3 (ATCC No :CRL_1687)、HPAF-II (ATCC No CRL-1997))、肝細(xì)胞系例如 H印 G2(ATCC No :HTB_8065)、腸細(xì)胞系例如 FHs 74 (ATCC No: CCL-241)獲得的調(diào)理培養(yǎng)基提供。胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且其他胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物不斷被鑒別。這些標(biāo)志物可用于確定根據(jù)本發(fā)明處理過(guò)的細(xì)胞是否已分化而獲得胰腺內(nèi)分泌譜系特征性特性。胰腺內(nèi)分泌譜系特異性標(biāo)志物包括一種或多種轉(zhuǎn)錄因子例如NGN3、NEUROD或ISLl的表達(dá)。β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且其他β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物不斷被鑒別。這些標(biāo)志物可用于確定根據(jù)本發(fā)明處理過(guò)的細(xì)胞是否已分化而獲得β細(xì)胞譜系特征性特性。β細(xì)胞譜系特異性特征包括一種或多種轉(zhuǎn)錄因子例如， PDXl (胰十二指腸同源盒基因-1)、ΝΚΧ2. 2、ΝΚΧ6. 1、ISLU ΡΑΧ6、ΡΑΧ4、NEUROD, HNFl β、 HNF6、HNT3i3或MAFA等的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)分泌細(xì)胞鑒別領(lǐng)域中已得到公認(rèn)。參見(jiàn)(例如)Edlund (Nature Reviews Genetics 3:524—632(2002))?？赏ㄟ^(guò)將處理過(guò)的細(xì)胞群體暴露于可特異性識(shí)別由表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的試劑(例如抗體)來(lái)確定分化效率。作為另一種選擇， 可通過(guò)將處理過(guò)的細(xì)胞群體暴露于可特異性識(shí)別由表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的試劑(例如抗體)來(lái)確定分化效率。用于評(píng)估蛋白質(zhì)標(biāo)志物和核酸標(biāo)志物在培養(yǎng)的或分離的細(xì)胞中的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法包括定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、RNA印跡法、原位雜交法(參見(jiàn)例如，Current Protocols inMolecular Biology (Ausubel 等人(編輯)， 2001增補(bǔ)版))和免疫測(cè)定法(如對(duì)切片材料的免疫組織化學(xué)分析)、蛋白質(zhì)印跡法，對(duì)于在完整細(xì)胞中可接近的標(biāo)志物而言有流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)(參見(jiàn)例如，Harlow和Lane， Using Antibodies :A Laboratory Manual, New York :CoId Spring HarborLaboratory Press (1998))ο在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)在處理后測(cè)定給定細(xì)胞培養(yǎng)物中胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的百分比來(lái)確定分化的效率。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約100%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約90%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約80%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。 在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約70%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約60%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約50%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中， 本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約40%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約30%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約20%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約10%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約5%的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)測(cè)定葡萄糖刺激的胰島素分泌來(lái)確定分化的效率，胰島素分泌可通過(guò)測(cè)量由細(xì)胞釋放的C-肽的量測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約IOOOng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約900ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約800ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約700ng C-肽/pgDNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約600ng C-肽/pg DNA0在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約500ng C-肽/pg DNA0在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約400ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約500ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約400ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約300ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約200ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約IOOng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約90ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約80ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約70ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約60ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約50ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約40ng C-肽/pgDNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約30ng C-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約20ngC-肽/pg DNA。在一個(gè)替代實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞可產(chǎn)生約IOng C-肽/pg DNA。iX^在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有1型糖尿病，或有發(fā)展1型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法。本方法涉及對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使該多能干細(xì)胞體外分化成細(xì)胞譜系，并將該β-細(xì)胞譜系的細(xì)胞移植進(jìn)患者中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有2型糖尿病，或有發(fā)展2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法。該方法涉及將多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使該培養(yǎng)的細(xì)胞體外分化成 β -細(xì)胞譜系，并將該β -細(xì)胞譜系的細(xì)胞移植進(jìn)該患者中。如果合適，可用有利于該植入細(xì)胞存活和功能的藥劑或生物活性劑對(duì)患者進(jìn)行進(jìn)一步處理。這些試劑可包括(例如)胰島素、TGF-β家族的成員(包括TGF-i3 1、2和 3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子_1 和-2、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA和-BB、血小板富集血漿、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、II)、生長(zhǎng)分化因子(⑶F-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子(VEGF)、多效蛋白 (pleiotrophin)、內(nèi)皮素等等。其他的藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)和II、GLP-1和2模擬體 、毒蜥外泌肽_4、視黃酸、甲狀旁腺激素、MAPK抑制劑，例如已公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0209901和已公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/01327 中所公開(kāi)的化合物。可使多能干細(xì)胞在移植進(jìn)接受者前分化成胰島素生成細(xì)胞。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，在移植進(jìn)接受者之前，使多能干細(xì)胞完全分化成細(xì)胞。作為另一種選擇，可將多能干細(xì)胞以未分化狀態(tài)或部分分化的狀態(tài)移植進(jìn)接受者中?？稍谠摻邮苷咧邪l(fā)生進(jìn)一步分化。
可將定形內(nèi)胚層細(xì)胞或，作為另一選擇，胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞，或作為另一種選擇，β 細(xì)胞作為分散細(xì)胞進(jìn)行移植，或可將這些細(xì)胞形成簇，可將這些細(xì)胞簇輸注進(jìn)肝門(mén)靜脈內(nèi)。 作為另一種選擇，可將細(xì)胞設(shè)置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性裝置中或可進(jìn)行封裝以保護(hù)其免受宿主免疫應(yīng)答的破壞。可將細(xì)胞移植進(jìn)接受者中的合適位置內(nèi)。植入位點(diǎn)包括(例如)肝臟、原來(lái)的胰腺、腎包膜下空間、網(wǎng)膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮下袋。為了增強(qiáng)植入細(xì)胞的進(jìn)一步分化、存活率或活性，可在施用細(xì)胞之前、與其同時(shí)或之后施用額外的因子，例如生長(zhǎng)因子、抗氧化劑或抗炎劑。在某些實(shí)施例中，將生長(zhǎng)因子用于使所施用的細(xì)胞在體內(nèi)分化。這些因子可由內(nèi)源性細(xì)胞分泌并原位暴露于所施用的細(xì)胞。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的內(nèi)源生長(zhǎng)因子或外源施用的生長(zhǎng)因子的任意組合來(lái)誘導(dǎo)植入細(xì)胞進(jìn)行分化。移植中所用的量取決于多種因素，包括患者的狀況和對(duì)該療法的響應(yīng)，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有糖尿病，或有發(fā)展糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法。該方法涉及培養(yǎng)多能干細(xì)胞、使該培養(yǎng)的細(xì)胞體外分化成細(xì)胞譜系，并將該細(xì)胞摻入三維的支持物中。在移植進(jìn)患者前，可將該細(xì)胞在該支持物上體外維持。作為另一種選擇，可將包含該細(xì)胞的支持物直接移植進(jìn)患者中而無(wú)需進(jìn)行額外的體外培養(yǎng)?？扇芜x將至少一種有利于植入細(xì)胞的存活和功能的藥劑摻入該支持物中。適用于本發(fā)明目的的支持材料包括可用于組織修復(fù)的組織模板、導(dǎo)管、屏障物和貯器。具體地講，已經(jīng)在體外和體內(nèi)用于生物組織重建或再生，以及用于遞送趨化劑來(lái)誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織物和非織造結(jié)構(gòu)形式的合成材料和天然材料適用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。參見(jiàn)，例如在美國(guó)專(zhuān)利5，770，417、美國(guó)專(zhuān)利6，022，743、美國(guó)專(zhuān)利5，567，612、美國(guó)專(zhuān)利5，759，830、美國(guó)專(zhuān)利6，626，950、美國(guó)專(zhuān)利6，534，084、美國(guó)專(zhuān)利 6，306，424、美國(guó)專(zhuān)利6，365，149、美國(guó)專(zhuān)利6，599，323、美國(guó)專(zhuān)利6，656，488、美國(guó)已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0062753Α1、美國(guó)專(zhuān)利4，557，264和美國(guó)專(zhuān)利6，333，029中所公開(kāi)的材料。為了形成含有藥劑的支承體，可在形成支承體前將藥劑與聚合物溶液混合。作為另一種選擇，可將藥劑涂覆于制好的支持物上，優(yōu)選在存在藥物載體的情況下進(jìn)行。藥物可以液體、細(xì)分固體或任何其他合適的物理形式存在。作為另一種選擇，可將賦形劑加入支持物中以改變藥劑的釋放速率。在一個(gè)替代實(shí)施例中，將至少一種為抗炎化合物的藥物化合物摻入支持物中，例如在美國(guó)專(zhuān)利6，509，369中所公開(kāi)的化合物。可將至少一種為抗凋亡化合物的藥物化合物摻入支持物中，例如在美國(guó)專(zhuān)利 6，793，945中所公開(kāi)的化合物?？蓪⒅辽僖环N為纖維變性抑制劑的藥物化合物摻入支持物中，例如在美國(guó)專(zhuān)利 6，331，298中所公開(kāi)的化合物。支持物還可摻有至少一種能夠增強(qiáng)血管生成的藥物化合物，例如美國(guó)已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0220393和美國(guó)已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0209901中所公開(kāi)的化合物。支持物還可摻有至少一種為免疫抑制化合物的藥物化合物，例如美國(guó)已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0171623中所公開(kāi)的化合物。支持物還可摻有至少一種為生長(zhǎng)因子的藥物化合物，例如TGF-β家族的成員(包括 TGF-β 1、2 和 3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(ΒΜΡ-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12 和-13)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1和_2、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA和-ΒΒ、血小板富集血漿、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、II)、生長(zhǎng)分化因子(⑶F-5、-6、-8、-10、-15)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子(VEGF)、多效蛋白、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、缺氧誘導(dǎo)因子1- α、高血糖素樣肽-I (GLP-I)、GLP-I和GLP-2模擬體 和毒蜥外泌肽-4、nodal、成頭蛋白、NGF、視黃酸、甲狀旁腺激素、腱生蛋白-C、彈性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凱薩林菌素 (cathelicidin)、防御素(defensin)、層粘連蛋白、含有粘附性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如纖粘蛋白和玻璃粘連蛋白的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物肽、MAH(抑制劑(例如在美國(guó)已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0209901和美國(guó)已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/01327 中所公開(kāi)的化合物)。可通過(guò)將細(xì)胞簡(jiǎn)單地沉積在該支架上來(lái)實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明細(xì)胞摻入支架中。細(xì)胞可通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散進(jìn)入支架中(J. Pediatr. Surg. 23(1 Pt 2) :3-9(1988)).已經(jīng)發(fā)展了若干其他方法來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞接種的效率。例如，已經(jīng)將轉(zhuǎn)瓶用于將軟骨細(xì)胞接種于聚乙醇酸支架上 (Biotechnol. Prog. 14(2) 193-202 (1998)。用于細(xì)胞接種另一種方法是利用離心，這種離心產(chǎn)生最小的應(yīng)力給接種的細(xì)胞并增強(qiáng)接種效率。例如，Yang等人發(fā)展了一種細(xì)胞接種方法(J. Biomed. Mater. Res. 55(3) :379-86 Q001))，稱為離心細(xì)胞固定(Centrifugational Cell Immobilization, CCI)。本發(fā)明通過(guò)(但不限于)以下實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)例實(shí)例1 本發(fā)明的肽的設(shè)計(jì)該工作的目的是，基于可利用的配體的結(jié)構(gòu)信息和已知的激活素肽及TGF-β家族的其他成員各自的配體-受體相互作用來(lái)設(shè)計(jì)激活素A的變體肽。對(duì)激活素A的兩種晶體結(jié)構(gòu)(Inyu 禾口 ls4Y，可在 Protein databank :http //www. rcsb. org 找至Ij )的分析鑒定了多個(gè)可進(jìn)行突變的氨基酸殘基。選擇位于同型二聚體界面的殘基進(jìn)行突變。盡管一部分該二聚體界面殘基是共同的，但晶體中單體的相對(duì)取向有顯著差異。因而，選擇了獨(dú)立的兩組殘基，每一組基于各自的晶體結(jié)構(gòu)。未對(duì)半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸殘基進(jìn)行改變，因?yàn)檫@些殘基通常在蛋白質(zhì)中起著獨(dú)特的結(jié)構(gòu)性作用，例如就半胱氨酸而言，可形成二硫鍵，或者就甘氨酸和脯氨酸殘基而言，可使得形成其他殘基無(wú)法觸及的主鏈角度。利用pdb號(hào)為Inyu的激活素A復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，針對(duì)如下位點(diǎn)進(jìn)行突變101、 16F、39Y、41E、43E、74F、75A、76N、77L、78K、79S、82V。利用 pdb 號(hào)為 ls4y 的激活素 A 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，針對(duì)如下位點(diǎn)進(jìn)行突變16F、18V、19S、20F、37A、38N、39Y、41E、74F、82V、107N、 109I、110V、116S。將程序Rosetta (參見(jiàn)例如 Simons 等人，Mol Biol，268，209-225，1997 和 Simons， K. Τ.等人，Proteins, 34,82-95,1999)用于對(duì)激活素配體的兩條鏈中的所選殘基進(jìn)行組合突變。該程序?qū)λ?0種氨基酸每一者選取側(cè)鏈構(gòu)象的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，并用Metropolis蒙特卡羅方法搜索在能量上有利的構(gòu)象。選擇了總共93種設(shè)計(jì)以及野生型激活素A肽序列。 根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)這些序列進(jìn)行測(cè)試。表1列出了本發(fā)明的肽的氨基酸序列。ACTm是野生型激活素分子。ACTN 2至ACTN 48是使用晶體結(jié)構(gòu)Inyu計(jì)算得到的本發(fā)明的肽序列。 ACTN 49至ACTN 94是使用晶體結(jié)構(gòu)ls4y計(jì)算得到的本發(fā)明的肽序列。沒(méi)有兩條肽序列是相同的。所述肽序列中的變化在圖1(ACTN 2至ACTN 48)和圖2(ACTN 49至ACTN 94)中以系統(tǒng)樹(shù)示出。實(shí)例2 本發(fā)明的肽的克降和表汰設(shè)計(jì)了編碼表1所列肽的基因用以克隆進(jìn)表達(dá)載體中。基于關(guān)于激活素A和 TGF-β家族其他成員的前體形式的蛋白酶解加工的科學(xué)文獻(xiàn)，將表達(dá)構(gòu)建體設(shè)計(jì)為含有激活素A的完整前體形式(原區(qū)加成熟區(qū))。產(chǎn)生了野生型激活素A前體表達(dá)構(gòu)建體以使得能通過(guò)將僅含有成熟蛋白區(qū)的編碼序列克隆進(jìn)該野生型激活素A構(gòu)建體而隨后構(gòu)建全部激活素A變體表達(dá)構(gòu)建體。因而，所有表達(dá)構(gòu)建體具有相同的激活素A原區(qū)。根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Centocor R&D Inc.的美國(guó)專(zhuān)利中6，670，127和6，521，427中公開(kāi)的方法，利用人密碼子偏好性，將表1中的野生型激活素A和全部93種設(shè)計(jì)的變體的氨基酸序列回譯成DNA序列。表2中列出了 DNA序列。使用野生型激活素A的原區(qū)的天然氨基酸序列和天然DNA序列(未進(jìn)行回譯)并分別表1和表2中列出。然后通過(guò)使用 GENEWRITER 技術(shù)(Centocor R&D，US)將序列分解成較小的片段并合成這些寡核苷酸，然后用RP HPLC(Dionex, Germany)進(jìn)行純化，來(lái)產(chǎn)生由單種原結(jié)構(gòu)域和94種成熟蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成的每種DNA序列。然后用轉(zhuǎn)讓給Centocor R&D Inc.的美國(guó)專(zhuān)利6，670，127和 6，521，427中公開(kāi)的方法，將每種DNA序列的純化的寡核苷酸獨(dú)立地組裝成全長(zhǎng)DNA片段。第一步，在用整個(gè)變體庫(kù)進(jìn)行處理前，制備含有野生型激活素(ACTN 1)的表達(dá)構(gòu)建體以評(píng)價(jià)表達(dá)系統(tǒng)。利用)CbaI和NotI位點(diǎn)(圖3中的斜體)，將激活素A原區(qū)域DNA片段克隆進(jìn)pcDNA3. 1(-) (Invitrogen,目錄號(hào)V795_20)中。然后利用SgrAI (帶下劃線的粗體)和NotI位點(diǎn)(圖4)，將編碼激活素A成熟蛋白的DNA片段克隆進(jìn)該原區(qū)構(gòu)建體并框內(nèi)融合至該原區(qū)，從而產(chǎn)生全長(zhǎng)的前體表達(dá)構(gòu)建體(圖5)。然后將編碼變體ACTN 2至ACTN 8的成熟蛋白質(zhì)的DNA片段以相似方式克隆進(jìn)原區(qū)構(gòu)建體以產(chǎn)生這些變體的前體表達(dá)構(gòu)建體。作為陽(yáng)性對(duì)照，從OriGene Technologies, Inc.(目錄號(hào)TC118774)商購(gòu)獲得人激活素A表達(dá)構(gòu)建體。該克隆中的激活素A的mRNA的登錄號(hào)為NM_002192. 2，該哺乳動(dòng)物表達(dá)載體為 pCMV6-XL4?；驑?gòu)建體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)比較ACTN 1和OriGene野生型激活素A前體構(gòu)建體的表達(dá)和活性，以確定ACTN 1構(gòu)建體是否將產(chǎn)生活性分子。細(xì)胞維持將HEK293-E細(xì)胞在^3FreeMyle培養(yǎng)基Qnvitrogen ；目錄號(hào) 12338)中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞濃度在1.5和2. OX IO6個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，將細(xì)胞稀釋至2. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞在37°C和8% CO2下，在以125RPM搖動(dòng)的增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。激活素A變體的轉(zhuǎn)染在單獨(dú)的裝有20ml培養(yǎng)基的125ml搖瓶(Corning ；目錄號(hào)43114 中，將變體轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293-E細(xì)胞中。將細(xì)胞稀釋至1. O X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總 DNA (25 μ g)稀釋進(jìn) 1. Oml 的 Opti-Pro (Invitrogen ；目錄號(hào)12309)并將 25 μ 1 的 FreeStyle Max 轉(zhuǎn)染試劑 Qnvitrogen ；目錄號(hào)16447)稀釋進(jìn) 1. Oml 的 Opti-Pro 中。將稀釋的DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將^iil DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。通過(guò)以5，000Xg離心10分鐘將上清液從細(xì)胞分離并濾過(guò)0.2μπι過(guò)濾器 (Cotning;目錄號(hào)431153)，然后用 Amicon Ultra 濃縮器 IOK (目錄號(hào):UFC901096)濃縮 10倍和50倍，并以3，750 Xg離心大約10分鐘。在基于細(xì)胞的測(cè)定法中檢查濃縮上清液和未濃縮上清液，測(cè)量本發(fā)明的肽使人胚胎干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力(參見(jiàn)實(shí)例6)，以S0X17 強(qiáng)度作為示值讀數(shù)。來(lái)自O(shè)riGene野生型構(gòu)建體的濃縮上清液和未濃縮上清液兩者均比來(lái)自ACTN 1構(gòu)建體的濃縮上清液具有高很多的活性(S0X17強(qiáng)度)(圖6)。該結(jié)果導(dǎo)致決定來(lái)將ACTN 1構(gòu)建體的pcDNA3. 1 (-)表達(dá)載體改成Centocor哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pUnder，后者具有一貫較好的表達(dá)特性，有可能是由于在核心CMV啟動(dòng)子上游包括了完整的內(nèi)含子A。利用EcoRI和HindIII位點(diǎn)(灰色粗體，圖7A和7B)將全長(zhǎng)的ACTm前體基因從 pcDNA3. 1 (-)亞克隆進(jìn)pUnder中。將該新的ACTN 1野生型激活素A構(gòu)建體連同OriGene 構(gòu)建體兩者均獨(dú)立地轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO-S或HEK293-F細(xì)胞中。如上所述制備上清液并檢測(cè)激活素A活性。在基于細(xì)胞的測(cè)定法中發(fā)現(xiàn)來(lái)自ACTN IpUnder構(gòu)建體的上清液比來(lái)自O(shè)riGene 野生型構(gòu)建體具有更高的活性(通過(guò)細(xì)胞數(shù)目和S0X17強(qiáng)度增加來(lái)判斷)(圖8A和8B)。因?yàn)閬?lái)自pUnder構(gòu)建體的ACTN 1的表達(dá)導(dǎo)致上清液的活性水平比來(lái)自相應(yīng)的 pcDNA3. 1 (-)構(gòu)建體的要高，所以隨后對(duì)于整個(gè)激活素A變體庫(kù)，在pUnder中產(chǎn)生全長(zhǎng)前體表達(dá)構(gòu)建體。利用SgrAI和NotI克隆位點(diǎn)(帶下劃線的粗體和斜體，圖7A和7B)，將所述變體的僅跨越成熟蛋白區(qū)的DNA片段每一者亞克隆進(jìn)pUnder中，替代ACTN 1成熟蛋白編碼序列，而仍然保留原區(qū)完整。激活素A變體的轉(zhuǎn)染在單獨(dú)的裝有20ml培養(yǎng)基的125ml搖瓶(Corning ；目錄號(hào)43114 中，將變體轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293-F細(xì)胞中。將細(xì)胞稀釋至1. O X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總 DNA (25 μ g)稀釋進(jìn) 1. Oml 的 Opti-Pro (Invitrogen ；目錄號(hào)12309)并將 25 μ 1 的 FreeStyle Max 轉(zhuǎn)染試劑 Qnvitrogen ；目錄號(hào)16447)稀釋進(jìn) 1. Oml 的 Opti-Pro 中。將稀釋的DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將^iil DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。使用前七種激活素A變體(ACTN 2至ACTN 8)的pUnder表達(dá)構(gòu)建體，對(duì)所產(chǎn)生的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。包括OriGene和ACTN 1激活素A野生型對(duì)照在內(nèi)。這兩種對(duì)照蛋白質(zhì)的表觀分子量類(lèi)似并且與所計(jì)算的分子量26kD —致。觀察到幾種變體有表達(dá)， 但變體之間的表達(dá)水平不一致(圖9)。這總體上表明，某些變體中的氨基酸置換沒(méi)有影響表達(dá)，且仍允許前體蛋白的正確加工。還通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析了來(lái)自pUnder表達(dá)構(gòu)建體(總共39種)的第二組上清液。 大多數(shù)變體的表達(dá)未能檢測(cè)到(數(shù)據(jù)未示出)。圖10中僅示出了具有可檢測(cè)信號(hào)的那些變體的蛋白質(zhì)印跡。以該方式對(duì)其余的變體的表達(dá)進(jìn)行了分析。實(shí)例3和4的背景本發(fā)明的肽的親和純化該部分的目標(biāo)是發(fā)展激活素A變體的親和純化的手段。第一種方法稱為bis-his， 是將金屬結(jié)合位點(diǎn)引入本發(fā)明的肽的氨基酸序列中，這將使得每種變體能選擇性地結(jié)合至金屬親和基質(zhì)。如果可鑒定到bis-his變體以高的親和性結(jié)合至該基質(zhì)并且對(duì)所有的激活素A變體均適用，則可在基因組裝時(shí)整合進(jìn)該bis-his位點(diǎn)。然而，因?yàn)檫@些變體將會(huì)以比具有多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)低的親和性結(jié)合，所以能否與具有類(lèi)似金屬結(jié)合位點(diǎn)的其他內(nèi)源性蛋白質(zhì)完全分離是不確定的。為了解決這一問(wèn)題，還采用了卵泡抑素親和基質(zhì)，該基質(zhì)將特異性結(jié)合所有激活素A變體。盡管該方法涉及表達(dá)和純化卵泡抑素并隨后產(chǎn)生卵泡抑素親和基質(zhì)，但其還可以有助于其他TGF-β家族成員的純化。這些方法在下面實(shí)例3和4 中描述。實(shí)例3 本發(fā)明的肽的金屬螯合純化第一種方法涉及工程改造分子以選擇性地結(jié)合金屬親和色譜基質(zhì)。工程改造過(guò)的蛋白質(zhì)可帶有增強(qiáng)該蛋白質(zhì)純化的肽序列標(biāo)簽。將一系列組氨酸殘基整合進(jìn)肽序列是一個(gè)借此可用固定化金屬親和色譜來(lái)純化所關(guān)注的蛋白質(zhì)的例子。IMAC是基于組氨酸殘基與金屬(例如鈷、鎳或鋅)的配位共價(jià)結(jié)合。結(jié)合后，可通過(guò)PH的改變或通過(guò)添加競(jìng)爭(zhēng)性分子(例如咪唑)來(lái)洗脫，從而提供一定程度的純化。通常，將組氨酸殘基引入N或C 端。然而，由于激活素A表達(dá)為前體肽，在該前體肽中N端要被切除，N端標(biāo)簽將會(huì)在細(xì)胞內(nèi)加工過(guò)程中喪失。此外，添加C端標(biāo)簽據(jù)懷疑可阻止該分子的正確二聚化和加工。參見(jiàn)例如 Pangas，S.和 Woodruff，Τ. ;J. Endocrinology，第 172 卷，第 199-210 頁(yè)，2002 年。因而，選擇成熟激活素A序列內(nèi)的內(nèi)部位置用于用組氨酸殘基置換以產(chǎn)生合成的金屬結(jié)合位點(diǎn)。該方法引入兩個(gè)暴露于溶劑的組氨酸殘基，這兩個(gè)組氨酸殘基由α螺旋的單個(gè)轉(zhuǎn)角分開(kāi)(His-X3-His)或處于β片層中的兩個(gè)分開(kāi)的位置(His-X-His)。參見(jiàn)例如Sub等人， Protein Engineering，第4卷，第3期，第301-305頁(yè)，1991年。表3示出了其中已進(jìn)行組氨酸置換的所選肽的氨基酸序列。含有組氨酸置換的本發(fā)明的肽的轉(zhuǎn)染根據(jù)實(shí)例2所述方法，產(chǎn)生編碼表3中所列肽的基因序列并將其插入PUnder載體。如下對(duì)HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染當(dāng)天， 在單獨(dú)的2L搖瓶(每種載體一個(gè))(Corning目錄號(hào)431255)將細(xì)胞在750ml的培養(yǎng)基中稀釋至 1.0X IO6 個(gè)細(xì)胞 /ml。將總 DNA(937. 5 μ g)稀釋進(jìn) 7. 5ml 的 Opti-Pro (Invitrogen ； 目錄號(hào):12309)并將 937. 5 μ 1 的 FreeStyle Max 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen ；目錄號(hào)16447) 稀釋進(jìn)7. 5ml的Opti-Pro中。將稀釋的DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將15ml DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。含組氨酸置換的本發(fā)明的肽的純化采用固定化金屬螯合親和色譜(IMAC)的純化用GE Healthcare的Unicorn 軟件在AKTA FPLC色譜系統(tǒng)上進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，在轉(zhuǎn)染后四天收獲來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293-F細(xì)胞的細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)使之澄清，并過(guò)濾(0. 2 μ m PES膜，Corning)。用激活素A ELISA(R&D Systems ；目錄號(hào)DY338)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定特定蛋白質(zhì)的相對(duì)量。用 LV Centramate(Pall)濃縮器將樣品濃縮4倍并通過(guò)使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)1203)的蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)。圖11示出了各上清液4倍濃縮后數(shù)種肽變體的代表性圖。然后將濃縮的樣品用 IOx PBS稀釋至Ix PBS的終濃度，再次用0. 2 μ m的膜過(guò)濾。以大約IOmg蛋白質(zhì)/ml樹(shù)脂的相對(duì)濃度將稀釋的上清液上樣至平衡OOmM磷酸鈉，0. 5M NaCl,pH7. 4)過(guò)的HisTrap柱 (GE Healthcare)上。上樣后，洗滌柱子并用20柱體積用線性梯度的咪唑(0-500mM)洗脫蛋白質(zhì)。圖12示出了肽變體ACTD20的代表性IMAC純化曲線。收集峰級(jí)分，并在4°C下相對(duì)于PBS，pH 7透析過(guò)夜。從透析液移出蛋白質(zhì)，過(guò)濾(0.2 4!11)，通過(guò)在嫩而01^^分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)上測(cè)量^Onm下的吸光度來(lái)確定總蛋白質(zhì)濃度。如先前所述，用激活素A ELISA確定特定蛋白質(zhì)的濃度。如有必要，用IOK截留分子量(MWCO)離心濃縮器(Millipore)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮。通過(guò)SDS-PAGE和使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體(R&D Systems ；目錄號(hào)1203) 的蛋白質(zhì)印跡評(píng)價(jià)純化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。圖13示出了來(lái)自六種代表性肽純化的咪唑級(jí)分的蛋白質(zhì)印跡洗脫圖。將純化的蛋白質(zhì)在4°C下保存。正如所預(yù)期的，所檢驗(yàn)的所有單bis-his對(duì)構(gòu)建體均被阻留在金屬親和色譜基質(zhì)上。然而，由于這些點(diǎn)突變導(dǎo)致形成單個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，與基質(zhì)結(jié)合是非特異性的，所述變體與含有類(lèi)似位點(diǎn)的其他蛋白質(zhì)一同被洗脫。為了增強(qiáng)特異性結(jié)合和駐留，將另外的一對(duì)組氨酸殘基添加至每一 K7H/N9H單對(duì)構(gòu)建體(表4)。再次，每種雙bis-his構(gòu)建體在金屬親和基質(zhì)上展現(xiàn)出明顯的富集以及與非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)清楚地分開(kāi)。還將第三對(duì)組氨酸殘基添加至這些構(gòu)建體中分離最好的構(gòu)建體(從ACTN 34得到ACTD 23)以圖進(jìn)一步增加與非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的分離。然而，這些分子沒(méi)有展現(xiàn)出優(yōu)于雙bis-his構(gòu)建體的特異性駐留。實(shí)例4 本發(fā)明的肽的卵泡抑素純化采取了針對(duì)純化一系列激活素A變體的第二種方法，以利用卵泡抑素和激活素A 之間的高度親和相互作用。卵泡抑素是天然的激活素A拮抗劑，從而抑制I型和II型受體相互作用兩者。由于本發(fā)明中的變體包含二聚體界面中而不是受體結(jié)合界面中的改變，所以由于未對(duì)受體結(jié)合表面進(jìn)行改變，卵泡抑素是用于親和基質(zhì)的合理選擇。卵泡抑素288 和315(分別是卵泡抑素的殘基1-288和1-315)以非常高的親和力(大約300pM)結(jié)合激活素A，而卵泡抑素12和123(分別是卵泡抑素的殘基64-212和殘基64-288)以適度的親和力(大約400nM)結(jié)合。所測(cè)試的卵泡抑素構(gòu)建體包括卵泡抑素12(FS12)、卵泡抑素 288 (FS288)和卵泡抑素315 (FS315)，參見(jiàn)表5。對(duì)這些構(gòu)建體每一者進(jìn)行設(shè)計(jì)以進(jìn)行哺乳動(dòng)物表達(dá)，其含有多組氨酸標(biāo)簽以用于金屬親和純化。卵泡抑素變體的克隆分別在表6和表7中給出了三種帶多組氨酸標(biāo)簽的所設(shè)計(jì)的卵泡抑素基因變體ACTA 1、ACTA2和ACTA 3的蛋白質(zhì)序列和基因序列。合成所述基因并如實(shí)例2中針對(duì)激活素A基因變體所描述的進(jìn)行組裝。使用在每種基因序列的前面和后面的EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)，將組裝好的基因利用載體的獨(dú)特EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)克隆進(jìn)Centocor pUnder哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中(在實(shí)例2中有詳細(xì)描述)。卵泡抑素變體表達(dá)的評(píng)價(jià)在單獨(dú)的裝有750ml培養(yǎng)基的2L搖瓶(每種載體一個(gè))(Corning ；目錄號(hào)431255)中，用HEK293-F細(xì)胞轉(zhuǎn)染變體(ACTA1、ACTA2和 ACTA3)。將細(xì)胞稀釋至1. OX IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總DNA (937. 5 μ g)稀釋進(jìn)7. 5ml的 Opti-Pro(Invitrogen ；目錄號(hào)12309)并將 937. 5 μ 1 的 FreeMyle Max 轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen ；目錄號(hào)16447)稀釋進(jìn)7. 5ml的Opti-Pro中。將稀釋的DNA添加至稀釋的 Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將15ml DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。在轉(zhuǎn)染后四天收獲細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)使之澄清，并過(guò)濾(0. 2 μ m PES膜，Corning)。通過(guò)使用用于檢測(cè)的抗卵泡抑素抗體(R&DSystems ；目錄號(hào)669)或抗五-組氨酸抗體^jiagen ； 目錄號(hào)34660)的蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)卵泡抑素變體的表達(dá)。圖14示出了來(lái)自培養(yǎng)物上清液的卵泡抑素變體表達(dá)的代表性蛋白質(zhì)印跡。選擇一種變體(ACTA 3)用于放大表達(dá)和純化。ACTA 3的放大表達(dá)將HEK293-F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)Applikon生物反應(yīng)器中。在轉(zhuǎn)染前當(dāng)天，以4. OX IO6個(gè)細(xì)胞/ml對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行接種?？刂品磻?yīng)器在頂部空間具有空氣，監(jiān)控A并通過(guò)噴射控制為50%。通過(guò)(X)2和碳酸氫鈉控制pH。用marine攪拌葉輪以 115RPM攪拌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，將pH保持為7. 2，然后在轉(zhuǎn)染時(shí)降至6. 8。在轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞濃度為1. OX IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總DNA(1. 25mg/L)稀釋進(jìn)50ml/L 的 Opti-Pro 中，并將 1. 25ml/L 的 FreeStyleMax 轉(zhuǎn)染試劑稀釋進(jìn) 50ml/L 的 Opti-Pro 中。 將稀釋的DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將100ml/L的DNA Max復(fù)合物等分試樣添加至生物反應(yīng)器并培養(yǎng)96小時(shí)。ACTA3的金屬螯合純化使用GE Healthcare’ s Unicorn 軟件在AKTAFPLC色譜系統(tǒng)上進(jìn)行純化。在轉(zhuǎn)染后四天收獲細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)澄清，過(guò)濾(0. 2 μ m PES膜，Corning)，并用Centramate(Pall)濃縮器濃縮至少于1L。然后將濃縮的樣品用 IOx PBS稀釋至Ix PBS的終濃度，再次用0. 2 μ m的膜過(guò)濾。以大約IOmg蛋白質(zhì)/ml樹(shù)脂的相對(duì)濃度將稀釋的上清液上樣至平衡OOmM磷酸鈉，0. 5M NaCl, pH7. 4)過(guò)的HisTrap 柱(GE Healthcare)上。上樣后，洗滌柱子并用分級(jí)梯度的咪唑(10mM、50mM、150mM、250mM 和500mM)洗脫蛋白質(zhì)。圖15A示出了卵泡抑素變體ACTA3的代表性IMAC純化曲線。圖 15B示出了上圖中的IMAC純化洗脫曲線的SDSPAGE。收集用150mM咪唑洗脫的峰級(jí)分并用10K MWCO離心式濃縮器(Millipore)濃縮。將濃縮材料上樣至平衡(PBS，pH7)過(guò)的 ^/60Superdex200柱(GE Healthcare)上，通過(guò)尺寸排阻色譜純化。收集含有ACTA3的級(jí)分并用10K MWCO離心式濃縮器(Millipore)濃縮。通過(guò)在NAN0DR0P 分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)上測(cè)量^Onm下的吸光度來(lái)確定純化的ACTA3的濃度。通過(guò)SDS-PAGE 評(píng)估所純化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。將純化的蛋白質(zhì)在4°C下保存。ACTA 3與NHS-瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)根據(jù)隨樹(shù)脂提供的生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行與 NHS-瓊脂糖凝膠(GE Healthcare)的偶聯(lián)。簡(jiǎn)而言之，將所純化的卵泡抑素在4°C下透析過(guò)夜進(jìn)偶聯(lián)緩沖液(0. 2MNaHC03, 0.5M NaCl pH8. 3)中。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)制備N(xiāo)HS-瓊脂糖凝膠并添加至所透析的蛋白質(zhì)。在4°C下使偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生過(guò)夜。第二天根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)洗滌卵泡抑素-NHS-瓊脂糖凝膠樹(shù)脂并用PBS，pH7平衡。使用ACTA 3親和色譜純化本發(fā)明的肽簡(jiǎn)而言之，在轉(zhuǎn)染后4天收獲來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293-F細(xì)胞的細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)澄清，并過(guò)濾(0. 2 μ m PES 膜，Corning)。通過(guò)激活素A ELISA (R&D Systems ；目錄號(hào)DY338)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定特定蛋白質(zhì)的相對(duì)量。使用LV Centramate(Pall)濃縮器將樣品濃縮至少于或等于 IOOml0然后將濃縮的樣品用IOx PBS稀釋至Ix PBS的終濃度，再次用0. 2 μ m的膜過(guò)濾。 將平衡過(guò)的ACTA 3親和樹(shù)脂添加至稀釋的上清液，將該漿料在4°C下孵育過(guò)夜。在接下來(lái)的一天，洗滌柱子并用10柱體積0. IM甘氨酸，PH2.5洗脫蛋白質(zhì)。立刻通過(guò)洗脫進(jìn)裝有 10%級(jí)分體積的1.0M Tris, pH 9的試管中(即如果收集Iml的洗出液，試管則預(yù)先裝有 0. Iml Tris緩沖液)來(lái)中和所洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分。收集峰級(jí)分，并在4°C下相對(duì)于PBS，pH 7透析過(guò)夜。移出所透析的蛋白質(zhì)，過(guò)濾(0. 2 μ m)，通過(guò)在NAN0DR0P 分光光度計(jì)(ThermoFisher Scientific)上測(cè)量^Onm下的吸光度來(lái)確定蛋白質(zhì)濃度。如有必要，用IOK截留分子量(MWCO)離心濃縮器(Millipore)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮。通過(guò)SDSPAGE和蛋白質(zhì)印跡評(píng)估所純化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。圖16示出了肽變體ACTN 1的代表性純化，該圖使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)3381)(圖16A)或抗前體抗體(R&DSystems ； 目錄號(hào)120 (圖16B)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡或通過(guò)銀染色(圖16C)產(chǎn)生。將純化的蛋白質(zhì)在 4°C下保存。實(shí)例5 人配體干細(xì)胞培養(yǎng)從WiCell Research hstitute，he. (Madison，WI)獲得人胚胎干細(xì)胞系 HI、 H7和H9，并根據(jù)該來(lái)源公司提供的說(shuō)明進(jìn)行培養(yǎng)。也可將人胚胎干細(xì)胞接種于包被有以 1 30稀釋的低生長(zhǎng)因子MATRIGEL (BDBiosciences ；目錄號(hào)356231)的板上并在補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems ；目錄號(hào)233_FB)的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用膠原酶 IV(Invitrogen/GIBCO ；目錄號(hào)17104-019)、分散酶(Invitrogen ；目錄號(hào):17105-041)或釋放酶CI酶(Roche ；目錄號(hào)11814435001)將在MATRIGEL 上培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代。實(shí)例6 激活素A牛物測(cè)定法激活素A是多種細(xì)胞類(lèi)型分化的重要介體。當(dāng)用激活素A和Wnt3a的組合處理人胚胎干細(xì)胞時(shí)，代表定形內(nèi)胚層的多種基因上調(diào)。測(cè)量人胚胎干細(xì)胞中的這種分化的生物測(cè)定法以小型化設(shè)計(jì)適于用于篩選目的96孔板。利用采用市售激活素A和Wnt3a重組蛋白的處理并測(cè)量被視為定形內(nèi)胚層的代表性標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄因子S0X17的蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)完成驗(yàn)證?；罴?xì)胞測(cè)定法簡(jiǎn)而言之，將Hl或H9人胚胎干細(xì)胞簇在低生長(zhǎng)因子 MATRIGEL (Invitrogen ；目錄號(hào)356231)包被的組織培養(yǎng)塑料上培養(yǎng)。細(xì)胞通過(guò)以下方式來(lái)傳代利用膠原酶(Invitrogen ；目錄號(hào)17104-019)處理并小心刮擦、洗滌以除去殘余酶，并以1 1(表面面積)的比例接種于低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的96孔板(黑色，96 孔，PackardViewPlates ；目錄號(hào)=6005182)上。讓細(xì)胞成簇貼附，然后在1至3天時(shí)間內(nèi)恢復(fù)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，每天用補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF (R&D Systems ；目錄號(hào)233_FB)的MEF調(diào)理培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在測(cè)定法的最開(kāi)始將各板的孔在PBS中洗滌兩次，然后將DMEM:F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (Invitrogen ；目錄號(hào)=11330-032)中的測(cè)試樣品的等分試樣(100 μ 1)添加至各孔。測(cè)試條件一式三份進(jìn)行，在總共四天測(cè)定期間每隔一天通過(guò)從各孔抽吸出培養(yǎng)基并用測(cè)試樣品替換培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。在測(cè)定法的第一天和第二天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有 0. 5% FCS (HyClone ；目錄號(hào)SH30070. 03)和 20ng/ml Wnt3a (R&D Systems ；目錄號(hào) 1324-WN)的DMEM:F12中。在測(cè)定法的第三天和第四天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有2% FCS但沒(méi)有任何Wnt3a的DMEM:F12中。陽(yáng)性對(duì)照樣品由如下組成在整個(gè)測(cè)定法中以lOOng/ml的濃度加入的重組人激活素A(P印rotech ；目錄號(hào)120-14)和在第1天和第 2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。陰性對(duì)照樣品省略了用激活素A和Wnt3a兩者進(jìn)行的處理。高內(nèi)涵分析在四天的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用PBS洗滌測(cè)定板兩次，用4%多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，然后用PBS洗滌三次并用0. 5% Triton X-100在室溫下透化處理20分鐘。將細(xì)胞再用PBS洗滌三次，然后用4%雞血清(Invitrogen ；目錄號(hào)16110082)在PBS 中于室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人S0X17 ；R&D Systems ；目錄號(hào)AF1924)在4%雞血清中以1 100稀釋?zhuān)谑覝叵录又撩總€(gè)孔保持一小時(shí)。Alexa Fluor 488綴合的二抗 (雞抗山羊IgG ;Molecular Probes)在PBS中以1 200稀釋?zhuān)⒃谟肞BS洗滌三次后加至每個(gè)樣品孔。為了對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，在室溫下加入4yg/mlHoechst 33342 (Invitrogen ； 目錄號(hào)H3570)保持十分鐘。將板用PBS洗滌一次，并保留在100 μ 1/孔PBS中以進(jìn)行成像。用IN Cell Analyzer 1000細(xì)胞分析儀(GE Healthcare)進(jìn)行成像，對(duì)于用 Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的細(xì)胞采用51008bs 二向分色鏡。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔并根據(jù)單獨(dú)用二抗染色的無(wú)處理陰性對(duì)照孔來(lái)優(yōu)化曝光時(shí)間。每孔獲取15個(gè)視野的圖像，以補(bǔ)償生物鑒定和后續(xù)染色程序中的任何細(xì)胞損失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare)軟件從每個(gè)孔獲得總細(xì)胞數(shù)目和總S0X17強(qiáng)度的測(cè)量值?；诨译A水平(基線范圍100-300)和核大小確定細(xì)胞核的分裂情況。計(jì)算每個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。總S0X17蛋白表達(dá)記錄為總強(qiáng)度或累積強(qiáng)度，該強(qiáng)度定義為細(xì)胞總熒光乘以細(xì)胞面積?；诨译A范圍在200至3500之間的接受標(biāo)準(zhǔn)來(lái)去除背景。通過(guò)將每個(gè)孔的總強(qiáng)度除以陽(yáng)性對(duì)照的平均總強(qiáng)度，將總強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。對(duì)于每個(gè)重復(fù)組，對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖17示出了對(duì)該篩選測(cè)定法的驗(yàn)證，檢測(cè)了市售激活素A(Peprotech)的兩倍稀釋曲線并同時(shí)測(cè)量了細(xì)胞數(shù)(圖17A)和S0X17強(qiáng)度(圖17B)兩者。通常在100-20/ml范圍內(nèi)觀察到激活素A對(duì)誘導(dǎo)S0X17表達(dá)的最佳效果，其中EC5tl為30-50/ml。在測(cè)定法的第 1天和第2天在處理中忽略Wnt3a不能產(chǎn)生可測(cè)量的S0X17表達(dá)。沒(méi)有激活素A也不能產(chǎn)生S0X17表達(dá)。檢測(cè)野生型激活素A標(biāo)準(zhǔn)品表達(dá)了兩種野生型激活素A基因構(gòu)建體并測(cè)試功能活性:pCMV6-XL4哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(目錄號(hào):SC118774)中的OriGene激活素A和 pcDNA3. 1 (-)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的ACTNl。兩種構(gòu)建體在它們各自的表達(dá)載體中均利用 CMV啟動(dòng)子，并且兩者均在HEK293-E細(xì)胞中表達(dá)。在96小時(shí)后收集培養(yǎng)上清液并測(cè)試功能活性。將以Ix濃縮(純的)或4x濃縮母液形式接收到上清液1 4稀釋于DMEM:F12中以產(chǎn)生中間母液，然后進(jìn)一步進(jìn)行兩倍系列稀釋?zhuān)詈? 5稀釋進(jìn)裝有細(xì)胞和測(cè)定培養(yǎng)基的每一個(gè)孔中(最終測(cè)定稀釋度范圍為1 20至1 640)。圖18示出了人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化(由S0X17表達(dá)水平測(cè)量)的結(jié)果。在該測(cè)定法中，OriGene野生型激活素A表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)于ACTN 1表達(dá)。濃縮OriGene野生型上清液提高了功能活性大約1. 5倍。為了改善表達(dá)系統(tǒng)，隨后將ACTN 1構(gòu)建體移至pUnder哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。如實(shí)例2所述，利用EcoRI和HindIII位點(diǎn)將全長(zhǎng)的ACTN 1前體基因從pcDNA3. 1 (-)亞克隆進(jìn) pUnder中。將該新的ACTN 1野生型激活素A構(gòu)建體連同OriGene構(gòu)建體兩者均獨(dú)立地轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO-S或HEK293-F細(xì)胞中。將在96小時(shí)時(shí)收獲的清液如實(shí)例2中所述制備并測(cè)試激活素A活性。將以Ix濃縮(純的)或IOx濃縮母液形式接收到上清液1 4或1 8稀釋于DMEM:F12中以產(chǎn)生中間母液，然后進(jìn)一步1 5稀釋進(jìn)裝有細(xì)胞和測(cè)定培養(yǎng)基的每一個(gè)孔中(最終測(cè)定稀釋度范圍為1 20至1 40)。表19A示出了在該測(cè)定法中使用市售的重組人激活素A(P印rotech)的人胚胎干細(xì)胞分化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中將S0X17表達(dá)水平作為定形內(nèi)胚層分化的標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)量。比較在該測(cè)定法中使用的多種表達(dá)系統(tǒng)中的OriGene 激活素A和ACTN 1的結(jié)果在圖19B中示出。使用pUnder表達(dá)載體和HEK293F細(xì)胞ACTm表達(dá)得以顯著改善；甚至是在濃縮上清液后，CHOS細(xì)胞中的ACTN 1表達(dá)顯示出弱的或可忽略不計(jì)的結(jié)果。實(shí)例7 本發(fā)明的肽使人胚胎干細(xì)胞分化成表汰定形內(nèi)胚層譜系特征件標(biāo)志物的細(xì)胞的能力激活素A序列中的特定氨基酸殘基的改變對(duì)該分子的功能性質(zhì)具有深遠(yuǎn)的影響， 并因而改變了多種生物學(xué)結(jié)果。改變可(例如)修改結(jié)合親和力或二聚體穩(wěn)定性，或者是以積極的方式改變或以負(fù)面的方式改變。在生物測(cè)定法中測(cè)量所表達(dá)的變體的功能活性并確定特定殘基的修飾模式是否與相對(duì)于野生型標(biāo)準(zhǔn)的功能增加或降低相關(guān)很重要。篩選如上面實(shí)例5和實(shí)例6所述，將從人胚胎干細(xì)胞系Hl獲得的細(xì)胞簇進(jìn)行接種并進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，將Hl人胚胎干細(xì)胞簇在低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的組織培養(yǎng)塑料上培養(yǎng)。細(xì)胞通過(guò)以下方式來(lái)傳代利用膠原酶處理并小心刮擦、洗滌以除去殘余酶， 并以1 1(表面面積)的比例接種于低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的96孔板上。讓細(xì)胞成簇貼附，然后在1至3天時(shí)間內(nèi)恢復(fù)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，每天用補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF (R&DSystems ； 目錄號(hào)233-FB)的MEF調(diào)理培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在測(cè)定法的最開(kāi)始將各板的孔在PBS中洗滌兩次，然后將DMEM:F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (Invitrogen ；目錄號(hào)=11330-032)中的測(cè)試樣品的等分試樣(100 μ 1)添加至各孔。測(cè)試條件一式三份進(jìn)行，在總共四天測(cè)定期間每隔一天通過(guò)從各孔抽吸出培養(yǎng)基并用測(cè)試樣品替換培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。在測(cè)定法的第一天和第二天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有 0. 5% FCS (HyClone ；目錄號(hào)SH30070. 03)和 20ng/ml Wnt3a (R&D Systems ；目錄號(hào) 1324-WN)的DMEM:F12中。在測(cè)定法的第三天和第四天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有2% FCS但沒(méi)有任何Wnt3a的DMEM:F12中。陽(yáng)性對(duì)照樣品由如下組成在整個(gè)測(cè)定法中以lOOng/ml的濃度加入的重組人激活素A和在第1天和第2天加入的Wnt3a (20ng/ml)。 陰性對(duì)照樣品省略了用激活素A和Wnt3a兩者進(jìn)行的處理。用純的、IOx或50x濃縮母液的形式接收每種表達(dá)的變體肽的上清液。將測(cè)試上清液1 4或1 8稀釋于DMEM:F12中以產(chǎn)生中間稀釋液，然后進(jìn)一步1 5稀釋進(jìn)裝有細(xì)胞和測(cè)定培養(yǎng)基的每孔中(最終測(cè)定稀釋度范圍為1 20至1 40)。來(lái)自O(shè)riGene或 ACTN 1(各對(duì)應(yīng)于激活素A野生型)表達(dá)構(gòu)建體用作這些測(cè)定法的陽(yáng)性對(duì)照。高內(nèi)涵分析在四天的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用PBS洗滌測(cè)定板兩次，用4%多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，然后用PBS洗滌三次并用0. 5% Triton X-100在室溫下透化處理20分鐘。將細(xì)胞再用PBS洗滌三次，然后用4%雞血清(Invitrogen ；目錄號(hào)16110082)在PBS中于室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人S0X17 ；R&D Systems ；目錄號(hào)AF1924)在4%雞血清中以1 100稀釋?zhuān)谑覝叵录又撩總€(gè)孔保持一小時(shí)。將Alexa Fluor 488綴合的二抗 (雞抗山羊IgG ;Molecular Probes)在PBS中以1 200稀釋?zhuān)⒃谟肞BS洗滌三次后加至每個(gè)樣品孔。為了對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，在室溫下加入4 μ g/ml Hoechst 33342 (Invitrogen ； 目錄號(hào)H3570)保持十分鐘。將板用PBS洗滌一次，并保留在100 μ 1/孔PBS中以進(jìn)行成像。用IN Cell Analyzer 1000細(xì)胞分析儀(GE Healthcare)進(jìn)行成像，對(duì)于用 Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的細(xì)胞采用51008bs 二向分色鏡。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔并根據(jù)單獨(dú)用二抗染色的無(wú)處理陰性對(duì)照孔來(lái)優(yōu)化曝光時(shí)間。每孔獲取15個(gè)視野的圖像，以補(bǔ)償生物鑒定和后續(xù)染色程序中的任何細(xì)胞損失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare)軟件從每個(gè)孔獲得總細(xì)胞數(shù)目和總S0X17強(qiáng)度的測(cè)量值?；诨译A水平(基線范圍100-300)和核大小確定細(xì)胞核的分裂情況。計(jì)算每個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差?？係0X17蛋白表達(dá)記錄為總強(qiáng)度或累積強(qiáng)度，該強(qiáng)度定義為細(xì)胞總熒光乘以細(xì)胞面積?；诨译A范圍在200至3500之間的接受標(biāo)準(zhǔn)來(lái)去除背景。通過(guò)將每個(gè)孔的總強(qiáng)度除從陽(yáng)性對(duì)照的平均總強(qiáng)度，將總強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。對(duì)于每個(gè)重復(fù)組，對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。表8示出了人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化(由S0X17表達(dá)水平測(cè)量)的結(jié)果。 根據(jù)該篩選，對(duì)應(yīng)于一亞組變體肽的上清液可鑒定為在定形內(nèi)胚層生物測(cè)定法中具有顯著的功能活性。在一些情況下，某些肽變體的功能活性顯示出劑量滴定效果，在其中將上清液相對(duì)于純的未濃縮樣品濃縮IOx或50x時(shí)具有更高活性；例如，當(dāng)相對(duì)于它們各自相應(yīng)的未濃縮上清液濃縮IOx時(shí)，ACTN 4的樣品上清液顯示高2. 6倍的效力，而ACTN 16顯示出4倍的改善。某些樣品未能表現(xiàn)出任何功能活性或相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照具有最低限度的功能活性。 這可反映蛋白質(zhì)表達(dá)的差別，或者，可反映突變對(duì)激活素A變體的正常折疊、二聚體形成或與其各自的受體的親和力的影響。然而，該篩選結(jié)果確實(shí)鑒定了一亞組在定形內(nèi)胚層生物測(cè)定法中具有顯著功能的變體肽。表9展示了該亞組命中變體肽。如果沒(méi)有關(guān)于這些上清液樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的額外信息，那么該列表可能不是能充分理解的并且不能用于對(duì)變體肽的效力相對(duì)于彼此或相對(duì)于野生型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排序。實(shí)例8 本發(fā)明的肽的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定能夠測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液(純的或濃縮的)中以及用于多種純化策略的樣品中的激活素A蛋白質(zhì)的總量很重要。這是向能夠?qū)⒆凅w肽相互之間以及與野生型對(duì)照或商業(yè)來(lái)源的激活A(yù)相比較的必要步驟。為此，將市售的人激活素A的ELISA試劑盒用該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品和上述生物測(cè)定法中所用的不同商業(yè)來(lái)源的激活素A兩者進(jìn)行驗(yàn)證。在一后續(xù)步驟中， 在ELISA測(cè)定法中測(cè)試了激活A(yù)以及本發(fā)明的變體肽的表達(dá)并純化的樣品以確定每種樣品中總蛋白質(zhì)的測(cè)量值。使用一種市售的人激活素A的DuoSet試劑盒(R&D Systems,目錄號(hào)DY338)根據(jù)由生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)(不同的是，在每一推薦步驟洗滌步驟進(jìn)行四次)，測(cè)定了細(xì)胞培養(yǎng)上清液(純樣品)、濃縮的上清液和純化材料的總激活素A蛋白質(zhì)。未包括在該試劑盒中并從其他商業(yè)來(lái)源購(gòu)買(mǎi)的試劑包括BSA級(jí)分IV (RIA級(jí)；Sigma ；目錄號(hào)A7888)TMB溶液 (Sigma ；目錄號(hào)T0440)、PBS (Invitrogen ；目錄號(hào)14190)、Tween-20 (JT Baker ；目錄號(hào) X251-07)、硫酸(JT Baker ；目錄號(hào)=9681-00)和尿素(BioRad ；目錄號(hào)161-0731)。將該試劑盒中由生產(chǎn)商提供的重組人激活素A用作ELISA驗(yàn)證的參照標(biāo)準(zhǔn)。將該材料進(jìn)行兩倍系列稀釋以產(chǎn)生七點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，最高標(biāo)準(zhǔn)為8ng/ml，如圖20A中所示。還將另一商業(yè)來(lái)源的重組人激活素A(P^rotech目錄號(hào)120-14)與所述試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了平行測(cè)試，并產(chǎn)生了相同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖20B所示，表明了該測(cè)定法的高度可重復(fù)性。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液(純的或濃縮的)和純化的材料(來(lái)自IMAC或ACTA 3親和純化柱)系列稀釋?zhuān)沟脻舛瓤蓮臉?biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分計(jì)算。所有樣品的ELISA結(jié)果在表10中示出。選擇一系列來(lái)自初步篩選的變體肽用于完成評(píng)價(jià)。在搖瓶中使用相應(yīng)的pUnder 載體和HEK293-F細(xì)胞如上面所述轉(zhuǎn)染變體。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞稀釋至1. OX IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總DNA的等分試樣稀釋進(jìn)Opti-Pro (Invitrogen ；目錄號(hào)12309)中，并將FreeMyle Max轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen ；目錄號(hào)16447)的等分試樣稀釋進(jìn)Opti-Pro中。將稀釋的DNA 添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘，隨后添加該DNAMax復(fù)合物至細(xì)胞搖瓶中并在37°C和8% CO2下以125RPM搖動(dòng)孵育96小時(shí)。通過(guò)以5，OOOXg離心10分鐘將上清液從細(xì)胞分離并濾過(guò)0. 2μπι過(guò)濾器(Corning;目錄號(hào)431153)，然后用Amicon Ultra濃縮器10k(目錄號(hào)UFC901096)濃縮10倍，并以3，750Xg離心大約10分鐘。將樣品在4°C 下保存。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液系列稀釋?zhuān)沟脻舛瓤蓮臉?biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分計(jì)算。所有樣品的ELISA結(jié)果在表10和表11中示出。表10示出了首次嘗試將樣品稀釋跨越大的范圍以找到每種樣品處于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性部分的適當(dāng)稀釋度。這是重要的以便能夠精確地計(jì)算樣品濃度。表11示出了使用適當(dāng)稀釋系列的第二次實(shí)驗(yàn)以及各樣品最終的計(jì)算濃度。_ 9帖JM臨·港十牛顯示已用組氨酸殘基進(jìn)行改變以易于純化的本發(fā)明的變體肽也在定形內(nèi)胚層分化測(cè)定法中具有活性并且該活性與特定蛋白質(zhì)的相對(duì)量相關(guān)很重要。選擇一亞組從上面實(shí)例5中的初步篩選鑒定的變體肽用于另外的bis-his突變。在相應(yīng)培養(yǎng)物表達(dá)和濃縮后， 對(duì)樣品的總激活素A蛋白質(zhì)和功能作用進(jìn)行測(cè)定。含組氨酸插入的本發(fā)明的肽的轉(zhuǎn)染根據(jù)實(shí)例2中所述的方法，產(chǎn)生表2中所列的編碼bis-his肽ACTD 2至ACTD 16及它們各自的親本構(gòu)建體(ACTN UACTN 16和ACTN 34)的基因序列并將其插入pUnder載體。如下對(duì)HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在搖瓶中將細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋至1. OX IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總DNA稀釋進(jìn)Opti-Pro中， 并將FreeMyle Max轉(zhuǎn)染試劑稀釋進(jìn)Opti-Pro中。將稀釋的DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和 8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。在轉(zhuǎn)染后四天收獲來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293-F細(xì)胞的細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)使之澄清，并過(guò)濾(0. 2 μ m PES 膜，Corning)。用 LV Centramate(Pall)濃縮器將樣品濃縮4倍或10倍，并在4°C下保存。ELISA蛋白質(zhì)定量使用市售的人激活素A的DuoSet試劑盒(R&DSystems，目錄號(hào)DY338)根據(jù)由生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)(不同的是，在每一推薦步驟將洗滌步驟進(jìn)行四次)，測(cè)定了濃縮細(xì)胞培養(yǎng)上清液的總激活素A蛋白。將由該試劑盒的生產(chǎn)商提供的重組人激活素A用作ELISA驗(yàn)證的參照標(biāo)準(zhǔn)。在表12中示出了計(jì)算得到的每種樣品的ELISA激活素A蛋白質(zhì)濃度?；罴?xì)胞測(cè)定法簡(jiǎn)而言之，根據(jù)實(shí)例5中所述的方法將Hl人胚胎干細(xì)胞簇在低生長(zhǎng)因子MATRIGEL (BD Biosciences目錄號(hào)356231)包被的組織培養(yǎng)塑料上培養(yǎng)。細(xì)胞通過(guò)以下方式來(lái)傳代利用膠原酶處理并小心刮擦、洗滌以除去殘余酶，并以1 1(表面面積)的比例接種于低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的96孔板上。讓細(xì)胞成簇貼附，然后在1至 3天時(shí)間內(nèi)恢復(fù)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，每天用補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems ；目錄號(hào)233_FB) 的MEF調(diào)理培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在測(cè)定法的最開(kāi)始將各板的孔在PBS中洗滌兩次，然后將DMEM:F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的測(cè)試樣品的等分試樣(ΙΟΟμΙ)添加至各孔。測(cè)試條件一式三份進(jìn)行，在總共四天測(cè)定期間每隔一天通過(guò)從各孔抽吸出培養(yǎng)基并用測(cè)試樣品替換培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。在測(cè)定法的第一天和第二天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有0. 5% FCS(HyClone ；目錄號(hào) SH30070. 03)和 20ng/mlWnt3a(R&D Systems ；目錄號(hào)1324_WN)的 DMEM:F12 中。在測(cè)定法的第三天和第四天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有2% FCS但沒(méi)有任何Wnt3a的 DMEM:F12中。陽(yáng)性對(duì)照樣品由如下組成在整個(gè)測(cè)定法中以lOOng/ml的濃度加入的重組人激活素A(P印rotech ；目錄號(hào):120-14)和在第1天和第2天加入的Wnt3a (20ng/ml)。陰性對(duì)照樣品省略了用激活素A和Wnt3a兩者進(jìn)行的處理。高內(nèi)涵分析在四天的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用PBS洗滌測(cè)定板兩次，用4%多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，然后用PBS洗滌三次并用0. 5% Triton X-100在室溫下透化處理20分鐘。將細(xì)胞再用PBS洗滌三次，然后用4%雞血清(Invitrogen ；目錄號(hào)1611008 在PBS中于室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人S0X17 ；R&D Systems ；目錄號(hào)AF1924)在4%雞血清中以1 100稀釋?zhuān)谑覝叵录又撩總€(gè)孔保持一小時(shí)。將Alexa Fluor 488綴合的二抗 (雞抗山羊IgG ;Molecular Probes)在PBS中以1 200稀釋?zhuān)⒃谟肞BS洗滌三次后加至每個(gè)樣品孔。為了對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，在室溫下加入4 μ g/ml Hoechst 33342 (Invitrogen ； 目錄號(hào)H3570)保持十分鐘。將板用PBS洗滌一次，并保留在100 μ 1/孔PBS中以進(jìn)行成像。用IN Cell Analyzer 1000細(xì)胞分析儀(GE Healthcare)進(jìn)行成像，對(duì)于用 Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的細(xì)胞采用51008bs 二向分色鏡。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔并根據(jù)單獨(dú)用二抗染色的無(wú)處理陰性對(duì)照孔來(lái)優(yōu)化曝光時(shí)間。每孔獲取15個(gè)視野的圖像，以補(bǔ)償生物鑒定和后續(xù)染色程序中的任何細(xì)胞損失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare)軟件從每個(gè)孔獲得總細(xì)胞數(shù)目和總S0X17強(qiáng)度的測(cè)量值?；诨译A水平(基線范圍100-300)和核大小確定細(xì)胞核的分裂情況。計(jì)算每個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差?？係0X17蛋白表達(dá)記錄為總強(qiáng)度或累積強(qiáng)度，該強(qiáng)度定義為細(xì)胞總熒光乘以細(xì)胞面積?；诨译A范圍在200至3500之間的接受標(biāo)準(zhǔn)來(lái)去除背景。通過(guò)將每個(gè)孔的總強(qiáng)度除以陽(yáng)性對(duì)照的平均總強(qiáng)度，將總強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。對(duì)于每個(gè)重復(fù)組，對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。表12示出了多種激活素A肽變體的活性結(jié)果，其中在該測(cè)定法中定形內(nèi)胚層形成后細(xì)胞數(shù)目和S0X17表達(dá)兩者均與從ELISA結(jié)果估計(jì)的激活素A濃度相關(guān)。顯然就肽變體的野生型家族(ACmi和bis-his變體ACTD2-6)而言，額外的組氨酸取代對(duì)關(guān)于定形內(nèi)胚層形成的功能活性具有極小或沒(méi)有影響。對(duì)于其他肽變體家族(ACTrne和ACTN34)及它們各自的bis-his變體(分別是ACTD7-11和ACTD12-16)這也是如此，其中足量的蛋白質(zhì)被添加至功能測(cè)定法中。實(shí)例10 通過(guò)用本發(fā)明的肽處理人胚胎干細(xì)胞而形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的FACS分析顯示本發(fā)明的變體肽可支持定形內(nèi)胚層分化(通過(guò)其他生物標(biāo)志物指示)是很重要的。CXCR4是常常與定形內(nèi)胚層相關(guān)的表面蛋白。顯示具有為了易于純化而插入的額外組氨酸置換的變體肽不會(huì)影響激活素A分子的功能性質(zhì)也是很重要的。在該實(shí)例中，使人胚胎干細(xì)胞經(jīng)歷使用一系列天然野生型和兩種變體分子的bis-his原型的定形內(nèi)胚層分
化方案。
含組氨酸插入的本發(fā)明的肽的轉(zhuǎn)染根據(jù)實(shí)例2所述方法，產(chǎn)生編碼表3中所列的 bis-his肽ACTD3和ACTD8的基因序列并將其插入pUnder載體。如下對(duì)HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在獨(dú)立的搖瓶中將細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋至1.0X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。 將總DNA稀釋進(jìn)Opti-Pro中，并將FreeMyle Max轉(zhuǎn)染試劑稀釋進(jìn)Opti-Pro中。將稀釋的DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。含組氨酸插入的本發(fā)明的肽的純化采用固定化金屬螯合親和色譜(IMAC)的純化用GE Healthcare，s UNICORN 軟件在AKTA FPLC色譜系統(tǒng)上進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染后四天收獲來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293-F細(xì)胞的細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)使之澄清，并過(guò)濾(0.2μπι PES膜，Corning)。使用實(shí)例6所述的方法通過(guò) ELISA測(cè)定特定蛋白質(zhì)的相對(duì)量。用LVCentramate(Pall)濃縮器將樣品濃縮4倍或10倍并通過(guò)使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)1203)的蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)。在這時(shí)保存ACTD3和ACTD8濃縮樣品的等分試樣而無(wú)需進(jìn)一步純化以用于活細(xì)胞測(cè)定法。然后將該濃縮樣品用IOx PBS稀釋至 Ix PBS的終濃度，再次用0. 2 μ m的膜過(guò)濾。以大約IOmg蛋白質(zhì)/ml樹(shù)脂的相對(duì)濃度將稀釋的上清液上樣至平衡OOmM磷酸鈉，0. 5M NaCl,pH7. 4)過(guò)的HisTrap柱(GE Healthcare) 上。上樣后，洗滌柱子并用20柱體積用線性梯度的咪唑(0-500mM)洗脫蛋白質(zhì)。收集峰級(jí)分，并在4°C下相對(duì)于PBS，pH 7透析過(guò)夜。從透析液移出透析過(guò)的蛋白質(zhì)，過(guò)濾(0.2μπι)， 通過(guò)在NAN0DR0P 分光光度計(jì)(ThermoFisher Scientific)上測(cè)量^Onm下的吸光度來(lái)確定總蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE和使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems;目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體(R&D Systems ；目錄號(hào)1203)的蛋白質(zhì)印跡評(píng)估純化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。如有必要，用10K截留分子量(MWCO)離心濃縮器(Millipore)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮。將樣品在4°C下保存。ELISA測(cè)定法在ELISA中測(cè)試ACTD3 (4倍濃縮)、ACTD8 (10倍濃縮)的培養(yǎng)物上清液和每一者的IMAC純化材料以測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。使用市售的人激活素A的DuoSet試劑盒(R&D Systems,目錄號(hào)DY338)根據(jù)由該生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)(不同的是，在每一推薦步驟將洗滌步驟進(jìn)行四次)，測(cè)定了樣品的總激活素A蛋白質(zhì)。將由該試劑盒的生產(chǎn)商提供的重組人激活素A用作ELISA驗(yàn)證的參照標(biāo)準(zhǔn)。ACTD3的濃縮上清液以不足以通過(guò)ELISA 測(cè)量的量存在。所計(jì)算的其余樣品的蛋白質(zhì)濃度如下ACTD8(10x上清液濃縮物)361ng/ ml ；ACTD8 (IMAC 純化過(guò)的)1，893ng/ml ；ACTD3 (IMAC 純化過(guò)的)57，956ng/ml?；罴?xì)胞測(cè)定法簡(jiǎn)而言之，根據(jù)實(shí)例5中所述的方法將Hl人胚胎干細(xì)胞簇在低生長(zhǎng)因子MATRIGEL (BD Biosciences目錄號(hào)356231)包被的組織培養(yǎng)塑料上培養(yǎng)。細(xì)胞通過(guò)以下方式來(lái)傳代利用膠原酶處理并小心刮擦、洗滌以除去殘余酶，并以1 1(表面面積)的比例接種于低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的96孔板上。讓細(xì)胞成簇貼附，然后在1至 3天時(shí)間內(nèi)恢復(fù)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，每天用補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems ；目錄號(hào)233_FB) 的MEF調(diào)理培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在測(cè)定法的最開(kāi)始將各板的孔在PBS中洗滌兩次，然后將DMEM:F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的測(cè)試樣品的等分試樣(100μ 1)添加至各孔。測(cè)試條件在九孔重復(fù)組中進(jìn)行，在總共四天測(cè)定期間每隔一天通過(guò)從各孔抽吸出培養(yǎng)基并用測(cè)試樣品替換培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。在測(cè)定法的第一天和第二天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有0. 5% FCS(HyClone ；目錄號(hào)SH30070. 03)禾P20ng/ml Wnt3a(R&D Systems ；目錄號(hào)1324_WN)的 DMEM:F12 中。在測(cè)定法的第三天和第四天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于具有2% FCS但沒(méi)有任何Wnt3a 的DMEM:F12中。陽(yáng)性對(duì)照樣品由如下組成在整個(gè)測(cè)定法中以lOOng/ml的濃度加入的重組人激活素A(P印rotech ；目錄號(hào):120-14)和在第1天和第2天加入的Wnt3a (20ng/ml)。 陰性對(duì)照樣品省略了用激活素A和Wnt3a兩者進(jìn)行的處理。將每種濃縮上清液或IMAC純化的樣品1 16稀釋于DMEM:F12中以產(chǎn)生中間稀釋液，然后進(jìn)一步1 5稀釋進(jìn)裝有細(xì)胞和測(cè)定培養(yǎng)基的每孔中(最終測(cè)定稀釋度1 80)。在四天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用PBS洗滌測(cè)定孔，對(duì)于每種處理?xiàng)l件通過(guò)用TrypLETM(Invitrogen ；目錄號(hào)12604-013)簡(jiǎn)單處理3_5分鐘而從九個(gè)重復(fù)孔收集細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。在FACS分析前將細(xì)胞在PBS中洗滌一次。FACS分析將用于FACS分析的細(xì)胞于4 °C下在PBS (Invitrogen ；目錄號(hào) 14040-133)中的0. 5 %人Y -球蛋白(Sigma ；目錄號(hào)G_4386) =BDFACS染色緩沖液-BSA(BD ；目錄號(hào)5M657)的1 5溶液中封閉15分鐘。然后將細(xì)胞在4 °C下用 CD9PE(BD ；目錄號(hào)555372)、CD99PE (Caltag ；目錄號(hào)MHCD9904)禾Π CXCR4APC (R&D Systems ；目錄號(hào)FAB173A)的抗體染色30分鐘。在BD FACS染色緩沖液中的一系列洗滌后，將細(xì)胞用7-AAD(BD ；目錄號(hào)559925)針對(duì)生活力進(jìn)行染色并在BD FACSArray上進(jìn)行。 將針對(duì)PE和APC兩者的小鼠IgGlK同種型對(duì)照抗體用于測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖21所示的結(jié)果表明，來(lái)自bis-his構(gòu)建體每一者的純化材料均具有功能活性并且可誘導(dǎo)從人胚胎干細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層。實(shí)例11 本發(fā)明的肽的效力評(píng)價(jià)變體肽每一者較于野生型激活素A分子(ACTm)的相對(duì)活性和效力很重要。 在該實(shí)例中，選擇了 15種變體肽并使其表達(dá)，通過(guò)ELISA對(duì)來(lái)自濃縮的培養(yǎng)上清液的所分泌產(chǎn)物每一者進(jìn)行定量。然后在使用人胚胎干細(xì)胞的定形內(nèi)胚層分化方案中評(píng)價(jià)一定劑量的每種肽的功能活性。本發(fā)明的肽的轉(zhuǎn)染根據(jù)實(shí)例2所述方法，產(chǎn)生編碼表13中所列的bis-his肽的基因序列并將其插入PUnder載體中。用Freestyle Max轉(zhuǎn)染試劑Gnvitrogen ；目錄號(hào) 16447)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 細(xì)胞。在20ml轉(zhuǎn)染體積的轉(zhuǎn)染之前，將細(xì)胞稀釋至1. 0 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將1.25 μ g/ml的轉(zhuǎn)染物稀釋進(jìn)1.0ml 0PTIPR0(Invitrogen ；目錄號(hào)12309)中并將1.25ml Max轉(zhuǎn)染試劑稀釋進(jìn)1. Oml 0PTIPR0中。將DNA和Max轉(zhuǎn)染試劑添加在一起以形成脂質(zhì)復(fù)合物并在室溫下孵育10分鐘。然后將該脂質(zhì)復(fù)合物添加至細(xì)胞中并置于培養(yǎng)箱中4天，在37°C和8% CO2下以125RPM搖動(dòng)。在轉(zhuǎn)染后四天收獲細(xì)胞，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)使之澄清，并過(guò)濾(0. 2 μ m PES膜，Corning)。使用實(shí)例6所述的方法通過(guò)ELISA測(cè)定特定蛋白質(zhì)的相對(duì)量。如有必要，將該蛋白質(zhì)上清液用Amicon Ultra 濃縮器I (Mi Ilipore ；目錄號(hào):UFC900396)以，3，500RCF離心大約40分鐘而濃縮20倍，并通過(guò)使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體抗體 (R&D Systems ；目錄號(hào)1203)的蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)。在這時(shí)保存ACTD3和ACTD8濃縮樣品的等分試樣而無(wú)需進(jìn)一步純化以用于活細(xì)胞測(cè)定法。將IOx PBS添加至濃縮樣品至Ix PBS 終濃度，然后通過(guò)0.2μ過(guò)濾器。如有必要，將蛋白質(zhì)濃縮20倍。將樣品在4°C下保存。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在獨(dú)立的搖瓶中將細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋至1.0X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將總DNA稀釋進(jìn)Opti-Pro中，并將FreeMyle Max轉(zhuǎn)染試劑稀釋進(jìn)Opti-Pro中。將稀釋的 DNA添加至稀釋的Max試劑并在室溫下孵育10分鐘。將DNA Max復(fù)合物的等分試樣添加至細(xì)胞搖瓶中并置于37°C和8% CO2條件下的以125RPM搖動(dòng)的培養(yǎng)箱中96小時(shí)。在轉(zhuǎn)染后四天收獲來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293-F細(xì)胞的細(xì)胞上清液，通過(guò)離心(30分鐘，6000rpm)使之澄清，并過(guò)濾(0.2μπι PES膜，Corning)。使用實(shí)例6所述的方法通過(guò) ELISA測(cè)定特定蛋白質(zhì)的相對(duì)量。用LVCentramate(Pall)濃縮器將樣品濃縮4倍或10倍并通過(guò)使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)1203)的蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)。在這時(shí)保存ACTD3和ACTD8濃縮樣品的等分試樣而無(wú)需進(jìn)一步純化以用于活細(xì)胞測(cè)定法。然后將該濃縮樣品用IOx PBS稀釋至 Ix PBS的終濃度，再次用0. 2 μ m的膜過(guò)濾。以大約IOmg蛋白質(zhì)/ml樹(shù)脂的相對(duì)濃度將稀釋的上清液上樣至平衡OOmM磷酸鈉，0. 5M NaCl,pH7. 4)過(guò)的HisTrap柱(GE Healthcare) 上。上樣后，洗滌柱子并用20柱體積用線性梯度的咪唑(0-500mM)洗脫蛋白質(zhì)。收集峰級(jí)分，并在4°C下相對(duì)于PBS，pH 7透析過(guò)夜。從透析液移出透析過(guò)的蛋白質(zhì)，過(guò)濾(0.2μπι)， 通過(guò)在NAN0DR0P 分光光度計(jì)(ThermoFisher Scientific)上測(cè)量^Onm下的吸光度來(lái)確定總蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE和使用用于檢測(cè)的抗激活素A抗體(R&D Systems;目錄號(hào)3381)或抗激活素A前體(R&D Systems ；目錄號(hào)1203)的蛋白質(zhì)印跡評(píng)估純化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。如有必要，用IOK截留分子量(MWCO)離心濃縮器(Millipore)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮。將樣品在4°C下保存。ELISA測(cè)定法在ELISA中測(cè)試15種不同的ACTN肽(另外還包括野生型ACTm 分子)的培養(yǎng)上清液以測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。使用市售的人激活素A的DuoSet試劑盒(R&D Systems,目錄號(hào)DY338)根據(jù)由該生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)(不同的是，在每一推薦步驟將洗滌步驟進(jìn)行四次)測(cè)定樣品。將由該試劑盒的生產(chǎn)商提供的重組人激活素A用作ELISA驗(yàn)證的參照標(biāo)準(zhǔn)。ACTN56、ACTN65和ACTN69的濃縮上清液的存在量不足以用ELISA測(cè)量。所計(jì)算的其余樣品的蛋白質(zhì)濃度在表13中示出?；罴?xì)胞測(cè)定法簡(jiǎn)而言之，根據(jù)實(shí)例5中所述的方法將Hl人胚胎干細(xì)胞簇在低生長(zhǎng)因子MATRIGEL (BD Biosciences目錄號(hào)356231)包被的組織培養(yǎng)塑料上培養(yǎng)。細(xì)胞通過(guò)以下方式來(lái)傳代用膠原酶處理并小心刮擦、洗滌以除去殘余酶，并以1 1(表面面積) 的比例接種于低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的96孔板(PerkinElmer ；目錄號(hào)6005182)上， 體積為0. Iml/孔。讓細(xì)胞成簇貼附，然后在一至三天時(shí)間內(nèi)恢復(fù)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，每天用補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems ；目錄號(hào)233_FB)的MEF調(diào)理培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在整個(gè)測(cè)定法期間，將板維持在37°C、5 % CO2下。在測(cè)定法的最開(kāi)始將各板的孔在PBS中洗滌兩次，然后將測(cè)試樣品的等分試樣 (100 μ 1)添加至各孔。測(cè)試條件在總共四天的測(cè)定期間重復(fù)進(jìn)行三次，在第1天和第3天通過(guò)從各孔抽吸培養(yǎng)基并用新鮮測(cè)試培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基來(lái)飼養(yǎng)?；贏CTN濃縮上清液每一者的ELISA結(jié)果，在適當(dāng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生了兩倍稀釋系列(范圍為3. lng/ml至400ng/ml) 以用于在第1天和第3天添加至測(cè)定法中。在測(cè)定法的第一天和第二天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于補(bǔ)充有0. 5% FCS (HyClone ；目錄號(hào)SH30070. 03)和20ng/mlWnt3a (R&D Systems ；目錄號(hào)1324_WN)的DMEM:F12中。在測(cè)定法的第三天和第四天，將添加至測(cè)定孔的測(cè)試樣品稀釋于補(bǔ)充有2% FCS但沒(méi)有任何Wnt3a的DMEM:F12中。陽(yáng)性對(duì)照樣品由如下組成在整個(gè)測(cè)定法中以lOOng/ml的濃度加入的重組人激活素A (P印rotech ；目錄號(hào) 120-14)和僅在第1天和第2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。陰性對(duì)照樣品由沒(méi)有任何生長(zhǎng)因子的測(cè)定培養(yǎng)基組成。高內(nèi)涵分析在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將測(cè)定板用PBSanvitrogen ；目錄號(hào)14190)洗滌一次，用4%多聚甲醛(Alexis Biochemical ；目錄號(hào)ALX-350_011)在室溫下固定20分鐘， 然后用PBS洗滌三次并用0. 5% Triton X-100 (Sigma ；目錄號(hào)T8760_2)在室溫下透化處理20分鐘。將細(xì)胞再用PBS洗滌三次，然后用4%雞血清(Invitrogen ；目錄號(hào)16110082) 在PBS中于室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人S0X17 ；R&D Systems ；目錄號(hào)AF19M) 在4%雞血清中以1 100稀釋?zhuān)谑覝叵录又撩總€(gè)孔保持兩小時(shí)。在用PBS洗滌三次后， 將以1 200稀釋于PBS中的Alexa Fluor 488綴合的二抗(雞抗山羊IgG ；Invitrogen ； 目錄號(hào)A21467)加至每個(gè)孔。為了對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，在室溫下加入Syg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen ；目錄號(hào)H3570)保持十分鐘。將板用PBS洗滌一次，并保留在100 μ 1/ 孔PBS中以進(jìn)行成像。用IN Cell Analyzer 1000細(xì)胞分析儀(GE Healthcare)進(jìn)行成像，對(duì)于用 Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的細(xì)胞采用510(^bs 二向分色鏡。從每孔的25個(gè)視野獲得圖像。用IN Cell Developer Toolbox 1· 7 (GE Healthcare)軟件從每個(gè)孔獲得總強(qiáng)度的測(cè)量值?；诨译A水平(基線范圍100-300)和核大小確定細(xì)胞核的分裂情況。計(jì)算每個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差?？偟鞍妆磉_(dá)記錄為總強(qiáng)度或累積強(qiáng)度，該強(qiáng)度定義為細(xì)胞總熒光乘以細(xì)胞面積?；诨译A范圍在200至4500之間的接受標(biāo)準(zhǔn)來(lái)去除背景。 通過(guò)將每個(gè)孔的總強(qiáng)度除以陽(yáng)性對(duì)照的平均總強(qiáng)度，將總強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。在圖22的分圖a至i中，測(cè)定法結(jié)果圖示了 S0X17表達(dá)百分比對(duì)肽濃度。對(duì)于變體ACTN肽每一者，示出了相對(duì)于野生型ACTm肽的相似曲線的劑量滴定曲線。還標(biāo)明了曲線擬合度的值(R2值)。所有的變體ACTN肽的劑量滴定結(jié)果與野生型ACTm肽劑量滴定密切匹配，其中曲線偏移波動(dòng)處于每一標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍內(nèi)。這些數(shù)據(jù)表明，每種變體 ACTN肽的效力與野生型ACTm肽的相似或相當(dāng)。實(shí)例12 :ACTN變體肽可介導(dǎo)下游胰腺分化證實(shí)用本發(fā)明的肽處理人胚胎干細(xì)胞將不會(huì)阻止向內(nèi)胚層和內(nèi)分泌譜系進(jìn)一步分化很重要。將兩種ACTN用于使人胚胎干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。此后，將分步分化方案應(yīng)用于處理細(xì)胞，以促進(jìn)向胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌譜系的分化。在整個(gè)分步分化過(guò)程中，將用ACTm野生型肽處理的細(xì)胞的平行對(duì)照樣品用于比較。在分化的每個(gè)階段取得樣品，以確定代表分化的多個(gè)階段的蛋白質(zhì)和mRNA生物標(biāo)記的出現(xiàn)。用于測(cè)定法的細(xì)胞準(zhǔn)備將人胚胎干細(xì)胞(HlhESC系)的母培養(yǎng)物以未分化、多能狀態(tài)維持在補(bǔ)充有bFGF(P印rol^ech ；目錄號(hào)100_18B)的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中的低生長(zhǎng)因子 MATRIGEL 包被的平皿上，平均每四天傳代。傳代通過(guò)這樣進(jìn)行使細(xì)胞培養(yǎng)物在37°C下暴露于lmg/ml膠原酶(Invitrogen，目錄號(hào)17104-019)的溶液五至七分鐘，然后用MEF調(diào)理培養(yǎng)基沖洗該單層并小心刮擦以回收細(xì)胞簇。將細(xì)胞簇低速離心以收集細(xì)胞沉淀并除去殘余的膠原酶。將細(xì)胞簇以1 3或1 4的比例分傳以進(jìn)行例行維持培養(yǎng)，或者以1 1 比例分傳以立即進(jìn)行測(cè)試。將所有人胚胎干細(xì)胞系以小于50的傳代數(shù)進(jìn)行維持，并例行評(píng)價(jià)核型表型是否正常和支原體污染是否存在。
將細(xì)胞簇均勻地再懸浮于補(bǔ)充有8ng/ml bFGF的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中，并以0. 5ml/ 孔的體積接種到低生長(zhǎng)因子MATRIGEL 包被的M孔黑壁培養(yǎng)板(Arctic White ；目錄號(hào) AWLS-303012)上。日常飼養(yǎng)是通過(guò)從每個(gè)孔抽吸掉廢培養(yǎng)基并用等體積的新鮮培養(yǎng)基替換來(lái)進(jìn)行。在整個(gè)測(cè)定法期間，將板維持在37°C、5% CO2下。測(cè)定法如下開(kāi)始該測(cè)定法從每個(gè)孔抽吸掉培養(yǎng)基，并重新添加測(cè)試培養(yǎng)基的等分試樣(0.5ml)。在三天的周期內(nèi)進(jìn)行分化第一步的測(cè)試條件，每天通過(guò)從各孔抽吸培養(yǎng)基并用新鮮的測(cè)試培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基來(lái)飼養(yǎng)。如先前實(shí)例11中所述，用人激活素A 的DuoSet ELISA試劑盒(R&DSystems ；目錄號(hào)DY338)評(píng)價(jià)ACTN肽的濃縮上清液的蛋白質(zhì)濃度。在測(cè)定的第一天，將ACTN肽在具有2%牛白蛋白級(jí)分V、無(wú)脂肪酸BSA(FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc ；目錄號(hào)152401)、8ng/ml bFGF 禾Π 20ng/ml Wnt3a (R&D Systems ； 目錄號(hào):1324-WN/CF)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen ；目錄號(hào):22400)中稀釋至終濃度lOOng/ml，然后添加至測(cè)定孔。在測(cè)定法的第二天和第三天，將ACTN肽稀釋進(jìn)補(bǔ)充有 2 %無(wú)脂肪酸BSA和8ng/ml bFGF而無(wú)任何Wnt3a的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后添加至測(cè)定孔。陽(yáng)性對(duì)照樣品包括稀釋于具有所標(biāo)明的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中的商業(yè)來(lái)源的激活素 A(PeproTech ；目錄號(hào)120-14)。在三天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，從一些孔收獲細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)分析，以評(píng)價(jià)CXCR4(定形內(nèi)胚層形成的標(biāo)志物)的水平。從另外的孔收獲樣品用于RT-PCR 分析其他分化標(biāo)志物。對(duì)其他培養(yǎng)孔進(jìn)行S0X17蛋白質(zhì)表達(dá)水平的高內(nèi)涵分析。在該分化方案的第一步結(jié)束時(shí)，使各處理組的重復(fù)平行孔組進(jìn)行進(jìn)一步分步分化。重要的是注意在第一個(gè)三天后，所有經(jīng)歷連續(xù)培養(yǎng)和分化的孔接受相同的處理。這種連續(xù)分化的方案在下面描述。在分化的第二個(gè)步驟，將培養(yǎng)物在DMEM:F12培養(yǎng)基(Invitrogen ；目錄號(hào) 11330-032)中培養(yǎng)兩天，所述DMEM:F12培養(yǎng)基補(bǔ)充有2%牛血清白蛋白級(jí)分V、無(wú)脂肪酸 BSA (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc ；目錄號(hào)152401)、50ng/ml FGF7 (PeproTech ；目錄號(hào) 100-19)和250nM環(huán)巴胺(Calbiochem ；目錄號(hào)239804)。在這兩天每天均抽吸各孔中的培養(yǎng)基并用新鮮等分試樣(0. 5ml)替換。用四天進(jìn)行該分化方案的步驟3。通過(guò)從各孔抽吸培養(yǎng)基并用新鮮等分量 (0. 5ml)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen ；目錄號(hào)10569)替換每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行飼養(yǎng)，所述高葡萄糖 DMEM 補(bǔ)充有 B27 (Invitrogen ；目錄號(hào)17504-044)、50ng/ml FGF7、100ng/ml 成頭蛋白(R&D Systems ；目錄號(hào):3344_NG)、250nM KAAD-環(huán)巴胺(Calbiochem ；目錄號(hào) 239804)和2 μ M全反式視黃酸(RA) (Sigma-Aldrich ；目錄號(hào)R2625)。在該分化的第三個(gè)步驟結(jié)束時(shí)，從一些孔收獲細(xì)胞用于通過(guò)RT-PCR分析以測(cè)量分化的標(biāo)志物。對(duì)其他培養(yǎng)孔進(jìn)行PDXl ( 一種與胰腺內(nèi)胚層相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)和CDX2 ( 一種與腸內(nèi)胚層相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的高內(nèi)涵圖像分析。用三天進(jìn)行該分化方案的步驟4。通過(guò)從各孔抽吸培養(yǎng)基并用新鮮等分量 (0. 5ml)的高葡萄糖DMEM替換每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行飼養(yǎng)，所述高葡萄糖DMEM補(bǔ)充有1 % B27、 100ng/ml 成頭蛋白、100ng/ml 軸突導(dǎo)向因子-4(R&D Systems) U μ M DAPI^PlyM Alk 5 抑制劑(Axxora ；目錄號(hào)ALX-270-445)。在該分化的第四個(gè)步驟結(jié)束時(shí)，從一些孔收獲細(xì)胞用于通過(guò)RT-PCR分析以測(cè)量分化的標(biāo)志物。FACS分析將用于FACS分析的細(xì)胞于4 °C下在PBS (Invitrogen ；目錄號(hào)14040-133)中的0. 5 %人Y -球蛋白(Sigma ；目錄號(hào)G_4386) =BDFACS染色緩沖液-BSA(BD ；目錄號(hào)5M657)的1 5溶液中封閉15分鐘。然后將細(xì)胞用CXCR4APC的抗體(R&D Systems ；目錄號(hào)FAB173A)在4°C下染色30分鐘。在BD FACS染色緩沖液中的一系列洗滌后，將細(xì)胞用7-AAD(BD ；目錄號(hào)559925)針對(duì)生活力進(jìn)行染色并在BD FACSArray 上進(jìn)行。將APC的小鼠IgGlK同種型對(duì)照抗體用于測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。RT-PCR分析通過(guò)在存在含乙醇的高鹽緩沖液的情況下與硅膠膜(foieasy Mini Kit, Qiagen, CA)結(jié)合，隨后通過(guò)洗滌來(lái)除去污染物來(lái)對(duì)RNA樣品進(jìn)行純化。用TURBO DNA-free試劑盒(Ambion，INC)使RNA進(jìn)一步純化，并隨后將高質(zhì)量的RNA在水中稀釋。通過(guò)在分光光度計(jì)上讀取A260和A280讀數(shù)來(lái)評(píng)估產(chǎn)率和純度。用ABI (ABI，CA)大容量cDNA 庫(kù)試劑盒從純化的RNA制備cDNA拷貝。除非另外指明，否則所有試劑均購(gòu)自Applied Biosystems。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)用 ABI PRISM 7900 序列檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。將TAQMAN^ UNIVERSALPCR MASTER MIX (ABI，CA)用于20ng的逆轉(zhuǎn)錄RNA，總反應(yīng)體積為20μ1。每種cDNA樣品重復(fù)運(yùn)行兩次以校正吸量誤差。使用濃度為200nM的引物和FAM-標(biāo)記的TAQMAN 探針。使用此前由Applied Biosystems開(kāi)發(fā)的人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)內(nèi)源性對(duì)照對(duì)每一個(gè)靶標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。引物和探針組如下GAPDH(Applied Biosystems), F0XA2(Hs00232764_ml, Applied Biosystems), S0X17(Hs00751752_s 1, Applied Biosystems)、CDX2(Hs00230919_ml，Applied Biosystems)、PDXl (Hs00236830_ml，Applied Biosystems) 、 NGN3 (Hs00360700_gl, AppliedBiosystems) 、 NKX6. 1 (Hs00232355_ml, Applied Biosystems)禾口 PTFl α (Hs00603586_gl，Applied Biosystems)。在 50 °C 下初女臺(tái)孵育2分鐘然后95°C下孵育10分鐘后，將樣品進(jìn)行40次的兩階段循環(huán)變性步驟，95°C 15 秒，然后退火/延伸步驟，60°C 1分鐘。數(shù)據(jù)分析用GENEAMP 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)的軟件進(jìn)行。對(duì)于每個(gè)引物/探針組，Ct值確定為熒光強(qiáng)度達(dá)到擴(kuò)增指數(shù)區(qū)中部中的特定值時(shí)的循環(huán)數(shù)。用比較性Ct方法來(lái)計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于每種cDNA樣品，從所關(guān)注基因的Ct值減去內(nèi)源對(duì)照Ct值而得到改變的Ct值(ACt)。靶標(biāo)的歸一化量計(jì)算為 2-ACt，假設(shè)擴(kuò)增為100%的效率。最終的數(shù)據(jù)是相對(duì)于校準(zhǔn)樣品表示的。高內(nèi)涵分析在三天的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將測(cè)定板用PBSanvitrogen ；目錄號(hào)14190) 洗滌一次，用4%多聚甲醛(Alexis Biochemical ；目錄號(hào)ALX-350-011)在室溫下固定 20分鐘，然后用PBS洗滌三次并用0.5% Triton X-100 (Sigma ；目錄號(hào)T8760_2)在室溫下透化處理20分鐘。將細(xì)胞再用PBS洗滌三次，然后用4%雞血清anvitrogen ；目錄號(hào)16110082)在PBS中于室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人S0X17 ；R&D Systems ； 目錄號(hào)AF1924)在4%雞血清中以1 100稀釋?zhuān)谑覝叵录又撩總€(gè)孔保持兩小時(shí)。在用PBS洗滌三次后，將以1 200稀釋于PBS中的Alexa Fluor 488綴合的二抗(雞抗山羊IgG5Invitrogen;目錄號(hào)A21467)加至每個(gè)孔。為了對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，在室溫下加入5 μ g/mlHoechst 33342 (Invitrogen ；目錄號(hào)H3570)保持十分鐘。將板用PBS洗滌一次，并保留在100 μ 1/孔PBS中以進(jìn)行成像。用于分析的其他一抗包括1 100稀釋的小鼠抗人 CDX2 (Invitrogen ；目錄號(hào)397800)、1 100 稀釋的山羊抗人 PDXl (Santa Cruz Biotechnology ；目錄號(hào)SC-14664)、1 200 稀釋的兔抗人胰島素(Cell Signaling;目錄號(hào):C27C9)和1 1500稀釋的小鼠抗人胰高血糖素(Sigma-Aldrich ；目錄號(hào)G2654)。用于分析的二抗包括1 400稀釋的Alexa Fluor 647雞抗小鼠IgG(Invitrogen ；目錄號(hào) A-21463) U 200 稀釋的 Alexa Fluor 488 驢抗山羊 IgG(Invitrogen ；目錄號(hào)A11055)、 1 1000 稀釋的 Alexa Fluor 647 雞抗兔 IgG(Invitrogen ；目錄號(hào)A2144;3)禾口 1 1000 稀釋的 Alexa Fluor 488 雞抗小鼠(Invitrogen ；目錄號(hào):A21200)。用IN Cell Analyzer 1000細(xì)胞分析儀(GE Healthcare)進(jìn)行成像，對(duì)于用 Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的細(xì)胞采用510(^bs 二向分色鏡。從每孔的25個(gè)視野獲得圖像。用IN Cell Developer Toolbox 1· 7 (GE Healthcare)軟件從每個(gè)孔獲得總強(qiáng)度的測(cè)量值?；诨译A水平(基線范圍100-300)和核大小確定細(xì)胞核的分裂情況。計(jì)算每個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。總蛋白表達(dá)記錄為總強(qiáng)度或累積強(qiáng)度，該強(qiáng)度定義為細(xì)胞總熒光乘以細(xì)胞面積?；诨译A范圍在200至4500之間的接受標(biāo)準(zhǔn)來(lái)去除背景。 通過(guò)將每個(gè)孔的總強(qiáng)度除以陽(yáng)性對(duì)照的平均總強(qiáng)度，將總強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。結(jié)果圖23示出了針對(duì)定形內(nèi)胚層的多種代表性標(biāo)志物，使用流式細(xì)胞檢測(cè)分析、PCR和高內(nèi)涵測(cè)量在分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的結(jié)果。圖23A圖示了 CXCR4水平的FACS 分析，將用商業(yè)來(lái)源的激活素A處理與野生型Acrai處理相比較；對(duì)于兩種處理結(jié)果證實(shí)具有相當(dāng)?shù)暮蛷?qiáng)的CXCR4表達(dá)。圖2 示出了兩種變體肽(ACTN4和ACTN48)與野生型ACTm 肽相比較的CXCR4表達(dá)；對(duì)于所有處理結(jié)果均是等價(jià)的或相當(dāng)?shù)?。圖23C至圖23F示出了在分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)細(xì)胞數(shù)目和S0X17表達(dá)的高內(nèi)涵分析，同樣證實(shí)對(duì)于用市售激活素A和ACNTl野生型肽處理結(jié)果等價(jià)，還顯示出與兩種變體肽每一者具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。 圖23G和23H示出了在分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的RT-PCR結(jié)果。相對(duì)于ACTm和市售激活素A處理，用ACTN4和ACTN48變體肽處理的樣品具有類(lèi)似的S0X17和F0XA2 (與定形內(nèi)胚層分化相關(guān)的標(biāo)志物)表達(dá)水平。圖M示出了針對(duì)胰腺內(nèi)胚層的多種代表性標(biāo)志物，使用PCR和高內(nèi)涵測(cè)量在分化的第三個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的結(jié)果。用ACTN4和ACTN48變體肽處理得到等價(jià)的細(xì)胞數(shù)目和等價(jià)的PDXl和⑶X2的蛋白質(zhì)表達(dá)，與使用市售激活素A或ACTm野生型肽處理時(shí)所觀察到的結(jié)果相當(dāng)。RT-PCR結(jié)果一致。圖25示出了在分化的步驟四結(jié)束時(shí)的RT-PCR結(jié)果。與前面一樣，相對(duì)于用市售激活素A或ACTm野生型肽處理用ACTN4和ACTN48變體肽處理得到相當(dāng)?shù)南掠我认俜只瘶?biāo)志物表達(dá)。這些綜合結(jié)果證明，ACTN4和ACTN48變體肽可在定形內(nèi)胚層分化以及后續(xù)的胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌分化期間替代激活素A。藉此將整篇文檔中引用的出版物全文以引用方式并入本文。盡管上文已結(jié)合實(shí)例和優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍不受上述具體實(shí)施方式
的限定，而受以下在專(zhuān)利法原則下正確解釋的權(quán)利要求書(shū)的限定。本發(fā)日月^Ht的WMmmmaR的氨, !!序歹U原區(qū)> 野生型激活素 A 原區(qū)(SwissProt/UniProt :P08476) :SEQ ID 1MPLLffLRGFLLASCffIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEAVKKHIL匪LHL KKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVDARKSTWH VFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEKEQSHRPFLM LQARQSEDHPHRRRRR成熟蛋白區(qū)>ACmi(野生型激活素 A) (SwissProt/UniProt :P08476) :SEQ ID 2GLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN2 :SEQ ID 3GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDLGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN3 :SEQ ID 4GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN4 :SEQ ID 5GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN5 :SEQ ID 6GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSNLGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN6 :SEQ ID 7GLECDGKVNLCCKKQWFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVTNHYRMR GHSPFADMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN7 :SEQ ID 8GLECDGKVNYCCKKQHFVSFKIDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRM RGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN8 :SEQ ID 9GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN9 :SEQ ID 10GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFADLGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN10 :SEQ ID 11GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFAQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN11 :SEQ ID 12GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHAHHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN12 :SEQ ID 13GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN13 :SEQ ID 14GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN14 :SEQ ID 15GLECDGKVNLCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFAQMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN15 :SEQ ID 16GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN16 :SEQ ID 17GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSQMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN17 :SEQ ID 18GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN18 :SEQ ID 19GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN19 :SEQ ID 20GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN20 :SEQ ID 21GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN21 :SEQ ID 22GLECDGKVNYCCKKQWFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN22 :SEQ ID 23GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFALMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN23 :SEQ ID 24GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN24 :SEQ ID 25GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGRCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN25 :SEQ ID 26GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN26 :SEQ ID 27GLECDGKVNLCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN27 :SEQ ID 28GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN28 :SEQ ID 29GLECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN29 :SEQ ID 30GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN30 :SEQ ID 31GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSKMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN31 :SEQ ID 32GLECDGKVNTCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN32 :SEQ ID 33GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSNMGSCCIPTKRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN33 :SEQ ID 34GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECMGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN34 :SEQ ID 35GLECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDLGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN35 :SEQ ID 36GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN36 :SEQ ID 37GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN37 :SEQ ID 38GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN38 :SEQ ID 39GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQLGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN39 :SEQ ID 40GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN40 :SEQ ID 41GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCAGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSNMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN41 :SEQ ID 42GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN42 :SEQ ID 43GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN43 :SEQ ID 44GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN44 :SEQ ID 45GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN45 :SEQ ID 46GLECDGKVNTCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN46 :SEQ ID 47GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPHANRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN47 :SEQ ID 48GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN48 :SEQ ID 49GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRM RGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN49 :SEQ ID 50GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQ匪IVEECGCS>ACTN50 :SEQ ID 51GLECDGKVNICCKKQLFGRTKDIGffNDffIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN51 :SEQ ID 52GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT>ACTN52 :SEQ ID 53GLECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN53 :SEQ ID 54GLECDGKVNICCKKQEFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN54 :SEQ ID 55GLECDGKVNICCKKQSFAQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN55 :SEQ ID 56GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT>ACTN56 :SEQ ID 57GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCV>ACTN57 :SEQ ID 58GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN58 :SEQ ID 59GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN59 :SEQ ID 60GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPNANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCV>ACTN60 :SEQ ID 61GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCV>ACTN61 :SEQ ID 62GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN62 :SEQ ID 63GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN63 :SEQ ID 64GLECDGKVNICCKKQSFSQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT>ACTN64 :SEQ ID 65GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT>ACTN65 :SEQ ID 66GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN66 :SEQ ID 67GLECDGKVNICCKKQMFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN67 :SEQ ID 68GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN68 :SEQ ID 69GLECDGKVNICCKKQSFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN69 :SEQ ID 70GLECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQQMVVEECGCT>ACTN70 :SEQ ID 71GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT>ACTN71 :SEQ ID 72GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN72 :SEQ ID 73GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN73 :SEQ ID 74GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT>ACTN74 :SEQ ID 75GLECDGKVNICCKKQSFGRAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT>ACTN75 :SEQ ID 76GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMKVEECGCT>ACTN76 :SEQ ID 77GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN77 :SEQ ID 78GLECDGKVNICCKKQMFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN78 :SEQ ID 79GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN79 :SEQ ID 80GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT>ACTN80 :SEQ ID 81GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCV>ACTN81 :SEQ ID 82GLECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT>ACTN82 :SEQ ID 83GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN83 :SEQ ID 84GLECDGKVNICCKKQSFGRAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN84 :SEQ ID 85GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN85 :SEQ ID 86GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN86 :SEQ ID 87GLECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN87 :SEQ ID 88GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN88 :SEQ ID 89GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN89 :SEQ ID 90GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN90 :SEQ ID 91GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN91 :SEQ ID 92GLECDGKVNICCKKQSFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT>ACTN92 :SEQ ID 93GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT>ACTN93 :SEQ ID 94GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT>ACTN94 :SEQ ID 95GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMR GHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVAEECGCT^ 2編碼本發(fā)明的肽的DNA序列ME >野生型激活素A原區(qū)SEQ ID 96ATGCCCTTGCTTTGGCTGAGAGGATTTCTGTTGGCAAGTTGCTGGATTATAGTGAGGAGTTCCCCCACC CCAGGATCCGAGGGGCACAGCGCGGCCCCCGACTGTCCGTCCTGTGCGCTGGCCGCCCTCCCAAAGGATGTACCCAA CTCTCAGCCAGAGATGGTGGAGGCCGTCAAGAAGCACATTTTAAACATGCTGCACTTGAAGAAGAGACCCGATGTCA CCCAGCCGGTACCCAAGGCGGCGCTTCTGAACGCGATCAGAAAGCTTCATGTGGGCAAAGTCGGGGAGAACGGGTAT GTGGAGATAGAGGATGACATTGGAAGGAGGGCAGAAATGAATGAACTTATGGAGCAGACCTCGGAGATCATCACGTT TGCCGAGTCAGGAACAGCCAGGAAGACGCTGCACTTCGAGATTTCCAAGGAAGGCAGTGACCTGTCAGTGGTGGAGC GTGCAGAAGTCTGGCTCTTCCTAAAAGTCCCCAAGGCCAACAGGACCAGGACCAAAGTCACCATCCGCCTCTTCCAG CAGCAGAAGCACCCGCAGGGCAGCTTGGACACAGGGGAAGAGGCCGAGGAAGTGGGCTTAAAGGGGGAGAGGAGTGA ACTGTTGCTCTCTGAAAAAGTAGTAGACGCTCGGAAGAGCACCTGGCATGTCTTCCCTGTCTCCAGCAGCATCCAGC GGTTGCTGGACCAGGGCAAGAGCTCCCTGGACGTTCGGATTGCCTGTGAGCAGTGCCAGGAGAGTGGCGCCAGCTTG GTTCTCCTGGGCAAGAAGAAGAAGAAAGAAGAGGAGGGGGAAGGGAAAAAGAAGGGCGGAGGTGAAGGTGGGGCAGG AGCAGATGAGGAAAAGGAGCAGTCGCACAGACCTTTCCTCATGCTGCAGGCCCGGCAGTCTGAAGACCACCCTCATC GCCGGCGTCGGCGG成熟蛋白區(qū)>ACTN1 (野生型激活素 A) =SEQ ID 97GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGTTCTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACTACTGCGAGGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN2 :SEQ ID 98GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCC CCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCG CCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTC AGCGACCTGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACAT CATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN3 :SEQ ID 99GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN4:SEQ ID 100GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN5 :SEQ ID 101GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCAACCTGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN6 :SEQ ID 102GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGTGGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN7 :SEQ ID 103GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGCACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGCTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN8 :SEQ ID 104GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN9 :SEQ ID 105GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCGACCTGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN10 :SEQ ID 106GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN11 :SEQ ID 107GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCCAGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN12 :SEQ ID 108GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN13 :SEQ ID 109GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN14:SEQ ID 110GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCCAGATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN15 :SEQ ID 111GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN16 :SEQ ID 112GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCCAGATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN17 :SEQ ID 113GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN18 :SEQ ID 114GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN19 :SEQ ID 115GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACMGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN20 :SEQ ID 116GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCCAGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN21 :SEQ ID 117GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGTGGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN22 :SEQ ID 118GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCCTGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN23 :SEQ ID 119GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN24 :SEQ ID 120GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAGGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN25 :SEQ ID 121GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN26 :SEQ ID 122GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN27 :SEQ ID 123GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACAGGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN28 :SEQ ID 124GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN29 :SEQ ID 125GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN30 :SEQ ID 126GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCAAGATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN31 :SEQ ID 127GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACACCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN32 :SEQ ID 128GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN33 :SEQ ID 129GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCATGGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN34 :SEQ ID 130GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACCTGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN35 :SEQ ID 131GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN36 :SEQ ID 132GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN37 :SEQ ID 133GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN38 :SEQ ID 134GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCCAGCTGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN39 :SEQ ID 135GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN40 :SEQ ID 136GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCGCCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCAACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN41 :SEQ ID 137GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGCTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACAGGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN42 :SEQ ID 138GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN43 :SEQ ID 139GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN44 :SEQ ID 140GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN45 :SEQ ID 141GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACACCTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN46 :SEQ ID 142GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCGGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCCACG CCAACAGGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN47 :SEQ ID 143GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN48 :SEQ ID 144GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN49 :SEQ ID 145GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCA GCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA>ACTN50 :SEQ ID 146GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCAGGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCGTGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN51 :SEQ ID 147GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAGGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN52 :SEQ ID 148GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCAAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN53 :SEQ ID 149GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGGAGTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN54:SEQ ID 150GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGCCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN55 :SEQ ID 151GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN56 :SEQ ID 152GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA>ACTN57 :SEQ ID 153GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN58 :SEQ ID 154GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN59 :SEQ ID 155GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA>ACTN60 :SEQ ID 156GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA>ACTN61 :SEQ ID 157GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN62 :SEQ ID 158GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN63 :SEQ ID 159GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCAGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN64 :SEQ ID 160GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN65 :SEQ ID 161GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN66 :SEQ ID 162GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGATGTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN67 :SEQ ID 163GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN68 :SEQ ID 164 GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN69 :SEQ ID 165GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGCAGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN70 :SEQ ID 166GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCGTGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN71 :SEQ ID 167GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN72 :SEQ ID 168GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN73 :SEQ ID 169GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN74 :SEQ ID 170GGCCTGGAGTGC GACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAGGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN75 :SEQ ID 171GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAGGATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN76 :SEQ ID 172GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN77 :SEQ ID 173GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGATGTTCGGCAAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN78 :SEQ ID 174GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCGTGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN79 :SEQ ID 175GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAGGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN80 :SED ID 176GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA>ACTN81 :SEQ ID 177GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCAAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCGTGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAGGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN82 :SEQ ID 178GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN83 :SEQ ID 179GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAGGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN84 :SEQ ID 180GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN85 :SEQ ID 181GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCGTGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN86 :SEQ ID182GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA >ACTN87 :SEQ ID 183GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN88 :SEQ ID 184GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN89 :SEQ ID 185GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN90 :SEQ ID 186GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN91 :SEQ ID 187GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAGGACCAAGGACAT CGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATC GCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGGCC AACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCAT CAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN92 :SEQ ID 188GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATC GGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGC CGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCG CCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATC ATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA>ACTN93 :SEQ ID 189
權(quán)利要求
1.一種使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，所述方法包括用培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞，持續(xù)足以使所述多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的一段時(shí)間，所述培養(yǎng)基含有肽，所述肽包含含有至少一個(gè)點(diǎn)突變的激活素A的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)點(diǎn)突變是激活素A氨基酸序列中的至少一個(gè)選自如下的氨基酸殘基10I、16F、39Y、41E、43E、74F、75A、76N、77L、78K、79S和 82V。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述至少一個(gè)點(diǎn)突變選自缺失、插入和置換。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)點(diǎn)突變是激活素A氨基酸序列中的至少一個(gè)選自如下的氨基酸殘基16F、18V、19S、20F、37A、38N、39Y、41E、74F、82V、107N、 109I、110V和 116S。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)點(diǎn)突變選自缺失、插入和置換。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步修飾所述包含含有至少一個(gè)點(diǎn)突變的激活素A氨基酸序列的肽，以含有至少一個(gè)能特異性結(jié)合至親和純化柱中的固相基質(zhì)上的配體的區(qū)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述至少一個(gè)能特異性結(jié)合至親和純化柱中的固相基質(zhì)上的配體的區(qū)域是金屬結(jié)合位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述金屬結(jié)合位點(diǎn)包含一對(duì)組氨酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。具體來(lái)講，本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法和組合物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生和純化能使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的試劑的方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102171330SQ200980134985
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者E·基, G·拉胡納桑, J·A·康諾爾, J·R·帕迪納斯, J·劉, J·戴維斯, M·J·亨特, R·V·斯萬(wàn)森 申請(qǐng)人:森托科爾奧索生物科技公司