專利名稱：使用染色體非整合型病毒載體制造經(jīng)初始化的細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)初始化的細胞的制造方法、通過該方法制造的細胞、以及該方法中使用的組合物等。特別是，本發(fā)明涉及由分化的體細胞制造多能干細胞的方法、以及通過該方法制備的多能干細胞。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(ES細胞)是從哺乳動物胚泡的內(nèi)部細胞團建立的干細胞，其在保持了分化成所有細胞的能力(分化多能性)的同時，還能夠無限增殖。由于該特性，將從ES細胞大量誘導(dǎo)、制備的心肌細胞、神經(jīng)細胞移植給心肌梗塞、帕金森病患者來進行治療的干細胞療法備受期待。此外，其作為病理、藥理基礎(chǔ)研究或藥物研發(fā)的開發(fā)工具的應(yīng)用也令人期待。但是，該ES細胞存在利用和犧牲人受精卵這樣的倫理問題。此外，還存在有限的供體受精卵的組織相容性抗原與患者不一致這樣的免疫排斥問題。另一方面，生物體的各組織中存在神經(jīng)干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞等組織干細胞。組織干細胞不使用受精卵， 因此少有或者沒有倫理問題；此外，由于可以使用患者自身的細胞，因而可以避免免疫排斥反應(yīng)。但是，組織干細胞的性質(zhì)并不一定清楚，因而分離困難，且數(shù)量極少。而且，組織干細胞的增殖能力、分化能力有限，遠不能與ES細胞相比。如果能夠采取某種手段將組織干細胞、分化細胞等體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕c具有高增殖能力和分化多能性的ES細胞類似的細胞(稱為 ES樣細胞)，對臨床應(yīng)用等而言，這種ES樣細胞將成為理想的干細胞。具體地，采集哺乳動物的細胞、特別是患者的體細胞(皮膚、胃、肺等組織、血液細胞等)，用核初始化因子(nuclear !^programming factors)(誘導(dǎo)核初始化(nuclear !^programming)的因子)刺激培養(yǎng)的這些細胞，制作ES樣細胞(也稱“人工多能干細胞”、 “誘導(dǎo)多能干細胞(iPS細胞)”或“胚胎干細胞樣細胞”)?？梢云诖龑⒃撝谱鞯腅S樣細胞直接或以細胞庫的形式儲備而作為于細胞應(yīng)用于臨床、或者用于包括藥理、病理在內(nèi)的基礎(chǔ)研究(專利文獻1)。此外，還可以使用從患者建立的人工多能干細胞進行藥效確認實驗。核初始化因子(nuclear !^programming factors)包括例如 Oct 基因、Klf 基因、 Myc基因、Sox基因、Nanog基因、LiM8基因、TERT基因以及SV40LargeT基因等(專利文獻 2、非專利文獻1 7)。例如，已知可以使用下述4種重組病毒載體，從上述體細胞制作上述ES樣細胞 (非專利文獻1 7)。當臨床應(yīng)用上述制作的ES樣細胞時，有可能能夠避免免疫排斥問題、 倫理層面問題。(1)包含0ct3/4基因的γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體(以下將其合稱“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”)(2)包含Klf4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(3)包含c-Myc基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(4)包含Sox2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上述專利文獻、非專利文獻如下。
現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 國際公開W02005/080598專利文獻2 國際公開W02007/069666非專利文獻

非專利文獻1 =Cell. 2007 Nov 30 ；131 (5) :861_872非專利文獻2 :Science. 2007Dec 21 ；318 (5858) :1917_1920非專利文獻3 :Nat Biotechnol. 2008Jan ；26(1) 101-106非專利文獻4 :Science. 2007Dec 21 ；318 (5858) :1920_1923非專利文獻5 =Nature. 2008Jan 10 ；451 (7175) 141-146非專利文獻6 :PNAS. 2008Feb 26 ； 105 (8) :2883_2888非專利文獻7 =Cell. 2008Apr 18 ； 133 (2) :250_26
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題但是，就使用上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制作的ES樣細胞而言，必須注意因載體對宿主染色體的整合而引起染色體的結(jié)構(gòu)性改變。存在導(dǎo)致無法預(yù)料的染色體功能異常的可能性，特別是存在癌細胞化的隱患。其原因是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用。因為在使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下，由于載體對導(dǎo)入細胞的染色體隨機整合，有使染色體內(nèi)的癌抑制基因失活、 或者使與插入位點相鄰的參與癌化的基因活化的危險性(《實驗醫(yī)學(xué)》Vol.26No.5(增刊) PP. 35-40,2008)。此外，當其整合至其它基因或?qū)υ摶虻谋磉_進行修飾的基因時，同樣存在轉(zhuǎn)變?yōu)樾再|(zhì)無法預(yù)期的細胞的可能性。而且，最近認為染色體的所謂非編碼區(qū)域也擔負著一定的染色體功能，因此還必須要考慮逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合到非編碼區(qū)域所帶來的不期望的結(jié)果。再者，在載體插入?yún)⑴c多能干細胞的分化的基因的情況下，對于使用通過分化干細胞而得到的細胞進行的治療或研究，也存在因不能進行分化而無法獲得細胞、因而無法實施的可能性。這樣，在基于傳統(tǒng)方法的細胞初始化中，除了使用所得ES樣細胞進行治療存在安全性問題之外，在使用由患者建立的ES樣細胞的藥效、病理學(xué)分析中，還必須考慮因染色體內(nèi)外源基因的插入而引起的、原本在細胞中發(fā)揮功能的基因的失活或活化所造成的影響，而這樣的分析成為極其困難的操作。此外，在使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下，即使是同一研究者，也會由于批次不同，而存在無法保證人工多能干細胞的均一性的問題；或者，不同制作者即使按相同規(guī)程進行制作，所建立的ES樣細胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體會插入到染色體內(nèi)的不同位置，這也會存在無法保證人工多能干細胞的均一性的問題。本發(fā)明旨在從根本上解決諸如上述的問題，提供簡便且有效地制造染色體上未整合外源基因的ES樣細胞、S卩非染色體重組ES細胞的方法。此外，本發(fā)明提供用于在該方法中對誘導(dǎo)初始化有用的基因?qū)虢M合物。此外，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的方法獲得的多能干細胞。解決問題的方法本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過使用染色體非整合型載體，能夠制造染色體上未整合外源基因的多能干細胞。
S卩，本發(fā)明涉及使用染色體非整合型載體的多能干細胞的制造方法、以及采用本發(fā)明的方法制作的ES樣細胞等，更具體地，涉及各項權(quán)利要求中記載的發(fā)明。而且，引用同一權(quán)利要求的權(quán)利要求所記載的發(fā)明中的兩者或更多的任意組合所構(gòu)成的發(fā)明，也是本說明書中所意圖的發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及〔1〕一種用于在細胞的初始化中導(dǎo)入基因的方法，該方法包括使用染色體非整合型病毒載體將該基因?qū)爰毎?；?〕〔1〕所述的方法，其中，所述初始化是誘導(dǎo)多能干細胞；〔 3〕〔 1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述染色體非整合型病毒載體是RNA病毒載體；〔4〕〔3〕所述的方法，其中，所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；〔5〕〔4〕所述的方法，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體；〔6〕〔5〕所述的方法，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體； 〔7〕〔1〕 〔6〕中任一項所述的方法，其中，該基因選自下述的(1) (8)(I)Oct 基因(2) Klf 基因(3) Myc 基因(4) Sox 基因(5) Nanog 基因(6)Lin28 基因(7) SV40LargeT 抗原基因⑶ TERT 基因；〔8〕用于細胞的初始化中的基因?qū)氲慕M合物，其包含染色體非整合型病毒載體；〔9〕〔8〕所述的組合物，其中，所述初始化是誘導(dǎo)多能干細胞；(10)〔8〕或〔9〕所述的組合物，其中，所述染色體非整合型病毒載體是RNA病毒載體；〔11〕(10)所述的組合物，其中，所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；〔12〕〔11〕所述的組合物，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體；〔13〕〔12〕所述的組合物，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體；〔14〕〔8〕 〔13〕中任一項所述的組合物，其中，該基因選自下述的(1) ⑶(I)Oct 基因(2) Klf 基因(3) Myc 基因(4) Sox 基因(5) Nanog 基因(6)Lin28 基因(7) SV40LargeT 抗原基因⑶ TERT 基因。此外，本發(fā)明涉及〔1〕制造經(jīng)初始化的細胞的方法，該方法包括使至少一種染色體非整合型病毒載體與經(jīng)分化的細胞接觸的步驟；〔2〕〔1〕所述的方法，其中，經(jīng)初始化的細胞是人工多能干細胞；〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，該載體是攜帶至少一種編碼核初始化因子的基因的至少一種染色體非整合型病毒載體；〔4〕〔3〕所述的方法，其中，該基因選自下述的(1) (8)(I)Oct 基因(2) Klf 基因(3) Myc 基因Sox 基因(5) Nanog 基因(6)Lir^8 基因(7) SV40LargeT 抗原基因(8) TERT 基因；〔5〕〔1〕 〔4〕中任一項所述的方法，其中，組合載體，使得細胞內(nèi)內(nèi)源性或外源性表達至少Oct基因、Klf基因和Sox基因這3種基因、或者至少Oct基因、Sox基因、Nanog 基因、LiM8基因這4種基因。〔6〕〔5〕所述的方法，其中，組合載體，使得細胞內(nèi)內(nèi)源性或外源性表達至少Oct基因、Klf基因、Sox基因和Myc基因這4種基因；〔7〕〔1〕 〔6〕中任一項所述的方法，其中，所述染色體非整合型病毒載體是RNA 病毒載體；〔8〕〔7〕所述的方法，其中，所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；〔9〕〔8〕所述的方法，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體；〔10〕〔9〕所述的方法，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體；〔11〕制造經(jīng)分化的細胞的方法，該方法包括使通過〔1〕 〔10〕中任一項所述的方法制造的細胞分化的步驟；〔12〕通過〔1〕 〔11〕中任一項所述的方法制造的細胞；〔13〕〔12〕所述的細胞，其中，載體未通過初始化步驟整合至染色體中；〔14〕用于在細胞的初始化中使用的組合物，其包含染色體非整合型病毒載體作為表達載體；〔15〕〔14〕所述的組合物，其中，初始化是從經(jīng)分化的細胞誘導(dǎo)多能干細胞；(16)〔 14〕或〔15〕所述的組合物，其中，所述染色體非整合型病毒載體是RNA病毒載體；(17) (16)所述的組合物，其中，所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；〔18〕〔17〕所述的組合物，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體；〔19〕〔18〕所述的組合物，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體；〔20〕〔14〕 〔19〕中任一項所述的組合物，其中，載體至少攜帶編碼選自下述的 (1) (8)的初始化因子的基因(I)Oct 基因(2) Klf 基因
(3)Myc基因(4)Sox基因
⑶Nanog基因(6)Lin28基因(7)SV40LargeT 抗原基因 (8)TERT基因；〔21〕染色體非整合型病·；載體在制造用于經(jīng)分化的細胞的初始化的藥物中的用途；〔22〕〔21〕所述的用途，其中，所述初始化是經(jīng)分化的細胞誘導(dǎo)多能干細胞； (23)〔21〕或〔22〕所述的用途，其中，所述染色體非整合型病毒載體是RNA病毒載
體；〔24〕〔23〕所述的用途，其中，所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體； 〔25〕〔24〕所述的用途，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體；〔26〕〔25〕所述的用途，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體； 〔27〕〔21〕 〔26〕中任一項所述的用途，其中，所述載體至少攜帶編碼選自下述的 (1) (8)的初始化因子的基因 (I)Oct基因 U) Klf基因(3)Myc基因(4)Sox基因(5)Nanog 基因(6)Lin28基因(7)SV40LargeT 抗原基因 (8)TERT基因。此外，本發(fā)明涉及〔1〕攜帶選自下述的(1) (8)的基因的染色體非整合型病毒載體 (I)Oct基因 U) Klf基因(3)Myc基因(4)Sox基因(5)Nanog 基因(6)Lin28基因(7)SV40LargeT 抗原基因 (8)TERT基因； 〔2〕〔 1〕所述的載體，其中，所述染色體非整合型病毒載體是RNA病毒載體；〔3〕〔 2〕所述的載體，其中，所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；〔4〕〔3〕所述的載體，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體；〔5〕〔4〕所述的載體，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體。 而且，本說明書中記載的任意發(fā)明要素及其任意組合，均是本說明書所意圖的。此外，在這些發(fā)明，除本說明書所述的任意要素或其任意組合以外的發(fā)明，也是本說明書所意圖的。此外，對于本發(fā)明，說明書中中記載的某特定實施方式不僅公開其本身，還公開包含該實施方式的更上位的本說明書中公開的發(fā)明中的除該實施方式以外的發(fā)明。發(fā)明的效果如以上說明的，通過本發(fā)明的方法制作的細胞的染色體上未整合外源基因，因而， 不僅適合于利用該細胞的試驗、研究，而且在疾病的治療中也可以期待能夠避免免疫排斥問題、倫理層面問題，進而避免基于遺傳毒性的癌化的危險性、染色體功能變化引起的不可預(yù)期的副作用、以及細胞性質(zhì)的變化。而且，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠從包括成人皮膚細胞在內(nèi)的希望的細胞種類以顯著高于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳統(tǒng)方法的效率(例如約10倍)誘導(dǎo)多能干細胞。而且，就使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳統(tǒng)方法而言，即使采用完全相同的規(guī)程來制作細胞，所建立的ES樣細胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體仍會插入到染色體內(nèi)的不同位置，因而無法保證人工多能干細胞的均一性；與此相對，采用本發(fā)明的方法，載體不插入到染色體上，因而能夠穩(wěn)定地制作遺傳上更均一的細胞。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒通常具有強的向性，例如，對于目前的常規(guī)初始化方法中使用的同向性(ecotropic)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而言，存在或外部導(dǎo)入有逆轉(zhuǎn)錄病毒受體是初始化的先決條件，在沒有表達逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的動物物種中建立人工多能干細胞是困難的。與此相對，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于廣泛的動物物種(全體哺乳動物)，例如應(yīng)用于猴、豬等作為疾病模型動物需求大的生物物種。


[圖1]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的形態(tài)的照片。上圖的中間和右邊的圖顯示載體導(dǎo)入后23日的集落。下圖顯示傳代后的集落。[圖2]通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的堿性磷酸酶染色結(jié)果。[圖3]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的細胞內(nèi)特定基因的表達量的結(jié)果。顯示出了使用從堿性磷酸酶陽性集落群(ALP(+))制備的mRNA(圖(a))和從單一集落制備的 mRNA(圖(b))的RT-PCR的結(jié)果。在這些細胞中，不僅確認了 0ct3/4、Sox2、Klf4、和c-Myc 的表達，而且還觀察到了 ES細胞標志物Nanog的表達(圖(a)和(b))。此外，在從單一克隆傳代的細胞中，確認了 hTERT的表達，這是顯示無限增殖能力的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活化的指標(圖(b))。BJ 未導(dǎo)入載體的細胞。NCCIT 胚胎癌細胞(陽性對照)。對照是無模板 DNA的陰性對照。[圖4]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的ES標識物的表達的結(jié)果。BJ:未導(dǎo)入載體的細胞。NCCIT 胚胎性癌細胞(陽性對照)。對照是無模板DNA的陰性對照。[圖5]對通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性進行檢測的結(jié)果。[圖6]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的多分化能力的結(jié)果。示出了胚狀體形成實驗的結(jié)果。[圖7]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的多分化能力(體外)的結(jié)果。顯示利用本發(fā)明的載體從人BJ細胞誘導(dǎo)的無病毒的誘導(dǎo)多能性干(iPS)細胞在體外向中胚層 (心肌、血細胞)、外胚層(TH陽性多巴胺能神經(jīng)元)、內(nèi)胚層(Soxl7陽性細胞和PDXl陽性胰β細胞)來源的有用細胞的分化。[圖8]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的多分化能力(體內(nèi))的結(jié)果。將利用本發(fā)明的載體從人BJ細胞誘導(dǎo)得到的無病毒的iPS細胞HNLs、HNLl施用于免疫缺陷小鼠的皮下而制作的胚胎瘤。a:各種分化組織。b:軟骨和分泌細胞(黑箭頭)。(骨組織(1: 從分泌組織(黑箭頭)和神經(jīng)上皮分化而得的視網(wǎng)膜樣組織(白箭頭)。e 變移上皮組織 (中)。f 硬骨和骨髓樣組織(白箭頭)。g 胃腸道樣組織。h 球形組織。i 心肌樣組織。[圖9]顯示通過本發(fā)明的方法獲得的細胞的實驗胚胎學(xué)的結(jié)果。a:分別針對 0ct3/4和Nanog采用亞硫酸氫鹽測序法分析了人ES細胞特異性啟動子區(qū)域的活化狀態(tài)。 活化的去甲基化區(qū)域用白圈表示，甲基化區(qū)域用黑圈表示。針對親本株人新生兒周皮細胞 BJ來源的kV-iPS克隆HNLl和HNLs、人成人皮膚細胞HDF來源的％V_iPS克隆7H5進行了分析。所有kV-iPS細胞在兩個區(qū)域中均確認了相應(yīng)啟動子的活化。b 對于利用SeV從人BJ細胞誘導(dǎo)得到的無病毒iPS細胞HNLl用微陣列進行了基因表達分析，與作為親本株的BJ細胞和人ES細胞H9株進行了比較。以r表示相關(guān)系數(shù)。其結(jié)果是，與已經(jīng)報導(dǎo)的通過逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的人iPS細胞HDF-iPS相比，無外源基因的kV-iPS顯示出更接近人ES 細胞H9株的表達譜(profile)(相關(guān)系數(shù)r = 0. 9789)。[圖10]通過細胞增殖除去導(dǎo)入的外源基因和仙臺病毒載體。這是顯示導(dǎo)入的外源基因和仙臺病毒GeV)載體隨著細胞增殖被稀釋/除去的圖。(A)對于來源于新生兒細胞(BJ)或成人細胞(HDF)的kV-iPS細胞(使用18+c-Myc的BJ來源克隆4BJ1， Bl ；HDF來源克隆使用7H5、HNL-c-Myc的BJ來源克隆HNLs，HNLl 6，HNLp)，通過使用識別載體部分的序列的引物進行RT-PCR隨時間測定了其中導(dǎo)入的外源基因的表達減少(P 表示傳代數(shù))。隨著傳代的進行，確認了 4個導(dǎo)入初始化因子減少為3個、2個的現(xiàn)象。觀察到這樣的傾向當在18+位導(dǎo)入外源基因時，c-Myc最先被除去；而當在HNL位導(dǎo)入c-Myc 時，c-Myc保留到最后。這提示，通過4個載體之間的組合，具有一定的復(fù)制優(yōu)勢。此外，用 HNL-c-Myc誘導(dǎo)的克隆HNLs和HNLl中完全不存在外源基因。(B) iPS細胞內(nèi)的SeV基因組的隨時間性減少。像A中那樣，采用定量RT-PCR測定了各iPS細胞克隆中SeV基因組的隨時間性減少。其結(jié)果，通過定量PCR也確認了 SeV基因組隨傳代而減少的事實，且明確了在 HNLl和HNLs克隆中SeV基因組的消失。(C) iPS細胞內(nèi)的SeV蛋白質(zhì)的消失。利用抗SeV 抗體進行Wfesternep跡同樣確認了 A、B中已確認的SeV來源基因在HNLl和HNLs中的消失，而且可以確認不僅基因組消失，SeV來源蛋白質(zhì)也消失了。[圖11]利用抗病毒蛋白質(zhì)抗體回收病毒載體陰性細胞集團。(上圖)顯示iPS 集落內(nèi)的病毒載體稀釋。利用抗HN抗體進行的針細胞集落的染色提示集落內(nèi) SeV陽性細胞與陰性細胞混合存在，如左模式圖所示那樣，通過選擇病毒粒子少的部分來回收陰性群體是可行的(P:傳代數(shù))。(下圖)實際上，可以以SeV感染細胞表面展現(xiàn)的HN抗原為指標，利用抗HN抗體來除去SeV陽性細胞。HkV-iPS細胞群體(殘存c-Myc/SeV的株HNLp4親本(parent))與抗HN抗體反應(yīng)，并使它們結(jié)合于IMag(BD)磁珠，回收其陰性級分，通過RT-PCR確認為陰性(HNL4p-)。此外，對陽性群體進行濃縮也是可行的 (HNL4p+)。[圖12]新溫度敏感株(TS)的特性。實施例1中使用的TS株在37°C的細胞毒性少，而即使從35°C變化到39°C，所加載的GFP蛋白的表達的變化也比較少(對照TS/ Δ F)。但是，對于新構(gòu)建的TS7 (Υ942Η，L1361C，L1558I)，在38°C以上未觀察到GFP的表達； TS13(P2, L1558I)中 37°C 的表達低于；TS15 (P2，L1361C，L1558I)中在 37°C基本未見GFP的表達。[圖13]利用溫度敏感株TS7，TS13，TS15/AF/SeV進行的人 iPS細胞誘導(dǎo)及病毒的除去。A.使在TS7，TS13或TS15的HNL位(HN基因與L基因之間)上攜帶c_Myc而得的 Δ F/TS/SeV、與在TS中攜帶0ct3/4，Sox2,Klf4而得的Δ F/TS/SeV同時感染新生兒周皮細胞BJ，誘導(dǎo)了人iPS細胞。分離得到的iPS細胞，A. RT-PCR的結(jié)果顯示，其半數(shù)以上變成無外源基因；B.在對無外源基因的iPS細胞克隆中的SeV蛋白質(zhì)進行確認時，顯示即使在蛋白水平也完全無病毒。(4BJ1和Bl =SeV表達iPS細胞；對照SeV感染LLC-MK2細胞)。[圖14]利用溫度敏感株TS7、TS13、TS15/AF/SeV誘導(dǎo)的人iPS細胞的ES標識物表達。針對在圖13所示的實驗中已確認無外源基因、無病毒的iPS細胞克隆，通過RT-PCR 確認了 ES標識物的表達。在全部的無病毒的iPS細胞中均確認了所考察的全部ES標識物的表達。[圖15]利用其它SeV載體、初始化因子誘導(dǎo)的SeV-iPS細胞。㈧在Lm(Y1214F) AF/SeV (與實施例1中所用的TS Δ F/SeV不同的載體骨架)中加載0ct3/4，Sox2，0ct4， Nanog，進行了 iPS細胞誘導(dǎo)，得到了堿性磷酸酶(ALP)陽性的ES樣細胞集落。(B)利用 Thomson 的 4 個因子(0ct3/4，Sox2, Nanog, Lin28 Δ F/TS/SeV)進行 iPS 細胞誘導(dǎo)。除了 Yamanaka 的 4 個因子(0ct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)(左圖)以外，利用 Thomson 的 4 個因子 (0ct3/4，Sox2，Nanog，Lin28 Δ F/TS/SeV)(右圖)也誘導(dǎo)出了 iPS 細胞。發(fā)明的
具體實施例方式以下，對本發(fā)明的實施方式進行具體說明。本發(fā)明提供使用染色體非整合型病毒載體誘導(dǎo)經(jīng)分化的細胞的初始化的方法、 特別是從體細胞制造多能干細胞的方法。該方法包括使例如攜帶編碼希望導(dǎo)入的核初始化因子(nuclear reprogramming factor (s))的基因的染色體非整合型病毒載體與體細胞等經(jīng)分化的細胞相接觸的步驟。更具體地，本發(fā)明提供用于在細胞的初始化中導(dǎo)入基因的方法，該方法是使用染色體非整合型病毒載體將該基因?qū)胗行枰募毎槐景l(fā)明還提供用于該方法的包含染色體非整合型病毒載體的組合物。本發(fā)明中，多能干細胞是指由動物的胚泡期的胚的內(nèi)部細胞團產(chǎn)生的干細胞或具有與之相似的表現(xiàn)型的細胞。具體地，本發(fā)明中誘導(dǎo)的多能干細胞是表達作為ES樣細胞的指標的堿性磷酸酶的細胞。此外優(yōu)選地，多能干細胞通過培養(yǎng)形成由相對于細胞質(zhì)的細胞核的比率高的細胞構(gòu)成的扁平集落。培養(yǎng)可以是與適宜的飼養(yǎng)細胞(feeder) —起進行。此外，在數(shù)周內(nèi)停止增殖的MEF等培養(yǎng)細胞相對， 多能干細胞能夠長期傳代，這根據(jù)其經(jīng)過傳代例如每3日一次傳代進行15次以上、優(yōu)選20 次以上、25次以上、30次以上、35次以上、或40次以上之后亦不失去增殖性的事實來加以確證。此外，多能干細胞優(yōu)選表達內(nèi)源性的0ct3/4或Nanog，更優(yōu)選表達這兩者。此外，多能干細胞優(yōu)選表達TERT，顯示端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(合成端粒重復(fù)序列的活性)。此外，多能干細胞優(yōu)選具有分化成三胚層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)的能力(例如在畸胎瘤形成和/ 或胚狀體形成中)。更優(yōu)選地，多能干細胞通過移植至胚泡生成種系嵌合體。能夠種系傳遞 (Germline transmission)的多能干細胞是指具有種系嵌合能力(germline-competent) 的多能干細胞。這些表現(xiàn)型的確認可以通過公知的方法來實施(W02007/69666 ；Ichisaka T 等，Nature 448(7151) :313_7，2007)。此外，本發(fā)明中“已分化”是指例如，分化程度高于多能干細胞，包括尚保持著分化成多種細胞譜系的能力的狀態(tài)(例如體性干細胞等)、以及終末分化的狀態(tài)。經(jīng)分化的細胞是指來源于多能干細胞的(多能干細胞以外的)細胞。經(jīng)分化的細胞可以是例如不具有分化成三胚層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)的能力的細胞。這樣的細胞如果不經(jīng)過初始化 (r印rogramming)，就不具有形成三胚層的能力。此外，經(jīng)分化的細胞可以是例如不能生成自身所屬的胚層類型以外的細胞的細胞。經(jīng)分化的細胞可以是體細胞，例如可以是生殖細胞以外的細胞。本發(fā)明中初始化(reprogramming)是指使某細胞的分化狀態(tài)成為較之未分化的狀態(tài)，包括例如經(jīng)分化的細胞脫分化，例如從不具有分化多能性的細胞誘導(dǎo)具有分化多能性的細胞、例如多能干細胞。此外，本發(fā)明中脫分化是指使某細胞成為更不成熟的(例如未分化的)狀態(tài)。脫分化也可以是指某細胞返回其分化的最初狀態(tài)或中途狀態(tài)。此外，脫分化也可以是指從不能生成自身所屬的胚層類型以外的細胞的細胞變成能夠分化成其它胚層的細胞的狀態(tài)。脫分化包括例如，不具有三胚層分化能力的細胞獲得三胚層分化能力。 此外，脫分化包括多能干細胞的生成。此夕卜，本發(fā)明中，體細胞是指例如多能干細胞以外的細胞。體細胞包括例如，構(gòu)成多細胞生物的細胞中的多能干細胞以外的細胞、及其培養(yǎng)細胞。體細胞包括例如，體性干細胞和終末分化的細胞。本發(fā)明中，病毒載體是具有相應(yīng)的病毒來源的基因組核酸，并能夠通過在該核酸中整合導(dǎo)入基因而表達該基因的載體。此外，本說明書中，用于制造多能干細胞的染色體非整合型病毒載體是指來源于病毒的、能夠?qū)⒒驅(qū)氚屑毎牟《据d體，而且其是不存在導(dǎo)入的基因整合至宿主染色體(核來源染色體)的危險性的攜帶體(carrier)。通過構(gòu)建攜帶外源基因的染色體非整合型病毒載體，能夠得到本發(fā)明中使用的重組非整合型病毒載體。此外，本發(fā)明中，病毒載體除了包括感染病毒粒子之外，還包括病毒核心、病毒基因組與病毒蛋白質(zhì)的復(fù)合體、或包含非感染性病毒粒子等的復(fù)合體，它們是具有導(dǎo)入細胞中而表達加載的基因的能力的復(fù)合體。例如，在RNA病毒中，由病毒基因組及與之結(jié)合的病毒蛋白質(zhì)構(gòu)成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)能夠在導(dǎo)入細胞后向細胞中導(dǎo)入表達基因 (W000/70055)。針對細胞的導(dǎo)入可以使用適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑等來進行。本發(fā)明中的病毒載體也包括這樣的核糖核蛋白(RNP)。本發(fā)明中，“不存在整合至宿主染色體的危險性”，是指在導(dǎo)入病毒載體時，病毒載體向宿主染色體整合的頻率充分地低。優(yōu)選地，向宿主染色體整合的頻率例如，在以10PFU/ 細胞感染人纖維肉瘤來源細胞株HT1080(ATCC CCL121)時為5X 10_4以下、更優(yōu)選10_4以下、更優(yōu)選10_5以下、更優(yōu)選10_6以下、更優(yōu)選10_7以下。本發(fā)明中使用的非整合型病毒載體特別優(yōu)選為RNA病毒。本發(fā)明中，RNA病毒是指具有RNA基因組、且在生命周期中不具有DNA階段的病毒。本發(fā)明中，RNA病毒不具有逆轉(zhuǎn)錄酶(即，不包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)。即，在病毒增殖中，病毒基因組不經(jīng)由DNA，而通過RNA依賴性RNA聚合酶被復(fù)制。RNA病毒不具有DNA階段，因此，通過使用RNA病毒載體，能夠?qū)⑨槍λ拗魅旧w的整合風險抑制在最小限度。RNA病毒包括單鏈RNA病毒(包括正鏈RNA病毒和負鏈RNA病毒)和雙鏈RNA病毒。 此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(無包膜病毒；non-enveloped viruses)，優(yōu)選使用有包膜病毒來源的載體。本發(fā)明中，RNA病毒具體包括屬于以下的科的病毒。
沙粒病毒科(Arenaviridae)如拉沙病毒等正粘病毒科(Orthomyxoviridae)如流感病毒等冠狀病毒科(Coronaviridae)如SARS病毒等披膜病毒科(Togaviridae)如風疹病毒等副粘病毒科(Paramyxoviridae)如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙臺病毒、如RS
病毒等微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)如脊髓灰質(zhì)炎病毒、克沙奇病毒、艾可病
母寺纖維病毒科(Filoviridae)如馬爾堡病毒、埃博拉出血熱病毒等黃病毒科(Flaviviridae)如黃熱病病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎
病毒等布尼亞病毒科(Bunyaviridae)；包括布尼亞病毒屬、漢坦病毒屬、內(nèi)羅病毒屬和白蛉病毒屬等彈狀病毒科(lihabdoviridae)如狂犬病病毒等，以及呼腸孤病毒科(Reoviridae)本發(fā)明中使用的染色體非整合型病毒載體是例如負鏈RNA病毒載體。負鏈RNA 病毒載體是指由包含負鏈(相對于編碼病毒蛋白質(zhì)的有義鏈的反義鏈)的RNA作為基因組的病毒構(gòu)成的載體。負鏈RNA也稱作陰性鏈RNA。作為本發(fā)明中作為示例公開的負鏈 RNA病毒，特別可以列舉出單鏈負鏈RNA病毒(也稱非分節(jié)型(non-segmented)負鏈RNA 病毒)?！皢捂滉幮枣淩NA病毒”是指基因組中具有單鏈陰性鏈[即負鏈]RNA的病毒。作為這樣的病毒，包括屬于副粘病毒(副粘病毒科；包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)，麻疹病毒屬(Morbillivirus)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)和肺病毒屬(Pneumovirus)等)、 彈狀病毒(彈狀病毒科；包括水皰病毒屬(Vesiculovirus)，狂犬病毒屬(Lyssavirus)和短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)等)、纖絲病毒(Filoviridae)等科的病毒，其在分類學(xué)上屬于單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)(々〗> ^第57卷第1期pp^_36、2007 ； Annu. Rev. Genet. 32,123-162,1998 ；Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven,1305-1340,2001 ；Microbiol. Immunol. 43,613-624, 1999 ；Field Virology, Third edition ppl205_12411996)。作為本發(fā)明中作為示例公開的負鏈RNA病毒載體，可以列舉出副粘病毒載體。副粘病毒載體是來源于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的病毒載體?？梢粤信e出例如作為副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙臺病毒(Sendai virus)。作為其它例子，可以列舉出新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疫病毒(Measles virus)、RS 病毒(Respiratory syncytial virus)、牛癌病毒 (rinderpest virus)、瘟熱病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒 1，2，3型、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、彈狀病毒科 (Rhabdoviridae)的水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)等。作為可在本發(fā)明中使用的病毒的進一步示例，包括例如仙臺病毒、人副流感病毒-1 (HPIV-I)、人副流感病毒-3 (HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(⑶V)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒 (Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒_2(HPIV_2)、猴副流感病毒5 (SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒_4b (HPIV_4b)、流行性腮腺炎病毒(Mumps)、和新城疫病毒(NDV)等。更優(yōu)選地，可以列舉出選自仙臺病毒(SeV)、人副流感病毒-I(HPIV-I)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒 (Nipah)中的病毒。本發(fā)明中使用的載體可以是例如屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒或其衍生物，例如屬于呼吸道病毒屬(genus Respirovirus) (也稱副粘病毒屬(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中包括在不損害病毒的基因?qū)肽芰Φ耐瑫r病毒基因被修飾的病毒和化學(xué)修飾的病毒。作為可適用于本發(fā)明的呼吸道病毒屬病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-I)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、 牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙臺病毒(也稱小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型 (SPIV-10)等。
作為本發(fā)明中作為示例公開的負鏈RNA病毒，更具體地，可以列舉出仙臺病毒。 野生型仙臺病毒的基因組在3'的短前導(dǎo)區(qū)域之后，依次包含核殼(N)基因、磷(P)基因、 基質(zhì)(M)基因、融合(F)基因、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因和大(L)基因、以及短的 5'-后隨序列(trailer)區(qū)域。與野生型病毒相當?shù)闹亟M載體以及各種突變型載體的制作均是已知的。而且還顯示，僅使用除去該病毒的包膜而得到的RNP也能夠?qū)崿F(xiàn)基因?qū)?(W000/70055)。因此，基于RNP的初始化也包含在本發(fā)明中。對于其它病毒的RNP也是一樣。本發(fā)明中的染色體非整合型病毒可以來源于天然株、野生株、突變株、實驗室傳代株和人工構(gòu)建的株等?？傊摬《局灰軌蛘T導(dǎo)目的初始化，可以是具有與從自然界分離的病毒相同的結(jié)構(gòu)的病毒載體，也可以是通過基因重組進行人工修飾而得到的病毒。例如，可以是野生型病毒所具有的任何基因中存在突變、缺損的病毒。此外，還可以使用DI粒子(J. Virol. 68 :8413-8417，1994)等不完全病毒。例如，可以適宜使用編碼病毒的包膜蛋白質(zhì)或外殼蛋白質(zhì)的至少1個基因中具有突變或缺損的病毒。這樣的病毒載體可以是例如能夠在感染細胞中復(fù)制基因組、但不能形成感染性病毒粒子的病毒載體。這樣的復(fù)制能力缺損型病毒載體沒有將感染擴大至周圍的隱患，因而安全性高。例如可以使用不含有編碼F、H、HN、或G等包膜蛋白質(zhì)或刺突蛋白質(zhì)的基因中的至少1個或者它們的組合的負鏈 RNA 病毒(W000/70055 和 W000/70070 ；Li, H. -0.等，J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。 如果基因組RNA中編碼基因組復(fù)制所必需的蛋白質(zhì)(例如N、P、和L蛋白質(zhì))，則能夠在感染細胞中擴增基因組。為了制造缺損型病毒，例如可以在病毒產(chǎn)生細胞中外源性地供給缺損的基因產(chǎn)物或能夠補償該基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)(W000/70055和W000/70070 ；Li, H. -0.等， J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。此外，不需與缺損的病毒蛋白質(zhì)完全互補、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒載體的方法也是已知的(W000/70070)。此外，在以 RNP (例如由N、L、P蛋白質(zhì)和基因組RNA構(gòu)成的RNP)的形式回收病毒載體的情況下，能夠制造載體，而無需補償包膜蛋白質(zhì)。此外，還優(yōu)選使用攜帶突變型病毒蛋白質(zhì)基因的病毒載體。本發(fā)明特別提供初始化中的基因?qū)敕椒ㄒ约敖?jīng)初始化的細胞的制造方法，其中使用了病毒基因中具有突變和 /或缺失的RNA病毒載體。例如，對于包膜蛋白質(zhì)、外殼蛋白質(zhì)，已知有包括弱毒化突變、溫度敏感性突變在內(nèi)的多種突變。本發(fā)明中可以適宜地使用具有這些突變蛋白質(zhì)基因的RNA 病毒。本發(fā)明中優(yōu)選可以使用細胞毒性減弱的載體。細胞毒性例如可以通過對從細胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)進行定量來測定。例如，可以使用細胞毒性與野生型相比顯著弱化的載體。就細胞毒性弱化的程度而言，可以使用例如以MOI 3感染HeLa(ATCC CCL-2)或猴CV-1(ATCC CCL 70)并培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)液中的LDH釋放量，與野生型相比顯著降低的、 例如降低20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上或50%以上的載體。此外， 降低細胞毒性的突變中包括溫度敏感性突變。溫度敏感性突變是指與低溫(例如30°C 320C )相比，在病毒宿主的通常溫度(例如37°C 38°C )下活性顯著地降低的突變。這樣的具有溫度敏感性突變的蛋白質(zhì)能夠在容許溫度(低溫)下制作病毒，因而便于使用。本發(fā)明中有用的具有溫度敏感性突變的病毒載體，例如與在培養(yǎng)細胞中于30°C進行感染時相比，于37°C進行感染時的增殖速度或基因表達水平為至少1/2以下、優(yōu)選1/3以下、更優(yōu)選 1/5以下、更優(yōu)選1/10以下、更優(yōu)選1/20以下。本發(fā)明中使用的染色體非整合型病毒載體只要不抑制初始化且能夠誘導(dǎo)基于初始化因子的初始化，也可以是野生型，此外，優(yōu)選至少1個、更優(yōu)選至少2、3、4、5個或其以上的病毒基因中具有缺失或突變。缺失和突變還可以針對各基因任意地組合導(dǎo)入。此處所說的突變，可以是功能降低型突變或溫度敏感性突變，而且是至少在37°C下可使病毒的增殖速度或攜帶的基因的表達水平與野生型相比降低至優(yōu)選為1/2以下、更優(yōu)選為1/3以下、更優(yōu)選為1/5以下、更優(yōu)選為1/10以下、更優(yōu)選為1/20以下的突變。使用這樣的修飾病毒載體，特別是對于多能干細胞的誘導(dǎo)而言可能是重要的。例如本發(fā)明中適用的負鏈RNA病毒載體中，至少2個病毒基因發(fā)生了缺失或突變。這樣的病毒包括至少2個病毒基因缺失的病毒、至少2個病毒基因突變的病毒、至少1個病毒基因突變而至少1個病毒基因缺失的病毒。突變或缺失的至少2個病毒基因優(yōu)選是編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。例如F基因缺失、且M和/或HN(或H)基因缺失、或M和/或HN(或H)基因中有突變(例如溫度敏感性突變)的載體，是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。此外，例如F基因缺失、且M或HN(或H)基因也缺失、而余下的M和/或HN(或H)基因中具有突變(例如溫度敏感性突變)的載體，也是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。本發(fā)明中使用的載體，更優(yōu)選至少3個病毒基因(優(yōu)選編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的至少3個基因)缺失或突變。這樣的病毒載體包括至少3個基因缺失的載體、至少3個基因突變的載體、至少1個基因突變且至少2個基因缺失的載體、至少2個基因突變且至少1個基因缺失的載體。更優(yōu)選的實施方式有，例如，缺失F基因、且M和HN(或H)基因也缺失、或M和HN(或H)基因具有突變(例如溫度敏感性突變)的載體，這樣的載體是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。此外，例如F基因缺失、且M或者HN(或H)基因也缺失、而余下的M 或者HN(或H)基因有突變(例如溫度敏感性突變)的載體，本發(fā)明中也是優(yōu)選使用的。這樣的突變型的病毒可以采用公知的方法來制作。例如，作為負鏈RNA病毒的M基因的溫度敏感性突變，可以列舉出選自仙臺病毒的M蛋白質(zhì)中的69位(G69)、116位(Tl 16)和183位(A183)中的任意位點或其它負鏈RNA 病毒M蛋白質(zhì)的同源位點的氨基酸取代(Inoue,M.等，J. Virol. 2003，77 :3238-3246)。其它負鏈RNA病毒M蛋白質(zhì)的同源位點的氨基酸是容易鑒定的，具體地例如，作為與^^ M蛋白質(zhì)的G69相當?shù)腗蛋白質(zhì)的同源位點，可以列舉出人副流感病毒-I(HPIV-I)(括號內(nèi)為簡稱)的G69、人副流感病毒-3(HPIV-;3)的G73、海豹瘟熱病毒(PDV)和犬瘟熱病毒(CDV)的 G70、海豚麻疹病毒(DMV)的G71、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒 (RPV)的G70、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)的G81、人副流感病毒-2 (HPIV-2) 的G70、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒_4b(HPIV_4b)的E47、流行性腮腺炎病毒(Mumps)的E72(文字和編號表示氨基酸及其位置)。此外，作為與M蛋白質(zhì)的T116 相當?shù)母鱉蛋白質(zhì)的同源位點，可以列舉出人副流感病毒-I(HPIV-I)的T116、人副流感病毒-3 (HPIVD的T120、海豹瘟熱病毒(PDV)和犬瘟熱病毒(⑶V)的T104、海豚麻疹病毒 (DMV)的T105、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的T104、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)的T120、人副流感病毒_2 (HPIV-幻和猴副流感病毒5(SW)的T117、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒_4b (HPIV_4b)的T121、流行性腮腺炎病毒(Mumps)的T119、新城疫病毒(NDV)的S120。作為與M蛋白質(zhì)的A183 相當?shù)母鱉蛋白質(zhì)的同源位點，可以列舉出人副流感病毒-I(HPIV-I)的A183、人副流感病毒-3 (HPIVD的F187、海豹瘟熱病毒(PDV)和犬瘟熱病毒(⑶V)的Y171、海豚麻疹病毒 (DMV)的Y172、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的Y171、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)的Y187、人副流感病毒_2 (HPIV-2)的Y184、猴副流感病毒5 (SW)的F184、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒_4b (HPIV_4b)的 F188、流行性腮腺炎病毒(Mumps)的F186、新城疫病毒(NDV)的Y187。在以上所列舉的病毒中，具有編碼各自的M蛋白質(zhì)中上述3個位點中的任一個、優(yōu)選任意2個位點的組合、更優(yōu)選全部3個位點上的氨基酸被其它氨基酸取代的突變M蛋白質(zhì)的基因組的病毒，是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。氨基酸突變優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸，例如取代成BL0SUM62 矩陣(Henikoff，S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) 的值為3以下、優(yōu)選2以下、更優(yōu)選1以下、更優(yōu)選0以下的氨基酸。具體地，可以將仙臺病毒M蛋白質(zhì)的G69、T116和A183或者其它病毒M蛋白質(zhì)的同源位點分別取代成Glu(E)、 Ala(A)和Ser⑶。此外，還可以利用與麻疹病毒溫度敏感株P(guān)253-505 (Morikawa，Y.等， Kitasato Arch. Exp. Med. 1991 :64 ； 15-30)的M蛋白質(zhì)的突變同源的突變。突變的導(dǎo)入例如可以使用寡核苷酸等、采用公知的突變導(dǎo)入方法來實施。此外，作為HN(或H)基因的溫度敏感性突變，例如可以列舉出任意選自仙臺病毒的HN蛋白質(zhì)的262位、264位和461位(K461)中的位點或其它負鏈RNA 病毒M蛋白質(zhì)的同源位點的氨基酸取代(Inoue,M.等，J. Virol. 2003，77 :3238-3246)。具有編碼3個位點中的任何1個、優(yōu)選任意2個位點的組合、更優(yōu)選全部3個位點的氨基酸被取代成其它氨基酸的突變HN蛋白質(zhì)的基因組的病毒，是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。同上述， 氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸。作為優(yōu)選的一個例子，可以將仙臺病毒HN蛋白質(zhì)的h2&2、G264和K461或者其它病毒HN蛋白質(zhì)的同源位點分別取代成Thr(T)、Arg(R)和Gly (G)。此外，例如還可以以流行性腮腺炎病毒的溫度敏感性疫苗株 Urabe AM9為參照，針對HN蛋白質(zhì)的464以及468位的氨基酸導(dǎo)入突變(Wright，K. Ε.等， Virus Res. 2000 :67 ；49-57)。此外，負鏈RNA病毒可以在P基因和/或L基因中具有突變。作為這樣的突變，具體地可以列舉出=SeV P蛋白質(zhì)的86位的Glu(E86)的突變、SeVP蛋白質(zhì)的511位的Leu(L511) 到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒P蛋白質(zhì)的同源位點的取代。同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體地可以示例出86位的氨基酸到 Lys的取代、511位的氨基酸到Wie的取代等。此外，在L蛋白質(zhì)中，可以列舉出L蛋白質(zhì)的1197位的Asn (Ni 197)和/或1795位的Lys(K1795)到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒L蛋白質(zhì)的同源位點的取代，同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體地可以示例出1197位的氨基酸到kr的取代、1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突變能夠顯著提高持續(xù)感染性、2次粒子釋放的抑制或細胞毒性的抑制的效果。而且，通過組合包膜蛋白質(zhì)基因的突變和/或缺損，能夠急劇地提升所述效果。此外，對于L基因，可以列舉出L蛋白質(zhì)的1214位的Tyr(Y1214)和/或 1602位的Met (M1602)到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒L蛋白質(zhì)的同源位點的取代，同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體地可以示例出1214位的氨基酸到Wie的取代、1602位的氨基酸到Leu的取代等。以上示例的突變可以任意組合。在本發(fā)明中，為了表達核初始化因子(nuclear !^programming factors)，特別優(yōu)選使用例如SeV M蛋白質(zhì)的至少69位的G、116位的T以及183位的A，SeV HN蛋白質(zhì)的至少262位的A、264位的G以及461位的K，SeVP蛋白質(zhì)的至少511位的L，SeV L蛋白質(zhì)的至少1197位的N以及1795位的K分別被取代成其它氨基酸，且F基因缺損或缺失的仙臺病毒載體；其它負鏈RNA病毒的各同源蛋白質(zhì)中的同源位點上具有取代突變、且F基因缺損或缺失的F基因缺損或缺失載體；以及具有與之同樣或更低的細胞毒性和/或具有與之同樣或更高的溫度敏感性的F基因缺損或缺失的負鏈RNA病毒載體。作為具體的取代實例， 可以示例出例如M蛋白質(zhì)的G69E、T116A以及A183S取代，HN蛋白質(zhì)的A262T、G264以及 K461G的取代，P蛋白質(zhì)的L51IF取代，以及L蛋白質(zhì)的W197S和K1795E取代。編碼核初始化因子(nuclear !^programming factors)的基因可以配置在例如負鏈RNA基因組的最上游(3'側(cè))(例如N基因的3'側(cè))。但是，對于Myc基因，可以將其配置在其它位置，例如負鏈RNA基因組的后方，即更靠5'側(cè)的位置。例如，可以插入到HN基因與L基因之間。此外，作為L蛋白質(zhì)的突變，還可以列舉出選自SeV L蛋白質(zhì)的942位(Y942)、 1361位(L1361)和1558位(L1558)中的任意位點的氨基酸到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒L蛋白質(zhì)的同源位點的取代。同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體地，可以示例出942位的氨基酸到His的取代、1361位的氨基酸到Cys的取代、1558位的氨基酸到Ile的取代等。特別可以優(yōu)選使用至少942位或1558 位發(fā)生了取代的L蛋白質(zhì)。例如，優(yōu)選除了 1558位以外、1361位也被取代成其它氨基酸的突變L蛋白質(zhì)。此外，還優(yōu)選除了 942位以外、1558位和/或1361位也被取代成其它氨基酸的突變L蛋白質(zhì)。通過這些突變，能夠提高L蛋白質(zhì)的溫度敏感性。此外，作為P蛋白質(zhì)的突變，可以列舉出選自P蛋白質(zhì)的433位(D433)、434 位(R434)和437位(K437)中的任意位點的氨基酸到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA 病毒P蛋白質(zhì)的同源位點的取代。同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體地，可以示例出433位的氨基酸到Ala㈧的取代、434位的氨基酸到 Ala(A)的取代、437位的氨基酸到Ala(A)的取代等。特別可以優(yōu)選使用上述3個位點全部發(fā)生取代的P蛋白質(zhì)。通過這些突變，可以提高P蛋白質(zhì)的溫度敏感性。下述病毒載體也是本發(fā)明中優(yōu)選使用的編碼SeV P蛋白質(zhì)的至少433位的D、434 位的R和437位的K這3個位置被取代成其它氨基酸的突變P蛋白質(zhì)、和SeV L蛋白質(zhì)的至少1558位的L被取代的突變L蛋白質(zhì)(優(yōu)選至少1361位的L也被取代成其它氨基酸的突變L蛋白質(zhì))的、F基因缺損或缺失的仙臺病毒載體；其它負鏈RNA病毒中同源位點發(fā)生突變的F基因缺損或缺失載體；以及具有與之同樣或更低的細胞毒性和/或與之同樣或更高的溫度敏感性的F基因缺損或缺失的負鏈RNA病毒載體。各病毒蛋白質(zhì)中，除了上述突變以外，其它氨基酸(例如10個以內(nèi)、5個以內(nèi)、4個以內(nèi)、3個以內(nèi)、2個以內(nèi)或1個氨基酸) 也可以具有突變。具有上述所示突變的載體顯示高的溫度敏感性，因此在初始化完成后，通過將細胞在稍微的高溫(例如37. 5 39°C、優(yōu)選38 39°C或38. 5 39°C )下進行培養(yǎng)， 能夠簡便地將載體除去。核初始化因子(nuclear !^programming factors)可以適宜插入到基因組的適當位置，例如插入基因組的最上游(3'側(cè))(例如NP基因的3'側(cè))。Myc基因可以插入到例如負鏈RNA病毒的基因組的中央的5'端側(cè)(正中的基因的5'端側(cè))、例如L基因的5'側(cè)或3'側(cè)、特別是L基因的3’側(cè)(例如HN-L間)。載體的細胞毒性，例如可以通過對從細胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)進行定量來測定。具體地例如，測定以MOI 3感染HeLa(ATCC CCL-2)或猴CV-1 (ATCC CCL 70)并培養(yǎng)3 天后的培養(yǎng)液中的LDH釋放量。LDH釋放量越少，細胞毒性越低。此外，溫度敏感性可以通過測定病毒宿主在通常溫度(例如37°C 38°C )下的病毒增殖速度或加載基因的表達水平來確定。與不具有突變的情況相比，病毒的增殖速度和/或攜帶的基因的表達水平越是降低，則判定溫度敏感性越高。此外，在使用有包膜病毒的情況下，可以使用包膜中包含與病毒本來具有的包膜蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)的病毒。例如，在制造病毒時，通過使病毒產(chǎn)生細胞表達希望的外源性包膜蛋白質(zhì)，能夠制造含該外源性包膜蛋白質(zhì)的病毒。對于這樣的蛋白質(zhì)，沒有特殊限制，可以使用對哺乳動物細胞賦予感染能力的希望的粘附因子、配體、受體等蛋白質(zhì)。具體地，可以列舉出例如水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus ；VSV)的G蛋白質(zhì)(VSV-G)。VSV-G蛋白質(zhì)可以來源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株 (J. Virology 39:519-528(1981))來源的VSV-G蛋白，但不限于此。本發(fā)明中作為示例公開的負鏈RNA病毒可以任意組合包含其它病毒來源的包膜蛋白質(zhì)。具有核初始化因子(nuclear !^programming factors)的重組RNA病毒的重構(gòu)可以利用公知方法進行。就作為本發(fā)明的示例公開的負鏈RNA病毒而言，作為具體的規(guī)程，代表性地可以通過下述步驟來制造(a)使編碼負鏈RNA病毒基因組RNA (負鏈)或其互補鏈 (正鏈)的cDNA在表達病毒粒子形成所必需的病毒蛋白質(zhì)(N、PjPL)的細胞中進行轉(zhuǎn)錄的步驟，和(b)回收含有生成的病毒的培養(yǎng)上清的步驟。粒子形成所必需的病毒蛋白質(zhì)可以由轉(zhuǎn)錄后的病毒基因組RNA表達，也可以從基因組RNA以外反式供給。例如，可以將編碼 N、P和L蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒導(dǎo)入細胞來供給。在基因組RNA中粒子形成所必需的病毒基因缺損的情況下，在病毒產(chǎn)生細胞中另行表達該病毒基因，以補全粒子的形成。為了在細胞內(nèi)表達病毒蛋白質(zhì)或RNA基因組，將下述載體導(dǎo)入宿主細胞，所述載體中，編碼所述蛋白質(zhì)或基因組RNA的DNA連接在能夠在宿主細胞中發(fā)揮功能的適當啟動子的下游。轉(zhuǎn)錄的基因組 RNA在病毒蛋白質(zhì)的存在下得以復(fù)制，并形成感染性病毒粒子。
在制造包膜蛋白質(zhì)等基因缺損的缺損型病毒時，在病毒產(chǎn)生細胞中表達能夠補償缺損的蛋白質(zhì)或其功能的其它病毒蛋白質(zhì)等。例如，作為本發(fā)明的示例的負鏈RNA病毒的制造可以采用以下的公知方法來實施(W097/16539 ；W097/16538 ；W000/70055 ；W000/70070 ；W001/18223 ；W003/025570 ； W02005/071092 ；W02006/137517 ；W02007/083644 ；W02008/007581；Hasan, Μ. K.等，J.Gen. Virol. 78 :2813-2820,1997、Kato，Α.等，1997，EMBO J. 16 :578-587 以及 Yu，D.等， 1997，Genes Cells 2 :457-466 ；Durbin, Α. P.等，1997，Virology 235 :323-332 ；ffhelan, S. P.等，1995，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :8388-8392 ；Schnell. Μ. J.等，1994，EMBO J. 13 :4195-4203 ；Radecke, F.等，1995，EMBO J. 14 :5773-5784 ；Lawson, N. D.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4477-4481 ；Garcin, D.等，1995，EMBO J. 14 :6087-6094 ；Kato, Α.等，1996，Genes Cells 1 :569-579 ；Baron, Μ. D.與 Barrett, Τ.，1997，J. Virol. 71 1265-1271 ；Bridgen, Α.與 Elliott, R. Μ. ，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 15400-15404 ；Tokusumi，Τ.等· Virus Res. 2002 :86 ；33-38、Li, H. -0.等，J. Virol. 2000 74 ；6564-6569)。通過這些方法，可以從DNA重構(gòu)包括副流感病毒、水皰性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒(Rinderpest virus)、仙臺病毒等在內(nèi)的負鏈RNA病毒。正⑴鏈RNA病毒的制造方法，可以列舉出以下的例子。1)冠狀病毒Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.Curr Top Microbiol Immunol. 2005 ；287 :161-97. Review.2)披膜病毒Yamanaka R,Zullo SA,Ramsey J,Onodera M,Tanaka R,Blaese M,Xanthopoulos KG.Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.Cancer Gene Ther. 20010ct ；8 (10) :796-802.Datwyler DA, Eppenberger HM,Roller D,B ailey JE, Magyar JP.Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.J Mol Med. 1999Dec ；77(12) :859-64.3)微小核糖核酸病毒Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus ；the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus—based RPS-Vax vector system.J Virol. 2002Feb ；76 (4) :1649-62.Mueller S, Wimmer E.
Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.J Virol. 1998Jan ；72(1) :20-31.4)黃病毒Yun Si，Kim SY，Rice CM，Lee YM.Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.J Virol. 2003Jun ；77 (11) :6450-65.Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX,Monath TP, Chambers TJ.Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).J Virol. 2001Jan ；75 (2) :934-42.5)呼腸孤病毒Roner MR, Joklik WK.Reovirus reverse genetics Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.Proc Natl Acad Sci U S A. 2001Jul 3 ；98(14) :8036-41. Epub 200IJun 26.關(guān)于其它的RNA病毒的增殖方法和重組病毒的制造方法，可以參照病毒實驗學(xué)各論改訂第二版(,^ > 7実験學(xué)各論、改訂二版)(國立預(yù)防衛(wèi)生研究所學(xué)友會編，丸善， 1982)。上述的染色體非整合型病毒載體中，可以適宜地使其攜帶用于細胞的初始化的基因。攜帶的基因可以是參與從經(jīng)分化的細胞誘導(dǎo)多能干細胞等各種干細胞等的希望的基因。例如，可以攜帶所述初始化所必需的基因、或提高初始化的效率的基因。即，本發(fā)明提供本發(fā)明的染色體非整合型病毒載體用于在細胞的初始化中導(dǎo)入基因的用途、以及用于在細胞中表達初始化因子以誘導(dǎo)該細胞的初始化的用途。此外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的染色體非整合型病毒載體的用于在細胞的初始化中導(dǎo)入基因的作用劑(導(dǎo)入劑、基因?qū)雱?、 以及用于在細胞中表達初始化因子的作用劑。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的染色體非整合型病毒載體，用于在細胞中表達初始化因子、誘導(dǎo)該細胞的初始化的作用劑。此外，本發(fā)明的載體可以用于在進行細胞的核初始化時在該細胞中表達希望的基因。攜帶1個或以上的編碼核初始化因子(nuclear reprogramming factor)的基因的非整合型病毒載體，可以依照本發(fā)明用于細胞的初始化。本發(fā)明可以用于醫(yī)學(xué)的用途和非醫(yī)學(xué)的用途，在醫(yī)學(xué)和非醫(yī)學(xué)的實施方式中是有用的。例如，本發(fā)明可以用于治療、手術(shù)和/或診斷目的，或者可以用于非治療、非手術(shù)和/或非診斷目的。本發(fā)明中，核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)是指能夠單獨或與多個因子共同用于將某細胞的分化狀態(tài)誘導(dǎo)至相對未分化的狀態(tài)的基因或其產(chǎn)物，例如包括能夠用于誘導(dǎo)經(jīng)分化的細胞脫分化的基因或其產(chǎn)物。本發(fā)明中，核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)包括核的初始化(!^programming)所必需的因子、和提高核初始化的效率的輔助性因子(輔助因子)。本發(fā)明中，可以使載體攜帶用于核初始化(nuclear reprogramming)的希望的基因。例如，可以攜帶用于多能干細胞的制造的基因。 作為用于誘導(dǎo)多能干細胞的核初始化因子(nuclear reprogramming factors)，具體地可以使用例如在ES細胞、初期胚等中表達、但在分化的多種體細胞中不表達或表達降低的基因(ES細胞特異性基因等)。這樣的基因優(yōu)選是編碼轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白質(zhì)等的基因。鑒定核初始化基因(nuclear reprogramming factors)的方法是已知的(W02005/80598)，實際上，已證明采用該方法鑒定出的基因顯示對于向多能干細胞的初始化(!^programming)是有用的(W02007/69666)。 作為這樣的基因的例子，可以列舉出DPPA5(發(fā)育多能性相關(guān)5，ES細胞特異性基因 1 (ESGl)；登錄號 NM_001025290，NM_025274, XM_236761)、F-框蛋白 15 (Fbxl5, NM_152676，ΝΜ_015798)、Nanog (NM_024865, AB093574)、 ECATl (ES 細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物 1 ; AB211062，AB211060)、ERAS (ES 細胞表達的 Ras ；NM_181532, NM_181548)、DWT3L (DNA (包嘧啶-5-)-甲基轉(zhuǎn)移酶 3-樣；NM_013369，NM_019448)、ECAT8 (AB211063，AB211061)、GDF3(生長分化因子 3 ；NM_020634, NM_008108)、S0X15 (SRY(性別決定區(qū) Y)-box 15 ；NM_006942, NM_009235)、DPPA4 (發(fā)育多能性相關(guān) 4 ；NM_018189, NM_028610)、DPPA2 (NM_138815, NM_028615)、FTHL17 (運鐵蛋白，重鏈多肽-樣 17 ；NM_031894, NM_031261)、SALL4 (sal-樣 4 ；NM_020436, NM_175303)、0ct3/4(也稱 P0U5F1 ；ΝΜ_002701, ΝΜ_203289, ΝΜ_013633, NM_001009178)、Sox2(NM_003106，NM_011443，XM_574919)、Rex-I (ZFP42(鋅指蛋白 42homolog) ；NM_174900, NM_009556)、Utfl (未分化的胚胎細胞轉(zhuǎn)錄因子 1 ；NM_003577， NM_009482)、TCLlA (Τ 細胞白血病 / 淋巴瘤 IA ； NM_021966, NM_009337)、DPPA3 (也稱 Stella，NM_199286, NM_139218, XM_216263)、KLF4(Kruppel-樣因子 4 ；NM_004235, NM_010637)、聯(lián)蛋白β 1(鈣粘蛋白-相關(guān)蛋白β 1 ;NM_001904，NM_007614 ；含S33Y突變體)、c-Myc (ΝΜ_002467, ΝΜ_010849 ；含T58A突變體)、STAT3 (信號轉(zhuǎn)導(dǎo)者和轉(zhuǎn)錄活化者3 ； NM_139276, NM_213659)、GRB2 (結(jié)合于生長因子受體的蛋白 2 ；NM_002086, NM_008163)，以及這些基因所屬家族的其它成員的基因等。這些基因已被顯示通過導(dǎo)入細胞能夠誘導(dǎo)多能干細胞(W02007/69666)。因此，攜帶這些基因中的任一個的染色體非整合型病毒載體、例如RNA病毒載體，在本發(fā)明中可以用于誘導(dǎo)細胞的脫分化，特別優(yōu)選用于多能干細胞的誘導(dǎo)?？梢詫⑦@些基因1個1個分別地整合在獨立的載體中，也可以將多個基因一起整合在 1個載體中。此外，可以將各基因整合在一種載體中，或者也可以將不同種類的載體(包括染色體整合型病毒載體和/或非病毒載體)與染色體非整合型病毒載體組合使用。此外， 各病毒載體可以分別包裝，而在使用時組合使用?；蛘?，可以將攜帶不同基因的多個病毒載體預(yù)先組合做成試劑盒，或者混合起來作為組合物。此外，在細胞的初始化、特別是多能干細胞的制造中也優(yōu)選使用包含這些基因的任意組合(或全部)的1個或其以上的非整合型病毒載體、以及包含該載體的試劑盒或組合物。對于組合物的情況，載體可以適宜混合在滅菌水、PH緩沖液、生理鹽水、培養(yǎng)液等中。而且，這些體系中，還可以將核初始化基因的一部分或大部分替換成作為其表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。即，本發(fā)明的組合物和試劑盒只要包含至少一種染色體非整合型病毒載體，還可以包含表達初始化因子的其它載體(染色體整合型病毒載體和/或非病毒載體)和/或誘導(dǎo)初始化的化合物、蛋白質(zhì)等。初始化的必要因子可以全部由染色體非整合型病毒載體表達，或者也可以僅一部分由染色體非整合型病毒載體表達而其它部分由其它載體和/或化合物(例如蛋白質(zhì)或低分子化合物)供給。此外，本發(fā)明的經(jīng)初始化的細胞的制造方法，并不限于全部的基因?qū)刖褂萌旧w非整合型病毒載體來進行的方法。即，本發(fā)明的方法使用至少一種染色體非整合型病毒載體即可，還包括組合使用表達初始化因子的其它載體(染色體整合型病毒載體和/或非病毒載體)和/或誘導(dǎo)初始化的化合物等。本發(fā)明涉及包含染色體非整合型病毒載體作為表達載體的用于細胞的初始化的組合物。此外，本發(fā)明涉及染色體非整合型病毒載體的用于經(jīng)分化的細胞的初始化的用途。 例如，本發(fā)明提供染色體非整合型病毒載體的用途，其用于在細胞的初始化中針對有必要的細胞導(dǎo)入基因。此外，本發(fā)明涉及用于在細胞的初始化中導(dǎo)入基因的方法，該方法中使用染色體非整合型病毒載體，針對有必要的細胞導(dǎo)入該基因。此外，本發(fā)明還涉及包含染色體非整合型病毒載體的用于細胞的初始化中的基因?qū)氲慕M合物、用于細胞的初始化中的基因?qū)氲淖饔脛?用于細胞的初始化中的基因?qū)氲膶?dǎo)入劑、細胞的初始化中的基因?qū)雱?。此外，本發(fā)明還涉及染色體非整合型病毒載體用于制造用于在細胞的初始化中針對有必要的細胞導(dǎo)入基因的藥物的用途。此外，本發(fā)明提供包含染色體非整合型病毒載體的用于在細胞的初始化中使用的基因?qū)雱?基因表達劑或表達載體)。此外，本發(fā)明提供包含染色體非整合型病毒載體的初始化基因?qū)雱?基因表達劑或表達載體)。此外，本發(fā)明提供包含染色體非整合型病毒載體的核初始化因子(nuclear reprogramming factor)表 ii^Ll (t^^II^nftlSIS (a nuclear reprogramming gene)導(dǎo)人齊Ll、t亥率刀女臺(a nuclear reprogramming gene)表達載體)。此外，本發(fā)明提供包含編碼核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)的染色體非整合型病毒載體的多能干細胞誘導(dǎo)劑和多能干細胞誘導(dǎo)輔助劑。此外，本發(fā)明提供染色體非整合型病毒載體用于經(jīng)分化的細胞的初始化的用途。 此外，本發(fā)明提供染色體非整合型病毒載體用于制造用于經(jīng)分化的細胞的初始化的藥劑、 試劑和/或醫(yī)藥的用途。此外，本發(fā)明還涉及染色體非整合型病毒載體用于制造經(jīng)分化的細胞的核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)導(dǎo)入劑的用途。

此處，初始化可以是例如從分化的細胞誘導(dǎo)多能干細胞。載體可以整合編碼用于初始化的因子的基因來使用。作為編碼初始化因子的基因，可以列舉出編碼例如上述或者以下示例的因子中的任何一個的基因。而且，導(dǎo)入的因子可以根據(jù)希望初始化的細胞的來源適宜選擇，可以是人來源的， 也可以是其它哺乳動物來源例如小鼠、大鼠、兔、豬、或者猴等靈長類來源的。此外，基因和蛋白質(zhì)的序列并不一定是野生型的序列，只要能夠誘導(dǎo)初始化，可以具有任何突變。實際上，已知使用突變型基因制作多能干細胞的實例(W02007/69666)。例如，編碼添加、缺失、 取代、和/或插入1個或少數(shù)(例如數(shù)個、3個以內(nèi)、5個以內(nèi)、10個以內(nèi)、15個以內(nèi)、20個以內(nèi)、25個以內(nèi))氨基酸而成的氨基酸序列、且能夠誘導(dǎo)初始化的基因，可以在本發(fā)明中使用。此外，只要保持生物學(xué)活性(初始化誘導(dǎo)能力)，例如N末端和/或C未端的1個 數(shù)個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸發(fā)生缺失或添加而成的多肽、以及 1個 數(shù)個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸發(fā)生取代而成的多肽等， 也是可以使用的。作為可以使用的變體，包括例如天然蛋白質(zhì)的片段、類似物、衍生物、以及與其它多肽的融合蛋白質(zhì)(例如添加異種信號肽或抗體片段而成的等)。具體地，包括下述多肽，所述多肽包含在野生型氨基酸序列中取代、缺失、和/或添加1個或其以上的氨基酸而成的序列、且具有與野生型蛋白質(zhì)等同的生物學(xué)活性(例如誘導(dǎo)初始化的活性)。在使用野生型蛋白質(zhì)的片段的情況下，通常包含野生型多肽(對于分泌蛋白質(zhì)為成熟型的形態(tài))的70%以上、優(yōu)選80%以上、85%以上、更優(yōu)選90%以上、95%以上或98%以上的連續(xù)區(qū)域。氨基酸序列的變體，例如可以通過在編碼天然多肽的DNA中導(dǎo)入突變來制備 (Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York,1983) ；Kunke1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :488-492,1985 ；Kunkel 等，Methods Enzymol. 154 :367-382,1987 ;Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y. ),1989 ；U. S. Pat. No. 4，873，192)。關(guān)于如何進行氨基酸取代而不影響生物學(xué)活性，可以參考例如Dayhoff等 (Dayhoff 等，in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.)，1978)的指導(dǎo)。對于進行修飾的氨基酸的數(shù)目沒有特殊限制，例如是天然的成熟型多肽的全部氨基酸的30%以內(nèi)、優(yōu)選25%以內(nèi)、更優(yōu)選20%以內(nèi)、更優(yōu)選15%以內(nèi)、更優(yōu)選10%以內(nèi)、5% 以內(nèi)或3%以內(nèi)，例如15個氨基酸以內(nèi)、優(yōu)選10個氨基酸以內(nèi)、更優(yōu)選8個氨基酸以內(nèi)、更優(yōu)選5個氨基酸以內(nèi)、更優(yōu)選3個氨基酸以內(nèi)。在對氨基酸氨基酸進行取代時，通過取代成側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸可以期待保持蛋白質(zhì)的活性。這樣的取代，在本發(fā)明中稱作保守取代。保守取代可以列舉出例如堿性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸 (例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、 蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等各組內(nèi)的氨基酸之間的取代等。 此外，可以列舉出例如，BL0SUM62 取代矩陣(S. Henikoff and J. G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89 :10915-10919,1992)中處于正值關(guān)系的氨基酸之間的取代。經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間顯示高同源性。高同源性是指具有例如70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上或96%以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序 (Altschul，S. F.等，J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)來確認。例如，可以在 NCBI (National Center for Biothchnology ^formation)的BLAST的網(wǎng)頁上，使用默認參數(shù)來進行檢索 (Altschul S. F.等，Nature Genet. 3 :266-272,1993 ；Madden, Τ. L.等，Meth. Enzymol. 266 131-141,1996 ；Altschul S. F.等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 ；Zhang J. Madden Τ. L.，Genome Res. 7 =649-656,1997)。例如，通過進行 2 個序列的比較的 blast2sequences 程序(Tatiana A 等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247-250,1999)，制作 2 個序列的比對，可以確定序列的同一性?？瘴话村e配對待，計算出例如相對于天然型細胞因子(分泌后的成熟型的形態(tài))的氨基酸序列全體的同一性的值。具體地，計算出野生型蛋自質(zhì)(若為分泌蛋白質(zhì)則為成熟型)的全部氨基酸數(shù)中的一致的氨基酸數(shù)的比例。此外，基因可以導(dǎo)入沉默突變，而不改變所編碼的氨基酸序列。特別是，在富含AT 的基因中，針對5個以上的連續(xù)的A或T堿基，將其取代成G或C，而不改變所編碼的氨基酸序列，從而能夠穩(wěn)定地獲得基因的高表達。此外，作為修飾蛋白質(zhì)或者用于初始化的蛋白質(zhì)，可以列舉出與編碼野生型蛋白質(zhì)的基因的編碼區(qū)域的一部分或全部在嚴格條件下雜交的核酸所編碼的、具有與野生型蛋白質(zhì)等同的活性(誘導(dǎo)初始化的活性)的蛋白質(zhì)。在雜交中，例如，可以從包含野生型蛋白質(zhì)基因的編碼區(qū)域序列或其互補序列的核酸或作為雜交對象的核酸中的任何一方制備探針，通過檢測其是否與另一方的核酸雜交來進行鑒定。嚴格雜交的條件例如是在含 5xSSC,7% (W/V)SDS、100y g/ml 變性鮭魚精 DNA、5xDenhardt 液(IxDenhardt 溶液含 0. 2% 聚乙烯基吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白以及0. 2% Ficoll)的溶液中，于60°C、優(yōu)選65°C、 更優(yōu)選68°C進行雜交，然后在與雜交相同的溫度下，于2xSSC中、優(yōu)選IxSSC中、更優(yōu)選 0. 5xSSC中、更優(yōu)選0. IxSSC中振蕩洗滌2小時的條件。

為了誘導(dǎo)細胞的初始化，特別優(yōu)選的基因可以列舉出F-框蛋白15 (Fbxl5, NM_152676，ΝΜ_015798)、Nanog (NM_024865，AB093574)、ERAS (ES 細胞表達的 Ras ； NM_181532,NM_181548)、DPPA2 (NM_138815，NM_028615)、0ct3/4(也稱 P0U5F1 ；NM_002701, NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、Sox2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、TCLlA (T 細胞白血病 / 淋巴瘤 IA ；NM_021966, NM_009337)、KLF4 (Kruppel-樣因子 4 ;NM_004235， ΝΜ_010637)、聯(lián)蛋白 β 1(鈣聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白 beta 1 ;NM_001904，NM_007614 ；含 S33Y 突變體)和c-Myc(NM_002467，NM_010849 ；含T58A突變體)、以及這些基因所屬家族的其它成員的基因等。有報導(dǎo)稱，在導(dǎo)入這些基因的情況下，顯示出誘導(dǎo)多能干細胞的形態(tài)的集落的比例甚至高于導(dǎo)入下文所述的4種基因(0ct3/4、Sox2、KLF4和c-Myc)時的比例 (W02007/69666)。因此，攜帶這些基因中的任何一個的染色體非整合型病毒載體在本發(fā)明中可以用于誘導(dǎo)細胞的初始化，特別是優(yōu)選可以用于誘導(dǎo)多能干細胞。各個病毒載體可以在使用時進行組合來使用。此外，也可以預(yù)先做成試劑盒，或者混合起來作為組合物。此外， 本發(fā)明還包括包含這些基因的任意組合(或全部)的、1個或其以上的染色體非整合型病毒載體，以及包含該載體的試劑盒或組合物。其中，對多能干細胞的誘導(dǎo)而言特別優(yōu)選的基因的組合之一是至少包含Sox基因、KLF基因、Myc基因和Oct基因這4種基因的組合(Takahashi, K. and Yamanaka S.， Cell 126，663-676，2006 ；Lowry WE 等，Proc Natl Acad Sci US A,105(8) :2883_8，2008 ； Masaki, H.等，Stem Cell Res. 1 :105_115，2008 ；W02007/69666)。此處，Sox 蛋白質(zhì)、KLF 蛋白質(zhì)、Myc蛋白質(zhì)和Oct蛋白質(zhì)、以及它們的基因是指分別屬于Sox家族、KLF家族、 Myc家族和Oct家族的成員的蛋白質(zhì)和基因。有報告稱，通過進行調(diào)整使得分別表達1個以上的這4個家族的成員，可以從分化的各種細胞誘導(dǎo)多能干細胞。例如，有報告稱，對于Sox家族的基因，使用Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5、Soxl7中的任何一個基因，均可以誘導(dǎo)多能干細胞(W02007/69666)。此外，對于KLF家族，使用KLF4或KLF2均能夠誘導(dǎo)多能干細胞(W02007/69666)。對于Myc家族，不僅是使用野生型c_Myc、使用T58A突變體或 N-Myc、L-Myc 也能夠誘導(dǎo)多能干細胞(W02007/69666 ；Blelloch R.等，Cell Stem Cell, 1 245-247,2007)。這樣，由于可以通過多種方式選擇家族的基因并使用，可以適宜地選擇上述的4種家族基因來誘導(dǎo)初始化。例如，已經(jīng)判明從仙臺病毒載體等RNA病毒載體表達野生型c-Myc的表達量少。但是，通過在野生型c-Myc中導(dǎo)入選自a378g、tll22c、tll25c、all91g和all94g中的1個以上、優(yōu)選2個以上、3個以上、4個以上、或全部5個突變，可使得穩(wěn)定地從載體高表達基因成為可能。本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用例如SEQ ID NO :45所示的修飾型c-Myc基因?；蛟谳d體中的插入位置，可以選擇所希望的位點。例如，Myc基因可以配置在負鏈RNA基因組的后方(5'側(cè))，即在基因組上配置的多個蛋白質(zhì)編碼序列中，從5'側(cè)數(shù)起比從3'側(cè)數(shù)起更先數(shù)到的位置(參照實施例)。Myc 基因可以配置在例如，最5'側(cè)(即5'側(cè)起第1位)、或者5'側(cè)起第2或第3位。Myc基因可以配置在例如基因組的5'側(cè)起第2位，具體地，在基因組的最5'側(cè)是L基因、然后是 HN基因的情況下，Myc基因可以配置于它們之間。Myc基因中可以適宜導(dǎo)入沉默突變、取代連續(xù)的A或T的堿基序列，而不改變所編碼的氨基酸序列。將Myc基因配置在負鏈RNA基因組的后方(5'側(cè))而成的負鏈RNA病毒載體可以與編碼其它核初始化因子的負鏈RNA病毒載體組合使用。這種情況下，在編碼其它核初始化因子的負鏈RNA病毒載體中，這些核初始化因子可以配置在各載體的負鏈RNA基因組中的前方(3'側(cè))，即在基因組上配置的多個蛋白質(zhì)編碼序列中，從3'側(cè)數(shù)起比從5'側(cè)數(shù)起更先數(shù)到的位置。例如，可以配置在最3'側(cè)(即3'側(cè)起第1位)、或者3'側(cè)起第2 或第3位。例如，編碼Myc以外的核初始化因子的基因(例如Oct基因、Klf基因和Sox基因)在各負鏈RNA病毒載體中可以配置在基因組的5'側(cè)起第1位或第2位、更優(yōu)選第1 位。具體地，可以在位于基因組的NP基因的3'側(cè)的最3'端側(cè)配置編碼核初始化因子的基因?？梢詮某跏蓟旰蟮募毎募溥m宜選擇出除去了載體的細胞。例如可以選擇自然除去載體的細胞。為此，例如可以使用病毒載體特異性的抗體(例如抗HN抗體)進行負選擇。此外，在使用溫度敏感性載體時，通過在高溫(例如37.5 39°C、優(yōu)選38 39°C或 38. 5 39°C )下進行培養(yǎng)，可以簡便地除去載體。具體地，作為KLF 家族，包括 Klfl (ΝΜ_006563, ΝΜ_010635)、Klf2 (ΝΜ_016270, NM_008452)、Klf4 (NM_004235, NM_010637)、Klf5 (NM_001730，NM_009769)；作為 Myc 家族，包括 c-Myc (NM_002467, NM_010849，含 T58A 突變體)、N-Myc (NM_005378, NM_008709)、 L-Myc (NM_005376, NM_005806)；作為 Oct 家族，包括 OctlA (NM_002697，NM_198934)、 0ct3/4(NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178)、0ct6(NM_002699， NM_011141)；作為 Sox 家族，包括 Soxl (NM_005986，NM_009233)、Sox2 (NM_003106， NM_011443, XM_574919)、Sox3(NM_005634, NM_009237)、Sox7(NM_031439, NM_011446), Soxl5(NM_006942, NM_009235)、 Soxl7(NM_022454, NM_011441)、 Soxl8(NM_018419, NM_009236)。攜帶這些基因中的任何一個的染色體非整合型病毒載體，在本發(fā)明中可以用于誘導(dǎo)細胞的脫分化，特別優(yōu)選用于誘導(dǎo)多能干細胞。而且，Myc家族的基因?qū)τ诙嗄芨杉毎恼T導(dǎo)并非必需，僅使用除Myc家族基因以外的3個家族的基因也能夠誘導(dǎo)多能干細胞(Nakagawa M.等，Nat Biotechnol. 26(1) 101-6,2008 ；Wering M.等，Cell Stem Cell 2(1) 10-2，2008 ；實施例 5)。在不表達 Myc 基因的情況下，例如通過p53 siRNA和UTFl能夠使多能干細胞的誘導(dǎo)效率顯著地提高 (Y. Zhao等，Cell Stem Cell,3(5) :475_479，2008 ;Ν·Maherali，and K.Hochedlinger,Cell Stem Cell, 3 (6) :595-605, 2008)。此外，有報告稱，僅使用除KLF家族的基因之外的3個家族的基因也能夠誘導(dǎo)多能干細胞(Park IH等，Nature，451 (7175) 141-6，2008)。此外，有報告稱，通過結(jié)合使用G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(BIX-01294 ；Kubicek, S.等，Mol. Cell 25，473-481，2007)，僅使用Klf基因、Sox基因和Myc基因這3個基因就可以從胚胎來源的NPC誘導(dǎo)多能干細胞(Shi Y 等，Cell Stem Cell, 2 (6) :525_8，2008)。因此，攜帶 Sox 基因、 KLF基因和Oct基因各基因中的任何一個，或者Sox基因、Myc基因和Oct基因各基因中的任何一個，或者Sox基因、Myc基因和Klf基因的組合的1個或多個染色體非整合型病毒載體，用于本發(fā)明中的細胞初始化的誘導(dǎo)是特別有用的，優(yōu)選可以用于誘導(dǎo)多能干細胞。編碼各基因的病毒載體可以分別單獨準備。它們可以在使用時組合使用。此外，也可以將任意組合或全部組合在一起作為試劑盒，或者混合起來作為組合物。此外，本發(fā)明還涉及包含這些基因的任意組合(或全部)的1種或多種染色體非整合型病毒載體，以及包含該載體的用于初始化的試劑盒或組合物。而且，還可以將該試劑盒中所含的一部分重組載體替換成具有相當功能的蛋白質(zhì)、合成化合物等。而且，例如在原來的經(jīng)分化的細胞中已經(jīng)內(nèi)源性表達了上述基因中的1個或幾個的情況下，可以省略該基因的導(dǎo)入。例如，神經(jīng)祖細胞(neural progenitor cells (NPCs)) 表達內(nèi)源性的Sox家族基因，因而僅通過導(dǎo)入0ct3/4和Klf4就可以誘導(dǎo)多能干細胞(Shi Y 等，Cell Stem Cell, 2 (6) :525-8,2008) 此外，有報告稱，使用 0ct4，Sox2，Esrrb (雌激素相關(guān)受體 β，ΝΜ_004452. 2，ΝΡ_004443. 2，ΝΜ_011934. 3，ΝΡ_036064. 2)這 3 個基因可以從小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)誘導(dǎo)多能干細胞，這暗示hrrb能夠補償Klf的功能(Feng， B.等，Nat Cell Biol. 11(2) 197-203，2009)。此外，通過組合組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 (BIX-01294)和鈣離子通道激動劑(BayK8644)，僅導(dǎo)入0ct3/4和Klf4就可以從胚成纖維細胞誘導(dǎo)多能干細胞(Shi Y等，Cell Stem Cell,3(5) =568-574, 2008) 0此外，有報告稱，在使用成體小鼠腦來源的神經(jīng)干細胞(neural stem cells ;NSCs)進行的實驗中，不僅是0ct3/4和Klf4的組合，僅導(dǎo)入0ct3/4和c-Myc這2個因子的基因，也能夠誘導(dǎo)多能干細胞(Kim, J. B.等，Nature, doi :10. 1038/nature07061 ；2008 年 6 月 29 日網(wǎng)上發(fā)表； Nature. 2008,454(7204) :646-50)。此外，通過調(diào)整培養(yǎng)時間，僅使用0ct4也能夠誘導(dǎo)多能干細胞(Jeong Beom Kim等，Cell，136 (3) :411_419，2009)?？梢赃m宜地使用必要的編碼初始化因子的染色體非整合型病毒載體。此外，內(nèi)源性初始化因子的內(nèi)源性表達如果是可以被其它基因的表達或化合物處理所誘導(dǎo)的，則可以只導(dǎo)入編碼不能僅被這樣的其它基因的表達或化合物處理所誘導(dǎo)的初始化因子的染色體非整合型病毒載體，同時結(jié)合表達所述其它基因的載體的導(dǎo)入或化合物處理。在本發(fā)明中，“組合載體，使得內(nèi)源性或外源性表達至少Oct基因、Klf基因和Sox基因這3種、或者至少Oct基因、Klf基因、Sox基因和Myc基因這4種、或者至少Oct基因、Sox基因、Nanog基因、LiM8基因這4種”不但包括例如某初始化因子在自然狀態(tài)下內(nèi)源性表達的狀態(tài)，還包括當通過導(dǎo)入表達其它基因的載體或用化合物、蛋白質(zhì)進行處理等能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性的初始化因子的表達時，組合染色體非整合型病毒載體以僅外源性表達不足的因子的情況。此外，除了上述4種或3種的組合以外，包含Oct基因、Sox基因、NANOG基因 (NM_024865, AB093574)和LI擬8基因(NM_0M674)這4種的各基因的組合對于誘導(dǎo)多能干細胞也是有用的(Yu J.等，Science，318 (5858) 1917-20，2007)。此外，這其中優(yōu)選再組合進Myc基因和KLF基因(Liao J等，Cell Res. 18(5) :600-3, 2008) 0攜帶這些中的任意基因的染色體非整合型病毒載體，在本發(fā)明中特別優(yōu)選用于誘導(dǎo)細胞的脫分化，優(yōu)選用于誘導(dǎo)多能干細胞。包含這些基因的任意組合(或全部)的1個或其以上的染色體非整合型病毒載體，以及包含該載體的試劑盒或組合物，優(yōu)選用于細胞的初始化，特別是多能干細胞的制造。而且，同上述，在作為對象的細胞已經(jīng)表達這些基因中的一部分的情況下，也可以不導(dǎo)入表達該基因的載體。而且，該試劑盒中所包含的一部分重組載體也可以替換成具有相當?shù)墓δ艿牡鞍踪|(zhì)、合成化合物等。 在以上描述的基因的組合中，還可以進一步組合其它基因，來提高初始化的誘導(dǎo)效率。作為這樣的基因，可以列舉出TERT(NM_198253，NM_009354)和/或SV40大T抗原 (NC_001669. 1, Fiers, W. (05-11-1978)Nature273 (5658) 113-120)(Park IH.等，Nature, 451(7175) :141-6，2008)。此外，可以進一步組合選自 HPV16E6,HPV16E7,Bmil (NM_005180, NM_007552)中的1個以上的基因。此外，可以表達選自Fbxl5 (Mol Cell Biol. 23(8) 2699-708，2003)、Nanog(Cell 113 :631_642，2003)、Eras (Nature 423，541-545，2003)、 DPPA2(Development 130 :1673-1680，2003)、 TCLlA(Development 130 :1673_1680， 2003)、β-聯(lián)蛋白(Nat Med 10(1) =55-63,2004)中的1個或任意組合。而且，可以組合選自 ECATl (AB211062，AB211060)、DPPA5(NM_001025290，NM_025274，XM_236761)、 DNMT3L(NM_013369, NM_019448)、 ECAT8(AB211063, AB211061)、 GDF3(NM_020634, NM_008108)、 S0X15(NM_006942, NM_009235)、 DPPA4(NM_018189, NM_028610)、 FTHL17(NM_031894, NM_031261)、 SALL4(NM_020436, NM_175303)、 Rex-I(NM_174900, NM_009556)、Utfl (NM_003577, NM_009482)、DPPA3 (NM_199286, NM_139218, XM_216263)、 STAT3(NM_139276，NM_213659)、和 GRB2(NM_002086，NM_008163)中的 1 個以上的基因。通過額外表達這些基因，能夠促進多能干細胞的誘導(dǎo)(W02007/69666)。在以成熟B細胞作為對象的情況下，例如，可以異處表達髓細胞轉(zhuǎn)錄因子C/ΕΒΡα (CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α) (ΝΜ_004364)，或者抑制B細胞轉(zhuǎn)錄因子Pax5 (成對框5 ；NM_016734)的表達，來促進初始化 (Hanna J, Cell. 133(2) =250-64, 2008) 0這些因子也可以使用本發(fā)明中的染色體非整合型病毒載體進行表達。而且，該試劑盒中所包含的一部分重組載體可以替換成具有相當功能的蛋白質(zhì)、合成化合物等。此外，除了表達上述的因子以外，例如，通過結(jié)合添加化合物，也能夠提高初始化的效率。例如，bFGF (堿性成纖維細胞生長因子)和/或SCF (干細胞因子)促進多能干細胞的誘導(dǎo)，而且能夠在多能干細胞的誘導(dǎo)中代替c-Myc的功能(W02007/69666)。此外，MAP激酶抑制劑(PD98056)可以用于建立更接近于ES細胞的多能干細胞等用途(W02007/69666)。 此外，有報告稱，通過DNA甲基化酶(Dnmt)抑制劑和/或組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)抑制齊U，能夠改善多能干細胞的誘導(dǎo)效率(Huangfu D等，Nat Biotechnol. (Published online 22 June 2008，doi 10. 1038/nbtl418) ；Nat. Biotechnol. 26，795-797 (2008))。例如，通過組合使用HDAC(VPA)，僅導(dǎo)入0ct4和Sox2這2個基因就能夠誘導(dǎo)多能干細胞(Huangfu， D.等，Nat Biotechnol. 200826(11) 1269-75) 0本發(fā)明的載體作為用于表達這些基因或其部分基因的作用劑是有用的。作為Dnmt抑制劑，可以使用例如5-氮雜胞苷等；作為HDAC 抑制劑，可以使用例如N-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)、丙戊酸(VPA) 等。此外，在使用5-氮雜胞苷的情況下，通過組合使用糖皮質(zhì)素(地塞米松)，可以提高效率。為了使細胞初始化，將上述組合的載體等導(dǎo)入細胞。在組合導(dǎo)入多個載體和/或化合物的情況下，導(dǎo)入優(yōu)選同時進行，具體地，優(yōu)選在添加最初的載體或化合物等后的48 小時以內(nèi)、優(yōu)選36小時以內(nèi)、更優(yōu)選24小時以內(nèi)、18小時以內(nèi)、12小時以內(nèi)、10小時以內(nèi)、8小時以內(nèi)、6小時以內(nèi)、3小時以內(nèi)、2小時以內(nèi)或1小時以內(nèi)，將編碼初始化因子的全部載體和/或化合物添加完畢。載體的用量可以適宜制備，優(yōu)選以MOI 0.3 100、更優(yōu)選 Μ0Ι0. 5 50、更優(yōu)選MOI 1 30、更優(yōu)選MOI 1 10、更優(yōu)選MOI 1 5、更優(yōu)選MOI約3 進行感染。誘導(dǎo)出的多能干細胞形成與ES細胞十分相似的扁平集落，并表達堿性磷酸酶。 此外，誘導(dǎo)出的多能干細胞可以表達未分化細胞標志物NanOg、0ct4和/或Sox2等。此外， 誘導(dǎo)出的多能干細胞優(yōu)選表達TERT和/或顯示端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明還涉及表達堿性磷酸酶、優(yōu)選還表達未分化細胞標志物Nanog和/或TERT的細胞的制造方法，以及染色體非整合型病毒載體在制造該細胞和制造誘導(dǎo)該細胞的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明，能夠從含成人皮膚細胞和新生兒周皮細胞的希望的細胞以例如 0. 3Χ1(Γ5 以上、0. 5Χ1(Γ5 以上、0. 8Χ1(Γ5 以上、或 1Χ1(Γ5 以上(例如 1. 7Χ1(Γ5 2.4X10,的出現(xiàn)率，優(yōu)選以 1·5Χ1(Γ5 以上、1.7Χ1(Γ5 以上、2. 0Χ1(Γ5 以上、2. 5Χ1(Γ5 以上、3Χ1(Γ5 以上、4Χ1(Γ5 以上、5Χ1(Γ5 以上、8Χ1(Γ5 以上、1Χ1(Γ4 以上、2Χ1(Γ4 以上、 3Χ10—4 以上、5Χ1(Γ4 以上、8Χ1(Γ4 以上、1Χ1(Γ3 以上、1. 5Χ1(Γ3 以上、2Χ1(Γ3 以上或 2. 3X ΙΟ"3以上的出現(xiàn)率誘導(dǎo)出多能干細胞的集落。對于作為誘導(dǎo)初始化的對象的經(jīng)分化的細胞，沒有特殊限制，可以使用希望的體細胞等。從體細胞生成多能干細胞，不僅可以從小鼠胚胎來源的細胞生成，從采集自成體小鼠尾部的經(jīng)分化的細胞、或肝細胞和胃粘膜細胞生成也顯示是可行的，這提示并非依賴于細胞類型或分化狀態(tài)(W02007/069666 ；Aoi Τ.等，Science [2008年2月14日網(wǎng)上發(fā)表]； Science. 2008 ；321 (5889) =699-702)。此外，對于人類，已經(jīng)確認可以從成人的面部皮膚來源的成纖維細胞、成人滑膜細胞、新生兒周皮來源成纖維細胞、成人間充質(zhì)干細胞、成人手掌的皮膚細胞、胚胎細胞等多種多樣的細胞誘導(dǎo)多能干細胞(Takahashi K et al. (2007) Cell 131 :861-872 ；Park IH 等，Nature，451 (7175) 141-6，2008)。此外，有報告稱，從胰臟 β細胞、B淋巴細胞這樣的終末分化細胞同樣可以誘導(dǎo)多能干細胞(Stadtfeld M等，Curr Biol.2008May 21. [PubMed, PMID :18501604] ；Curr Biol. 2008 ；18(12) :890-4 ；Hanna J.等，Cell. 133(2) :250-64,2008).這些認識提示，多能干細胞的誘導(dǎo)不依賴于作為基礎(chǔ)的細胞。在這些從這些希望的體細胞誘導(dǎo)多能干細胞的過程中，可以適用本發(fā)明的方法。具體地，作為初始化的對象的經(jīng)分化的細胞包括成纖維細胞、滑膜細胞、口腔或胃等的粘膜細胞、肝細胞、骨髓細胞、牙胚細胞、其它希望的細胞。此外，細胞可以是來源于例如胚、胚胎、 新生兒、小孩、成人或老年人的細胞。此外，對動物的來源沒有特殊限制，包括哺乳動物等， 哺乳動物包括例如人和非人靈長類(猴等)、小鼠、大鼠等嚙齒類和牛、豬、羊等非嚙齒類。采用本發(fā)明的方法制造的細胞可用于分化成各種組織或細胞，可用于希望的試驗、研究、診斷、檢查、治療等。例如，預(yù)期誘導(dǎo)出的干細胞可用于干細胞療法。例如，可以使用采集自患者的體細胞，誘導(dǎo)初始化(reprogramming)，然后，將分化誘導(dǎo)所得的體性干細胞或其它體細胞移植給患者。對于細胞分化誘導(dǎo)的方法沒有特殊限制，例如，可以通過視黃酸處理、各種增殖因子-細胞因子處理、利用激素進行的處理來誘導(dǎo)分化。此外，所得細胞可以用于檢測希望的藥物、化合物的效果，由此可以實施藥物、化合物的篩選。實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體地說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。 此外，本說明書中引用的文獻及其它參考資料，全部并入作為本說明書的一部分。
<本發(fā)明中使用的攜帶外源基因的仙臺病毒載體的制作>本發(fā)明中使用的攜帶外源基因的仙臺病毒載體的制作方法如下所示。如無特別說明，外源基因的導(dǎo)入使用該載體來進行。此外，下述％V18+/TSAF是M蛋白質(zhì)中具有 G69E、T116A和A183S的突變、HN蛋白質(zhì)中具有A262T、G264和K461G的突變、P蛋白質(zhì)中具有L511F突變、且L蛋白質(zhì)中具有mi97S和K1795E突變的F基因缺失型仙臺病毒載體 (W02003/025570)。該載體的NP基因的上游(基因組的3 ‘側(cè)；也稱“ 18+位”)具有導(dǎo)入基因插入位點(NotI位點)。(1)用于分離c-Myc基因、Sox2基因、KLF4基因以及0ct3/4基因的cDNA文庫的制作為了分離c-Myc基因、Sox2基因、KLF4基因以及0ct3/4基因，從Jurkat細胞抽提了總 RNA。將 1.0X 106(個)細胞的 Jurkat 細胞(Schneider U et al (1977) Int J Cancer 19(5) :621-6)于8000rpm、室溫離心1分鐘，進行了收集。添加細胞溶解緩沖液 (IOmM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl, 1. 5mM MgCl2,0· 65% NP-40) 200 μ 1，吹吸后，利用渦旋振蕩使之懸浮。6000rpm離心分離3分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另外的1.5ml Eppendorf管中， 添加200 μ 1的抽提緩沖液。利用渦旋振蕩充分懸浮后，添加400 μ 1的苯酚/氯仿/異戊醇 (25 24 1)，再利用渦旋振蕩充分懸浮。15000rpm、4°C離心分離5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另外的1. 5ml Eppendorf管中，添加400 μ 1的異丙醇，利用渦旋振蕩充分懸浮后，于_20°C 冷卻30分鐘。15000rpm、4°C離心分離15分鐘，除去上清，在沉淀物中加入70%乙醇1ml， 利用渦旋振蕩懸浮后，15000rpm、4°C離心分離5分鐘。除去上清并于室溫進行干燥后，將其溶解于100 μ 1的不含核酸酶的水中，得到了 Jurkat細胞的總RNA溶液。為了分離KLF4基因，采用與上述相同的方法從人胚胎腎細胞來源的^3Τ/17細胞 (人胚胎腎亞克隆 17，ATCC CRL-11286, Pear, W. S.等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 8392-8396)中回收了總 RNA。為了分離0ct3/4基因，采用與上述相同的方法從人胚胎瘤細胞NCCIT細胞(ATCC 編號 CRL-2073 ；Damjanov I，等，Lab. Invest. 1993,68(2) :220-32)中回收了總 RNA。從回收的總RNA 使用 Superscript III 逆轉(zhuǎn)錄酶 Qnvitrogen 目錄號 18080-044) 合成了 cDNA。將總RNA 1 μ g、隨機六聚體IOOngUOmM dNTP混合液1 μ 1用不含核酸酶的水調(diào)整至13 μ 1。65°C熱處理5分鐘，然后在冰上放置冷卻1分鐘。然后，添加切第一鏈緩沖液 4μ1 0. IM DTT 1 μ 1、RNaseOUTl μ 1，再添加 Superscript III RT Ιμ ，通過吹吸進行混合后，旋轉(zhuǎn)沉降，進行25 V 5分鐘、50°C 60分鐘、70°C 15分鐘的反應(yīng)。添加 TE (pH8. 0)180 μ 1，將此作為 cDNA 文庫。(2)人轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的分離和攜帶有c-Myc的仙臺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建從Jurkat的cDNA文庫使用PrimeStar (商標)HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式會社目錄號 R010A)以 c-Myc-21F(5，-AACCAGCAGCCTCCCGCGACG-3，(SEQ ID NO 1))禾口 c_Myc 1 930R(5‘-AGGACATTTCTGTTAGMGGMTCG-3‘ (SEQ ID NO :2))為引物，進行了 PCR(94°C _3 分鐘 —980C -10秒、55°C -15秒、72°C _2分鐘進行40個循環(huán)一72°C _7分鐘)。將該PCR產(chǎn)物用 TE 稀釋 100 倍后，對于其中的 1 μ 1，使用 c-Myc-F(5，-GATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACC-3，(SEQ ID NO 3))和c-Myc-R(5，-GTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTG-3，(SEQ ID NO :4))引物進行PCR。 將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切出約1. 3kbp的條帶，用Qiaquick凝膠抽提
30試劑盒tolAGEN，目錄號觀706)進行了純化?？?隆至pCAGGS_BSX(W02005/071092)的SwaI 位點，進行測序選擇出正確的克隆，得到了 pCAGGS-BSX-c-Myc。然后，以pCAGGS-BSX-c-Myc 作為模板，使用 Notl-c-Myc F(5，-ATTGCGGCCGCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCAC-3，(SEQ ID NO: 5))和Notl-c-Myc R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACGCACAAG AGTTCCGTAGCTGTTCAAGTTTGTGTTTC-3，(SEQ ID NO :6))引物進行 PCR。PCR產(chǎn)物用 Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號觀106)進行純化，然后進行Not I消化(37°C 3小時)。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號觀106)進行純化，克隆至Bluescript質(zhì)粒載體的Not I位點，通過測序確認基因序列，選擇出序列正確的克隆，得到了 pBS-KS-c-Myc。 將pBS-KS-c-Myc用Not I消化(37°C，3小時)，用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，切出約1. 5k bp的條帶，用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(GIAGEN，目錄號洲706)純化。將該包含c_Myc基因的NotI片段克隆至編碼仙臺病毒載體(SeV18+/TSAF)的反基因組的pSeV18+/TS Δ F載體的Not I位點，通過測序選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pSeV18+C-MyC/TSAF。(3)人轉(zhuǎn)錄因子S0X2基因的分離和攜帶S0X2基因的仙臺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建從Jurkat的cDNA文庫，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式會社目錄號 R010A)并利用 S0X2-64F(5，-CAAAGTCCCGGCCGGGCCGAGGGTCGG-3，(SEQ ID NO :7))禾口 S 0X2-1404R(5，-CCCTCCAGTTCGCTGTCCGGCCC-3，(SEQ ID NO :8))引物，進行了 PCR(94°C _3 分鐘一98°C -10秒、55°C -15秒、72°C _2分鐘進行40個循環(huán)一72°C _7分鐘)。將該PCR產(chǎn)物用 TE 稀釋 100 倍后，對于其中的 1 μ 1，使用 Sox2-F(5，-GATGTACAACATGATGGAGACGGAGC-3，( SEQ ID NO 9))和 Sox2-R(5，-GTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTG-3，(SEQ ID NO :10))引物進行了 PCR。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切出約0. 95k bp的條帶，用Qiaquick 凝膠抽提試劑盒GIAGEN，目錄號觀706)進行了純化?？寺≈羛CAGGS_BSX的SwaI位點， 進行測序選擇出正確的克隆，從而得到了 PCAGGS-BSX-S0X2。然后，以pCAGGS-BSX_S0X2作為模板，用 Not I Sox-2F(5’-ATTGCGGCCGCATGTACAACATGATGGAGACG-3’ (SEQ ID NO :11)) 和 Not I Sox-2R(5'-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGA GGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3，(SEQ IDNO 12))引物進行 PCR。將 PCR 產(chǎn)物用 Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號觀106)進行純化，然后進行Not I消化(37°C、3小時)。用 Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號觀106)進行純化，克隆至Bluescript質(zhì)粒載體的Not I位點，通過測序確認基因序列，選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pBS-KS-Sox2。 將pBS-KS-SoX2用Not I進行消化(37°C 3小時)，用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切出約Ik bp的條帶，用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(GIAGEN，目錄號觀706)進行了純化。將該含Sox2基因的NotI片段克隆至pSeV18+/TSAF載體的Not I位點，通過測序選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pSeV18+Sox2/TS Δ F。(4)人轉(zhuǎn)錄因子KLF4基因的分離和攜帶有KLF4基因的仙臺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建從Jurkat的cDNA文庫，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARABio株式會社目錄號 R010A)并利用 KIF-4-35F(5，-CCACATTAATGAGGCAGCCACCTGGC-3，(SEQ ID NO :13))和 KI F-41772R(5‘-GCAGTGTGGGTCATATCCACTGTCTG-3‘ (SEQ ID NO :14))引物，進行了 PCR(94°C _3 分鐘一980C -10秒、55°C -15秒、72°C _2分鐘進行40個循環(huán)一72°C _7分鐘)。將該PCR 產(chǎn)物用 TE 稀釋 100 倍后，對于其中的 1 μ 1，使用 KIF4-F(5，-GATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCC C-3，(SEQ ID NO :15))和 KIF4_R(5，-GTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAG-3，(SEQ ID NO 16))引物，進行了 PCR。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切出約1.4k bp的條帶，用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(QIAGEN，目錄號28706)進行了純化?？寺≈羛CAGGS_BSX 的SwaI位點，從而得到了 pCAGGS-BSX-KLF4#19。測序結(jié)果可以確認pCAGGS_BSX_KLF4#19 有1個位置發(fā)生了沉默突變(cl9t)。因而，以pCAGGS-BSX-KLF4#19作為模板，使用NotI-KIF4-F(5‘-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3 ‘ (SEQ ID NO: 17))和 NotI_KIF4-R (5，-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTMGGCGA GGTGGTC-3，(SEQ ID NO 18))引物進行了 PCR。將 PCR 產(chǎn)物用 Qiaquick PCR 純化試劑盒 (GIAGEN,目錄號28106)進行純化，克隆pCAGGS_BSX的SwaI位點。通過測序進行確認，選擇出序列正確的克隆，從而得到了 PCAGGS-BSX-KLF4。然后，以pCAGGS_BSX_KLF4作為模板， 使用 NotI-KIF4-F(5’ -ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3，(SEQ ID NO: 17))和 NotI-KIF4-R(5’ -ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCA TGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3，(SEQ ID NO 18))引物進行了 PCR。將 PCR 產(chǎn)物用 Qiaquick PCR 純化試劑盒(GIAGEN，目錄號28106)進行純化，然后進行Not I消化(37°C 3小時)。使用 Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號28106)進行純化，克隆至Bluescript質(zhì)粒載體的Not I位點，通過測序確認基因序列，選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pBS-KS-KLF4。 將pBS-KS-KLF4用Not I進行消化(37°C 3小時)，用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切出約 1. 5k bp的條帶，用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(GIAGEN，目錄號28706)進行了純化。將該包含KLF4基因的Not I片段克隆至pSeV18+/TSAF載體的Not I位點，通過測序選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pSeV18+KLF4/TS Δ F。 (5)人轉(zhuǎn)錄因子0ct3/4基因的分離和攜帶了 0ct3/4基因的仙臺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建從NCCIT的cDNA文庫，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARABio株式會社目錄號 R010A)并利用 0ct-3-28F(5，-CACCATGCTTGGGGCGCCTTCCTTCC-3，(SEQ ID NO 19))和 OC T3/4R301(5，-CATCGGAGTTGCTCTCCACCCCGAC-3，(SEQ ID NO :20))引物、0CT3/4F 192(5'-CCC GCCGTATGAGTTCTGTGG-3，(SEQ ID NO 21))和NotI-0ct_3/4R-DPN(5，-GCCGCGGCCGCGTTATCAG TTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3，(SEQ IDNO 22))引物，進行了 PCR (94°C -3 分鐘—98°C -10 秒、55°C -15秒、72°C -1分鐘進行35個循環(huán)一72°C _7分鐘)，將0ct3/4分2個區(qū)域進行了擴增。將這2個PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號28106)進行純化，將其洗脫至試劑盒附帶的洗脫液100 μ 1中。洗脫液用TE稀釋50倍。將這些PCR產(chǎn)物 μ 進行混合，使用 Not I-0ct-3/4F (5，-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3，(SEQ ID NO : 23))和 Not I-0ct-3/4R-DPN (5，-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3， (SEQ ID NO 22))引物，進行了 PCR(94°C -3 分鐘一98°C -10 秒、55°C -15 秒、72°C _1· 5 分鐘進行35個循環(huán)一72°C -7分鐘)。用Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN,目錄號28106) 純化PCR產(chǎn)物，然后將其克隆至pCAGGS-BSX的SwaI位點，進行測序，選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pCAGGS-BSX-0ct3/4。然后，以 pCAGGS-BSX_0ct3/4 作為模板，使用 Not I-O ct-3/4F(5‘-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3‘(SEQ IDNO 23))和 Not I-Oct-3/4 R(5’-GCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGA GTGGTGAC-3，(SEQ ID NO 24))引物，進行了 PCR(94°C -3 分鐘一98°C -10 秒、55°C -15 秒、 72 V -2分鐘進行25個循環(huán)一72 V ~7分鐘)。將PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN,目錄號28106)純化，然后用Not I消化(37°C、2小時)。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(GIAGEN，目錄號觀106)純化，將該包含0ct3/4基因的Not I片段克隆至pSeV18+/ TSAF載體的Not I位點，通過測序選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pSeV18+0ct3/4/ TS Δ F。(6)攜帶人轉(zhuǎn)錄因子的仙臺病毒載體的制作轉(zhuǎn)染的前一天，在6孔平板上播種IO6細胞/孔的^3Τ/17細胞，在37°C的(X)2培養(yǎng)箱(5% CO2條件下)中進行了培養(yǎng)。將該293T/17細胞與pCAGGS_NP、pCAGGS_P4C(-)、 pCAGGS-L(TDK)、pCAGGS-T7、pCAGGS_F5R(W02005/071085)以及上述所示的攜帶了人轉(zhuǎn)錄因子的仙臺病毒載體質(zhì)粒(pkV18+c-Myc/TSAF 或的eV18+Sox2/TS Δ F 或的eV18+KLF4/ TS Δ F 或 pSeV18+0ct3/4/TS Δ F)按照分別 0. 5 μ g，0. 5 μ g，2 μ g，0. 5 μ g，0. 5 μ g 和 5. 0 μ g 的量進行混合，使用15 μ 1的TransIT-LTl (Mirus)進行了轉(zhuǎn)染。在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。然后，將表達仙臺病毒的融合蛋白質(zhì)(F蛋白質(zhì))的細胞LLC-MK2/F/A(Li，H. -0. 等，J. Virology 74. 6564-6569(2000), W000/70070)按每孔 IO6 細胞的比例在轉(zhuǎn)染后的 293T/17細胞上疊層，在37°C的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。第二天，棄去細胞的培養(yǎng)液，用添加有青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基(以下稱作PS/MEM) Iml洗滌細胞1次，每孔添加含2. 5 μ g/ml 胰蛋白酶的PS/MEM培養(yǎng)基(以下稱作Try/PS/MEM) 1ml，于32°C的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。 每3 4天更換培養(yǎng)基一次，并根據(jù)情況用LLC-MK2/F/A細胞進行傳代來繼續(xù)培養(yǎng)。對于一部分培養(yǎng)上清，通過血紅細胞凝集分析確認有無載體回收，在獲得充分的血紅細胞凝集反應(yīng)后，回收了培養(yǎng)上清。從回收的培養(yǎng)上清使用QIAamp病毒RNA迷你試劑盒(GIAGEN，目錄號52906)回收RNA，以攜帶的轉(zhuǎn)錄因子的區(qū)域為靶標進行了 RT-PCR。通過測序確認所得 RT-PCR產(chǎn)物是正確的堿基序列，制作了下述(a) (d)的載體。(a)攜帶0ct3/4基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱作“18+0ct3/4/ TS Δ F載體”)(b)攜帶Sox2基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱作“SeV18+SoX2/TSAF 載體”)(c)攜帶Klf4基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱作“SeV18+Klf4/TSAF 載體”)(d)攜帶c-Myc基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱作“SeVlS+c-Myc/ TS Δ F載體”)<實施例1>利用攜帶外源基因的仙臺病毒載體制作ES樣細胞首先，將8.0χ105(個)的人新生兒周皮來源成纖維細胞(BJ) (ATCC(http:// www. atcc. org)、CRL-2522)(人成人皮膚來源成纖維細胞 HDF (Applications， Inc. 106-05A-1388 ；36歲成人白人女性頰來源)和人胚胎肺細胞來源成纖維細胞(MRC5 ； ATCC, CCL-171)在 DMEM(GIBC0-BRL, 11995)，10% FBS(GIBC0-BRL)中于 37°C、0. 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天(DMEM(GIBC0-BRL, 11995), 10% FB S(GIBC0-BRL))。培養(yǎng)后，將MOI = 3的濃度的下述(a) (d)的載體施用于上述培養(yǎng)的細胞。(a)kV18+0ct3/4/TSAF 載體(b)kV18+Sox2/TSAF 載體(c)kV18+Klf4/TSAF 載體
(d)kV18+c-Myc/TSAF 載體施用上述載體后，第二天更換培養(yǎng)基(DMEM(GIBC0-BRL，11995)，10 % FBS (GIBC0-BRL))。然后，在37°C、0. 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 8天。然后，在于包被有明膠的IOcm 培養(yǎng)皿中制備的5. OX 105(個)絲裂霉素處理過的飼養(yǎng)細胞(例如MEF)上培養(yǎng)用0. 25% 胰蛋白酶解離的上述導(dǎo)入細胞5.0X 104(個) 1.0X106(個)。第二天，將DMEMUO% FBS 更換為靈長類ES用培養(yǎng)基OteproCell公司，RCHEMD001)(添加最濃度如g/ml的bFGF)，在 3% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的更換每日或每二日進行一次。培養(yǎng)基可以是飼養(yǎng)細胞的條件化培養(yǎng)基。集落在數(shù)日后出現(xiàn)，通過基本上培養(yǎng)20天左右，出現(xiàn)了人ES細胞樣集落(圖1 ； BJ來源)。對圖1的照片進行觀察，可見與誘導(dǎo)前的成纖維細胞(BJ)明顯不同的、與在人ES 細胞中所見相同的扁平集落(實驗醫(yī)學(xué)Vol^6，No.5(增刊):ρρ· 35-40，2008)。挑取該集落，在新的飼養(yǎng)細胞上進行培養(yǎng)。這些細胞能夠用ES細胞樣解離液加以解離(胰蛋白酶與膠原酶混合物=IteproCell公司，RCHETP002)并進行傳代和增殖。為了明確上述初始化實驗中獲得的細胞是否表達ES細胞的特征性未分化標志物，進一步進行了下述實驗。<實施例2>通過上述初始化實驗獲得的細胞的堿性磷酸酶染色用NBCT/BCIP (PIERCE, NBT/BCIP, l_St印，#；34042)進行染色，考察 ES 細胞的未分化標志物堿性磷酸酶的活性，結(jié)果觀察到了被染成藍色的堿性磷酸酶陽性集落(圖2)。<實施例3>通過上述培養(yǎng)獲得的細胞的細胞內(nèi)特定基因表達量的檢測收集上述實施例2所示的堿性磷酸酶陽性的多個集落(ALP(+))，抽提了 RNA(圖 3(a)的ALP(+))。用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并使用各自的引物進行了 PCR(圖3(a))。 就引物序列而言，0ct3/4 使用了 Fw :5' -GATCCTCGGACCTGGCTAAGC-3 ‘ (SEQ ID NO: 25)和 Rv :5 ‘ -GCTCCAGCTTCTCCTTCTCCAGC-3 ‘ (SEQ ID NO 26)，Sox2 使用了 Fw :5 ‘-AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3‘ (SEQ ID N0:27)和 Rv:5' -ATGCGCTGGTTCACGCC CGCGCCCAGG-3 ‘ (SEQ ID NO :28)，KLF4 使用了 Fw :5 ‘ -GCTGCACACGACTTCCCCCTG-3 ‘ (S EQ ID NO :29)禾口 Rv :5' -GGGGATGGAAGCCGGGAGGAAGCGG-3 ‘ (SEQ ID NO 30), c-myc 使用了 Fw:5' -TCTCAACGACAGCAGCTCGC-3 ‘ (SEQ ID NO :31)和 Rv :5 ‘ -CAGGAGCCT GCCTCTTTTCCACAGA-3 ‘ (SEQ ID NO :3 ，Nanog 使用了 Fw :5 ‘ -TACCTCAGCCTCCAGCAGAT -3' (SEQ ID NO 33) ^P Rv 5' -TGCGTCACACCATTGCTATT-3‘ (SEQ ID NO 34), β -肌動蛋白使用了 Fw 5 ‘ -CAACCGCGAGAAGATGAC-3 ‘ (SEQ ID NO 35)禾口 Rv 5' -AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3‘ (SEQ ID NO 36)。此外，分離單一的ES樣細胞集落，按照與上述相同的方法進行了 RT_PCR(圖3 (b) 的 4BJ_liPS)。同時，還使用引物 Fw 5' -tgcccggacctccatcagagccag-3 ‘ (SEQ ID NO :37)禾口 Rv :5, -tcagtccaggatggtcttgaagtctg-3，(SEQ ID NO :38)對 hTERT 的表達進行了檢測。檢測到了在誘導(dǎo)前的成纖維細胞(BJ)中不能檢出的導(dǎo)入基因的表達(0ct3/4， Sox2, Klf4)，c-Myc的表達也增加了。此外，還發(fā)現(xiàn)ES細胞標志物Nanog也如陽性對照胚胎性癌細胞(NCCIT)中那樣被誘導(dǎo)表達(圖3(a)的ALP(+))。Nanog是新鑒定出的同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(Cell，Vol. 113，631-642，2003)，其在ES細胞、EG細胞等多能干細胞或初期胚中特異性表達，參與保持多能性與自復(fù)制能力的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。此外，在單一集落來源的細胞中也觀察到了未分化ES細胞的標志物基因表達，而且還觀察到hTERT的表達，這是顯示無限增殖能力的端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活化指標(圖3(b)的4BJ-liPS)。上述事實支持分離出的集落的細胞是多能干細胞。
<實施例4>使用突變型c-Myc制作誘導(dǎo)性多能干細胞導(dǎo)入沉默突變的人轉(zhuǎn)錄因子c-Myc (以下稱作C_rMyC)的制作以 pBS-KS-c-Myc 作為模板，使用 PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA Bio 株式會社目錄號R010A)并加入突變導(dǎo)入用的6種引物(c-rMycl-F(5‘ -CGGACGACGAGACCTTCATCAAGA ACATCATCATCCAGGACTG-3‘ (SEQ ID NO :39))、c_rMycl-R(5' -CAGTCCTGGATGATGATGTTCTTGA TGMGGTCTCGTCGTCCG-3 ‘ (SEQ ID NO :40))、c-rMyc2_F(5' -GAACGAGCTAMACGGAGCTTCTTCG CCCTGCGTGACCAGATCC-3 ‘ (SEQ ID NO :41))、c-rMyc2-R(5 ‘ -GGATCTGGTCACGCAGGGCGMGAA GCTCCGTTTTAGCTCGTTC-3‘ (SEQ ID NO :42))、c-rMyc3-F(5‘ -CCCAAGGTAGTTATCCTTAAGAAG GCCACAGCATACATCCTGTC-3 ‘ (SEQ ID NO :43))和 c_rMyc3-R(5' -GACAGGATGTATGCTGTGGCCT TCTTAAGGATAACTACCTTGGG-3 ‘ (SEQ ID NO :44)))，進行了 PCR(94°C _3 分鐘一98°C-30 秒、 55 0C -30秒、72°C -6分鐘進行25個循環(huán)一72 °C _7分鐘)。將PCR產(chǎn)物用Dpn I于37°C處理2小時。使用該反應(yīng)液5 μ 1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (ToYoBo Code No. DNA-903)。挑取16 個大腸桿菌菌落，進行小量制備(minipre)，通過測序選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pBS-KS-c-rMyc。將pBS-KS-c-rMyc用Not I進行消化(37°C 3小時)，用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切出約1. 5k bp的條帶，用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(GIAGEN，目錄號28706) 進行了純化。將該包含c-rMyc基因的Not I片段克隆至pSeV(HNL)/TS Δ F載體的Not I 位點，通過測序選擇出序列正確的克隆，從而得到了 pSeV(HNL)-C-rMyC/TSAF。c-rMyc的堿基序列和氨基酸序列如SEQ ID N0:45和46所示。c-rMyc具有a378g、tll22c、tll25c、 all91g、禾口 all94g 的突變。pSeV(HNL)/TSAF 的構(gòu)建如下進行。 以 Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP(國際
發(fā)明者伴浩志, 房木野繪美, 米滿吉和, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社