專利名稱：用超聲波方法促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法是通過超聲波來刺激在培養(yǎng)基里生長的動(dòng)物細(xì)胞來促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖的。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是體外增殖動(dòng)物細(xì)胞是常見的方式。動(dòng)物細(xì)胞株的大量培養(yǎng)是生產(chǎn)病毒疫苗和許多生物技術(shù)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。通過在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用重組DNA(rDNA)技術(shù)可以生產(chǎn)酶、合成激素、免疫生物品(單克隆抗體、白細(xì)胞介素、淋巴激活素)、和抗癌藥物等多種生物產(chǎn)品。盡管許多簡單的蛋白可以通過在細(xì)菌培養(yǎng)中應(yīng)用rDNA來生產(chǎn)，但是在現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)中，許多復(fù)雜的蛋白基于糖基化的原因(carbohydrate-modified)則必須在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。許多不同類型的細(xì)胞都可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，這也引起了很多不同領(lǐng)域的研究人員的極大興趣。干細(xì)胞便是其中的一種。干細(xì)胞與身體內(nèi)的其他細(xì)胞不同。所有干細(xì)胞，不管其來源如何，具有三種基本特征它們可以長期分裂和自我更新；它們是非分化的；它們可以產(chǎn)生一種或多種分化完全的細(xì)胞類型。干細(xì)胞保持未分化的狀態(tài)需要很多特定因素和條件，這些特定因素和條件引起了科學(xué)家們的極大感興。科學(xué)家們終于在多年反復(fù)試驗(yàn)和失敗中學(xué)會(huì)了在實(shí)驗(yàn)室中分離和培養(yǎng)干細(xì)胞而不致讓它們自發(fā)分化成特異細(xì)胞類型的方法。因此，通曉在成熟的生物體中調(diào)節(jié)干細(xì)胞群增殖但又能保持其未分化狀態(tài)的信號傳輸系統(tǒng)是非常必要的。這些信息也是科學(xué)家能否在實(shí)驗(yàn)室生長大量未分化干細(xì)胞的重中之重。干細(xì)胞是未分化的。干細(xì)胞的基本特性之一就是它沒有實(shí)行專門功能的組織特異性結(jié)構(gòu)。例如，干細(xì)胞不能像心肌細(xì)胞那樣與鄰近細(xì)胞協(xié)作給身體輸送血液，它也不能想紅細(xì)胞那樣在血流中攜帶氧分子。但是，未分化的干細(xì)胞能生成像心臟肌肉細(xì)胞、紅細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞等那樣的分化完全的細(xì)胞?？茖W(xué)家們正在試圖在實(shí)驗(yàn)室找到控制干細(xì)胞分化的新方法，從而生長出用于像以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療法或藥物篩選等特定目的的細(xì)胞或組織。通常情況下，成體干細(xì)胞只能分化成其所在組織的細(xì)胞類型。比如，骨髓中的造血干細(xì)胞通常生成各類血液細(xì)胞。通常認(rèn)為骨髓中造血細(xì)胞，也稱造血干細(xì)胞，不能生成其他組織的細(xì)胞，如大腦中的神經(jīng)細(xì)胞。過去幾年的實(shí)驗(yàn)證實(shí)某個(gè)組織的干細(xì)胞也許會(huì)生成另一個(gè)完全不同組織的細(xì)胞類型。人類干細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)和臨床上有許多用途。人類胚胎干細(xì)胞的研究會(huì)讓人了解人類發(fā)育過程中的復(fù)雜事件。本工作的主要目的是辨別未分化的干細(xì)胞是如何分化為形成不同組織和器官的特別細(xì)胞的。科學(xué)家們知道控制轉(zhuǎn)化的基因的開通與關(guān)閉是此過程的關(guān)鍵。在一些嚴(yán)重的醫(yī)療狀況下，如癌癥和生育缺陷，就是由于不正常的細(xì)胞分裂和分化所造成。進(jìn)一步完全的理解這些過程中的基因和分子生物控制將有助于明白這些疾病的產(chǎn)生并能提出新的治療方法。能提前控制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化需要更多的有關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和轉(zhuǎn)化中分子和基因信號通路的基礎(chǔ)研究。最近在iPS細(xì)胞的研究進(jìn)展中顯示了一些特別的因子參與其中，然而，需要設(shè)計(jì)相關(guān)技術(shù)用來安全地在細(xì)胞中引進(jìn)這些特別因子并控制由這些特別因子引起的生物過程。人類干細(xì)胞也能用于測試新藥物。例如，可以利用人類多功能干細(xì)胞株產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞測試新藥物的安全性。其他類型的細(xì)胞株已經(jīng)應(yīng)用在這個(gè)領(lǐng)域了。例如癌細(xì)胞株被用于篩選潛在的抗癌藥物。有了多能干細(xì)胞將能對更大范圍的細(xì)胞類型進(jìn)行藥物測試。然而為有效的篩選藥物，比較不同藥物的條件必須相同。因此，在測試藥物過程中，科學(xué)家們必須要能精確的控制干細(xì)胞分化為特別的細(xì)胞類型的過程。目前的控制分化的信號的知識(shí)不足以準(zhǔn)確模擬生成用于測試藥物的純的分化細(xì)胞群的條件。也許人類干細(xì)胞最重要的潛在應(yīng)用是生長用于細(xì)胞學(xué)療法中的細(xì)胞和組織。目前，捐助的器官和組織通常用于替換生病的或損壞的組織，但移植組織和器官的需求遠(yuǎn)大于供應(yīng)。干細(xì)胞，可控的分化成特定的細(xì)胞類型，提供了可能的再生細(xì)胞和組織來源以治療包括老年癡呆癥、脊髓損傷、中風(fēng)、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病?，F(xiàn)在極其需要發(fā)展新的技術(shù)來增強(qiáng)培養(yǎng)基中干細(xì)胞增殖并進(jìn)一步促進(jìn)更快和有效地研究干細(xì)胞及其潛在應(yīng)用。超聲波的刺激在液體中產(chǎn)生“微孔”或稱為“微孔洞”的小氣泡。每一輪波幅中， 這些氣泡擴(kuò)張和收縮，在微觀尺度產(chǎn)生了很大的力和擾動(dòng)。某些情況下，聲波強(qiáng)到足以使孔洞破裂，從而在孔洞附近導(dǎo)致更極端的擾動(dòng)、高溫、和自由基。這些破裂強(qiáng)大到會(huì)驅(qū)除或破壞細(xì)胞。超聲波的應(yīng)用是基于這些過程，常見的用途是做為有效的清潔設(shè)備；如有足夠的強(qiáng)度，孔洞的破裂是細(xì)胞環(huán)境的主導(dǎo)因素。這可將有害細(xì)菌從表面剝離，甚至殺死大部分細(xì)菌。此技術(shù)的有效性通過如下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將超聲波加于玻璃試管的一端，頻率約100kHz，強(qiáng)度約40W/cm2，大約88%的細(xì)菌從試管表面除去。類似實(shí)驗(yàn)在各種情況下進(jìn)行過，如將生物膜從反向滲透膜上剝離。超聲設(shè)備積極的售給實(shí)驗(yàn)室用于清潔。如同驅(qū)除細(xì)菌，超高強(qiáng)度超聲波(> lOW/cm2)用于殺死懸浮的細(xì)菌，這有賴于孔洞破裂從而撕裂細(xì)菌薄膜。低強(qiáng)度超聲波也有其用途；長期以來已意識(shí)到超聲波可以促進(jìn)骨骼生長，幾乎 80%北美的理療師有超聲發(fā)射器用于加速康復(fù)。目前的研究表明只有低強(qiáng)度的超聲在此情形下有效，以此為目的在市場上可見低強(qiáng)度脈沖超聲設(shè)備(LIPUS)。一種方法見于 Duarte (1982)的美國專利 U. S. Pat. No. 4，530, 360。一種用低強(qiáng)度脈沖超聲波作為輔助治療來加速傷口愈合的方法見于 Bachem(2005)的美國專利 U. S. Pat. Application 2006/0106424A1。此方法用超聲來增加人體巨噬細(xì)胞的吞噬行為，并依據(jù)類似原理達(dá)成此目的。然而，此方法沒有涉及創(chuàng)傷范圍外的其他超聲波的運(yùn)用。美國專利(U.S. Patent Application No. US 2003/0153077 Al)詳細(xì)描述一種用低強(qiáng)度超聲波來刺激生物膜和其他細(xì)胞生長的方法。這種方法靠平衡微孔的破裂導(dǎo)致的有益的擾動(dòng)與相應(yīng)的負(fù)面效應(yīng)，低強(qiáng)度超聲可以提高細(xì)胞生長率可高達(dá)50%。實(shí)驗(yàn)人員以此測試了人體和細(xì)菌細(xì)胞，頻率范圍從20kHz到IMHz而強(qiáng)度范圍從1到5000mW/cm2。然而， 盡管增加細(xì)胞生長對發(fā)酵過程是有益的，該研究組的參數(shù)沒有提供發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的最優(yōu)比率。發(fā)明概述本發(fā)明的方法是用校正過的超聲波刺激來提高細(xì)胞培養(yǎng)基中動(dòng)物細(xì)胞增殖率。也就是說本發(fā)明的方法是通過細(xì)胞暴露給特定頻率和強(qiáng)度的超聲波，此發(fā)明成為了一種在培養(yǎng)基中增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞生長的方法。超聲波能夠在緊鄰細(xì)胞壁和其他固體表面附近產(chǎn)生微觀尺度的擾動(dòng)從而有利于生長在絕大多數(shù)環(huán)境下的細(xì)胞的增殖?；谂囵B(yǎng)基中細(xì)胞的種屬和類型的不同，超聲頻率可取的范圍是IMHz和2MHz之間。例如，超聲波的刺激頻率可選在1. 4至1. 6MHz之間。再例如，含有脈沖的超聲波將有助于最大限度的減少環(huán)境溫度的增加。另一個(gè)例子中，當(dāng)脈沖設(shè)置在占空比為4 1，脈沖時(shí)間大約1秒，最為有效。再一個(gè)例子中，超聲波可以被精確調(diào)整，從而在“微孔的破裂”的負(fù)面效應(yīng)與擾動(dòng)提供給細(xì)胞的正面效應(yīng)之間達(dá)到平衡，允許最大限度的增加細(xì)胞的營養(yǎng)攝取和新陳代謝物排出。在另一個(gè)方面，這項(xiàng)技術(shù)包含可以有監(jiān)測到超聲波實(shí)際應(yīng)用強(qiáng)度的方法，猶如靶細(xì)胞可以“感覺”到一樣。然而，這并不是在任何情況下都是必需的，即使沒有此種監(jiān)測技術(shù)設(shè)置，超聲波刺激方法照樣可以進(jìn)行。只要將任何超聲測量儀器連接到超聲發(fā)射器上，測量就可以進(jìn)行。例如，利用傳感器能將收集到的信息通過有線或無線的連接傳回到超聲發(fā)生器。另一方面，此發(fā)明包括了校正技術(shù)，利用上述傳感器監(jiān)測到的超聲強(qiáng)度，儀器能校正改變超聲波發(fā)射以達(dá)到最大效果。這有助于最大限度的提高細(xì)胞增殖速率。根據(jù)細(xì)胞在培養(yǎng)基中的脆弱性，超聲強(qiáng)度可以大于lOmW/cm2至5000mW/cm2。例如，超聲的方向可以被調(diào)整以達(dá)到最低的減少反射和干涉作用，或者被轉(zhuǎn)動(dòng)方向以達(dá)到超聲發(fā)射的最大效應(yīng)。


為了更好的理解上述列舉的此項(xiàng)發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，以下給出更為詳細(xì)的描述。 以特定的例子為例，結(jié)果在附錄的圖片中詳細(xì)的描述。以下例子只是此發(fā)明的實(shí)例之一，并不局限于此。在以下的圖片中圖IA是一示意圖描述了此發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例，如何促使干細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖。圖IB是具有系統(tǒng)反饋的超聲系統(tǒng)的示意圖。圖2展示的是超聲處理對LP-HSPC的增殖的作用。對照組無超聲波。A組40mW/ cm2, B組70mW/cm2，C組60mW/cm2，D組50mW/cm2?？v坐標(biāo)單位為OD (光學(xué)密度)。在這些試驗(yàn)中使用了生長因子和細(xì)胞因子的混合物(SCF :100ug/ml, TPO :50ug/ml, Flt3_ligand 50ug/ml)ο圖3A是⑶34陽性干細(xì)胞超聲處理前的形態(tài)(第O天)圖是⑶34陽性干細(xì)胞經(jīng)過4天超聲LIPUS刺激后的形態(tài)(第5天)。
圖4是⑶34陽性干細(xì)胞經(jīng)過4次不同強(qiáng)度超聲刺激后的細(xì)胞數(shù)目的對照圖。圖5顯示的是超聲波處理沒有使⑶34陽性的HSPC(人體造血干/祖細(xì)胞)發(fā)生分化。圖中不同組使用的超聲強(qiáng)度分別是A組40mW/cm2，B組70mW/cm2，C組60mW/cm2，D 組40mW/cm2。本圖是通過使用流式細(xì)胞儀(FACS)探測⑶34陽性的HSPC細(xì)胞表面的⑶34 和⑶14這兩種標(biāo)記物的量化表達(dá)而得到的。實(shí)例詳述參考以下例子和附圖可以更好的理解所述的發(fā)明方法。本發(fā)明方法，可以通過許多方式加以應(yīng)用和變更來加以概述。因此，如下的詳細(xì)描述不是用來局限此發(fā)明的范圍。事實(shí)上，此描述僅代表目前考慮的實(shí)例。此術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)基”可包括任何一群在受控環(huán)境下的細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞可以是任何來自動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞株，包括并不局限于，原始細(xì)胞，固定化的細(xì)胞，或干細(xì)胞。培養(yǎng)基可以是懸浮生長細(xì)胞，也可是2維或3維貼壁生長細(xì)胞，或任何其他培養(yǎng)基系統(tǒng)。此術(shù)語“動(dòng)物”是指動(dòng)物界和復(fù)細(xì)胞生物界中的多細(xì)胞的和真核的生物。顯然，它包括哺乳動(dòng)物綱和昆蟲類。術(shù)語“干細(xì)胞”是具有自我更新和能力特性的細(xì)胞。自我更新指能至少進(jìn)行一代有絲分裂并保持效能。效能指細(xì)胞未分化并能發(fā)展為一種或多種不同細(xì)胞類型。干細(xì)胞可以是全能的、多功能的、多能的、寡能的或?qū)Ｄ艿?。干?xì)胞可以是胎兒、胚胎或成體干細(xì)胞。術(shù)語“大約”用于指在可接受的范圍內(nèi)高于或低于所指圖表，任何情況下都不高于或低于10%。也可指不確定性或測量設(shè)備或儀器的不精確性。本發(fā)明可能適用于動(dòng)物細(xì)胞或者是來源相當(dāng)廣泛的細(xì)胞類型。這些細(xì)胞或者是細(xì)胞培養(yǎng)包括干細(xì)胞，免疫T細(xì)胞或者是胰島細(xì)胞等等。細(xì)胞增殖的增強(qiáng)在很多方面都可以應(yīng)用，例如細(xì)胞本身數(shù)目的增加或者可以用來產(chǎn)生更多有用的生物分子或者復(fù)合物等等。為何本發(fā)明中的超聲波會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞增殖的機(jī)理還不明確。不受限于任何理論， 已經(jīng)顯明本發(fā)明通過允許快速傳輸基本物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞和快速從細(xì)胞中分散新陳代謝副產(chǎn)品，從而加快蛋白質(zhì)表達(dá)。盡管絕大多數(shù)培養(yǎng)基技術(shù)是通過用攪拌或搖晃細(xì)胞培養(yǎng)物的方法試圖解決這個(gè)問題，我們相信有微觀的緩沖區(qū)存在于固定面或細(xì)胞壁附近，從而局限了液體的流動(dòng)。如果浸泡細(xì)胞的液體在緊鄰細(xì)胞的區(qū)域是凝滯的，這將限制傳輸小分子，如氧、氨基酸、二氧化碳等，進(jìn)入或從細(xì)胞中出來。當(dāng)受到超聲波刺激時(shí)，存在于細(xì)胞培養(yǎng)液中的小氣泡會(huì)收縮和擴(kuò)張。這種運(yùn)動(dòng)對包圍氣泡的液體產(chǎn)生了作用力，當(dāng)氣泡壓縮時(shí)，液體被“推”向小氣泡的周圍，當(dāng)氣泡擴(kuò)張時(shí)，液體被推開。這在微觀尺度上產(chǎn)生了足夠的擾動(dòng)。這種擾動(dòng)甚至是局部的，因?yàn)闅馀輧A向在細(xì)胞壁或固體表面周圍形成，正好是原來凝滯的區(qū)域。如果壓力足夠高(由于高強(qiáng)度的超聲所導(dǎo)致)，氣泡會(huì)完全塌縮。簡單的熱力學(xué)表明在這種情況下溫度會(huì)突然上升，某一研究聲稱溫度高達(dá)5000K，塌縮導(dǎo)致熱的激波或“剪切力”，或直接朝向氣泡中心的力。塌縮引起大范圍的擾動(dòng)，從而營養(yǎng)和廢物的轉(zhuǎn)移更快，但同時(shí)，過強(qiáng)的溫度和力也會(huì)破壞或撕裂細(xì)胞壁。本發(fā)明中的超聲的強(qiáng)度和頻率必須能夠被調(diào)節(jié)以達(dá)到能平衡空穴效應(yīng)帶來的有害和有益的效果。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲在高頻時(shí)，超過lMhz，對培養(yǎng)液中的動(dòng)物細(xì)胞生長是有益的。以前手段的超聲刺激頻率范圍在20kHz和IMHz之間。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)許多情況下優(yōu)化的頻率是高于1MHz。因此，在一個(gè)實(shí)例中超聲頻率大于IMHz小于2MHz。在1. 5MHz左右， 試驗(yàn)表明許多細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞和其他動(dòng)物細(xì)胞，允許最大“微攪動(dòng)”而只經(jīng)受最小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害。因此，在一實(shí)例中，超聲大于約1. 4MHz小于約1. 6MHz。這種高頻范圍是出人意料之外的，因?yàn)闆]有理論基礎(chǔ)來預(yù)測這種增強(qiáng)效果，而且高頻傳統(tǒng)上是與降低效率聯(lián)系的。目前為止，沒有任何其他技術(shù)建議用如此高頻范圍來刺激細(xì)胞生長或蛋白質(zhì)表達(dá)。超聲強(qiáng)度在約5mW/cm2至約5000mW/cm2之間。在一實(shí)例中，強(qiáng)度范圍在約40mW/ cm2和約80mW/cm2之間，另一實(shí)例中，最優(yōu)強(qiáng)度約為60mW/cm2。在一實(shí)例中，此發(fā)明包括了用超聲波來加強(qiáng)干細(xì)胞的增殖。近年來，干細(xì)胞吸引了許多注意力是因?yàn)樗鼈兡芊只扇梭w許多不同類型的組織。超聲波增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)的能力促進(jìn)了培養(yǎng)基中干細(xì)胞的增殖。不同細(xì)胞有不同長處和弱點(diǎn)，不是所有細(xì)胞都需要同樣的頻率和強(qiáng)度。不同種類或來源的細(xì)胞可能有很大的不同。本方法因此提供了頻率和強(qiáng)度的窗口以對不同細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化操作。在一實(shí)例中，超聲發(fā)射器放置在離目標(biāo)區(qū)域足夠近的地方從而向細(xì)胞傳遞特定頻率和強(qiáng)度的超聲刺激。超聲是通過壓電材料制成的傳感探頭傳遞給實(shí)驗(yàn)室通常用到的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的細(xì)胞的。傳感探頭應(yīng)該正確放置以通過培養(yǎng)基傳遞最強(qiáng)而且均勻的超聲。如圖1所示，實(shí)際操作中我們使用標(biāo)準(zhǔn)超聲傳導(dǎo)膠來使探頭和培養(yǎng)器皿緊密接觸。在一實(shí)例中，超聲加于培養(yǎng)基對數(shù)生長階段；然而，其有益效應(yīng)可在其它任何生長階段實(shí)現(xiàn)。持續(xù)的超聲波刺激是不必要的，每M小時(shí)用中，小于1小時(shí)超聲就可促進(jìn)增長率或蛋白質(zhì)表達(dá)。在一實(shí)例中，每對小時(shí)中，只需要用10到20分鐘的刺激就足以體現(xiàn)LIPUS 的益處。合適的頻率和強(qiáng)度的優(yōu)化可用以觀察或?qū)嶒?yàn)為根據(jù)來確定，如果技巧得當(dāng)可以不必大量試驗(yàn)。一般的，原核細(xì)胞比真核細(xì)胞更耐久因此能承受更高強(qiáng)度的超聲波刺激。 強(qiáng)度范圍簡略的討論于Pitt等的專利申請，題為“促進(jìn)細(xì)胞生長率的方法”，(Pub. No. US 2003/0153077A1)，其內(nèi)容被允許在參考文獻(xiàn)中包括。結(jié)論是真核細(xì)胞約為8-50mW/cm2而原核細(xì)胞約為2-2. 2W/cm2。在所有的Pitt等的專利試驗(yàn)中頻率為70kHz。在一實(shí)例中，因?yàn)殚L時(shí)間的超聲波刺激會(huì)積累熱量并破壞處理的細(xì)胞，最好超聲波為脈沖。脈沖的持續(xù)時(shí)間可以通過有技巧的經(jīng)驗(yàn)方法確定。在一實(shí)例中，1 4的占空比和1秒的周期時(shí)間被用在測試中(也就是200微秒的作用之后是800微秒的‘安靜期’)。 占空比和周期長度可以根據(jù)需要或要求改變。根據(jù)細(xì)胞種類及細(xì)胞其它特征，超聲波頻率和強(qiáng)度，其他脈沖周期也許更合適。當(dāng)將本技術(shù)中的幾種機(jī)制聯(lián)合在一起，這項(xiàng)技術(shù)可稱為“LIPUS”，即低強(qiáng)度脈沖超聲。在一實(shí)例中，此發(fā)明除包含了超聲感應(yīng)器，有效地連于超聲發(fā)射器外，還包含有頻率和強(qiáng)度反饋控制機(jī)制。超聲強(qiáng)度的測量可以通過合適的而且已經(jīng)商業(yè)化的器具來完成。 實(shí)際操作中，如果加入檢測探頭，本發(fā)明中的方法還可以把收集到的信號疊加到超聲發(fā)生器上。這個(gè)可以通過有線或者無線的連接完成。圖IB就是一個(gè)包含了反饋回路的裝置的示意圖。反饋回路的作用是維持超聲的強(qiáng)度和頻率在一個(gè)特定的水平或范圍內(nèi)。如上所述，此方法適用于在受控環(huán)境下的細(xì)胞生長，包括懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞生長正如在這里的描述和以后隨之而來的申報(bào)，本發(fā)明可具體實(shí)現(xiàn)于其他特定形式， 而不偏離其結(jié)構(gòu)、方法、或其它基本特性。正如附錄的申報(bào)所指，所有被描述的例子在每一方面都被認(rèn)為是就其所是的具體實(shí)例，因此，而不僅僅是之前的描述。任何在申報(bào)中的含義上的變化和等同的改變將都包含在其范圍內(nèi)。以下的例子僅僅作為示范，而不對此發(fā)明有任何局限。
例1，分離⑶34+陽性造血干/原細(xì)胞(HSPC)血白細(xì)胞制品(LP)經(jīng)過患者同意后獲得(依據(jù)阿爾伯塔大學(xué)人類研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的制度準(zhǔn)則)。LP用于分離CD34+陽性造血干/原細(xì)胞(HSPC)，按照制造商(Miltenyi-Biotec， Auburn, CA)所介紹的免疫磁珠分選的方法。簡要地，低密度單核細(xì)胞通過使用60 % percoll構(gòu)建的密度梯度離心的方法分離，用⑶34+陽性抗體OlBEND 10)標(biāo)記，然后通過一個(gè)陽性篩選柱。經(jīng)流式細(xì)胞儀來(FACS)測定，分離的臍帶血CD34陽性干細(xì)胞的純度高于 92%。例2，用低強(qiáng)度脈沖超聲波(LIPUS)刺激所有細(xì)胞生長在 Iscove's modified Dulbecco，s (IMDM，GibcoBRL，Long Island, NY, USA)培養(yǎng)基，其中含有20%牛血清(BGS ；Hyclone, Logan, UT, USA)and復(fù)合細(xì)胞因子 (SCF :100ug/ml, TPO :50ug/ml, Flt3_ligand :50ug/ml)，細(xì)胞在培養(yǎng)基中保存 4 天。用低強(qiáng)度脈沖超聲波刺激培養(yǎng)細(xì)胞，超聲波頻率1. 5MHz，20%占空比，可調(diào)強(qiáng)度在 30mW/cm2和lOOmW/cm2之間。為有助于用超聲波處理培養(yǎng)細(xì)胞，4個(gè)超聲傳感器固定在一個(gè)塑料架上并通過4個(gè)獨(dú)立的纜線連接到信號發(fā)生控制盒。細(xì)胞(3xl05)接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中用于實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)前，傳感器的運(yùn)作應(yīng)被檢查。用適量的耦合劑，然后將培養(yǎng)皿固定在超聲傳感器上，不同強(qiáng)度為40mW/cm2，50mff/cm2,60mff/cm2, 70mff/cm2的超聲在4天內(nèi)每M小時(shí)施加10分鐘。未處理的盤總是放在另一個(gè)孵化器中用于參照。例3，細(xì)胞增殖和存活率在培養(yǎng)的第5天，細(xì)胞增殖和存活率用臺(tái)盼藍(lán)和344，5-dimethylthiaZ0l-2-yl) -5- (3carboxymethoxyphenyl) _2_ (4-sulfophenyl) _2H_tetrazolium(MTS)對細(xì)胞毒性進(jìn)行分析和評估。96孔板讀數(shù)分析儀，AQueous One Solution(Promega，Madison，WI)，被用來作MTS檢測。簡要說明如下，細(xì)胞被接種于96孔板培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有細(xì)胞因子復(fù)合物(SCF :100ug/ml,TP0 :50ug/ml，F(xiàn)lt3_ligand :50ug/ml)的培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度為每孔 3xl05 個(gè)細(xì)胞。然后用LIPUS處理細(xì)胞4天。在臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)中，在含有懸浮生長的細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入同等量的0.4%稀釋在PBS緩沖液的臺(tái)盼藍(lán)(Sigma，St. Louis, Mo)溶液，細(xì)胞數(shù)用 Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)出。為了做MTS 分析，將 CellTiter 96 AQueous One 溶液(20 μ 1/100 μ 1 溶液)加入每個(gè)孔，細(xì)胞在37度下培養(yǎng)1-4小時(shí)。測量吸收率G90nm)，細(xì)胞增殖率通過計(jì)算處理過和未處理過的細(xì)胞的吸收率之比來得到。對比未用LIPUS處理過的HSPC，處理過的HSPC數(shù)量在4天培養(yǎng)后增加了大約400% (圖 2)。例4，細(xì)胞形態(tài)評估用LIPUS擴(kuò)展的細(xì)胞甩干用于細(xì)胞離心涂片器。細(xì)胞離心涂片器用 May-Grunwald-Giemsa染色。細(xì)胞酶聯(lián)斑點(diǎn)用蒸餾水洗滌并在顯微分析前風(fēng)干。對照組和超聲刺激組的HSPC細(xì)胞形態(tài)學(xué)分別顯示在圖3A和!3B。例5，F(xiàn)ACS 分析FACS分析儀被用來評估在細(xì)胞表面⑶34 (是造血干/原細(xì)胞標(biāo)記)和⑶14(是單核/巨噬細(xì)胞區(qū)分標(biāo)記)的表達(dá)，PE-anti-⑶34和FITC_anti_CD14單克隆抗體(BD Biosciences, Oakville, ON)來檢測OKM和CD14抗原。簡單描述如下，PBS緩沖液(不含 Ca和Mg離子)含有5% BGS被用來給細(xì)胞染色。洗凈后細(xì)胞被2%的多聚甲醛固定，然后用于 FACS 分析，儀器是 FACscan (Becton-Dickinson, SanJose, CA)并用 PE-goat-anti-mouse immunoglobulin(IgG)作為同型對照。為消除任何非特定吸附，使用了同樣比率的熒光物/ 蛋白質(zhì)做為同類型對照并使用了特定抗體。例6，使用細(xì)胞因子即使聯(lián)合使用細(xì)胞因子復(fù)合物(SCF:100ug/ml, TPO :50ug/ml，F(xiàn)lt3_ligand 50ug/ml)后超聲仍可達(dá)到增效作用，如圖4所示。圖中，無細(xì)胞因子復(fù)合物時(shí)，超聲刺激了溫和的細(xì)胞生長00-60%)。然而，與細(xì)胞因子復(fù)合物同時(shí)使用時(shí)，超聲可對HSPC增殖有協(xié)同增效作用。與對照組對比，圖4顯示了單用細(xì)胞因子復(fù)合物(“細(xì)胞因子+對照”)或不同強(qiáng)度超聲與細(xì)胞因子復(fù)合物聯(lián)合使用(“細(xì)胞因子+。。。”)的細(xì)胞數(shù)量，不同強(qiáng)度為us_A:40mW/ cm2，us_B :70mff/cm2,us_C :60mff/cm2, us_D :50mW/cm2。實(shí)驗(yàn)之前第 0 天，細(xì)胞數(shù)為 3xl05。單用細(xì)胞活素混合物(“細(xì)胞活素+參照”)而無超聲，細(xì)胞數(shù)為8. IxlO5因此與第0天比細(xì)胞數(shù)增加了 2. 7倍。然而，當(dāng)超聲和細(xì)胞因子復(fù)合物聯(lián)用時(shí)，就達(dá)到了細(xì)胞生長的增效作用。細(xì)胞數(shù)增加到 1. 25xl06 (us_B :70mff/cm2)和 1. 63xl06 (us_C :60mW/cm2)，是單用細(xì)胞活素多 1. 52 到 2 倍，比第0天的參照多4. 15到5. 41倍。例7，干細(xì)胞停留在未分化狀態(tài)如圖5，超聲處理過的HSPC (人體造血干/原細(xì)胞)未分化。第5天使用流式細(xì)胞儀(FACS)來檢測LIPUS擴(kuò)展的HSPC中的CD34和CD14。在所有不同強(qiáng)度下(A :40mW/cm2， B :70mff/cm2, C :60mff/cm2, D :40mff/cm2)絕大多數(shù)的干細(xì)胞保持 CDiM 陽性。例8，LIPUS擴(kuò)展的HSPC的體內(nèi)功能A)人體細(xì)胞移植分析8到10周大的30只N0D/SCID老鼠被低于致命劑量的輻照(375cGy，鈷60放射源) 并在M小時(shí)后從眼眶后植入LIPUS擴(kuò)展的人體造血干/原細(xì)胞(HSPC)或?qū)φ誋SPC QXlO5 細(xì)胞每只老鼠。對照組10只老鼠；陰性對照組(僅注射PBS緩沖液)10只老鼠；LIPUS-擴(kuò)展HSPC 10只老鼠)。N0D/Lt&_Prkdcscid(N0D/SCID)老鼠飼養(yǎng)并保持在指定的flora條件下單獨(dú)通風(fēng)(高效粒子捕獲過濾空氣)的消毒隔離籠子內(nèi)。一旦被輻照，它們服用口服抗生素(Ne0myCin2mg/ml在消毒過的酸性水中，pH 2.0)以預(yù)防感染。在移植后的5個(gè)星期，從老鼠骨髓和周圍血液中分離出人類移植細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀(FACS)對這些細(xì)胞進(jìn)行分析，特異性抗人⑶45-all0phy0Cyanin(APC)， anti-CD19 PE，anti_CD33 PE,anti-CD34 APC，and anti_CD38 PE 單克隆抗體被使用在試驗(yàn)。(mAbs;all obtained from BD PharMingen)。未注射的老鼠作為陰性對照。B)歸巢試驗(yàn)8到10周大的60只N0D/SCID老鼠被低于致命劑量的輻照(375cGy，鈷60放射源)并在M小時(shí)后經(jīng)由眼球后靜脈植入LIPUS擴(kuò)展的人體造血干/原細(xì)胞(HSPC)或?qū)φ?HSPCQXIO5細(xì)胞每只老鼠。對照組10只老鼠；陰性對照組(僅注射PBS緩沖液)10只老鼠；LIPUS-擴(kuò)展HSPC 10只老鼠)。植入2或16小時(shí)后，細(xì)胞從老鼠骨髓和脾臟被收集， 特異性抗人anti-CD34 APC, andanti-CD38PE單克隆抗體被使用于測定人類細(xì)胞，至少有 IO6Cells每樣本被FACS分析。在體內(nèi)和體外功能試驗(yàn)中，以下指標(biāo)用來評估干細(xì)胞質(zhì)量。(i)細(xì)胞存活率或細(xì)胞數(shù)干細(xì)胞的存活率用臺(tái)盼藍(lán)染色或碘化丙啶排除法來確定，細(xì)胞增殖用MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)來監(jiān)測。(ii)表型特征⑶34是最常見的標(biāo)記，在臨床或科研中用來獲得大量的人體造血干/原細(xì)胞(HSPC)。事實(shí)上，⑶34+陽性和⑶38-陰性細(xì)胞是更原始，更多(潛)能的HSPC。 為了分析LIPUS處理過的細(xì)胞的自我更新和分化能力，要用流式細(xì)胞儀(FACS)來分析與分化相關(guān)的⑶；34、⑶38和其他造血標(biāo)記如⑶14和⑶15 (髓單核細(xì)胞/單核細(xì)胞)。(iii)細(xì)胞集落形成單位試驗(yàn)(CFU)最常見的方法用來對單一或多系統(tǒng)的造血前細(xì)胞的細(xì)胞集落形成(CFCs) or集落單位形成進(jìn)行定量分析，(CFUs)。該技術(shù)用黏稠的或半固體的材料和培養(yǎng)基來促進(jìn)增殖和分化并允許單個(gè)原始細(xì)胞克隆下一代從而聚集形成成熟細(xì)胞群體。并且，從生長在半固體介質(zhì)中的原始群體重新生長的效率可用來探測和量化體外的自我更新。因此，超聲刺激擴(kuò)展的臍帶血(CB)CD34+的分化和自我更新能力可用 CFU試驗(yàn)來測量。(iv)長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的定量頻率和它們的表現(xiàn)型及功能型特征的研究原始造血原細(xì)胞，在長時(shí)間培養(yǎng)中從能夠啟動(dòng)到持續(xù)骨髓形成達(dá)數(shù)星期，被稱為長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC).在臍帶血細(xì)胞中長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞出現(xiàn)機(jī)率能用筆標(biāo)準(zhǔn)的長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞試驗(yàn)來測定。(ν)體內(nèi)干細(xì)胞功能分析除了體外功能分析來評估干細(xì)胞功能，體內(nèi)功能分析也能用來評估。HSPC的標(biāo)志是當(dāng)植入骨髓抑制的受體后它們能長期穩(wěn)定的再造整個(gè)造血系統(tǒng)。老鼠的植入分析是極好的研究干細(xì)胞生物學(xué)基本原理的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，包括免疫遺傳表型研究、歸巢能力和移植動(dòng)力學(xué)。由于免疫缺陷老鼠品種(如N0D/SCID)的異種植入模型的發(fā)展，使在在實(shí)驗(yàn)室條件下評估人類HSCs的歸巢能力和移植而成為可能。因此，LIPUS擴(kuò)展的臍帶血⑶34+陽性細(xì)胞的移植和歸巢效率能夠被N0D/SCID再生試驗(yàn)加以評估。
權(quán)利要求
1.一個(gè)增加動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基生長率的方法，包括使用頻率從約IMHz到約 IOMHz的超聲波來處理細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中超聲波是脈沖的形式。
3.權(quán)利要求2的方法，其中超聲波的頻率從約IMHz到2MHz。
4.權(quán)利要求3的方法，其中超聲波的頻率從約1.4MHz到約1. 6MHz。
5.權(quán)利要求4的方法，其中超聲波的頻率約為1.5MHz。
6.權(quán)利要求1的方法，其中超聲波的強(qiáng)度從約lmW/cm2到約5W/cm2。
7.權(quán)利要求6的方法，其中超聲波的強(qiáng)度從約lOmW/cm2到約150mW/cm2。
8.權(quán)利要求1的方法，其中動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基包含干細(xì)胞。
9.任何前述權(quán)利要求的方法，其中超聲波是周期間隔的使用。
10.權(quán)利要求10的方法，其中超聲波的使用在M小時(shí)期間為1個(gè)或多個(gè)間隔總時(shí)間不超過大約60分鐘。
11.權(quán)利要求11的方法，其中超聲波的使用在M小時(shí)期間為單一間隔大約10或大約 20分鐘。
12.與任何前述權(quán)利要求的方法聯(lián)合使用一種反饋系統(tǒng)的方法，即在目標(biāo)區(qū)測量超聲發(fā)射量，并調(diào)整發(fā)射強(qiáng)度以保證優(yōu)化的頻率和強(qiáng)度到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞。
全文摘要
一種通過使用頻率高于1MHz的超聲提高動(dòng)物細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)速率的方法。
文檔編號C12P21/00GK102171337SQ200980138634
公開日2011年8月31日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者H·古爾, J·邢, J·陳, W·T·昂 申請人:智能納米股份有限公司