專利名稱：用于檢測癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用CAPRIN-I作為腫瘤標(biāo)記物的癌的檢測方法。
背景技術(shù)：
癌是死亡的主要原因。目前對癌進(jìn)行的治療主要是以手術(shù)療法為主、組合使用放射療法和化學(xué)療法的對癥療法。目前隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，如果能夠早期檢測的話則癌幾乎是可治愈的疾病。因此，需要一種無需癌患者付出太多體力或經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的，能夠使用血清或尿等簡便地進(jìn)行檢查的癌的檢測方法。作為使用血液或尿的癌診斷方法，測定腫瘤標(biāo)記物等腫瘤生產(chǎn)物的方法目前已變得很普及。所謂腫瘤生產(chǎn)物是指與腫瘤相關(guān)的抗原、酶、特定蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、腫瘤基因、 腫瘤基因產(chǎn)物及腫瘤抑制基因等，癌胚抗原CEA、糖蛋白質(zhì)CA19-9、CA125、前列腺特異抗原 PSA、在甲狀腺中產(chǎn)生的肽類激素降鈣素等在一些癌類型中作為腫瘤標(biāo)記物被用于癌診斷。 但是在多種癌中，不存在對癌診斷有用的腫瘤標(biāo)記物。另外，目前所知的大部分腫瘤標(biāo)記物僅以痕量(約為pg/mL級程度)存于體液中。所以為了檢測此類標(biāo)記物需要高靈敏度的測定方法或特殊的技術(shù)。在這種現(xiàn)狀中，預(yù)期提供能夠以簡便操作方法高靈敏度地檢測各種癌類型的新型癌檢查方法，從而產(chǎn)生用于各種癌的診斷用途。另外，如果不僅能夠檢測癌，還能夠?qū)υ谌庋劭床灰姷牟糠之a(chǎn)生的癌進(jìn)行診斷、進(jìn)行癌的程度診斷、癌的惡性程度或術(shù)后追蹤診斷、復(fù)發(fā)診斷、轉(zhuǎn)移診斷等，那么將非常有用。具體而言，如果能夠?qū)υ谌庋劭床灰姷牟课划a(chǎn)生的癌進(jìn)行診斷，則對腹腔內(nèi)等不易察覺部位的癌的早期檢測來說有用。另外，可檢測對尚未達(dá)到肉眼能確認(rèn)程度的大小的腫瘤的情形下，即使通過超聲波檢查、CT (計算機(jī)化斷層顯像)或MRI (核磁共振成像)也不能發(fā)現(xiàn)的癌。另外，基于腫瘤在原發(fā)部位的擴(kuò)散程度以及向局部淋巴結(jié)、遠(yuǎn)位器官的轉(zhuǎn)移的有無來分類癌的進(jìn)展程度。通常，有5個疾病階段(每一個稱為“階段”)，階段數(shù)字越大表明癌的更晚期。嚴(yán)格來說，階段的定義根據(jù)器官而不同。然而，例如病期0的癌是指存留在上皮內(nèi)的癌，病期IV是指遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移的癌。在發(fā)現(xiàn)了這種癌程度的情況下，可以決定適合的治療方針，以及診斷抗癌劑治療效果。作為決定治療方針的具體例子，在前列腺癌等的情況下，存在無需治療的類型，因?yàn)樗鼈儛盒猿潭确浅５筒⑶一静话l(fā)展。反之，也存在需要治療的類型，因?yàn)樗鼈兪且鹣蚬堑绒D(zhuǎn)移、伴隨疼痛直至患者死亡的進(jìn)行性癌。諸如激素療法及摘除手術(shù)等的治療分別伴隨著副作用。因此，需要適當(dāng)判斷并決定治療方法。另外，如果能夠適當(dāng)?shù)嘏袛嗫拱﹦┑倪x擇是否適合，或適當(dāng)?shù)嘏袛嘟Y(jié)束施與抗癌劑的時機(jī)等，則還可以減輕患者體力上、經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。因此，能夠診斷癌進(jìn)展程度是重要的。癌細(xì)胞的特征之一是它們進(jìn)行幼化，即去分化。除去一部分癌類型，低分化或者未分化等分化度低的癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移后迅速生長并且導(dǎo)致治療預(yù)后不良。我們說這種癌的惡性程度高。相反，具有高分化度的高分化的癌細(xì)胞中保留受影響器官的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)?？梢哉f此類癌具有相對低的惡性程度。如果能明確這種癌的惡性程度，則可以采取以下考量。即使腫瘤小，但如果惡性程度高，則在摘除腫瘤時可以確保多些邊緣。此外，在關(guān)注周圍組織的較大范圍時能進(jìn)行追蹤觀察。如果能夠進(jìn)行包括復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的術(shù)后追蹤，則可以診斷能否通過手術(shù)完全摘除腫瘤。未完全腫瘤摘除時很可能引起復(fù)發(fā)。因此，此類診斷可以提供以短的間隔更仔細(xì)地進(jìn)行追蹤觀察、或需要時盡早再次進(jìn)行手術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。另外，如果復(fù)發(fā)的話，能夠早期發(fā)現(xiàn)的可能性也高。在遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移發(fā)生時發(fā)現(xiàn)往往檢測已晚。然而，如果能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移診斷，則可能提供將檢查范圍擴(kuò)大至除摘除部位及其周邊之外區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)。已知犬比人變老快7倍。最近，陪伴動物通常作為家族的一員被飼養(yǎng)，并且具有與飼養(yǎng)人相同的生活習(xí)慣。因此，當(dāng)其陪伴動物患癌時，可以預(yù)測飼養(yǎng)人將來患癌的危險性高。如果能夠簡便且正確對陪伴動物進(jìn)行癌診斷，則期待能提供預(yù)防飼養(yǎng)人患癌的線索?，F(xiàn)在，據(jù)說犬的飼養(yǎng)數(shù)在日本約為6，700, 000只，另外美國約為17，640，000只。除接種狂犬病育苗之外通常接種5種、7種、8種等混合疫苗也較為普及，因此致死率高的感染癥已經(jīng)減少，諸如犬細(xì)小病毒感染、犬瘟熱病毒感染、犬副流感(犬舍咳)、犬腺病毒II型感染癥(犬舍咳)、犬傳染性肝炎、犬冠狀病毒感染以及鉤端螺旋體病等。因此，犬的平均壽命延長。7歲以上的高齡犬占全部飼養(yǎng)狗數(shù)的35.5%。家犬死亡原因也與人的那些相同，諸如持續(xù)增加的癌、高血壓和心臟病。在美國1年間約有4，000，000只犬被診斷為癌。日本也有約1，600，000只潛在患有某種腫瘤的犬。但是，目前為止沒有簡便的動物用癌診斷藥。此外，動物醫(yī)療中還未普及利用X射線、CT掃描、MRI進(jìn)行攝影或照相等的檢查方法。觸診后，進(jìn)行簡單的血液檢查和利用X射線照相的檢查，診斷目前主要依賴于獸醫(yī)經(jīng)驗(yàn)。雖然使用血清的檢查方法也已經(jīng)部分地進(jìn)行，但由于還未發(fā)現(xiàn)犬的腫瘤標(biāo)記物所以該方法使用人的腫瘤標(biāo)記物。正確的癌診斷需要開腹手術(shù)，其給犬帶來很大的體力負(fù)擔(dān)、給飼養(yǎng)人帶來費(fèi)用負(fù)擔(dān)。如果能夠簡便地進(jìn)行犬及貓等陪伴動物的癌診斷，則能早期檢測或正確診斷癌，并且預(yù)期對陪伴動物的癌治療有用。另外，如果可以使用上述血清進(jìn)行簡便地癌診斷，則期待不僅能夠進(jìn)行癌診斷，還對定期健康診斷、手術(shù)前診斷及決定治療方針等具有巨大貢獻(xiàn)。陪伴動物尚未普及像人那樣的健康檢查。所以癌在很多情況下發(fā)現(xiàn)較晚，使得腫瘤變大飼養(yǎng)人才開始注意并入院就診。該變大的腫瘤為惡性時，很多情況下即使進(jìn)行了手術(shù)等外科療法或應(yīng)用抗癌劑的藥物等，治療也已經(jīng)為時過晚。因此，通常獸醫(yī)在判斷為惡性時不進(jìn)行手術(shù)而進(jìn)行抗癌劑治療。如果進(jìn)行手術(shù)，也需要嚴(yán)格實(shí)施確保邊緣的大小及手術(shù)中血液、細(xì)胞飛散對策等手術(shù)中的對策。最好手術(shù)后立即開始抗癌劑治療，以短的間隔進(jìn)行追蹤觀察。如果將上述癌診斷合并到最近日漸普及的且稱為用于犬的完全醫(yī)學(xué)檢查的犬健康檢查，則期待可導(dǎo)致早期檢測。另一方面，在良性腫瘤的情況下，即使腫瘤較大也可以進(jìn)行手術(shù)。手術(shù)后只需要護(hù)理切除部分，不必進(jìn)行昂貴的抗癌劑治療，追蹤觀察中也不必緊張。在當(dāng)前情況下，提供可以適用于動物癌診斷的、高靈敏度且簡便的癌檢測方法，則使得可進(jìn)行正確且有效的治療，這給飼養(yǎng)人和獸醫(yī)都帶來了很多好處。胞質(zhì)和增殖相關(guān)蛋白I(CAPRIN-I)是當(dāng)靜止期的正常細(xì)胞被活化或發(fā)生細(xì)胞分裂時表達(dá)的胞內(nèi)蛋白。CAPRIN-I還已知涉及例如通過細(xì)胞中RNA形成胞內(nèi)應(yīng)激顆粒調(diào)節(jié)的 mRNA運(yùn)輸、以及翻譯控制。同時，CAPRIN-I具有不同的名稱。此類名稱的實(shí)例包括GPI錨定的膜蛋白1和膜組分表面標(biāo)記1蛋白(MllSl)，似乎這一蛋白被認(rèn)為是膜蛋白。這些不同的名稱源自這樣的報告CAPRIN-1基因序列最初具有GPI結(jié)合區(qū)并且CAPRIN-I是在大腸癌細(xì)胞中表達(dá)的膜蛋白(J. Biol. Chem. , 270 :20717-20723,1995) 0后來報導(dǎo)了該報告中描述的CAPRIN-I基因序列是不正確的；1個核苷酸從GenBank等中目前登記的CAPRIN-I 基因序列中的缺失造成移碼，因而導(dǎo)致80個氨基酸從C端缺失，并且因而所得的人為產(chǎn)物 (74個氨基酸)是前述報告中所提及的GPI結(jié)合區(qū)；并且在該序列的5’側(cè)也存在錯誤，由此導(dǎo)致53個氨基酸從N端缺失(J. Immunol.，172 =2389-2400, 2004)。此外，已經(jīng)報道了由 GenBank等中目前所登記CAPRIN-I基因序列編碼的蛋白質(zhì)不是細(xì)胞膜蛋白(J. Immunol.， 172 :2389-2400,2004)。此外，基于J. Biol. Chem.，270 :20717-20723(1995)對 CAPRIN-1 是細(xì)胞膜蛋白的報告，US 2008/0075722和WO 2005/100998公開了名為MllSl的CAPRIN-I作為細(xì)胞膜蛋白可作為癌治療的靶(實(shí)施例中沒有提及)。然而，如J. Immunol.，172 =2389-2400(2004) 中所報道的那樣，從US2008/0075722和W02005/100998申請以來直到現(xiàn)在，一般認(rèn)為 CAPRIN-I不表達(dá)在細(xì)胞表面。顯然僅基于不正確信息即CAPRIN-I是細(xì)胞膜蛋白的US 2008/0075722和WO 2005/100998的公開內(nèi)容不應(yīng)當(dāng)理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識。 此外，從未有CAPRIN-I在乳腺癌細(xì)胞等中比在正常細(xì)胞中以更高水平表達(dá)的報道。發(fā)明概述本發(fā)明待解決的技術(shù)問題。本發(fā)明的目的在于提供在癌的診斷中有用的癌的檢測手段。解決該問題的手段通過深入的研究，通過SEREX方法，應(yīng)用衍生自犬睪丸組織的cDNA文庫和來自患乳腺癌的狗的血清，本發(fā)明人已經(jīng)獲得了編碼與存在于帶癌活生物來源血清中的抗體相結(jié)合的蛋白質(zhì)的cDNA，并且基于該cDNA，他們制備了具有SEQ ID NO :6、8、10、12和14所示氨基酸序列的犬CAPRIN-I多肽?；谂c所獲得基因同源的人基因，本發(fā)明人還制備了具有 SEQ ID NO 2和4所示氨基酸序列的人CAPRIN-I多肽。此外，本發(fā)明發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)編碼這些蛋白質(zhì)的基因在犬和人睪丸及惡性癌細(xì)胞中特異性表達(dá)(參見實(shí)施例1)；基于這些蛋白質(zhì)氨基酸序列制備的重組多肽僅與來自帶癌活體的血清特異性反應(yīng)；以及利用使用該重組多肽制備的抗體，可以從帶癌活體中特異性檢測出CAraiN-Ι。由此，從而完成了本申請發(fā)明。具體地，本發(fā)明提供一種癌的檢測方法，所述方法是針對從生物體中分離的試樣所進(jìn)行，包括測定CAPRIN-I的表達(dá)。此外，本發(fā)明還提供了用于檢測癌的試劑，其包含在體內(nèi)被誘導(dǎo)的抗CAPRIN-I抗體，以及進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的多肽。此外，本發(fā)明提供了用于檢測癌的試劑，其包含與CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體，或其抗原結(jié)合片段。此外，本發(fā)明提供了用于檢測癌的試劑，其包含與序列表中SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13等所示核苷酸序列中15個或更多個核苷酸、優(yōu)選20至25個或更多個核苷酸、以及更優(yōu)選30或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。具體地，本發(fā)明具有以下特征(1)癌檢測方法，包括測定從生物體分離的樣本中通過抗原抗體反應(yīng)而與抗 CAPRIN-I蛋白抗體具有結(jié)合反應(yīng)性的多肽的表達(dá)，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有序列表
6中偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30所示的任一氨基酸序列。(2)根據(jù)上述(1)的方法，其中待測定的多肽是具有偶數(shù)編號的SEQ IDNO 2-30(即，SEQ ID NO :2、4、6、8、... 30)所示任一氨基酸序列的CAPRIN-I蛋白，或與該 CAPRIN-I蛋白具有85%或更多序列同一性的多肽。(3)根據(jù)上述⑴或(2)的方法，其中所述的生物體是人、狗或貓。(4)根據(jù)上述(3)的方法，其中所述的生物體是狗，并且所述待測定的多肽具有偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。(5)根據(jù)上述的方法，其中所述的生物體是狗，并且所述待測定的多肽具有 SEQ ID NO :6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。(6)根據(jù)上述(3)的方法，其中所述的生物體是人，并且所述待測定的多肽具有 SEQ ID NO :2或4所示的氨基酸序列。(7)根據(jù)上述(1)至(6)任一項(xiàng)的方法，其中通過抗體的免疫測定法測定所述多肽的表達(dá)，其中所述抗體可包含于樣本中并且是在體內(nèi)針對待測多肽而被誘導(dǎo)的。(8)根據(jù)上述⑴至(7)任一項(xiàng)的方法，其中所述的樣本是血清、血漿、腹水或胸腔積液。(9)根據(jù)上述(1)至(6)任一項(xiàng)的方法，其中通過測定樣本中所包含的編碼該多肽的mRNA來測定所述多肽的表達(dá)。(10)根據(jù)上述(9)的方法，包括應(yīng)用與上述mRNA核苷酸序列中15個或更多個核苷酸、優(yōu)選20至25個或更多個核苷酸、以及更優(yōu)選30或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸檢測樣本中所述mRNA的存在量。(11)根據(jù)上述(10)的方法，其中所述生物體是狗，并且上述多核苷酸是與SEQ ID NO :5、7、9、11或13所示核苷酸序列中15個或更多個核苷酸、優(yōu)選20至25個或更多個核苷酸、以及更優(yōu)選30或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。(12)根據(jù)上述(10)的方法，其中所述生物體是人，并且上述多核苷酸是與SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列中15個或更多個核苷酸、優(yōu)選20至25個或更多個核苷酸、以及更優(yōu)選30或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。(13)根據(jù)上述(9)至(1 任一項(xiàng)的方法，其中上述樣本是組織或細(xì)胞。(14)根據(jù)上述(1)至(13)任一項(xiàng)的方法，其中所述的癌是選自以下的至少一種類型腦腫瘤，頭、頸、肺、子宮或食管的鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤，肺或子宮的腺癌、腎癌、惡性混合瘤、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、棘皮瘤樣牙齦瘤、口腔瘤、肛門周圍腺癌、肛囊瘤、肛囊頂泌腺癌、Sertoli細(xì)胞癌、陰道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔內(nèi)腺癌、鼻腺癌、甲狀腺癌、大腸癌、支氣管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、組織細(xì)胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大細(xì)胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹膜內(nèi)平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、胃腸淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小細(xì)胞至中細(xì)胞淋巴瘤、腎上腺髓質(zhì)瘤、顆粒細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤。(15)根據(jù)上述(1)至(14)任一項(xiàng)的方法，包括基于當(dāng)上述多肽的表達(dá)水平比對照高時則癌惡性程度高這一事實(shí)來進(jìn)一步檢測癌的惡性程度。(16)根據(jù)上述⑴至(15)任一項(xiàng)的方法，包括基于當(dāng)所述多肽的表達(dá)水平比對照
7高時則癌進(jìn)展程度是進(jìn)展的這一指示來進(jìn)一步檢測癌的進(jìn)展程度。(17)用于檢測癌的試劑，其包含與針對CAPRIN-I蛋白在體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過抗原抗體反應(yīng)具有結(jié)合反應(yīng)性的多肽，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有序列表中偶數(shù)編號的 SEQ ID NO :2-30所示的任一氨基酸序列。(18)用于檢測癌的試劑，其包含與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述多肽通過抗原抗體反應(yīng)與抗CAPRIN-I蛋白抗體具有結(jié)合反應(yīng)性并且所述多肽是在體內(nèi)(或在生物體中)產(chǎn)生的，其中所述CAPRIN-I蛋白具有序列表中偶數(shù)編號的 SEQ ID NO :2-30所示的任一氨基酸序列。(19)根據(jù)上述(18)的用于檢測癌的試劑，其中所述的與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段是與癌細(xì)胞表面結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。(20)根據(jù)上述(18)或(19)的用于檢測癌的試劑，其中所述的與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段與包含除SEQ ID NO 6和18之外偶數(shù)編號的SEQ ID NO 2至30所示任一氨基酸序列的氨基酸殘基編號50-98或氨基酸殘基編號233-305的區(qū)域中7個或更多個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽，或包含上述多肽為部分序列的多肽具有免疫學(xué)反應(yīng)性。(21)根據(jù)(18)-(20)任一項(xiàng)的用于檢測癌的試劑，其中所述的與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段是與SEQ ID NO :43結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，具有 SEQ ID NO :44和45的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID N0:44和 46的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :44和47的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :44和48的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :49和50的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段， 具有SEQ ID NO :51和52的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO 53和M的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID N0:55和56的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO 57和58的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，或具有SEQ ID NO 59和60的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。(22)用于檢測癌的試劑，其包含與序列表中奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1_29(即，SEQ ID N0:l、3、5、7、..29)所示任一核苷酸序列中15個或更多個核苷酸、優(yōu)選20至25個或更多個核苷酸、以及更優(yōu)選30或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，提供了癌檢測的新方法。如在以下給出的實(shí)施例中詳細(xì)描述的那樣， 基于CAPRIN-I (或也稱為Caprin-Ι)的氨基酸序列制備的重組多肽與特異性存在于癌患者血清中的抗體反應(yīng)。因此，在生物體中存在的癌可通過本發(fā)明的方法檢測樣本中的抗體而檢測出。此外，還可通過測定CAPRIN-I本身來檢測生物體中存在的癌。根據(jù)本發(fā)明的方法，可檢測肉眼不可見小尺寸癌或體內(nèi)深處的癌。因此，本發(fā)明的方法可用于在健康檢查等時間早期檢測癌。另外，通過在癌治療后在對患者的追蹤觀察中利用本發(fā)明的方法，還可以早期檢測出復(fù)發(fā)的癌。并且，根據(jù)本發(fā)明的方法，還可以進(jìn)行癌的進(jìn)展程度診斷，諸如腫瘤增大、對周圍組織的浸潤以及癌向淋巴結(jié)及遠(yuǎn)位器官的轉(zhuǎn)移。另外，惡性程度高的癌患者與惡性程度低的癌患者相比，其血清抗體水平更高。根據(jù)本發(fā)明的方法，還可以診斷癌的惡性程度。此外，如以下實(shí)施例所述，編碼CAPRIN-I的mRNA在睪丸和癌細(xì)胞中特異性高水平表達(dá)。因此，還可通過測定該mRNA檢測癌。附圖簡述

圖1顯示了編碼CAPRIN-I蛋白的基因在正常組織和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)模式。參考編號1表示編碼CAPRIN-I蛋白的基因的表達(dá)模式。參考編號2表示GAPDH基因的表達(dá)模式。圖2顯示了通過考馬斯染色法檢測犬CAPRIN-I衍生多肽的結(jié)果，所述多肽是本發(fā)明中使用的多肽一個實(shí)例，其由實(shí)施例中的大腸桿菌產(chǎn)生并經(jīng)純化的。參考編號3表示犬 CAPRIN-I衍生多肽的條帶。圖3顯示了使用實(shí)施例中制備的犬CAPRIN-I衍生多肽對帶癌犬的癌診斷結(jié)果的一部分。圖4顯示了使用實(shí)施例中制備的犬CAPRIN-I衍生多肽對帶癌犬的癌詳細(xì)診斷結(jié)果的一部分。實(shí)施本發(fā)明的最佳方案根據(jù)發(fā)明的方法，使用從生物體分離樣本測定CAPRIN-I的表達(dá)。測定CAPRIN-I 表達(dá)的方法的實(shí)例包括包括對樣本中含有的抗CAPRIN-I抗體進(jìn)行免疫測定的方法(第1 方法)；包括對樣本中含有的CAPRIN-I本身進(jìn)行免疫測定的方法(第2方法)；及包括測定樣本中含有的編碼CAPRIN-I的mRNA的方法(第3方法)。本發(fā)明的方法中，可以采用上述任一種方法測定CAPRIN-I的表達(dá)。在本發(fā)明中，術(shù)語“測定”是指檢測、定性檢測、定量檢測及半定量檢測中的任一種。SEQ ID NO :6、8、10、12或14所示的氨基酸序列是犬CAPRIN-1的氨基酸序列。犬 CAPRIN-I具有這樣的氨基酸序列，即通過SEREX方法，應(yīng)用衍生自犬睪丸組織的cDNA文庫以及來自帶癌犬的血清，作為能與特異性地存在于來自帶瘤犬的血清中的抗體結(jié)合的多肽而鑒定的序列(見實(shí)施例1)。具體而言，針對具有SEQ ID NO :6、8、10、12或14所示氨基酸序列的CAPRIN-I的抗體在帶瘤犬中在體內(nèi)被特異性地誘導(dǎo)。因此，可應(yīng)用上述第1方法， 通過測定上述針對具有SEQ ID NO :6、8、10、12或14所示氨基酸序列的CAPRIN-I的抗體來檢測犬癌(參見實(shí)施例3和4)。還可應(yīng)用上述第2方法，通過測定SEQ ID N0:6、8、10、12 或14所示的作為抗原的CAPRIN-I本身來檢測犬癌(參見實(shí)施例5和6)。此外，如以下實(shí)施例所述，可通過測定編碼CAPRIN-I的mRNA來檢測犬癌，因?yàn)樵搈RNA在睪丸和癌細(xì)胞中以顯著高的水平表達(dá)(參見實(shí)施例1)。本文中使用的術(shù)語“具有氨基酸序列，，是指氨基酸殘基以所述順序進(jìn)行排列。因此，例如，表述“具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多肽”是指具有由SEQ ID NO :2所示的Met Pro Ser Ala...(中略)...Gln Gln ValAsn氨基酸序列組成的709個氨基酸殘基的多肽。另外，例如，還可將“具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多肽”簡稱為“SEQ ID NO :2的多肽”?！熬哂泻塑账嵝蛄小钡谋硎龇绞揭彩峭瑯拥摹Ｔ谶@一情況下，術(shù)語“具有” 可被表述“由......組成”替換。另外，本文所使用的術(shù)語“多肽”是指多個氨基酸通過形成肽鍵而形成的分子。此
9類分子的實(shí)例不僅包括具有大量組成氨基酸的多肽分子，還包括具有少量氨基酸的低分子量分子(寡肽)，及全長蛋白質(zhì)，本發(fā)明中還包括全長CAPRIN-I蛋白，其每一個具有SEQ ID NO 2-30中偶數(shù)序列ID所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的方法中，不僅是SEQ ID NO :6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1，其他哺乳動物的CAPRIN-I (下文中，還可能稱為犬CAPRIN-I的“同源物”。當(dāng)簡單地稱為“CAPRIN-1 ” 時，本文不僅包括來自狗的CAPRIN-I，還包括來自其他動物的CAPRIN-1)也用于進(jìn)行測定。 如以下實(shí)施例具體描述的那樣，編碼人CAPRIN-I的mRNA在人睪丸和癌細(xì)胞中以高水平顯著地表達(dá)，如SEQ ID NO :6、8、10、12或14的犬CAPRIN-I的情況一樣。然而，在健康人體中， 沒有檢測到抗人CAPRIN-I的抗體。此外，在健康貓科動物身體中沒有檢測到抗貓CAPRIN-I 的抗體，而是僅在帶癌貓中檢測到。因此，可通過測定哺乳動物中的CAPRIN-I表達(dá)檢測狗以外的哺乳動物的癌。本發(fā)明的方法的測定對象、除狗之外的哺乳動物的CAPRIN-I的實(shí)例包括但不限于人CAPRIN-I和貓科動物CAPRIN-I。編碼人CAPRIN-I的核苷酸序列及其氨基酸序列分別在序列表的SEQ IDNO :1和3，以及2和4所示。與犬CAPRIN-I的序列同一性就核苷酸序列而言是94%，以及就氨基酸序列而言是98%。即使遺傳上遠(yuǎn)距離的哺乳動物的犬和人也共享就CAPRIN-I氨基酸序列而言非常高的98%的序列同一性。因此，認(rèn)為犬和除人之外的哺乳動物，即犬CAPRIN-I及其同源物共享高達(dá)約85%或更高的序列同一性。因此，本發(fā)明方法測定其表達(dá)的CAPRIN-I與SEQ ID NO :6、8、10、12或14所示的犬CAPRIN-1 氨基酸序列優(yōu)選具有85%或高、以及更優(yōu)選95%或更高的序列同一性。在上述第1方法中，可以通過使用了與該抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗原性物質(zhì)的免疫測定法而容易地測定可存在于樣本中的上述抗體。免疫測定方法本身為公知的常用方法，如下詳述的那樣。作為免疫測定法的抗原物質(zhì)，例如可以使用在帶癌犬身體中誘導(dǎo)該抗體的，SEQ ID NO :6、8、10、12或14的犬CAPRIN-I。另外，抗體具有交叉反應(yīng)性。因此，即使實(shí)際為作為免疫原的抗原物質(zhì)之外的分子，但只要該分子上存在與免疫原的表位類似的結(jié)構(gòu)，則該分子也可以通過抗原抗體反應(yīng)與針對免疫原被誘導(dǎo)的抗體結(jié)合。特別地，來自哺乳動物的蛋白及來自其它哺乳動物的其同源物共享很高的氨基酸序列同一性，并且通常具有彼此類型的表位結(jié)構(gòu)。如下述實(shí)施例中的具體記載所示，SEQ ID N0:6、8、10、12或14的犬 CAPRIN-I，不僅在帶癌犬體內(nèi)與針對該犬CAraiN-I誘導(dǎo)的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，還在帶癌貓體內(nèi)與針對貓CAPRIN-I誘導(dǎo)的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。另外，人CAPRIN-I與帶癌犬體內(nèi)及帶癌貓體內(nèi)被誘導(dǎo)的上述抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。因此，在本發(fā)明的第1方法中，可以使用源自任一種哺乳動物CAPRIN-I作為免疫測定法的抗原。通常，當(dāng)抗原物質(zhì)是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和高分子量的蛋白質(zhì)等時，在分子上存在結(jié)構(gòu)不同的多個部位。因此，在生物體內(nèi)生產(chǎn)出能夠識別并結(jié)合此類抗原物質(zhì)不同位點(diǎn)的多種抗體。具體地，生物體內(nèi)針對諸如蛋白質(zhì)的抗原物質(zhì)產(chǎn)生的抗體，是作為多種抗體的混合物的多克隆抗體。本申請發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的抗體也是多克隆抗體。其特異性存在于源自帶癌活體的血清中的，與重組CAPRIN-I蛋白通過抗原抗體反應(yīng)而特異性結(jié)合。本發(fā)明所使用的術(shù)語“多克隆抗體”是指在源自體內(nèi)含有抗原物質(zhì)的活體的血清中存在的抗體，并且是在體內(nèi)針對該抗原物質(zhì)被誘導(dǎo)的抗體。作為用于免疫測定帶癌活動物中特異性抗體的抗原，在下述實(shí)施例中，制備SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :8 (犬 CAPRIN-1)的多肽，以及 SEQ IDNO :2 (人 CAPRIN-1)的多肽。確認(rèn)這些多肽與源自帶癌活體的血清中上述抗體的反應(yīng)性。但是，由于上述抗體為多克隆抗體，所以其天然地與由SEQID NO :6、8或2的同源物組成的多肽結(jié)合。即使在所述多肽的片段的情況下，由于所述多克隆抗體中可以含有能夠識別相關(guān)片段的結(jié)構(gòu)的抗體，所以仍然可以與源自帶癌活體的血清中含有的上述抗體結(jié)合。即，無論是SEQ ID N0:6、8或2的同源物的多肽(即，全長CAPRIN-I蛋白)，還是其片段，均可以同樣地用于測定在帶癌活體血清中特異性含有的上述多克隆抗體，并且均對癌的檢測有用。因此，本發(fā)明的第1方法中作為免疫測定的抗原使用的多肽的實(shí)例，并不僅為由CAPRIN-I全長區(qū)域(例如SEQID NO 6、8或2、組成的多肽，還包括由CAPRIN-I的氨基酸序列中的連續(xù)7個或更多個、優(yōu)選連續(xù) 8個或更多個、9個或更多個、或10個或更多個氨基酸組成，并且與針對CAPRIN-I的多克隆抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的多肽片段(以下，可簡稱為“特異反應(yīng)性部分多肽”)。本領(lǐng)域公知，約7個或更多個氨基酸殘基的多肽可發(fā)揮抗原性。然而，如果構(gòu)成多肽的氨基酸殘基的數(shù)量太少，此類多肽非?？赡芘c樣本中存在的、針對CAPRIN-I之外的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)。因此，從提高免疫測定精度的觀點(diǎn)考慮，多肽片段的理想的氨基酸殘基數(shù)目可以優(yōu)選為30或更多個、或50或更多個，更優(yōu)選100或更多個、或150或更多個，更優(yōu)選300或更多個，甚至更優(yōu)選600或更多個，以及更優(yōu)選1000或更多個，以及1500或更多個。用作抗原的多肽的特別優(yōu)選的實(shí)例是偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30的多肽或其片段。編碼由偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30 (即，SEQ ID NO :2、4、6…28、30)的氨基酸序列組成的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列顯示于奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1-29(即，SEQ ID NO 1 λ 3 Λ 5. >27、29)ο通常，蛋白質(zhì)抗原領(lǐng)域技術(shù)人員公知，即使當(dāng)在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中替代、缺失、添加或者插入少數(shù)氨基酸殘基時，所得產(chǎn)物也可能具有與原蛋白質(zhì)基本等價的抗原性。 因此，如下所述的多肽(以下，可簡稱為“特異反應(yīng)性修飾多肽”)也可以以與上述多肽相同的方式用于癌的檢測，所述多肽具有就CAPRIN-I的氨基酸序列而言替代、缺失和/或插入少數(shù)(優(yōu)選1個或幾個)氨基酸殘基，并且與原始序列具有80%或更多、優(yōu)選90%或更多、更優(yōu)選95%或更多、更優(yōu)選98%或更多的序列同一性的序列，并且該多肽通過抗原抗體反應(yīng)與針對CAPRIN-I的多克隆抗體特異性結(jié)合。優(yōu)選該特異反應(yīng)性修飾多肽具有就 CAPRIN-I的氨基酸序列而言替代、缺失、添加和/或插入1個或幾個氨基酸殘基的氨基酸序列。本文所使用的術(shù)語“幾個”是指2-10的整數(shù)，優(yōu)選2-6的整數(shù)，以及更優(yōu)選2-4的整數(shù)。本文所使用的術(shù)語“(氨基酸序列的)序列同一性”如下獲得將兩氨基酸序列進(jìn)行比對從而使待比較的2個氨基酸序列的氨基酸殘基盡可能多地匹配、用匹配的氨基酸殘基數(shù)除以總氨基酸殘基數(shù)，并以百分比表示所得結(jié)果。上述比對時，需要時，在待比較的一個或兩個序列中適宜地插入空位。這類序列的比對可以使用公知程序進(jìn)行，諸如BLAST、 FASTA 或 CLUSTALff(Karlin 和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,87 :2264-2268, 1993 ；Altschul 等，Nucleic Acids Res.，25 :3389-3402,1997)。構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種氨基酸可以分成如下幾組具有低極性側(cè)鏈的中性氨基酸(Gly、lie、Val、Leu、Ala、Met和、具有親水性側(cè)鏈的中性氨基酸(Asn、Gin、Thr, Ser.Tyr和Cys)、酸性氨基酸(Asp和Glu)、堿性氨基酸(Arg、Lys和His)以及芳香族氨基酸(Wie、Tyr, Trp和His)，其中每組的成員之間具有彼此類似的性質(zhì)。已知這些氨基酸之間的替代(即，保守替代)很少改變所得多肽的性質(zhì)。因此，當(dāng)替代CAPRIN-I的氨基酸殘基時，通過在相同組的成員間進(jìn)行替代，從而使得維持與對應(yīng)抗體的結(jié)合性的可能性增高。 然而，在本發(fā)明中，上述變體可包括非保守替代，只要賦予了與非變體等價或幾乎等價的免疫誘導(dǎo)活性即可。如下所述的多肽(以下，可簡稱為“特異反應(yīng)性加成多肽”)也可以以與上述多肽類似的方式用于癌的檢測，所述多肽含有本發(fā)明使用的上述多肽作為部分序列(即，在本發(fā)明中使用的多肽的一端或者兩端添加另一(多)肽制得的產(chǎn)物)、并且通過抗原抗體反應(yīng)與針對CAPRIN-I的多克隆抗體特異性結(jié)合。本發(fā)明中使用的上述多肽可以根據(jù)化學(xué)合成法進(jìn)行合成，諸如Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧基羰基法)(日本生物化學(xué)學(xué)會編輯，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座 (Biochemical Experimental Lecture Series) 1，蛋白質(zhì)化學(xué) IV，化學(xué)修飾和肽合成， TOKYO KAGAKU DOZIN CO.，LTD (日本)，1981)。另外，還可以利用各種市售的肽合成儀通過常用方法進(jìn)行合成。備選地，可以使用公知的基因工程技術(shù)容易地制備(Sambrook
MolecularCloning,第二 片反，Current Protocols in Molecular Biology (1989), ColdSpring Harbor Laboratory Press, Ausubel 等，Short Protocols inMolecular Biology, 3rd Edition,A Compendium of Methods from CurrentProtocoIs in Molecular Biology (1995)，John Wiley & Sons，等)。例如，從表達(dá)編碼 SEQ ID NO :2 的人 CAPRIN-1 或其同源物的基因的組織中提取RNA，通過RT-PCR制備該基因的cDNA。將該cDNA的全長或者所希望的一部分整合至到表達(dá)載體中，然后將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，由此得到目的多肽。編碼SEQ ID NO :6、8、10、12和14的犬CAPRIN-1的cDNA核苷酸序列分別顯示于SEQ ID NO 5、7、9、11和13。其人類同源因子，即編碼SEQ ID NO :2和4的人CAPRIN-1的cDNA核苷酸序列分別顯示于SEQ ID N0:1和3。因此可以參照這些核苷酸序列容易地設(shè)計RT-PCR中使用的引物。另外，如下述所述，可應(yīng)用參照奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1-29的核苷酸序列設(shè)計的引物擴(kuò)增編碼非人哺乳動物CAPRIN-I的基因。例如，可通過與上述技術(shù)類似的技術(shù)容易地制備編碼貓科動物CAPRIN-I的cDNA。RNA的提取、RT-PCR、cDNA向載體中的整合至以及載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入，可以采用公知的方法進(jìn)行，例如如下所述。另外，本文使用的載體及宿主細(xì)胞也為眾所周知的，并且各種載體和宿主細(xì)胞可商購獲得。上述宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，只要它們可以表達(dá)上述多肽即可。原核細(xì)胞的實(shí)例包括大腸桿菌等。真核細(xì)胞的實(shí)例包括諸如猴腎細(xì)胞(C0S1)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)、人胚腎細(xì)胞系(HEK293)以及小鼠胚胎皮膚細(xì)胞系(NIH3T3)的哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞， 出芽酵母、裂殖酵母、蠶細(xì)胞以及非洲爪蟾卵細(xì)胞。當(dāng)使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時，可以使用具有原核細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、核糖體結(jié)合部位、多克隆部位、終止子、藥物耐性基因和營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因等的表達(dá)載體。作為大腸桿菌用表達(dá)載體，其實(shí)例有PUC載體、pBluescriptll, pET表達(dá)系統(tǒng)、pGEX表達(dá)系統(tǒng)等。將編碼上述多肽的DNA整合至這種表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞，然后培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，由此可以使上述DNA編碼的多肽在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。此時，還可以使該多肽以與其他蛋白質(zhì)的融合蛋白形式進(jìn)行表達(dá)。編碼上述多肽的DNA例如可以如上所述通過RT-PCR制備cDNA而獲得。此外，編碼上述多肽的此類DNA還可以如下所述使用市售的
12核酸合成儀通過常用方法合成。編碼SEQ ID NO 2和4的CAPRIN-I的基因的cDNA核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO :1和3所示。使用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時，使用具有啟動子、剪接區(qū)域、聚(A)添加部位等的真核細(xì)胞用表達(dá)載體。此類所述表達(dá)載體的實(shí)例包括pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、 pBK-CMV、pBK-RSV、EBV載體、pRS、pcDNA3和pYES2等。與上述類似，將編碼本發(fā)明中使用的多肽的DNA整合到此類表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞，然后培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，由此可以使上述DNA編碼的多肽在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)使用pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達(dá)載體時，能夠以與各種標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)上述多肽，所述標(biāo)簽諸如His標(biāo)簽(例如，(His)6至(His) 10)、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GFP等。為將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，可以使用公知方法，諸如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、微注射、病毒感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、以及與可滲透細(xì)胞膜的肽結(jié)合?？梢越M合應(yīng)用公知的分離技術(shù)從宿主細(xì)胞中分離和純化目的多肽。此類公知技術(shù)的實(shí)例包括利用諸如尿素的變性劑或表面活性劑的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析、溶劑分餾及沉淀法、透析、離心、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦電泳、離子交換色譜法、 疏水色譜法、親和層析以及反相色譜法等。通過以上方法所得的多肽包括以與任何其他蛋白質(zhì)的融合蛋白形式的多肽。此類融合蛋白的實(shí)例包括與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、His標(biāo)簽等的融合蛋白。此類融合蛋白形式的多肽也是上述特異反應(yīng)性加成多肽的實(shí)例，并且可以用于本發(fā)明的第1種檢測方法。此外，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的多肽，可在翻譯后在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行各種修飾。此類翻譯后被修飾的多肽只要能與抗CAPRIN-I多克隆抗體結(jié)合，則也可以用于在本發(fā)明的第1種檢測方法。上述翻譯后修飾的實(shí)例包括N端蛋氨酸的移除、N端乙?；?、糖基化、通過細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的限制分解、肉豆蔻?；?、異戊二烯化和磷酸化?？赏ㄟ^使用上述多肽作為抗原的免疫測定法容易地測定樣本中抗體。免疫測定法本身在該領(lǐng)域中是公知的。基于反應(yīng)類型，可將免疫測定法分為夾心法、競爭法、凝集法、 蛋白質(zhì)印跡法等。另外，基于標(biāo)記物，例如可將免疫測定法分為放射免疫測定法、熒光免疫測定法、酶免疫測定法和生物素免疫測定法等?？梢允褂萌我獾倪@些方法進(jìn)行上述抗體的免疫測定。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選將夾心ELISA及凝集法用于上述抗體的免疫測定技術(shù)， 因?yàn)檫@些方法的操作簡便且不需要大型裝置。但該技術(shù)不限于它們。當(dāng)作為抗體的標(biāo)記物使用酶時，此類酶沒有特別的限制，只要其滿足以下條件轉(zhuǎn)換數(shù)大、即使與抗體結(jié)合也穩(wěn)定、其特異性地使底物顯色等?？捎糜谕ǔ５拿该庖邷y定的酶的實(shí)例包括過氧化物酶、 β -半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。另外還可以使用酶抑制劑、輔酶等。這些酶與抗體的結(jié)合可以通過使用諸如馬來酰亞胺化合物的交聯(lián)劑的公知方法來進(jìn)行。作為底物，可以根據(jù)所使用的酶的種類使用公知的物質(zhì)。例如使用過氧化物酶作為酶時，可以使用3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺。此外， 使用堿性磷酸酶作為酶時，可以使用對硝基苯酚等。作為放射性同位素，可以使用放射免疫測定中通常使用的放射性同位素，諸如125I及咕。作為熒光染料，可以使用熒光抗體技術(shù)中通常使用的熒光染料，諸如異硫氰酸熒光素(FITC)及四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)。由于上述免疫測定技術(shù)方法本身是公知的，在本說明書中沒有必要對其進(jìn)行解釋。然而，當(dāng)簡單地描述這些免疫測定技術(shù)時，則例如夾心法包括將作為抗原使用的上述多肽固定在固相，使其與諸如血清的樣本反應(yīng)，洗滌，與適當(dāng)?shù)牡诙贵w反應(yīng)，洗滌，然后測定與固相結(jié)合的第二抗體?？赏ㄟ^將抗原多肽固定至固相中，從而容易地除去未結(jié)合的第二抗體。因此，其優(yōu)選作為本發(fā)明的癌檢測方法的方案。作為第二抗體，如果樣本源自犬， 則可以使用抗犬IgG抗體。通過用上述示例的標(biāo)記物質(zhì)事先標(biāo)記第二抗體，可以測定結(jié)合于固相的第二抗體。這樣測定得到的第二抗體量相應(yīng)于血清樣本中的上述抗體量。當(dāng)使用酶作為標(biāo)記物質(zhì)時，通過加入在酶作用下分解以顯色的底物，然后通過光學(xué)方法測定底物的分解量，由此測定抗體量。使用放射性同位素作為標(biāo)記物質(zhì)時，可以通過閃爍計數(shù)器 (Scintillation Counter)等測定來自放射性同位素的放射線量。在本發(fā)明的第2種方法中，測定可包含在從活體得到的樣本中的CAPRIN-1。如上所述，在癌患者中，與犬或人等的CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體的量明顯很高。這表示在癌細(xì)胞中作為抗原積累的CAPRIN-I的量顯著很高。還可通過直接測定CAPRIN-I 檢測癌，如下述實(shí)施例中的具體記載所示。因此，可以與上述第1種方法類似地，通過測定 CAPRIN-I本身而體內(nèi)檢測癌?？梢酝ㄟ^公知的免疫測定技術(shù)容易地測定樣本中的多肽。具體而言，例如制備與 CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或者其抗原結(jié)合片段，使用該抗體或者其抗原結(jié)合片段進(jìn)行免疫測定，然后由此可以測定可能存在于樣本中的CAPRIN-I。如上所述，抗體具有交叉反應(yīng)性。因此，例如通過使用與SEQ ID NO :6的犬CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或者其抗原結(jié)合片段，不僅可以測定SEQ ID N0:6的犬CAPRIN-1，還可以測定其他哺乳動物中的同源物(例如，SEQ ID NO :2或4的人CAPRIN-I，或貓CAPRIN-1)。如上所述，免疫測定技術(shù)本身為公知的常用方法。這一檢查揭示了 CAPRIN-I是在癌細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白。患癌活體含有多種蛋白酶。具體地，在患癌活體中，CAPRIN-I序列的細(xì)胞外表達(dá)部分通過降解而從癌細(xì)胞中分離出來，因而此部分以比CAPRIN-I序列的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)部分更高的水平存在。因此，當(dāng)使用與癌細(xì)胞表面結(jié)合的、針對這一測定中使用的CAPRIN-I的抗體或其抗原結(jié)合片段時， 可在較高的水平檢測到CAPRIN-I并且可以較高的靈敏度診斷癌。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用與癌細(xì)胞表面上存在的CAPRIN-I蛋白的部分結(jié)合的抗體。在癌細(xì)胞表面上存在的 CAPRIN-I的部分肽的實(shí)例是，包含序列表中除SEQ ID NO :6和SEQ ID N0:18之外的偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30所示氨基酸序列中氨基酸殘基編號(aa) 50-98或氨基酸氨基編號 (aa) 233-305內(nèi)7個或更多個連續(xù)氨基酸殘基的多肽。其特定的實(shí)例是SEQ ID NO 43或 SEQ ID NO :61所示的氨基酸序列(在SEQ ID NO :61所示氨基酸序列中，優(yōu)選為SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO :63所示的氨基酸序列區(qū)域)，或與相關(guān)氨基酸序列具有80%或更多、優(yōu)選 85%或更多、更優(yōu)選90%或更多、更優(yōu)選95%或更多序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明使用的抗體的實(shí)例包括所有與這些肽結(jié)合的抗體?？贵w的特定實(shí)例包括與SEQ ID N0:43結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :44和45的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :44和46的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有 SEQ ID NO :44和47的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID N0:44和 48的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :49和50的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :51和52的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :53和M的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段， 具有SEQ ID NO :55和56的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO 57和58的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :59和60的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。本文中所使用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指能與抗原結(jié)合的抗體片段，諸如抗體分子中含有的Fab片段及F(ab’)2片段。本發(fā)明使用的抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體。 對于免疫測定等，優(yōu)選為重現(xiàn)性高的單克隆抗體。以多肽作為免疫原的多克隆抗體及單克隆抗體的制備方法是公知的，并且可通過常用方法容易地進(jìn)行。例如，將CAPRIN-I與諸如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、酪蛋白和血清白蛋白等的載體蛋白結(jié)合，然后將所得物作為免疫原與佐劑一起對動物進(jìn)行免疫，由此可誘發(fā)針對該多肽的抗體。將從經(jīng)免疫的動物中收集的諸如脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的產(chǎn)抗體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而制備雜交瘤，然后選擇產(chǎn)生與 CAPRIN-I結(jié)合的抗體的雜交瘤，然后進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以從培養(yǎng)上清液中得到以CAPRIN-I 作為對應(yīng)抗原的單克隆抗體。上述方法為公知的常用方法。在本發(fā)明的第3種方法中，測定可包含在獲自活體的樣本中的編碼CAPRIN-I的 mRNA。如以下實(shí)施例所詳細(xì)描述的那樣，編碼SEQ ID NO :6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1 或SEQ ID NO :2或4的人CAPRIN-I的mRNA在癌細(xì)胞中以顯著高的水平表達(dá)。因此，可通過測定樣本中此類mRNA而體內(nèi)檢測癌。樣本中的mRNA例如可以通過應(yīng)用該mRNA作為模板的諸如實(shí)時檢測RT-PCR的常用方法定量確定。此類mRNA可基于作為常用方法的RNA印跡中的染色強(qiáng)度大概地進(jìn)行定量。編碼偶數(shù)編號的SEQ ID NO 2-30的CAPRIN-I多肽的cDNA序列分別如奇數(shù)編號的 SEQ ID NO :1- 所示。因此，以所述序列作為基礎(chǔ)，制備與奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1- 任一項(xiàng)所示的核苷酸序列中的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸(以下稱作“癌檢測用多核苷酸”)，并且然后使用該多核苷酸作為探針或核酸擴(kuò)增法中的引物，可測定試樣中的mRNA量。 如下所述，如果其為與奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1- 任一項(xiàng)所示的核苷酸序列中的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸，還可檢測編碼除犬和人之外的哺乳動物中的CAPRIN-I的mRNA。此外，在本發(fā)明中，多核苷酸可以為RNA或DNA。本文所示使用的術(shù)語“特異性雜交”是指在通常雜交的條件下，對象僅與靶部分區(qū)域雜交，而與其他區(qū)域基本上不雜交。本文所使用的術(shù)語“(在)通常雜交的條件下”，是指通常PCR的退火或應(yīng)用探針進(jìn)行檢測時使用的條件。例如在利用了 Taq聚合酶的PCR時，該術(shù)語指使用諸如50mM KC1、 IOmM Tris-HCl (pH8. 3-9. 0)和l_5mM MgCl2的通常緩沖液，在約-60°C的適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟认逻M(jìn)行反應(yīng)。另外例如在Northern雜交的情況下，該術(shù)語是指使用諸如5XSSPE、50%甲酰胺、5XDenhardt，s溶液和 0. 1-0. 5% SDS ；或者0. 1-5X SSC^PO. 1-0. 5% SDS 的通常的雜交溶液，在約42°C _65°C適當(dāng)?shù)碾s交溫度下進(jìn)行反應(yīng)。此外，雜交后，例如用0. 1-0. 2XSSC 和0. 1% SDS洗滌。但是，適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟然蛘唠s交溫度不限定于上述實(shí)例，可以基于作為引物或者探針使用的癌檢測用多核苷酸的Tm值及實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定此類溫度范圍。本文所使用的表達(dá)“基本上不雜交”是指對象不與靶部分區(qū)域真正雜交；或者即使與靶部分區(qū)域雜交，對象也以顯著低的量與靶部分區(qū)域雜交，即，相對而言可以忽略不計的量。在此類條件下特異性雜交的多核苷酸的實(shí)例是與靶部分區(qū)域的核苷酸序列具有一定水平或更多序列同一性的多核苷酸。此類多核苷酸的特定實(shí)例具有70%或更多、優(yōu)選80% 或更多、85%或更多、更優(yōu)選90%或更多、更優(yōu)選93%或更多、更優(yōu)選95%或更多、進(jìn)一步更優(yōu)選98%或更多的序列同一性。最優(yōu)選該多核苷酸具有與靶部分區(qū)域的核苷酸序列同一的核苷酸序列。序列同一性的定義與上述氨基酸序列的序列同一性的定義方式相同。即使癌檢測用多核苷酸的末端含有與對象不雜交的區(qū)域，在作為探針的情況下，只要雜交的區(qū)域占整個探針的約一半或更多則也可以用于檢測。另外，在作為引物的情況下，只要雜交的區(qū)域占整個引物的約一半或更多且處于3’末端側(cè)，則由于可以發(fā)生正常退火和延伸反應(yīng)， 所以也可以用于檢測。如上所述，當(dāng)癌檢測用多核苷酸的末端含有不雜交的區(qū)域時，計算與對象的核苷酸序列的序列同一性時，僅著眼于雜交的區(qū)域進(jìn)行計算，不考慮不雜交的區(qū)域。本發(fā)明中使用的術(shù)語“部分序列”是指奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1- 所示的核苷酸序列中的一部分序列，特別地為連續(xù)15個或更多個核苷酸、優(yōu)選連續(xù)18個或更多個核苷酸、更優(yōu)選連續(xù)20個或更多個、或25個或更多個核苷酸、以及更優(yōu)選連續(xù)30、40或50個或更多個核苷酸的部分序列。本發(fā)明中所使用的術(shù)語“SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列”是指，除SEQID NO :5實(shí)際顯示的核苷酸序列之外，還包含與其互補(bǔ)的序列。因此，例如，表達(dá) “具有SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含具有SEQ ID NO :5實(shí)際顯示的核苷酸序列的單鏈多核苷酸、具有SEQ IDNO 5所示序列互補(bǔ)的核苷酸序列的單鏈多核苷酸、以及包含它們的雙鏈多核苷酸。制備本發(fā)明使用的多核苷酸時、或制備編碼本發(fā)明使用的多肽的多核苷酸時，選擇適當(dāng)?shù)娜我环N核苷酸序列，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行這一選擇。從確保特異性的觀點(diǎn)考慮，癌檢測用多核苷酸的核苷酸數(shù)優(yōu)選為18個或更多個核苷酸。在作為探針使用時，多核苷酸的大小優(yōu)選為18個或更多個核苷酸、更優(yōu)選為20個或更多個核苷酸，以及編碼區(qū)域的全長或更少。作為引物使用時，該多核苷酸大小優(yōu)選為18 個或更多個核苷酸，以及50個或更少核苷酸。癌檢測用多核苷酸的優(yōu)選實(shí)例是包含奇數(shù)編號的SEQ IDNO 1-29任一項(xiàng)所示的核苷酸序列中連續(xù)18個或更多個核苷酸的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員在參考了這一說明書之后可顯而易見地得知與SEQID NO :5、7、 9、11或13中的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸分別用于測定編碼SEQ ID N0:6、8、10、12 或14的犬CAPRIN-I的mRNA量；以及與SEQ ID NO :1或3中的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸分別用于測定編碼SEQ ID NO :2或4的人CAPRIN-I的mRNA量。然而，來自哺乳動物的蛋白與來自另一哺乳動物的其同源物通常甚至在堿基序列水平上共享很高的序列同一性。 因此，奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1-13的序列間的序列同一性高達(dá)94%至100%。因此，與SEQ ID NO 5序列的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸還可與奇數(shù)編號的SEQ ID NO 1-29任一項(xiàng)相關(guān)部分區(qū)域相對應(yīng)的部分區(qū)域雜交。如以下實(shí)施例所描述的那樣，分別具有SEQ ID NO :33和34所示核苷酸序列的引物對與奇數(shù)編號的SEQ ID NO :1- 任一序列的部分區(qū)域、以及SEQ ID NO :5的部分區(qū)域兩者雜交，因此例如可檢測編碼SEQ IDNO 6的犬CAPRIN-I的mRNA，以及編碼其同源物的 mRNA。因此，例如，利用與SEQ ID NO :5的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸，不僅可檢測編碼SEQ ID NO 6的犬CAPRIN-I的mRNA，還可檢測編碼SEQ IDNO :2或4的人CAPRIN-1的 mRNA。類似地，還可檢測編碼另一哺乳動物(諸如貓)的CAPRIN-I的mRNA。設(shè)計癌檢測用多核苷酸時，期望選擇在SEQ ID編號(奇數(shù)編號的SEQ ID NO 1_29)之間具有特別高的序列同一性(優(yōu)選核苷酸序列相同)的部分區(qū)域。如果犬和人之間存在具有特別高的序列同一性的部分區(qū)域，則可以預(yù)測在其他動物種的同源基因中也存在與該區(qū)域具有非常高的序列同一性的區(qū)域。通過選擇此類部分區(qū)域，則可以提高測定mRNA的精度，其中所述mRNA編碼除犬及人之外的動物種的CAPRIN-I。使用與受試核酸的部分區(qū)域特異性雜交的多核苷酸作為諸如PCR的核酸擴(kuò)增法的引物或者探針來測定受試核酸的方法是公知的。除下述實(shí)施例中具體描述的RT-PCR之外，此類方法的實(shí)例還包括RNA印跡和原位雜交。本發(fā)明中測定mRNA量時，可以采用所有的這些公知測定方法。諸如PCR的核酸擴(kuò)增法本身在本領(lǐng)域是公知的，并且因此其使用的試劑盒及裝置也可商購，因此可以容易地進(jìn)行該方法。具體地，例如可以如下進(jìn)行應(yīng)用作為模板的受試核酸(例如編碼下述蛋白質(zhì)的基因的cDNA，所述蛋白質(zhì)具有偶數(shù)編號的SEQ ID NO 2-30 任一項(xiàng)所示的氨基酸序列)和一對癌檢測用多核苷酸(引物)，在公知的緩沖液中、在熱穩(wěn)定DNA聚合酶(諸如Taq聚合酶或Pfu聚合酶)及dNTP (此處，N = A、T、C或G)存在下， 通過改變反應(yīng)液的溫度進(jìn)行變性、退火和延伸各步驟。通常，變性步驟在90-95°C進(jìn)行，退火步驟在模板和引物的Tm或者其附近(優(yōu)選在士4°C以內(nèi))進(jìn)行，延伸步驟在熱穩(wěn)定DNA聚合酶(諸如Taq聚合酶或Pfu聚合酶)最適溫度即72°C或該最適溫度附近進(jìn)行。各步驟進(jìn)行約30秒至2分鐘，可適當(dāng)選擇。例如將該熱循環(huán)重復(fù)約25-40次，由此擴(kuò)增引物對之間的模板核酸的區(qū)域。核酸擴(kuò)增法不限定于PCR，本文還可以使用本領(lǐng)域公知的其他核酸擴(kuò)增法。如上所述，使用一對癌檢測用多核苷酸作為引物、使用受試核酸作為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增法時，受試核酸被擴(kuò)增。然而，當(dāng)試樣中不含受試核酸時不引起擴(kuò)增。因此通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物可以確認(rèn)試樣中是否存在受試核酸。擴(kuò)增產(chǎn)物可以過如下方法進(jìn)行檢測，所述方法包括將擴(kuò)增后的反應(yīng)溶液進(jìn)行電泳，然后將條帶用溴化乙錠等染色，或所述方法包括在所述電泳后將擴(kuò)增產(chǎn)物固定在諸如尼龍膜的固相中，與和受試核酸特異性雜交的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗滌，并且然后檢測該標(biāo)記。另外，可應(yīng)用猝滅熒光染料和報告熒光染料，進(jìn)行所謂實(shí)時檢測PCR，并由此定量試樣中受試核酸的量。由于實(shí)時檢測PCR用試劑盒可商購，所以可以容易地進(jìn)行實(shí)時檢測PCR。此外，還可以基于電泳條帶的強(qiáng)度對受試核酸進(jìn)行半定量。 受試核酸可以為mRNA，或由mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA。作為受試核酸擴(kuò)增mRNA時，也可以采用使用了上述引物對的NASBA法(3SR法、或TMA法)。NASBA法本身是公知的，用于該方法的試劑盒也可商購，所以可以使用上述引物對容易地進(jìn)行該方法。作為探針，可以使用用熒光標(biāo)記、放射標(biāo)記、生物素標(biāo)記等對癌檢測用多核苷酸進(jìn)行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。多核苷酸的標(biāo)記方法本身是公知的?？赏ㄟ^如下方法檢查試樣中是否存在受試核酸固定受試核酸或者其擴(kuò)增物，與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗滌，以及然后測定與固相結(jié)合的標(biāo)記。備選地，還可固定癌檢測用多核苷酸，使受試核酸與其雜交，然后應(yīng)用標(biāo)記探針等檢測結(jié)合于固相上的受試核酸。在這種情況下，結(jié)合于固相上的癌檢測用多核苷酸也稱為探針。使用多核苷酸探針測定受試核酸的方法在本領(lǐng)域也是公知的?？梢匀缦逻M(jìn)行該方法在緩沖液中使多核苷酸探針與受試核酸在Tm或者其附近(優(yōu)選在士4°C以內(nèi))接觸用于雜交，洗滌，然后測定雜交的標(biāo)記探針或者與固相探針結(jié)合的模板核酸。此類方法的實(shí)例包括諸如RNA印跡、原位雜交、DNA印跡法的公知方法。在本發(fā)明中，可以使用任一種公知方法。本發(fā)明的檢測方法基于如上所述測定的CAPRIN-I的表達(dá)水平，判斷對象動物是否患癌。癌的檢測可以僅通過測定對象動物中CAPRIN-I的表達(dá)。但從提高檢測精度的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選如下方案檢查1位或多位健康受試者樣本中CAPRIN-I的表達(dá)水平(抗體水平、多肽水平或者mRNA水平)，由此取得健康受試者基準(zhǔn)值，然后將對象動物的測定值與從健康受試者獲得的該基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。為進(jìn)一步提高檢測精度，還可以檢測從多位已知患癌的患者體內(nèi)取得的樣本中的CAPRIN-I表達(dá)水平，由此獲得癌患者基準(zhǔn)值，然后可將對象動物的測定值與健康受試者基準(zhǔn)值及癌患者基準(zhǔn)值兩者進(jìn)行比較。上述基準(zhǔn)值例如可以通過量化各樣本中的CAPRIN-I表達(dá)水平、并然后計算其平均值來確定?？梢酝ㄟ^檢查對多位健康受試者及癌患者的CAPRIN-I表達(dá)水平，從而事先確定健康受試者基準(zhǔn)值與癌患者基準(zhǔn)值。因此，本發(fā)明的方法中與基準(zhǔn)值進(jìn)行比較時，可以使用預(yù)先確定的基準(zhǔn)值。在本發(fā)明的檢測方法中，可以組合使用基于其他癌抗原或癌標(biāo)記物的診斷。因此， 可以進(jìn)一步提高癌的檢測精度。例如，當(dāng)通過本發(fā)明的方法測定特異存在于癌患者中的抗體時，可以與上述多肽類似地組合使用癌組織中通常表達(dá)的其他多肽作為抗原。另外，也可以組合地進(jìn)行本發(fā)明的方法和利用已知的癌標(biāo)記物的診斷。根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，可以體內(nèi)地檢測癌。特別是，如下述實(shí)施例所描述的那樣，根據(jù)本發(fā)明的方法可以檢測甚至小到肉眼看不見的大小的腫瘤或體內(nèi)深部的腫瘤。因此，本發(fā)明的方法對癌的早期檢測有用。另外，通過對處于癌治療后追蹤觀察中的患者使用本發(fā)明的檢測方法，則如果癌復(fù)發(fā)時可以早期檢測出該癌。另外，在帶癌活體中，如果表達(dá)本發(fā)明所測定的CAPRIN-I的癌細(xì)胞數(shù)增加，則該活體內(nèi)積累的該蛋白及其mRNA的量升高，并且血清中產(chǎn)生較多針對CAPRIN-I的抗體。同時，如果癌細(xì)胞數(shù)減少，體內(nèi)積累的該蛋白及其mRNA的量減少，血清中的針對CAPRIN-I的抗體減少。因此，當(dāng)CAPRIN-I的表達(dá)量比對照更高時，可以確定腫瘤增大或發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，即癌的進(jìn)展程度有所進(jìn)展。實(shí)際上，如以下實(shí)施例詳細(xì)描述的那樣，伴隨著諸如腫瘤增大及轉(zhuǎn)移的癌發(fā)展(惡化)，可以觀察到帶癌活體中上述血清抗體水平的上升。如上所述，還可通過本發(fā)明的方法檢測癌的進(jìn)展程度。另外，如下述實(shí)施例所述，在相同種類的腫瘤中，惡性腫瘤中的上述抗體水平顯著高于良性腫瘤中的上述抗體量。因此，當(dāng)CAPRIN-I的表達(dá)水平高時，可以確定癌的惡性程度較高。具體地，還可通過本發(fā)明的方法檢測出癌的惡性程度。可根據(jù)本發(fā)明的癌檢測方法進(jìn)行檢查的癌是表達(dá)CAPRIN-I的癌。此類癌包括， 但不限于腦腫瘤，頭、頸、肺、子宮或食管的鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤、肺或子宮的腺癌、腎癌、惡性混合瘤、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、棘皮瘤樣牙齦瘤、口腔瘤、肛門周圍腺癌、肛囊瘤、肛囊頂泌腺癌、Sertoli細(xì)胞癌、陰道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔內(nèi)腺癌、鼻腺癌、甲狀腺癌、大腸癌、支氣管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、組織細(xì)胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大細(xì)胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹膜內(nèi)平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、胃腸淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小細(xì)胞至中細(xì)胞淋巴瘤、腎上腺髓質(zhì)瘤、顆粒細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤。此外，應(yīng)用本發(fā)明方法的活體是哺乳動物，優(yōu)選為人、狗或貓。
用于本發(fā)明方法的樣本的實(shí)例包括諸如血液、血清、血漿、腹水、胸水的體液，組織和細(xì)胞。特別地，在上述第1種方法及第2種方法中，可以優(yōu)選使用血清、血漿、腹水及胸水， 以及在測定mRNA的上述第3種方法中優(yōu)選組織樣本及細(xì)胞樣本。在第1方法中用作免疫測定的抗原的上述多肽(S卩，SEQ ID NO 2的犬CAPRIN-I 或其同源物、特異反應(yīng)性部分多肽、特異反應(yīng)性修飾多肽、以及特異反應(yīng)性加成多肽)可以作為用于檢測癌的試劑提供。該試劑可以僅由上述多肽組成，或可以含有各種添加劑等，例如用于穩(wěn)定該多肽。另外，該試劑還可以以在諸如板或膜的固相中固定的形式提供。多肽的優(yōu)選實(shí)例如上所述。在第2種方法中用于對CAPRIN-I本身進(jìn)行免疫測定的、與CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段也可以作為用于檢測癌的試劑提供。這種情況下，用于檢測癌的試劑可以僅由上述抗體或者抗原結(jié)合片段組成，或可以含有對該抗體或者抗原結(jié)合片段的穩(wěn)定等有用的各種添加劑等。另外，該抗體或其抗原結(jié)合片段也可以是結(jié)合有金屬的形式，所述金屬諸如錳或鐵等。將這種金屬結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段施與活體內(nèi)時，該金屬結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段在抗原蛋白質(zhì)以較高水平存在的部位中以升高的水平積聚。因此，通過MRI等測定金屬，由此可以檢測出產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞的存在。此外，第3種方法中用于mRNA測定的上述癌檢測用多核苷酸也可以作為用于檢測癌的試劑提供。在這種情況下，癌檢測用試劑可以僅由該多核苷酸組成，或可含有對該多核苷酸的穩(wěn)定等有用的各種添加劑等。該試劑中含有的癌檢測用多核苷酸優(yōu)選為引物或者探針。癌檢測用多核苷酸的條件及優(yōu)選實(shí)例如上所述。
實(shí)施例本發(fā)明將參考以下實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明，不過本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于此。實(shí)施例1 通過SEREX方法獲得新的癌抗原蛋白(l)cDNA文庫的構(gòu)建通過酸胍-酚-氯仿方法從健康犬的睪丸組織提取總RNA,并且使用 01igotex-dT30mRNA純化試劑盒(Takara Shuzo Co. , Ltd.)，根據(jù)其中包含的說明書純化 poIyA RNA。使用如此獲得的mRNA(5 μ g)合成犬睪丸cDNA噬菌體文庫。使用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒和 ZAP-cDNA GigapackIIIGold Cloning試劑盒(STRATAGENE), U 據(jù)各試劑盒中所包含的各份說明書構(gòu)建cDNA噬菌體文庫。由此構(gòu)建的cDNA噬菌體文庫的大小是 7. 73X 105pfu/ml。(2)使用血清篩選cDNA文庫使用上述構(gòu)建的犬睪丸cDNA噬菌體文庫實(shí)施免疫篩選。具體地，在NZY瓊脂糖平板(Φ90Χ15πιπι)上用噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-BlueMRF’)，由此獲得2210個克隆。 在42°C培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞3至4小時以形成噬斑。平板以IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纖維素膜(Hybond C Extra =GE Healthcare Bio-Science)在 37°C覆蓋 4小時，從而誘導(dǎo)并表達(dá)蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到該膜上。隨后，回收該膜，浸泡在含有 0.5%粉末脫脂乳的TBS(IOmM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)中并在4°C振搖過夜以封閉非特異性反應(yīng)。使該濾膜與500倍稀釋的患病犬血清在室溫反應(yīng)2至3小時。就上述患病犬的血清而言，使用從患有乳腺癌的犬中收集的血清。這些血清貯藏在-80°C并在即將使用前預(yù)處理。預(yù)處理血清樣品的方法如下。具體而言，宿主大腸桿菌 (XLl-BLue MRF’)用其中未插入外來基因的λ ZAP表達(dá)噬菌體感染，并且隨后在NZY平板培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)過夜。隨后，添加含有0. 5M NaCl的緩沖液(0. 2M NaHCO3, pH 8. 3)至該平板，使該平板在4°C靜置15小時，然后收集上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取物。隨后，使由此收集的大腸桿菌/噬菌體提取物流經(jīng)NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，由此固定衍生自大腸桿菌/噬菌體的蛋白質(zhì)。使患病犬的血清流經(jīng)固定有蛋白質(zhì)的柱以與其反應(yīng)，并且從血清中除去已經(jīng)吸附至大腸桿菌和噬菌體的抗體。將已經(jīng)流過該柱的血清級分用含有0. 5%粉末脫脂乳的TBS稀釋500倍。將所得物用作免疫篩選材料。膜上已經(jīng)轉(zhuǎn)印上經(jīng)處理的血清和上述融合蛋白的膜用TBS-T (0. 05 %吐溫20/ TBS)洗滌4次，然后使已經(jīng)用含有0. 5%粉末脫脂乳的TBS稀釋5000倍作為第二抗體的山羊抗犬IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP綴合的(BETHYL Laboratories))與該膜在室溫反應(yīng) 1小時。檢測通過使用NBT/BCIP反應(yīng)溶液(Roche)的酶顯色反應(yīng)實(shí)施。從NZY瓊脂糖平板(Φ90χ15πιπι)收集與顯色反應(yīng)陽性的位點(diǎn)相對應(yīng)的菌落，并將其懸浮于500 μ ISM緩沖液 (IOOmM NaCl，IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠，pH 7.5)。以與上文所述相似的方法重復(fù)第二和第三篩選，從而篩選30，940個與血清IgG反應(yīng)的噬菌體克隆，直至顯色反應(yīng)陽性菌落單一化。由此分離了 5個陽性克隆。(3)分離的抗原基因的同源性搜索為了對通過上述方法分離的5個陽性克隆進(jìn)行核苷酸序列分析，實(shí)施將噬菌體載體轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒載體的操作。具體地，制備200 μ 1吸光度0D_為1. 0的含宿主大腸桿菌 (XLl-Blue MRF，)溶液。將其與250 μ 1純化的噬菌體溶液混合，并隨后和1 μ IExAssist輔助噬菌體(STRATAGENE)混合，隨后在37°C反應(yīng)15分鐘。添加:3ml LB培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng) 2. 5至3小時。培養(yǎng)后，立即通過水浴將溶液溫度保持在70°C，持續(xù)20分鐘，4°C和IOOOXg 離心15分鐘，并且然后收集上清液作為噬菌粒溶液。隨后，制備200 μ 1吸光度OD6tltl為1. 0 的含噬菌粒宿主大腸桿菌(SOLR)溶液。將該溶液與10 μ 1純化的噬菌體溶液混合，隨后在 37°C反應(yīng)15分鐘。將溶液(50 μ 1)接種于含有氨芐青霉素(終濃度50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基，并且在37°C培養(yǎng)過夜。收集轉(zhuǎn)化的SOLR單菌落并且在含有氨芐青霉素(終濃度 50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)。應(yīng)用QIAGEN質(zhì)粒小量制備試劑盒OiIAGEN)純化含有目的插入物的質(zhì)粒DNA。使用SEQ ID NO :31的T3引物和SEQ ID NO :32的T7引物，通過引物步行法，對純化的質(zhì)粒進(jìn)行插入物全長序列的分析。作為序列分析的結(jié)果，獲得SEQ ID NO :5,7,9, 11和13的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列以及由該基因編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO :6、8、10、12 和 14)來實(shí)施同源性搜索程序 BLAST 搜索(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)。作為這個用已知基因進(jìn)行的同源性檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得的5個基因均編碼 CAPRIN-1。就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，這五個基因之間的序列同一性為100%的核苷酸序列同一性和99 %的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所述基因與編碼人同源物的基因的序列同一性為94%的核苷酸序列同一性和98%的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :1和3，并且其氨基酸序列顯示于SEQ IDNO :2和4。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，由此獲得的犬基因與編碼牛同源物的基因的序列同一性為94%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO 15，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :16。就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼牛同源物的基因之間的序列同一性為94%的核苷酸序列同一性，以及93%至97%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼馬同源物的基因的序列同一性為93%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。馬同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:17，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:18o就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼馬同源物的基因之間的序列同一性為93%的核苷酸序列同一性和96%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼小鼠同源物的基因的序列同一性為87%至89%的核苷酸序列同一性和95%至97%的氨基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列如SEQ ID N0:19、21、23、25和27所示并且其氨基酸序列如SEQ ID NO: 20、22、對、沈和觀所示。就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼小鼠同源物的基因之間的序列同一性為89%至91%的核苷酸序列同一性和95%至96%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼雞同源物的基因的序列同一性為82%的核苷酸序列同一性和87%的氨基酸序列同一性。雞同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :29，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :30。就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼雞同源物的基因之間的序列同一性為81% 至82%的核苷酸序列同一性和86%的氨基酸序列同一性。(4)每一組織中的基因表達(dá)分析通過RT_PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)方法通過上述方法在犬和人正常組織及多種細(xì)胞系中獲得的基因的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄按照以下方式實(shí)施。具體地，使用TRIZOL試劑anvitrogen)， 按照其中包含的方案從每一組織(50mg至IOOmg)和各細(xì)胞株(5至IOx IO6個細(xì)胞)中提取總RNA。使用用于RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)按照其中包含的方案，利用提取的總RNA合成cDNA。使用對所獲得基因特異的引物(根據(jù)SEQ ID NO 33和34)，按照以下方式實(shí)施PCR。具體地，如下實(shí)施PCR 通過添加諸試劑(0. 25 μ 1通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備的樣品，上述引物(每種2 μ Μ)，dNTP (每種0. 2mM)和0. 65U ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co. ,Ltd.))和附帶的緩沖液以調(diào)節(jié)至25 μ 1總體積制備反應(yīng)溶液，然后應(yīng)用Thermal Cycler (BIORAD)，對所述溶液進(jìn)行以下30個循環(huán)94°C /30秒，60°C /30秒和72°C /30秒。上述基因特異性引物用來擴(kuò)增SEQ ID NO 5的核苷酸序列(犬CAPRIN-I 基因)第206至632位核苷酸之間的區(qū)域和SEQ ID NO=I的核苷酸序列(人CAPRIN-I基因)第698至IlM位核苷酸的區(qū)域。作為對照，同時使用GAPDH特異性引物(SEQ ID NO 35和36)。作為結(jié)果，如圖1中顯示，在健康犬的睪丸組織中觀察到強(qiáng)表達(dá)，同時在犬乳腺癌及腺癌組織中觀察到表達(dá)。此外，還證實(shí)了與所獲得基因同源的人同源物的表達(dá)。作為結(jié)果，如犬CAPRIN-I基因的情況類似，在正常組織的情況下，僅在睪丸中證實(shí)了其表達(dá)。然而，在癌細(xì)胞的情況下，在許多類型的癌細(xì)胞系諸如乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌和食道癌細(xì)胞系中檢測到表達(dá)。尤其在許多乳腺癌細(xì)胞系中證實(shí)了其表達(dá)。基于這些結(jié)果，證實(shí)了在除睪丸組織之外的正常組織中觀察不到CAPRIN-I表達(dá)，然而，CAPRIN-I在許多癌細(xì)胞中并且尤其在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)。
此外，在圖1中，縱軸上的參考編號1顯示上文所鑒定的每一基因的表達(dá)模式并且相同軸上的參考編號2顯示了用于對照的GAPDH基因的表達(dá)模式。(5)免疫組織化學(xué)染色(5)-1 正常小鼠和犬組織中的CAPRIN-I表達(dá)小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/異氟烷麻醉下放血。剖腹手術(shù)后，將器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宮、小腸、食道、心臟、腎、 唾液腺、大腸、乳腺、腦、肺、皮膚、腎上腺、卵巢、胰腺、脾臟和膀胱)分別轉(zhuǎn)移至含有PBS的 ΙΟ-cm平皿中。在PBS中切開每一器官并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0. IM磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4)回流固定過夜。棄去回流液，用PBS漂洗每一器官的組織表面，將含有10%蔗糖的PBS溶液添加入50-ml微離心管。然后將每一組織置于每一管中，然后使用轉(zhuǎn)子在4°C振搖2小時。用含有20%蔗糖的PBS溶液更換每一溶液，然后使其在4°C靜置直至組織沉降。 用含有30%蔗糖的PBS溶液更換每一溶液，并使其在4°C靜置直至組織沉降。取出每一組織并使用手術(shù)刀切下所需的區(qū)域。隨后，將OCT化合物(Tissue Tek)施加至每一組織表面并鋪展開，并隨后將組織置于Cryomold上。將Cryomold置于干冰上以迅速冷凍。使用冷凍切片機(jī)(LEICA)將組織切成厚度10 μ m至20 μ m，并且用電吹風(fēng)對載玻片上的組織切片風(fēng)干 30分鐘，由此制備其上置有組織切片的載玻片。隨后，將每一載玻片置于充滿PBS-T(含有 0. 05%吐溫20的生理鹽水)的染色瓶，每隔5分鐘更換PBS-T，更換3次。使用Kimwipes 紙巾擦掉每一切片周圍的多余水分，用DAKOPEN(DAKO)圈定切片。將MOM小鼠Ig封閉試劑(VECTASTAIN)施用于小鼠組織上作為封閉液，并將含有10%胎牛血清的PBS-T溶液置于犬組織上作為封閉液。使這些產(chǎn)物置于保濕室中在室溫靜置1小時。隨后，用封閉液制備10 μ g/ml抗CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#8)溶液，其中所述的抗體是實(shí)施例 3制備的具有SEQ ID NO :55的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :56的輕鏈可變區(qū)，并與癌細(xì)胞表面反應(yīng)，將該溶液施加于每一載玻片，并且然后在保濕室中于4°C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向每一載玻片中施加用封閉液稀釋250倍的MOM生物素標(biāo)記的抗 IgG抗體(VECTASTAIN)，隨后使之在保濕室中于室溫靜置1小時。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加抗生物素蛋白-生物素ABC試劑(VECTASTAIN)，并隨后使之在保濕室中于室溫靜置5分鐘。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加DAB 染色溶液(IOmg DAB+10 μ 1 30%Η202/0. 05Μ Tris-HCl (pH 7. 6)，50ml)，并隨后使之在保濕室中于室溫靜置30分鐘。載玻片用蒸餾水淋洗，然后施加蘇木精試劑(DAKO)。使載玻片于室溫靜置1分鐘后，用蒸餾水淋洗。載玻片依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(zhì)(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結(jié)果，在所有唾液腺、腎、結(jié)腸和胃組織的細(xì)胞內(nèi)觀察到微弱程度的CAPRIN-I表達(dá)；然而在細(xì)胞的表面上沒有觀察到CAPRIN-I表達(dá)。此外，在來自其它器官的組織中完全沒有觀察到表達(dá)。(5)-2 犬乳腺癌組織中的CAPRIN-I表達(dá)使用通過病理診斷法診斷為患有惡性乳腺癌的犬的108份冷凍犬乳腺癌組織樣品，通過與上述類似的方法制備冷凍切片載玻片，并且用實(shí)施例3制備的單克隆抗體#8進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在108份樣品的100份(92. 5% )中證實(shí)了 CAPRIN-I表達(dá)。CAPRIN-I在異型度高的癌細(xì)胞表面上是特別強(qiáng)烈地表達(dá)。
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(5)-3 人乳腺癌組織中的CAPRIN-I表達(dá)應(yīng)用石蠟包埋的人乳腺癌組織陣列(BIOMAX)的188份乳腺癌組織樣品實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。在60°C處理3小時后，將該人乳腺癌組織陣列加入到充滿二甲苯的染色瓶中，然后每5分鐘更換二甲苯，更換3次。隨后，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯重復(fù)相似流程。將人乳腺癌組織陣列浸入充滿含有0. 05%吐溫20的IOmM檸檬酸緩沖液(pH 6. 0)的染色瓶中，在125°C處理5分鐘，并且在室溫靜置40分鐘或更長時間。使用Kimwipes紙巾從該陣列中擦掉每一切片周圍的多余水分，用DAK0PEN圈定每一切片，并且向該陣列逐滴添加足夠量的過氧化物酶阻斷劑(DAKO)。使該陣列在室溫靜置5分鐘后，然后浸入充滿PBS-T 的染色瓶。每5分鐘更換PBS-T，更換3次。將含有10% FBS的PBS-T溶液施加在該陣列上作為封閉液，并且使該陣列置于保濕室中在室溫持續(xù)1小時。隨后，施與應(yīng)用含5% FBS 的PBS-T溶液調(diào)節(jié)為10 μ g/ml濃度的實(shí)施例3中制備的單克隆抗體#8，并且然后在保濕室中于4°C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，逐滴添加合適量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO)至陣列，并且隨后使該陣列在保濕室中于室溫靜置 30分鐘。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，施加DAB染色液(DAKO)至該陣列，并且在室溫靜置約10分鐘。從陣列中棄去DAB染色液，然后用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘。用蒸餾水淋洗載陣列，然后依次地浸在70^^80%, 90^^95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出陣列，用Glycergel封片介質(zhì)(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結(jié)果，在全部188份乳腺癌組織樣品的138份(73% )中觀察到強(qiáng)烈的 CAPRIN-I 表達(dá)。(5)-4 人惡性腦腫瘤中的CAPRIN-I表達(dá)用實(shí)施例3制備的單克隆抗體#8如上文(5)-3中類似的方式對石蠟包埋的人惡性腦腫瘤組織陣列(BIOMAX)的247份惡性腦腫瘤組織樣品實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在全部247份惡性腦腫瘤組織樣品的227份(92%)中觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-I表達(dá)。(5)-5 人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中的CAPRIN-I表達(dá)用實(shí)施例3制備的單克隆抗體#8以如上文(5)-3中類似的方式對石蠟包埋的人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織陣列(BIOMAX)的150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣品實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在全部150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣品的136份 (90%)中觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-I表達(dá)。特別地，揭示了 CAPRIN-I在轉(zhuǎn)移自乳腺癌的癌組織中也強(qiáng)烈地表達(dá)。實(shí)施例2 制備新的犬和人癌抗原蛋白(1)重組蛋白的制備基于實(shí)施例1中獲得的SEQ ID NO 5的基因以下文所述方式制備重組蛋白。通過添加試劑(1 μ 1從實(shí)施例1中獲得的噬菌粒溶液制備并經(jīng)過序列分析的載體、含有NdeI和 KpnI限制性位點(diǎn)的兩種類型的引物(每種0. 4 μ Μ，根據(jù)SEQ ID NO 37和38)、0. 2mM dNTP 和1. 25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附帶的緩沖液調(diào)節(jié)至達(dá)到總體積50 μ 1從而制備反應(yīng)溶液，然后使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物重復(fù)30個循環(huán)98°C /10秒和68°C /1. 5分鐘的反應(yīng)，從而進(jìn)行PCR。使用上述兩種引物來擴(kuò)增編碼SEQ ID NO 6的全長氨基酸序列的區(qū)域(P47)。PCR后，將擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳， 然后使用QIAquick凝膠提取試劑盒OiIAGEN)純化約1. 4kbp的DNA片段。
將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將改載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后收集質(zhì)粒。通過測序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶處理目的序列匹配的質(zhì)粒，然后用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物。然后將目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶處理的大腸桿菌pET30b表達(dá)載體(Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 中，然后用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，由此在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。另外，基于SEQ ID NO :7的基因以下文所述方式制備犬同源基因的重組蛋白。通過添加試劑(1 μ 1實(shí)施例1中所制備的組織和/或細(xì)胞cDNA (通過RT-PCR可證實(shí)其表達(dá))、 含有NdeI和KpnI限制性位點(diǎn)的兩種類型的引物(每一種0. 4 μ M，根據(jù)SEQ ID NO 39和 40)、0. 2mM dNTP 和 1. 25UPrimeSTAR HS 聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附帶的緩沖液以調(diào)節(jié)至達(dá)到總體積50 μ 1從而制備反應(yīng)溶液，使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使該溶液進(jìn)行30個循環(huán)98°C /10秒和68°C /2. 5分鐘的反應(yīng)。使用上述兩種引物來擴(kuò)增編碼SEQ ID NO :8的全長氨基酸序列的區(qū)域。PCR后，擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，然后使用QIAquick凝膠提取試劑盒^IAGEN)純化約2. 2kbp的DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后回收質(zhì)粒。通過測序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和 KpnI限制性酶處理與目的序列匹配的質(zhì)粒，然后用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物。然后將目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶處理的大腸桿菌pET30b表達(dá)載體 (Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，然后用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，由此在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。使用SEQ ID NO 1的基因以下文所述方式制備人同源基因的重組蛋白。通過添加試劑(在實(shí)施例1中制備的組織或細(xì)胞cDNA(l μ 1)(通過RT-PCR可證實(shí)其表達(dá))、含有SacI和XhoI限制性位點(diǎn)的兩種類型的引物(每種0. 4 μ Μ，根據(jù)SEQ ID NO :41和42)、 0. 2mM dNTP 和 1. 25UPrimeSTAR HS 聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附帶的緩沖液以調(diào)節(jié)至達(dá)到總體積50 μ 1制備反應(yīng)溶液，使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進(jìn)行30 個循環(huán)98°C /10秒和68°C /2. 5分鐘的反應(yīng)，從而進(jìn)行PCR。使用上述兩種引物來擴(kuò)增編碼SEQ ID NO :2的全長氨基酸序列的區(qū)域。PCR后，擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳， 并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒^IAGEN)純化約2. Ikbp的DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體Gnvitrogen公司)。將所得物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，回收質(zhì)粒。通過測序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用McI和HioI限制性酶處理與目的序列匹配于的質(zhì)粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物。然后將目的基因序列插入用Mel和BioI限制性酶處理的大腸桿菌表達(dá)載體(pET30a，Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 中，然后用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，由此在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。(2)重組蛋白的純化上述表達(dá)SEQ ID NO :1、5或7的基因的重組大腸桿菌在含有30 μ g/ml卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)直至在600nm的吸光度達(dá)到約0. 7。然后添加異丙基-β _D_1_硫代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，隨后在37°C培養(yǎng)4小時。此后，以4800rpm離心10分鐘收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，然后以4800rpm離心10分鐘，用于洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，然后在冰上超聲破碎。超聲破碎的大腸桿菌溶液以6000rpm離心20分鐘。將所得的上清液用作可溶性級分，并且所得沉淀用作不溶性級分。將可溶級分添加至根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備的鎳螯合柱(載體 ChelateingS印harose (商標(biāo))Fast Flow(GE Health Care)；柱體積:5ml ；50mM鹽酸緩沖液 (pH 8. 0)作為平衡緩沖液)。用約10倍柱體積的50mM鹽酸緩沖液(pH 8. 0)和含有20mM 咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗去未吸附的級分。洗滌之后，立即用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗脫6個床。在通過考馬斯染色法證實(shí)了目的蛋白的洗脫之后，將含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)的洗脫級分添加至強(qiáng)陰離子交換柱(載體Q S印harose (商標(biāo))Fast Flow (GE Health Care)；柱體積5ml ；以及 20mM 磷酸鹽緩沖液(PH 8.0)作為平衡緩沖液)。用10倍柱體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) 和含有200mM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗去未吸附的級分。洗滌后，立即用含有400mM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗脫5個床。由此，獲得了各個具有SEQ IDNO :2、6或8所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的純化級分。然后將這些純化的級份用作用于施用試驗(yàn)的材料。圖2顯示了通過電泳分離并通過考馬斯染色檢測的SEQ ID NO :2的蛋白。將200 μ 1通過上述方法獲得的每一純化制備物分散到Iml的反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl2,pH 7.4)中，然后添加 2μ1 腸激酶(Novagen)。使制備物在室溫靜置過夜進(jìn)行反應(yīng)，切除His標(biāo)簽，并且然后使用腸激酶切割捕獲試劑盒(Novagen) 根據(jù)隨附的說明書進(jìn)行純化。隨后，使用超濾法NAN0SEP 10K OMEGA(PALL)，用生理磷酸鹽緩沖液(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)置換1. 2ml由上述方法獲得的每一純化制備物。應(yīng)用0.22 μ m HT Tuffryn Acrodisc(PALL)實(shí)施無菌過濾，并且所得物用于以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3 制備抗CAPRIN-I抗體(1)制備抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體為獲得與CAPRIN-I結(jié)合的抗體，合成了 CAPRIN-1衍生肽(Arg-Asn-Leu-Glu -Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln (SEQ IDNO :43))。將作為抗原的 Img 所述肽和與肽等量的不完全弗氏佐劑(IFA)溶液混合。每兩周一次地將該混合物皮下施與兔4次。隨后，收集血液，由此獲得含有多克隆抗體的抗血清。此外，應(yīng)用蛋白G載體(GE HealthcareBio-Sciences)純化該抗血清，并且獲得抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體。接下來，檢查所獲得的多克隆抗體與乳腺癌細(xì)胞表面的反應(yīng)性。具體地，IO6個 MDA-MB-231V人乳腺癌細(xì)胞系在1. 5ml微離心管中離心。將含有該多克隆抗體的補(bǔ)充有0. 胎牛血清(FBQ WPBS溶液加入該管。使該溶液在冰上靜置1小時。用PBS洗滌后，往溶液中加入用含有0. 1% FBS的PBS稀釋500倍的FITC-標(biāo)記的山羊抗-兔IgG 抗體(InvitrogenCorporation)，然后使溶液在冰上靜置1小時。用PBS洗滌后，應(yīng)用 FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)測量熒光強(qiáng)度。同時，通過添加含 0.1% FBS的PBS替代多克隆抗體，進(jìn)行上述類似的步驟，由此制備對照。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)多克隆抗體處理的細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度比對照細(xì)胞中的強(qiáng)度更強(qiáng)。因此，證實(shí)了所獲得的多克隆抗體與乳腺癌細(xì)胞表面結(jié)合。(2)抗CAPRIN-I蛋白單克隆抗體的制備
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將實(shí)施例2中制備的SEQ ID NO :2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1) (100 μ g)與等量的MPL+TDM佐劑(Sigma)混合。將該混合物用作每只小鼠的抗原溶液。將該抗原液腹膜內(nèi)地施用至6周齡的Balb/c小鼠(Japan SLCInc.)，并且以每周為間隔再施用該溶液3次。 最后免疫3日后取出脾臟，然后將其在兩片無菌的載玻片之間研磨。用PBS(-) (Nissui)洗滌所得物，然后以1500rpm離心10分鐘，并因此重復(fù)3次移除上清液的程序。由此，獲得脾臟細(xì)胞。將由此獲得的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0(購自ATCC)以10 1的比例混合。添加PEG溶液至細(xì)胞，其中所述的PEG溶液通過使在37°C加熱的200 μ 1含有10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基與800 μ 1 PEG1500 (Boehringer)混合而制得。使溶液靜置5分鐘以進(jìn)行細(xì)胞融合。以1700rpm離心5分鐘，以移除上清液。將細(xì)胞懸浮于150ml已經(jīng)添加2% 等量HAT溶液(Gibco)的含有15% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基)中，并且以每孔100 μ 1鋪種于15塊96孔平板(Nunc)中。在37°C和5% CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞7 天，由此獲得因脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合而產(chǎn)生的雜交瘤。使用由這樣制備的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)， 選擇雜交瘤。將實(shí)施例2中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次，以每孔400 μ 1的量添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma)，并且然后使該平板在室溫靜置3小時。移除該溶液，用400 μ 1的PBS-T洗滌各孔3次。以每孔100 μ 1的量添加上文獲得的每個雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時。用PBS-T洗滌各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG (H+L)抗體(Invitrogen Corporation)， 并且在室溫靜置1小時。用PBS-T洗滌各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加TMB底物溶液 (Thermo)，并且靜置15至30分鐘，由此進(jìn)行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)。使用吸光度計測定在450nm的吸光度和在595nm的吸光度。結(jié)果，選出了具有高吸光度值的產(chǎn)生抗體的多株雜交瘤。將由此選出的雜交瘤以每孔0. 5個雜交瘤的量添加至96孔平板并培養(yǎng)。1周后， 觀察到在孔中形成單個集落雜交瘤。進(jìn)一步培養(yǎng)這些孔中的細(xì)胞。使用從克隆的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選擇雜交瘤。將實(shí)施例2中制備的 CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次。以每孔400 μ 1的量添加0. 5% BSA溶液，并且然后使該平板在室溫靜置3小時。移除該溶液，用400 μ 1的PBS-T洗滌各孔3次。以每孔100 μ 1 的量添加上文獲得的每個雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時。用PBS-T 洗滌各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG (H+L) 抗體anvitrogenCorporation)，并且在室溫靜置1小時。用PBS-T洗滌各孔3次，以每孔 100 μ 1的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且靜置15至30分鐘，由此進(jìn)行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)。使用吸光度計測定在450nm 的吸光度和在595nm的吸光度。結(jié)果，獲得了多個雜交瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系產(chǎn)生顯示出與 CAPRIN-I蛋白的反應(yīng)性的單克隆抗體。應(yīng)用蛋白G載體純化雜交瘤培養(yǎng)上清液，由此獲得與CAPRIN-I蛋白結(jié)合的150個單克隆抗體。接下來，在這些單克隆抗體當(dāng)中選出顯示了與表達(dá)CAPRIN-I的乳腺癌細(xì)胞的表面的反應(yīng)性的單克隆抗體。具體地，在1.5ml微量離心管中離心IO6個MDA-MB-231V人乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞。添加上文制備的每一雜交瘤上清液(100 μ 1)，并且在冰上靜置1小時。在用PBS洗滌后，添加用含有0. 胎牛血清的PBS稀釋500倍的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(Invitrogen Corporation)，并在冰上靜置1小時。在用PBS洗滌后，使用 FACSCalibur (Becton，Dickinson and Company)測量熒光強(qiáng)度。同時，應(yīng)用用培養(yǎng)基代替抗體實(shí)施類似程序，由此制備對照。結(jié)果，選出了 10個(#1至#10)具有比對照更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度的單克隆抗體；即，選出了與乳腺癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體。這些單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)顯示于SEQ ID N0:44-60。上述單克隆抗體#1包含SEQ ID NO :44的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :45的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#2包含SEQ ID N0:44的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 46的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#3包含SEQID NO 44的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :47的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#4包含SEQ ID NO :44的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 48 的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#5包含SEQ ID NO 49的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 50的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#6包含SEQ ID NO 51的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 52的輕鏈可變區(qū)， 單克隆抗體#7包含SEQ ID NO 53的重鏈可變區(qū)和SEQ IDNO 54的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#8包含SEQ ID NO 55的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 56的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#9包含SEQ ID NO 57的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 58的輕鏈可變區(qū)，單克隆抗體#10包含SEQ IDNO 59的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 60的輕鏈可變區(qū)。(3)鑒定CAPRIN-I蛋白中的肽，其中與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I抗體結(jié)合所述肽應(yīng)用上面獲得的與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#10，鑒定了由這些單克隆抗體識別的CAPRIN-I蛋白中的部分序列。首先，將重組CAPRIN-I蛋白溶液用PBS調(diào)節(jié)為含有1 μ g/μ 1濃度蛋白質(zhì)的溶液，將DTT(Fluka)添加到100 μ 1該溶液中至IOmM終濃度，隨后在95°C反應(yīng)5分鐘，由此使CAPRIN-I蛋白內(nèi)的二硫鍵還原。接下來，以20mM的終濃度加入碘乙酰胺(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)，然后在遮光條件下在37°C對硫醇基進(jìn)行烷基化反應(yīng)30分鐘。將50 μ g每一種抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#10加入到40 μ g如此獲得的還原的烷基化的CAPRIN-I蛋白中。將混合物體積調(diào)節(jié)至ImL 20mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)，然后在攪拌混合每一混合物的同時使該混合物在4°C反應(yīng)過夜。然后，添加胰蛋白酶(ftOmega)至0. 2 μ g的終濃度。在37°C反應(yīng)1小時、2小時、4 小時和12小時后，將所得物與在ImM碳酸鈣及NP-40緩沖液QOmM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)、 5mM EDTA、150mM NaCl和NP-40)中的蛋白A-玻璃珠(GE)混合，然后反應(yīng)30分鐘，其中所述的蛋白A-玻璃珠在此之前用含BSA(Sigma)的PBS進(jìn)行封閉并然后用PBS洗滌。用25mM碳酸銨緩沖液(pH 8. 0)洗滌每一反應(yīng)混合物，然后用100 μ 10. 甲酸洗脫抗原-抗體復(fù)合物。應(yīng)用Q-TOF Premier(Waters-MicroMass)根據(jù)該儀器所附說明對洗脫物進(jìn)行LC-MS分析。結(jié)果，鑒定出了 SEQ ID NO 61的多肽作為CAPRIN-I的部分序列，其被所有抗 CAPRIN-I單克隆抗體#1至#10識別。此外，鑒定了 SEQ ID NO :62的肽，其作為上述SEQ ID NO 61多肽中的部分序列，被單克隆抗體#1_#4、#5-#7和#9識別。還揭示了單克隆抗體#1至#4識別SEQ ID NO 63的肽，其為SEQ ID NO 62肽中的部分序列肽。實(shí)施例4 應(yīng)用CAPRIN-I多肽診斷癌
(1)犬癌診斷從被確認(rèn)患有惡性或良性腫瘤的342只患病犬和6只健康犬采集血液，分離血清。 使用實(shí)施例2制備的犬CAPRIN-I多肽(SEQ ID NO 8)和抗犬IgG抗體，通過ELISA法測定與該多肽特異性反應(yīng)的血清IgG抗體滴度。如下固定所制備的多肽按100 μ 1/孔將用磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋為5 μ g/ mL的重組蛋白質(zhì)溶液添加到96孔固定氨基板(immobilizer aminoplates) (Nunc)中，在 4°C靜置過夜。如下進(jìn)行封閉按100 μ L/孔加入含有0.5% BSA(牛血清白蛋白)(Sigma Aldrich Japan)的50mM碳酸氫鈉緩沖溶液(pH8. 4)(以下稱為封閉溶液)，室溫下振蕩1 小時。按100 μ L/孔添加用封閉溶液稀釋1000倍的稀釋血清，然后在室溫下振蕩3小時進(jìn)行反應(yīng)。用含有 0. 05% Tween20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(以下稱為PBS-T)洗滌反應(yīng)溶液3次。按100 μ L/孔加入用封閉溶液稀釋3000倍的HRP修飾犬IgG抗體(山羊抗狗IgG-h+I HRP綴合的BETHYL Laboratories)，隨后室溫下振蕩溶液反應(yīng)1小時。用PBS-T洗滌3次后，按照100 μ 1/孔添加HRP底物TMB (I-Step Turbo TMB (四甲基聯(lián)苯胺)，PIERCE)，然后在室溫下進(jìn)行酶底物反應(yīng)30分鐘。之后，按 100 μ 1/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma Aldrich Japan)終止反應(yīng)。用微孔板讀數(shù)儀測定 450nm處的吸光度。作為對照，用未固定所制備的重組蛋白質(zhì)的樣品，以及沒有使帶癌犬血清與之反應(yīng)的樣品進(jìn)行上述同樣地處理并進(jìn)行比較。使用被摘除的腫瘤組織進(jìn)行病理診斷，最終上述癌診斷中使用的全部342個樣品中有215個樣品被確診為惡性。具體而言，上述樣品被診斷為具有以下癌，諸如惡性黑素瘤、惡性混合瘤、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、棘皮瘤樣牙齦瘤、口腔瘤、肛門周圍腺癌、肛囊瘤、肛囊頂泌腺癌、Sertoli 細(xì)胞癌、陰道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔內(nèi)腺癌、鼻腺癌、甲狀腺癌、大腸癌、支氣管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、組織細(xì)胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大細(xì)胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹膜內(nèi)平滑肌瘤、平滑肌瘤、鱗狀細(xì)胞癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、胃腸淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小細(xì)胞至中細(xì)胞淋巴瘤、腎上腺髓質(zhì)瘤、顆粒細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤。發(fā)現(xiàn)來自這些帶癌犬生物體的血清中具有顯著高的針對重組蛋白質(zhì)的抗體滴度， 如圖3所示。當(dāng)將該診斷方法的惡性腫瘤的參考值確定為健康犬平均值的2倍或更多時， 證實(shí)有108個樣品被診斷為惡性，其為所有樣品的50. 2%。這些108個樣品的癌的種類如下所述。盡管某些樣品患有多種類型的癌，但以下所示的數(shù)值為每種癌的累計總值。6例惡性黑素瘤、11例淋巴瘤、1例化膿性炎癥、1例顆粒細(xì)胞瘤，4例肝細(xì)胞癌，3 例惡性睪丸瘤，3例口腔瘤，7例肛門周圍腺癌、12例肉瘤、35例乳腺癌、1例肺癌、6例腺管癌、2例皮脂腺癌、5例肥大細(xì)胞瘤、1例平滑肌肉瘤、3例鱗狀細(xì)胞癌、2例惡性混合腫瘤、1 例血管外皮瘤、1例移行上皮細(xì)癌、1例血管外皮瘤、1例血管外皮細(xì)胞瘤和1例皮脂腺上皮瘤。使用從末期癌患病犬采集的胸腔積液和腹水，進(jìn)行相同的診斷，結(jié)果可以檢測出與通過使用血清的本診斷方法所得的結(jié)果相同的值，可以診斷為癌。另外，證實(shí)了采用本診斷方法可以進(jìn)行肉眼不可見部位的癌診斷、癌進(jìn)展程度診斷、惡性程度診斷、或癌術(shù)后的追蹤診斷、復(fù)發(fā)診斷、轉(zhuǎn)移診斷等診斷。以下描述了圖4所示的詳細(xì)診斷的幾個具體例。(2)-1肉眼不可見腫瘤的癌診斷患病犬1(平毛尋回獵犬(flat-coated retriever))在2007年6月7日時間點(diǎn)未確認(rèn)有腫瘤。但在約20日后即2007年6月M日在該患病犬1左上頌犬齒根的牙齦處發(fā)現(xiàn)了蒂狀的直徑2mm的腫瘤。在發(fā)現(xiàn)之日將蒂部結(jié)扎并切除。在可以肉眼確認(rèn)到腫瘤以前，可以確認(rèn)在450nm處的吸光度為0. 06，并且該值與發(fā)現(xiàn)腫瘤時確定的0. 04幾乎一樣。 由該結(jié)果也可證明，通過使用本方法可以診斷肉眼不可見部分的癌，諸如腹腔內(nèi)癌。另外，由于在用肉眼可確認(rèn)腫瘤以前可以確認(rèn)前述值上升，因此認(rèn)為成功地檢測出了腫瘤發(fā)生的前兆。因此，證實(shí)了該技術(shù)對諸如定期健康檢查的體檢也有用。(2)-2癌的進(jìn)展程度診斷癌的進(jìn)展程度基于腫瘤的大小、腫瘤深度、腫瘤如何影響周圍組織、轉(zhuǎn)移的存在與否進(jìn)行判斷。已揭示了當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或癌發(fā)展時可以檢測出更高的值。(2)-3癌的惡性程度診斷基底細(xì)胞瘤包括惡性基底細(xì)胞瘤和良性基底細(xì)胞瘤。近年來，根據(jù)新WHO，傾向于將惡性基底細(xì)胞瘤歸類為基底細(xì)胞癌的實(shí)例，將良性基底細(xì)胞瘤歸類為毛芽瘤的實(shí)例。診斷為患有基底細(xì)胞癌(惡性)的患病犬2 (比格犬)在手術(shù)時進(jìn)行血清診斷，結(jié)果450nm處的吸光度為0.04。同時，診斷為患有毛芽瘤(良性)的患病犬3 (雜種)在手術(shù)時進(jìn)行血清診斷，結(jié)果450nm處的吸光度為0，即檢測不到。因此，證實(shí)了即使均歸類為基底細(xì)胞瘤的腫瘤也可以被診斷出不同類型的基底細(xì)胞瘤，即惡性基底細(xì)胞癌和良性毛芽瘤。接下來，舉出乳腺腫瘤的例子?？蓪⑷橄倌[瘤分類為諸如乳腺癌或乳腺惡性混合腫瘤的惡性腫瘤、以及未表現(xiàn)出惡性癥狀的良性乳腺腫瘤?；疾∪?(喜樂蒂牧羊犬(Shetland Sheepdog))于2007年7月17日接受了乳腺癌摘除手術(shù)。患病犬4患有3個腫瘤。應(yīng)用分離的組織進(jìn)行的病理診斷得出了相同的診斷。 強(qiáng)非典型性和侵襲性乳腺組織經(jīng)歷了比較寬范圍的乳頭狀-腺樣生長，并且在樣品中也證實(shí)了血管侵襲。因此，患病犬4被診斷為患有高度惡性乳腺癌。應(yīng)用手術(shù)時收集的血液進(jìn)行血清學(xué)診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)450nm的吸光度為0. 41。同時，患病犬5 (玩具貴賓犬(toy poodle))于2007年10月9日接受了乳腺癌摘除手術(shù)。在這時應(yīng)用分離的組織進(jìn)行的病理診斷揭示盡管腫瘤在乳腺上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞生長的地方形成，但肌上皮細(xì)胞的成分是均一的紡錘形細(xì)胞，并且沒有檢測到惡性生長；并且乳腺上皮細(xì)胞成分呈現(xiàn)出輕度大小差異，以及觀察到核異形。因此，患病犬5診斷為患有良性乳腺癌，因?yàn)闆]有檢測到惡性生長。手術(shù)時收集血液并進(jìn)行血清診斷的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，450nm處的吸光度為0。上述兩個樣本的結(jié)果揭示了高度惡性腫瘤的值比良性的低惡性腫瘤更高。此外，還檢查了 M個惡性腫瘤(乳腺癌)樣品，諸如乳腺癌或乳腺惡性混合腫瘤樣品，以及21個沒有顯示出惡性的良性乳腺腫瘤樣品的診斷分布。雖然良性乳腺腫瘤樣品顯示出與健康犬類似的分布，但乳腺癌樣品顯示出很高值的分布。(2)-4術(shù)后追蹤診斷患病犬6(雜種犬)由于肥大細(xì)胞瘤而于2005年5月23日入院并進(jìn)行了摘除手術(shù)。此時進(jìn)行的血清診斷的結(jié)果為，450nm處的吸光度為0.10。當(dāng)肥大細(xì)胞是未完全切除時會反復(fù)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤。因此，通過手術(shù)是否能達(dá)到完全的腫瘤摘除是很重要的。在 2006年12月19日的追蹤觀察中，發(fā)現(xiàn)450nm處的吸光度為0.05，由此證實(shí)了降低的抗體滴度。這一時間，沒有證實(shí)復(fù)發(fā)。因此，在患病犬6的情況中，可認(rèn)為由于腫瘤能被完全切除，因此血清診斷結(jié)果比手術(shù)時更低。患病犬7 (比格犬)于2008年2月14日由于肥大細(xì)胞腫瘤而進(jìn)行了摘除手術(shù)。此時進(jìn)行的血清診斷的結(jié)果為，發(fā)現(xiàn)450nm處的吸光度為0. 17。應(yīng)用切除的組織進(jìn)行組織學(xué)診斷，結(jié)果觀察到了侵襲增生，并且患病犬7被診斷為患有向應(yīng)用中度分化型(Patnaik II 型)的肥大細(xì)胞瘤?；疾∪?于2008年3月10日入院追蹤觀察，并再次進(jìn)行血清診斷。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)450nm處的吸光度為0.07。這一時間，沒有證實(shí)轉(zhuǎn)移，也沒有證實(shí)復(fù)發(fā)。因此，在患病犬7的情況中，可認(rèn)為由于腫瘤能被完全切除，因此血清診斷結(jié)果比手術(shù)時更低。(2)-5復(fù)發(fā)診斷患病犬8(雪橇犬(Husky))于2007年5月8日進(jìn)行乳腺癌摘除手術(shù)。此時進(jìn)行的血清診斷的結(jié)果為，發(fā)現(xiàn)450nm處的吸光度為0. 05。使用摘除的組織進(jìn)行病理診斷，發(fā)現(xiàn)異型性強(qiáng)的上皮細(xì)胞增生主要形成腺管結(jié)構(gòu)。因此，患病犬8被診斷為患有乳腺原發(fā)性腺癌。此時，已經(jīng)證實(shí)淋巴管內(nèi)存在許多癌細(xì)胞，表明向淋巴結(jié)及遠(yuǎn)位部的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的風(fēng)險高。2007年6月觀日(自手術(shù)約一個半月后)，在相同部位確認(rèn)到復(fù)發(fā)。到此時血清診斷的結(jié)果為0. 09，確認(rèn)了值升高。在患病犬8的情況下，揭示了由于腫瘤未被完全切除或復(fù)發(fā)，所以6月下旬的診斷結(jié)果比5月上旬更高。( -6轉(zhuǎn)移診斷患病犬9 (蘇格蘭梗(Scottish terrier))經(jīng)歷了多次轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，包括2003年 2月的乳腺腫瘤、2003年8月口腔內(nèi)惡性黑色素瘤、2005年1月嘴唇惡性黑色素瘤、2005年 4月13日口腔內(nèi)黑色素瘤。上述腫瘤均已通過手術(shù)被切除。患病犬9于2005年4月口腔內(nèi)黑色素瘤復(fù)發(fā)后，因追蹤觀察于2006年12月17日再次入院，并進(jìn)行血清診斷。結(jié)果，在 450nm處的吸光度為0. 09。半年后，患病犬9于2007年6月20日由于頸部淋巴和膝后窩淋巴肥大再次入院。如果為淋巴瘤，則全身淋巴結(jié)均腫?；疾∪?只有2處淋巴結(jié)腫。因此臨床診斷患病犬9很可能是因轉(zhuǎn)移引起的淋巴瘤。通過本技術(shù)的的診斷，發(fā)現(xiàn)450nm處的吸光度升高至0. 10，表明該淋巴瘤是由以前的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移引起的。患病犬10 (Shiki inu)于2006年3月11日因右嘴唇部口腔惡性黑色素瘤進(jìn)行了腫瘤摘除?；疾∪?0具有自2006年6月10日至同年9月沈日給與抗癌劑(環(huán)磷酰胺) 的治療史，以及自2006年5月23日給與有機(jī)鍺為主成分的Biremo S。于2007年3月20 日移除了認(rèn)為從之前的腫瘤轉(zhuǎn)移所致的腫瘤，此時進(jìn)行血清診斷，結(jié)果為發(fā)現(xiàn)450nm處的吸光度約為0. 03，幾乎檢測不到。使用此時摘除的組織進(jìn)行病理診斷，診斷為轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤。但是，在手術(shù)切除轉(zhuǎn)移的黑色素瘤3個月后，即2007年6月27日再次發(fā)生轉(zhuǎn)移。 2007年3月20日在右頸部產(chǎn)生了腫瘤，但在2007年6月27日在該位置對側(cè)產(chǎn)生了另一腫瘤。腫瘤的形狀也形成與前次類似的黑色塊。腫瘤大小為3. 1X3. 2X0. 8cm，經(jīng)臨床診斷也為轉(zhuǎn)移。此時進(jìn)行血清診斷，結(jié)果證實(shí)450nm處的吸光度升高至0. 23，提示為以前存在的腫瘤的轉(zhuǎn)移。(2)-7使用人CAPRIN-I衍生多肽的癌診斷
應(yīng)用實(shí)施例2制備的人CAPRIN-I的多肽(SEQ ID NO 2)，以與上述類似的方式測定與該多肽反應(yīng)的犬血清IgG抗體的滴度。應(yīng)用健康犬的血清檢查的結(jié)果表明，在450nm 處幾乎沒有檢測到吸光度，與上述情況類似。另一方面，患病犬11 (Shih tzu)于2007年6月21日進(jìn)行了乳腺癌摘除手術(shù)。應(yīng)用切除的組織進(jìn)行病理診斷，結(jié)果患病犬11被診斷為患有中等惡性的乳腺癌，其中除了存在纖維結(jié)締組織某種程度的彌漫性增生外，強(qiáng)異型性且侵襲性的乳腺組織進(jìn)行腺-管狀-乳頭狀增殖，從而形成大和小塊。患病犬11在450nm處的吸光度為0. 26。(3)貓的診斷接下來，進(jìn)行帶癌貓及健康貓的診斷。使用犬CAPRIN-I的多肽(如上使用)和抗貓IgG抗體，以與上述同樣的方法測定與該多肽特異性反應(yīng)的貓血清中IgG抗體滴度。作為第二抗體，將 HRP 修飾的抗貓 IgG 抗體(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE) =CAPPEL RESERCH REAGENTS)用封閉溶液稀釋 8000 倍，然后使用?；疾∝? (雜種)于2007年5月8日因乳腺癌進(jìn)行了腫瘤摘除手術(shù)?；疾∝?在 450nm處的吸光度為0.21。另外，2006年10月17日因腺管癌接受了摘除手術(shù)的患病貓 2 (Himalayans)在450nm處的吸光度為0. 18。而在健康貓中沒有檢測到吸光度。此外，應(yīng)用實(shí)施例2制備的人CAPRIN-I的多肽(SEQ ID NO 2)，以與上述類似的方式測定與該多肽反應(yīng)的貓血清IgG抗體的滴度。結(jié)果，在健康貓的情況下，當(dāng)固定該多肽時，在450nm處幾乎沒有檢測吸光度。另一方面，患病貓3 (American Shorthair)于2008 年4月15日進(jìn)行了乳腺癌摘除手術(shù)。應(yīng)用切除的組織進(jìn)行病理診斷，結(jié)果患病貓3被診斷為患有伴有大和小壞死組織的高度惡性乳腺癌，其中強(qiáng)異型性和侵襲性乳腺組織進(jìn)行片狀生長成大和小塊。在患病貓3的情況下，450nm處的吸光度為0. 12。因此，這證實(shí)了可與犬類似地通過這一技術(shù)診斷貓的癌，因?yàn)閺幕及┴埖臉悠分袡z測到值，但是在健康貓的樣品中未檢測到。(4)人的癌診斷應(yīng)用實(shí)施例2制備的人CAPRIN-I的多肽(SEQ ID NO 2)和抗人IgG抗體，測定與該多肽特異性反應(yīng)的健康人血清IgG抗體的滴度。如下固定所制備的多肽按100 μ 1/ 孔將用磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋為 οομ g/mL的重組蛋白質(zhì)溶液添加到96孔固定氨基板 (immobilizer amino plates) (Nunc)中，在4°C下靜置過夜。如下進(jìn)行封閉。將4克Block Ace粉(DS PHARMABIOMEDICAL Co.，Ltd.)溶解于100ml純水中，然后該溶液用純水稀釋4 倍。然后按100 μ 1/孔添加該溶液(以下稱為封閉溶液)，室溫下振蕩1小時。按100 μ L/ 孔添加用封閉溶液稀釋1000倍的稀釋血清，然后在室溫下振蕩3小時進(jìn)行反應(yīng)。用含有 0. 05% Tween20(ffako Pure Chemical Industries, Ltd.)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(以下稱為PBS-T)洗滌反應(yīng)溶液3次后，按100 μ L/孔加入用封閉溶液稀釋10000倍的HRP修飾的抗人IgG抗體(HRP-山羊抗人IgG (H+L)綴合物Zymed Laboratories)，隨后室溫下振蕩溶液反應(yīng)1小時。用PBS-T洗滌3次后，按照100 μ 1/孔添加HRP底物TMB (1-Step Turbo TMB (四甲基聯(lián)苯胺)，PIERCE)，然后在室溫下進(jìn)行酶底物反應(yīng)30分鐘。之后，按100 μ 1/ 孔加入0. 5Μ硫酸溶液(Sigma AldrichJapan)終止反應(yīng)，然后用微孔板讀數(shù)儀測定450nm 處的吸光度。固定用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)節(jié)至50 μ g/ml的白蛋白抗原，然后用作陽性對照。結(jié)果，在白蛋白抗原的情況下，7個健康受試者的結(jié)果為450nm處的吸光度平均高達(dá) 0. 45，但是在上述多肽的情況下，沒有檢測到吸光度。以與上述類似的方法，對來自惡性乳腺癌患者的17份血清樣品(購自ProMedDx) 進(jìn)一步進(jìn)行測定，測定與人來源癌抗原蛋白(SEQ ID NO :3的氨基酸序列)特異性反應(yīng)的血清IgG抗體滴度。結(jié)果，在上述多肽的情況下，450nm處的吸光度高達(dá)0. 48，這是17例乳腺癌患者的結(jié)果平均值。此外，應(yīng)用實(shí)施例2制備的犬CAPRIN-I多肽(SEQ ID NO 8)和抗人IgG抗體，以與上述類似的方法測定了與該多肽特異性反應(yīng)的人血清IgG抗體的滴度。結(jié)果，7個健康受試者的結(jié)果平均值為0. 04，而17例乳腺癌患者的結(jié)果平均值高達(dá)0. 55。基于上述結(jié)果，證實(shí)了也可通過這一技術(shù)檢測人的癌。實(shí)施例5 通過測定抗原多肽的癌診斷聯(lián)合使用實(shí)施例3(1)獲得的抗CAPRIN-I-衍生肽(SEQ ID NO 43)的多克隆抗體，以及實(shí)施例3(2)中獲得的每一個抗CAPRIN-I蛋白的單克隆抗體，通過夾心ELISA法檢測樣品(來自帶癌活體的血清)中含有的該抗原多肽本身，其中所述的樣品在實(shí)施例 4(1)-(3)應(yīng)用CAPRIN-I多肽進(jìn)行癌診斷時，反應(yīng)陽性。該多克隆抗體用作第一抗體，并且每一單克隆抗體用作第二抗體。測定了與每一上述抗體特異性反應(yīng)的蛋白的血清蛋白水平。如下固定第一抗體將用磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至5 μ g/ml濃度的多克隆抗體按100 μ L/孔添加到96孔固定氨基板(Immobilizer Amino Plate) (Nunc)中，室溫下振蕩2 小時。如下進(jìn)行封閉按照100 μ 1/孔加入含有0.5% BSA(牛血清白蛋白，Sigma Aldrich Japan)的50mM碳酸氫鈉緩沖溶液(pH8. 4)(以下稱為封閉溶液)，室溫下振蕩1小時。之后， 按100μ L/孔添加用封閉溶液稀釋的來自帶癌活體的血清，然后在室溫下振蕩3小時進(jìn)行反應(yīng)。此時將稀釋倍率調(diào)整為10倍系列稀釋(10-1000倍)。用含有0.05% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(以下稱為PBS-T)清洗3次， 按照100 μ L/孔加入用封閉溶液稀釋至1 μ g/ml的作為第二抗體的每一單克隆抗體，室溫下振蕩1小時進(jìn)行反應(yīng)。用PBS-T清洗3次后，按照100 μ L/孔加入用封閉溶液稀釋5000 倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG(H+L)抗體(Invitrogen Corporation)作為第三抗體，室溫下靜置1小時。用PBS-T清洗3次，按照100 μ 1/孔添加TMB底物溶液(Thermo)，然后靜置 15-30分鐘用于顏色反應(yīng)。顏色顯現(xiàn)后，按100 μ 1/孔加入IN硫酸終止反應(yīng)，然后用吸收分光計測定450nm處的吸光度。結(jié)果，當(dāng)使用與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的#1_#10單克隆抗體作為第二抗體時，對所有來自患有乳腺癌、惡性黑素瘤等的帶癌犬和帶癌貓的樣品檢測到0. 3或更高的吸光值(多肽水平)，然而在健康犬和健康貓中沒有檢測到吸光度。另一方面，當(dāng)將與CAPRIN-I蛋白本身反應(yīng)，但不與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體用作第二抗體時，對所有樣品檢測到多肽水平， 但吸光值均為0. 05或以下，其比聯(lián)合使用與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗體時得到的結(jié)果更低。因此，通過這一包括應(yīng)用抗CAPRIN-I抗體檢測抗原多肽的技術(shù)，可診斷癌。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明在工業(yè)上可用于診斷或檢測癌。本說明書包括日本專利申請?zhí)?008-202320的說明書和/或附圖的全部或部分公開內(nèi)容，其中所述申請為本申請的優(yōu)先權(quán)文件。此外，本文中引用的全部出版物、專利和專利申請也通過引用的方式完整并入本文中。序列表獨(dú)立文本SEQ ID NO :31-42 引物
權(quán)利要求
1.用于檢測癌的方法，其包括測定從生物體分離的樣本中通過抗原抗體反應(yīng)而與抗 CAPRIN-I蛋白抗體具有結(jié)合反應(yīng)性的多肽的表達(dá)，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有序列表中偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30所示的任一氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中待測定的多肽是具有偶數(shù)編號的SEQIDNO :2-30所示任一氨基酸序列的CAPRIN-I蛋白，或與所述CAPRIN-I蛋白具有85%或更多序列同一性的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的生物體是人、狗或貓。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的生物體是狗，并且所述待測定的多肽具有偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的生物體是狗，并且所述待測定的多肽具有SEQ ID NO :6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的生物體是人，并且所述待測定的多肽具有SEQ ID NO :2或4所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中通過抗體的免疫測定法測定所述多肽的表達(dá)，其中所述抗體可包含于樣本中并且是在體內(nèi)針對待測多肽而被誘導(dǎo)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述的樣本是血清、血漿、腹水或胸腔積液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中通過測定樣本中所包含的編碼該多肽的mRNA 來測定所述多肽的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，包括應(yīng)用與所述mRNA核苷酸序列中15個或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸檢測樣本中所述mRNA的存在量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述生物體是狗，并且所述多核苷酸是與SEQID NO :5、7、9、11或13所示核苷酸序列中15個或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述生物體是人，并且所述多核苷酸是與SEQID NO :1或3所示核苷酸序列中15個或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)的方法，其中所述樣本是組織或細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述的癌是選自以下的至少一種類型腦腫瘤，頭、頸、肺、子宮或食管的鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤、肺或子宮的腺癌、腎癌、惡性混合瘤、 肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、棘皮瘤樣牙齦瘤、口腔瘤、肛門周圍腺癌、肛囊瘤、肛囊頂泌腺癌、 krtoli細(xì)胞癌、陰道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔內(nèi)腺癌、鼻腺癌、甲狀腺癌、大腸癌、支氣管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、組織細(xì)胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大細(xì)胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹膜內(nèi)平滑肌瘤、平滑肌瘤、 慢性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、胃腸淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小細(xì)胞至中細(xì)胞淋巴瘤、腎上腺髓質(zhì)瘤、顆粒細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，包括基于當(dāng)所述多肽的表達(dá)水平比對照高時則癌惡性程度高這一事實(shí)來進(jìn)一步檢測癌的惡性程度。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，包括基于當(dāng)所述多肽的表達(dá)水平比對照高時則癌進(jìn)展程度是進(jìn)展的這一指示來進(jìn)一步檢測癌的進(jìn)展程度。
17.用于檢測癌的試劑，其包含與針對CAPRIN-I蛋白在體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過抗原抗體反應(yīng)具有結(jié)合反應(yīng)性的多肽，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有序列表中偶數(shù)編號的SEQ ID NO 2-30所示的任一氨基酸序列。
18.用于檢測癌的試劑，其包含與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述多肽通過抗原抗體反應(yīng)與抗CAPRIN-I蛋白抗體具有結(jié)合反應(yīng)性并且所述多肽是在體內(nèi)產(chǎn)生的，其中所述CAPRIN-I蛋白具有序列表中偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30所示的任一氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用于檢測癌的試劑，其中所述的與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段是與癌細(xì)胞表面結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的用于檢測癌的試劑，其中所述的與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段與下述多肽具有免疫學(xué)反應(yīng)性，包含除SEQ ID NO 6和18之外偶數(shù)編號的SEQ ID NO 2至30所示任一氨基酸序列的氨基酸殘基編號50-98或氨基酸殘基編號233-305的區(qū)域中7個或更多個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽，或包含上述多肽為部分序列的多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的用于檢測癌的試劑，其中所述的與多肽進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段是與SEQ ID NO :43結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，具有 SEQ ID NO :44和45的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID N0:44和 46的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :44和47的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :44和48的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO :49和50的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段， 具有SEQ ID NO :51和52的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO 53和M的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID N0:55和56的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，具有SEQ ID NO 57和58的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，或具有SEQ ID NO 59和60的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
22.用于檢測癌的試劑，其包含與序列表中奇數(shù)編號的SEQID NO :1- 所示任一核苷酸序列中15個或更多個核苷酸的部分序列特異性雜交的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測癌的方法，其包括測定從生物體分離的樣本中與抗CAPRIN-1蛋白抗體通過抗原抗體反應(yīng)具有結(jié)合反應(yīng)性的多肽的表達(dá)，其中所述的CAPRIN-1蛋白包含序列表中偶數(shù)編號的SEQID NO2-30所示的任一氨基酸序列。也公開了用于檢測癌的試劑，其包含CAPRIN-1蛋白或其片段、抗CAPRIN-1蛋白或其片段的抗體、或編碼CAPRIN-1蛋白或其片段的多核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK102171570SQ20098013903
公開日2011年8月31日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者岡野文義, 鈴木佳奈 申請人:東麗株式會社