專利名稱：多重?cái)U(kuò)增與檢測(cè)的制作方法
多重?cái)U(kuò)增與檢測(cè)本發(fā)明涉及多重檢測(cè)的領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及在單次反應(yīng)中，基于探針的不同熔解溫度或熔解圖譜，檢測(cè)一份樣品中一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的方法。本發(fā)明還提供了用于此類方法的探針和試劑盒。利用多種引物對(duì)，以在單次PCR反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多種目標(biāo)序列的多重PCR，是一種比使用單種引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)PCR更加高效率的PCR方法。對(duì)不同目標(biāo)核酸的同時(shí)擴(kuò)增降低了 PCR分析的成本和時(shí)間消耗，令實(shí)驗(yàn)變差和交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)最小化，并且提高了最終結(jié)果的可靠性。多重PCR已被用于DNA檢測(cè)的多個(gè)領(lǐng)域，包括微生物的鑒定、基因表達(dá)分析、突變和多態(tài)性分析、基因分型和DNA陣列分析以及RNA檢測(cè)。已發(fā)展出了用于在PCR反應(yīng)過程中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量的實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR所基于的原理是，從染料發(fā)射出的熒光直接或間接地與新合成的擴(kuò)增子的形成相關(guān)聯(lián)，或者引物與DNA模板之間的退火可以被檢測(cè)到并且在每個(gè)PCR循環(huán)中與擴(kuò)增子的量成比例。 實(shí)時(shí)PCR以閉管方式進(jìn)行，并且可以定量。目前已有數(shù)種進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的方法，例如利用 TaqMan 探針(美國(guó)專利 5，210，015 和 5，487，972，以及 Lee 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)21 :3761-6,1993)，分子信標(biāo)(美國(guó)專利5，925，517和6，103，476，以及Tyagi和 Kramer, Nat. Biotechnol.(國(guó)家生物科技)14 =303-8,1996)，自檢測(cè)擴(kuò)增子(蝎型探針) (美國(guó)專利 6，326，145，以及 Whitcombe 等人，Nat. Biotechnol.(國(guó)家生物科技)17 :804-7, 1999)，Amplisensor (Chen 等人，Appl. Environ. Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué))64 4210-6，1998)，AmplifIuor (美國(guó)專利 6，117，635，以及 Nazarenko 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25 :2516-21,1997)，替換雜交探針(Li 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)30 :E5,2002) ；DzyNA-PCR(Todd 等人，Clin. Chem.(臨床化學(xué))46 :625_30，2000)，熒光限制酶檢測(cè)(Cairns等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.(生物化學(xué)與生物物理研究通訊)318 :684-90，2004)，以及鄰近雜交探針(美國(guó)專利6，174,670以及Wittwer等人， Biotechniques (生物技術(shù))22 130-1，1；34_8，1997)。這些探針大多包含一對(duì)涉及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的染料(一種報(bào)告染料和一種受體染料)，其中所述受體染料可令所述報(bào)告染料的熒光發(fā)射淬滅?？傊?，熒光標(biāo)記的探針提高了擴(kuò)增子定量的特異性。用于PCR的另一種形式的探針，是一種具有兩條互補(bǔ)的寡核苷酸的雙鏈線性探針。該在先技術(shù)中所描述的探針具有相同的長(zhǎng)度，其中至少一種寡核苷酸以一種單鏈構(gòu)象作為針對(duì)一段目標(biāo)序列的探針。上述寡核苷酸之一的5'端被一種熒光基團(tuán)標(biāo)記，而另一種寡核苷酸的3'端被一種淬滅劑，如一種受體熒光基團(tuán)標(biāo)記，或者反之亦可。當(dāng)這兩種寡核苷酸相互退火時(shí)，上述兩種標(biāo)記互相接近，從而使熒光淬滅。而競(jìng)爭(zhēng)性地與探針結(jié)合的目標(biāo)(靶)核酸，則能隨著其濃度的升高導(dǎo)致探針的熒光發(fā)生低于正比例的升高。(Morrison L.等人，Anal. Biochem.(分析生物化學(xué))，Vol.183，pages 231-244(1989)；美國(guó)專利 5，928，862)。通過將互補(bǔ)的兩條寡核苷酸之一縮短幾個(gè)堿基，從而得到一種部分雙鏈的線性化探針，這種經(jīng)改進(jìn)的雙鏈線性探針亦為本領(lǐng)域所知。該在先技術(shù)中的這種雙鏈線性探針中， 較長(zhǎng)的寡核苷酸末端被一種熒光基團(tuán)標(biāo)記，而較短的寡核苷酸末端被一種淬滅劑標(biāo)記。所述探針以雙鏈形式存在時(shí)，由于熒光基團(tuán)和淬滅劑位置緊鄰，熒光發(fā)射較弱。而當(dāng)一種目標(biāo) (靶)核酸存在時(shí)，帶有淬滅劑的較短的寡核苷酸則被該目標(biāo)(靶)核酸所取代。結(jié)果，較長(zhǎng)的寡核苷酸(以探針-目標(biāo)核酸雜交體形式存在)的熒光發(fā)射充分變強(qiáng)(Li等人，Nucleic Acids Research (核酸研究)，Vol. 30, No. 2, e5 (2002))。US2005/0227257描述了一種略加改進(jìn)的雙鏈線性核酸探針。該專利申請(qǐng)中所描述的探針的改進(jìn)為，與前述探針相比，通過將兩種互補(bǔ)的寡核苷酸之一縮短更多的堿基，而得到一種部分雙鏈的線性化探針。熒光雜交探針還被用于其他的領(lǐng)域。例如，利用熒光雜交探針進(jìn)行多重基因分型的方法已有描述(例如US6，140，054)，該方法利用與基因組、核酸序列的一段經(jīng)PCR擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域雜交的熒光雜交探針的熔解溫度，來鑒定突變和多態(tài)性。高通量遺傳檢測(cè)的出現(xiàn)使得對(duì)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析成為必要，并且令多重PCR和實(shí)時(shí)PCR向著結(jié)合成為多重實(shí)時(shí)PCR發(fā)展。由于雙鏈DNA嵌入染料的非特異性，這些染料并不適合用于多重檢測(cè)，而熒光標(biāo)記的探針則令多重實(shí)時(shí)PCR成為可能。但是，多重實(shí)時(shí)PCR受限于熒光染料組合的可用性。目前，實(shí)時(shí)PCR中最多只能同時(shí)對(duì)四或五種熒光染料進(jìn)行檢測(cè)和定量。US2005/0053950描述了一種用于多重實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法。該方法根據(jù)擴(kuò)增子以雙鏈體或分離形式存在時(shí)，每種擴(kuò)增子不同的熔解溫度(Tm)和雙鏈DNA 染料，如STOR Green I的熒光發(fā)射變化，在單次實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中對(duì)多種PCR產(chǎn)物或擴(kuò)增子進(jìn)行定量。對(duì)于一種特異性的擴(kuò)增子，在一低于其Tm的溫度測(cè)得的熒光發(fā)射，與在一高于其Tm的溫度測(cè)得的熒光發(fā)射之間的熒光發(fā)射差異，對(duì)應(yīng)于以雙鏈體存在的該擴(kuò)增子的熒光發(fā)射值。相應(yīng)地，在單次PCR反應(yīng)中，每種擴(kuò)增子的熒光發(fā)射差異可用于對(duì)其進(jìn)行定量。但是，此類方法的多重性和敏感度相對(duì)較低。例如，長(zhǎng)度為約100至150個(gè)核苷酸之間的擴(kuò)增子，在熔解溫度方面差別微小。因此，這些技術(shù)要求使用大小差別巨大的擴(kuò)增子，以能對(duì)其加以區(qū)分。但是，對(duì)于具有更高的多重性和敏感度水平的多重實(shí)時(shí)PCR，還需要發(fā)展出其他在單次PCR反應(yīng)中對(duì)多種目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增和定量的方法。本發(fā)明的方法不同于在先技術(shù)。首先，本方法所基于的，是每種探針不同的熔解特性(Tm或熔解圖譜)，和當(dāng)探針內(nèi)部的雙鏈部分以雙鏈體或分離形式存在時(shí)，該探針上的標(biāo)記物的熒光發(fā)射變化。本發(fā)明的探針包含一個(gè)雙鏈部分，該雙鏈部分可由一種第一寡核苷酸和一種第二寡核苷酸形成；對(duì)于每種探針，所述雙鏈部分具有獨(dú)特的Tm，由此在包含相同或相似的標(biāo)記物的一組探針中，可對(duì)不同的探針加以區(qū)分。其次，所述第一寡核苷酸可包含或不包含一種或多種標(biāo)記，并且此第一寡核苷酸在擴(kuò)增反應(yīng)過程中被消耗。在兩種不同溫度檢測(cè)的熒光發(fā)射之間的差異，對(duì)應(yīng)于當(dāng)某些探針被消耗后，該探針的熒光發(fā)射值。第三， 對(duì)未消耗的探針進(jìn)行的熔解圖譜測(cè)量，提供了一份樣品中目標(biāo)(靶)核酸的存在或者其量的一種指標(biāo)。為了便于理解本發(fā)明，對(duì)一些術(shù)語定義如下。本文所用術(shù)語“核酸”是核苷酸共價(jià)連接的序列，其中一個(gè)核苷酸的戊糖的3’位置通過磷酸二酯基團(tuán)被連接至下一個(gè)戊糖的5’位置，并且其中核苷酸殘基(堿基)被以特異序列連接，即，核苷酸的線性順序。本文所用術(shù)語“多聚核苷酸”是包含長(zhǎng)度大于200核苷酸的序列的核酸。本文所用術(shù)語“寡核苷酸”是短的多聚核苷酸或多聚核苷酸的一部分。 寡核苷酸典型地包含約200到約100堿基的序列?！昂怂帷?、“DNA”以及類似術(shù)語還包括核酸類似物，即，具有磷酸二酯主鏈以外的類似物。舉例來說，本領(lǐng)域已知并且在主鏈上具有肽鍵而非磷酸二酯鍵的所謂“肽核酸”，被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所用術(shù)語“目標(biāo)(靶)序列”、“目標(biāo)(靶)核酸”、“目標(biāo)(靶)核酸序列”和 “所感興趣的核酸”可互換使用，它們是指將對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增或者檢測(cè)或者既擴(kuò)增又檢測(cè)的一段目標(biāo)(靶)區(qū)域。目標(biāo)(靶)序列作為擴(kuò)增和檢測(cè)的對(duì)象可以是任何核酸。目標(biāo)(靶) 序列可以是RNA、cDNA、基因組DNA，或者來自如一種致病的微生物或病毒的DNA或RNA。目標(biāo)(靶)序列還可以是經(jīng)化學(xué)試劑、各種酶類以及物理暴露處理過的DNA。一份樣品中令人感興趣的目標(biāo)(靶)核酸序列可以以單鏈DNA或RNA如cDNA、mRNA、其他RNA，或以分離的互補(bǔ)鏈的形式存在。可以通過物理的、化學(xué)的或酶學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)(靶)核酸互補(bǔ)鏈的分離。為了便于描述和理解，當(dāng)提及所感興趣的核酸或目標(biāo)(靶)核酸時(shí)，既指在一份待測(cè)樣品中所發(fā)現(xiàn)的這些部分，也指這些核酸的部分的擴(kuò)增拷貝，除非有相反的特別說明。本文所用術(shù)語“引物”是指一種自然產(chǎn)生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸當(dāng)被置于誘發(fā)與一條核酸鏈互補(bǔ)的一種引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(shí)，能夠作為合成的起始點(diǎn)，其中所述條件即有核苷酸和一種聚合反應(yīng)試劑如DNA聚合酶的存在，以及適當(dāng)?shù)臏囟群途彌_條件。本文中的引物是經(jīng)過選擇從而與待擴(kuò)增的各特異性序列的不同鏈充分互補(bǔ)的。也就是說引物與它們各自的對(duì)應(yīng)鏈必須充分互補(bǔ)以能與之雜交。一段非互補(bǔ)的核苷酸片段可以與引物的5’端相聯(lián)，而該引物序列的其余部分與目標(biāo)堿基序列的診斷區(qū)互補(bǔ)。除了當(dāng)非互補(bǔ)的核苷酸如上文所述存在于預(yù)先確定的引物末端時(shí)以外，引物通常是互補(bǔ)的。本文所用術(shù)語“與……互補(bǔ)”是指一個(gè)核苷酸能與另一個(gè)特定的核苷酸堿基配對(duì)。 即腺苷與尿苷或胸苷互補(bǔ)，鳥苷與胞苷互補(bǔ)。根據(jù)本說明書的目的應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，盡管在某些情況下胸苷與鳥苷可以堿基配對(duì)，亦不應(yīng)將它們視為互補(bǔ)的。根據(jù)本發(fā)明的目的，術(shù)語“充分互補(bǔ)”是指探針的一條鏈上大于或等于70 %，優(yōu)選大于80 %，更優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于95%或99%的核酸堿基，在一種匹配方式下能在探針的另一條鏈(或者所感興趣的核酸)上找到其Watson-Crick結(jié)合伴侶，使得相應(yīng)的核苷酸能夠彼此雜交。確定相同或相似的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中被編碼。優(yōu)選的決定兩條序列間相同及相似的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但不限于在GCG Pileup程序包中可找到的GCG Pileup程序，所述程序使 M Needleman 禾口 ffunsch以 gap creation penalty = 12 禾口 gap extension penalty =4為所述算法的標(biāo)準(zhǔn)缺省值(Devereux等人，核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 12 387-395 (1984))，BLASTP，BLASTN，以及 FASTA (Pearson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國(guó)科學(xué)院院刊)85 :2444-2448(1988)).所述BLASTX程序是從NCBI和其他來源可公開獲得的(BLAST手冊(cè)，Altschul等人，Natl. Cent. Biotechnol. Inf (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)，Natl. Library Med.(美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館)(NCBI NLM)，NIH(美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院)，Bethesda, MD ；Altschul 等人，J. MoI. Biol.(分子生物學(xué)雜志)215 :403-410 (1990)； Altschul 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25 :3389-3402 (1997)).術(shù)語“雙鏈體”和“雙鏈”可互換使用，它們是指一條寡-多聚核苷酸與互補(bǔ)的寡-多聚核苷酸雜交。術(shù)語“相同的”是指兩段核酸序列具有同樣的序列或互補(bǔ)的序列。
術(shù)語“同源的”意為一個(gè)單鏈核酸序列可以與互補(bǔ)的單鏈核酸序列雜交。雜交的程度可以依賴于許多因素，包括兩個(gè)序列間的相同的量以及雜交條件(例如溫度和鹽濃度)。 優(yōu)選地，相同的區(qū)域是大于約S3P，更優(yōu)選地，相同的區(qū)域是大于10bp。本文所用術(shù)語“連續(xù)監(jiān)測(cè)”以及類似術(shù)語，是指在PCR的一個(gè)循環(huán)中進(jìn)行多次監(jiān)測(cè)，優(yōu)選在溫度轉(zhuǎn)變期間，更優(yōu)選在每一溫度轉(zhuǎn)變過程中收集至少一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。本文所用術(shù)語“逐循環(huán)”監(jiān)測(cè)，是指在每一循環(huán)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行一次或多次監(jiān)測(cè)。術(shù)語“實(shí)際消耗量”(ACA)是指在一個(gè)反應(yīng)中，熒光檢測(cè)所反映的被消耗的探針的量。本文所用術(shù)語“擴(kuò)增”是指在核酸序列的混合物中令一種特定核酸序列的濃度升高的任何擴(kuò)增過程。本文所用術(shù)語“樣品”以其最廣義使用。一份被懷疑含有核酸的生物樣品可以包含但不限于基因組DNA，cDNA(在溶液中或與固相載體結(jié)合)以及類似物。本文所用術(shù)語“標(biāo)記”是指任何一種能被用于提供一種可檢測(cè)的(優(yōu)選為可以計(jì)量的)信號(hào)，并能與核酸或蛋白質(zhì)相聯(lián)的原子或分子。標(biāo)記提供的信號(hào)可以通過熒光、放射性、比色法、重量分析、磁性、酶活性以及類似途徑檢測(cè)。本文所用術(shù)語“相鄰”或“基本上相鄰”，是指兩種寡核苷酸在模板核酸與之互補(bǔ)的鏈上的位置關(guān)系。模板與寡核苷酸雜交的兩個(gè)區(qū)域可以是連續(xù)的，即在這兩個(gè)模板區(qū)域之間沒有間隔?；蛘?，模板與寡核苷酸雜交的兩個(gè)區(qū)域可以被1至約40個(gè)核苷酸間隔開，更優(yōu)選約1至10個(gè)核苷酸。術(shù)語“加熱循環(huán)”、“熱循環(huán)”是指溫度自一個(gè)完全變性溫度，至一個(gè)退火(或者雜交)溫度，再至一個(gè)延伸溫度，并回到完全變性溫度變化的重復(fù)循環(huán)。上述術(shù)語還指自一個(gè)變性溫度至一個(gè)延伸溫度的重復(fù)循環(huán)，其中退火和延伸溫度合并為同一溫度。完全變性溫度令所有的雙鏈片段解鏈成為單鏈。退火溫度令引物與一種核酸模板的分離單鏈上的互補(bǔ)序列雜交或退火。延伸溫度允許擴(kuò)增子的新生DNA鏈的合成。本文所用術(shù)語“反應(yīng)”，是指雜交反應(yīng)、延伸反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)，或者其他生物學(xué)、化
學(xué)反應(yīng)。本文所用術(shù)語“擴(kuò)增混合物”或“PCR混合物”，是指從核酸模板中檢測(cè)目標(biāo)(靶) 核酸所需的組分的混合物。所述混合物可以包含核苷酸(dNTPs)、探針、一種耐熱聚合酶、引物以及多條核酸模板。所述混合物還可以進(jìn)一步包含一種Tris緩沖液、一種單價(jià)鹽和Mg2+。 每種組分的濃度為本領(lǐng)域所熟知，并可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員作進(jìn)一步的優(yōu)化。術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”或“擴(kuò)增子”，是指在一種擴(kuò)增方法如PCR中，禾Ij用一對(duì)引物，由一種聚合酶擴(kuò)增出的DNA片段。術(shù)語“熔解圖譜”是指對(duì)一種寡(或多)核苷酸及其互補(bǔ)體進(jìn)行的、作為該寡(或多)核苷酸分子自雙鏈狀態(tài)向單鏈核酸(或者反之亦可)轉(zhuǎn)變的指征的測(cè)量結(jié)果的集合。 一種核酸自雙鏈狀態(tài)向單鏈狀態(tài)的轉(zhuǎn)變?cè)诒绢I(lǐng)域通常描述為該核酸分子的“熔解”。上述轉(zhuǎn)變也可以描述為該核酸的“變性”或“解鏈”。相應(yīng)地，本發(fā)明中的熔解圖譜也可以稱為“解鏈圖譜”、“變性圖譜”、“熔解曲線”、“解鏈曲線”、“雜交/解鏈圖譜”等。一種核酸分子的“熔解溫度”或者“Tm”通常是指一種多核苷酸與其互補(bǔ)序列解離時(shí)的溫度?？偟膩碚f，Tm可以被定義為當(dāng)雙鏈核酸分子中一半的Watson-Crick堿基對(duì)斷開或解離(即“熔解”了)，而另外一半的Watson-Crick堿基對(duì)依然保持完整的雙鏈構(gòu)象時(shí)的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中雙鏈核酸分子為寡核苷酸，在其他實(shí)施方案中雙鏈核酸以一種兩狀態(tài)方式解離，上述這些實(shí)施方案中，一種核酸的Tm還可被定義為當(dāng)一份樣品中一半的核酸分子處于單鏈構(gòu)象，而該樣品中另外一半的核酸分子處于雙鏈構(gòu)象時(shí)的溫度。因此，Tm 表明了核酸分子自雙鏈向單鏈轉(zhuǎn)變(或者反之，核酸分子自單鏈向雙鏈轉(zhuǎn)變)的中點(diǎn)。本領(lǐng)域中普遍認(rèn)為，核酸分子自雙鏈向單鏈的轉(zhuǎn)變并非在單一的溫度發(fā)生，而是在一個(gè)溫度范圍內(nèi)發(fā)生。盡管如此，Tm提供了關(guān)于一份樣品中的核酸分子以單鏈還是雙鏈構(gòu)象存在的一種方便的近似量度。如此，一份核酸樣品的熔解溫度可以通過分析該樣品的熔解圖譜而容易地獲得。術(shù)語“消耗”或“消耗量”是指在一種標(biāo)記的探針通常會(huì)保持完整的溫度下，游離的該標(biāo)記的探針的量的減少。上述標(biāo)記的探針可不包含雙鏈部分；上述標(biāo)記的探針的消耗可以導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)的變化。上述標(biāo)記的探針的消耗可以包括探針與目標(biāo)(靶)核酸的雜交或與目標(biāo)(靶)核酸雜交時(shí)該探針的降解。當(dāng)探針包含雙鏈部分時(shí)，游離的標(biāo)記的探針量的減少，可以由該探針的至少一種鏈，即該探針的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸或二者皆有， 的消失引起。上述探針的至少一種鏈的消失意味著該探針的第一寡核苷酸或該探針的第二寡核苷酸或者該探針的上述兩種寡核苷酸與目標(biāo)核酸發(fā)生雜交。上述探針的第一寡核苷酸或該探針的第二寡核苷酸或者該探針的上述兩種寡核苷酸與目標(biāo)(靶)核酸發(fā)生雜交后， 可繼之以該探針的寡核苷酸作為引物發(fā)生延伸，或者繼之以該探針的寡核苷酸發(fā)生降解。本發(fā)明描述的方法允許對(duì)大量不同的目標(biāo)(靶)核酸序列進(jìn)行基本上同時(shí)的擴(kuò)增和檢測(cè)。第一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)一份樣品進(jìn)行一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的檢測(cè)的方法，所述方法包括(a)令一份包含一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的樣品與一種反應(yīng)混合物接觸，所述混合物包含一個(gè)包括兩種或多種探針的探針組，其中至少一種具有雙鏈部分的探針可以包含一種包含一個(gè)第一區(qū)域和一個(gè)第二區(qū)域的第一寡核苷酸，其中所述第一區(qū)域與一種目標(biāo)(靶)核酸的部分充分互補(bǔ)，和至少一種第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一個(gè)與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域充分互補(bǔ)的區(qū)域，如此上述第一和第二寡核苷酸能夠形成該探針的一個(gè)雙鏈部分，其中每種探針包含能產(chǎn)生一種可變信號(hào)的一種可檢測(cè)的標(biāo)記或可檢測(cè)的多種標(biāo)記的組合，其中所述信號(hào)反映了一種目標(biāo)(靶)核酸是否存在，并且其中至少兩種探針包含相同的可檢測(cè)的標(biāo)記或者其發(fā)射光譜不可區(qū)分的不同的可檢測(cè)的標(biāo)記，并且其中每種上述探針有不同的熔解特性(熔解溫度Tm)并能在熔解圖譜分析中區(qū)分；(b)在樣品/反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)，其中所述反應(yīng)為延伸條件下的一種引物延伸反應(yīng)，其中，當(dāng)一種目標(biāo)(靶)核酸存在時(shí)，所述探針作為引物得到延伸并因此被消耗， 其中相應(yīng)探針作為可延伸的引物的第一寡核苷酸與目標(biāo)(靶)序列雜交，并因此在所述引物延伸反應(yīng)中被消耗，其中所述探針被消耗的寡核苷酸不再能參與形成該探針的雙鏈部分(雙鏈體)；以及(c)作為溫度的一個(gè)函數(shù)，通過檢測(cè)來自未被消耗的探針上的標(biāo)記的信號(hào)，測(cè)量所述反應(yīng)混合物中所述未被消耗的探針的熔解圖譜至少一次，其中所述熔解圖譜提供了至少一種目標(biāo)(靶)核酸是否在所述樣品中存在的指征。在該實(shí)施方案中，探針的第一寡核苷酸作為引物起作用。在一個(gè)引物延伸反應(yīng)中， 將探針的混合物加入至包含用于在延伸條件下進(jìn)行延伸的所有成分的反應(yīng)混合物中。如果一種特定的目標(biāo)(靶)核酸存在于上述反應(yīng)中，則相應(yīng)探針的所述寡核苷酸與目標(biāo)(靶) 序列雜交，然后得到延伸并摻入至引物延伸產(chǎn)物中，并因此被消耗。所述被消耗的寡核苷酸不再能參與形成該探針的雙鏈部分。在熔解圖譜分析中，被消耗的探針表現(xiàn)為一個(gè)峰的降低或消失。另一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)一份樣品進(jìn)行一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的檢測(cè)的方法，所述方法包括(a)令一份包含一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的樣品與一種雜交反應(yīng)混合物接觸，所述雜交反應(yīng)混合物包含一個(gè)包括兩種或多種探針的探針組，其中至少一種探針包含一種包含一個(gè)與一種目標(biāo)(靶)核酸的部分充分互補(bǔ)的第一區(qū)域和一個(gè)第二區(qū)域的第一寡核苷酸，和至少一種第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一個(gè)與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域充分互補(bǔ)的區(qū)域，如此上述第一和第二寡核苷酸能夠形成一個(gè)雙鏈部分，其中所述至少一種探針包含能產(chǎn)生一種可變信號(hào)的一種可檢測(cè)的標(biāo)記或可檢測(cè)的多種標(biāo)記的組合，其中所述信號(hào)反映了該探針的第一和第二寡核苷酸組成的一個(gè)雙鏈部分是否存在，并且其中至少兩種所述探針包含相同的可檢測(cè)的標(biāo)記或者其發(fā)射光譜不可區(qū)分的不同的可檢測(cè)的標(biāo)記，并且其中每種上述探針的第一和第二寡核苷酸所組成的雙鏈部分有不同的熔解特性并能在熔解圖譜分析中區(qū)分；(b)于雜交條件下在樣品/反應(yīng)混合物中進(jìn)行雜交反應(yīng)，其中，當(dāng)一種目標(biāo)(靶) 核酸存在時(shí)，與該目標(biāo)(靶)核酸的部分充分互補(bǔ)的探針的第一寡核苷酸，與該目標(biāo)序列發(fā)生雜交并因此在上述反應(yīng)過程中被消耗，其中探針的所述被消耗的寡核苷酸不再能參與形成該探針的雙鏈部分(雙鏈體)；以及(c)作為溫度的一個(gè)函數(shù)，通過檢測(cè)來自未被消耗的探針上的標(biāo)記的信號(hào)，測(cè)量所述反應(yīng)混合物中所述未被消耗的探針的熔解圖譜至少一次，其中所述熔解圖譜提供了至少一種目標(biāo)(靶)核酸是否在所述樣品中存在的指征。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針或探針的第一寡核苷酸可作為雜交探針起作用。在一個(gè)雜交反應(yīng)中，將探針的混合物加入至包含用于雜交條件下的所有成分的反應(yīng)混合物中。如果一種特定的目標(biāo)(靶)核酸存在于上述反應(yīng)中，則相應(yīng)探針的所述寡核苷酸與該目標(biāo)序列雜交，并因此被消耗。所述被消耗的寡核苷酸不再能參與形成該探針的雙鏈部分。在熔解圖譜分析中，被消耗的探針表現(xiàn)為一個(gè)峰的降低或消失。另一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)一份樣品進(jìn)行一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的檢測(cè)的方法，所述方法包括(a)令一份包含一種或多種目標(biāo)(靶)核酸的樣品與一種擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述混合物包含(i) 一對(duì)或多對(duì)正向/反向寡核苷酸引物，其中當(dāng)所述樣品中存在一種或多種目標(biāo)(靶)核酸時(shí)，所述引物對(duì)能擴(kuò)增所述目標(biāo)(靶)核酸，(ii) 一個(gè)包括兩種或多種探針的探針組，其中至少一種探針包含一種包含一個(gè)與一種目標(biāo)(靶)核酸的部分充分互補(bǔ)的第一區(qū)域和一個(gè)第二區(qū)域的第一寡核苷酸，和至少一種第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一個(gè)與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域充分互補(bǔ)的區(qū)域，如此上述第一和第二寡核苷酸能夠形成一個(gè)雙鏈部分，其中所述至少一種探針包含能產(chǎn)生一種可變信號(hào)的一種可檢測(cè)的標(biāo)記或可檢測(cè)的多種標(biāo)記的組合，其中所述信號(hào)反映了該探針的第一和第二寡核苷酸組成的一個(gè)雙鏈部分是否存在，并且其中至少兩種所述探針包含相同的可檢測(cè)的標(biāo)記或者其發(fā)射光譜不可區(qū)分的不同的可檢測(cè)的標(biāo)記，并且其中每種上述探針的第一和第二寡核苷酸所組成的雙鏈部分有不同的熔解特性并能在熔解圖譜分析中區(qū)分；(b)在在樣品/擴(kuò)增反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)其中，當(dāng)一種目標(biāo)(靶)核酸存在時(shí)，與該目標(biāo)(靶)核酸的部分充分互補(bǔ)的所述第一寡核苷酸，與該目標(biāo)(靶)序列發(fā)生雜交并因此在上述擴(kuò)增反應(yīng)過程中被消耗；(c)作為溫度的一個(gè)函數(shù)，通過檢測(cè)來自未被消耗的探針上的標(biāo)記的信號(hào)，測(cè)量所述未被消耗的探針的熔解圖譜至少一次，其中所述熔解圖譜提供了至少一種目標(biāo)核酸是否在所述樣品/擴(kuò)增反應(yīng)混合物中得到擴(kuò)增的一個(gè)指征。其中所述至少兩種探針中的一種第一探針具有一個(gè)基于其雙鏈部分的熔解溫度 TmI，其中所述至少兩種探針中的一種第二探針具有一個(gè)基于其雙鏈部分的熔解溫度 Tm2,其中TmI > Tm2，其中相同的標(biāo)記分別與所述第一和第二探針相聯(lián)，其中，任何在TmI和/或Tm2的熔解峰的降低提供了所述第一和/或第二探針的消耗的指征。優(yōu)選地，上述該方法包括步驟(d)(i)比較步驟(C)中獲得的至少兩種熔解圖譜和 / 或(ii)將步驟(c)中獲得的一種熔解圖譜與
一種事先獲得的相同探針的熔解圖譜，或者相同探針的一種在平行對(duì)照反應(yīng)中同時(shí)獲得的熔解圖譜，或者相同探針的一種理論上的熔解圖譜進(jìn)彳亍比較其中所述熔解圖譜的變化提供了至少一種目標(biāo)核酸是否在所述樣品/擴(kuò)增反應(yīng)混合物中得到擴(kuò)增的一個(gè)指征。所述擴(kuò)增反應(yīng)可以為任意一種擴(kuò)增方法，例如PCR，SDA, NASBA, LAMP，3SR，ICAN， TMA,解旋酶依賴的等溫DNA擴(kuò)增以及類似方法。PCR為一種優(yōu)選的擴(kuò)增方法。所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物應(yīng)包含標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增試劑。擴(kuò)增試劑可以方便地分為四類組分(i) 一種水性緩沖液，通常包括但不限于一種鎂鹽，(ii)擴(kuò)增底物，例如DNA或RNA， (iii) 一種或多種寡核苷酸引物(通常針對(duì)每種目標(biāo)序列有兩種引物，當(dāng)采用PCR時(shí)，所述序列限定了雙鏈目標(biāo)序列的兩條互補(bǔ)鏈的5'端)，以及(iv) —種擴(kuò)增酶如一種多核苷酸聚合酶(例如，用于PCR的Taq聚合酶或用于TMA的RNA聚合酶)，或者一種連接酶。此外， 通常還需要適當(dāng)?shù)暮塑杖姿?。更多的試劑或添加劑的加入可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員酌情而定，并且這些試劑的選擇屬于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技能范圍。當(dāng)然，當(dāng)上述擴(kuò)增試劑用于同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增時(shí)，上述擴(kuò)增試劑中還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑。根據(jù)所采用的擴(kuò)增反應(yīng)方法，對(duì)擴(kuò)增試劑進(jìn)行選擇，屬于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技能范圍。在本文所描述的方法中，所提供的樣品為被懷疑包含目標(biāo)核酸或所感興趣的核苷酸變異的樣品。樣品中包含的目標(biāo)核酸可以是雙鏈的基因組DNA或者在必要時(shí)是cDNA，然后利用任何為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的適當(dāng)?shù)淖冃苑椒?，包括物理的、化學(xué)的或酶學(xué)的方法，使上述基因組DNA或cDNA變性。一種用于鏈分離的優(yōu)選的物理方法包括加熱核酸至其完全(> 99% )變性。典型的熱變性條件包括從約80°C至約105°C范圍的溫度，和從數(shù)秒至數(shù)分鐘范圍的時(shí)間。作為變性之外的另一選擇，目標(biāo)核酸可以以一種單鏈形態(tài)，例如單鏈的RNA或DNA病毒，存在于樣品中。然后將變性的核酸鏈與寡核苷酸引物和探針在雜交條件下共同孵育，所述雜交條件即令所述引物或探針能與核酸單鏈結(jié)合的條件。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，退火的引物和/或探針被一種聚合劑延伸。在適當(dāng)量的四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)或其如前所述的類似物的存在下，寡核苷酸引物依賴于模板的延伸反應(yīng)，在包含適當(dāng)?shù)柠}、金屬陽(yáng)離子和PH緩沖體系的反應(yīng)介質(zhì)中，被一種聚合劑所催化。合適的聚合劑為已知可催化依賴于引物和模板的DNA合成的酶類。利用所述DNA聚合酶類催化DNA合成的反應(yīng)條件為本領(lǐng)域所熟知。探針在擴(kuò)增過程中被消耗。一種擴(kuò)增引物可以是一種目標(biāo)特異性的引物，其包含一個(gè)與目標(biāo)核酸的一個(gè)目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的3’啟始部分。擴(kuò)增引物也可以是通用引物，所述通用引物具有與靶特異引物的 5’通用部分相同或基本上相同的序列。反應(yīng)可以包括針對(duì)多個(gè)靶序列的擴(kuò)增的多個(gè)引物。 所述多個(gè)引物的所述5’通用部分可以具有實(shí)質(zhì)相同的序列組成，所述實(shí)質(zhì)相同的序列組成是與所述通用擴(kuò)增引物的所述3’啟始部分等同或基本上等同。優(yōu)選地，所述引物是DNA引物，特別是適合于PCR擴(kuò)增的那些。用于SNP基因分型或者檢測(cè)變異核苷酸時(shí)，擴(kuò)增引物可以是一種等位基因特異性的引物，其中所述引物的一個(gè)末端核苷酸為經(jīng)過選擇，從而與所懷疑的變異核苷酸或相應(yīng)的正常核苷酸之一互補(bǔ)的，由此當(dāng)所述引物與包含一個(gè)特定核苷酸的診斷區(qū)域退火時(shí)，所述引物的延伸產(chǎn)物得到合成，而當(dāng)所述引物與不包含目標(biāo)核酸序列的該特定核苷酸的診斷區(qū)域退火時(shí)，所述延伸產(chǎn)物不被合成。擴(kuò)增反應(yīng)混合物中包括由正向和反向引物組成的引物對(duì)，如此若樣品中存在一種目標(biāo)核酸，所述引物對(duì)將能擴(kuò)增該目標(biāo)核酸，擴(kuò)增優(yōu)選以一種指數(shù)方式進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物中會(huì)含有1至50、1至25、1至20或1至10種引物對(duì)。在另一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物中會(huì)含有5至50、5至25、5至20或5至10種引物對(duì)。如上所述，一種特定的引物對(duì)中的正向或反向引物可以是一種在多于一種引物對(duì)中共用的通用引物。擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含由兩種或多種探針組成的一個(gè)探針組。所述探針包含一種包含一個(gè)第一區(qū)域和一個(gè)第二區(qū)域的第一寡核苷酸，其中所述第一區(qū)域與一種目標(biāo)核酸的部分充分互補(bǔ)，和—種第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一個(gè)與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域充分互補(bǔ)的區(qū)域，如此上述第一和第二寡核苷酸能夠形成該探針的一個(gè)雙鏈部分。所述第一寡核苷酸須能在適當(dāng)?shù)碾s交條件下與至少一種所述目標(biāo)核酸的部分相結(jié)合。優(yōu)選地，每種第一寡核苷酸對(duì)僅一種目標(biāo)核酸的部分具有特異性。所述第一寡核苷酸應(yīng)具有一個(gè)第一區(qū)域，該第一區(qū)域的核苷酸序列與一種目標(biāo)核酸的部分的核苷酸序列互補(bǔ)或充分互補(bǔ)。此第一互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度優(yōu)選為6至100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為15至30個(gè)核苷酸。所述第一寡核苷酸的總長(zhǎng)度優(yōu)選為15至150個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為17至100個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為20至80個(gè)核苷酸。在一些反應(yīng)包括引物延伸或擴(kuò)增的實(shí)施方案中，與所述第一寡核苷酸互補(bǔ)的目標(biāo)核酸的部分須屬于將被正向和反向引物擴(kuò)增的序列或與該序列重疊?；蛘?，所述第一寡核苷酸可以是所述擴(kuò)增引物之一，例如是正向或者反向引物。在一些實(shí)施方案中，所述第一和 /或第二寡核苷酸不是一種正向或者反向引物。所述第二寡核苷酸包含一個(gè)與所述第一寡核苷酸的一個(gè)第二區(qū)域充分互補(bǔ)的區(qū)域。此第二區(qū)域的長(zhǎng)度優(yōu)選為4至100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為15至30個(gè)核苷酸。所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域可與所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域重疊或不重疊。所述第二寡核苷酸的總長(zhǎng)度優(yōu)選為6至150個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為10至100個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為12至80個(gè)核苷酸。所述第一和第二寡核苷酸可以在5'或3'端包含1至5個(gè)或1至10個(gè)或更多的分別與目標(biāo)核酸或所述第一寡核苷酸不互補(bǔ)的核苷酸。寡核苷酸探針可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸類似物和/或非核苷酸的化學(xué)部分?？赡艽龠M(jìn)探針結(jié)合的對(duì)所述探針的改進(jìn)包括但不限于向所述探針中摻入帶正電荷的或中性的磷酸二酯鍵，以減弱探針和目標(biāo)核酸的多聚陰離子主鏈之間的斥力(參見 Letsinger等人，1988，J. Amer. Chem. Soc.(美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志)110 :4470)；向所述探針中摻入烷基化或鹵化的基團(tuán)如5-溴尿苷，以促進(jìn)堿基堆積；向所述探針中摻入核糖核苷酸， 以促使探針目標(biāo)核酸雙鏈體形成具有增強(qiáng)的堿基堆積的“A”型結(jié)構(gòu)；用2，6_ 二氨基嘌呤(氨基腺苷)替換所述探針中部分或全部的腺苷；以及摻入核苷酸衍生物如LNA (鎖核酸)， PNA (肽核酸)或類似物。通常所述探針的3’末端為“封閉的”，以阻止探針摻入到引物延伸產(chǎn)物中。不過在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，一些探針同時(shí)還作為引物起作用，因此所述探針的3'末端為未封閉的?！胺忾]”可以通過使用非互補(bǔ)的堿基或通過將一個(gè)化學(xué)部分，如生物素或磷酸基團(tuán)，添加到最后一個(gè)核苷酸的羥基上來實(shí)現(xiàn)。依賴于所選擇的部分，所述化學(xué)部分還可以作為一種用于后續(xù)檢測(cè)或者捕獲與之相聯(lián)的核酸的標(biāo)記，而起到雙重作用。封閉還可以通過去除3’ -羥基或使用缺少3’ -羥基的核苷酸如雙脫氧核苷酸而實(shí)現(xiàn)。不難理解，術(shù)語“探針”是指該種探針的復(fù)數(shù)，即反應(yīng)混合物中并不僅僅包含該探針的一個(gè)分子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域不重疊或者不充分重疊。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域充分重疊，或者所述第二區(qū)域包含于所述第一區(qū)域中。在這些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交形成的雙鏈體的Tm，優(yōu)選高于所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雜交形成的雙鏈體的Tm，如此若一種目標(biāo)核酸存在，所述第一寡核苷酸與該目標(biāo)核酸形成更牢固的雜交體，從而與所述第一 /第二寡核苷酸雙鏈體相比在更高的溫度熔解。優(yōu)選地，所述第一寡核苷酸與目標(biāo)核酸形成的雙鏈體的Tm比所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸形成的雙鏈體的Tm高至少2度或至少5度。在另一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸可以包含一個(gè)與用于擴(kuò)增的一種引物的序列相同或充分相同的第三區(qū)域。本發(fā)明的至少一種探針能夠形成一個(gè)雙鏈部分。由于這種雙鏈部分，該探針具有一個(gè)熔解溫度Tm和一種特征性的熔解圖譜。特別地，本發(fā)明的多種探針的一種混合物也具有一種特征性的熔解圖譜。熔解溫度(Tm)受若干因素的影響，包括但不限于鹽濃度、DNA濃度、變性劑的存在、 核酸序列、GC含量以及長(zhǎng)度。典型地，每種雙鏈核酸探針具有一個(gè)獨(dú)特的Tm。在低于一個(gè)給定Tm的溫度下，至少50%的核酸雙鏈體保持以雙鏈體形式存在。相反，在高于一個(gè)給定 Tffl的的溫度下，預(yù)計(jì)超過50%的核酸雙鏈體會(huì)解鏈為兩條寡核苷酸單鏈。任意一種給定的DNA片段的Tm可以通過為本領(lǐng)域所熟知的方法加以確定。例如， 本領(lǐng)域中測(cè)定一段DNA片段Tm的一種方法是，利用一臺(tái)紫外分光光度計(jì)中的一個(gè)恒溫小室，并測(cè)定伴隨溫度緩慢升高時(shí)268nm的吸光度。以吸光度對(duì)溫度作圖，得到一條有兩個(gè)平穩(wěn)段的S形曲線。(例如，參見

圖1)。吸光度在這兩個(gè)平穩(wěn)段之間的中間點(diǎn)對(duì)應(yīng)于該片段的Tm?；蛘?，以吸光度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)對(duì)溫度作圖，得到一條正態(tài)分布曲線。該正態(tài)曲線的峰對(duì)應(yīng)于該片段的Tm。還可以通過最近鄰法測(cè)定一種探針的Tm或者多種探針的一種混合物的多個(gè)Tm，并且在單次反應(yīng)中的探針上存在一種雙鏈DNA染料或標(biāo)記時(shí)，還可以對(duì)一種探針的Tm或者多種探針的一種混合物的多個(gè)Tm進(jìn)行細(xì)致的或者說精確的測(cè)量。例如，以每秒0. OrC至3°C 的速率，將一種包含一種探針和適當(dāng)?shù)木彌_液的反應(yīng)混合物從一個(gè)雜交溫度加熱至完全變性溫度。同時(shí)，以一種被上述染料(標(biāo)記)吸收的波長(zhǎng)的光照射上述混合物，并檢測(cè)和記錄上述染料(探針)的熒光發(fā)射，作為熒光發(fā)射讀數(shù)。以上述熒光發(fā)射讀數(shù)相對(duì)于溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)對(duì)溫度作圖，得到若干正態(tài)曲線，所述曲線的每個(gè)峰對(duì)應(yīng)于該探針的實(shí)際Tm。所述曲線也被稱為“熔解圖譜”或“雜交/解鏈圖譜”。一種探針的Tm或熔解圖譜還可以通過一種基于本領(lǐng)域所熟知的理論的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行估計(jì)。對(duì)于一次多重檢測(cè)，在一個(gè)反應(yīng)中包括了由針對(duì)多種目標(biāo)序列的多種探針構(gòu)成的探針組。在一個(gè)實(shí)施方案中，一組探針中的不同探針可以包含相同的標(biāo)記或者其發(fā)射光譜不可區(qū)分的標(biāo)記。這樣的一個(gè)探針組中的每種探針應(yīng)具有不同的Tm，從而令各自的熔解圖譜能夠相互區(qū)分。不僅個(gè)別的探針具有一種熔解圖譜，上述探針組中的多種探針的混合物也具有該探針組特征性的熔解圖譜。所述反應(yīng)混合物可以包含一種沒有特征性熔解溫度的單鏈探針。根據(jù)本發(fā)明，通過設(shè)計(jì)由與不同的目標(biāo)序列雜交的探針和基于其內(nèi)部的雙鏈部分而具有不同熔解溫度的探針組成的探針組，可以在單個(gè)管中對(duì)多種目標(biāo)核酸序列進(jìn)行分析。如果一種目標(biāo)序列存在，則其相應(yīng)的探針被消耗。然后根據(jù)反應(yīng)前后所述探針組的熔解圖譜之間的比較，可以確定該目標(biāo)的序列。有利地，一個(gè)探針組中的不同探針可以與同樣的標(biāo)記相聯(lián)，從而允許在單個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針組中的每種探針與同樣的標(biāo)記，例如一個(gè)熒光能量轉(zhuǎn)移對(duì)或接觸淬滅對(duì)，更特別地，一種為熒光基團(tuán)的第一標(biāo)記和一種為淬滅劑的第二標(biāo)記相聯(lián)。另一方面，多個(gè)探針組可以與不同的標(biāo)記對(duì)相聯(lián)，從而各個(gè)探針組可基于不同發(fā)射光譜而相互區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明，分析多種目標(biāo)核酸的方法既可以利用與具有可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同標(biāo)記相聯(lián)的多種探針的混合物，也可以利用與具有相同的或重疊的發(fā)射光譜的標(biāo)記相聯(lián)，但可基于其內(nèi)部的雙鏈部分在熔解溫度上的不同而加以區(qū)分的多種探針的混合物。當(dāng)利用具有雙鏈部分的探針時(shí)，所述探針可以包含兩條鏈一條第一寡核苷酸和一條第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含一個(gè)與一種目標(biāo)核酸充分互補(bǔ)的第一區(qū)域 (參見圖4)。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針包含一條第一寡核苷酸和至少一條第二寡核苷酸(參見圖4A至J)。所述第一寡核苷酸包含一個(gè)與一種目標(biāo)核酸充分互補(bǔ)的第一區(qū)域和一個(gè)第二區(qū)域，其中所述第二區(qū)域與一條或多條第二寡核苷酸充分互補(bǔ)，從而所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸能結(jié)合形成一個(gè)雙鏈部分。所述第一區(qū)域和第二區(qū)域可以以任意順序排列，例如5'至3'或3'至5'(參見圖4A)，或者一個(gè)區(qū)域包含在另一個(gè)區(qū)域內(nèi)(參見圖 4B)。優(yōu)選地，若所述第一寡核苷酸作為一種引物，所述第一區(qū)域和第二區(qū)域以3'至5'的順序排列(參見圖4A)。在一方面，所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域不重疊或者不充分重疊(參見圖4A)。換句話說，所述第一區(qū)域與一段目標(biāo)序列互補(bǔ)，而所述第二區(qū)域與該目標(biāo)序列不互補(bǔ)。當(dāng)所述第二區(qū)域與所述目標(biāo)序列不互補(bǔ)時(shí)，不同的探針可以具有相同或充分相同的第二區(qū)域序列，并且該探針組的不同探針之間可以具有相同的第二寡核苷酸。當(dāng)所述探針組有相同的第二寡核苷酸時(shí)，該探針組中的不同探針的第一寡核苷酸的第二區(qū)域可以在長(zhǎng)度和/或核苷酸序列方面有差異，從而各種探針有不同的Tm和熔解圖譜。另一方面，所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域充分重疊，或者所述第二區(qū)域包含于所述第一區(qū)域內(nèi)(參見圖4B)，其中所述第一寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交形成的雙鏈體的Tm高于所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雜交形成的雙鏈體的Tm，如此若一種目標(biāo)核酸存在，該目標(biāo)核酸與所述探針的第一寡核苷酸形成更牢固的雜交體，從而該目標(biāo)核酸/第一寡核苷酸雙鏈體與第二寡核苷酸/第一寡核苷酸雙鏈體相比在更高的溫度熔解。在該方面，所述第一區(qū)域可以比所述第二區(qū)域更長(zhǎng)，或者所述第二區(qū)域可以在與所述第二寡核苷酸雜交時(shí)包含錯(cuò)配的核苷酸。所述第一寡核苷酸與目標(biāo)核酸的結(jié)合阻止了所述探針的第二寡核苷酸與第一寡核苷酸結(jié)合。優(yōu)選地，所述第一寡核苷酸與所述目標(biāo)序列的雜交體的Tm比所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸的雜交體的Tm高至少2度。更優(yōu)選地，所述第一寡核苷酸與所述目標(biāo)序列的雜交體的Tm比所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸的雜交體的Tm高至少5度。又一方面，第一寡核苷酸包含一個(gè)與一段引物序列相同或充分相同的第三區(qū)域 (參見圖4C和E)。所述第三區(qū)域可與目標(biāo)序列互補(bǔ)或不互補(bǔ)。一組探針中的多種探針可以包含相同的第三區(qū)域序列。與所述第三區(qū)域序列相同的所述引物可以作為一種通用擴(kuò)增引物。當(dāng)目標(biāo)核酸特異性的探針(作為引物)經(jīng)過若干個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增變得不足時(shí)，上述通用引物可以作為接替的引物在后續(xù)循環(huán)中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述第一和第二寡核苷酸通過一種連接部分相連。 這種連接部分可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸類似物或者一種非核苷酸的化學(xué)鍵， 換言之，所述第一和第二寡核苷酸可以是相連的寡核苷酸中的一段(圖4K)。在該實(shí)施方案中，所述探針可以理解為僅包含一段第一寡核苷酸(參見圖4K)，此第一寡核苷酸包含能形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的自我互補(bǔ)區(qū)域，其中所述自我互補(bǔ)區(qū)域彼此充分互補(bǔ)，形成了該探針的雙鏈部分。其中的莖部分可以位于寡核苷酸的任意部分并且長(zhǎng)度為4至20個(gè)核苷酸。所述寡核苷酸的3'部分優(yōu)選與目標(biāo)序列互補(bǔ)。它可以具有一個(gè)平末端，或者3'突出或5'突出末端。平末端或3'突出末端為優(yōu)選的形式。上述含雙鏈部分的探針的第一寡核苷酸能在擴(kuò)增過程中被消耗?；蛘撸鲜龊p鏈部分的探針的第一和第二寡核苷酸都能在擴(kuò)增過程中被消耗。優(yōu)選地，將所述第一寡核苷酸設(shè)計(jì)為會(huì)在一次反應(yīng)中被消耗，而所述第二寡核苷酸可保持不變。所述探針可以被延伸，從而可作為一種引物起作用?；蛘撸龅谝还押塑账岬?’ 端被封閉并且第二寡核苷酸的3’被封閉，從而不可被延伸。每種探針包含一個(gè)能產(chǎn)生一種可變信號(hào)的可檢測(cè)的標(biāo)記，其中所述信號(hào)反映了該探針的雙鏈部分是否存在。此外，至少兩種所述探針包含相同的可檢測(cè)的標(biāo)記或者其發(fā)射光譜不可區(qū)分的不同的可檢測(cè)的標(biāo)記。所述探針上的標(biāo)記可以是一種熒光基團(tuán)，或者所述探針可以包含一對(duì)相互作用的標(biāo)記，例如熒光基團(tuán)和/或非熒光的染料。此類相互作用的標(biāo)記的一個(gè)例子是一對(duì)熒光基團(tuán)-淬滅劑對(duì)。所述探針上的標(biāo)記可以位于任何位置，只要其能與其他標(biāo)記或者其他實(shí)體如G核苷酸相互作用。在一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸包含一個(gè)第一標(biāo)記并且所述第二寡核苷酸包含第二標(biāo)記。優(yōu)選地，所述第一標(biāo)記是一種熒光基團(tuán)而所述第二標(biāo)記是一種淬滅劑，或者反之亦可。
在另一些實(shí)施方案中，所述探針包含兩種標(biāo)記，此兩種標(biāo)記為一個(gè)FRET對(duì)。優(yōu)選地，一種標(biāo)記在第一寡核苷酸上而第二種標(biāo)記在第二寡核苷酸上。此外，所述第一和第二寡核苷酸都可以包含多個(gè)標(biāo)記實(shí)體。例如，所述第一和第二寡核苷酸都可以既包含一個(gè)熒光基團(tuán)又包含一個(gè)淬滅劑。典型地，所述熒光基因和所述淬滅劑與所述寡核苷酸相聯(lián)，并且聯(lián)接方式滿足當(dāng)所述第一寡核苷酸與一段未標(biāo)記的模板序列(例如一條目標(biāo)核酸)結(jié)合時(shí)，該熒光基團(tuán)與該淬滅劑分離?；蛘?，所述熒光基因與所述淬滅劑與所述寡核苷酸相聯(lián)，并且聯(lián)接方式滿足當(dāng)所述第一寡核苷酸與一段未標(biāo)記的模板序列(例如一條目標(biāo)核酸)結(jié)合時(shí)，該熒光基團(tuán)與該淬滅劑被拉至緊鄰位置，從而該熒光基團(tuán)被淬滅。本文所用術(shù)語“熒光基團(tuán)”是指在一定范圍的激發(fā)波長(zhǎng)下吸收光能，并以一個(gè)不同范圍的波長(zhǎng)發(fā)射光能的基團(tuán)。熒光標(biāo)記的例子包括但不限于Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 660 和 Alexa Fluor 680)，AMCA，AMCA-S，BODIPY 染料 (BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550， BODIPY 558/568， BODIPY 564/570，BODIPY 576/589，BODIPY 581/591，BODIPY 630/650，BODIPY 650/665), 羧基羅丹明 6G，羧基-X-羅丹明(ROX)，Cascade 藍(lán)(Cascade Blue)，Cascade 黃 (Cascade Yellow)，花青染料(Cy3，Cy5，Cy3. 5，Cy5. 5)，磺酰，Dapoxyl，二烷基氨基香豆素 (Dialkylaminocoumarin),4‘ ,5' -二氯-2' ,7' - 二甲氧基-熒光素，DM-NERF，伊紅， 赤蘚紅，熒光素，F(xiàn)AM，羥基香豆素，IRDye (IRD 40，IRD 700，IRD 800)，J0E，麗絲胺羅丹明 B，Marina Blue，甲氧基香豆素，萘熒光素(Naphthofluorescein)，俄勒岡綠488，俄勒岡綠 500，俄勒岡綠514，太平洋藍(lán)(Pacific Blue), PyMPO，芘，羅丹明6G，羅丹明綠，羅丹明紅， 對(duì)甲氨基酚綠(Rhodol Green) 2' ,4' ,5' ,7'-四溴砜-熒光素 O' ,4' ,5' ,7' -Tet ra-bromosulfone-fluorescein)，四甲基羅丹明(TMR)，羧基四甲基羅丹明(TAMRA)，德克薩斯紅和德克薩斯紅-χ。本文所用術(shù)語“淬滅劑”包括任何當(dāng)與一種激發(fā)態(tài)的熒光標(biāo)記緊鄰時(shí)，能夠吸收該熒光標(biāo)記的能量，并能令此能量散逸的基團(tuán)。淬滅劑可以是一種熒光的淬滅劑或一種非熒光的淬滅劑，后者也被稱為暗淬滅劑。以上所列的熒光基團(tuán)當(dāng)被拉攏至另一熒光基團(tuán)相鄰位置時(shí)能起到淬滅劑的作用，其中所發(fā)生的淬滅可以是FRET淬滅或者接觸淬滅。優(yōu)選使用不發(fā)射任何可見光的暗淬滅劑。暗淬滅劑的例子包括但不限于DABCYL(4-G' -二甲基對(duì)胺基偶氮苯)苯甲酸)琥珀酰亞胺酯，二芳基羅丹明羧酸(diarylrhodamine carboxylic acid)，琥珀酰亞胺酯(QSY-7)，4'，5' _ 二硝基熒光素羧酸，琥珀酰亞胺酯OlSY-33)， quencherl，“黑洞淬滅劑”(BHQ-1，BHQ_2和BHQ-3)，核苷酸類似物，鳥苷酸殘基，納米粒子， 以及金顆粒。上述相互作用的標(biāo)記對(duì)可以形成FRET關(guān)系或者接觸淬滅關(guān)系。優(yōu)選地，為了有效的接觸淬滅，熒光標(biāo)記和淬滅劑之間的距離是O到10個(gè)核苷酸；更優(yōu)選地，熒光標(biāo)記和淬滅劑之間的距離是O到5個(gè)核苷酸；更優(yōu)選地，熒光標(biāo)記和淬滅劑之間的距離是O到2個(gè)核苷酸.淬滅劑優(yōu)選為非熒光體。淬滅劑可以是一種納米粒子。所述納米粒子可以是一種金納米粒子。上述淬滅劑還可能是鳥苷酸殘基或多聚鳥苷酸殘基。每種探針上的標(biāo)記或多個(gè)標(biāo)記的組合能夠產(chǎn)生一種每種探針特征性的可檢測(cè)的信號(hào)，此信號(hào)可表示第一和第二寡聚核苷酸的雙鏈區(qū)存在還是不存在。標(biāo)記的功能是顯示探針的第一寡聚核苷酸是與第二寡聚核苷酸結(jié)合還是與靶核苷酸結(jié)合，更能顯示是否第二寡聚核苷酸結(jié)合。至少一種標(biāo)記與所述探針或其第一寡核苷酸，或者與該探針的第二寡核苷酸相聯(lián)。當(dāng)所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸結(jié)合時(shí)，該標(biāo)記令熒光發(fā)射增強(qiáng)或者減弱。優(yōu)選地，所述探針包含一種第一標(biāo)記和一種第二標(biāo)記，其中至少一種標(biāo)記能夠產(chǎn)生一種可檢測(cè)的信號(hào)，并且其中所述信號(hào)的強(qiáng)度受這兩種標(biāo)記的接近程度的影響。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記與所述雙鏈部分的一條鏈相聯(lián)，并且所述第二標(biāo)記與所述探針的該雙鏈部分的另一條鏈相聯(lián)，如此當(dāng)該探針的內(nèi)部雙鏈體形成時(shí)，所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記位置緊鄰。在另一些實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記與所述第一寡核苷酸相聯(lián)，并且所述第二標(biāo)記與所述第二寡核苷酸相聯(lián)，如此當(dāng)所述探針的內(nèi)部雙鏈部分形成時(shí)，所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記位置緊鄰。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸不包含標(biāo)記。在另一些實(shí)施方案中，所述第二寡核苷酸包含一種單一標(biāo)記，當(dāng)所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)，該標(biāo)記能改變其熒光發(fā)射。在一些實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記與所述第一寡核苷酸相聯(lián)，并且所述第二標(biāo)記與所述第二寡核苷酸相聯(lián)，如此當(dāng)所述探針的內(nèi)部雙鏈體形成時(shí)，所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記位置緊鄰。優(yōu)選地，所述第一標(biāo)記與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域相聯(lián)，并且所述第二標(biāo)記與所述第二寡核苷酸上與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域相聯(lián)，如此當(dāng)所述探針的內(nèi)部雙鏈體形成時(shí)，所述第一和第二標(biāo)記被拉攏至位置緊鄰。這樣的實(shí)施方案的例子顯示于圖4A、4B和4C中。在本發(fā)明的一些方面中，所述探針的第一寡核苷酸不包含標(biāo)記，而該探針的第二寡核苷酸包含至少一種、優(yōu)選兩種標(biāo)記。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二寡核苷酸包含一個(gè)第一標(biāo)記和一個(gè)第二標(biāo)記。所述第一標(biāo)記在所述第二寡核苷酸的一個(gè)末端或接近末端處與之相聯(lián)，并且所述第二標(biāo)記在該第二寡核苷酸的另一個(gè)末端或接近該末端處與之相聯(lián)，由此當(dāng)該第二寡核苷酸不與第一寡核苷酸雜交時(shí)，該第二寡核苷酸處于將該第一標(biāo)記和第二標(biāo)記拉攏至緊鄰位置的一種無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)或一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)， 上述兩種標(biāo)記保持彼此遠(yuǎn)離。這樣的實(shí)施方案的例子顯示于圖4D、4E和4F中。在先技術(shù)中已知，當(dāng)一種雙標(biāo)記的寡核苷酸處于單鏈狀態(tài)并且在一定的許可溫度下時(shí)，其可以形成一種無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)。這樣的線性寡核苷酸探針在溶液中的行為類似一種無規(guī)線團(tuán)它的兩個(gè)末端會(huì)偶然地互相接近，導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移的一種可測(cè)量的改變。但是，當(dāng)這種探針與其模板結(jié)合時(shí)，該探針-模板雜交體迫使該探針的兩個(gè)末端分開，破壞了這兩個(gè)末端部分之間的相互作用，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射的一種改變。雙標(biāo)記的寡核苷酸也可以形成一種稱為分子信標(biāo)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。分子信標(biāo)探針是能形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸探針，在所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，一種熒光基團(tuán)和一種淬滅劑通常被置于該寡核苷酸相對(duì)的兩端。在所述探針末端處的短的互補(bǔ)序列允許一種分子內(nèi)莖的形成，從而令所述熒光基團(tuán)與所述淬滅劑能處于緊鄰位置。上述分子信標(biāo)的環(huán)部分與所感興趣的一種目標(biāo)核酸互補(bǔ)。這種探針與其目標(biāo)核酸之間的結(jié)合形成了一種雜交體，令所述莖分開。這將導(dǎo)致一種構(gòu)象變化，構(gòu)象變化使所述熒光基團(tuán)和所述淬滅劑彼此分開并導(dǎo)致更強(qiáng)的熒光信號(hào)(Tyagi S.和Kramer F. R.，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))，Vol. 14，pages 303-308(1996) ；Tyagi 等人，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))，Vol. 16，pages 49-53(1998) ；Piatek 等人，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))，Vol. 16, pages 359-363 (1998) ；Marras S.等人，Genetic Analysis :Biomolecular Engineering (遺傳分析-生物分子工程)，Vol. 14，pages 151-156(1999) ；Tpp I.等人， BioiTechniques (生物技術(shù))，Vol 28，pages 732-738 (2000)) 在本發(fā)明中，具有雙鏈部分的線性探針的一種第二寡核苷酸，是一種探針的一個(gè)雙鏈部分的一部分，其中所述第二寡核苷酸可以是一種類似分子信標(biāo)的寡核苷酸。這種探針與其他探針的不同之處在于，所述第二寡核苷酸可不與目標(biāo)序列雜交，而與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域雜交，其中所述第二區(qū)域可與目標(biāo)序列無關(guān)。所述第二寡核苷酸可以是能與目標(biāo)序列雜交的，但它被設(shè)計(jì)為在實(shí)際的擴(kuò)增反應(yīng)中不能與目標(biāo)序列雜交。所述第二寡核苷酸可以包含與一種目標(biāo)序列不能牢固地結(jié)合的序列。在擴(kuò)增反應(yīng)的延伸和退火步驟，溫度可能會(huì)太高，使得所述第二寡核苷酸不能與目標(biāo)序列雜交。而在通常于延伸步驟之后進(jìn)行的信號(hào)收集步驟，溫度可能會(huì)較低，但由于待擴(kuò)增的目標(biāo)序列可能因擴(kuò)增引物業(yè)已進(jìn)行的延伸而變成雙鏈，所述目標(biāo)序列可能會(huì)不能供所述第二寡核苷酸雜交。因此，在信號(hào)收集步驟，所述第二寡核苷酸可能僅能與所述探針未被消耗的第一寡核苷酸雜交。另一方面，所述第一寡核苷酸不含標(biāo)記而所述第二寡核苷酸包含一種標(biāo)記。當(dāng)所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交從而形成所述探針的雙鏈部分時(shí)，所述標(biāo)記的可檢測(cè)的信號(hào)發(fā)射，相對(duì)于該標(biāo)記在單鏈形式的所述第二寡核苷酸中的發(fā)射發(fā)生改變。這可以是由于所述標(biāo)記被拉至與所述第一寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸緊鄰的位置，或者由于所述標(biāo)記被拉離了所述第二寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在先技術(shù)中已知，當(dāng)一種熒光染料與特定的核苷酸，例如一個(gè)G核苷酸位置緊鄰時(shí)，其熒光發(fā)射可發(fā)生改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針的第一寡核苷酸不含標(biāo)記，并且所述探針包含兩種能與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域上的不同部分相鄰地或充分相鄰地雜交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸之一與一種第一標(biāo)記相聯(lián)，而另一種第二寡核苷酸與一種第二標(biāo)記相聯(lián)，如此當(dāng)上述兩種第二寡核苷酸與上述第一寡核苷酸雜交時(shí)，這兩種標(biāo)記被拉至緊鄰位置并且一種標(biāo)記影響來自另一種標(biāo)記的信號(hào)。所述緊鄰位置可以導(dǎo)致如FRET或接觸淬滅的關(guān)系。與上述第一寡核苷酸雜交的上述兩種第二寡核苷酸是所述探針的部分。上述兩種標(biāo)記的第二寡核苷酸被設(shè)計(jì)為不與擴(kuò)增的目標(biāo)序列雜交，而與未被消耗的第一寡核苷酸雜交。圖41和4J中給出了這樣的實(shí)施方案的例子。在其他一些實(shí)施方案中，一種探針的第一和第二寡核苷酸通過包含核苷酸或一種非核苷酸的化學(xué)部分的一種連接部分相連，從而允許所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述第一和第二寡核苷酸分別被標(biāo)記，如此當(dāng)所述探針形成一種內(nèi)部莖-環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，上述標(biāo)記被拉至緊鄰位置并且一種標(biāo)記影響來自另一種標(biāo)記的信號(hào)。所述連接部分可以是如分子式為(CH2)n的一個(gè)簡(jiǎn)單部分，或者是功能與之相當(dāng)?shù)囊环N連接(η優(yōu)選地為1至100或1至50)。優(yōu)選地，所述連接部分為與所述第一和第二寡核苷酸相連的一種寡核苷酸。優(yōu)選地，上述環(huán)與所述目標(biāo)序列互補(bǔ)。所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的至少兩種探針包含相同的可檢測(cè)的標(biāo)記或者其發(fā)射光譜不可區(qū)分的一種不同的可檢測(cè)的標(biāo)記。在多重反應(yīng)中，兩種或多種探針被用于檢測(cè)兩種或多種目標(biāo)核酸的存在。但是，這并不一定意味著，每種不同的探針需要有不同的可區(qū)分的標(biāo)記。每種探針可以具有依賴于其內(nèi)部雙鏈部分的特征的一種特有的熔解圖譜。因此，若兩種或多種探針具有可區(qū)分的熔解特性，則可將相同的標(biāo)記用于這些探針。也就是說，用相同的標(biāo)記或其發(fā)射光譜不可區(qū)分的標(biāo)記標(biāo)記的不同探針，必須具有不同的熔解特性，優(yōu)選具有不同的熔解溫度(Tm)。上述不同的熔解特性將允許各種探針在步驟(c)中被鑒定和/或定量。本文所用術(shù)語“熔解特性”包括探針的熔解圖譜(優(yōu)選通過測(cè)定來自該探針上的標(biāo)記的信號(hào)作為溫度的函數(shù)進(jìn)行測(cè)量)和/或探針的熔解溫度(Tm)。當(dāng)稱探針的熔解特性是“不同的”時(shí)，應(yīng)當(dāng)明白這種不同之處系會(huì)在相同或?qū)φ諚l件下測(cè)得。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，兩種或多種探針被相同的可檢測(cè)的標(biāo)記標(biāo)記。例如， 第一寡聚核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或者更多種的不同的探針可以都被相同的標(biāo)記標(biāo)記，或第二寡聚核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或者更多種的不同的探針可以都被相同的標(biāo)記標(biāo)記。在步驟(b)中，在所述樣品/擴(kuò)增(或樣品/雜交)反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)， 其中，當(dāng)一種目標(biāo)核酸存在時(shí)，與該目標(biāo)核酸的部分充分互補(bǔ)的探針(第一寡聚核苷酸)在所述擴(kuò)增反應(yīng)過程中被消耗。所述擴(kuò)增反應(yīng)可以在本領(lǐng)域已知的條件下進(jìn)行，如此與所述目標(biāo)核酸的部分充分互補(bǔ)的探針被消耗。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增包括至少一個(gè)變性步驟、至少一個(gè)退火步驟和至少一個(gè)引物延
伸步驟。更優(yōu)選地，所述擴(kuò)增是一種包括兩個(gè)或更多的變性、退火和引物延伸步驟的熱循環(huán)擴(kuò)增。優(yōu)選的擴(kuò)增反應(yīng)包括PCR，SDA, NASBA, LAMP，3SR，ICAN, TMA，解旋酶依賴的等溫 DNA擴(kuò)增以及類似方法。PCR為一種優(yōu)選的擴(kuò)增方法。若所述擴(kuò)增為PCR，則所述條件包括將反應(yīng)進(jìn)行熱循環(huán)。當(dāng)一種目標(biāo)核酸在所述樣品中存在時(shí)，至少一些與該目標(biāo)核酸的部分互補(bǔ)的探針 (第一寡聚核苷酸)將在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下與各自的互補(bǔ)部分雜交。所述第一寡核苷酸將因此被消耗。所述探針的消耗通過其與目標(biāo)序列的雜交而實(shí)現(xiàn)，雜交可繼以在擴(kuò)增步驟中所述探針向擴(kuò)增產(chǎn)物中的摻入或/和所述探針的降解。也就是說，所述探針第一寡核苷酸在被消耗后不再能重新構(gòu)成其之前形成了一種部分的那樣的探針。在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中，當(dāng)探針具有兩條鏈時(shí)，本發(fā)明的探針可以通過將所述第一和第二寡核苷酸以任意比例，例如，所述第二寡核苷酸對(duì)所述第一寡核苷酸的比例優(yōu)選為大于1，或者可以為大于0. 1且小于1，添加到所述反應(yīng)中而構(gòu)成。如此，所述第一和第二寡核苷酸可以獨(dú)立地加入加入到擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。依賴于檢測(cè)方法的類型和實(shí)際使用的標(biāo)記的類型，當(dāng)所述探針或所述探針的第一寡核苷酸被消耗時(shí)，來自所述探針的信號(hào)(例如熒光發(fā)射)可以增強(qiáng)或減弱。參閱圖4中所示的實(shí)施方案。在圖4A至4C中，由于與熒光基團(tuán)相聯(lián)的第一寡核苷酸被消耗，并因此允許該熒光基團(tuán)發(fā)射其信號(hào)，所述探針的消耗導(dǎo)致熒光的增強(qiáng)。相反地，在圖4D至4F中，所述第一寡核苷酸的消耗釋放了雙重末端標(biāo)記的第二寡核苷酸，并因此允許熒光基團(tuán)與淬滅劑彼此并置，從而導(dǎo)致來自所述熒光基團(tuán)的信號(hào)的降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針第一寡核苷酸可被延伸，并且作為正向或反向引物起作用。所述探針的第一寡核苷酸可以作為擴(kuò)增引物之一，能夠被摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物之中， 并因此被消耗(參見圖6)。在一次PCR中，所述探針的第一寡核苷酸與針對(duì)反向鏈的另一擴(kuò)增引物作為引物對(duì)共同進(jìn)行擴(kuò)增。在信號(hào)收集步驟，或者測(cè)量所述探針的熔解圖譜的步驟，該探針的已摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中的第一寡核苷酸不再能參與形成該探針內(nèi)部雙鏈部分的雙鏈體。所述探針未被消耗的、能夠參與形成該探針雙鏈體的第一寡核苷酸的量，可以被測(cè)定，并且此信號(hào)可以轉(zhuǎn)換為被消耗了的第一寡核苷酸的量，從而測(cè)定出哪種或者有多少目標(biāo)序列存在于一份樣品中。當(dāng)所述第一寡核苷酸作為一種引物起作用時(shí)，所述第二寡核苷酸優(yōu)選不作為一種引物起作用。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單鏈探針或具有兩條鏈的探針的第一寡核苷酸在擴(kuò)增過程中被降解。例如，所述第一寡核苷酸可以包括對(duì)一種消化劑敏感的核苷酸或非核苷酸的化學(xué)部分。一個(gè)進(jìn)一步的例子中，當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)，所述探針或所述第一寡核苷酸能被上述消化劑降解。例如，所述探針或所述第一寡核苷酸可以包含RNA核苷酸。當(dāng)所述第一寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交時(shí)，它能被具有核酸核酸酶H活性的酶降解。可以設(shè)計(jì)為當(dāng)所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雜交以形成所述探針的雙鏈部分時(shí)，所述第一寡核苷酸不能被降解。所述第一寡核苷酸也可以被一種外切核酸酶降解。例如，所述第一寡核苷酸的3'核苷酸可以被一種聚合酶的3'外切核酸酶活性降解。所述第一寡核苷酸還可以被一種內(nèi)切核酸酶降解，例如在與一種目標(biāo)核酸雜交時(shí)被一種限制酶降解。優(yōu)選地，所述單鏈探針或具有兩條鏈的探針的第一寡核苷酸被一種DNA聚合酶， 例如Taq DNA聚合酶的5'外切核酸酶活性降解。在該實(shí)施方案中，所述探針的第一寡核苷酸可以是3'端被封閉的，并且因此而不能被延伸。在PCR擴(kuò)增中，所述第一寡核苷酸與目標(biāo)序列上兩邊分別為正向和反向引物的區(qū)域雜交，并且能被一種核酸酶活性，例如Taq聚合酶的5'外切核酸酶活性降解(參見圖8)。或者，所述探針的第一寡核苷酸3'端是未被封閉的，并且因此而能被延伸。所述第一寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交，并且能被一種聚合酶延伸。所述第一寡核苷酸上游的一種擴(kuò)增引物也得到延伸。在PCR擴(kuò)增中，當(dāng)上述擴(kuò)增引物延伸至與所述第一寡核苷酸的延伸鏈相遇時(shí)，所述第一寡核苷酸的整條延伸鏈能被一種核酸酶活性，例如Taq聚合酶的5'外切核酸酶活性降解(參見圖7)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針的消耗可以僅僅是該探針與目標(biāo)序列的雜交，雜交的探針由此不再能形成所述探針的雙鏈結(jié)構(gòu)(參見圖幻。優(yōu)選地，擴(kuò)增被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生一種單鏈的產(chǎn)物，如此所述探針的第一寡核苷酸能在退火步驟期間和/或延伸步驟之后與目標(biāo)序列雜交。用以產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物的方法可以是不對(duì)稱PCR，或者在PCDR中描述的一種方法(PCT/GB2007/00379;3)。上述單鏈的擴(kuò)增鏈可以與所述第一寡核苷酸形成一種牢固的雜交體；所述第一寡核苷酸因此可以視作已被消耗，因?yàn)槠潆y以再供形成所述探針的內(nèi)部雜交體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針的第一寡核苷酸可以作為一種巢式內(nèi)側(cè)擴(kuò)增引物起作用。所述第一寡核苷酸與一種外側(cè)擴(kuò)增引物與目標(biāo)核酸的同一鏈退火。與目標(biāo)核酸雜交后，所述外側(cè)擴(kuò)增引物和所述第一寡核苷酸可以都得到延伸。如果DNA聚合酶包含一種置換活性，則所述第一寡核苷酸的延伸鏈可在所述外側(cè)引物的延伸過程中被置換。如果DNA聚合酶包含一種5'外切核酸酶活性，則所述第一寡核苷酸的延伸鏈可在所述外側(cè)引物的延伸過程中被降解。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增條件可以被設(shè)計(jì)為令所述探針在所述擴(kuò)增的一些階段即使當(dāng)目標(biāo)核酸存在時(shí)也不被消耗，而在另一些階段被消耗。例如，若所述擴(kuò)增為PCR，在擴(kuò)增的一些熱循環(huán)中，所述探針可因退火和延伸溫度設(shè)置得太高，令所述探針不能結(jié)合而不被消耗。擴(kuò)增的熱循環(huán)條件可以被設(shè)計(jì)為令所述探針可以在擴(kuò)增的一些階段或者最后一個(gè)循環(huán)被消耗。例如，在熱循環(huán)之后，將PCR管置于一個(gè)比所述熱循環(huán)的退火和延伸溫度都更低的溫度孵育。這個(gè)較低的溫度允許所述探針與目標(biāo)核酸雜交，導(dǎo)致雜交的探針被延伸或降解。步驟(b)可以進(jìn)一步包括步驟(bl)在多個(gè)測(cè)量溫度(MTs)，逐循環(huán)地測(cè)量熒光發(fā)射(FEs)。所述測(cè)量溫度(MTs)是指逐循環(huán)地對(duì)所述探針上的標(biāo)記進(jìn)行熒光發(fā)射讀數(shù)以測(cè)定一種探針的熒光發(fā)射量的溫度。優(yōu)選地，在一個(gè)反應(yīng)中的每一循環(huán)，在反應(yīng)混合物經(jīng)一種被所述探針上的一種標(biāo)記吸收的波長(zhǎng)的光照射或激發(fā)之后，獲得、檢測(cè)和/或記錄該標(biāo)記的熒光發(fā)射。術(shù)語“逐循環(huán)”是指在每一循環(huán)中測(cè)量。在一個(gè)循環(huán)中，在一個(gè)測(cè)量溫度進(jìn)行熒光發(fā)射讀數(shù)以計(jì)算剩余探針的熒光發(fā)射量。熒光發(fā)射可以連續(xù)地或間歇地被檢測(cè)、記錄或獲得。在一個(gè)連續(xù)記錄過程中，在例如一個(gè)PCR反應(yīng)的每一循環(huán)，所述探針的熒光發(fā)射例如每50ms、每100ms、每200ms或每Is被監(jiān)測(cè)和記錄一次。由此可以形成時(shí)間、溫度和熒光發(fā)射的一個(gè)立體圖。在任意一個(gè)給定的循環(huán)，在對(duì)應(yīng)于一個(gè)所期望的MT的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒光發(fā)射讀數(shù)，以測(cè)定該循環(huán)中所述探針的熒光發(fā)射量。在一個(gè)間歇記錄過程中，在每一循環(huán)中，僅當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到一個(gè)所期望的MT時(shí)進(jìn)行熒光發(fā)射讀數(shù)。對(duì)于通過摻入至擴(kuò)增產(chǎn)物或被一種消化劑降解而被消耗的探針，所述逐循環(huán)的熒光發(fā)射(FE)優(yōu)選在每一循環(huán)的延伸步驟完成之后進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于通過與目標(biāo)序列雜交而被消耗的探針，所述逐循環(huán)的熒光發(fā)射(FE)可以在每一循環(huán)的延伸步驟完成之前進(jìn)行測(cè)定。本文所述的熒光發(fā)射(FE)是指經(jīng)基線校正的熒光(dR)。通常，對(duì)于每一孔(反應(yīng))和每一光路，利用一種線性最小均方算法(或者其他類似算法)在一定范圍的循環(huán)對(duì)原始熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合以得到一條基線。對(duì)每一循環(huán)，計(jì)算上述基線函數(shù)的值并將其從原始熒光中扣除，從而得到經(jīng)基線校正的熒光(dR)。熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(擴(kuò)增圖)可以描述為一個(gè)二元函數(shù)一個(gè)線性分量或者說背景，和一個(gè)包含有關(guān)信息的指數(shù)分量。熒光中的線性部分可以被算出并扣除，以分離出上述指數(shù)分量。對(duì)于每一擴(kuò)增圖(即每一反應(yīng)和每一標(biāo)記)，進(jìn)行的處理由三個(gè)步驟組成1.鑒定出所有熒光組分均為嚴(yán)格線性(熒光無指數(shù)增長(zhǎng))的循環(huán)的范圍。2.利用以上確定的循環(huán)過程中的熒光強(qiáng)度值，將數(shù)據(jù)擬合為一條直線(一個(gè)預(yù)測(cè)上述線性分量在整個(gè)反應(yīng)中的貢獻(xiàn)的函數(shù))。3.在每一循環(huán)過程中，扣除上述預(yù)測(cè)的背景熒光強(qiáng)度。如此得到的曲線對(duì)應(yīng)于因 DNA擴(kuò)增導(dǎo)致的熒光變化。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含“η”種用于對(duì)“η”種目標(biāo)核酸進(jìn)行多重檢測(cè)的探針時(shí)，第一種探針的熔解溫度為Tml，第二種探針的熔解溫度為Tm2，第三種探針的熔解溫度為Tm3， 第k種探針的熔解溫度為Tmk，并且第η種探針的熔解溫度為1>，其中TmI > Tm2 > Tm3 >... Tmk > 1>，其中η和k為正整數(shù)，1彡k彡n，并且η彡2。在一個(gè)特定的溫度或一系列的溫度，一種探針的雙鏈形式占探針總量的百分比， 可以通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，或者進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中所述預(yù)測(cè)可以通過計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行。由于一種探針熔解時(shí)的熒光發(fā)射的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)對(duì)溫度作圖會(huì)得到一條正態(tài)分布曲線，統(tǒng)計(jì)學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地定義一個(gè)ΜΤ，一種給定探針總量的一個(gè)百分比的該探針在該MT 處于雙鏈形式或單鏈(即分離的)形式。據(jù)此，一個(gè)測(cè)量溫度為，例如不多于20%的一種探針處于單鏈形式的一個(gè)溫度?？梢灾谱鞒鲆粋€(gè)列出每種探針在每一溫度其雙鏈(ds)和單鏈(s)形式的百分比的表。在一個(gè)測(cè)量溫度Ma可以獲得一個(gè)第一熒光發(fā)射FEa，其中在此Ma多于50%的第一探針處于雙鏈形式；在一個(gè)測(cè)量溫度肌13可以獲得第二熒光發(fā)射FEb，其中在Mffll3多于50 %的第二探針處于雙鏈形式；在一個(gè)測(cè)量溫度Ml可以獲得第k熒光發(fā)射FEk，其中在此MTk多于50%的第k種探針處于雙鏈形式；在一個(gè)測(cè)量溫度MT (n-1)可以獲得第n_l熒光發(fā)射FE(n-l)，其中在此MT(n-l)多于50%的第n_l種探針處于雙鏈形式；在一個(gè)測(cè)量溫度Mn可以獲得第η熒光發(fā)射FEn，其中在此Mn多于50%的第η種探針處于雙鏈形式；可供選擇地，在一個(gè)測(cè)量溫度MTO可以獲得一個(gè)熒光發(fā)射FE0，其中在此MTO不多于10%的第一探針處于雙鏈形式。盡管以上提到的50%是處于雙鏈形式的探針的一個(gè)優(yōu)選的量，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為任何百分比都可使用，例如40 %、55%、70 %或80%。優(yōu)選地，在一個(gè)測(cè)量溫度MTk逐循環(huán)地獲得熒光發(fā)射FEk的步驟，其中在此ffll不多于30%的第(k-Ι)種探針處于其內(nèi)部雙鏈形式。更優(yōu)選地，在一個(gè)測(cè)量溫度Ml逐循環(huán)地獲得熒光發(fā)射FEk的步驟，其中在此ffll不多于20% 的第(k-Ι)種探針處于其內(nèi)部雙鏈形式。步驟(b)可進(jìn)一步包括步驟( )對(duì)每種探針，逐循環(huán)地測(cè)定來自被消耗的探針的熒光發(fā)射的實(shí)際消耗量，其中第k種探針的熒光發(fā)射的實(shí)際消耗量記為ACAk。在一個(gè)特定的測(cè)量溫度(MTa)，此溫度一種探針有一定百分比(dSka)%處于ds (雙鏈)形式，第一探針在此測(cè)量溫度MTa對(duì)熒光發(fā)射FE的貢獻(xiàn)為(dsla) % * (ACA1)，第二探針的貢獻(xiàn)為(ds2a) % * (ACA2),第k種探針的貢獻(xiàn)為(dska) (ACAk)。例如，在60°C，70 %的探針1處于ds形式；在50°C，80%處于ds形式。所述探針1在60°C對(duì)FE的貢獻(xiàn)為701^MACA1)；所述探針 1在50°C對(duì)FE的貢獻(xiàn)為80% * (ACA1)。若存在多種探針，則FE為被消耗的所有探針?biāo)暙I(xiàn)的總量。實(shí)際消耗量(ACA)可以用下列公式計(jì)算在溫度a，總熒光發(fā)射為
FEa = (ACAl) * (dsla) % + (ACA2) * (ds2a) % + (ACA3) * (ds3a) % ·.. + (ACAn) *(dsna)%在溫度b，總熒光發(fā)射為FEb = (ACAl) *(dslb) % + (ACA2) * (ds2b) % + (ACA3) * (ds3b) % … + (ACAn) *(dsna)%在溫度c，總熒光發(fā)射為FEc = (ACAl) *(dslc) % + (ACA2) * (ds2c) % + (ACA3) * (ds3c) % … + (ACAn) *(dsna)%依此類推。單獨(dú)的ACA可以從以上公式算出?！?”表示“乘以”。優(yōu)選地，每種探針的實(shí)際消耗量通過一種運(yùn)行上述計(jì)算的計(jì)算機(jī)程序獲得?；蛘?， 上述計(jì)算可以人工進(jìn)行。例如，在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中，有針對(duì)三種目標(biāo)序列的三種探針。在65°C時(shí)，5 %的第一探針處于雙鏈形式，0%的第二探針和0%的第三探針處于雙鏈形式。在60°C時(shí)，60%的第一探針處于雙鏈形式，5%的第二探針處于雙鏈形式，0%的第三探針處于雙鏈形式。在55°C 時(shí)，90 %的第一探針處于雙鏈形式，55 %的第二探針處于雙鏈形式，5 %的第三探針處于雙鏈形式。在45°C時(shí)，多于95%的所有各種探針處于雙鏈形式。在60°C收集第一熒光發(fā)射 FE60，在55°C收集第二熒光發(fā)射FE55，在45°C收集第三熒光發(fā)射FE45?？晒┻x擇地，在收集所述第一熒光發(fā)射之前，在65°C或更高的溫度收集一個(gè)熒光發(fā)射，是為FE65。由單種探針的實(shí)際消耗量ACA貢獻(xiàn)的FE用ds% * (ACA)進(jìn)行計(jì)算。參見下表
權(quán)利要求
1.一種用于針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)靶核酸檢驗(yàn)樣品的方法，所述方法包括(a)將包括一個(gè)或更多個(gè)靶核酸的樣品與擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括(i) 一對(duì)或更多對(duì)正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一個(gè)或更多個(gè)靶核酸存在于所述樣品中，所述引物對(duì)能夠擴(kuò)增所述一個(gè)或更多個(gè)靶核酸， ( )兩個(gè)或更多個(gè)探針，其中每個(gè)探針包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中每個(gè)探針包括可檢測(cè)的標(biāo)記物或者可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物或可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)是該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探針中的至少兩個(gè)包括相同的可檢測(cè)標(biāo)記物或者具有不可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同的可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中這樣的探針中的每個(gè)的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解特征是不同的；(b)在擴(kuò)增條件下，在所述樣品/反應(yīng)混合物上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中，當(dāng)靶核酸存在時(shí)， 與該靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)的探針的所述第一寡核苷酸與所述靶核酸雜交，因此被消耗，其中探針的所述被消耗的寡核苷酸不再能夠參與形成所述探針的雙鏈部分(雙鏈體)； 以及(c)通過檢測(cè)來自在未被消耗的探針中的所述標(biāo)記物的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)作為溫度的函數(shù)，至少測(cè)量一次所述反應(yīng)混合物中的所述未被消耗的探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解圖譜，其中所述熔解圖譜提供至少一個(gè)靶核酸是否存在于所述樣品中的指征， 其中所述探針的所述至少兩個(gè)中的第一探針具有依據(jù)所述第一探針的雙鏈部分的熔解溫度TmI，其中所述探針的所述至少兩個(gè)中的第二探針具有依據(jù)所述第二探針的雙鏈部分的熔解溫度Tm2，其中 TmI > Tm2，其中所述相同的標(biāo)記物被獨(dú)立地附接到所述第一和第二探針， 其中在TmI和/或Tm2的任一熔解峰的降低提供所述一個(gè)或多個(gè)第一和/或第二探針的消耗的指征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熔解圖譜是在反應(yīng)/擴(kuò)增發(fā)生前測(cè)量(擴(kuò)增前熔解圖譜)，和/或是在反應(yīng)/擴(kuò)增完成后測(cè)量(擴(kuò)增后熔解圖譜)，和/或是在每個(gè)循環(huán)或者選擇的循環(huán)的反應(yīng)/擴(kuò)增期間測(cè)量(擴(kuò)增中熔解圖譜)，其中所述方法額外地包括步驟(d)， (i)比較至少兩個(gè)在(c)中獲得的熔解圖譜，和/或 ( )將在步驟(c)中獲得的熔解圖譜與相同探針的之前獲得的溶解曲線比較，或者與同時(shí)在對(duì)照反應(yīng)中平行獲得的相同探針的熔解圖譜比較，或者與相同探針的理論熔解圖譜比較，其中所述熔解圖譜的改變提供至少一個(gè)靶核酸是否存在于所述樣品/反應(yīng)混合物中的指征，其中所述擴(kuò)增前熔解圖譜是在反應(yīng)/擴(kuò)增開始之前在相同的反應(yīng)容器中被測(cè)量的，或者是在單獨(dú)的反應(yīng)容器中被測(cè)量的，在所述單獨(dú)的反應(yīng)容器中由于反應(yīng)混合物缺乏所述反應(yīng)/擴(kuò)增所必須的一種或更多種成分而無擴(kuò)增發(fā)生，其中在步驟(d)中，將所述擴(kuò)增后或擴(kuò)增中熔解圖譜與所述探針的雙鏈體的所述擴(kuò)增前熔解圖譜比較，以確定特定探針是否被消耗，作為相應(yīng)靶存在于所述樣品中的指征。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，其中步驟(b)還包括逐循環(huán)在各個(gè)測(cè)量溫度(MT)獲得熒光發(fā)射(FE)的步驟(bl)，其中所述熒光發(fā)射(FE)是基線校正的熒光(dR)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中當(dāng)所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括針對(duì)“η”個(gè)靶核酸的多重檢測(cè)的“η”個(gè)探針時(shí)，其中第一探針具有熔解溫度TmI，第二探針具有熔解溫度Tm2，第三探針具有熔解溫度Tm3，第η探針具有熔解溫度Tmn，其中TmI > Τω2 > Τω3···> 1>，每個(gè)探針在特定溫度或不同溫度的雙鏈形式的百分比是以實(shí)驗(yàn)方法確定的，或者是通過計(jì)算機(jī)程序理論上計(jì)算出的，其中第一熒光發(fā)射Ffe是在測(cè)量溫度Ma獲得的，在所述測(cè)量溫度ffl^a， 第一探針的多于50%是雙鏈體形式，第二熒光發(fā)射FEb是在測(cè)量溫度Mb獲得的，在所述測(cè)量溫度Mb，第二探針的多于50%是雙鏈體形式，第n-1熒光發(fā)射FE(n-l)是在測(cè)量溫度 MT(n-l)獲得的，在所述測(cè)量溫度MT(n-1)，第(n_l)探針的多于50%是雙鏈體形式，第η熒光發(fā)射FEn是在測(cè)量溫度Mn獲得的，在所述測(cè)量溫度Μη，第η探針的多于80%是雙鏈體形式，以及可選地，熒光發(fā)射FEO是在測(cè)量溫度MTO獲得的，在所述測(cè)量溫度ΜΤ0，第一探針的不多于10%是雙鏈體形式，其中η是正整數(shù)并且η≥2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述步驟(b)還包括逐循環(huán)確定針對(duì)每個(gè)探針的熒光發(fā)射的實(shí)際消耗量(ACA)的步驟0^2)，其中第k探針的熒光發(fā)射的實(shí)際消耗量以ACAk 描述，其中所述第k探針在特定測(cè)量溫度(MTa)具有百分比為(dska)%的ds (雙鏈)形式， 在該測(cè)量溫度Ma由所述第一探針貢獻(xiàn)的所述熒光發(fā)射Ffe將是(dsla) (ACA1)，由所述第二探針貢獻(xiàn)的將是(ds2a) % * (ACA2)，由所述第k探針貢獻(xiàn)的將是(dska) % * (ACAk)，由所述第η探針貢獻(xiàn)的將是(dsna) % * (ACAn)，其中實(shí)際消耗量(ACA)的計(jì)算使用以下公式在測(cè)量溫度Ma，總熒光發(fā)射將是FEa = (ACAl)*(dsla) % + (ACA2)*(ds2a) % + (ACA3)*(ds3a) % — + (ACAn)*(dsna) %在測(cè)量溫度Mb，總熒光發(fā)射將是FEb = (ACAl)*(dslb) % + (ACA2)*(ds2b) % + (ACA3)*(ds3b) % — + (ACAn)*(dsna) %在測(cè)量溫度MTc，總熒光發(fā)射將是FEc = (ACAl)*(dslc) % + (ACA2)*(ds2c) % + (ACA3)*(ds3c) %…+ (ACAn)*(dsna) %其余類推，其中針對(duì)每個(gè)探針的所述ACA可以從以上公式計(jì)算，其中“*”表示“乘以”， “k”是正整數(shù)，1≤k≤n，并且“η”是探針的數(shù)目。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中每個(gè)探針的熒光發(fā)射的所述實(shí)際消耗量是通過計(jì)算機(jī)程序獲得的，所述計(jì)算機(jī)程序在每個(gè)循環(huán)在每個(gè)測(cè)量溫度進(jìn)行計(jì)算。
7.一種用于針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)靶核酸檢驗(yàn)樣品的方法，所述方法包括(a)將包括一個(gè)或更多個(gè)靶核酸的樣品與反應(yīng)混合物接觸，所述反應(yīng)混合物包括 兩個(gè)或更多個(gè)探針，其中每個(gè)探針包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中每個(gè)探針包括可檢測(cè)的標(biāo)記物或者可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物或可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)是該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探針中的至少兩個(gè)包括相同的可檢測(cè)標(biāo)記物或者具有不可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同的可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中這樣的探針中的每個(gè)的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解特征(熔解溫度，Tffl)是不同的，并且所述熔解特征在熔解圖譜分析中是可區(qū)分的；(b)在所述樣品/反應(yīng)混合物上進(jìn)行所述反應(yīng)，其中所述反應(yīng)是在延伸條件下的引物延伸反應(yīng)，其中，當(dāng)靶核酸存在時(shí)，相對(duì)應(yīng)的是可延伸引物的探針的所述第一寡核苷酸與靶核酸雜交，因此在所述引物延伸反應(yīng)期間被消耗，其中探針的所述被消耗的寡核苷酸不再能夠參與形成所述探針的雙鏈部分(雙鏈體)；以及(c)通過檢測(cè)來自未被消耗的探針中的所述標(biāo)記物的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)作為溫度的函數(shù)，至少測(cè)量一次所述反應(yīng)混合物中的所述未被消耗的探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解圖譜，其中所述熔解圖譜提供至少一個(gè)靶核酸是否存在于所述樣品中的指征。
8.一種用于針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)靶核酸檢驗(yàn)樣品的方法，所述方法包括(a)將包括一個(gè)或更多個(gè)靶核酸的樣品與雜交反應(yīng)混合物接觸，所述雜交反應(yīng)混合物包括兩個(gè)或更多個(gè)探針，其中每個(gè)探針包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中每個(gè)探針包括可檢測(cè)的標(biāo)記物或者可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物或可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)是該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探針中的至少兩個(gè)包括相同的可檢測(cè)標(biāo)記物或者具有不可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同的可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中這樣的探針中的每個(gè)的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解特征是不同的，并且所述熔解特征在熔解圖譜分析中是可區(qū)分的；(b)在雜交條件下，在所述樣品/反應(yīng)混合物上進(jìn)行所述雜交反應(yīng)，其中，當(dāng)靶核酸存在時(shí)，與該靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)的探針的第一寡核苷酸與靶核酸雜交，因此在所述反應(yīng)期間被消耗，其中探針的所述被消耗的寡核苷酸不再能夠參與形成所述探針的雙鏈部分(雙鏈體)；以及(C)通過檢測(cè)來自未被消耗的探針中的所述標(biāo)記物的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)作為溫度的函數(shù)，至少測(cè)量一次所述反應(yīng)混合物中的所述未被消耗的探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解圖譜，其中所述熔解圖譜提供至少一個(gè)靶核酸是否存在于所述樣品中的指征。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增是等溫?cái)U(kuò)增或熱循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，所述反應(yīng)包括兩次或更多次的變性、退火和引物延伸步驟。
10.一種用于監(jiān)控至少兩個(gè)靶核酸的PCR擴(kuò)增的方法，所述方法包括(a)將包括一個(gè)或更多個(gè)靶核酸的樣品與擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括(i) 一對(duì)或更多對(duì)正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一個(gè)或更多個(gè)靶核酸存在于所述樣品中，所述引物對(duì)能夠擴(kuò)增所述一個(gè)或更多個(gè)靶核酸， ( )兩個(gè)或更多個(gè)探針，其中每個(gè)探針包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中每個(gè)探針包括熒光標(biāo)記物或者熒光標(biāo)記物/淬滅劑對(duì)，所述熒光標(biāo)記物或者熒光標(biāo)記物/淬滅劑對(duì)能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)表征該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在，并且其中所述探針中的至少兩個(gè)包括相同的可檢測(cè)標(biāo)記物或者具有不可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同的可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中這樣的探針中的每個(gè)的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解特征是不同的；(b)進(jìn)行包括所述樣品/擴(kuò)增反應(yīng)混合物的熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)其中，當(dāng)靶核酸存在時(shí)，與該靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)的探針的所述第一寡核苷酸在所述擴(kuò)增反應(yīng)中被消耗；并且其中所述步驟(b)還包括逐循環(huán)在各個(gè)測(cè)量溫度(MT)獲得熒光發(fā)射(FE)的步驟 (bl)，其中所述熒光發(fā)射(FE)是基線校正的熒光(dR)，其中當(dāng)所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括針對(duì)“η”個(gè)靶核酸的多重檢測(cè)的“η”個(gè)探針時(shí)，其中第一探針具有熔解溫度TmI，第二探針具有熔解溫度Tm2，第三探針具有熔解溫度Tm3，第η探針具有熔解溫度Tmn，其中TmI > Τω2 > Τ;>··> Tmn，其中每個(gè)探針在特定溫度或不同溫度的雙鏈形式的百分比是以實(shí)驗(yàn)方法確定的，或者是通過計(jì)算機(jī)程序理論上計(jì)算出的，其中第一熒光發(fā)射FEa是在測(cè)量溫度Ma獲得的，在所述測(cè)量溫度ffl^a，第一探針的多于50%是雙鏈體形式，第二熒光發(fā)射FEb是在測(cè)量溫度1013獲得的，在所述測(cè)量溫度Mb，第二探針的多于50%是雙鏈體形式，第n-1熒光發(fā)射FE(n-l)是在測(cè)量溫度MT(n_l)獲得的，在所述測(cè)量溫度MT(n-l)，第(n-1)探針的多于50%是雙鏈體形式，第η熒光發(fā)射FEn是在測(cè)量溫度 MTn獲得的，在所述測(cè)量溫度ΜΤη，第η探針的多于80%是雙鏈體形式，以及可選地，熒光發(fā)射FEO是在測(cè)量溫度MTO獲得的，在所述測(cè)量溫度ΜΤ0，第一探針的不多于10%是雙鏈體形式，其中η是正整數(shù)并且η彡2，其中所述步驟(b)還包括逐循環(huán)確定針對(duì)每個(gè)探針的熒光發(fā)射的實(shí)際消耗量(ACA) 的步驟( )，其中第k探針的熒光發(fā)射的所述實(shí)際消耗量以ACAk描述，其中所述第k探針在特定測(cè)量溫度(MTa)具有百分比為(dSka)%的ds (雙鏈)形式，在該測(cè)量溫度Ma由所述第k探針貢獻(xiàn)的所述熒光發(fā)射FEa將是(dska) % * (ACAk)，由所述第η探針貢獻(xiàn)的將是 (dsna) % *(ACAn)，其中實(shí)際消耗量(ACA)的計(jì)算使用以下公式在測(cè)量溫度Ma，總熒光發(fā)射將是FEa = (ACAl)*(dsla) % + (ACA2)*(ds2a) % + (ACA3)*(ds3a) %…+ (ACAn)*(dsna) %在測(cè)量溫度Mb，總熒光發(fā)射將是FEb = (ACAl)*(dslb) % + (ACA2)*(ds2b) % + (ACA3)*(ds3b) %…+ (ACAn)*(dsna) %在測(cè)量溫度MTc，總熒光發(fā)射將是FEc = (ACAl)*(dslc) % + (ACA2)*(ds2c) % + (ACA3)*(ds3c) %…+ (ACAn)*(dsna) %其余類推，其中針對(duì)每個(gè)探針的所述ACA可以從以上公式計(jì)算，其中“*”表示“乘以”， “k”是正整數(shù)，1彡k彡n，并且“η”是探針的數(shù)目，其中每個(gè)探針的熒光發(fā)射的所述實(shí)際消耗量是通過計(jì)算機(jī)程序獲得，所述計(jì)算機(jī)程序在每個(gè)循環(huán)在每個(gè)測(cè)量溫度進(jìn)行計(jì)算，并且其中每個(gè)探針的熒光發(fā)射的所述實(shí)際消耗量與所述靶核酸的擴(kuò)增程度相關(guān)，所述靶核酸與該探針結(jié)合。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中探針的所述消耗是通過所述探針的所述第一寡核苷酸與所述靶序列的雜交來實(shí)現(xiàn)的，接下來是所述探針的所述第一寡核苷酸整合入擴(kuò)增產(chǎn)物，其中當(dāng)所述探針的所述第一寡核苷酸可以被整合入所述擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，所述第一寡核苷酸是可延伸的引物或者是所述正向/反向寡核苷酸引物對(duì)之一。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中探針的所述消耗是通過所述探針的所述第一寡核苷酸與所述靶序列的雜交來實(shí)現(xiàn)的，接下來是所述探針的第一和/或第二寡核苷酸的降解，其中當(dāng)所述探針的所述第一寡核苷酸在所述反應(yīng)期間被降解，所述反應(yīng)混合物包括雙鏈依賴的核酸酶活性。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針包括第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物，其中所述第一標(biāo)記物是熒光基團(tuán)，并且所述第二標(biāo)記物是淬滅劑，反之亦然。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一標(biāo)記物被附接至所述第一寡核苷酸， 并且所述第二標(biāo)記物被附接至所述第二寡核苷酸，使得當(dāng)所述探針的內(nèi)部雙鏈體形成時(shí)， 所述第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物是非常接近的。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中標(biāo)記物在所述探針的一個(gè)寡核苷酸上，所述一個(gè)寡核苷酸或者是所述第一寡核苷酸，或者是所述第二寡核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述探針的所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物， 并且所述探針的所述第二寡核苷酸包括至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)標(biāo)記物，其中所述第二寡核苷酸包括第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物，所述第一標(biāo)記物被附接在或靠近第二寡核苷酸的一端， 并且所述第二標(biāo)記物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，從而當(dāng)所述第二寡核苷酸不與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)，所述第二寡核苷酸是無規(guī)卷曲或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)使得所述第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物非常接近。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，并且所述第二寡核苷酸包括標(biāo)記物，其中，當(dāng)所述第二寡核苷酸雜交至所述第一寡核苷酸以形成所述探針的所述雙鏈部分時(shí)，所述標(biāo)記物能夠改變相對(duì)于單鏈形式的所述第二寡核苷酸的發(fā)射的信號(hào)發(fā)射。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述探針的所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物， 并且其中所述探針包括兩個(gè)第二寡核苷酸，所述兩個(gè)第二寡核苷酸能夠鄰近地或基本上鄰近地雜交至所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域的不同部位，其中所述第二寡核苷酸中的一個(gè)是與第一標(biāo)記物附接的，并且另一個(gè)第二寡核苷酸是與第二標(biāo)記物附接的，使得當(dāng)所述兩個(gè)第二寡核苷酸雜交至所述第一寡核苷酸時(shí)，使得所述兩個(gè)標(biāo)記物非常接近，并且一個(gè)標(biāo)記物影響來自另一個(gè)標(biāo)記物的信號(hào)。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中探針的所述第一和第二寡核苷酸通過包括核苷酸的連接部分或者非核苷酸的化學(xué)連接部分連接，允許所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述第一和第二寡核苷酸是分別用第一和第二標(biāo)記物來標(biāo)記，使得當(dāng)所述探針形成內(nèi)部莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，使得所述標(biāo)記物非常接近，并且一個(gè)標(biāo)記物影響來自另一個(gè)標(biāo)記物的信號(hào)。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第一區(qū)域與所述第一寡核苷酸的第二區(qū)域基本上不重疊。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第一區(qū)域與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上重疊，或者所述第二區(qū)域嵌入所述第一區(qū)域， 其中所述第一寡核苷酸與所述靶序列雜交的所述雙鏈體的Tm比所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雜交的所述雙鏈體的Tm更高，使得如果靶存在，所述第一寡核苷酸與所述靶形成比所述第一 /第二寡核苷酸雙鏈體更強(qiáng)的雜交體，并且因此在更高的溫度熔解。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包括第三區(qū)域，所述第三區(qū)域與用于所述擴(kuò)增反應(yīng)的引物的序列等同或基本上等同。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中探針的所述第一和第二寡核苷酸兩者均能夠在擴(kuò)增期間被消耗。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸在3’末端被封閉，并且其中所述第二寡核苷酸在3’末端被封閉。
25.一種用于針對(duì)靶核酸上一個(gè)或更多個(gè)變異的核苷酸的檢驗(yàn)樣品的方法，所述方法包括(a)將包括靶核酸的樣品與反應(yīng)混合物接觸，所述反應(yīng)混合物包括(i) 一對(duì)或更多對(duì)正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一個(gè)或更多個(gè)靶核酸存在于所述樣品中，所述引物對(duì)能夠擴(kuò)增所述一個(gè)或更多個(gè)靶核酸，( )至少一對(duì)探針，其中所述一對(duì)探針中的第一探針包括與野生型靶核酸序列互補(bǔ)的序列，所述一對(duì)探針中的第二探針包括與含有變異核苷酸的靶核酸序列互補(bǔ)的序列，其中所述一對(duì)探針中的每個(gè)探針包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中所述一對(duì)探針中的每個(gè)探針包括相同的第二寡核苷酸，其中每個(gè)探針包括可檢測(cè)的標(biāo)記物或者可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物或可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)表征該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在，并且其中所述探針中的至少兩個(gè)包括相同的可檢測(cè)標(biāo)記物或者具有不可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同的可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中這樣的探針中的每個(gè)的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解特征是不同的；(b)在所述樣品/反應(yīng)混合物上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中，當(dāng)靶核酸存在時(shí)，與該靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)的探針的所述第一寡核苷酸在擴(kuò)增期間被消耗，以及(C)通過檢測(cè)來自在未被消耗的探針中的所述標(biāo)記物的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)作為溫度的函數(shù)，至少測(cè)量一次所述反應(yīng)混合物中的所述未被消耗的探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解圖譜，其中所述熔解圖譜提供在所述樣品/擴(kuò)增反應(yīng)混合物中是否至少一個(gè)靶核酸已被擴(kuò)增的指征。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述一對(duì)探針中所述相同的寡核苷酸包括通用堿基或與所述靶核酸序列中的所述變異的核苷酸對(duì)應(yīng)的肌苷，其中所述通用堿基是3-硝基吡咯2’ -脫氧核苷、5-硝基吲哚、嘧啶類似物或嘌呤類似物。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中不同探針的多個(gè)第一寡核苷酸雜交至靶序列的同一鏈的不同位點(diǎn)。
28.一種用于與根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法一起使用的計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)品， 當(dāng)在合適的數(shù)據(jù)處理裝置上運(yùn)行時(shí)，用于比較探針的熔解圖譜和/或定量多個(gè)靶的實(shí)時(shí) PCR擴(kuò)增，當(dāng)被計(jì)算機(jī)處理器執(zhí)行時(shí)，所述計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)品使用以下公式進(jìn)行實(shí)際消耗量 (ACA)的計(jì)算在測(cè)量溫度Ma，總熒光發(fā)射將是FEa = (ACAl)*(dsla) % + (ACA2)*(ds2a) % + (ACA3)*(ds3a) % — + (ACAn)*(dsna) % 在測(cè)量溫度Mb，總熒光發(fā)射將是FEb = (ACAl)*(dslb) % + (ACA2)*(ds2b) % + (ACA3)*(ds3b) % — + (ACAn)*(dsna) % 在測(cè)量溫度MTc，總熒光發(fā)射將是FEc = (ACAl)*(dslc) % + (ACA2)*(ds2c) % + (ACA3)*(ds3c) %…+ (ACAn)*(dsna) % 其余類推，其中針對(duì)每個(gè)探針的所述ACA可以從以上公式計(jì)算，其中“*”表示“乘以”， “k”是正整數(shù)，1≤k≤n，并且“η”是探針的數(shù)目。
29.一種包括計(jì)算機(jī)內(nèi)存的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，所述計(jì)算機(jī)內(nèi)存具有存儲(chǔ)在其中的計(jì)算機(jī)軟件程序，其中所述計(jì)算機(jī)軟件程序，當(dāng)被處理器執(zhí)行或在計(jì)算機(jī)中被執(zhí)行時(shí)，實(shí)現(xiàn)根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一所述的方法。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中所述計(jì)算機(jī)軟件程序?qū)崿F(xiàn)包括以下步驟的方法，所述步驟是在擴(kuò)增期間或在擴(kuò)增終點(diǎn)計(jì)算每個(gè)探針的熒光發(fā)射的實(shí)際消耗量和/ 或確定熔解圖譜的特征。
31.一種用于針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)靶核酸的檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括探針，所述探針包括15-150核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)4-150核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中每個(gè)探針包括可檢測(cè)的標(biāo)記物或者可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物或可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)表征該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在， 并且其中(a)所述探針的所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，所述第二寡核苷酸包括第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物，其中所述第一標(biāo)記物被附接在或靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二標(biāo)記物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，從而當(dāng)所述第二寡核苷酸不與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)，所述第二寡核苷酸是無規(guī)卷曲的或者是莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)使得所述第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物非常接近，并且其中當(dāng)所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)，所述兩個(gè)標(biāo)記物被保持遠(yuǎn)離彼此；或者(b)所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，并且所述第二寡核苷酸包括標(biāo)記物，其中，當(dāng)所述第二寡核苷酸雜交至所述第一寡核苷酸以形成所述探針的所述雙鏈部分時(shí)，相對(duì)于當(dāng)為單鏈形式的所述第二寡核苷酸時(shí)所述標(biāo)記物的所述發(fā)射，所述標(biāo)記物能夠改變所述標(biāo)記物的可檢測(cè)信號(hào)發(fā)射；或者(c)所述探針的所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，所述探針包括兩個(gè)第二寡核苷酸，所述兩個(gè)第二寡核苷酸能夠鄰近地或基本上鄰近地雜交至所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域的不同部分，其中所述第二寡核苷酸中的一個(gè)與第一標(biāo)記物附接，并且另一個(gè)第二寡核苷酸與第二標(biāo)記物鏈接，使得當(dāng)所述兩個(gè)第二寡核苷酸雜交至所述第一寡核苷酸時(shí)，使得所述兩個(gè)標(biāo)記物非常接近，并且一個(gè)標(biāo)記物影響來自另一個(gè)標(biāo)記物的信號(hào)。
32. 一種用于針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)靶核酸的檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括含有兩個(gè)或更多個(gè)探針的探針混合物，其中每個(gè)探針包括15-150核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與一個(gè)靶核酸的一部分基本上互補(bǔ)，以及至少一個(gè)4-150核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域，使得所述第一和第二寡核苷酸能夠形成雙鏈部分，其中每個(gè)探針包括可檢測(cè)的標(biāo)記物或者可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物或可檢測(cè)的標(biāo)記物的組合能夠產(chǎn)生可變的信號(hào)，所述可變的信號(hào)表征該探針的所述第一和第二寡核苷酸之間的雙鏈部分的存在或不存在， 并且其中(a)所述第一標(biāo)記物被附接至所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域，并且所述第二標(biāo)記物被附接到所述第二寡核苷酸的區(qū)域，所述第二寡核苷酸的所述區(qū)域與所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域互補(bǔ)，使得當(dāng)所述探針的內(nèi)部雙鏈體形成時(shí)，使得所述第一和第二標(biāo)記物非常接近；或者(b)所述探針的所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，所述第二寡核苷酸包括第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物，其中所述第一標(biāo)記物被附接在或者靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二標(biāo)記物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，從而當(dāng)所述第二寡核苷酸不與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)，所述第二寡核苷酸是無規(guī)卷曲的或者是莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)使得所述第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物非常接近，并且其中當(dāng)所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交時(shí)，所述兩個(gè)標(biāo)記物被保持遠(yuǎn)離彼此；或者(C)所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，并且所述第二寡核苷酸包括標(biāo)記物，其中當(dāng)所述第二寡核苷酸雜交至所述第一寡核苷酸以形成所述探針的所述雙鏈部分時(shí)，相對(duì)于當(dāng)為單鏈形式的所述第二寡核苷酸時(shí)所述標(biāo)記物的所述發(fā)射，所述標(biāo)記物能夠改變所述標(biāo)記物的可檢測(cè)信號(hào)發(fā)射；或者(d)所述探針的所述第一寡核苷酸不包括標(biāo)記物，所述探針包括兩個(gè)第二寡核苷酸，所述兩個(gè)第二寡核苷酸能夠鄰近地或基本上鄰近地雜交至所述第一寡核苷酸的所述第二區(qū)域的不同部位，其中所述第二寡核苷酸中的一個(gè)與第一標(biāo)記物附接，并且另一個(gè)第二寡核苷酸與第二標(biāo)記物附接的，使得當(dāng)所述兩個(gè)第二寡核苷酸雜交至所述第一寡核苷酸時(shí)，使得所述兩個(gè)標(biāo)記物非常接近，并且一個(gè)標(biāo)記物影響來自另一個(gè)標(biāo)記物的信號(hào)；或者(e)探針的所述第一和第二寡核苷酸通過包括核苷酸的連接部分或者非核苷酸的化學(xué)連接部分接合，允許所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述第一和第二寡核苷酸分別用第一和第二標(biāo)記物標(biāo)記，使得當(dāng)所述探針形成內(nèi)部莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，使得所述標(biāo)記物非常接近，并且一個(gè)標(biāo)記物影響來自另一個(gè)標(biāo)記物的信號(hào)；并且其中所述探針中的至少兩個(gè)包括相同的可檢測(cè)標(biāo)記物或者具有不可區(qū)分的發(fā)射光譜的不同的可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中這樣的探針中的每個(gè)的所述第一和第二寡核苷酸之間的所述雙鏈部分的熔解特征是不同的。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中至少一個(gè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的(a)或(c)部分或權(quán)利要求32的(a)、(b)、(d)或(e)部分所述的試劑盒，其中所述探針包括第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述第一標(biāo)記物是熒光基團(tuán)并且所述第二標(biāo)記物是淬滅劑，或者反之亦然。
36.如權(quán)利要求31的(a)-(c)部分的任一所定義的探針，權(quán)利要求32的探針混合物在如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所定義的方法中的應(yīng)用。
37.基本上如此處所描述和/或參照實(shí)施例的根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及多重?cái)U(kuò)增的領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及在單次反應(yīng)中，基于引物和/或探針的不同熔解溫度或熔解圖譜，檢測(cè)一份樣品中一種或更多種目標(biāo)(靶)核酸的方法。本發(fā)明還提供了用于此類方法的探針和試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102171366SQ200980138727
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者富國(guó)良 申請(qǐng)人:奧西泰克有限公司